DE10139730A1

DE10139730A1 - Verfahren zur Herstellung CNA

Info

Publication number: DE10139730A1
Application number: DE10139730A
Authority: DE
Inventors: Dieter Reuschling; Jochen Mueller-Ibeler; Thomas Wagner; Thomas Krumm; Jochen Wermuth; Marc Pignot
Original assignee: Nanogen Recognomics GmbH
Current assignee: Nanogen Recognomics GmbH
Priority date: 2001-08-13
Filing date: 2001-08-13
Publication date: 2003-02-27
Also published as: WO2003016561A3; EP1427710A2; WO2003016561A2; US20040249152A1; JP2005500391A; AU2002333408A1

Abstract

Die Erfindung betrifft ein neues Verfahren zur Herstellung von CNA-Oligomeren sowie künstliche supramolekulare CNA-p-RNA-Paarungssysteme und deren Verwendung, insbesondere in biotechnologischen Assays.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von CNA-Oligomeren und -Polymeren sowie Verfahren zur Herstellung der dazu benötigten CNA- Monomerbausteine und die Verwendung der CNA-Oligomere zur Bildung künstlicher supramolekulare Paarungssysteme, insbesondere in biotechnologischen Assays.
Auf dem Gebiet der klinischen Diagnostik oder im Bereich des pharmazeutischen Target- und Wirkstoffscreenings konnten in den letzten Jahren viele neue Verfahren, die auf der Biochip-Technologie basieren etabliert werden. Bisher hat sich das Interesse vor allem auf DNA-Chips konzentriert, um z. B. das Vorhandensein spezifischer Nukleinsäuresequenzen in einer Probe mittels Hybridisierung nachzuweisen.

Davon ausgehend lag die Idee nahe molekulare Paarungssysteme auch zur thermodynamisch kontrollierbaren Erzeugung von supramolekularen Aufbauten für biotechnologische Assays zu nutzen, wie sie z. B. in WO99/15893 beschrieben sind. Dazu werden im allgemeinen interessante chemische Substanzen, wie z. B. Peptide oder Proteine an Nukleinsäurederivate mit spezifischen Sequenzen fixiert. Durch Paarung mit Nukleinsäurefragmenten mit korrespondierenden Sequenzen können dann intermediär die gewünschten supramolekularen Systeme erzeugt werden. Sind dabei Fragmente mit bekannter Sequenz an einem definierten Ort auf einer Oberfläche als Rezeptor befestigt, können an einem Fragment mit komplementärer Sequenz befestigte chemische Substanzen sogar ortsaufgelöst adressiert werden.

Natürlich vorkommende Nukleinsäuren, wie DNA und RNA, sind allerdings als adressierbare "Carrier" in molekularen selbstorganisierenden Systemen nur bei Einhaltung annähernd physiologischer Bedingungen geeignet. Dies liegt zum einen an der zu geringen chemischen Stabilität natürlich vorkommender Nukleinsäuren, z. B. gegenüber Nukleasen oder basischen bzw. sauren Bedingungen, zum anderen wird deren Paarungsverhalten durch verfahrensbedingte Faktoren, wie z. B. den Salzgehalt und die Temperatur des Mediums beeinflusst, was deren Einsatz in biotechnologischen Assays stark einschränkt.

Aus diesem Grunde wird seit längerem nach künstlichen molekularen Paarungssystemen gesucht, die zum Aufbau von supramolekularen Architekturen geeignet sind und gleichzeitig unterschiedlichste Assaybedingungen tolerieren.

Ein seit längerem bekanntes Paarungssystem stellen p-RNA-Oligomere (Helv. Chim. Acta 1993, 76, 2161-2183, Helv. Chim. Acta 1995, 78, 1621-1635, Helv. Chim. Acta 1996, 79, 2316-2345, Helv. Chim. Acta, 1997, 80, 1901-1951, Helv. Chim. Acta, 2000, 83, No. 6, 1079-1107) dar. Aufgrund ihres modifizierten Zucker-Phosphat- Rückgrates ist deren spezifische Wechselwirkung mit biologisch aktiven Substanzen wie Enzymen, DNA- oder RNA-Strängen ausgeschlossen, die Empfindlichkeit der Hybridisierung komplementärer p-RNA-Oligomere z. B. gegenüber der Salzkonzentration in einem Probenmedium bleibt allerdings auch bei der Verwendung von p-RNAs weiterhin ein Problem.

Aufgrund ihres ungeladenen peptidischen Rückgrats stellen vor allem Cyclohexyl- oder Heterocyclohexyl-Nukleo-Amid-Oigomere (CNA-Oligomere), wie sie in WO99/15509 beschrieben sind, eine geeignete Alternative zu den geladenen phosphathaltigen Paarungssystem dar. Insbesondere deren Verwendung in Assays bei denen nicht in physiologischem Medium gearbeitet werden kann erscheint die Verwendung solcher CNA-Paarungssysteme als geeignet. Nachteilig ist allerdings der stark hydrophobe Charakter der CNAs, wodurch deren Einsetzbarkeit in polaren Lösungsmitteln, wie z. B. Wasser eingeschränkt ist.

Darüber hinaus ist bisher die Herstellung von CNA-Oligomeren, wie sie in WO99/15509 beschrieben ist, schwierig. Insbesondere der aufwendige mehrstufige Syntheseweg, vor allem aufgrund einer komplexen Schutzgruppen-Strategie, sowie die Reaktionsführung unter drastischen Bedingungen führt zu geringen Ausbeuten an CNA-Oligomeren. Neben den geringen Ausbeuten sind die CNA-Oligomere bisher nicht in größerem Maßstab herstellbar, wodurch deren Nutzung in biotechnologischen Assays bisher erschwert wurde. Weiterhin ist die Herstellung der für die Synthese von CNA-Oligomeren benötigten Monomerbausteine aufwendig und mit nur durchschnittlichen Ausbeuten möglich (WO99/15509), so dass auch die Verfügbarkeit dieser Edukte den technischen Einsatz von CNA-Oligomer-Produkten erschwert.

Aufgabe war es nun ein Verfahren zur CNA-Oligomerisierung bereitzustellen, mit dem größere Mengen an CNA-Oligomeren synthetisch zugänglich sind und mit dem hohe Ausbeuten an CNA-Oligomer erzielt werden können.

Die Aufgabe kann durch ein Verfahren zur Herstellung von CNA-Oligomeren, das folgende Verfahrensschritte umfasst:

a) Aktivierung der Carboxylfunktion eines CNA-Monomerbausteins,
b) anschließende Veresterung des CNA-Monomerbausteins mit freien Hydroxygruppen eines Trägers unter basischen Bedingungen und
c) nachfolgendem Aufbau des Oligomeren über repetitive Zyklen, ausgehend von der Abspaltung der Schutzgruppe an der Aminogruppe des Cyclohexylringes des CNA-Monomers und anschließender Anknüpfung eines weiteren aktivierten CNA-Monomers gelöst werden, wobei CNA-Monomere der Formel (I) eingesetzt werden,

worin A, D und F unabhängig voneinander für eine -CR³R⁴-, -NR⁵-, -O- oder -S- Gruppe und E für eine -CR⁶- Gruppe stehen können, wobei R³, R⁴, R⁵ oder R⁶ unabhängig voneinander für ein Wasserstoffatom oder eine C₁-C₁₂-Alkylgruppe stehen kann und worin B eine Nucleobase, bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe Adenin, Guanin, Cytosin, Thymin, Uracil, Isoguanin, Isocytosin, Xanthin oder Hypoxanthin, darstellt, deren primäre Aminogruppen in ungeschützter oder Boc-geschützter Form vorliegen können: Bevorzugt stellen die Gruppen A, D und F ein Kohlenstoffatom und die Reste R⁴-R⁶ Wasserstoffatome dar. Heterocyclische Verbindungen der Formel (I) besitzen bevorzugt an den Positionen A, D und F insgesamt ein Sauerstoff- oder ein Schwefelatom oder ein bis zwei Stickstoffatome.

Überraschend kann die hier beschriebene CNA-Oligomerisierung, ganz im Gegensatz zu den herkömmlichen DNA- oder RNA-Oligomerisierungsverfahren, sowohl mit lediglich Boc-geschützten als auch mit bereits Basen-ungeschützten CNA-Monomeren durchgeführt werden. Dadurch kann der finale Verfahrensschritt zur Schutzgruppenabspaltung, üblicherweise durch mehrstündige Behandlung der pMBz geschützten Oligomere unter Zusatz von 2M NaOH bei 55°C, vermieden werden (WO99/15509). So können die aufgrund einer Fragmentierung unter den harschen pMBz-Entschützungsbedingungen resultierenden hohen Ausbeuteverluste vermieden werden. Das vorliegende erfindungsgemäße Herstellungsverfahren für CNA-Oligomere verläuft demgegenüber mit annähernd 100%iger Ausbeute. Da jeder Kupplungsschritt quantitativ verläuft, sind intermediär keine freien Cyclohexylaminogruppen am Ende eines Synthesezyklus vorhanden, wodurch auch die Maskierung solcher Abbrauchsequenzen unnötig wird. Damit wird auch die Synthese längerer CNA-Oligomere in größeren Mengen möglich.

In einer bevorzugten Ausführungsform kann die Synthese der CNA-Oligomere von den entsprechenden Monomerbausteinen an fester Phase, z. B. einem Tentagel- Harz (Tentagel S-HMB, Rapp-Polymere), in Anlehnung an die Merrifield- Peptidsynthese durchgeführt werden (Merrifield, J. Amer. Chem. Soc. 1963, 85, 2149). Hierzu wird zunächst eine mit einem Linker, wie z. B. einem Hydroxymethylbenzoyl-Linker (HMB-Linker), derivatisierte feste Phase eingesetzt und die Beladung des Trägers durch Aktivierung der Carboxylfunktion eines der Monomerbausteine, z. B. mit HATU (N-[(dimethylamino)(3H-1,2,3-triazolo(4,5b)pyridin-3-yloxy)methylene]- N-methylmethanaminiumhexafluophosphat), DIC, TBTU oder HBTU und anschließender Anknüpfung an die freie Hydroxylfunktion des Polymerträgers unter basischen Bedingungen vorgenommen. Der nachfolgende Aufbau des Oligomeren erfolgt nun über repetitive Zyklen, die aus Abspaltung einer temporären Boc- Schutzgruppe, an der Aminfunktion des am Cyclohexylring kovalent an den Träger gebundenen Monomerbausteins und anschließender Anknüpfung eines in Lösung aktivierten Monomers bestehen. Die bevorzugten Kupplungszeiten liegen zwischen 3 bis 6 Stunden. Beispielhaft ist ein Syntheseschema in Tabelle 1 aufgeführt. Tabelle 1 Schema eines Synthesezyklus zur Herstellung von CNA-Oligomeren

Ein Vorteil dieser Synthese liegt hierbei, wie bereits erwähnt, in der zum Aufbau eines CNA-Oligomers einsetzbaren Monomerbausteine. So ist es vorteilhaft die Monomerbausteine an den Nukleobasen lediglich Boc geschützt oder gar komplett ungeschützt einzusetzen. Hierbei wird im Fall des Guanin-Baustein bevorzugt die 2- Aminofunktion der Nucleobase Boc geschützt eingesetzt. Der Cytosin-Bausteins wird bevorzugt an der Nucleobase N⁴-Boc geschützt eingesetzt, der Adenin- Baustein wird bevorzugt an der Nucleobase sowohl N⁶-Boc geschützt als auch ungeschützt verwendet und der Thymin-Baustein wird bevorzugt an der Nucleobase N³-Boc geschützt als auch ungeschützt für die Oligomerisierung eingesetzt. In allen Fällen, bei denen der Monomerbaustein Boc geschützt vorliegt, wird die Boc- Schutzgruppe direkt während des Boc-Entschützungsschritts (siehe dazu Table 1, Verfahrensschritt 1) wieder entfernt, so dass nach jedem Kupplungsschritt alle Nukleobasen ungeschützt vorliegen. Liegen die Basen der CNA-Monomerbausteine bereits Boc-ungeschützt vor, können diese auch direkt zum Aufbau eines Oligomers eingesetzt werden.

Bevorzugt werden dementsprechend CNA-Monomere verwendet, die aus der Gruppe 3-tert.-Butoxycarbonyl-1-[(1R, 2R, 4R)-2-tert.-butoxycarbonylamino-4- carboxymethyl-cyclohex-1-yl]-thymin (Formel (II)), 1-[(1R, 2R, 4R)-2-tert.- Butoxycarbonylamino-4-carboxymethyl-cyclohex-1-yl]-thymin (Formel (III)), N⁶-tert.- Butoxycarbonyl-9-[(1R, 2R, 4R)-2-tert.-butoxycarbonylamino-4-carboxymethyl- cyclohex-1-yl]-adenin (Formel (IV)), 9-[(1R, 2R, 4R)-2-tert.-butoxycarbonylamino-4- carboxymethyl-cyclohex-1-yl]-adenin (Formel (V)), N⁴-tert.-Butoxycarbonyl-1-[(1R, 2R, 4R)-2-tert.-butoxycarbonylamino-4-carboxymethyl-cyclohex-1-yl]-cytosin (Formel (VI)), 1-[(1R, 2R, 4R)-2-tert.-butoxycarbonylamino-4-carboxymethyl- cyclohex-1-yl]-cytosin (Formel (VII), N²-tert.-Butoxycarbonyl-9-[(1R, 2R, 4R)-2-tert.- butoxycarbonylamino-4-carboxymethyl-cyclohex-1-yl]-guanin (Formel (VIII)), 9-[(1R, 2R, 4R)-2-tert.-butoxycarbonylamino-4-carboxymethyl-cyclohex-1-yl]-guanin (Formel (IX)) ausgewählt sind.

