WO1998042735A1 - Neue monomerbausteine zur markierung von peptidischen nukleinsäuren - Google Patents

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WO1998042735A1
WO1998042735A1 PCT/EP1998/001723 EP9801723W WO9842735A1 WO 1998042735 A1 WO1998042735 A1 WO 1998042735A1 EP 9801723 W EP9801723 W EP 9801723W WO 9842735 A1 WO9842735 A1 WO 9842735A1
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nucleobase
nucleic acid
radical
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PCT/EP1998/001723
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Frank Bergmann
Rupert Herrmann
Christoph Seidel
Troels Koch
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Dako A/S
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/06—Dipeptides
    • C07K5/06008—Dipeptides with the first amino acid being neutral
    • C07K5/06017—Dipeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic
    • C07K5/06026—Dipeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic the side chain containing 0 or 1 carbon atom, i.e. Gly or Ala
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/001—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof by chemical synthesis
    • C07K14/003—Peptide-nucleic acids (PNAs)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • the invention relates to new monomer building blocks for labeling peptide nucleic acids and similarly constructed nucleic acid-binding oligomers with groups which are coupled to a nucleobase and / or to the peptide backbone of the peptide nucleic acid.
  • the invention further relates to peptide nucleic acids which contain at least one labeled monomeric building block.
  • marker groups e.g. B. Reporter molecules in nucleic acids are of great importance for many applications.
  • the prerequisite here is the targeted installation of couplable groups, e.g. B. amino groups, in the nucleic acid.
  • couplable groups e.g. B. amino groups
  • specially modified monomeric nucleotide building blocks are produced which are compatible with the nucleic acid synthesis strategy subsequently used.
  • B. Trifluoroacetyl- or Fmoc-protected aminoalkyloxy phosphoramidites are used for a 5 'end label (cf., for example, EP-A-224 578, Coull et al., Tetra-hedron Lett. 27 (1986), 3991 - 3994).
  • phosphoramidites which contain a trifluoroacetyl or Fmoc-protected amino acid group and a DMTr ether, the base bodies being of a non-nucleotide nature (EP-A-0 313 219, Nelson et al., Nucleic Acids Res. 17 ( 1989, 7179-7186) or nucleotidic in nature (Ruth, DNA 4 (1985), 93, WO 84/03285).
  • certain positions of the nucleobase or sugar come into play for the coupling of reporter molecules Question (see e.g. Ruth (1991) Oligodeoxynucleotides with reporter groups attached to the base, in: Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach
  • nucleoside triphosphates modified on the nucleobase or on the ribose for the enzymatic construction of a nucleic acid are also known (EP-A-0063 879, EP-A-0286 898).
  • the functional groups capable of coupling reporter molecules can be blocked by a suitable protective group, so that the coupling of the reporter group can only be carried out after the protective nucleus acid has been removed by so-called "postlabeling".
  • a reporter molecule can also be coupled directly to the functional group, provided that it is stable under the conditions prevailing in nucleic acid synthesis and deprotection.
  • An amino side group capable of coupling reporter molecules can also be introduced to inter-nucleotide phosphate groups by oxidizing the oligonucleotide phosphite triesters or H-phosphonate obtained with a mono-protected diamine to the corresponding phosphoramidate (WO 92/08728 and Agrawal et al., Nucleic Acids Res 18: 5419 (1990).
  • PNA peptidic nucleic acids Due to the increased affinity and selectivity in the base pairing to a complementary nucleic acid counter-strand in comparison to conventional nucleic acids, peptidic nucleic acids (PNA) are becoming increasingly important when carrying out hybridization reactions (Egholm et al., J. Am. Chem. Soc. 114 (1992), 1895-1897, WO92 / 20 702 and WO 92/20 703).
  • the sugar phosphate backbone of the nucleic acids is replaced by a peptide backbone, e.g. B. replaced a 2 -aminoethylglycine backbone.
  • the nucleobases are on the central nitrogen atom z. B. coupled via a methylene carbonyl group.
  • the synthesis of a PNA therefore differs significantly from DNA synthesis, since other protective groups and coupling chemistries are required.
  • the introduction of functional groups for further derivatizations, e.g. B. for the introduction of reporter molecules, has so far been carried out directly at the N-terminus of the last PNA building block or after further coupling of one or more ⁇ -amino acids.
  • a terminal introduction of functional groups was also possible by incorporating lysine residues at the C- and N-terminus.
  • a first embodiment of the present invention relates to monomeric building blocks for the synthesis of nucleic acid-binding peptide oligomers which carry a labeling group or a group capable of coupling to a labeling group on the nucleobase.
  • Such monomers are preferably represented by compounds of the formula (I):
  • B is a natural or unnatural nucleobase which may have a protective group
  • L is a labeling group, preferably selected from signaling groups, intercalators and pharmaceutically active groups, or a group capable of coupling to a labeling group, which optionally carries a protective group,
  • A, C, D each independently represent chemical bonds or organic radicals
  • E is a group selected from N, R 1 ⁇ or CH, where R 1 is an organic radical or hydrogen, Q is a group NR 2 Y, where R 2 is an organic radical or hydrogen, and Y is a protective group or a carrier ,
  • I is a group selected from COX, CSX, SOX or S0 2 X, where X is OH, SH, OM, SM or a protective group and M is a cation, preferably a metal or ammonium cation and n is an integer from 1 to 3 , preferably 1.
  • A, C and D are preferably can carry C L -C alkylene, alkenylene or alkynylene, which may optionally contain heteroatoms such as 0, N, P, or halogen and / or substituents.
  • A is particularly preferably a - (CH 2 ) i-CO radical, where 1 is an integer from 0 to 5.
  • A is most preferably a -CH 2 CO radical.
  • C is particularly preferred - (CH 2 ) k -CHR 'radical, ..- where k is an integer from 0 to 5 and R' is hydrogen or the side chain is a naturally occurring amino acid.
  • C is most preferably a - (CH 2 ) 2 radical.
  • D is particularly preferably a (CH 2 ) m-CHR "radical, where m is an integer from 0 to 5 and R is hydrogen or the side chain of a naturally occurring amino acid.
  • D is most preferably a -CH 2 radical.
  • a and B or A and D can also be bridged to one another, ie form a common ring structure.
  • the present invention relates to monomeric building blocks for the synthesis of nucleic acid-binding peptide oligomers which contain at least one signaling group on the peptide backbone.
  • These monomer units are preferably compounds of the formula (II):
  • L is a labeling group, preferably selected from signaling groups, intercalators and pharmaceutically active groups and n and m are 0 or 1 to 3, with the proviso that the sum of n + m is not 0. N and m are preferably 0 or 1.
  • the group L is preferably a substituent of D.
  • D is particularly preferably a group -CH (R'-L), where R 'is an organic radical as defined above.
  • R ' is the rest of the side chain of a naturally occurring amino acid or the corresponding enantiomeric compound, e.g. B. Lysine.
  • the asymmetric carbon atom of the group -C * H (R'-) preferably has the D configuration.
  • the nucleobase of the compounds (I) and (II) is any natural or unnatural nucleobase, it being possible in principle to use all nucleobases which are capable of hybridizing with a complementary natural nucleobase on a DNA or RNA molecule.
  • Nucleobase B is preferably selected from thymine, uracil, cytosine, adenine, guanine, hypoxanthine, purine, 7-deazapurine, 2,4-diaminopurine, 2,6-diaminopurine, 7-deazaguanine, pseudouracil, pseudocytosine, pseudoisocytosine, N 4 N 4 -ethanocytosine, N 6 , N 6 -ethano-2, 6-diamino-purine, 5- (C 3 -C 6 ) -alkynylcytosine, 5-fluorouracil or 2-hydroxy-5-methyl-4-triazolopyrimidine, where the nucleobase may have a protective group.
  • the nucleobase B preferably carries one or more protective groups, in particular on exocyclic amino functions.
  • a protecting group according to the present invention is a chemical group which prevents the functional group to which it is attached from participating in a chemical reaction which is not desired.
  • the protective group can be removed from this functional group without destroying it.
  • Suitable protective groups are base-labile protective groups such as. B. 9-fluorenylmethoxycarbonyl (Fmoc), 2,2- [bis (4-nitrophenyl)] ethoxycarbonyl (Bnpeoc), 2- (2,4-dinitrophenyl) ethoxycarbonyl (Dnpeoc), 2- (4-nitrophenyl ) -ethyloxycarbonyl, 1- (4, 4-dimethyl-2, 6-dioxocyclohexylidene) ethyl (Dde) and 2-methylsulfonylethyloxycarbonyl (Msc).
  • Fmoc 9-fluorenylmethoxycarbonyl
  • Bnpeoc 2,2- [bis (4-nitrophenyl)] ethoxycarbonyl
  • Dnpeoc 2- (2,4-dinitrophenyl) ethoxycarbonyl
  • Acid-labile protecting groups of the urethane type such as tert-butyloxycarbonyl (Boc), 4-methoxybenzyloxycarbonyl (Moz) or of the trityl type such as triphenylmethyl (Trt), (4-methoxyphenyl) diphenylmethyl (Mmt), (4 -Methylphenyl) diphenylmethyl (Mtt), di- (4-methoxyphenyl) phenylmethyl (Dmt) suitable.
  • Boc, Trt, Mmt, Mtt and Dmt are particularly preferred.
  • the group L is coupled to the nucleobase B.
  • Preferred coupling positions are as follows: If the nucleobase is a pyrimidine base (C, T, U or an unnatural derivative thereof), the group L can preferably be bound to the C-5 position. If the nucleobase is a cytosine or a derivative thereof, the group L can preferably be bound to the N-4 position. If the nucleobase is a purine base (A, G or a derivative thereof), the Group L should preferably be attached to the C-8 position. If the nucleobase is adenine or a derivative thereof, the group L can preferably be bound to the N-6 position.
  • the group L can preferably be bound to the N-2 position. If the nucleobase is a 7-deazapurine, the group L can preferably be bound to the C-7 position.
  • the nucleobase is particularly preferably a pyrimidine base and the group L is bound to the C-5 position.
  • Group L is a group preferably selected from signaling groups, intercalators and pharmaceutically active groups or a group capable of coupling to one of the aforementioned groups.
  • Group L can carry one or more protecting groups if necessary to prevent undesired reactions under the conditions prevailing during PNA synthesis.
  • the group L is preferably coupled to the nucleobase B via a bond which is stable under conditions in which the intermediate protective groups used for the particular synthesis strategy are split off.
  • L is preferably not an exocyclic amino function directly protected by a base-labile protective group.
  • an exocyclic amino function is understood to mean an amino function located directly (i.e. not via a linker) on the heterocycle.
  • Group L is preferably a signaling group or a reporter molecule. All previously known signaling groups for polypeptides and nucleotides, in particular non-radioactive signaling groups, are suitable for this. Examples of such groups are chromogens (fluorescent or luminescent groups, dyes), enzymes, NMR-active groups or metal particles, haptens, e.g. As digoxigenin, or biotin and derivatives thereof, which are bindable with streptavidin or avidin. Furthermore, the marking group can also have a pho- to be activatable cross-linking group, e.g. B. an azido or aziring group.
  • Particularly preferred signal-generating groups are metal chelates detectable by electrochemiluminescence, particularly preferably ruthenium chelates, e.g. B. a ruthenium (bispyridyl) 3 2+ chelate.
  • ruthenium labeling groups are described, for example, in EP-A-0580 979, WO 90/053 01, WO 90/11 511 and WO 92/14 138. These documents are .. 'up due to the reference into the present description.
  • the group L can also be an intercalator, which can be incorporated into a PNA-nucleic acid hybrid and, if necessary, in this way enables its detection.
  • Suitable intercalators are e.g. B. thiazole orange, ethidium bromide 15 or propidium iodide.
  • the group L can be a pharmaceutically active group, e.g. B. an RNA-cleaving group, such as an imidazole-containing radical (cf. WO 93/17 7117, DE-A-44 25 20 311, WO 96/07 667) or a group which has the pharmacodynamic or pharmacokinetic properties can improve (WO94 / 068 15).
  • an RNA-cleaving group such as an imidazole-containing radical (cf. WO 93/17 7117, DE-A-44 25 20 311, WO 96/07 667) or a group which has the pharmacodynamic or pharmacokinetic properties can improve (WO94 / 068 15).
  • marker groups can be introduced into the monomer unit before the synthesis of the nucleic acid-binding oligomers, provided that they are compatible with the conditions prevailing in the particular synthesis strategy. Compatibility can
  • oligomer 30 can be achieved or / and improved by inserting appropriate groups on functional protective groups such as amino or OH groups of the labeling groups.
  • functional protective groups such as amino or OH groups of the labeling groups.
  • suitable groups that are stable during oligomer synthesis are luminescent metal chelates such as ruthenium
  • the group L can also be a residue which is capable of coupling to a labeling group.
  • suitable residues are reactive groups such as amino groups or active esters, which are preferably connected to the nucleobase or the peptide backbone via suitable linkers.
  • L in this case preferably has the structure -R '-NHY, where R' is a C 2 -C 10 alkylene, alkenylene or alkynylene radical which optionally contains heteroatoms and Y is a protective group.
  • nucleic acid-binding peptide oligomers are compounds composed of several monomeric building blocks, the linkage of the building blocks being at least partly via peptide bonds or other acid amide bonds (e.g. CONH, CONR 2 , CSNH, CSNR 2 , SONH, SONR 2 , S0 2 NH or S0 2 NR 2 , where R 2 is as previously defined).
  • These oligomers can also bind to nucleic acids via base pairing. Such a base pairing usually takes place through hydrogen bonds between complementary nucleobases.
  • Nucleic acid-binding oligomers can basically bind to nucleic acids in two ways. In the first case, a strand of the nucleic acid-binding oligomer binds to a selected region of a single-stranded nucleic acid, a double strand or duplex being formed. In the second case, two molecules of the nucleic acid-binding oligomer can form a complex with the selected region of a nucleic acid, a triple helix strand or a triplex being formed. Nucleic acid-binding oligomers are, for example, peptidic nucleic acids, as are known from WO92 / 20 702.
  • the present invention not only covers PNA with identical, repeating backbone groups, but also nucleic acid-binding oligomers in which the backbone consists of different monomeric subunits, and as described in WO 95/14 706.
  • Compounds are also covered according to EP-A-0 627 677, where mixed structures of peptide-bound monomers and oligonucleotide subunits are disclosed.
  • compounds are detected as disclosed in 'WO 96/20 212 and EP-A-0 700 928. The aforementioned documents become part of the description by reference.
  • nucleic acid-binding oligomers are peptidic nucleic acids according to formula (III):
  • n is an integer of at least 3
  • x is an integer of 2 to n-1
  • each of the groups B 1 to B n is a nucleobase as previously defined
  • each of the groups C 1 -C n has the meaning (CR 6 R 7 ) y , preferably CR 6 R 7 , CHR 6 CHR 7 or CR 6 R 7 CH 2 , where R 6 is hydrogen and R 7 is selected from the group consisting of the side chains of naturally occurring alpha-amino acids or R 6 and R 7 are selected independently from the group consisting of hydrogen, Ci-Cg-alkyl, aryl, aralkyl, heteroaryl, hydroxy, CVCg-alkoxy, Alkylthio, NR 3 R 4 and SR 5 , where R 3 and R 4 are as defined below and R 5 is hydrogen, or with hydroxy, Alkoxy or Is alkyl, or R 6 and R 7 together are an alicyclic or form a heterocyclic system or is C ⁇ C "CO, CS or CNR 3 ;
  • each of the radicals D ⁇ D has the meaning (CR 6 R 7 ) Z , preferably CR 6 R 7 , CHR 6 CHR 7 or CH 2 CR 6 CR 7 ', where R 6 and R 7 are as previously defined, y and z are integers from 0 to 10, the sum of y + z being at least 2, preferably more than 2 but not more than 10;
  • each of the radicals G ⁇ G " " 1 has the meaning -NR 3 CO-, -NR 3 CS-, -NR 3 SO- or -NR 3 S0 2 in any orientation, where R 3 is as defined below;
  • a 1 -A n is a group of the formula (purple), (Illb), (IIIc) or (Illd) and E ⁇ E "N or R 3 N + or
  • X is 0, S, Se, NR 3 , CH 2 or C (CH 3 ) 2 ,
  • Y is a single bond, O, S or NR 4 ,
  • p and q are each an integer from 0 to 5, the sum p + q preferably not being greater than 5;
  • r and s are each integers from 0 to 5, the sum r + s preferably not being greater than 5;
  • each of the radicals R 8 and R 9 is independently selected from the group consisting of hydrogen, hydroxy, amine, halogen, C 1 -C 4 alkoxy, Alkythio and optionally substituted C ⁇ -C 4 alkyl, the substituents preferably consisting of hydroxy, C-. - C 4 alkoxy or C 1 -C 4 alkylthio groups can be selected;
  • each of R 3 and R 4 is independently selected from the group consisting of hydrogen, C-. - ⁇ alkyl, which is optionally substituted with hydroxy or C x -C 4 alkoxy or C ] , -C 4 alkylthio, hydroxy, Ci-Cg alkoxy, Alkythio and amine;
  • Q 'and I' are independently selected from the group consisting of NH 2 , CONH 2 , COOH, hydrogen, -Alkyl, an amine blocked by a protective group, marking groups, intercalators, chelators, peptides, proteins, carbohydrates, lipids, steroids, nucleosides, nucleotides, nucleoside diphosphates, nucleoside triphosphates, oligonucleotides including oligoribonucleotides and oligodeoxyribonucleosides, and oligodeoxyribonucleotides insoluble polymers and nucleic acid binding groups and
  • nucleic acid binding oligomers comprise at least one monomeric subunit of the general formula (IV):
  • B is a nucleobase as previously defined
  • k, 1 and m are independently an integer from 0 to 5
  • R 7 is selected from the group consisting of hydrogen and the side chains of naturally occurring alpha-amino acids.
  • PNA building blocks The synthesis of PNA building blocks according to the invention is described using the example of the nucleobase thymidine, into which an allylamino group has been introduced, which is used for coupling to other groups, e.g. B. marker groups such as Ru (bipyrid-yl) 3 f is.
  • uracil-1-methyl acetate (2) was prepared starting from uracil (1) and methyl bromoacetate, which was then saponified to the corresponding sodium salt (3) with sodium hydroxide solution.
  • the desired amino-modified thymine PNA building block (11) was obtained by ester.
  • the Z-protected D-Lys-Thy ⁇ nin building block 12 which bears a group capable of coupling on the peptide backbone (FIG. 3), is a known compound which has hitherto been used to produce PNA sequences with improved solubility.
  • the PNA synthesis was carried out according to the method described in T. Koch et al. , Automated PNA Synthesis, Int. J. Peptide Protein Res., In press, presented on an ABI433A peptide synthesizer.
  • the nucleic acid-binding oligomers according to the invention can of course be synthesized in various ways.
  • a Boc / Z protecting group strategy is used in the examples of the present application, i. H. the intermediate protecting group of the PNA monomer building blocks is Boc (cleavage with trifluoroacetic acid), the nucleobases are protected with Z (benzyloxycarbonyl; cleavage with trifluoromethanesulfonic acid / trifluoroacetic acid mixture).
  • the amino groups present on the modified monomers according to the invention can also be protected with Z in this synthesis strategy.
  • base-labile intermediate amino protecting groups are used for PNA synthesis, especially Fmoc.
  • the nucleobases are with protected against base compatible protective groups, e.g. B. Monomethoxytrityl, Boc etc.
  • the additional amino group introduced by the modification according to the invention and to be permanently protected during the synthesis can also be protected here with monomethoxytrithyl or Boc.
  • nucleic 'ynoic Acid binding peptidic oligomer which contains at least one monomeric building block of the pelt gekop- a marker group to a nucleobase and / or contains to the peptide backbone.
  • the nucleic acid-binding oligomer preferably contains at least one monomeric building block selected from compounds of the formula (I) and (II).
  • the oligomer according to the invention when hybridized with a complementary nucleic acid (1), the resulting hybrid, which can be a double strand or a triple strand, has a higher melting point than a hybrid which contains an oligomer with the same sequence but without a labeling group, or (2) weaker destabilization takes place in a PNA-nucleic acid hybrid than in a nucleic acid-nucleic acid hybrid.
  • the oligomer according to the invention can contain several identical or different marker groups and, in addition, can also be coupled to other identical or different marker groups at the N- and C-terminus.
  • the oligomer according to the invention is particularly preferably a peptide nucleic acid and has a structure of the general formula
  • the PNA preferably contains at least one monomeric building block of the general formula
  • the nucleic acid-binding oligomers according to the invention are used for hybridization to nucleic acids.
  • methods for the detection and / or isolation of nucleic acids come into consideration, for. B. Diagnostic detection methods.
  • the oligomers according to the invention, especially when L is a pharmaceutically active group, also in therapeutic processes, e.g. B. can be used as antisense molecules.
  • the invention also relates to reagents and reagent kits for hybridization with nucleic acids which, in addition to other test components, contain a nucleic acid-binding oligomer according to the invention.
  • SEQ ID NO. 1 the nucleotide sequence of a Chla ydien probe
  • SEQ ID NO. 2 the nucleotide sequence of a reference or counter-strand probe to that in SEQ ID NO. 1 sequence shown
  • FIG. 1 the schematic representation of synthesis strategies with which the production of monomer building blocks according to the invention is not successful
  • FIG. 2 shows the schematic representation of a synthesis strategy with which the monomer building blocks according to the invention (for example 11) can be produced
  • FIG. 3 shows the structure of a PNA monomer (12) which is suitable for introducing marker groups on the peptide backbone
  • FIG 4 the structures of PNA monomers, linkers, labeling groups and a synthetic support resin.
  • Lithium hydroxide stirred overnight at room temperature.
  • MBHA resin (Novabiochem; 0.56 mmol / g) is left to swell in dichloromethane overnight. It is then filtered off and washed with 5% diisopropylethylamine solution in N-methylpyrrolidone (NMP). Then 0.77 ml of 0.26 M N t are added.
  • the PNA synthesis takes place on an ABI 433A peptide synthesizer from Applied-Biosystems with modified software.
  • the syntheses are carried out in 5 ⁇ mol amounts in a 3 ml reaction vessel.
  • a smaller measuring loop 150 ⁇ l is used.
  • the monomer blocks are dissolved in NMP and injected into individual cartridges (140 ⁇ l, 0.26 M).
  • the MBHA carrier material derivatized with Boc-Gly is filled into the 3 ml reaction vessel and attached to the synthesizer.
  • Trifluoroacetic acid / m cresol 95: 5 (2 x 180 sec); Bottle position 2) is used to split off the Boc protecting group.
  • the coupling time is 10 min, the monomer concentration during the coupling is 0.08 M.
  • a capping module with acetic anhydride / NMP / pyridine 1:25:25 (1 min; bottle position 4).
  • Each synthesis cycle is completed with an NMP wash module.
  • a dichloromethane wash module follows to dry the resin.
  • the couplings of the modified building blocks in particular are checked by a qualitative Kaiser test.
  • the PNA is separated from the resin and the protective groups in a manual step outside the device in a closable glass frit.
  • the resin is first washed with trifluoroacetic acid (TFA), then shaken for 1.5 hours
  • the analysis of the purified PNAs is carried out mass spectrometrically with MALDITOF-MS. 0
  • the PNA 20 is produced according to the synthesis method described above (Example 8), using component 11 as the 0 coupling component at position 12.
  • the terminal Boc protective group is split off with TFA / m-cresol 95: 5 (180 sec).
  • the resin is then washed with successive NMP and dichloromethane washes.
  • the terminal amino function is then acetylated with acetic acid / anhydride / pyridine / NMP 1: 2: 2 (1 hour).
  • the capping solution is then suctioned off and washed with NMP and dichloromethane. Cleavage and HPLC purification are carried out as described above (Example 8).
  • MALIDOTF-MS 5545.9 ( ⁇ 0.005%).
  • a 43 OD 260 aliquot of the purified PNA is evaporated to dryness.
  • the PNA is then dissolved in 0.1 M NaHC0 3 buffer pH 8.5 (1 ml).
  • the pH is checked and, if necessary, readjusted, then 2 mg of N-hydroxysuccinimide ester of Ru 5 (bipyridyl) 3 acid (Boehringer Mannheim, Ident No. 171 74 64) are dissolved in 1 ml of DMSO and shaken overnight to give the released amino function of the incorporated building block 11 to mark. It is then dialyzed against water (1000 MWCO, SpectraPor 6).
  • building block 12 The synthesis of building block 12 is carried out as in G. Haaima et al. , Appl. Chem., 1996, 108, 2068-2070.
  • the PNA 21 is produced according to the synthetic method described above (Example 8) using the building block 12 as the twelfth coupling building block (5 ⁇ mol scale). Yield: 114 OD 260 MS (MALDITOF): 6228.0 ( ⁇ 0.02%)
  • the sequence is derived from a chlamydial probe (with the basic nucleotide sequence given in SEQ ID NO. 1 as shown in FIG. 15):
  • Ru-U is the built-in building block 11, which was post-labeled with Ru (bpy) 3 -OSu on the amino function at C-5 by Uracil.
  • T Lys-Ru is the built-in building block 12, which has been post-labeled with Ru (bpy) 3 -OSu on the amino function of the lysine in the backbone.
  • Ru-Lys, Ru, Bio and Ado have the meaning shown in Fig. 4.
  • oligonucleotides (with the basic nucleotide sequence given in SEQ ID NO.2 as shown in FIG. 13 or SEQ ID NO 1 as shown in FIG. 14) are synthesized as reference or counter strand according to the standard phosphoramidite method:
  • Ru-U is the built-in DNA analogue to building block 11, which was post-labeled with Ru (bpy) 3 -OSu on the amino function at C-5 of the uracil.
  • the 5 'terminal Ru and Bio are each coupled via the corresponding phosphoramidite derivative.
  • the melting temperatures of hybrids of two complementary oligomers are determined on a Uvikon 931 spectral photometer from Kontron.
  • the temperature of the cuvette blocks is controlled by a Haake DC5 heating / cooling thermostat,
  • the internal T m control is carried out in a cuvette using a PDIO thermal sensor.
  • a contra software is used. It is measured in steps of 0.5 ° C. in 100 mM NaCl, 10 mM Na phosphate, 0.1 mM EDTA, pH 7 as a melting curve buffer. Both oligomers are used in equimolar amounts.
  • the final oligomer concentration is 2.5 nmol / ml.
  • Tm experiments are carried out.
  • the Tm values are summarized in Tab. 1.
  • the Tm of the DNA-DNA duplex is 56 ° C. While 5 'biotinylation leaves the Tm practically unaffected (55.9 ° C), 5' ruthenylation leads to a slightly increased Tm of 56.7 ° C by 0.7 ° C. The same picture is shown in the DNA-PNA duplex.
  • the unlabeled PNA-DNA duplex has a Tm of 73.5 ° C, amino-terminal biotinylation of the PNA does not affect stability (73.5 ° C), amino-terminal ruthenylation also leads to an increase in stability of 0.7 ° C to 74.2 ° C.