Grundsätzlich ist eine Oligomerisierung ohne Berücksichtigung der Stereoselektivität der CNA-Monomerbausteine möglich, so können z. B. racemische Gemische eines CNA-Monomers oder enantiomerenreine CNA-Monomerbausteine in beliebiger Reihenfolge als Edukt für die Oligomerisierung verwendet werden. Bevorzugt werden allerdings enantiomerenreine oder zumindest enantiomer angereicherte CNA-Oligomere zur Erzeugung von CNA-Oligomeren verwendet, da z. B. CNA- CNA-Duplices oder CNA-p-RNA-Heteroduplices nur mit Oligomeren gelingen die entweder aus (R)- oder (S)-CNA-Monomerbausteinen aufgebaut wurden. Die stereoselektive Herstellung solcher CNA-Oligomere gelingt einfach durch die Verwendung enantiomerer (R)- oder (S)-CNA-Monomere als Edukt für die Oligomerisierung.

Um die Löslichkeit der CNA-Oligomere in polaren Lösemitteln, insbesondere gegenüber wässrigen Medien, zu erhöhen, können über geeignete Linker hydrophile Gruppen eingeführt werden. Darüber hinaus erlauben hydrophile Gruppen am N- oder C-terminalen Ende der CNA-Oligomere einen aktiven Transport dieser Moleküle durch anlegen elektrischer Felder, wie dies z. B. in US-Patent 5.605.662 und in P. N. Gilles et al. [Nature Biotechnology, 17, 365-370 (1990)] beschrieben ist.

Als Linker zur Einführung von N-terminalen Phosphatgruppen haben sich z. B. Hydroxycarbonsäurederivate, wie Buttersäure bewährt (WO99/15509). Die Synthese von phosphorylierten CNA-Oligomeren lässt sich durch Einsatz eines bereits phosphoryliert vorliegenden Hydroxycarbonsäurederivat, in einer verbesserten Synthesevariante, immens vereinfachen und die Ausbeute steigern. So kann z. B. durch Einsatz von phosphorylierter Buttersäure unter den verwendeten Standardkupplungsbedingungen diese Gruppierung direkt in hohen Ausbeuten eingeführt werden.

Eine weitere alternative Methode zur Erhöhung der Hydrophilie der CNA-Oligomere bietet die Anknüpfung terminaler Lysin- oder Oligolysinreste an das C- und/oder N-terminale Ende der CNA-Oligomere.

Analog können auch einfach CNA-Peptid- oder CNA-Protein-Konjugate hergestellt werden, die zu einer besseren Löslichkeit in polaren Medien führen. Solche Konjugate sind allerdings vor allem als funktionelle Bestandteile in biotechnologischen Assays von Interesse. Insbesondere Konjugate die Antikörper, deren funktionelle Domänen, peptidische Antigene, Rezeptoren, Strukturproteine, Glykoproteine oder Enzyme enthalten sind für den Aufbau von Biochip-Oberflächen interessant.

Weiterhin gelingt auch die Anknüpfung vieler Marker, wie z. B. von Fluoreszenzfarbstoffen, radioaktiv markierten Aminosäuren oder Biotin, an die terminalen Enden der CNA-Oligomere.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein vorteilhaftes Verfahren zur Herstellung von zur Oligomerisierung besonders geeigneten CNA-Monomeren, die unmittelbar zur Durchführung der beschriebenen Oligomerisierung verwendet werden können. Neben der unmittelbaren Verwendbarkeit der CNA-Monomer- Produkte zur Oligomerisierung ist ein weiterer Vorteil der erfindungsgemäßen Synthese deren hohe Ausbeute, beruhend auf einer verbesserten Schutzgruppenstrategie.

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren zur Herstellung von CNA-Monomeren wird in einem ersten Schritt ein lodlactam der Formel (XIII)

in der A, D und F unabhängig voneinander für eine -CR³R⁴-Gruppe und E für eine -CR⁵-Gruppe stehen können, wobei R³, R⁴ oder R⁶ die oben genannte Bedeutung haben, wobei das lodlactam bevorzugt 8-Jod-2-azabicyclo[3.3.1]nonan-3-on ist, in Gegenwart einer Base an eine Nucleobase gekoppelt wird.

Als Basen kommen z. B. organische Basen, wie DBU, DBN, oder Carbonate, wie Alkali- und Erdalkalicarbonate in Frage, bevorzugt Basen sind NaH, OBu und K₂CO₃. Besonders bevorzugt wird NaH als Base in einem molaren Verhältnis von 1 : 1 zum Lactam eingesetzt.

Als Nucleobase kommen dazu Thymin, bevorzugt dessen Lithiumsalz, Adenin, N⁶- Benzoyl-adenin, N⁶-Dimethylaminoethylen-adenin, Cytosin, N⁴-Benzoyl-cytosin oder 2-Amino-6-chlor-purin in Frage. Anschließend wird die sekundäre Amingruppe des Lactamrings BOC-geschützt. Dabei können auch die weiteren primären und sekundären Amingruppen der Base BOC-geschützt werden. Ein gezielter vorheriger Schutz der Aminofunktionen des Basenteils des Monomers mit anderen Schutzgruppen ist überraschend nicht erforderlich. Folglich entfällt darüber hinaus die nötige Abspaltung dieser Schutzgruppen.

Nach Einführung der BOC-Schutzgruppe am N² des Lactams wird der Ring mit einem Lithiumsalz, bevorzugt mit Lithiumhydroxid-Monohydrat, zum gewünschten CNA-Monomer gespalten. Zur Synthese des Guaninbausteins muss vor der Lactamspaltung der Chlorsubstituent des Purins in eine Carbonylgruppe überführt werden.

Die so hergestellten CNA-Monomere können ohne weitere Derivatisierung direkt in der CNA-Oligomersynthese verwendet werden. Somit sind ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung CNA-Monomere, deren 2-Aminofunktion des Cyclohexanrings einfach Boc geschützt sind und deren Stickstoffatome des Basenteils nicht geschützt oder teilweise Boc geschützt vorliegen. Besonders bevorzugt sind CNA-Monomere aus der Gruppe 3-tert.Butoxycarbonyl-1-[(1R, 2R, 4R)-2-tert.butoxycarbonylamino-4-carboxymethyl- cyclohex-1-yl]-thymin, 1-[(1R, 2R, 4R)-2-tert.Butoxycarbonylamino-4-carboxymethyl- cyclohex-1-yl]-thymin, 9-[(1R, 2R, 4R)-2-tert.butoxycarbonylamino-4-carboxymethyl- cyclohex-1-yl]-adenin, N⁶-tert.Butoxycarbonyl-9-[(1R, 2R, 4R)-2- tert.butoxycarbonylamino-4-carboxymethyl-cyclohex-1-yl]-adenin, N⁴- tert.Butoxycarbonyl-1-[(1R, 2R, 4R)-2-tert.butoxycarbonylamino-4-carboxymethyl- cyclohex-1-yl]-cytosin, 1-[(1R, 2R, 4R)-2-tert.butoxycarbonylamino-4-carboxymethyl- cyclohex-1-yl]-cytosin, N²-tert.Butoxycarbonyl-9-[(1R, 2R, 4R)-2- tert.butoxycarbonylamino-4-carboxymethyl-cyclohex-1-yl]-guanin, 9-[(1R, 2R, 4R)-2- tert.butoxycarbonylamino-4-carboxymethyl-cyclohex-1-yl]-guanin.

Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren zur CNA-Oligomerisierung können CNA- Oligomere in ausreichender Menge bereitgestellt werden, um sie z. B. in biotechnologischen Assays als Paarungssystem einzusetzen.

Dabei kann überraschend gezeigt werden, dass CNA-Oligomere mit p-RNA- Oligomeren mit komplementärer Sequenz sehr spezifisch miteinander paaren und supramolekulare Heteroduplices bilden, deren chemische Eigenschaften und Struktur durch biologische Proben kaum beeinflusst werden. So paaren die Einzelstränge des Heteroduplex nicht mit DNA, RNA oder PNA. Komplementäre CNA und p-RNA bilden im Heteroduplex eine Leiterstruktur aus, die stabiler als die natürlich vorkommender Nukleinsäuren ist und deren spezifische Paarung weniger von externen Faktoren, wie z. B. von dem verwendeten Lösemittel abhängt. Daraus erfolgt eine sehr gute thermodynamische Kontrolle der Hybridisierung und Dehybridisierung in unterschiedlichsten Medien, insbesondere kann die Kontrolle unabhängig von natürlich vorkommenden Assoziationsprozessen ausgeübt werden. Durch die hohe Stabilität der zwischenmolekularen Bindung der CNA-Oligomere mit ihren komplemänteren p-RNA-Oligomeren können selbst relativ kurze Sequenzen noch sequenzspezifisch miteinander paaren. Dazu trägt auch bei, dass die Stabilität von CNA-Oligomeren mit ihren komplementären p-RNA-Oligomeren durch Basenfehlpaarungen stark herabgesetzt wird. Weiterhin paaren p-RNA und CNA exklusiv im Watson-Crick-Modus, wodurch deren Selektivität gesteigert wird. Ein weiterer Vorteil von CNA-Oligomeren ist deren Verwendbarkeit in Medien mit geringer Salzkonzentration, da selbst dann eine thermodynamisch stabile selektive Paarung mit komplementären p-RNA-Oligomeren zustande kommt. Zudem stabilisieren die CNA-Oligomere eine CNA-p-RNA-Heteroduplex bei erhöhten Temperaturen und in basischen bzw. sauren Medien.

Aufgrund des artifiziellen Oligomer-Rückgrates und der linearen Leiterstruktur werden CNA-p-RNA- Heteroduplexmoleküle nicht enzymatisch abgebaut und die Assoziation von doppelsträngigen Nukleinsäuren bindenden biologischen Molekülen, wie z. B. Histonen, Transkriptionsfaktoren, Repressoren, Ribosomen etc. wird minimiert.

Somit können nun je nach Assaybedingungen angepasste Paarungssysteme aus CNA-CNA-, p-RNA-p-RNA-Homoduplices oder CNA-p-RNA-Heteroduplices genutzt werden.

Geeignete Cyclohexyl- oder Heterocyclohexyl-Nukleo-Amid-Oligomere (CNA- Oligomere), wie sie zur Bildung von CNA-p-RNA-Heteroduplices geeignet sind, enthalten ein peptidisches Cyclohexylamid-Rückgrat, wie beispielhaft in Strukturformel (X) dargestellt.

In Strukturformel (X) stellt B beliebige Nukleobasen, wie z. B. Adenin, Guanin, Cytosin, Thymin, Uracil, Isoguanin, Isocytosin, Xanthin oder Hypoxanthin dar. Die Nukleobasen sind in 1'-Stellung am Cyclohexylrest gebunden. Die Cyclohexyl- oder Heterocyclohexylreste sind über 2'-4'-Amidbindungen zu einem CNA-Oligomer miteinander verknüpft. Prinzipiell ist ein stereochemisch regelmäßiger CNA- Oligomeraufbau für die Paarung mit p-RNA-Oligomeren vorteilhaft, wobei (S)-CNA- Oligomere mit (L)-p-RNA und (R)-CNA-Oligomere mit (D)-p-RNA hybridisieren.

Eine Vielzahl von monomeren Cyclohexyl- oder Heterocyclohexyl-Nukleo-Amin- Bausteinen (CNA-Monomere), die zum Aufbau entsprechender Oligomere dienen können (Strukturformel (XI)) sowie Verfahren zu deren Herstellung, sind in WO99/15509 beschrieben.

In Strukturformel (XI) steht B für eine Nucleobase und R¹ stellt eine NH₂-Gruppe dar. R² steht für eine CH₂-COOH-Gruppe. A, D und F können unabhängig voneinander für eine -CR³R⁴-, -NR⁵-, -O- oder -S- Gruppe und E für eine -CR⁶- Gruppe stehen, wobei R³, R⁴, R⁵ oder R⁶ unabhängig voneinander für ein Wasserstoffatom oder eine C₁-C₁₂-Alkylgruppe stehen kann. Besonders bevorzugt sind CNA-Monomere in denen die Reste R³ und R⁴ Wasserstoffatome sind.

Zur Bildung von erfindungsgemäßen Herteroduplices sind p-RNA-Oligomere geeignet, wie sie z. B. in (Helv. Chim. Acta 1993, 76, 2161-2183, Helv. Chim. Acta 1995, 78, 1621-1635, Helv. Chim. Acta 1996, 79, 2316-2345, Helv. Chim. Acta, 1997, 80, 1901-1951) beschrieben sind. Die p-RNA-Oligomere können ebenfalls modifiziert werden, so dass p-RNA-Konjugate entstehen, die Peptide, Proteine oder dem Fachmann bekannte Marker enthalten können. Bei der Herstellung solcher Konjugate werden bevorzugt Linker verwendet wie sie in DE 197 41 738 A1 beschrieben sind.

Die beschriebenen CNA-Oligomere können mit p-RNA-Oligomeren zu Heteroduplices, wie beispielhaft in Strukturformel (XII) gezeigt, hybridisieren, wobei B und B' jeweils zueinander komplementäre Basen darstellen.

Die CNA-p-RNA Heteroduplices besitzen relative hohe Schmelzpunkte, das heißt die Paarung ist relativ stabil. So können schon kurze Oligomer, wie z. B. 5-mere in wässriger Lösung stabile Heteroduplices bilden. Bevorzugt sind allerdings Heterduplices aus 7- bis 12-meren. Dem Einsatz längerer Oligomer zur Heteroduplexbildung steht natürlich nichts im Wege.

Darüber hinaus kann gezeigt werden, dass die CNA-p-RNA-Heteroduplexbildung auch bei der Verwendung kurzer CNA- und p-RNA-Oligomeren unter Niedersalzbedingungen recht hoch ist. Das Arbeiten unter Niedrigsalzbedingungen ist insbesondere für biotechnolgische Verfahren wichtig, da die Salzkonzentration die Konformation bzw. die Aktivität von biolologischen Substanzen, wie z. B. der DNA oder von Proteinen stark beeinflusst. Durch die Variation von CNA-CNA- und CNA- p-RNA-Parungssystemen kann der Zusatz von Kationen, um die negativen Ladungen der Duplex abzusättigen, minimiert werden.

Ausführungsbeispiele

Allgemeine Vorbemerkungen zu den Ausführungsbeispielen

Alle verwendeten reinen Lösemittel (Fluka) werden über einem Molekularsieb aufbewahrt und ohne weitere Reinigung verwendet.