  • Ru labeling on an internal Lys amino function provides the same gain in stability from 0.7 ° C to 74.2 ° C as amino terminal Ru installation.
  • Internal Ru labeling at the C-5 position of the uracil (component 11) even leads to the highest stabilization from 1.5 ° C to 75.0 ° C. It was also surprising to find that internal Ru labeling at the C-5 base position of the uracil in DNA-DNA duplexes leads to a slight de-stabilization of the double strand, while analogous internal labeling of the PNA leads to a stabilization of the PNA-DNA - duplexes leads.
  • MOLECULE TYPE Other nucleic acid
  • SEQUENCE DESCRIPTION SEQ ID NO: 1:

Abstract

Die Erfindung betrifft neue Monomerbausteine zur Markierung peptidischer Nukleinsäuren und ähnlich aufgebauter Nukleinsäure-bindender Oligomere mit Gruppen, die an eine Nukleobase oder/und an das Peptidrückgrat der peptidischen Nukleinsäure gekoppelt sind. Weiterhin betrifft die Erfindung peptidische Nukleinsäuren, die mindestens einen markierten monomeren Baustein enthalten.

Description

Neue Monomerbausteine zur Markierung von peptidischen Nukleinsäuren
Beschreibung
Die Erfindung betrifft neue Monomerbausteine zur Markierung peptidischer Nukleinsäuren und ähnlich aufgebauter Nukleinsäure-bindender Oligomere mit Gruppen, die an eine Nukleobase oder/und an das Peptidrückgrat der peptidischen Nukleinsäure gekoppelt sind. Weiterhin betrifft die Erfindung peptidische Nukleinsäuren, die mindestens einen markierten monomeren Baustein enthalten.
Die chemische Einführung von Markierungsgruppen, z. B. Reportermolekülen in Nukleinsäuren ist für viele Anwendungen von großer Bedeutung. Voraussetzung ist hier der gezielte Einbau von kopplungsfähigen Gruppen, z. B. Aminogruppen, in die Nukleinsäure. Dazu werden speziell modifizierte monomere Nukleo- tidbausteine hergestellt, die zu der anschließend angewandten Nukleinsäuresynthesestrategie kompatibel sind. So werden in der Nukleinsäurechemie z. B. Trifluoracetyl- oder Fmoc-ge- schützte Aminoalkyloxy-Phosphoramidite für eine 5 ' -Endmarkierung verwendet (vgl. z. B. EP-A-224 578, Coull et al . , Tetra- hedron Lett . 27 (1986), 3991 - 3994). Für Markierungen innerhalb eines Nukleinsäuremoleküls wurden Phosphoramidite verwendet, die eine Trifluoracetyl- oder Fmoc-geschützte Aminosäuregruppe und einen DMTr-Ether enthalten, wobei die Grundkörper nichtnukleotidischer Natur (EP-A-0 313 219, Nelson et al . , Nucleic Acids Res . 17 (1989, 7179-7186) oder nukleotidi- scher Natur (Ruth, DNA 4 (1985), 93, WO 84/03285) sein können. Im Falle eines nukleotidischen Grundkörpers kommen für die Kopplung von Reportermolekülen bestimmte Positionen der Nukleobase bzw. des Zuckers in Frage (vgl. z. B. Ruth (1991) Oligodeoxynucleotides with reporter groups attached to the base, in: Oligonucleotides and Analogues : A Practical Approach
(F. Eckstein, HRSG), Oxford University Press, Oxford, UK, pp . 255 - 282 und Manoharan et al . , Tetrahedron Lett . 36 (1995), 3647 - 3650) .
Entsprechende an der Nukleobase oder an der Ribose modifi- zierte Nukleosidtriphosphate zum enzymatischen Aufbau einer Nukleinsäure sind ebenfalls bekannt (EP-A-0063 879, EP-A-0286 898) .
Die funktioneilen, zur Kopplung von Reportermolekülen fähigen Gruppen können durch eine geeignete Schutzgruppe blockiert sein, so daß die Kopplung der Reportergruppe erst nach einer Schutzgruppenentfernung der synthetisierten Nukleinsäure durch ein sogenanntes "Postlabeling" durchgeführt werden kann. Ein Reportermolekül kann aber auch direkt an die funktioneile Gruppe angekoppelt sein, sofern es unter den bei der Nuklein- säuresynthese und der Schutzgruppeentfernung herrschenden Bedingungen stabil ist. Eine zur Kopplung von Reportermolekülen fähige Aminoseitengruppe kann im übrigen auch an inter- nukleotidischen Phosphatgruppen eingeführt werden, indem die erhaltenen Oligonukleotidphosphittriester oder H-Phosphonat mit einem monogeschützten Diamin zum entsprechenden Phosphoramidat oxidiert werden (WO 92/08728 und Agrawal et al., Nucleic Acids Res. 18 (1990), 5419).
Bei Hybridisierung von Nukleinsäuren, die innerhalb des Stranges mit Reportermolekülen gekoppelt sind, wird im allgemeinen eine Erniedrigung der Schmelztemperatur Tm nach Anhybridi- sierung eines komplementären Nukleinsäuregegenstrangs gefunden. Diese Erniedrigung der Schmelztemperatur kann in manchen Fällen zu Problemen für die Spezifität und Sensitivität von Nukleinsäure-Hybridisierungsverfahren führen.
Durch die erhöhte Affinität und Selektivität in der Basenpaarung zu einem komplementären Nukleinsäuregegenstrang im Ver- gleich zu üblichen Nukleinsäuren gewinnen peptidische Nukleinsäuren (PNA) eine immer größere Bedeutung bei der Durchführung von Hybridisierungsreaktionen (Egholm et al . , J. Am. Chem. Soc. 114 (1992), 1895 - 1897, WO92/20 702 und WO 92/20 703). Bei den PNA ist das Zuckerphosphat-Rückgrat der Nukleinsäuren durch ein peptidisches Rückgrat, z. B. ein 2 -Aminoethylglycin- Rückgrat ersetzt. Die Nukleobasen sind am zentralen Stick- stoffatom z. B. über eine Methylencarbonylgruppe angekoppelt. Die Synthese einer PNA unterscheidet sich daher wesentlich von der DNA- Synthese, da andere Schutzgruppen und Kopplungschemien erforderlich sind. Das Einbringen von funktioneilen Gruppen für weitere Derivatisierungen, z. B. zur Einführung von Repor- termolekulen, erfolgte bisher am N-Terminus des letzten PNA- Bausteins direkt oder nach weiteren Ankoppeln einer oder mehrerer ω-Aminosäuren. Auch durch Einbau von Lysinresten am C- und am N-Terminus war eine terminale Einführung von funktiona- lisierbaren Gruppen möglich.
Da durch diese terminale Markierung nur eine begrenzte Anzahl von Reportermolekülen in PNA eingeführt werden kann, besteht ein großes Bedürfnis nach alternativen Methoden zur Einführung von Markierungsgruppen in PNA.
Diese Aufgabe wird durch die vorliegende Erfindung dadurch gelöst, daß neue Monomerbausteine für die PNA-Synthese bereitgestellt werden, die die Einführung von Markierungsgruppen innerhalb des Stranges von PNA-Molekülen erlauben, wobei die Markierungsgruppe an eine Nukleobase und/oder an ein Peptidrückgrat gekoppelt wird.
Überraschenderweise wurde dabei festgestellt, daß bei Markierung von PNA an Nukleobasen und am Peptidrückgrat ein Anstieg der Schmelztemperatur von Hybriden mit einer Nukleinsäure gegenüber Hybriden mit nichtmarkierten PNA-Strängen auftritt oder zumindest eine schwächere Destabilisierung als bei einem entsprechenden DNA-DNA-Hybrid mit einem markierten DNA-Strang auftritt. Diese überraschende Schmelzpunkterhöhung führt bei Hybridisierungsreaktionen zu einer erhöhten Spezifität und erlaubt in Nachweisverfahren die Verwendung stringenterer Waschbedingungen und/oder kürzerer Sonden. Eine erste Ausfuhrungsform der vorliegenden Erfindung betrifft monomere Bausteine zur Synthese von Nukleinsäure-bindenden peptidischen Oligomeren, die eine Markierungsgruppe oder eine zur Kopplung mit einer Markierungsgruppe fähige Gruppe an der Nukleobase tragen. Derartige Monomere werden vorzugsweise durch Verbindungen der Formel (I) dargestellt:
B
A ι
E ( i :
D
Q
worin:
B eine natürliche oder nichtnatürlich Nukleobase ist, die gegebenenfalls eine Schutzgruppe trägt,
L eine Markierungsgruppe vorzugsweise ausgewählt aus signalgebenden Gruppen, Intercalatoren und pharmazeutisch wirksamen Gruppen oder eine zur Kopplung mit einer Markierungsgruppe fähige Gruppe ist, die gegebenenfalls eine Schutzgruppe trägt,
A, C, D jeweils unabhängig voneinander chemische Bindungen oder organische Reste darstellen,
E eine Gruppe ausgewählt aus N, R1^ oder CH ist, wobei R1 ein organischer Rest oder Wasserstoff ist, Q eine Gruppe NR2Y ist, wobei R2 ein organischer Rest oder Wasserstoff ist, und Y eine Schutzgruppe oder ein Träger ist,
I eine Gruppe ausgewählt aus COX, CSX, SOX oder S02X ist, wobei X OH, SH, OM, SM oder eine Schutzgruppe ist und M ein Kation, vorzugsweise ein Metall- oder Ammoniumkation ist und n eine ganze Zahl von 1 bis 3, vorzugsweise 1 ist. A, C und D sind vorzugsweise C-L-C^-Alkylen- , Alkenylen- oder Alkinylenreste, die gegebenenfalls Heteroatome wie 0, N, P oder Halogen oder/und Substituenten tragen können.
A ist besonders bevorzugt ein - (CH2) i-CO-Rest , wobei 1 eine ganze Zahl von 0 bis 5 ist. Am meisten bevorzugt ist A ein -CH2C0-Rest. C ist besonders bevorzugt - (CH2) k-CHR' -Rest , ..-wobei k eine ganze Zahl von 0 bis 5 ist und R' Wasserstoff oder die Seitenkette eine natürlich vorkommenden Aminosäure ist. Am meisten bevorzugt ist C ein - (CH2) 2-Rest . D ist besonders bevorzugt ein (CH2) m-CHR' ' -Rest , wobei m eine ganze Zahl von 0 bis 5 ist und R Wasserstoff oder die Seitenkette einer natürlich vorkommenden Aminosäure ist. Am meisten bevorzugt ist D ein -CH2-Rest. Alternativ können A und B oder A und D auch miteinander verbrückt sein, d. h. eine gemeinsame Ringstruktur ausbilden.
In einem weiterem Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung monomere Bausteine zur Synthese von Nucleinsäure-bindenden peptidischen Oligomeren, die mindestens eine signalgebende Gruppe am Peptidrückgrad enthalten. Vorzugsweise sind diese Monomerbausteine Verbindungen der Formel (II) :
B t A t
E
/ (II)
D — I
worin:
B, A, C, D, E, Q und I wie für die Verbindungen (I) definiert sind,
L eine Markierungsgruppe vorzugsweise ausgewählt aus signalgebenden Gruppen, Intercalatoren und pharmazeutisch wirksamen Gruppen ist und n und m 0 oder 1 bis 3 sind, mit der Maßgabe, daß die Summe von n + m nicht 0 ist. Vorzugsweise sind n und m 0 oder 1.
Bei den Verbindungen der Formel (II) ist die Gruppe L vorzugsweise ein Substituent von D. Besonders bevorzugt ist D eine Gruppe -CH(R'-L), wobei R' ein organischer Rest wie zuvor definiert ist. Am meisten bevorzugt ist R' der Rest der Seitenkette einer natürlich vorkommenen Aminosäure oder der ent- sprechenden enantiomeren Verbindung, z. B. Lysin. Das asymmetrische C-Atom der Gruppe -C*H(R'- ) weist vorzugsweise die D-Konfiguration auf.
Die Nukleobase der Verbindungen (I) und (II) ist eine belie- bige natürliche oder nichtnatürliche Nukleobase, wobei grundsätzlich alle Nukleobasen geeignet sind, die zur Hybridisierung mit einer komplementären natürlichen Nukleobase auf einem DNA- oder RNA-Molekül in der Lage sind. Vorzugsweise ist die Nukleobase B ausgewählt aus Thymin, Uracil, Cytosin, Adenin, Guanin, Hypoxanthin, Purin, 7-Deazapurin, 2 , 4-Diaminopurin, 2 , 6-Diaminopurin, 7-Deazaguanin, Pseudouracil , Pseudocytosin, Pseudoisocytosin, N4,N4-Ethanocytosin, N6,N6-Ethano-2 , 6-diamino- purin, 5- (C3-C6) -Alkinylcytosin, 5-Fluoruracil oder 2-Hydroxy- 5-methyl-4 -triazolopyrimidin, wobei die Nukleobase gegebenen- falls eine Schutzgruppe trägt.
Da im Stand der Technik zahlreiche Varianten für die Grundstruktur von PNA-Monomeren bekannt sind, können die Reste A, C, D, E, Q und I eine Vielzahl bekannter Bedeutungen annehmen. Insbesondere wird hinsichtlich der Bedeutung dieser Reste auf die Dokumente WO 92/20 702, WO 92/20 703, DE-A-43 31 012, DE- A-44 08 531, DE-A-44 08 533, DE-A-44 25 311 und EP-A-0 739 898 verwiesen. Die relevanten Passagen dieser Dokumente betreffend die Bedeutung der o. g. Reste werden durch die Bezugnahme zum Teil der vorliegenden Beschreibung. Die Nukleobase B trägt vorzugsweise eine oder mehrere Schutzgruppen, insbesondere an exozyklischen Aminofunktionen.
Eine Schutzgruppe gemäß vorliegender Erfindung ist eine che- mische Gruppe, die verhindert, daß die funktioneile Gruppe, an die sie gebunden ist, an einer chemischen Reaktion teilnimmt, die nicht erwünscht ist. Die Schutzgruppe kann von dieser funktionellen Gruppe entfernt werden, ohne sie zu zerstören.
Beispiele für geeignete Schutzgruppen sind basenlabile Schutzgruppen wie z. B. 9-Fluorenylmethoxycarbonyl (Fmoc) , 2,2- [Bis (4-nitrophenyl) ] -ethoxycarbonyl (Bnpeoc) , 2- (2 , 4-Dinitro- phenyl) -ethoxycarbonyl (Dnpeoc) , 2- (4-Nitrophenyl) -ethyloxy- carbonyl, 1- (4 , 4-Dimethyl-2 , 6-dioxocyclohexyliden) ethyl (Dde) und 2 -Methylsulfonylethyloxycarbonyl (Msc) . Von diesen Schutzgruppen besonders bevorzugt ist Fmoc. Weiterhin sind auch säurelabile Schutzgruppen vom Urethantyp wie tert-Butyloxycar- bonyl (Boc) , 4-Methoxybenzyloxy-carbonyl (Moz) oder vom Tri- tyltyp wie Triphenylmethyl (Trt) , (4-Methoxyphenyl) diphenyl- methyl (Mmt) , (4-Methylphenyl) diphenylmethyl (Mtt) , Di-(4-me- thoxyphenyl) phenylmethyl (Dmt) geeignet. Besonders bevorzugt von diesen Schutzgruppen sind Boc, Trt, Mmt, Mtt und Dmt.
Schließlich sind auch Schutzgruppen vom Acyltyp wie Benzoyl -
(Z) , Isobutyryl-, Acetyl-, Phenoxyacetyl- , 4- (t-Butyl) benzoyl , 4- (t-Butyl) -phenoxyacetyl -4- (methoxy) benzoyl geeignet . Zweckmäßigerweise werden solche Schutzgruppen verwendet, die mit der beabsichtigten Oligomersynthesestrategie kompatibel sind.
Bei Verbindungen der Formel (I) ist die Gruppe L an die Nu- kleobase B gekoppelt . Bevorzugte Kopplungspositionen sind wie folgt : Wenn es sich bei der Nukleobase um eine Pyrimidinbase (C, T, U oder ein nichtnatürliches Derivat davon) handelt, kann die Gruppe L vorzugsweise an die C-5 Position gebunden sein. Wenn es sich bei der Nukleobase um ein Cytosin oder ein Derivat davon handelt, kann die Gruppe L vorzugsweise an die N-4 Position gebunden sein. Wenn es sich bei der Nukleobase um eine Purinbase (A, G oder ein Derivat davon) handelt, kann die Gruppe L vorzugsweise an die C-8 Position gebunden sein. Wenn es sich bei der Nukleobase um Adenin oder um ein Derivat davon handelt, kann die Gruppe L vorzugsweise an die N-6 Position gebunden sein. Wenn es sich bei der Nukleobase um eine Purin- base handelt, kann die Gruppe L vorzugsweise an die N-2 Position gebunden sein. Wenn es sich um der Nukleobase um ein 7- Deazapurin handelt, kann die Gruppe L vorzugsweise an die C-7 Position gebunden sein. Besonders bevorzugt ist die Nukleobase eine Pyrimidinbase und die Gruppe L ist an die C-5 Position gebunden .
Die Gruppe L ist eine Gruppe vorzugsweise ausgewählt aus signalgebenden Gruppen, Intercalatoren und pharmazeutisch wirksamen Gruppen oder eine zur Kopplung mit einer der vor- genannten Gruppen fähige Gruppe . Die Gruppe L kann eine oder mehrere Schutzgruppen tragen, sofern dies erforderlich ist, um unerwünschte Reaktionen bei den während der PNA-Synthese herrschenden Bedingungen zu verhindern. Die Gruppe L ist vorzugsweise an die Nukleobase B über eine Bindung gekoppelt, die unter Bedingungen stabil ist, bei denen die für die jeweilige Synthesestrategie verwendeten intermediären Schutzgruppen abgespalten werden. Insbesondere ist L bevorzugt nicht eine direkt durch eine basenlabile Schutzgruppe geschützte exocy- clische Aminofunktion. Unter einer exocyclischen Aminofunktion wird in der vorliegenden Erfindung eine direkt (d.h. nicht über einen Linker) am Heterocyclus sitzende Aminofunktion verstanden.
Vorzugsweise ist die Gruppe L eine signalgebende Gruppe oder ein Reportermolekül. Hierfür geeignet sind alle bisher bekannten signalgebende Gruppen für Polypeptide und Nukleotide, insbesondere nichtradioaktive signalgebende Gruppen. Beispiele für solche Gruppen sind Chromogene (fluoreszierende oder lumi- neszierende Gruppen, Farbstoffe) , Enzyme, NMR-aktive Gruppen oder Metallpartikel, Haptene, z. B. Digoxigenin, oder Biotin und Derivate davon, die mit Streptavidin oder Avidin bindefähig sind. Weiterhin kann die Markierungsgruppe auch eine pho- toaktivierbare Quervernetzungsgruppe sein, z. B. eine Azido- oder Aziringruppe. Besonders bevorzugte signalgebende Gruppen sind durch Elektrochemolumineszenz nachweisbare Metallchelate, besonders bevorzugt Rutheniumchelate, z. B. ein Ruthenium- (bispyridyl) 3 2+Chelat . Geeignete Ruthenium-Markierungsgruppen sind beispielsweise in EP-A-0580 979, WO 90/053 01, WO 90/11 511 und WO 92/14 138 beschrieben. Diese Dokumente werden..'auf- grund der Bezugnahme Bestandteil der vorliegenden Beschreibung.
10
Weiterhin kann die Gruppe L auch ein Intercalator sein, der sich in ein PNA-Nukleinsäurehybrid einlagern kann und auf diese Weise gegebenenfalls dessen Nachweis ermöglicht. Geeignete Intercalatoren sind z. B. Thiazolorange, Ethidiumbromid 15 oder Propidiumiodid.
Weiterhin kann die Gruppe L eine pharmazeutisch wirksame Gruppe sein, z. B. eine RNA-spaltende Gruppe, wie etwa ein Imidazol enthaltender Rest (vgl. WO 93/17 7117, DE-A-44 25 20 311, WO 96/07 667) oder eine Gruppe, welche die pharmakodyna- mischen oder pharmakokinetischen Eigenschaften verbessern kann (WO94/068 15) . Diese Dokumente werden durch Bezugnahme zum Teil der vorliegenden Beschreibung.
25 Bei den Verbindungen der Formel (I) und (II) können Markierungsgruppen bereits vor der Synthese der Nukleinsäure-binden- den Oligomere in den Monomerbaustein eingeführt werden, sofern sie mit den bei der jeweiligen Synthesestrategie herrschenden Bedingungen kompatibel sind. Die Kompatibilität kann gegebe-
30 nenfalls durch Einfügung entsprechender Gruppen an funktionel - len Schutzgruppen wie etwa Amino- oder OH-Gruppen der Markierungsgruppen erreicht oder/und verbessert werden. Beispiele für geeignete Gruppen, die während der Oligomersynthese stabil sind, sind lumineszierende Metallchelate wie etwa Ruthenium
35 (bipyridyl) 3, Biotin oder Fluorescein. Andererseits kann die Gruppe L auch ein Rest sein, der zur Kopplung mit einer Markierungsgruppe fähig ist. Beispiele für geeignete Reste sind reaktive Gruppen wie etwa Aminogruppen oder Aktivester, die vorzugsweise über geeignete Linker mit der Nukleobase oder dem Peptid-Rückgrat verbunden sind. Bei Verbindungen der Formel (I) weist L in diesem Fall vorzugsweise die Struktur -R' -NHY auf wobei R' ein C2-C10 Älkylen- , Alkenylen- oder Alkinylenrest ist, der gegebenenfalls Heteroatome enthält und Y eine Schutzgruppe ist. Besonders bevorzugt ist R' eine -CH=CH-CH2-Gruppe .
Die erfindungsgemäßen Verbindungen der Formeln (I) und (II) können als monomere Bausteine bei der Synthese von Nukleinsäure-bindenden peptidischen Oligomeren eingesetzt werden. Nukleinsäure-bindende peptidische Oligomere sind aus mehreren monomeren Bausteinen zusammengesetzte Verbindungen, wobei die Verknüpfung der Bausteine zumindest teilweise über peptidische Bindungen oder andere Säureamidbindungen (z. B. CONH, CONR2, CSNH, CSNR2, SONH, SONR2, S02NH oder S02NR2, wobei R2 wie zuvor definiert ist) erfolgt. Diese Oligomere können außerdem an Nukleinsäuren über eine Basenpaarung binden. Eine solche Basenpaarung erfolgt üblicherweise durch Wasserstoffbrückenbindungen zwischen komplementären Nukleobasen. Nukleinsäure-bin- dende Oligomere können an Nukleinsäuren grundsätzlich auf zwei Arten binden. Im ersten Fall bindet ein Strang des Nuklein- säure-bindenden Oligomers an eine ausgewählte Region einer einzelsträngigen Nukleinsäure, wobei ein Doppelstrang oder Duplex gebildet wird. Im zweiten Fall können zwei Moleküle des Nukleinsäure-bindenden Oligomers einen Komplex mit der ausge- wählten Region einer Nukleinsäure bilden, wobei ein Tripelhe- lixstrang oder ein Triplex gebildet wird. Nukleinsäure-bin- dende Oligomere sind beispielsweise peptidische Nukleinsäuren, wie sie aus WO92/20 702 bekannt sind. Von der vorliegenden Erfindung erfaßt werden jedoch nicht nur PNA mit identischen, sich wiederholenden Rückgratgruppen, sondern auch Nukleinsäure-bindende Oligomere, bei denen das Rückgrat aus verschiedenen monomeren Untereinheiten besteht, und wie sie in WO 95/14 706 offenbart werden. Weiterhin erfaßt werden Verbindungen gemäß EP-A-0 627 677, wo gemischte Strukturen aus peptid- gebundenen Monomeren und Oligonukleotiduntereinheiten offenbart werden. Außerdem werden Verbindungen erfaßt, wie sie in ' WO 96/20 212 und EP-A-0 700 928 offenbart werden. Die zuvor genannten Dokumente werden durch die Bezugnahme zum Bestandteil der Beschreibung.
Besonders bevorzugte Nukleinsäure-bindende Oligomere sind peptidische Nukleinsäuren gemäß Formel (III) :
Figure imgf000013_0001
worin : n eine ganze Zahl von mindestens 3 ist, x eine ganze Zahl von 2 bis n-1 ist, jede der Gruppen B1 bis Bn eine Nukleobase wie zuvor definiert ist ,
jede der Gruppen C1-Cn die Bedeutung (CR6R7)y, vorzugsweise CR6R7, CHR6CHR7 oder CR6R7CH2 aufweist, wobei R6 Wasserstoff ist und R7 ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus den Seitenketten natürlich vorkommender alpha-Aminosäuren oder R6 und R7 unabhängig ausgewählt werden aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, Ci-Cg-Alkyl, Aryl , Aralkyl , Heteroaryl , Hydroxy, CVCg-Alkoxy,
Figure imgf000013_0002
Alkylthio, NR3R4 und SR5, wobei R3 und R4 wie im folgenden definiert sind und R5 Wasserstoff,
Figure imgf000013_0003
oder mit Hydroxy,
Figure imgf000013_0004
Alkoxy oder Alkyl ist, oder R6 und R7 zusammen ein alicyclisches oder ein heterocyclisches System bilden oder C^C" CO, CS oder CNR3 ist ;
jeder der Reste D^D" die Bedeutung (CR6R7)Z, vorzugsweise CR6R7, CHR6CHR7 oder CH2CR6CR7' aufweist, wobei R6 und R7 wie zuvor definiert sind, y und z ganze Zahlen von 0 bis 10 sind, wobei die Summe von y + z mindestens 2, vorzugsweise mehr als 2 aber nicht mehr als 10 ist;
jeder der Reste G^G""1 die Bedeutung -NR3CO- , -NR3CS-, -NR3SO- oder -NR3S02 in beliebiger Orientierung aufweist, wobei R3 wie im folgenden definiert ist;
ηeder der Reste A1-An und E1-En so ausgewählt sind, daß:
(a) A1-An eine Gruppe der Formel (lila) , (Illb) , (IIIc) oder (Illd) ist und E^E" N oder R3 N+ ist oder
b) A^A" eine Gruppe der Formel (Illd) ist und E1- En CH ist:
Figure imgf000014_0001
Figure imgf000014_0002
worin:
X 0, S, Se, NR3, CH2 oder C(CH3)2 ist,
Y eine Einfachbindung, O, S oder NR4 ist,
p und q jeweils eine ganze Zahl von 0 bis 5 sind, wobei die Summe p + q vorzugsweise nicht größer als 5 ist;
r und s jeweils ganze Zahlen von 0 bis 5 sind, wobei die Summe r + s vorzugsweise nicht größer als 5 ist;
jeder der Reste R8 und R9 unabhängig ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, Hydroxy, Amin, Halogen, C1-C4 Alkoxy,
Figure imgf000015_0001
Alkythio und gegebenenfalls substituiertem Cα-C4 Alkyl, wobei die Substituenten vorzugsweise aus Hydroxy-, C-. - C4-Alkoxy- oder C1-C4-Alkylthiogruppen ausgewählt werden;
jeder der Reste R3 und R4 unabhängig ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, C-,.-^ Alkyl, das gegebenenfalls mit Hydroxy- oder Cx-C4-Alkoxy- oder C],-C4 Alkylthio-substituiert ist, Hydroxy, Ci-Cg Alkoxy,
Figure imgf000015_0002
Alkythio und Amin;
Q' und I' unabhängig ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus NH2, CONH2, COOH, Wasserstoff,
Figure imgf000015_0003
-Alkyl , einem durch eine Schutzgruppe blockierten Amin, Markierungs- gruppen, Intercalatoren, Chelatoren, Peptiden, Proteinen, Kohlehydraten, Lipiden, Steroiden, Nukleosiden, Nukleotiden, Nukleosiddiphosphaten, Nukleosidtriphosphaten, Oligonnukleoti- den einschließlich Oligoribonukleotiden und Oligodeoxyribonu- kleotiden, Oligonukleosiden und löslichen und unlöslichen Polymeren sowie Nukleinsäure-bindenden Gruppen und
xl und yl jeweils eine ganze Zahl von 0 bis 10 ist, wobei die Verbindung dadurch gekennzeichnet ist, daß an mindestens einer Nukleobase oder/und an einer Position des Peptidrückgrats eine Gruppe L wie zuvor definiert vorliegt. Am meisten bevorzugt umfassen die Nukleinsäure-bindenden Oligomere mindestens eine monomere Untereinheit der allgemeinen Formel (IV) :
Figure imgf000016_0001
worin:
B eine Nukleobase wie zuvor definiert ist,
k, 1 und m unabhängig eine ganze Zahl von 0 bis 5 sind,
0 oder 1 ist und
R7 ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff und den Seitenketten von natürlich vorkommenden Alpha- Aminosäuren.