Die Oligomerisierung mittels Festphasensynthese wird unter Verwendung eines "TentaGel S HMB"-Harzes (Rapp Polymere) mit einer Kapazität von 0.23 mmol/g durchgeführt. Die Reaktionen werden in einer Chirana-Spritze (5 ml Volumen für eine Menge von über 100 mg Harz oder 2 ml Volumen für eine Harzmenge unter 100 mg) mit einer gefritteten Filtereinlage versehen durchgeführt.

Die HPLC-Untersuchungen werden mit einem Beckman System Gold™ Chromatographie-System mit programmierbarem Lösemittelmodul "126" und einem Diodenarray UVNis-Detectormodul "168" durchgeführt.

Die RP-HPLC wird im analytischen Maßstab unter Verwendung einer LiChrospher C-18 Hibar Säule (5 µm, 4 × 250 mm, Merck) bei einer Flussrate von 1 ml/min und im semipreparativen Maßstab unter Verwendung einer LiChrospher C-18 Säule (10 µm, 4 × 250 mm, Merck) bei einem Fluss von 1 ml/min durchgeführt.

Zur Eluierung werden folgende Lösungsmittel verwendet: Eluent A: Wasser, 0,1% TFA (v/v); Eluent B: MeCN, 0,1% TFA (v/v).

Für die analytischen HPLC-Läufe werden folgende Lösemittelgradienten aus Eluent A und Eluent B gewählt:
Methode A: Kontinuierliche Erhöhung des Lösemittelanteils von Eluent B von 10% auf 60% innerhalb von 30 min.
Methode B: Kontinuierliche Erhöhung des Lösemittelanteils von Eluent B von 10% auf 40% innerhalb von 30 min.
Methode C: Kontinuierliche Erhöhung des Lösemittelanteils von Eluent B von 10% auf 30% innerhalb von 40 min.

Für die semipreparativen HPLC-Läufe wird folgender Lösemittelgradient aus Eluent A und Eluent B gewählt:
Methode D: Kontinuierliche Erhöhung des Anteils von Eluent B von 10% auf 40% innerhalb von 30 min.

Die in den Ausführungsbeispielen angegebenen UV-Daten wurden mit einem Jasco V-530 UV/Vis-Spektrophotometer gewonnen, die CD-Spektren wurden mit einem Jasco J710 Spektropolarimeter aufgenommen, die Schmelzkurven (Tm-Kurven) wurden mittels UV-Messung mit einem Perkin-Eimer Lamda 2 UV/Vis- Spectrophotometer, ausgerüstet mit einem temperierbaren Quarzküvettenhalter und einem eingepassten, in die Messküvette einbringbaren Mikro-Thermoelement (Keithley Instruments DAS-801-AT-Bus Messkarte (Quick-Basic 4,0 driver)), bestimmt.

Die Messung der Tm-Kurven erfolgt bei einem Temperaturgradienten zwischen 5° und 90°C mit einer Aufheiz- oder Kühlrate von 1°C/40 s. Die Proben werden dazu in entgastem Tris-HCI Puffer (5 mM; pH 7,0) gelöst und in die Quarzküvetten (10 × 10 mm, 1 × 10 mm, Hellma; d = 10 oder d = 1) gegeben. Die Auswertung der Messdaten erfolgt mit der MicroCal Origin - Software unter Verwendung einer polynomialen Regression (600 Punkte, 9. Order).

Die Massenspektren wurden mit einem Electrospray-Ionisations- Massenspektrometer (ESI-MS) (Finnigan LCQ ion trap MS (Finnigan, USA)) mit einer Mischung aus MeCN/Wasser (1 : 1) enthaltend 0.1% TFA als Lösemittel, aufgenommen. Synthese der Monomerbausteine (R)-Thymin-Baustein Schema 1

Beispiel 1

1-[(1R, 5R, 8R)-3-oxo-2-azabicylo[3.3.1]nonan-8-yl]-thymin 2

1,26 g (10 mMol) Thymin werden bei 0°C in 50 ml THF vorgelegt und vorsichtig mit 4 ml (10 mMol) 2,5M Butyllithium in Hexan versetzt. Nach 10 minütigem Rühren der Lösung destilliert man im Vakuum das THF ab und nimmt den Rückstand (Monolithiumsalz des Thymins) in 10 ml DMF auf.
In einem zweiten Kolben werden 0,4 g (10 mMol) NaH (60%1 g) vorgelegt und bei 0°C 2,65 g (10 mMol) (1R, 5R, 8R)-8-Jod-2-azabicylclo[3.3.1]nonan-3-on 1 zugegeben. Nach etwa 30 Min. ist die H₂-Entwicklung beendet und man kann die obige Lithiumsalzlösung zugeben: Anschließend wird über Nacht (ca. 16 Stdn.) bei Raumtemperatur gerührt. Das Lösungsmittel wird im Vakuum abdestilliert, der Rückstand in Wasser gelöst und auf eine XAD-16-Säule gegeben; mit Wasser werden zunächst die anorganischen Bestandteile abgetrennt (einschließlich nicht umgesetztes Thymin) und dann mit Methanöl das organische Produkt von der Säule gelöst. Durch Eindampfen der Methanolfraktionen erhält man einen Rückstand, der zur weiteren Reinigung in Methylenchlorid gerührt und dann abgesaugt wird.(1,33 g) Aus der Mutterlauge kann durch Chromatographie (EtOAc/CH₃OH = 5 : 1) eine weitere Menge Produkt isoliert werden. (0,65 g)
1,98g(75%)
Schmp.: >300°C (Zers.)
R_F = 0,55 (Aceton : CH₂Cl₂ : CH₃OH : EtOAc : H₂O : AcOH = 9 : 6 : 2 : 2 : 2 : 1)
HPLC: >98% (Cyclobond I, CH₃CN/(H₂O+0,01 N TBAS) = 80 : 20]
[α] 22|D = +55,5° (c = 0,5; CH₃OH)
¹H-NMR (400 mHz, d₆-DMSO) 1,52-1,65 (m, 3H); 1,80-1.88 (m, 4H); 1,96-2,12 (m, 3H); 2,16-2,23 (m, 1H); 2,40-2,48 (m, 1H); 3,61 u. 4,17 (2m, 2H, CH-[NH] u. CH-N); 7,52 (d, 1H, =CH); 7,94 (d, 1H, NH-CO); 11,27 (s, 1H, CO-NH-CO) Beispiel 2 1-[(1R, 5R, 8R)-3-oxo-2-azabicylo[3.3.1]nonan-8-yl]-thymin 2
1,26 g (10 mMol) Thymin, 2,65 g (10 mMol) (1R, 5R, 8R)-8-Jod-2- azabicylclo[3.3.1]nonan-3-on 1 und 3,5 g (25 mMol) K₂CO₃ in 50 ml DMSO werden bei Raumtemperatur 48 Stdn. gerührt. Zur Aufarbeitung wird zunächst das DMSO im Vakuum abdestilliert und der Rückstand mit Tetrachlorkohlenstoff ausgekocht. Der verbleibende Rückstand wird in Wasser gelöst und auf eine XAD-16-Säule gegeben; mit Wasser werden zunächst die anorganischen Bestandteile abgetrennt (einschließlich nicht umgesetztes Thymin) und dann mit Methanol das organische Produkt von der Säule gelöst. Durch Eindampfen der Methanolfraktionen erhält man einen Rückstand, der zur weiteren Reinigung chromatographiert wird. (SiO₂ : EtOAc/EtOH = 5 : 1)
1,0 g (38%)
Physikalische Daten siehe Beispiel 1 Beispiel 3 3-tert.Butoxycarbonyl-1-[(1R, 5R, 8R)-3-oxo-2 tert.butoxycarbonyl-2- azabicylo[3.3.1]-nonan-8-yl]-thymin 3
2,1 g (8 mMol) 1-[(1R, 5R, 8R)-3-oxo-2-azabicylo[3.3.1]nonan-8-yl]-thymin 2, 1,38 ml (10 mMol) Triethylamin, 4,36 g (20 mMol) Pyrokohlensäure-di-tert.butylester und 50 mg DMAP werden in 50 ml Methylenchlorid ca. 4 Stdn. unter Rückfluß gekocht und über Nacht bei Raumtemperatur stehengelassen. (DC-Kontrolle: EtOAc) Wenn die Reaktion beendet ist, werden 50 ml Wasser zugegeben und ca. 10 Min. kräftig gerührt. Dann trennt man die organische Phase ab, extrahiert die wäßrige Phase mit Methylenchlorid, trocknet die vereinigten organischen Phasen und dampft das Lösungsmittel ab. Der Rückstand wird säulenchromatographisch gereinigt. (SiO₂, EtOAc)
2,85 g (77%)
Schmp.: 116°C
R_F = 0.41 (EtOAc)
HPLC: >98% (LiChrospher RP 18, CH₃CN/(H₂O+0,01 N TBAS) = 75 : 25]
[α] 22|D = +5,75° (c = 0,38; CH₃OH)
¹H-NMR (400 mHz, d₆-DMSO) 1,34 u. 1,43 (2s, 18H, 2 tert.Bu); 1,34-1,36 (m, 1H); 1,67-1,83 (m, 6H); 1,90-2,08 (m, 2H); 2,13-2,26 (m, 2H); 2,57-2,69 (m, 1 H); 4,22 u. 4,30 (2m, 2H, CH-[NH] u. CH-N); 7,56 (d, 1H, =CH); Beispiel 4 3-tert.Butoxycarbonyl-1-[(1R, 2R, 4R)-2-tert.butoxycarbonylamino-4- carboxymethyl-cyclohex-1-yl]-thymin 4
1,5 g (36 mMol) Lithiumhydroxid-monohydrat werden in 25 ml Wasser gelöst und bei 0°C mit 3,1 ml (36 mMol) H₂O₂ (35%) versetzt. Dann werden 5,6 g (12 mMol) 3- tert.Butoxycarbonyl-1-[(1R, 5R, 8R)-3-oxo-2 tert.butoxycarbonyl-2-azabicylo[3.3.1]- nonan-8-yl]-thymin 3 gelöst in 165 ml THF bei 0°C zugetropft; anschließend gibt man 50 ml Methanol hinzu und rührt ca. 18 Stdn. bei Raumtemperatur. Wenn noch Peroxide in der Lösung vorhanden sind, dann werden sie mit etwas Na₂SO₃-Lösung zerstört; anschließend destilliert man unter Vakuum THF/CH₃OH ab, versetzt die zurückbleibende wäßrige Phase mit Wasser und Methylenchlorid und stellt die Mischung mit verd. HCl auf pH3, trennt die organische Phase ab und extrahiert die wäßrige Phase mit Methylenchlorid. Nach dem Trocknen und Abdestillieren des Lösungsmittels erhält man einen Rückstand, der durch Chromatographie gereinigt wird. (SiO₂: EtOAc)
4,2 g (73%)
R_F = 0.71 (EtOAc/CH₃OH = 5 : 1))
HPLC: 96% [Cyclobond I, CH₃CN/(H₂O+0,01 N TBAS) = 92,5 : 7,5]
[α] 22|D = +24,8° (c = 0,56; CH₃OH)
¹H-NMR (400 mHz, CDCl₃) 1,05-1,25 (m, 2H); 1,32 u. 1,59 (2s, 18H, 2 tert.Bu); 1,57-1,68 (m, 1H); 1,80-2,08 (m, 3H); 1,91 (s, 3H, CH₃) 2,10-2,23 (m, 1H); 2,22-2,37 (m, 2H); 3,86 u. 4,33 (2 m, 2H, CH-[NH] u. CH-N); 4,73 (d, 1H, HN-CO); 7,15 (s, 1H, =CH); ca. 10.0 (br.s, 1H, CO₂H) Beispiel 5 1-[(1R, 2R, 4R)-2-tert.Butoxycarbonylamino-4-carboxymethyl-cyclohex-1-yl]- thymin 5
9,3 g (20 mMol) 3-tert.Butoxycarbonyl-1-[(1R, 5R, 8R)-3-oxo-2 tert.butoxycarbonyl-2- azabicylo[3.3.1]-nonan-8-yl]-thymin 3 werden in 450 ml THF vorgelegt und bei -10°C innerhalb 30 Min. eine Lösung von 4,2 g (100 mMol) Lithium-hyroxyd-monohydrat in 100 ml Wasser zugetropft. Anschließend werden 70 ml Methanol zugesetzt und so lange bei -10°C gerührt bis kein Ausgangsprodukt mehr vorhanden ist. (ca. 5 Stdn.; DC- Kontrolle: EtOAc) Anschließend wird 12 Stdn. bei Raumtemperatur und 15-20 Stdn. bei 45-55°C gerührt. (DC-Kontrolle: CH₂Cl₂/CH₃OH = 5 : 1) Das Lösungsmittel THF/CH₃OH wird unter Vakuum abdestilliert, der wäßrige Rückstand mit verdünnter HCL auf pH3 gestellt und mit Methylenchlorid extrahiert. Die organische Phase wird getrocknet, eingedampft und der Rückstand chromatographisch gereinigt. (SiO₂ : CH₂Cl₂/CH₃OH = 5 : 1)
3,5 g (46%)
Schmp.: 245°C(Zers.)
R_F = 0,36 (CH₂Cl₂/CH₂OH = 5 : 1)
HPLC: 98,7% [LiChrospher RP 18, CH₃CN, (H₂O+0,01 N TBAS) als Gradient (von 90% auf 60% in 30 Min.), Flow 1 ml/Min.] [α] 22|D = +22,6° (c = 0,57; CH₃OH) ¹H-NMR (400 mHz, d₆-DMSO) 1,3-1,32 (m, 2H); 1,26 (s, 9H, tert.Bu); 1,63-1,94 (m, 5H); 1,73 (s, 3H, CH₃); 2,06-2,21 (m, 2H); 3,75 (m, 1H, CH-[NH]); 4,18 (m, 1H, CH- N); 6,74 (d, 1H, NH-boc); 7,55 (s, 1H, -CH=); 11,06 (s, 1H, CO-NH-CO); 12,05 (s, 1H. (R)-Adenin-Baustei n Schema 2

Beispiel 6 N⁶-Benzoyl-9-[(1R, 5R, 8R)-3-oxo-2-azabicylo[3.3.1]nonan-8-yl]-adenin 6
In 50 ml DMF werden 0,4 g (10 mMol) NaH (60%ig) bei 0°C vorgelegt und 2,65 g (10 mMol) (1R, 5R, 8R)-8-Jod-2-azabicylclo[3.3.1]nonan-3-on 1 zugegeben. Nach etwa 30 Min. ist die H₂-Entwicklung beendet und 2,4 g (10 mMol) N⁶-Benzoyl-adenin können zugefügt werden. Anschließend entfernt man die Kühlung und rührt die Mischung bei Raumtemperatur über Nacht (ca. 15 Stdn.). Unter Vakuum wird dann das DMF abdestilliert, der Rückstand in ca. 100 ml Wasser aufgenommen und das Reaktionsprodukt mehrmals mit Methylenchlorid extrahiert. Die organische Phase wird mit gesättigter Kochsalzlösung gewaschen, getrocknet und eingedampft. Der feste Rückstand wird in Isopropanol aufgenommen und zurückbleibendes festes Produkt abgesaugt. [0,4 g (17%) N⁶-Benzoyl-adenin]. Das Filtrat wird eingedampft und chromatographiert. (SiO₂ : Zunächst EtOAc/CH₃OH = 5 : 1 dann CH₂Cl₂/CH₃OH = 5 : 1)
2,85 g (75,8%)
Schmp.: >300°C
R_F = 0,57 (CH₂Cl/CH₃OH = 5 : 1)
[α] 22|D = -35,1° (c = 1,1; CH₃OH)
HPLC: 94% [Cyclobond I, CH₃CN/(H₂O+0,01 N TBAS) = 90 : 10]
¹H-NMR (400 mHz, d₆-DMSO) 1,52-1,74 (m, 3H); 2,05-2,34 (m, 5H); 2,48-2,56 (m, 1H); 4,25 u. 4,62 (2 m, 2H, CH-[NH] u. CH-N); 7,52-8,07 (m, 5H, Ph); 8,11 (d, 1H, HN-[CH]); 8,68 u. 8,75 (2s, 2H, 2-CH=); 11,15 (s, 1H, NH-CO) Beispiel 7 N⁶-(Dimethylaminomethylen)-9-[(1R, 5R, 8R)-3-oxo-2-azabicylo(3.3.1]nonan-8- yl]-adenin 8
In 100 ml DMF werden 0,8 g (20 mMol) NaH (60%ig) bei 0°C vorgelegt und 5,3 g (10 mMol) (1R, 5R, 8R)-8-Jod-2-azabicylclo[3.3.1]nonan-3-on 1 zugegeben. Nach etwa 30 Min. ist die H₂-Entwicklung beendet und 3,8 g (20 mMol) N⁶- (Dimethylaminomethylen)-adenin können zugefügt werden. Anschließend entfernt man die Kühlung und rührt die Mischung bei Raumtemperatur ca. 48 Stdn. Unter Vakuum wird dann das DMF abdestilliert, der Rückstand in Wasser aufgenommen und zur Entfernung anorganischer Bestandteile auf ein XAD 16-Säule gegeben; nach dem Waschen mit Wasser wird mit Methanol das Produkt von der Säule gelöst. Nach dem Abdampfen des Lösungsmittels wird der Rückstand chromatographisch gereinigt. (SiO₂ : CH₂Cl₂/CH₃OH = 5 : 1)
5 g (76,5%)
R_F = 0,24 (CH₂Cl₂/CH₃OH = 10 : 1)
[α] 22|D = -81° (c = 0,4; CH₃OH)
HPLC: >98% [Cyclobond I, CH₃CN/(H₂O+0,01 N TBAS) = 80 : 20]
¹H-NMR (400 mHz, d₆-DMSO) 1,45-1,74 (m, 3H); 2,02-2,29 (m, 5H); 2,46-2,55 (m, 1H); 3,12 u. 3,18 (2s, 6H, 2 CH₃); 4,22 u. 4,51 (2m, 2H, CH-[NH] u. CH-N); 8,05 (d, 1H, HN-[CH]); 8,42 u. 8,44 (2s, 2H, 2-CH=); 8,92 (s, 1H, N =CH-N) Beispiel 8 9-[(1R, 5R, 8R)-3-Oxo-2-azabicylo[3.3.1]nonan-8-yl]-adenin 7
In 50 ml DMF werden 0,8 g (20 mMol) NaH (60%ig) bei 0°C vorgelegt und 5,3 g (20 mMol) (1R, 5R, 8R)-8-Jod-2-azabicylclo[3.3.1]nonan-3-on 1 zugegeben. Nach etwa 30 Min. ist die H₂-Entwicklung beendet und 2,3 g (20 mMol) Adenin können zugefügt werden. Anschließend entfernt man die Kühlung und rührt die die Mischung bei Raumtemperatur über Nacht (ca. 15 Stdn.). Unter Vakuum wird dann das DMF abdestilliert, der Rückstand in ca. 100 ml Wasser gelöst und zur Entfernung von Nebenprodukten mehrmals mit Ethylacetat extrahiert; die wäßrige Phase wird mit etwa 5 g NaHCOs aufgekocht und erkaltet auf eine XAD 16-Säule gegeben; mit Wasser wäscht man zunächst die anorganischen Salze von der Säule und anschließend mit Methanol das Reaktionsprodukt. Nach dem Eindampfen der Methanolphasen wird der Rückstand einmal in Ethylacetat aufgekocht, abgekühlt und abgesaugt.
4,4 g (80%)
Schmp.: >300°C
R_F = 0,6 (CH₂Cl₂/CH₃OH = 5 : 1)
[α] 22|D = -43° (c = 0,4; CH₃OH)
HPLC: 98% [Cyclobond I, CH₃CN/(H₂O+0,01 N TBAS) = 70 : 30]
¹H-NMR (400 mHz, d₆-DMSO) 1,47-1,73 (m, 3H); 2,04-2,28 (m, 5H); 2,47-2,56 (m, 1H); 4,22 u. 4,48 (2 m, 2H, CH-[NH] u. CH-N); 7,30 (s, 2H, NH₂); 8,13 (d, 1H, HN- CO); 8,16 u. 8,37 (2s, 2H, 2-CH=) Beispiel 9 9-[(1 R, 5R, 8R)-3-Oxo-2-azabicylo[3.3.1]nonan-8-yl]-adenin 7
1,35 g (10 mMol) Adenin, 2,65 g (10 mMol) (1R, 5R, 8R)-8-Jod-2- azabicylclo[3.3.1]nonan-3-on 1 und 2,1 g (15 mMol) Kaliumcarbonat werden in 50 ml Dimethylsulfoxid 2 Tage bei Raumtemperatur gerührt. Das Dimethylsulfoxid wird dann unter gutem Vakuum bei mäßiger Temperatur weitgehend abdestillert, der Rückstand in Wasser aufgenommen und auf eine XAD 16-Säule gegeben. Mit Wasser können die anorganischen Bestandteile zusammen mit nicht umgesetztem Adenin herausgewaschen werden; anschließend wird das vorgereinigte Reaktionsprodukt mit Methanol von der Säule gewaschen. Der Rückstand aus der Methanolphase wird chromatographisch gereinigt. (SiO₂ : CH₂Cl₂/CH₃OH = 5 : 1) 2,0 g (73%)
Physikalische Daten siehe Beispiel 8 Beispiel 10 N⁶-Benzoyl-N⁶-tert.butoxycarbonyl-9-[(1R, 5R, 8R)-3-oxo-2-tert.butoxycarbonyl- 2-azabicyto[3.3.1]nonan-8-yl]-adenin 13
1,88 g (5 mMol) N⁶-Benzoyl-9-[(1R, 5R, 8R)-3-oxo-2-azabicylo[3.3.1]nonan-8-yl]- adenin 6, 3,27 g (15 mMol) Pyrokohlensäure-di-tert.butylester und 100 mg DMAP in 50 ml Acetonitril werden 24 Stdn. bei Raumtemperatur gerührt. Nach dem Abdampfen des Lösungsmittels wird der Rückstand chromatographiert. (SiO₂ : EtOAc)
2,14 g (74,2%)
R_F = 0,77 (EtOAc/CH₃OH = 5 : 1)
¹H-NMR (400 mHz, d₆-DMSO) 1,25 u. 1,52 (2s, 18H, 2tert.Bu); 1,61-1,92 (m, 3H); 2,02-2,15 (m, 2H); 2,20-2,28 (m, 1H); 2,31-2,45 (m, 2H); 2,76-2,88 (m, 1H); 4,89 u. 5,15 (2 m, 2H, CH-[NH] u. CH-N); 7,52-7,81 (m, 5H, Ph); 8,87 u. 8,88 (2s, 2H, 2- CH=) Beispiel 11 N⁶-Di-(tert.butoxycarbonyl)-9-[(1R, 5R, 8R)-3-oxo-2-tert.butoxycarbonyl-2- azabicylo[3.3.1]nonan-8-yl]-adenin 11
10 g (36,7 mMol) 9-[(1R, 5R, 8R)-3-Oxo-2-azabicylo[3.3.1]nonan-8-yl]-adenin 7 in 350 ml Methylenchlorid werden mit 5,08 ml (36,7 mMol) TEA, 32 g (147 mMol) Pyrokohlensäure-di-tert.butylester und 200 mg DMAP bei Raumtemperatur vereinigt und dann ca. 4 Stdn. unter Rückfluß gerührt. (DC-Kontrolle: CH₂Cl₂/CH₃OH = 5 : 1) Nach dem Abdestillieren des Lösungsmittels wird der Rückstand durch Säulenchromatographie gereinigt. (SiO₂: EtOAc)
16,3 g (77,5%)
R_F = 0,58 (EtOAc)
[α] 22|D = -49,5° (c = 1,1; CH₃OH)
HPLC: 98% [Cyclobond I, CH₃CN]
¹H-NMR (400 mHz, CDC/3) 1,48 u. 1,61 (2s, 27H, 3tert.Bu); 1,76-1,95 (m, 3H); 2,15-2,45 (m, 4H); 2,50-2,57 (m, 1H); 2,80-2,90 (m, 1H); 4,93 u. 5,25 (2 m, 2H, CH-[NH] u. CH-N); 8,32 u. 8,87 (2s, 2H, 2-CH=) Beispiel 12 N⁶-(Dimethylaminomethylen)-9-((1R, 5R, 8R)-3-oxo-2-tert.butoxycarbonyl-2- azabicylo [3.3.1]nonan-8-yl]-adenin 9
5 g (13,4 mMol) N⁶-(Dimethylaminomethylen)-9-[(1R, 5R, 8R)-3-oxo-2- azabicylo(3.3.1]nonan-8-yl]-adenin 8 werden in 250 ml Methylenchlorid mit 1,86 ml TEA, 5,85 g (26,8 mMol) Pyrokohlensäure-di-tert.butylester und 20 mg DMAP ca. 60 Stdn. bei Raumtemperatur gerührt. Nach dem Abdampfen des Lösungsmittels wird der Rückstand chromatographiert. (SiO₂ : EtOAc/CH₃OH = 5 : 1)
5 g(87,5%)
R_F = 0,23 (EtOAc/CH₃OH = 5 : 1))
¹H-NMR (400 mHz, CDCl₃) 1,6 (s, 9H, tert.Bu); 1,75-2,56 (m, 8H); 2,78-2,89 (m, 1H); 3,22 u. 3,27 (25, 6H, 2CH₃); 4,87 u. 5,30 (2 m, 2H, CH-[NH] u. CH-N); 8,12 u. 8,54 (2s, 2H, 2-CH=); 8,95 (s, 1H, N =CH-N) Beispiel 13 N⁶-tert.Butoxycarbonyl-9-[(1R, 2R, 4R)-2-tert.butoxycarbonylamino-4- carboxymethyl-cyclohex-1-yl]-adenin 12
2,14 g (3,7 mMol) N⁶-Benzoyl-N⁶-tert.butoxycarbonyl-9-[(1R, 5R, 8R)-3-oxo-2- tert.butoxycarbonyl-2-azabicylo[3.3.1]nonan-8-yl]-adenin 13 werden in 80 ml THF vorgelegt. Bei 0°C werden innerhalb 30 Min. 0.9 g (21,5 mMol) LiOH-Monohydrat gelöst in 20 ml Wasser zugetropft. Dann gibt man 13 ml Methanol zu und rührt ca. 16 Stdn. bei Raumtemperatur. Nach dem Abdestillieren der organischen Lösungsmittel im Vakuum gibt man zum Rückstand etwas Wasser, stellt mit verdünnter HCl auf pH3, saugt das Reaktionsprodukt ab und wäscht dieses mit Wasser und Aceton.
1,0 g (55,5%)
Schmp.: >300°C
R_F = 0,6 (CH₂Cl₂/CH₃OH = 5 : 1)
[α] 22|D = +3,9° (c = 51; CH₂Cl₂/CH₃OH = 1 : 1)
HPLC: 98% [Cyclobond I, CH₃CN/(H₂O+0,01 N TBAS) = 95 : 5]
¹H-NMR (400 mHz, d₆-DMSO) 1,04 u. 1,47 (25, 18H, 2tert. Bu); 1,08-1,33 (m, 2H); 1,78-2,03 (m, 4H); 2,14-2,29 (m, 3H); 4,01 u. 4,31 (2 m, 2H, CH-[NH] u. CH-N); 6,85 (d, 1H, NH-[CH]); 8,4 u. 8,54 (2s, 2H, -CH=) 9, 9 (s, 1H, NH-C); 12, 13 (s, 1H, CO₂H) Beispiel 14 N⁶-tert.Butoxycarbonyl-9-[(1R, 2R, 4R)-2-tert.butoxycarbonylamino-4- carboxymethyl-cyclohex-1-yl]-adenin 12
11,24 g (19,6 mMol) N6-Di-(tert.butoxycarbonyl)-9-[(1R, 5R, 8R)-3-oxo-2- tert.butoxycarbonyl-2-azabicylo[3.3.1]nonan-8-yl]-adenin 11 werden in 390 ml THF vorgelegt. Bei -10°C werden innerhalb 30 Min. 4,11 g (98 mMol) LiOH-Monohydrat gelöst in 100 ml Wasser zugetropft. Dann gibt man 65 ml Methanol zu und rührt zunächst 2 Stdn. bei -10°C und dann ca. 16 Stdn. bei Raumtemperatur. Nach dem Abdestillieren der organischen Lösungsmittel im Vakuum gibt man zum Rückstand etwas Wasser, stellt mit verdünnter HCl auf pH3, saugt das Reaktionsprodukt ab und wäscht dieses mit Wasser und Aceton.
6,6 g (68,5%)
Physikalische Daten siehe Beispiel 13 Beispiel 15 N⁶-tert.Butoxycarbonyl-9-[(1R, 2R, 4R)-2-tert.butoxycarbonylamino-4- carboxymethyl-cyclohex-1-yl]-adenin 12
5,3 g (9,25 mMol) N⁶-Di-(tert.butoxycarbonyl)-9-[(1R, 5R, 8R)-3-oxo-2- tert.butoxycarbonyl-2-azabicylo[3.3.1]nonan-8-yl]-adenin 11 werden in 180 ml Methanol vorgelegt. Bei -15°C werden innerhalb 30 Min. 1,89 g (45 mMol) LiOH- Monohydrat, gelöst in 100 ml Wasser, zugetropft. Man rührt -15°C bis das Ausgangsprodukt verschwunden ist und dann ca. 16 Stdn. bei Raumtemperatur. Nach dem Abdestillieren der organischen Lösungsmittel im Vakuum stellt man den wäßrigen Rückstand mit verdünnter HCl auf pH3, und extrahiert das Reaktionsprodukt mit Methylenchlorid. Das Produkt wird chromatographisch gereinigt. (SiO₂: CH₂Cl₂/CH₃OH = 5 : 1)
3,8g(84%)
0,53 g (16%) N⁶-(tert.Butoxycarbonyl)-9-[(1R, 5R, 8R)-3-oxo-2- azabicylo[3.3.1]nonan-8-yl]-adenin
Physikalische Daten siehe Beispiel 13 Beispiel 16 9-[(1R, 2R, 4R)-2-tert.butoxycarbonylamino-4-carboxymethyl-cyclohex-1-yl]- adenin 10
5,0 g (12 mMol) N⁶-(Dimethylaminomethylen)-9-[(1R, 5R, 8R)-3-oxo-2- tert.butoxycarbonyl-2-azabicylo [3.3.1]nonan-8-yl]-adenin 9 werden in 240 ml Methanol vorgelegt. Bei -15°C werden innerhalb 30 Min. 2,52 g (60 mMol) LiOH- Monohydrat, gelöst in 60 ml Wasser, zugetropft. Man rührt -15°C bis das Ausgangsprodukt verschwunden ist und dann ca. 16 Stdn. bei Raumtemperatur. Nach dem Abdestillieren der organischen Lösungsmittel im Vakuum stellt man den wäßrigen Rückstand mit verdünnter HCl auf pH3, und extrahiert das Reaktionsprodukt mit Methylenchlorid. Das Produkt wird chromatographisch gereinigt. (SiO₂: Aceton/CH₂Cl₂/CH₃OH/EtOAc/H₂O/AcOH = 9 : 6 : 2 : 2 : 2 : 1)
2,4 g (51,3%)
Schmp.: 221°C (Zers.)
R_F = 0.31 (CH₂Cl₂/CH₃OH = 5 : 1)
HPLC: >98% [LiChrospher RP 18, CH₃CN/(H₂O+0,01 N TBAS) = 15 : 85]
[α] 22|D = +19,5° (c = 0,51; CH₃OH)
¹H-NMR (400 mHz, d₆-DMSO) 1,09 (s, 9H, tert.Bu); 1,05-1.31 (m, 2H); 1,76-2,01 (m, 4H); 2,08-2,26 (m, 3H); 3,98 u. 4,22 (2 m, 2H, CH-[NH] u. CH-N); 6,79 (d, 1H, NH- CO); 7,07 (s, 2H, NH₂); 8,07 u. 8,11 (2s, 2H, =CH); 12.2 (br.s, 1H, CO₂H
Als Nebenprodukt werden 1,3 g (40%) 9-[(1R, 5R, 8R)-3-Oxo-2- azabicylo[3.3.1]nonan-8-yl]-adenin 7 isoliert. (R)-Cytosin-Baustein Schema 3