Exemplarisch ist am Beispiel der Nukleobase Thymidin die Synthese von erfindungsgemäßen PNA-Bausteinen beschrieben, in die eine Allylaminogruppe eingeführt wurde, welche zur Kopplung an andere Gruppen, z. B. Markierungsgruppen wie etwa Ru(bipyrid- yl ) 3 f hig ist .
Die Synthese des in der Position C-5 aminomodifizierten Thy- min-PNA-Bausteins gestaltete sich schwierig. Zwei verschiedene Synthesestrategien sind in Fig. 1 und Fig. 2 dargestellt. Gemäß Fig. 1 wurde ausgehend von Uracil (1) und Bromessigsäu- remethylester Uracil-1-Essigsäuremethylester (2) hergestellt, der dann zum entsprechenden Natriumsalz (3) mit Natronlauge verseift wurde. Die Umsetzung von 2 mit Z-geschütztem Allyl- amin 4 über eine oxidative Kupplung mit Pd(OAc)2 und t-Butyl - perbenzoat nach der Methode von Hirota et al . , (Synthesis 5 1987, 495 - 496), in der die Reaktion von Uracil- und Uridin- Derivaten beschrieben ist, gelang nicht. Auch die in der Nu- kleinsäurechemie gebräuchlichste Methode, die C-C-Verknüpfung an der C-5-Position durch direkte Merkurierung von ungeschütztem 2 ' -Deoxyuridin oder -Cytidin und nachfolgende Alkylierung o in Gegenwart von Olefinen (Bergstrom et al . , J. Carbohydrates , Nucleosides, Nucleotides 4 (1977), 257; Bergstrom et al . , J. Am. Chem. Soc . 98 (1976) 1587; Cook et al . , Nucleic Acids Res . 16 (1988), 4077), führte nicht zum Erfolg.
5 Erstaunlicherweise, wie in Fig. 2 ersichtlich, führte gerade die Anwendung einer Modifikation der Heck-Reaktion (Heck, J. Am. Chem. Soc. 90 (1968) , 5518) zur gewünschten C-C-Verknüp- fung führte. Zuerst wurde 5-Joduracil (5) mit Bromessigsäuremethylester zum 5-Jodoruracil-1-essigsäuremethylester (6) 0 alkyliert. Die Heck-Reaktion von 6 mit Z-geschütztem Allylamin in Gegenwart von Pd(0Ac)2 und Triphenylphosphin in absolutem Acetonitril wurde unter Luftausschluß und bei überhöhter Temperatur (110°C Badtemperatur) durchgeführt und ergab die Verbindung (7) zusammen mit einem geringen Anteil des oxidierten 5 Nebenprodukts (8) . Der Methylester (7) wurde dann zur freien
Säure (8) verseift und mit 2-Boc-Aminoethylglycinmethylester
(7) analog mit der Methode von Dueholm et al . , (J. Org . Chem.
59 (1994), 5767) umgesetzt. Nach alkalischer Hydrolyse des
Esters wurde der gewünschte aminomodifizierte Thymin-PNA-Bau- 0 stein (11) erhalten.
Der Z-geschützte D-Lys-Thyτnin-Baustein 12, der eine zur Kopplung fähige Gruppe am Peptidrückgrat trägt (Fig.3) ist eine bekannte Verbindung, die bislang zur Herstellung von PNA Se- 35 quenzen mit verbesserter Löslichkeit Verwendung fand. Die PNA-Synthese erfolgte nach der in T. Koch et al . , Automated PNA Synthesis, Int. J. Peptide Protein Res., im Druck, dargestellten Weise auf einem ABI433A Peptid-Synthesizer . In Fig. 4 sind die eingesetzten kupplungsfähigen Komponenten, die Boc/Z-PNA-Standardmonomere, Ado-Linker, die verwendeten Mar- kierungsgruppen Ru (bpy) 3-Säure, Ru (bpy) 3-Lys) und Biotin) sowie das mit Boc-Gly derivatisierte MBHA-Harz aufgeführt .' Für die Markierung innerhalb des PNA-Strangs wurden die Monomerbausteine 11 (Fig. 2) und 12 (Fig. 3) eingebaut. Die PNA-Oligo- mere wurden über RP18 HPLC gereinigt. PNA-Moleküle, in die die Bausteine 11 oder 12 eingebaut worden waren, wurden mit Ru(bpy)3-OSu in DMSO und wässrigem 0,1 M NaHC03 nachträglich markiert .
Die erfindungsgemäßen Nukleinsäure-bindenden Oligomere können natürlich auf verschiedene Arten synthetisiert werden. So wird in den Beispielen der vorliegenden Anmeldung eine Boc/Z- Schutzgruppenstrategie angewandt, d. h. die intermediäre Schutzgruppe der PNA-Monomerbausteine ist Boc (Abspaltung mit Trifluoressigsäure) , die Nukleobasen sind mit Z (Benzyloxycar- bonyl ; Abspaltung mit Trifluormethansulfonsäure/Trifluoressig- säure-Gemisch) geschützt. Die auf den erfindungsgemäßen modifizierten Monomeren vorhandenen Aminogruppen können bei dieser Synthesestrategie ebenfalls mit Z geschützt werden.
Eine andere Synthesestrategie ist in DE-A-44 08 531 beschrieben. Dort werden schwach säurelabile intermediäre Schutzgruppen im PNA Monomer verwendet, vor allem Monomethoxytrityl . Die Aminogruppen der Nukleobasen sind mit gegen schwache Säuren kompatiblen Schutzgruppen geschützt, z. B. Acylschutzgruppen (Benzoyl, Isobutyryl, Acetyl etc.). Durch die erfindungsgemäße Modifizierung eingeführt zusätzliche Aminosäuren sollten bei dieser Strategie mit Trifluoracetyl oder Fmoc geschützt sein.
Bei der in DE-A-44 08 533 beschriebenen Synthesestrategie werden basenlabile intermediäre Aminoschutzgruppen zur PNA- Synthese verwendet, vor allem Fmoc. Die Nukleobasen sind mit gegen Base kompatiblen Schutzgruppen geschützt, z. B. Monome- thoxytrityl, Boc etc. Die zusätzliche, durch die erfindungsgemäße Modifikation eingeführte und während der Synthese permanent zu schützende Aminogruppe kann hier auch mit Monometho- xytrithyl oder Boc geschützt werden.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Nukle'insäure- bindendes peptidisches Oligomer, welches mindestens einen monomeren Baustein enthält, der eine Markierungsgruppe gekop- pelt an eine Nukleobase oder/und an das Peptidrückgrad enthält. Vorzugsweise enthält das Nukleinsäure-bindende Oligomer mindestens einen monomeren Baustein ausgewählt aus Verbindungen aus der Formel (I) und (II) . Weiterhin ist bevorzugt, daß bei Hybridisierung des erfindungsgemäßen Oligomers mit einer komplementären Nukleinsäure (1) das resultierende Hybrid, welches ein Doppelstrang oder ein Tripelstrang sein kann, einen höheren Schmelzpunkt als ein Hybrid aufweist, das ein Oligomer mit gleicher Sequenz, aber ohne Markierungsgruppe enthält oder (2) eine schwächere Destabilisierung in einem PNA-Nukleinsäure-Hybrid erfolgt als in einem Nukleinsäure- Nukleinsäure-Hybrid.
Das erfindungsgemäße Oligomer kann mehrere gleiche oder unterschiedliche Markierungsgruppen enthalten und darüber hinaus zusätzlich am N- und C-Terminus mit weiteren gleichen oder unterschiedlichen Markierungsgruppen gekoppelt sein. Besonders bevorzugt ist das erfindungsgemäße Oligomer eine peptidische Nukleinsäure und weist eine Struktur der allgemeinen Formel
(III) wie zuvor definiert auf. Die PNA enthält vorzugsweise mindestens einen monomeren Baustein der allgemeinen Formel
(IV) wie zuvor definiert.
Die erfindungsgemäßen Nukleinsäure-bindenden Oligomere werden zur Hybridisierung an Nukleinsäuren eingesetzt. Dabei kommen einerseits Verfahren zum Nachweis oder/und Isolierung von Nukleinsäuren in Betracht, z. B. diagnostische Nachweisverfahren. Andererseits können die erfindungsgemäßen Oligomere, insbesondere wenn L eine pharmazeutisch wirksame Gruppe ist, auch in therapeutischen Verfahren, z. B. als Antisense-Mole- küle eingesetzt werden.
Noch ein Gegenstand der Erfindung sind Reagenzien und Reagenzienkits zur Hybridisierung mit Nukleinsäuren, die neben anderen Testkomponenten ein erfindungsgemäßes Nukleinssäure.-bindendes Oligomer enthalten.
Weiterhin soll die Erfindung durch die nachfolgenden Sequenzprotokolle, Abbildungen und Beispiele erläutert werden. Es zeigen:
SEQ ID NO. 1: die Nukleotidsequenz einer Chla ydien-Sonde, SEQ ID NO. 2: die Nukleotidsequenz einer Referenz- bzw. Ge- genstrangsonde zu der in SEQ ID NO. 1 gezeigten Sequenz, Fig. 1 die schematische Darstellung von Synthesestrategien, mit denen die Herstellung erfindungsgemäßer Monomer- bausteine nicht gelingt,
Fig. 2 die schematische Darstellung einer Synthesestrategie, mit der die Herstellung erfindungsgemäßer Monomerbausteine (z. B. 11) gelingt, Fig. 3 die Struktur eines PNA-Monomers (12), das zur Ein- führung von Markierungsgruppen am Peptidrückgrat geeignet ist und Fig. 4 die Strukturen von PNA-Monomeren, Linkern, Markierungsgruppen und einem Syntheseträgerharz.
Beispiel 1
Herstellung von 5-Ioduracil-l-essigsäuremethylester (Verbindung 6 )
6 g 5-Ioduracil (Aldrich) werden in 75 ml absolutem DMF ge- löst. Dazu gibt man 3,48 g Kaliumcarbonat und 2,4 ml Bromessigsäuremethylester (Merck) . Der Ansatz wird unter einer Argonatmosphäre über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Der An- satz wird filtriert und im Vakuum zur Trockene eingeengt. Der Rückstand wird in 60 ml Wasser und 10 ml 2 M Salzsäure aufgenommen und 1 Stunde bei 0°C stark gerührt. Ein farbloser Niederschlag fällt aus. Dieser wird abgesaugt und mit Wasser neutral gewaschen. Der farblose Feststoff wird über Phosphor- pentoxid im Exsikkator getrocknet .
Ausbeute: 7,3 g (93 %) "
Fp: 183 - 184°C
Rf = 0,51 (Kieselgel; Dichlormethan/Methanol 100 : 6) 'H-NMR (dg-DMSO, pp ) : 11,80 (sb, 1H, NH) , 8,21 (s , 1H H-C (6) ) , 4,53 (s, 2H, CHj), 3,70 (s, 2H. OCH3)
Beispiel 2
Herstellung von N-Benzyloxycarbonylallylamin (Verbindung 4)
10,4 ml Allylamin und 19 ml Triethylamin werden in 50 ml absolutem Toluol gelöst. Zu der im Eisbad gekühlten Lösung tropft man unter Rühren eine 50%ige Benzylchloroformiat -Lösung in Toluol (46,8 ml) zu. Zur Vervollständigung der Reaktion wird noch 1 Stunde bei Raumtemperatur weitergerührt. Ein gebildeter Niederschlag wird abfiltriert. Danach wird das Fil- trat eingeengt und am Hochvakuum bis zur Gewichtskonstanz getrocknet (70°C, 0,5 mbar) . Ausbeute: 19,8 g (74 %) Rf = 0,79 (Kieselgel, Petrolether/Essigsäureethylester 1:1) 'H-NMR (dg-DMSO, ppm): 7,49 - 7,08 (m, 5H, Phenyl), 6,01 - 5,64 (m, 1H, =CH(Allyl)), 5,23 - 4,57 (m, 3H, =CH2 (Allyl) , NH) , 5,11 (s, 2H, CH2 (Benzyl)), 3,74 - 3,60 (m, 2H, CH2N)
Beispiel 3
Herstellung von 5- (N-Benzyloxycarbonyl-aminoallyl) uracil-1- essigsäuremethylester (Verbindung 7 )
1 g 5 - Ioduracil - l -essigsäuremethylester wird zweimal mit j e 20 ml absolutem Acetonitril koevaporiert und mit Argon belüftet .