Beispiel 17 N⁴-Benzoyl-1-[(1R, 5R, 8R)-3oxo-2-azabicyclo[3.3.1]nonan-8-yl]-cytosin 17
In 50 ml DMF werden 0,4 g (10 mMol) NaH (60%1 g) bei 0°C vorgelegt und 2,65 g (10 mMol) (1R, 5R, 8R)-8-Jod-2-azabicylclo[3.3.1]nonan-3-on 1 zugegeben. Nach cytosin können zugefügt werden. Anschließend entfernt man die Kühlung und rührt die die Mischung bei Raumtemperatur über Nacht (ca. 18 Stdn.). Unter Vakuum wird das DMF abdestilliert, der Rückstand in Methylenchlorid aufgenommen zweimal mit gesättigter Kochsalzlösung gewaschen. Die organische Phase wird getrocknet und eingedampft. Der feste Rückstand wird chromatographisch gereinigt.
(SiO₂ : EtOAc/CH₃OH = 5 : 1)
2,55 g (72%)
Schmp.: >300°C
R_F = 0,52 (CH₂Cl₂/CH₃OH = 5 : 1)
[α] 22|D = +88,7° (c = 0,8; CH₃OH)
HPLC: >97% (LiChrospher RP 18, CH₃CN/(H₂O+0,01 N TBAS = 30 : 70, Flow 1 ml/Min.]
¹H-NMR (400 mHz, d₆-DMSO) 1,49-1,69 (m, 3H); 1,85-1,98 (m, 1H); 2,01-2,25 (m, 4H); 2,44-2,53 (m, 1H); 3,75 u. 4,38 (2 m, 2H, CH-[NH] u. CH-N); 7,32-8,3 (m, 8H, Ph, N-CH=CH, NH-[CH]); 11,23 (s, 1H, NH-CO) Beispiel 18 1-[(1R, 5R, 8R)-3oxo-2-azabicyclo[3.3.1]nonan-8-yl]-cytosin 14
0,96 g (24 mMol) NaH (60%1 g) werden in 75 ml DMF vorgelegt und 2,22 g (20 mMol) Cytosin zugegeben; anschließend rührt man bis die H₂-Entwicklung beendet ist. Dann setzt man 5,3 g (20 mMol) (1R, 5R, 8R)-8-Jod-2-azabicylclo[3.3.1]nonan-3- on 1 zu und rührt bei Raumtemperatur weitere 15 Stdn. Das DMF wird unter Vakuum abdestilliert und der Rückstand mit 2,7 g (20 mMol) KH₂PO₄ gelöst in 100 ml Wasser versetzt. Die wäßrige Phase wird zunächst zweimal mit Ethylacetat gewaschen, dann auf eine XAD 16-Säule gegeben. Die Säule wäscht man gut mit Wasser und anschließend mit Methanol. Aus der Methanolfraktion erhält man das Produkt, das mit Ethylacetat verrührt, abgesaugt und getrocknet wird.
3,42 g (69%)
Schmp.: >300°C
R_F = 0,26 (Aceton/CH₂Cl₂/CH₃OH/EtOAc/H₂O/AcOH = 9 : 6 : 2 : 2 : 2 : 1) [α] 22|D = +103° (c = 0,4; CH₃OH)
HPLC: 98% [Cyclobond I, CH₃CN/(H₂O+0,01 N TBAS) = 75 : 25]
¹H-NMR (400 mHz, d₆-DMSO) 1,45-1,63 (m, 3H); 1,7-1,83 (m, 1H); 1,9-2,1 (m, 3H); 2,12-2, 2 (m, 1H); 2,39-2,48 (m, 1H); 3,65 u. 4,21 (2 m, 2H, CH-[NH] u. CH-N); 5,71 u. 7,71 (2d, 2H, N-CH=CH); 6,80-7,15 ("m", 2H, NH₂); 7,92 (d, 1H, NH-[CH]) Beispiel 19 1-[(1R, 5R, 8R)-3oxo-2-azabicyclo[3.3.1]nonan-8-yl]-cytosin 14
1,11 g (10 mMol) Cytosin, 2,65 g (10 mMol) (1R, 5R, 8R)-8-Jod-2- azabicylclo[3.3.1]nonan-3-on 1 und 2,1 g (15 mMol) K₂CO₃ in 50 ml DMSO werden 2 Tage bei Raumtemperatur gerührt. Das DMSO wird unter gutem Vakuum weitestgehend abdestilliert, der Rückstand in Wasser aufgenommen und auf eine XAD 16-Säule gegeben; diese wird zunächst mit Wasser gut gewaschen, anschließend kann mit Methanol das Reaktionsprodukt heruntergelöst werden. Die endgültige Reinigung erfolgt durch Chromatographie.
(SiO₂ : Aceton/CH₂C12/CH₃OH/EtOAc/H₂O/AcOH = 9 : 6 : 2 : 2 : 2 : 1)
1 g (40%)
Physikalische Daten siehe Beispiel 18 Beispiel 20 N⁴-Benzoyl-N⁴-(tert.butoxycarbonyl)-1-[(1R, 5R, 8R)-3oxo-2- tert.butoxycarbonyl 2-azabicyclo[3.3.1]nonan-8-yl)-cytosin 18
In 100 ml Acetonitril werden 3,5 g (10 mMol) N⁴-Benzoyl-1-[(1R, 5R, 8R)-3oxo-2- azabicyclo[3.3.1]nonan-8-yl]-cytosin 17 6,55 g (30 mMol) Pyrokohlensäure-di- tert. butylester und 250 mg DMAP 24 Stdn. bei Raumtemperatur gerührt. Die Reaktionsmischung wird unter Vakuum eingedampft und der Rückstand chromatographisch gereinigt. (SiO₂: EtOAc)
3,86 g (70%)
Schmp.: 181°C
R_F = 0,61 (EtOAc)
[α] 22|D = +15,3° (c = 1; CH₃OH)
HPLC: 98% [Cyclobond I, CH₃CN/(H₂O+0,01 N TBAS) = 98 : 2]
¹H-NMR (400 mHz, d₆-DMSO) 1,27 u. 1,41 (2s, 18H, 2tert.Bu); 1,45-1,54 (m, 1H); 1,72-1,82 (m, 1H); 1,83-1,97 (m, 3H); 1,99-2,12 (m, 1H); 2, 2-2,36 (m, 2H); 2,65-2,75 (m, 1H); 4,37 u. 4,41 (2 m, 2H, CH-[NH] u. CH-N); 6,97 u. 8,31 (2d, 2H, N-CH=CH); 7,55-7,88 (m, 5H, Ph) Beispiel 21 N⁴-Di-(tert.butoxycarbonyl)-1-[(1R, 5R, 8R)-3oxo-2-tert.butoxycarbonyl-2- azabicyclo[3.3.1]nonan-8-yl]-cytosin 15
In 300 ml Methylenchlorid werden 9,0 g (36,2 mMol) 1-[(1R, 5R, 8R)-3oxo-2- azabicyclo[3.3.1]nonan-8-yl]-cytosin 14, 5 ml (36,5 mMol) TEA, 31,6 g (145 mMol) Pyrokohlensäure-di-tert.butylester und 200 mg DMAP werden ca. 4 Stdn. unter Rückfluß gekocht. (DC-Kontrolle: Aceton/CH₂Cl₂/CH₃OH/EtOAc/H₂O/AcOH = 9 : 6 : 2 : 2 : 2 : 1) Nach dem Eindampfen wird der Rückstand mit ca. 50 ml EtOAc verrührt, abgekühlt und abgesaugt. (9,8 g) Aus der Mutterlauge können weitere 4,1 g durch Chromatographie isoliert werden. (SiO₂: EtOAc)
13,9 g (70%)
Schmp.: 208°C
R_F = 0,62 (EtOAc)
[α] 22|D = +16,1° (c = 0,99; CH₂C12)
HPLC: >98% [LiChrospher RP 18, CH₃CN/(H₂O+0,01 N TBAS = 60 : 40, Flow 1 ml/Min.]
¹H-NMR (400 mHz, CDCl₃) 1,53 u. 1,56 (2s, 27H, 3tert.Bu); 1,53-1,56 (m, 1H); 1,78-1,88 (m, 1 H); 1,96-2.2 (m, 4H); 2,31-2,48 (m, 2H); 2,68-2,79 (m, 1H); 4,35 u. 4,63 (2 m, 2H, CH-[NH] u. CH-N); 7,03 u. 7,72 (2d, 2H, N-CH=CH) Beispiel 22 N⁴-tert.Butoxycarbonyl-1-[(1R, 2R, 4R)-2-tert.butoxycarbonylamino-4- carboxymethyl-cyclohex-1-yl]-cytosin 16
5 g (9 mMol) N⁴-Benzoyl-N⁴-(tert.butoxycarbonyl)-1-[(1R, 5R, 8R)-3oxo-2- tert.butoxycarbonyl-2-azabicyclo[3.3.1]nonan-8-yl]-cytosin werden in 180 ml THF vorgelegt. Bei -10°C werden innerhalb 30 Min. 1,9 g (45 mMol) LiOH-Monohydrat in 45 ml Wasser zugetropft. Nach der Zugabe von 30 ml Methanol wird 2 Stdn. bei -10°C und ca. 18 Stdn. bei Raumtemperatur gerührt. Die organischen Lösemittel werden im Vakuum abdestillert, die wäßrige Phase wird mit verdünnter HCl auf pH3 gestellt und mit Methylenchlorid extrahiert. Dieses wird getrocknet, eingedampft und der Rückstand durch Chromatographie gereinigt. (SiO₂: CH₂Cl₂/CH₃OH = 95 : 5)
1,8 g(43%)
Schmp.: >300°C
R_F = 0,7 (CH₂C12/CH₃OH = 5 : 1))
[α] 22|D = +29,6° (c = 0,54 CH₂OH)
HPLC: 98% [Cyclobond I, CH₃CN/(H₂O+0,01 N TBAS) = 90 : 10]
¹H-NMR (400 mHz, d₆-DMSO) 1,05 u. 1,25 (25, 18H, 2tert. Bu); 1, 0-1,14 (m, 1H); 1,4-1,78 (m, 6H); 1,9-2,05 (m, 2H); 3,6 u. 4,22 (2 m, 2H, CH-[NH] u. CH-N); 6,62 (d, 1H, NH-[CH]); 6,7 u. 7,89 (2s, 2H, N-CH=CH) 9,5-12,5 (2H, NH-C, CO₂H) (R)-Guanin-Baustein Schema 7

Beispiel 23 2-Amino-6-chlor-9-((1R, 5R, 8R)-3oxo-2-azabicyclo[3.3.1]nonan-8-yl]-purin 19
2 g (50 mMol) NaH (60%ig) werden in 150 ml DMF vorgelegt. Bei 0°C in kurzer Zeit portionsweise 13,25 g (50 mMol) (1R, 5R, 8R)-8-Jod-2-azabicylclo[3.3.1]nonan-3-on 1 zugegeben; nach etwa 30 Min. bei 0°C ist die H₂-Entwicklung beendet und 8,5 g (50 mMol) 2-Amino-6-chlor-purin werden zugesetzt. Anschließend wird die Reaktionsmischung 24 Stdn. bei Raumtemperatur gerührt. Nach dem Abdestillieren des DMF unter Vakuum wird der feste Rückstand mit etwa 70 ml Wasser angeteigt abgesaugt und mit Aceton gewaschen: 7,8 g reines Reaktionsprodukt; aus dem Filtrat können nochmals 3.9 g Produkt durch Chromatographie (SiO₂: CH₂Cl₂/CH₃OH = 9 : 1) isoliert werden.
11,7 g(76%)
Schmp.: 275°C
R_F = 0,55 (CH₂Cl₂/CH₃OH = 5 : 1)
HPLC: 98% [Cyclobond I, CH₃CN/(H₂O+0,01 N TBAS) = 92,5 : 7,5]
[α] 22|D = -10,8° (c = 1; CH₃OH)
¹H-NMR (400 mHz, d₆-DMSO) 1,57-1,73 (m, 3H); 1,92-2,28 (m, 5H); 2,47-2,56 (m, 1H); 4,24 (m, 1H, HC-[NH]); 4,39 (m, 1H, CH-N); 6,82 (s, 2H, NH₂); 7,92 (d, 1H, NH- CO); 8,36 (s, 1H, -CH=) Beispiel 24 2-Amino-6-chlor-9-[(1R, 5R, 8R)-3oxo-2-azabicyclo[3.3.1]nonan-8-yl]-purin 19
2,65 g (10 mMol) (1R, 5R, 8R)-8-Jod-2-azabicylclo[3.3.1]nonan-3-on 1, 1,7 g (10 mMol) 2-Amino-6-chlor-purin und 2,1 g (15 mMol) K₂CO₃ werden in 50 ml DMSO 24 Stdn. bei Raumtemperatur gerührt. Nach dem Abdestillieren des DMSO unter Vakuum wird der Rückstand in 50 ml Wasser angeteigt, abgesaugt und mit Aceton gewaschen; man erhält 1,8 g reines Produkt, aus dem Filtrat isoliert man chromatographisch (SiO₂: CH₂Cl₂/CH₃OH = 9 : 1) weitere 0.3 g.
2,1 g (69%)
Physikalische Daten siehe Beispiel 28 Beispiel 25 2-[Di-(tert.Butylcarbonyl)-amino]-6-chlor-9-[(1R, 5R, 8R)-3oxo-2- tert.butoxycarbonyl-2-azabicyclo[3.3.1]nonan-8-yl]-purin 20
In 250 ml Methylenchlorid werden 12,73 g (41,5 mMol) 2-Amino-6-chlor-9-[(1R, 5R, 8R)-3oxo-2-azabicyclo[3.3.1]nonan-8-yl]-purin 19, 5,75 ml (41,5 mMol) TEA, 31,7 g (145 mMol) Pyrokohlensäure-di-tert.butylester und 150 mg DMAP ca. 12 Stdn. unter Rückfluß gekocht. (DC-Kontrolle: (CH₂Cl₂/CH₃OH = 5 : 1) Zur Aufarbeitung wird das Lösungsmittel abdestilliert und der Rückstand chromatographisch gereinigt.
(SiO₂ : EtOAc)
18,6 g (74%)
R_F = 0,74 (EtOAc)
HPLC: >98% [LiChrospher RP 18, CH₃CN/(H₂O+0,01 N TBAS) = 90 : 10]
[α] 22|D = -62° (c = 1,1; CH₃OH)
¹H-NMR (400 mHz, d₆-DMSO) 1,36 u. 1,48 (2s, 27H, 3tert.Bu); 1,60-1,85 (m, 3H); 2,02-2,13 (m, 2H); 2,17-2,27 (m, 1H); 2,35-2,49 (m, 2H); 2,77-2,89 (m, 1H); 4,85 (m, 1H, HC-[NH]); 5,21 (m, 1H, CH-N); 8,99 (s, 1H, -CH=) Beispiel 26 N²-tert.Butoxycarbonyl-9-[(1R, 2R, 4R)-2-tert.butoxycarbonylamino-4- carboxymethyl-cyclohex-1-yl]-guanin 22
4,1 g (6,75 mMol) 2-[Di-(tert.Butylcarbonyl)-amino]-6-chlor-9-[(1R, 5R, 8R)-3oxo-2- azabicyclo[3.3.1]nonan-8-yl]-purin 20 werden in 30 ml Methylenchlorid bei 0°C vorgelegt. Anschließend werden 2,3 g (32,5 mMol) 3-Hydroxy-propionitril, 3,84 g (65 mMol) Trimethylamin und 1,5 g (9,25 mMol) DBU zugegeben und 16 Stdn. bei Raumtemperatur gerührt. Nach dem Abdestillieren aller flüchtigen Bestandteile unter Vakuum wird der Rückstand mit wäßriger KH₂PO₄-Lösung sauer gestellt und mehrmals mit Methylenchlorid extrahiert. Aus der organischen Phase erhält man nach dem Trocknen und Eindampfen einen festen Rückstand (4,26 g), den man in 145 ml Methanol löst und bei -15°C innerhalb 30 Min. mit einer Lösung von 1,52 g (36,2 mMol) LiOH-Monohydrat in 36 ml Wasser versetzt. Dann wird 2 Stdn. bei -10°C und 20 Stdn. bei Raumtemperatur gerührt. Zur Aufarbeitung wird das Methanol unter Vakuum abdestilliert, der wäßrige Rückstand mit etwas Wasser verdünnt, dann mit verdünnter Salzsäure auf pH3 gestellt und mit Methylenchlorid extrahiert. Das Reaktionsprodukt wird chromatographisch gereinigt.
(SiO₂ : Aceton/CH₂Cl₂/CH₃OH/EtOAc/ H₂O/AcOH = 9 : 6 : 2 : 2 : 2 : 1)
2,87 g (84%)
Schmp. >300°C (Zers.)
R_F = 0.79 (Aceton/CH₂Cl₂/CH₃OH/EtOAc/H₂O/AcOH = 9 : 6 : 2 : 2 : 2 : 1)
R_F = 0.37 (CH₂Cl₂/CH₃OH = 5 : 1)
HPLC: >98% (Cyclobond I, CH₃CN/(H₂O+0,01 N TBAS) = 90 : 10]
[α] 22|D = +3,41° (c = 1; CH₃OH)
¹H-NMR (400 mHz, d₆-DMSO) 1,18 u. 1,48 (25, 18H, 2tert. Bu); 1,1-1.22 (m, 1H); 1,74-1,84 (m, 1H); 1,85-1,98 (m, 4H); 2,10-2,25 (m, 3H); 3,87-4,13 (m, 2H, CH-[NH], CH-N); 6,78 (d, 1H, NH-C[H]); 7,79 (s, 1H, N-CH=N); 11,02, 11,28 u. 12,1 (3s, 3H, NH, NH, CO₂H) Beispiel 27 N²-Di-(tert.Butylcarbonyl)-9-[(1R, 5R, 8R)-3oxo-2-tert.butoxycarbonylamino-2- azabicyclo-[3.3.1]nonan-8-yl]-guanin 21
37,8 g (62,3 mMol) 2-[Di-(tert.Butylcarbonyl)-amino]-6-chlor-9-[(1R, 5R, 8R)-3oxo-2- tert.butoxycarbonyl-2-azabicyclo[3.3.1]nonan-8-yl]-purin 20 werden in 190 ml Methylenchlorid vorgelegt. Bei 0°C werden 21,4 ml (313 mMol) 3Hydroxy-propionitril, 62,3 ml (ca 660 mMol) Trimethylamin und 9,13 ml (59 mMol) DBU zugegeben und anschließend 15 Stdn. bei Raumtemperatur gerührt. Dann werden im Vakuum alle flüchtigen Bestandteile abdestilliert, der Rückstand wird mit 300 ml wäßriger KH₂PO₄ Lösung versetzt und mit Methylenchlorid extrahiert. Aus der organischen Phase erhält man nach dem Trocknen und Eindampfen erhält man einen festen Rückstand, den man mit Diisopropylether behandelt und absaugt. (ca. 27,2 g) Die Reinigung erfolgt durch Chromatographie. (SiO₂: EtOAc/CH₃OH = 10 : 1)
25,5 g (69,5%)
R_F = 0,28 (EtOAc/CH₃OH = 5 : 1)

Beispiel 28

Festphasensynthese von (R,R,R)-enatiomeren oder (S,S,S)-enantiomeren CNA- Oligomeren

28.1 Festphasensynthese des CNA-Oligomers (R)-CNA[H(AATAT)OH] 28.1.1 Beladung des Trägers mit C-terminalen Monomeren 5 oder 10

Tentagel S HMB-Harz (100 mg; 28 µmol; Kapazität = 0.28 mmol/g) wird in eine 2 ml Spritze gegeben und mit wasserfreiem DMF (1.5 ml) 5 min bei Raumtemperatur gequollen und anschliessend das Lösungsmittel entfernt. Das Monomer 5 (32 mg, 84 µmol) wird in wasserfreiem DMF (200 µl) suspendiert und mit 200 µl einer Lösung aus HATU (32 mg, 84 µmol) in wasserfreiem DMF und DIPEA (36 mg, 280 µmol) versetzt. Nach fünfminütigem leichten Schütteln wird eine blaß-gelbe Lösung erhalten. Nach Zugabe der Lösung zum Harz wird die resultierende Suspension 8 h bei Raumtemperatur geschüttelt. Anschließend wird die Reaktionslösung entfernt und das Harz DMF (6 × 1.5 ml) und CH₂Cl₂ (6 × 1.5 ml) gewaschen und im Vakuum getrocknet.
Der beschriebene Reaktionszyklus wird unter Verwendung der selben stöchiometrischen Mengen an Reaktanden wiederholt, wobei die Inkubation der festen Phase mit den Monomeren 5 oder 10 über Nacht bei Raumtemperatur durchgeführt wird. Nach Beendigung der Umsetzung werden die überschüssigen Reaktanden entfernt. Das erhaltene Harz-Addukt wird DMF (6 × 1.5 ml), CH₂Cl₂ (6 × 1.5 ml)und Diethylether (3 × 1.5 ml) gewaschen und danach gründlich im Vakuum getrocknet.
Nach Abspaltung einer Probe der an den Harzträger angebundenen Monomere liefert eine HPLC-Analyse (Methode A) eine Beladung von 0.11-0.14 mmol/g. Zur quantitativen Bestimmung der Beladung des Harzes mit den jeweiligen Monomeren wird eine definierte Menge (ca. 3-4 mg) des Harzes (m_Harz) mit 2 N NaOH (150 µl) 30 min bei Raumtemperatur behandelt. Das Harz wird anschließend abfiltriert und zweimal mit der gleichen Menge 2 N NaOH (150 µl) gewaschen. Die Filtrate werden vereinigt und mit 2 N NaOH auf ein Volumen von 1 ml aufgefüllt. Zur spektrometrischen Untersuchung des Filtrates wird eine 100 µl Probe dieser Lösung entnommen und mit 2 N NaOH auf 1 ml verdünnt. Die Extinktion E des so verdünnten Filtrates wird bei 273 nm, im Falle des Vorliegens von CNA-Thymin-Derivativen (E_{273 nm} = 11500 l.mol^-1.cm^-1), respektive bei 260 nm, im Falle des Vorliegens von CNA-Adenin-Derivativen (E_{260 nm} = 15400 l.mol^-1.cm^-1), bestimmt. Die Kapazität X [mmol/g] des Harzes kann daraus mit Hilfe der erhaltenen Werte nach folgender Formel berechnet werden:

X = V × E/(ε × d × m_Harz)
Zum Cappen freier Hydroxygruppen wird das Harz in CH₂Cl₂ (700 µl) suspendiert und mit Ac₂O (206.7 mg; 2.0 mmol) und DIPEA (256.7 mg; 2.0 mmol) 15 min. bei Vorliegen des Adenin-Monomers, oder 1 h, bei vorliegen eines Thymin-Monomers, bei Raumtemperatur behandelt. Anschließend werden überschüssige Reaktanden entfernt und das Harz mit CH₂Cl₂ (10 × 1,5 ml) gewaschen und danach gründlich getrocknet.

28.1.2 Voraktivierung der Monomere 5 und 10

Zu einer Lösung der Monomeren 5 oder 10 (42 µmol) in wasserfreiem DMF (150 µl) wird HATU (42 µmo)l (Perseptive Biosystems) hinzugefügt. Anschließend wird der Ansatz 1 min geschüttelt. Nach fünfminütiger Inkubation der resultierenden Suspension mit DIEA (10.9 mg, 84 µmol) bei Raumtemperatur wird eine blaß-gelbe Lösung erhalten. Das so aktivierte Monomer kann nun zur Festphasenreaktion (Oligomerisierung) eingesetzt werden.