Danach gibt man 1 , 2 g N-Z-Allylamin, 80 mg Palladium ( II ) acetat , 0 , 18 g Triphenylphosphin, 0 , 9 ml Triethylamin und 40 ml absolutes Acetonitril zu. Der Reaktionsansatz wird unter einer Argon-Atmosphäre 100 Stunden bei einer Ölbadtemperatur von 115 °C stark gerührt. Es entsteht ein Metallspiegel. Nach Abkühlen wird in die Lösung Schwefelwasserstoff eingeleitet, dann wird der gebildete schwarze Niederschlag über ein Seitz- filter abfiltriert. Das Filtrat wird dann am Rotationsverdampfer zur Trockene eingeengt, in 20 ml Essigsäureethylester gelöst und über Flash-Chromatographie (Kieselgel, 30 x 5 cm) mit Petrolether/Essigsäureethylester 2 : 3 aufgereinigt . Die Produktfraktioonen und ein blau fluoreszierendes Oxidations - nebenprodukt (5- (N-Benzyloxycarbonyl -l-propin-3 -amino-1 - yl) uracil-1-essigsäure-methylester) werden im Rotationsverdampfer zur Trockene eingeengt und im Hochvakuum bis zur Gewichtskonstanz getrocknet. Produktausbeute: 0,54 g (45 %) gelblicher Feststoff
Rf = 0,22 (Kieselgel, Petrolether/Essigsäureethylester 2 : 3) Fp: 131 - 133 °C
'H-NMR (d6-DMS0, ppm) : 11,53 (sb, 1H, NH (Uracil) ) , 7,84 (s, 1H, H-C(6), 7,50 (b, 1H, NH) , 7,35 ( , 5H, Phenyl) , 6,55 - 6,02 (m, 2H, 2x =CH) , 5,04 (s, 2H, CH2Ph) , 4,55 (s, 2H, NCH2C00) , 3,90 - 3,64 (m, 2H =CH2) , 3,71 (s, 3H, 0CH3) Nebenproduktausbeute : 0,38 g
Rf (Nebenprodukt) = 0,3 (Kieselgel, Petrolether/Essigsäure- ethylester 2 : 3) 'H-NMR des Nebenprodukts (d6-DMSO, ppm): 11,41 (sb, 1H, NH (Uracil)), 9,14 (db, 1H NH) , 7,53 (s, 1H, H-C(6)), 7,45 - 7,19 (m, 5H, Phenyl), 5,14 (s, 2H, CH2Ph) , 4,54 (s, 2H, NCH2COO) , 3,70 (s, 3H, OCH3) , 1,79 (D, 2H, CH2NHCOOPH)
Beispiel 4:
Herstellung von 5- (N-Benzyloxycarbonyl-aminoallyl) uracil-1- essigsäure (Verbindung 9)
1 g 5- (N-Benzyloxycarbonyl-aminoallyl) uracil-1-essigsäureme- thylester wird in 20 ml Tetrahydrofuran (THF) und 10 ml 1 M
Lithiumhydroxid über Nacht bei Raumtemperatur gerührt .
Anschließend das THF am Rotationsverdampfer entfernt. Die zurückgebliebene Lösung wird mit 10 ml Wasser verdünnt und mit 2 M Salzsäure auf pH2 eingestellt. Anschließend wird dreimal mit je 70 ml Essigsäureethylester ausgeschüttelt. Die vereinigten organischen Phasen werden über Magnesiumsulfat getrock- net, filtriert und am Rotationsverdampfer zur Trockene eingeengt. Der bräunliche Feststoff wird bis zur Gewichtskonstanz am Hochvakuum getrocknet . Ausbeute: 0,72 g (73 %)
Rf = 0,47 (Kieselgel, n-Butanol/Eisessig/Wasser 4 : 1 : 1) Fp: 168 - 170 °C
"H-NMR (dg-DMSO, ppm) : < 12 (1H, COOH) , 11,47 (sb, 1H, NH (Uracil)), 7,83 (s, 1H, H-C (6)), 7,48 (b, 1H, NH) , 7,35 (m, 5H, Phenyl), 6,53 - 6,01 (m, 2H, 2x =CH) , 5,03 (s, 2H, CH2Ph) , 4,42 (s, 2H, NCH2COO) , 3,71 (t, 2H, CH2N (Allyl))
Beispiel 5 :
Herstellung N- (2 - tert-Butyloxycarbonyl -aminoethyl) -N' - 5 [5 - (N- benzyloxycarbonyl-aminoallyl) uracil - 1 -ylacetyl] glycinme thyl ester
9,36 g 5- (N-Benzyloxycarbonyl-aminoallyl) uracil-1-essigsäure werden in 10 ml absolutem Dimethylformamid (DMF) gelöst. Zu der Lösung gibt man frisch aktiviertes Molekularsieb 4A, 244 μl Diisopropylethylamin und 364 mg 0- (Benzotriazol-1-yl) - 1 , 1, 3 , 3-tetramethyluronium-hexafluorphosphat (HBTU) . Danach rührt man 30 min bei Raumtemperatur. Anschließend gibt man 159 mg Methyl -N- (2 -Boc-aminoethyl) glycinat (K. L. Duoholm et al . , Org. Prep. Proc . Int., 1993, 25, 457-461) in 5 ml DMF gelöst zu und rührt weitere 3 Stunden bei Raumtemperatur. Danach wird das Molekularsieb abfiltriert und das Filtrat am Hochvakuum eingeengt. Der Rückstand wird in wenig Essigsäureethylester aufgenommen, von dem gebildeten Niederschlag filtriert man ab. Das Filtrat wird auf ein Volumen von ca. 3 ml eingeengt und über Flash-Chromatographie (Kieselgel, 25 x 2,5 cm) mit Pe- trolether/Essigsäureethylester 1 : 3 als Eluens gereinigt . Die verreinigten Produktfraktionen werden eingeengt und am Hochvakuum getrocknet . Ausbeute: 0,29 g (78 %) farbloses Kristallisat Rf = 0,76 (Kieselgel, n-Butanol/Eisessig/Wassser 4:2:1) XH-NME (dg-DMSO, ppm) : 11,41 (sb, 1H, NH, (Uracil)) , 6,92 - 6,00 (m, 3H, NH, 2x =CH) , 5,02 (s, 2H, CH2Ph) , 4,71 - 4,31, 4,06, 3,71 (3 x 2H, 3 x NCH2CO) , 3,63 (s, 3H, OCH3 ) , 3,40 - 3, 00 (m, 4H, 2 x CH2N)
Beispiel 6 :
Herstellung von N- ( -2- tert-Butyloxycarbonyl-aminoethyl) -N' - [5- N-benzyloxycarbonyl-aminoallyl) uracil- 1-ylacetylglycin (Verbindung 11)
290 mg N- (2-tert-Butyloxycarbonyl-aminoethyl) -N' - [N-benzyloxycarbonyl-aminoallyl) -uracil - 1 -ylacetyl] glycinmethylester wer- den in 10 ml THF und 5 ml 1 M Lithiumhydroxid-Lösung 4 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Danach wird das THF am Rotationsverdampfer abgezogen. Der Rückstand wird mit 20 ml Wasser verdünnt und dreimal mit je 50 ml Essigsäureethylester ausgeschüttelt. Die vereinigten organischen Phasen werden über Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert, am Rotationsverdampfer zur Trockene eingeengt und am Hochvakuum getrocknet . Ausbeute: 270 mg (97 %)
R£ = 0,67 (Kieselgel, n-Butanol/Eisessig/Wasser 4 : 2 : 1) Fp: 156 - 159 °C UV (MeOH) : λmax [nm] (log e) : 238 (4,12), 293 (3,98)
'H-NMR (d6-DMSO, ppm): 12,7 (b, 1H, COOH) , 11,38/11,36 (2s, 1H,
NH, (Uracil), 7,63/7,58 (2s, 1H, H-C(6)), 7,44 (m, 1H, NH) ,
7,35 (m, 5H, Phenyl), 6,88/6,69 (2t, 2H, NH) , 6,38 - 6,33/6,11
(m, d, 2H, 2x =CH) , 5,02 (s, 2H, CH2Ph) , 4,70/4,53 (2s, 2H, NCH2CO) , 4,19/3,98 (2s, 2H, NCH2CH) , 3,70 (m, 2H, NCH2C0 (Al- lyl)9, 3,41 - 3,03 (m, 4H, 2 x CH2N) , 1,38/1,37 (2s, 9H, tBu) - Rotationsisomere ca . 2 : 1 Beispiel 7 :
Herstellung von Boc-Gly-MBHA-Trägermaterial
2 g MBHA Harz (Novabiochem; 0,56 mmol/g) wird über Nacht in Dichlormethan quellen gelassen. Danach wird abgesaugt und mit 5%iger Diisopropylethylamin-Lösung in N-Methylpyrrolidon (NMP) gewaschen. Danach gibt man 0,77 ml 0,26 M N t . -Butylöxycärbo- nyl- (Boc) -Glycin in NMP, 0,8 ml 0,5 M Diisopropylethylamin in NMP und 0,96 ml 0,202 M O- (7-Azabenzotriazol-l-yl) -1 , 1 , 3 , 3- tetramethyluronium-hexafluorphosphat (HATU) in NMP zusammen, aktiviert für 2 min vor und verdünnt mit 5 ml NMP. Die Lösung gibt man dann zum Harz und schüttelt 2 Stunden. Danach saugt man ab und wäscht mehrmals mit NMP, Ethanol und Dichlormethan. Danach gibt man zum Harz 10 ml Essigsäureanhydrid/Pyridin/NMP 1 : 2 : 2 und schüttelt über Nacht bei Raumtemperatur (Capping) . Anschließend saugt man ab, wäscht mehrmals mit NMP, Ethanol und Dichlormethan und trocknet im Hochvakuum. Ein qualitativer Kaiser-Test ist negativ und indiziert quantitatives Capping. Die Beladung wird mit einem quantitativen Kaiser- Test (nach ABI 433 A Synthesizer Manual) bestimmt. Beladung: 70 μmol/g.
Beispiel 8 :
PNA-Synthese (PNA-Monomere und markierte monomere Bausteine 11 und 12)
Die PNA-Synthese erfolgt auf einen ABI 433A Peptid-Synthesizer der Firma Applied-Biosystems mit modifizierter Software. Die Synthesen werden in 5 μmol Mengen in einem 3 ml Reaktionsgefäß durchgeführt. Es wird eine kleinere Meßschleife (150 μl) verwendet. Die Monomerbausteine werden in NMP gelöst und in individuelle Kartuschen eingespritzt (140 μl, 0,26 M) . Das mit Boc-Gly derivatisierte MBHA-Trägermaterial wird in das 3 ml Reaktionsgefäß gefüllt und am Synthesizer angebracht. Tri- fluoressigsäure/m Cresol 95 : 5 (2 x 180 sec) ; Flaschenposi- tion 2) wird verwendet, um die Boc-Schutzgruppe abzuspalten. Je 2 Waschmodule (Dichlormethan- und NMP-Modul bestehend je- weils 5 aufeinanderfolgenden Waschschritten) befinden sich zwischen Boc-Abspaltung und dem Kupplungsmodul (Dichlormethan = Flaschenposition 9; NMP = Flaschenposition 10). 140 μl 0,26 M Monomer (36 μmol), 150 μl 0,21 M HATU in NMP (32 μmol) und 150 μl 0,5 M Diisopropylethylamin in NMP (75 μmol) werden in jedem Kupplungsschritt gefördert (Diisopropylethylamin-Lösung = Flaschenposition 7; HATU-Lösung = Flaschenpositiori 8).; Die Monomere werden in der Synthesekartusche voraktiviert (1 min) , dann in das Reaktionsgefäß überführt. Die Kupplungszeit be- trägt 10 min, die Monomerenkonzentration während der Kupplung beträgt 0,08 M. Nach dem Kupplungsmodul erfolgt ein Capping- Modul mit Essigsäureanhydrid/NMP/Pyridin 1 : 25 : 25 (1 min; Flaschenposition 4) . Jeder Synthesezyklus wird mit einem NMP- Waschmodul abgeschlossen. Nach dem letzten Synthesezyklus folgt ein Dichlormethan-Waschmodul , um das Harz zu trocknen. Die Kupplungen gerade der modifizierten Bausteine werden durch einen qualitativen Kaiser-Test kontrolliert.
Die Abspaltung der PNA vom Harz und der Schutzgruppen erfolgt in einem manuellen Schritt außerhalb des Gerätes in einer verschließbaren Glasfritte. Das Harz wird zuerst mit Trifluor- essigsäure (TFA) gewaschen, dann schüttelt man 1,5 Stunden mit
2 ml Trifluormethansulfonsäure/Trifluoressigsäure/m-Cresol (2
: 8 : 1) . Die Abspaltlösung wird in ein Zentrifugenglas ge- saugt. Man wäscht mit 1 ml Trifluoressigsäure nach und präzi- pitiert die PNA mit Diethylether . Das Präzipitat wird nach
Zentrifugation von der überstehenden Lösung getrennt. Danach wäscht man zweimal mit Diethylether.