28.1.3 Überprüfung der Kupplungseffizienz

Die Effizienz der Kupplungsreaktion wird mittels RP-HPLC (Methode C) überprüft. Dazu wird eine Probe des Harzes (ca. 1 mg) aus dem Reaktionsansatz entnommen und 5-10 min mit 2 N NaOH/MeOH (90 µl, 1 : 1) behandelt. Anschließend wird die Probenlösung mit 2 N HCl (90 µl)neutralisiert und über RP-HPLC analysiert.

28.1.4 Syntheseprotokoll (s. Tabelle 1)

100 mg des Harzes (14 µmol; Kapazität: 0.14 mmol/g), beladen mit den Monomeren 5 oder 10 werden in eine Spritze (2 ml) gegeben. Die N-terminale Boc-Schutzgruppe wird mit TFA-CH₂Cl₂ 1 : 1 (1.5 ml), Verfahrensschritt 1) für 5 min bei Raumtemperatur abgespalten. Die Reaktionslösung wird entfernt und erneut frisches Entschützungsreagenz [TFA-CH₂Cl₂ 1 : 1 (1.5 ml)] hinzugegeben und weitere 30 min bei RT inkubiert. Das Harz wird mit CH₂Cl₂ (2 × 1.5 ml) gewaschen, mit 1 M DIEA in DMF (4 × 1.5 ml) neutralisiert, danach erneut mit DMF (6 × 1.5 ml) und mit CH₂Cl₂ (6 × 1.5 ml) gewaschen (Verfahrensschritte 2 bis 4, Tabelle 1). Das Boc-entschützte Harz wird im Vakkum getrocknet und im Anschluss 5 min mit wasserfreiem DMF (1.5 ml) behandelt. Nach Entfernung des DMF wird die Lösung des aktivierten Monomers 5 oder 10 (42 µmol) (s 1.1.2) hinzugefügt. Die Suspension wird 4 h geschüttelt (Verfahrensschritt 5, Tabelle 1). Nach Abschluss der Kupplung wird der Überstand abfiltriert und das Harz mit DMF (6 × 1.5 ml) und mit CH₂Cl₂ (6 × 1.5 ml) gewaschen (Verfahrensschritt 6, Tabelle 1). Eine Probe des harzgebundenen Kupplungsproduktes wird zur HPLC-Analyse (siehe oben, Methode C) entnommen. Da die Kupplung quantitativ verläuft ist ein nachfolgendes Cappen freier terminaler Aminofunktionen nicht notwendig.

28.1.5 Abspaltung der N-terminal substituierten Oligomere vom Träger

Nach Abschluß der Oligomerisierung wird das Produkt durch zweistündige Behandlung des harzgebundenen Oligomers mit 2 ml einer 2M wässrigen NaOH- Lösung in MeOH (1 : 1) bei Raumtemperatur vom Träger abgespalten. Nach Neutralisierung der Lösung mit 2M HCl, kann das erhaltene Oligomer mittels RP- HPLC (Method D) gereinigt werden. Die Produkt enthaltenden Fraktionen werden vereinigt und mittels Lyophilisation aufkonzentriert.
ESI-MS: (R)-CNA[H(AATAT)OH] (1360.7 [M + H]⁺, M_calc. = 1360.7 RP-HPLC (Method C): (R)-CNA[H(AATAT)OH] (R_t = 15.0 min). Tm value = 27.4°.
Alle nach dieser Methode synthetisierten CNA-Oligomere sind in der folgenden Tabelle 2 aufgelistet. Tabelle 2 Charakterisierung der CNAs mittels RP-HPLC und ESI-MS

a) (R)-(X)_n und (S)-(X)_n stehen für (1'R, 2'R, 4'R)-CNA-[H(X)_nOH], (1'S, 2'S, 4'S)- CNA-[H(X)_nOH], X: sind dabei die Monomerbausteine T, C, G and A, phba: (HO₂P(=O)-O-(CH₂)₃-C(=O) Radikal, Lys: Lysinrest, Ac: Acetylrest.
b) Methode B: Merck LiChrospher, 5 µm, 250 × 4.0 mm; Elution mit Wasser (0.1% TFA), und einem linearen Gradienten von MeCN [(0.1% TFA), 10-40% innerhalb 30 min].
c) Methode C: Merck LiChrospher, 5 µm, 250 × 4.0 mm; Elution mit Wasser (0.1% TFA), und einem linearen Gradienten von MeCN [(0.1% TFA), 10-30% innerhalb 40 min].
d) Das beobachtete relative Molekulargewicht wurde ausgehend vom einfach positiv geladenen Molekülion des jeweiligen CNA Oligomeres erhalten.

28.1.6 CNA/p-RNA Hybridisierung

Die Oligonukleotidstränge der CNA und p-RNA wurden in 5 mM Tris HCl Puffer derart gelöst, dass eine CNA Konzentration von 5 µM und eine equimolare p-RNA Konzentration von 5 µM vorlag. Die Lösung wurde anschließend im Temperaturbereich von 35°C bis -8°C (Vorschubgeschwindigkeit 80 s/°C) bei einer Wellenlänge von 265 nm absorptionsspektroskopisch untersucht.
Die Absorptionswerte wurden mit einem Perkin Eimer Gerät (Lambda 2) aufgezeichnet. Fig. 1A zeigt, dass selbst die kurze 5-mer Heteroduplex (Fig. 1B) stabil paart. Der Schmelzpunkt liegt bei 14°C. Darüber hinaus zeigt dieses Beispiel, dass die Paarung auch unter Niedrigsalzbedingungen erfolgt.

Beispiel 29

Verbesserung der Löslichkeit von CNAs durch Einführung einer Butyrophosphatgruppe

29.1 Addition von Di(p-methoxyphenyl)phenylmethyl-geschützter 4- Hydroxybutansäure an den N-Terminus des harzgebundenen Pentamers (R)- CNA[H(AATAT)OH]

Eine Lösung aus 4-(4,4-dimethoxytrityloxy)butansäure (57 mg, 140 µmol) [14] und HATU (53 mg, 140 µmol) in DMF (400 µl) wird vor der Zugabe von DIEA (27 mg, 210 µmol) 10 min gerührt, nach weiteren 2 min wird die Lösung zu 100 mg des, mit dem Pentamerrest (R)-CNA[H(AATAT)OH] beladenen Tentagel S HMB-Harzträger (0.14 mmol/g, 0.014 mmol) gegeben. Anschließend wird das Harz analog der Verfahrensschritte 1-4 (Tabelle 1) behandelt. Abschließend wird der Überstand abfiltriert, das modifizierte Harz DMF (4 × 4 ml) und CH₂Cl₂ (2 × 4 ml) gewaschen.

29.2 Detritylierung

Zur Detritylierung wird das modifizierte Harz mit einer 6%igen Lösung aus Dichloroessigsäure in CH₂Cl₂ je fünfmal 2 min lang behandelt, mit CH₂Cl₂ (4 × 4 ml) und mit MeCN (4 × 4 ml) gewaschen und abschließend über Nacht im Hochvakuum über P₂O₅ getrocknet.

29.3 Phosphorylierung und Oxidation

Das getrocknete modifizierte Harz wird 10 min mit 2 ml einer 0.5M Lösung aus Pyridinium-hydrochlorid in wasserfreiem MeCN gequollen. Das Reaktionsgefäß wird anschließend unter Ar-Atmosphäre gesetzt und mit einer Lösung aus 0.5M Pyridinium-hydrochlorid in MeCN (780 µl) und MeCN (145 µl) versetzt.
Anschliessend wird eine Lösung aus Bis-(2-cyanoethyl)-N,N-diisopropylamino phosphoramidit in wasserfreiem MeCN (75 µl, 300 mM) zu dem modifizierten Harz pipettiert und 45 min geschüttelt. Nach Entfernung des Überstandes wird dem Harz ein weiteres mal frisches Phosphorylierungsreagenz hinzugefügt und für 45 min behandelt. Der beschriebene Reaktionszyklus wird insgesamt viermal durchgeführt. Anschließend wird das Harz vom Überstand befreit und mit MeCN (6 × 1 ml) gewaschen und danach 3 × mit 1.5 ml einer iodhaltigen Oxidationslösung aus 5 mmol 10d, 223 mmol Collidin in MeCN/H₂O (64 : 36) 2 min behandelt. Nach vollständiger Oxidation wird das phosphorylierte Oligomer 5 × mit 1.5 ml einer 0.5M Lösung aus Pyridiniumhydrochlorid in wasserfreiem MeCN und 5 × mit 1,5 ml MeCN gewaschen.

29.4 Eliminierung der Cyanoethylgruppen

Das beladene Harz wird 15 h bei Raumtemperatur mit 1.5 ml einer 2.7M Lösung aus DBU in MeCN behandelt und anschließend mit MeCN (6 × 1.5 ml) und mit CH₂Cl₂ (6 × 1,5 ml) gewaschen.

29.5 Abspaltung des N-Terminal substituierten Oligomers vom Träger

Nach Abschluß der Synthese wird das phosphorylierte Produkt durch zweistündige Behandlung bei Raumtemperatur mit 2 ml einer 2M wässrigen NaOH-Lösung in MeOH (1 : 1) vom Träger abgespalten. Nach Neutralisierung mit 2M HCl wird das phosphorylierte Oligomer-Rohprodukt über eine RP-HPLC (Method D) gereinigt. Die erhaltenen Oligomerfraktionen werden vereinigt und mittels Lyophilisation aufkonzentriert.
ESI-MS: (R)-CNA[phba(AATAT)OH](1527.0 [M + H]⁺, 764.5 [M + 2H]²⁺; Mcalc. = 1526.6 RP-HPLC (Method C): (R)-CNA[phba(AATAT)OH] (R_t = 22.9 min). Tm value = 33.6°.

Beispiel 30

Verbesserung der Löslichkeit von CNAs durch direkte Einführung von 4- [[bis(phenylmethoxy)phosphinyl]oxy]-butansäure

30.1 Synthese von 4-Hydroxybutansäuremethylester

Butyrolacton (12 g, 140 mmol), MeOH (130 ml) und konz. Schwefelsäure (8 Tropfen) werden zusammen für 8 h unter Rückfluß erhitzt. Man läßt auf RT abkühlen und fügt unter Eis/Salz-Kühlung NaHCO₃ (1 g) hinzu und rührt für weitere 10 min. Der feste Rückstand wird abfiltriert und das Lösungsmittel am RV entfernt. Die erhaltene farblose Flüssigkeit wird chromatographisch an Kieselgel aufgereinigt (14 × 5,5 cm, Et₂O/CH₂Cl₂ 3 : 2). Die reinen Esterfraktionen werden vereinigt und nach Entfernen des Lösungsmittels resultieren 1,5 g (12,7 mmol, 9%) des Esters.

30.2 Synthese 4-[[Bis(phenylmethoxy)phosphinyl]oxy]-butansäuremethylester

6,9 g (19,7 mmol) Tribenzylphosphit werden in abs. CH₂Cl₂ (70 ml) gelöst und bei 0°C portionsweise Iod (4,59 g, 18 mmol) hinzugefügt. Das Iod löst sich innerhalb von 30 min, so daß eine klare farblose Lösung resultiert. HBU-Methylester (1,94 g, 16,4 mmol) werden in abs. CH₂Cl₂ (150 ml) gelöst und mit einem Eis/Salz-Gemisch auf -10°C gekühlt und Pyridin (5,3 ml = 5,18 g, 65,7 mmol) hinzugefügt. Nun wird die Lösung an Phosphorylierungreagenz innerhalb von 30 min hinzugetropft und weitere 10 min gerührt. Nach Hinzufügen von 20-%iger Zitronensäure (3 × 80 ml) wird ausgeschüttelt und zweimal mit Wasser (80 mnl) über Na₂SO₄ getrocknet. Die Chromatographie an Kieselgel (11,5 × 5,5 cm, 400 ml CH₂Cl₂, je 200 ml CH₂Cl₂/MeOH 20 : 1 und 15 : 1 dann mit 10 : 1 bis das Produkt eluiert) liefert das gewünschte Produkt (4,75 g, 12,1 mmol, 74%).

30.3 Synthese von 4-[[Bis(phenylmethoxy)phosphinyl]oxy]-butansäure

4-[[Bis(phenylmethoxy)phosphinyl]oxy]-butansäuremethylester (2 g, 5,3 mmol) wird in MeOH (150 ml) gelöst, mit 1M NaOH (15 ml) versetzt und der Ansatz für 6 h bei RT gerührt. Das Reaktionsvolumen wird bei RT am RV auf die Hälfte eingeengt, mit 1M NaOH (60 ml) vesetzt und die Lösung dreimal mit Et₂O extrahiert. Die wäßrige Phase wird isoliert, mit konz. HCl angesäuert (pH 1-2) und dreimal mit Essigsäureethylester extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen werden über Na₂SO₄ getrocknet und die reslutierende milchige Suspension an Kieselgel aufgereinigt (8 × 5,5 cm, CH₂Cl₂/MeOH 8 : 1). Man erhält 1,2 g des gewünschten Produktes (3,3 mmol, 62%).

30.4 Synthese von (R)-CNA[phba(ATATT)OH]

65 mg (6 µmol) des mit (R)-CNA[H(ATATT)OH]-Oligomer belegten Trägers werden in einer Spritze vorgelegt (2 ml). Die N-terminale Boc-Schutzgruppe wird durch Einwirkung mit TFA-CH₂Cl₂ 1 : 1 (1,5 ml) für 5 min entfernt. Frisches Entschützungreagenz wird hinzugefügt und die Boc-Entschpützungsreaktion für weitere 30 min bei RT vorgenommen. Die Reaktionslösung wird entfernt, der Träger mit CH₂Cl₂ (2 × 1.5 ml) gewaschen, mit 1M DIPEA in DMF (4 × 1.5 ml) neutralisiert und mit DMF (6 × 1.5 ml) und CH₂Cl₂ (6 × 1.5 ml) gewaschen (Operationen 2-4). Der Boc-entschützte Träger wird dann für 5 min mit abs. DMF (1.5 ml) gequollen und das Lösungsmittel abfiltriert. 4-[[Bis(phenylmethoxy)phosphinyl]oxy]-butansäure (6,6 mg, 18 µmol) werden in abs. DMF (250 µl) gelöst, HATU (6,9 mg, 18 µmol) hinzugefügt und DIPEA (6,3 µl, 36 µmol) hinzupipettiert. Nach ca. 2 min erhält man eine klare leicht gelb gefärbte Lösung, die zum Boc-entschützten hinzugefügt wird. Die Kupplung wird für 4 h bei RT durchgeführt. Nach Abspaltung der Benzylschutzgruppe mit TFA-H₂O-Triethylsilan (2 ml; 95 : 2,5 : 2,5) resultiert das phosphorylierte Pentamer in nahezu quantitativer Ausbeute.

Beispiel 31

C-terminale Peptidkonjugation eines CNA-Oligonukleotides in Lösung

31.1 lodacetylierung von (S)-CNA[Ac(AATAT)-Lys-OH] an der ε-Aminofunktion von Lysin

690 nmol (S)-CNA[Ac(AATAT)-Lys-OH werden in 800 pl 0.1 M Natriumhydrogencarbonat/DMF (1 : 2) gelöst und mit 150 Equivalenten Iodessigsäure-N- succinimidylester (102 µmol, 28.9 mg) unter Lichtausschluß 2 h geschüttelt. Das Produkt (S)-CNA[Ac(AATAT)-Lys(N^ε-Iodacetyl)-OH] wird direkt über präparative RP- HPLC aufgereinigt und über eine RP-C18 Kartusche entsalzt.
Für schwer lösliche Oligonukleotide kann als Lösugsmittelgemisch DMSO mit 3 Equivalenten Pyridin, bezogen auf das eingesetzte Oligonukleotid, verwendet werden.

31.2 Konjugation von (S)-CNA[Ac(AATAT)-Lys(N^ε-lodacetyl)-OH] mit H-Cys-Ser- Lys-Val-Gly-OH (Konjugat 1)

106 nmol (S)-CNA[Ac(AATAT)-Lys(N^ε-lodacetyl)-OH] werden in 20 µl DMF gelöst und anschließend mit einer Lösung aus H-Cys-Ser-Lys-Val-Gly-OH (256 nmol, 162 µg) in 20 µl DMF/EDTA-Borax-HCl-Puffer (pH = 7.5) versetzt. Der Ansatz wird 2 h unter Lichtausschluß geschüttelt, bis das Oligonukleotid vollständig reagiert hat. Das CNA-Konjugat (Konjugat 1) wird anschließend direkt über RP-HPLC aufgereinigt und über eine RP-C18 Kartusche entsalzt.

Beispiel 32

N-terminale Peptidkonjugation von harzgebundenen CNA-Oligonukleotiden (Konjugat 2)

C-terminal an Harz gebundenes (S)-CNA(Lys(TTTTT)OH] (200 nmol, bezogen auf das Oligonukleotid, Beladung 0.11 mmol/g, 2 mg Harz) werden mit 300 µl einer 0.1M Natriumhydrogencarbonat/DMF (1 : 2)-Lösung und 150 Equivalenten Iodessigsäure- Nsuccinimidylester (30 µmol, 8.5 mg) versetzt und unter Lichtausschluss 2 h geschüttelt. Anschließend werden die Harzkügelchen filtriert und mit DMF gewaschen. Das entstehende Iodacetylderivat (S)-CNA[(N^ε-lodacetyl)-Lys(TTTTT)- Harz] wird im Anschluss mit 400 nmol H-Cys-Ala-Ala-Ala-Gly-NH₂ in 200 µl DMF/EDTA-Borax-HCl Puffer (pH = 7.5) (2 : 1) umgesetzt. Nach waschen mit DMF und Dichlormethan kann das Produkt mit 2M NaOH vom Harz abgespalten werden. Nach Neutalisation der NaOH-Lösung mit 1 M HCl wird das Rohprodukt direkt über eine RP-HPLC aufgereinigt und über eine RP-C18 Kartusche entsalzt.

Beispiel 33

Fluoreszenzmarkierung eines CNA-Oligonukleotides in Lösung

Zu einer Lösung aus 130 nmol (R)-CNA [Ac-(CTGAA)-Lys] in 50 µl DMF wird eine Lösung aus 50 µl DMF und 780 nmol DIPEA zugegeben. Die vereinte Lösung wird anschließend mit einem Cy5 Labelling Kit (ca. 150 nmol) (Amersham Pharmacia Biotech, Prod. Nr.: PA15001) umgesetzt. Der Reaktionsansatz wird 24 h unter Lichtausschluss geschüttelt, bis das Oligonukleotid vollständig umgesetzt ist. Das markierte Oligonukleotid kann direkt über RP-HPLC aufgereinigt und über eine RP- C18 Kartusche entsalzt werden. Die erhaltene Verbindung ist zusammen mit dem dazugehörigen Massenspektrum in Fig. 2 A und B dargestellt.

Claims

1. Verfahren zur Herstellung von CNA-Oligomeren umfassend folgende Verfahrensschritte:

a) Aktivierung der Carboxylfunktion eines CNA-Monomerbausteins,

b) anschließende Veresterung dieses Monomerbausteins mit einer freien Hydroxylfunktion des Trägers unter basischen Bedingungen und

c) nachfolgendem Aufbau des Oligomeren über repetitive Zyklen ausgehend von der Abspaltung der Schutzgruppe an der Aminogruppe des Cyclohxylringes des CNA-Monomers und anschließender Anknüpfung eines weiteren aktivierten CNA-Monomers, wobei CNA- Monomere der Formel (I) eingesetzt werden,

worin A, D und F unabhängig voneinander für eine -CR³R⁴-, -NR⁵-, -O- oder -S- Gruppe und E für eine -CR⁶- Gruppe stehen können, wobei R³, R⁴, R⁵ oder R⁶ unabhängig voneinander für ein Wasserstoffatom oder eine C₁-C₁₂-Alkylgruppe stehen kann und worin B eine Nucleobase darstellt, deren primäre Aminogruppen in ungeschützter oder Boc-geschützter Form vorliegen können.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Nucleobase B ausgewählt ist aus der Gruppe Adenin, Guanin, Cytosin, Thymin, Uracil, Isoguanin, Isocytosin, Xanthin oder Hypoxanthin.

3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2 dadurch gekennzeichnet, dass CNA-Monomere verwendet werden, die aus der Gruppe 3-tert.- Butoxycarbonyl-1-[(1R, 2R, 4R)-2-tert.-butoxycarbonylamino-4- carboxymethyl-cyclohex-1-yl]-thymin (Formel (II)), 1-[(1R, 2R, 4R)-2-tert.- Butoxycarbonylamino-4-carboxymethyl-cyclohex-1-yl]-thymin (Formel (III)), N⁶-tert.-Butoxycarbonyl-9-[(1R, 2R, 4R)-2-tert.-butoxycarbonylamino-4- carboxymethyl-cyclohex-1-yl]-adenin (Formel (IV)), 9-[(1R, 2R, 4R)-2-tert.- butoxycarbonylamino-4-carboxymethyl-cyclohex-1-yl]-adenin (Formel (V)), N⁴- tert.-Butoxycarbonyl-1-[(1R, 2R, 4R)-2-tert.-butoxycarbonylamino-4- carboxymethyl-cyclohex-1-yl]-cytosin (Formel (VI)), 1-[(1R, 2R, 4R)-2-tert.- butoxycarbonylamino-4-carboxymethyl-cyclohex-1-yl]-cytosin (Formel (VII), N²-tert.-Butoxycarbonyl-9-((1R, 2R, 4R)-2-tert.-butoxycarbonylamino-4- carboxymethyl-cyclohex-1-yl]-guanin (Formel (VIII)), 9-[(1R, 2R, 4R)-2-tert.- butoxycarbonylamino-4-carboxymethyl-cyclohex-1-yl]-guanin (Formel (IX)) ausgewählt sind.

4. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass zur Aktivierung der Carbonylfunktion eines CNA-Monomerbausteins HATU, DIC, TBTU oder HBTU verwendet wird.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass das CNA-Oligomer oder der CNA-Monomerbaustein zusätzlich mit hydrophilen Gruppen, Markern oder biologisch aktiven Substanzen gekoppelt wird.

6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass als Linker zur Kopplung phosphorylierte Buttesäure verwendet wird.

7. Verfahren zur Herstellung von CNA-Monomeren für die CNA- Oligomersynthese umfassend folgende Verfahrensschritte:

a) Kopplung von eines lodlactams der Formel (XIII)

in der A, D und F unabhängig voneinander für eine -CR³R⁴-Gruppe und E für eine -CR⁶- stehen können, wobei R³, R⁴ oder R⁵ die oben genannte Bedeutung haben, in Gegenwart einer Base an eine Nucleobase aus der Gruppe Thymin, Adenin, N⁶-Benzoyl-adenin, N⁶- Dimethylaminoethylen-adenin, Cytosin, N⁴-Benzoyl-cytosin oder 2- Amino-6-chlor-purin,

b) anschließender Schutz des Stickstoffs des Lactamrings mit einer Boc- Schutzgruppe und

c) nukleophile Ringspaltung zum gewünschten CNA-Monomer, wobei im Falle der Verwendung des 2-Amino-6-chlor-purins der Chlorsubstituent in eine Ketogruppe überführt wird.

8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass als Jodlactam 8- Jod-2-azabicyclo[3.3.1]nonan-3-on eingesetzt wird.

9. Verfahren nach Anspruch 7 oder 8, dadurch gekennzeichnet, dass die nukleophile Ringspaltung zum CNA-Monomer mit LiOH oder LiOOH durchgeführt wird.

10. Verfahren nach Anspruch 7 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Einführung der Boc-Schutzgruppen durch Zugabe von Pyrokohlensäure-di- tert.-butylester in Gegenwart von Triethylamin und DMAP erfolgt.

11. Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 10 zur Herstellung des Thymin- Monomers, dadurch gekennzeichnet, dass ein Lithiumsalz des Thymins als Edukt eingesetzt wird.

12. Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 10 zur Herstellung des Guanin- Monomers, dadurch gekennzeichnet, dass die Überführung des Chlorsubsitutenten in eine Ketogruppe in Gegenwart von (CH₃)₃N, 3-OH- Propionitril und DBU erfolgt.

13. CNA-Monomere zur direkten Oligomerisierung mit der Struktur 3-tert.- Butoxycarbonyl-1-[(1R, 2R, 4R)-2-tert.-butoxycarbonylamino-4- carboxymethyl-cyclohex-1-yl]-thymin (Formel (II)), 1-[(1R, 2R, 4R)-2-tert.- Butoxycarbonylamino-4-carboxymethyl-cyclohex-1-yl]-thymin (Formel (III)), N⁶-tert.-Butoxycarbonyl-9-[(1R, 2R, 4R)-2-tert.-butoxycarbonylamino-4- carboxymethyl-cyclohex-1-yl]-adenin (Formel (IV)), 9-[(1R, 2R, 4R)-2-tert.- butoxycarbonylamino-4-carboxymethyl-cyclohex-1-yl]-adenin (Formel (V)), N⁴- tert.-Butoxycarbonyl-1-[(1R, 2R, 4R)-2-tert.-butoxycarbonylamino-4- carboxymethyl-cyclohex-1-yl]-cytosin (Formel (VI)), 1-[(1R, 2R, 4R)-2-tert.- butoxycarbonylamino-4-carboxymethyl-cyclohex-1-yl]-cytosin (Formel (VII), N²-tert.-Butoxycarbonyl-9-[(1R, 2R, 4R)-2-tert.-butoxycarbonylamino-4- carboxymethyl-cyclohex-1-yl]-guanin (Formel (VIII)), 9-[(1R, 2R, 4R)-2-tert.- butoxycarbonylamino-4-carboxymethyl-cyclohex-1-yl]-guanin (Formel (IX)) ausgewählt sind.

14. Heteroduplice enthaltend ein CNA-Oligomer und ein dazu komplementäres p- RNA-Oligomer.

15. Heteroduplice nach Anspruch 14 enthaltend CNA-Oligomere mit einem 2'-4'- Cyclohexyl-Polyamid-Rückgrat.

16. Heteroduplice nach Anspruch 14 oder 15 dadurch gekennzeichnet, dass die CNA-Oligomeren aus Monomeren der Strukturformel (XI) aufgebaut sind,

worin B für eine Nucleobase und R1 für eine NH₂-Gruppe und R² für eine CH₂-COOH-Gruppe steht und A, D und F unabhängig voneinander eine -CR³R⁴-, -NR⁵-, -O- oder -S- Gruppe und E eine -CR⁵- Gruppe sein können, wobei R³, R⁴, R⁵ oder R⁶ unabhängig voneinander für ein Wasserstoffatom oder eine C₁-C₁₂-Alkylgruppe stehen können.

17. Heteroduplice nach einem der Ansprüche 14 bis 16 mit der Strukturformel (XII)

worin B und B' komplementäre Nucleobasenpaare darstellen.

18. Heteroduplice nach einem der Ansprüche 14 bis 17, dadurch gekennzeichnet, dass das CNA-Oligomer oder das p-RNA-Oligomer modifiziert ist.

19. Heteroduplice nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass das CNA- Oligomer und/oder das p-RNA-Oligomer mit einem Peptid, einem Protein, einem radioaktiven Marker oder einem Farbstoff modifiziert ist und/oder das CNA-Oligomer mit einer N-terminalen Phosphatgruppe modifiziert ist.

20. Heteroduplice nach einem der Ansprüche 18 oder 19, dadurch gekennzeichnet, dass die Modifikationen terminal sind.

21. Heteroduplice nach einem der Ansprüche 18 bis 20, dadurch gekennzeichnet, dass als Linker am CNA-Oligomer N-terminale Hydroxycarbonsäurereste oder terminale Lysinreste vorhanden sind.

22. Modifizierte CNA-Oligomere dadurch gekennzeichnet, dass sie mit einem Fluoreszenzfarbstoff kovalent verknüpft sind.

23. Verwendung von CNA-p-RNA-Heteroduplice in biotechnologischen Assays.

24. Verwendung von modifizierten CNA-Oligomeren nach Anspruch 22 in biotechnologischen Assays.