Die PNA werden über eine analytische RP18-HPLC Säule (Delta- Pak, Waters, 5 μ, 125 x 4 mm) mit einem Wasser/Acetonitril/0 , 1 % Trifluoressigsäure-Gradienten (0,2' 100 % A, 2-30' 100-60 % A, 30-33' 60 % A, 33-35' 60-0% A, 35-45' 0% , 45-50' 0-100 % A, 50-55' 100 % A; A = 0,1 % TFA in Wasser; B= 0,1 % TFA in 95 % Acetonitril; Flußrate 1 ml/min) bei 60 °C analysiert. Die Reinigung erfolgt über eine präparative RP18-HPLC Säule (Nucleosil-RP18/Macherey-Nagel, 5 μ, 250 x 200 mm) mit demselben Elutionssystem( Gradient: 0-5' 100 % A, 5-40' 100-60% A, 40-45' 60 % A, 45-50' 60-0 % A, 50-60' = % A, 60-65' 0-100 % s A, 65-70' 100 % A; A = 0,1 % TFA in Wasser, B = 0,1 % TFA in 95 % Acetonitril; Flußrate 5 ml/min) bei 60 °C.
Die Analyse der gereinigten PNAs wird massenspektrometrisch mit MALDITOF-MS durchgeführt. 0
Beispiel 9»
PNA- und Oligonukleotidsynthese
9,1 PNA-Synthese unter Verwendung des Bausteins 11 und Post- 5 labeling mit dem N-Hydroxysuccinimidester der Ru(bipyri- dyl) 3-Säure
Die PNA 20 wird nach dem oben beschriebenen Syntheseverfahren (Beispiel 8) hergestellt unter Verwendung des Bausteins 11 als 0 Kupplungsbaustein an Position 12. Nach beendetem Synthesezyklus wird die terminale Boc-Schutzgruppe mit TFA/m-Cresol 95 : 5 abgespalten (180 sec) . Danach wird das Harz mit aufeinanderfolgenden NMP- und Dichlormethan-Waschschritten gewaschen. Anschließend wird die terminale Aminofunktion mit Essigsäure- 5 anhydrid/Pyridin/NMP 1 : 2 : 2 acetyliert (1 Stunde) . Dann wird die Capping-Lösung abgesaugt und mit NMP und Dichlormethan gewaschen. Abspaltung und HPLC-Reinigung erfolgen wie oben (Beispiel 8) beschrieben. MALIDOTF-MS: 5545,9 (Δ 0,005 %) . 0
Ein 43 OD260 Aliquot der gereinigten PNA wird zur Trockene eingeengt. Die PNA wird dann in 0,1 M NaHC03-Puffer pH 8 , 5 (1 ml) gelöst. Der pH wird überprüft und gegebenenfalls nachgestellt, danach gibt man 2 mg N-Hydroxysuccinimidester der Ru 5 (bipyridyl) 3-Säure (Boehringer Mannheim, Ident-Nr. 171 74 64) in 1 ml DMSO gelöst zu und schüttelt über Nacht, um die freigesetzte Aminofunktion des inkorporierten Bausteins 11 zu markieren. Danach wird gegen Wasser dialysiert (1000 MWCO, SpectraPor 6) . Anschließend wird zur Trockene eingeengt und über eine präparative RP 18 HPLC Säule (Nucleosil-RP18/Mache- rey-Nagel, 5 μ, 250 x 20 mm) gereinigt (Gradient: 0-5' 80 % A, 5-30' 80-60% A, 30-35' 60 % A, 35-65' 60- 0 % A, 65-70' 0 % A, 70-75' 0-100 % A, A: 0,1 % TFA in Wasser, B: 0,1 % TFA in 95 % Acetonitril, Flußrate: 4 ml/min. Ausbeute: 18 OD260 MS (MALDITOF: 6201,8 (Δ 0,02 %)
9.2 PNA-Synthese unter Verwendung des Bausteins 12 und Post- labeling mit dem N-Hydroxysuccinimidester der Ru- (bipyri- dyl) 3-Säure
Die Synthese von Baustein 12 erfolgt wie bei G. Haaima et al . , Angew. Chem., 1996, 108, 2068-2070 beschrieben.
Die PNA 21 wird nach dem oben beschriebenen Syntheseverfahren (Beispiel 8) hergestellt unter Verwendung des Bausteins 12 als zwölften Kupplungsbaustein (5 μmol Maßstab) . Ausbeute: 114 OD260 MS (MALDITOF): 6228.0 (Δ 0,02 %)
9.3 Synthetisierte PNA-Moleküle
Folgende PNA-Moleküle werden hergestellt. Die Sequenz leitet sich aus einer Chlamydien-Sonde (mit der in SEQ ID NO. 1 angegebenen Basis-Nukleotidsequenz wie in 15 gezeigt) ab:
H-CAT AGC ACT ATA GAA CTC TG Gly-NH2 15
Bio (Ado)3 CAT AGC ACT ATA GAA CTC TG Gly-NH2 17
Ru Ado CAT AGC ACT ATA GAA CTC TG Gly-NH2 19
Ac-CAT AGC AC(Ru-U) ATA GAA CTC TG Gly-NH2 20
Ac-CAT AGC AC (T Lys-Ru) ATA GAA CTC TG Gly-NH2 21 Ru Ado CAT AGC AC(Ru-U) ATA GAA CTC TG Gly-NH2 23
Ru Ado CAT AGC ACT ATA GAA C(Ru-U)C TG Gly-NH2 25
(Ru-Lys) (Ru-Lys) CAT AGC ACT ATA GAA CTC TG Gly-NH2 26 (Ru-Lys) (Ru-Lys) CAT AGC ACT ATA GAA CTC TG Gly-NH2 27
Dabei ist Ru-U der eingebaute Baustein 11, der an der Aminofunktion am C-5 von Uracil mit Ru(bpy)3-OSu postgelabelt wurde. T Lys-Ru ist der eingebaute Baustein 12, der an der Aminofunktion des Lysins im Backbone mit Ru(bpy)3-OSu postgelabelt wurde. Ru- Lys, Ru, Bio und Ado haben die in Fig. 4 dargestellte Bedeutung .
9.4 Synthetisierte Oligonukleotide
Als Referenz bzw. Gegenstrang werden folgende Oligonukleotide (mit der in SEQ ID NO.2 angegebenen Basis-Nukleotidsequenz wie in 13 bzw. SEQ ID NO 1 wie in 14 gezeigt) nach der Standard- Phosphoramiditmethode synthetisiert :
5'-CAG AGT TCT ATA GTG CTA TG-3' 13
5' -CAT AGC ACT ATA GAA CTC TG 3 ' 14
5' -Bio CAT AGC ACT ATA GAA CTC TG 3 ' 16 5'-Ru CAT AGC ACT ATA GAA CTC TG 3 ' 18
5'-Ru CAT AGC AC (Ru-U) ATA GAA CTC TG 3 ' 22
5'-Ru CAT AGC ACT ATA GAA C (Ru-U) C TG 3 ' 24
Ru-U ist hier das eingebaute DNA-Analogon zu Baustein 11, das an der Aminofunktion am C-5 des Uracils mit Ru(bpy)3-OSu postgelabelt wurde. Das 5' -terminale Ru und Bio werden jeweils über das entsprechende Phosphoramidit-Derivat gekoppelt.
Beispiel 10: Bestimmung der Schmelztemperaturen
10.1 Methodik
Die Bestimmung der Schmelztemperaturen von Hybriden zweier komplementärer Oligomere erfolgt an einem Uvikon 931 Spectral- photometer der Fa. Kontron. Die Temperierung der Küvetten- blöcke erfolgt über einen Haake DC5 Heiz-/Kühl -Thermostaten, die interne Tm-Kontrolle wird mittels eines PDIO-Thermofühlers in einer Küvette durchgeführt. Es wird eine Tra-Software der Fa. Kontron verwendet. Es wird in 0,5 °C Schritten in 100 mM NaCl , 10 mM Na-Phosphat, 0 , 1 mM EDTA, pH 7 als Schmelzkurvenpuffer gemessen. Beide Oligomere werden äquimolar eingesetzt. Die Oligomerenendkonzentration beträgt 2,5 nmol/ml.
10.2 Ergebnisse
Um den Einfluß des Labels bzw. der Labelposition sowie einen Stabilitätsvergleich von DNA-DNA- zu PNA-DNA-Duplex zu untersuchen, werden Tm-Experimente durchgeführt. Die Tm-Werte sind in Tab. 1 zusammengefaßt. Der Tm des DNA-DNA-Duplex liegt bei 56°C. Während 5 ' -Biotinylierung den Tm praktisch unbeeinflußt läßt (55,9°C) führt 5 ' -Ruthenylierung zu einem um 0,7°C leicht erhöhten Tm von 56,7°C. Das gleiche Bild zeigt sich im DNA- PNA-Duplex. Der ungelabelte PNA-DNA-Duplex hat einen Tm von 73,5°C, aminoterminale Biotinylierung der PNA führt zu keiner Beeinflussung der Stabilität (73,5°C), aminoterminale Ruthe- nylierung führt auch hier zu einer Stabilitätserhöhung von 0,7°C auf 74,2 °C.
Ru-Labeling an einer internen Lys-Aminofunktion (Baustein 12) liefert den gleichen Stabilitätsgewinn von 0,7°C auf 74,2°C wie aminoterminaler Ru-Einbau. Internes Ru-Labeling an der C-5 Position des Uracils (Baustein 11) führt sogar zu der höchsten Stabilisierung von 1,5°C auf 75,0°C. Überraschend war nun auch die Beobachtung, daß internes Ru-Labeling an der C-5 -Basenposition des Uracils in DNA-DNA-Duplexen zu einer leichten De- Stabilisierung des Doppelstranges führt, während analoges internes Labeling der PNA zu einer Stabilisierung des PNA-DNA- Duplexes führt. Dies zeigt folgender Vergleich der zweifach ruthenylierten Derivate (Tm-Experiment 9 mit 10 und 11 mit 12) : Während der DNA-Duplex abhängig von der Position der 2. Ru-Markierung um 2,3°C auf 54,4°C bzw. um 1,2°C auf 55,3°C gegenüber der 5 ' -Ru-Markierung destabilisiert wird, führt die analoge Einführung des 2. Ru-Labels über Baustein 11 in die PNA neben der aminoterminalen Ru-Markierung zu einer Stabilisierung um 2,3°C auf 76,5°C bzw. zu einem unveränderten Tm von 74,2°C. Zweifaches Aminoterminales Ru-labeling mit Ru-Lys führt ebenfalls zu einer Stabilisierung gegenüber Einfach-Ru- Labeling im PNA-DNA-Duplex von 2,3°C auf 76,5°C. Sind die terminalen Ru-Label über einen Ado-Linker getrennt, ist die Stabilisierung etwas niedriger (1,5°C).
Tab. 1: Tm-Experimente
Figure imgf000032_0001
SEQUENZPROTOKOLL
(1) ALLGEMEINE ANGABEN:
(i ) ANMELDER :
(A) NAME: Boehringer Mannheim GmbH
(B) STRASSE: Sandhofer Strasse 112-132
(C) ORT: Mannheim (E) LAND: DE
(F) POSTLEITZAHL: 68305
(ii) BEZEICHNUNG DER ERFINDUNG: Neue Monomerbausteine zur Markierung von peptidi- ischen Nucleinsäuren
(iii) ANZAHL DER SEQUENZEN: 2
iv) COMPUTER-LESBARE FASSUNG:
(A) DATENTRÄGER: Floppy disk (B) COMPUTER: IBM PC compatible
(C) BETRIEBSSYSTEM: PC-DOS/MS-DOS
(D) SOFTWARE: PatentIn Release #1.0, Version #1.30
(EPA)
(vi) DATEN DER URANMELDUNG:
(A) ANMELDENUMMER: DE 197 12 530.1
(B) ANMELDETAG: 25-MAR-1997
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 1: (i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 20 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang (D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Sonstige Nucleinsäure (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 1:
CATAGCACTA TAGAACTCTG 20 (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 2:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 20 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Sonstige Nucleinsäure
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 2:
CAGAGTTCTA TAGTGCTATG 20

Claims

Ansprüche
1. Verbindung der Formel (I)
B
I „
A i E (I)
D
/
Q
worin:
B eine natürliche oder nichtnatürliche Nukleobase ist, die gegebenenfalls eine Schutzgruppe trägt,
L eine Markierungsgruppe oder eine zur Kopplung mit einer Markierungsgruppe fähige Gruppe ist, die gegebenenfalls eine Schutzgruppe trägt, A, C, D jeweils unabhänging voneinander chemische Bindungen oder organische Reste darstellen,
E eine Gruppe ausgewählt aus N, RXN+ oder CH ist, wobei R1 ein organischer Rest oder Wasserstoff ist, Q eine Gruppe NR2Y ist, wobei R2 ein organischer Rest oder Wasserstoff ist, und Y eine Schutzgruppe oder ein Träger ist und
I eine Gruppe ausgewählt aus COX, CSX, SOX oder S02X ist, wobei X OH, SH, OM, SM oder eine Schutzgruppe ist, M ein Kation ist und n eine ganze Zahl von 1 bis 3 ist.
2. Verbindung nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß B eine Nukleobase ist ausgewählt aus Thymin, Uracil, Cytosin, Adenin, Guanin, Hypoxanthin, Purin, 7-Deazapu- rin, 2 , 4-Diaminopurin, 2 , 6-Diaminopurin, 7-Deazaguanin, Pseudouracil , Pseudocytosin, Pseudoisocytosin, N4,N4-Etha- nocytosin, Ns,N6-Ethano-2 , 6-diaminopurin, 5- (C3-C6) -Alki- nylcytosin, 5-Fluoruracil oder 2-Hydroxy-5-methyl-4-tria- zolopyrimidin ist, wobei die Nukleobase gegebenenfalls eine Schutzgruppe trägt.
3. Verbindung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Nukleobase eine Pyrimidinbase ist und die Gruppe L an die C-5 Position gebunden ist.
4. Verbindung nach Anspruch 1 oder 2 , dadurch gekennzeichnet, daß die Nukleobase Cytosin oder ein Derivat davon ist und die Gruppe L an die N-4 Position gebunden ist.
5. Verbindung nach Anspruch 1 oder 2 , dadurch gekennzeichnet, daß die Nukleobase eine Purinbase ist und die Gruppe L an die C-8 Position gebunden ist.
6. Verbindung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Nukleobase eine Adenin oder ein Derivat davon ist und die Gruppe L an die N-6 Position gebunden ist.
7. Verbindung nach Anspruch 1 oder 2 , dadurch gekennzeichnet, ' daß die Nukleobase Guanin oder ein Derivat davon ist und die Gruppe L an die N-2 Position gebunden ist.
8. Verbindung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Nukleobase ein 7-Deazapurin ist und die Gruppe L an die C-7 Position gebunden ist.
9. Verbindung nach einen der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Gruppe L eine signalgebende Gruppe ist.
10. Verbindung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Gruppe L ein lumineszierendes Metallchelat, Fluo- rescein oder Biotin ist.
11. Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Gruppe L ein Rest ist, der zur Kopplung mit einer Markierungsgruppe fähig ist.
12. Verbindung nach Anspruch 11 dadurch gekennzeichnet, daß L die Struktur -R' -NHY aufweist, wobei R' ein C2-C10- Alkylen-, Alkenylen- oder Alkinylenrest ist, der gegebenenfalls Heteroatome enthält, und Y eine Schutzgruppe ist .
13. Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß A ein C1-C10-Alkylen- , Alkenylen- oder Alkinylenrest ist, der gegebenenfalls Heteroatome oder/und Substituen- ten enthält.
14. Verbindung nach Anspruch 13 , dadurch gekennzeichnet, daß A ein -CH2-CO-Rest ist.
15. Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß C ein C1-C10-Alkylen- , Alkenylen- oder Alkinylenrest ist, der gegebenenfalls Heteroatome oder/und Substituen- ten trägt.
16. Verbindung nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß C ein -(CH2)2-Rest ist.
17. Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß D ein C-L-C-^-Alkylen- , Alkenylen- oder Alkinylenrest ist, der gegebenenfalls Heteroatome oder/und Substituen- 5 ten trägt .
18. Verbindung nach Anspruch 15, ' dadurch gekennzeichnet, daß D ein -CH2-Rest ist.
10
19. Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 18, dadurch gekennzeichnet, daß A und B oder A und D eine Ringstruktur bilden.
15 20. Verwendung von Verbindungen der Formel (I) nach einem der Ansprüche 1 bis 19 als monomere Bausteine bei der Synthese von Nukleinsäure-bindenden peptidischen Oligomeren.
21. Verbindung der Formel (II) :
20
B i
A
E (II)
Q - C D - I
25 (L)n (L)m
worin:
B, A, C, D, E, Q und I wie in Anspruch 1 definiert sind, 30 L eine Markierungsgruppe ist und n und m 0 oder 1-3 sind, mit der Maßgabe, daß die Summe von n + m nicht 0 ist.
22. Verbindung nach Anspruch 21, 35 dadurch gekennzeichnet, daß B eine Nukleobase ist aus Thymin, Uracil, Cytosin, Adenin, Guanin, Hypoxanthin, Purin, 7-Deazapurin, 2,4- Diaminopurin, 2 , 6 -Diaminopurin, 7-Deazaguanin, Pseudoura- cil, Pseudocytosin, Pseudoisocytosin, N4,N4-Ethanocytosin, N6,N6-Ethano-2 , 6 -diaminopurin, 5- (C3-C6) -Alkinylcytosin, 5- Fluoruracil oder 2-Hydroxy-5-methyl-4-triazolopyrimidin ist, wobei die Nukleobase gegebenenfalls eine Schutzgruppe trägt.
23. Verbindung nach Anspruch 21 oder 22, dadurch gekennzeichnet, daß die Gruppe L ein lumineszierendes Metallchelat, Bio- tin oder Fluorescin ist.
24. Verbindung nach einem der Ansprüche 21 bis 23, dadurch gekennzeichnet, daß A ein C^C^-Alkylen- , Alkenylen- oder Alkinylenrest ist, der gegebenenfalls Heteroatome oder/und Substituen- ten enthält .
25. Verbindung nach einem der Ansprüche 21 bis 24, dadurch gekennzeichnet, daß A ein -CH2-CO-Rest ist.
26. Verbindung nach einem der Ansprüche 21 bis 25, dadurch gekennzeichnet, daß C ein C1-C10-Alkylen- , Alkenylen- oder Alkinylenrest ist, der gegebenenfalls Heteroatome oder/und Substituen- ten trägt .
27. Verbindung nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, daß C ein -(CH2)2-Rest ist.
28. Verbindung nach einem der Ansprüche 21 bis 27, dadurch gekennzeichnet, daß D eine Gruppe -CH(R'-L)- ist, wobei R' ein organischer Rest ist.
29. Verbindung nach Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet, daß R' der Rest der Seitenkette einer natürlichen Amino- säure oder der entsprechenden enantiomeren Verbindung ist .
30. Verbindung nach einem der Ansprüche 28 bis 29, dadurch gekennzeichnet, daß das asymmetrische C-Atom der Gruppe -C*H(R'-L)- eine D-Konfiguration aufweist.
31. Verbindung nach Anspruch 29 oder 30, dadurch gekennzeichnet, daß R' der Rest einer Lysinseitenkette ist.
32. Verwendung von Verbindungen der Formel (II) nach einem der Ansprüche 21 bis 31 als monomere Bausteine bei der Synthese von Nukleinsäure-bindenden peptidischen Oligome- ren.
33. Nukleinsäure-bindendes Oligomer, dadurch gekennzeichnet, daß es mindestens einen monomeren Baustein mit einer Markierungsgruppe gekoppelt an eine Nukleobase oder/und an ein Peptidrückgrat enthält.
34. Oligomer nach Anspruch 33, dadurch gekennzeichnet, daß es mindestens einen monomeren Baustein enthält ausgewählt aus Verbindungen der Formeln (I) und (II) .
35. Oligomer nach Anspruch 33 oder 34, dadurch gekennzeichnet, daß bei Hybridisierung mit einer komplementären Nukleinsäure (1) das resultierende Hybrid einen höheren Schmelzpunkt als ein Hybrid aufweist, das ein Oligomer ohne Markierungsgruppe enthält, oder (2) eine schwächere De- stabilisierung in einem PNA-Nukleinsäure-Hybrid erfolgt als in einem Nukleinsäure-Nukleinsäure-Hybrid.
5 36. Oligomer nach einem der Ansprüche 33 bis 35, dadurch gekennzeichnet, daß es mehrere gleiche oder unterschiedliche Markierungsgruppen enthält.
ιo 37. Oligomer nach einem der Ansprüche 33 bis 36, dadurch gekennzeichnet, daß es zusätzlich aus N- oder/und C-Terminus mit Markierungsgruppen gekoppelt ist.
15 38. Nukleinsäure-bindendes Oligomer, das eine Struktur der allgemeinen Formel (III) aufweist:
Figure imgf000041_0001
worin :
30 n eine ganze Zahl von mindestens 3 ist, x eine ganze Zahl von 2 bis n-1 ist, jede der Gruppen B1 bis Bn eine Nukleobase wie zuvor definiert ist,
35 jede der Gruppen C^C" die Bedeutung (CR6R7)y, vorzugsweise CR6R7, CHR6CHR7 oder CR6R7CH2 aufweist, wobei R6 Wasserstoff ist und R7 ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus den Seitenketten natürlich vorkommender alpha-Aminosäuren oder R6 und R7 unabhängig ausgewählt werden aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, C-L-Cg-Alkyl, Aryl , Aralkyl, Heteroaryl, Hydroxy,
Figure imgf000042_0001
Alkylthio, NR3R4 und SR5, wobei R3 und R4 wie im folgenden definiert sind und R5 Wasserstoff, C-L-Cg-Alkyl oder mit Hydroxy, -C-L-Cg Alkoxy oder Ci-Cg-Alkylthio-substituiertes C1-C6 Alkyl ist, oder R6 und R7 zusammen ein alicyclisches oder ein hetero- cyklisches System bilden oder C^C" CO, CS oder CNR3 ist;
jeder der Reste Dx-Dn die Bedeutung (CR6R7)Z, vorzugsweise CR6R7, CHR6CHR7 oder CH2CR6CR7' aufweist, wobei R6 und R7 wie zuvor definiert sind, y und z ganze Zahlen von 0 bis 10 sind, wobei die Summe von y + z mindestens 2, vorzugsweise mehr als 2 aber nicht mehr als 10 ist;
jeder der Reste G'-G""1 die Bedeutung -NR3CO-, -NR3CS-, - NR3SO- oder -NR3S02 beliebiger Orientierung aufweist, wobei R3 wie im folgenden definiert ist;
jeder der Reste A^A" und E1-En so ausgewählt sind, daß:
(a) A'-A" eine Gruppe der Formel (lila) , (Illb) , (IIIc) oder (Illd) ist und E^E" N oder R3 N+ ist oder
(b) Ax-An eine Gruppe der Formel (Illd) ist und E1- En CH ist :
Figure imgf000043_0002
Illα) r-Y- C-. C (IHb)
Figure imgf000043_0003
Figure imgf000043_0001
Figure imgf000043_0005
Figure imgf000043_0004
worin :
X 0, S, Se, NR3, CH2 oder C(CH3)2 ist,
Y eine Einfachbindung, 0, S oder NR4 ist,
p und q jeweils eine ganze Zahl von 0 bis 5 sind, wobei die Summe p + q vorzugsweise nicht größer als 5 ist ;
r und s jeweils ganze Zahlen von 0 bis 5 sind, wobei die Summe r + s vorzugsweise nicht größer als 5 ist ;
jeder der Reste R8 und R9 unabhängig ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, Hydroxy, Amin, Halogen, C1-C4 Alkoxy, C1-C4 Alkythio und gegebenenfalls substituiertem C1-C4 Alkyl, wobei die Substituenten vor- zugsweise aus Hydroxy-, C1-C4-Alkoxy- oder C1-C4-Alkylthio- gruppen ausgewählt werden;
jeder der Reste R3 und R4 unabhängig ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, Cx-C4 Alkyl, das gegebenenfalls mit Hydroxy- oder C1-C4-Alkoxy- oder C,-C, Alkylthio- substituiert ist, Hydroxy,
Figure imgf000044_0001
Alkythio und Amin;
Q' und I' unabhängig ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus NH2, CONH2, COOH, Wasserstoff,
Figure imgf000044_0002
Alkyl, 0 -Alkyl , einem durch eine Schutzgruppe blockierten Amin, Markierungsgruppen, Intercalatoren, Chelatoren, Peptiden, Proteinen, Kohlehydraten, Lipiden, Steroiden, Nukleosiden, Nukleotiden, Nukleosiddiphosphaten, Nukleo- sidtriphosphaten, Oligonnukleotiden einschließlich Oligo- ribonukleotiden und Oligodeoxyribonukleotiden, Oligonu- kleosiden und löslichen und unlöslichen Polymeren sowie Nukleinsäure-bindenden Gruppen und
xl und yl jeweils eine ganze Zahl von 0 bis 10 ist, wobei die Verbindung dadurch gekennzeichnet ist, daß an mindestens einer Nukleobase oder/und an einer Position des Peptidrückgrats eine Gruppe L wie zuvor definiert vorliegt .
39. Oligomer nach Anspruch 38, dadurch gekennzeichnet, daß es mindestens einen monomeren Baustein der allgemeinen Formel (IV) aufweist:
Figure imgf000044_0003
worin :
B eine Nukleobase wie zuvor definiert ist,
k, 1 und m unabhängig eine ganze Zahl von 0 bis 5 0 sind,
p 0 oder 1 ist und
R7 ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Wasser- 5 stoff und den Seitenketten von natürlich vorkommenden Alpha-Aminosäuren.
40. Verwendung der Oligomere nach einem der Ansprüche 33 bis 39 zu Bindung von biologische Substanzen, insbesondere
20 zur Hybridisierung mit Nukleinsäuren.
41. Verwendung nach Anspruch 40 in einem Verfahren zum Nachweis oder/und zur Isolierung von Nukleinsäuren.
25 42. Verwendung nach Anspruch 40 in einem therapeutischen Verfahren.
43. Reagenz zur Hybridisierung mit Nukleinsäuren, dadurch gekennzeichnet,
30 daß es ein Nukleinsäure-bindendes Oligomer nach einem der Ansprüche 33 bis 39 enthält.
44. Reagenzienkit zu Hybridisierung mit Nukleinsäuren, dadurch gekennzeichnet,
35 daß er neben anderen Testkomponenten ein Reagenz nach Anspruch 43 enthält.
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