DE60222672T2

DE60222672T2 - Verfahren zur herstellung von lipid ii

Info

Publication number: DE60222672T2
Application number: DE60222672T
Authority: DE
Inventors: Larry Chris Indianapolis BLASZCZAK; Scott Carl Indianapolis MAULDIN; Michael Scott Carlsbad VANNIEUWENHZE; Mohammad Sadegh Indianapolis ZIA-EBRAHIMI
Original assignee: Eli Lilly and Co
Current assignee: Eli Lilly and Co
Priority date: 2001-04-18
Filing date: 2002-04-18
Publication date: 2008-07-24
Anticipated expiration: 2022-04-19
Also published as: ES2292750T3; ATE374207T1; EP1417223A1; DE60222672D1; WO2002085929A1; EP1417223B1; EP1417223B8; JP2005529838A

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Substraten für die Transglykosylaseenzyme der bakteriellen Zellwandbiosynthese und die hierdurch gebildeten Substrate insbesondere die chemische Synthese von Lipid II und Analoga hiervon.
Hintergrund der Erfindung
Potente und beachtlich untoxische Zellwandbiosyntheseinhibitoren haben die Behandlungspläne zur Bekämpfung von bakteriellen Infektionen sowohl im Krankenhaus als auch im ambulanten Umfeld für mehr als 50 Jahre dominiert. Kürzlich hat jedoch die Resistenz der Bakterien gegenüber diesen Antibiotika ein alarmierendes Niveau ereicht und hat begonnen, ihre ehemals zuverlässige klinische Wirksamkeit zu erodieren. Daher ist die Auffindung neuer Arzneimittel für die Zellwand-aktive Pharmakopöe dringend erforderlich.
Die Zellwandbiosyntheseenzyme (Peptidoglykanbiosyntheseenzyme) und ihre natürlichen Substrate können sehr brauchbare Werkzeuge bei Studien sein, die ausgeführt werden, um die Resistenzmechanismen auf molekularer Ebene zu verstehen oder zur Suche von neueren und effektiveren Mitteln. Obwohl von den Transpeptidaseenzymen bekannt ist, dass sie Ziele der β-Lactamantibiotika sind, waren Studien über den Transglykosylierungsprozess aufgrund der schwierigen Zugänglichkeit des natürlichen Transglykosylierungssubstrats, nämlich Lipid II und dessen Analoga, beschränkt. Die Isolierung von Lipid II aus Flüssigkulturen der Bakterien stellt mehrere große Herausforderungen dar, von denen die offensichtlichste der große Maßstab ist. Die Menge an Lipid II wurde mit nur 1000 bis 2000 Molekülen pro Zelle in Escherichia coli abgeschätzt. 1500 Moleküle pro Zelle entsprechen etwa 2,5 nM in einer dichten Kultur (10⁹ Cfu/ml). Obwohl 50 μg an ¹⁴C-Lipid II aus Micrococcus luteus isoliert wurden, ist die isolierte Menge sehr gering, unrein und radioaktiv (siehe beispielsweise H. Brotz et al., Antimicrob. Agents Chemother. 42, 154 (1998)). Zweitens ist die vollständige Abtrennung der sehr geringen Menge an Lipid II aus relativ großen Mengen an zellulärem Lipid und Membrankomponenten sehr schwierig. Daher besteht ein Bedarf für eine große und nachhaltige Versorgung mit Lipid II, um die bedeutsame Untersuchung des Transglykosylierungsprozesses zu unterstützen.
Während Lipid II ein brauchbares Werkzeug bei der Untersuchung der Resistenzmechanismen auf molekularer Ebene und der Suche nach neueren und effektiveren Mitteln ist, hat es auch andere Verwendungen. Beispielsweise ist Lipid II zur Quantifizierung von Lysozym brauchbar, einem Enzym, das vorzugsweise die beta-1,4-glykosidischen Bindungen zwischen N-Acetylmuraminsäure und N-Acetylglukosamin hydrolysiert, die beispielsweise in der Mukopeptidstrukturzellwand von Mikroorganismen vorkommen, wie Micrococcus lysodeikticus. Zusätzlich können bestimmte Lantibiotika durch Affinitätschromatographie auf Harz gereinigt werden, das immobilisiertes Lipid II enthält.
Kurze Zusammenfassung der Erfindung
Die Erfindung liefert ein Verfahren zur Herstellung eines Lipidsubstrats (beispielsweise Lipid II Analoga), die als Substrat für die Transglykosylaseenzyme der bakteriellen Zellwandbiosynthese verwendet werden können. Das Verfahren umfasst die folgenden Schritte:

(1) Bereitstellung eines geschützten Disaccharids der Formel 14
(2) Einführung eines anomeren Phosphats unter Bildung einer Verbindung der Formel 12
(3) Einführung einer Peptidbindung unter Bildung einer Verbindung der Formel 7
(4) Entfernung der Gruppen Pg⁶ aus der Verbindung der Formel 7 und Behandlung der erhaltenen Verbindung mit einer Base der Formel B unter Bildung eines Phosphatsalzes der Formel 6
(5) Behandlung der Verbindung der Formel 6 mit einem aktivierten Phosphatester der Formel 25
unter Bildung einer Verbindung der Formel 2
(6) Entfernung der Gruppen Pg⁰ und Pg³ und Abspaltung der Gruppe P unter Bildung eines Lipidsubstrats, worin Ac für -C(O)CH₃ steht, Pg⁰ für eine Acylhydroxyschutzgruppe steht, Pg³ für eine Acylhydroxyschutzgruppe steht, Pg⁴ für eine Carboxyschutzgruppe steht, Pg⁵ für eine Hydroxyschutzgruppe steht, Pg⁶ für eine Phosphatschutzgruppe steht, R² für Wasserstoff, (C₁-C₅)-Alkyl oder (C₁-C₃)-Alkylphenyl steht, X für einen Lipidträger steht, wobei es sich bei diesem Lipidträger um gesättigte und ungesättigte Kohlenwasserstoffketten handelt, die geradkettig oder verzweigtkettig, perfluoriert oder unsubstituiert sein können und 5 bis 55 Kohlenstoffatome und 1 bis 11 Prenyleinheiten aufweisen, L¹ eine Abgangsgruppe ist, P an das Carbonyl gebunden ist und für einen Rest einer Aminosäure oder eines Peptids steht, wobei P eine geschützte terminale Carboxygruppe umfasst, und P' für einen Rest einer Aminosäure oder eines Peptids steht.

Das Verfahren zur Herstellung von Lipid II umfasst folgende Schritte

(1) Bereitstellung eines geschützten Disaccharidkerns der Formel 14
(2) Einführung eines anomeren Phosphats unter Bildung einer Verbindung der Formel 12
(3) Einführung einer Polypeptidbrücke unter Bildung einer Verbindung der Formel 7a
(4) Entfernung der Gruppen Pg⁶ aus der Verbindung der Formel 7a und Behandlung der erhaltenen Verbindung mit einer Base der Formel B unter Bildung eines Phsphatsalzes der Formel 6a
(5) Behandlung der Verbindung der Formel 6a mit einem aktivierten Ester der Formel 25a
unter Bildung einer Verbindung der Formel 2a
und
(6) Entfernung der Gruppen Pg⁰, Pg³, Pg⁷ und Pg⁸ unter Bildung der gewünschten Lipid II Verbindung, worin A für Wasserstoff oder eine Carboxylgruppe steht, R² für Methyl steht, Ac für -C(O)CH₃ steht, Pg⁰ für eine Acylhydroxyschutzgruppe steht, Pg³ für eine Acylhydroxyschutzgruppe steht, Pg⁴ für eine Carboxyschutzgruppe steht, Pg⁵ für eine Hydroxyschutzgruppe steht, Pg⁶ für eine Phosphatschutzgruppe steht, Pg⁷ für eine Aminschutzgruppe steht, Pg⁸ für eine Carboxyschutzgruppe steht und L¹ für eine Abgangsgruppe steht.

Detaillierte Beschreibung
Definitionen

Wie oben und während der Beschreibung der Erfindung verwendet sollen die folgenden Abkürzungen, falls nichts anderes angegeben ist, die folgenden Bedeutungen haben:

Bezeichnung	Reagenz oder Fragment
Ac	-C(O)CH₃
AcOH	Essigsäure
Ac₂O	Essigsäureanhydrid
BOC	t-Butyloxycarbonyl
DBU	1,8-Diazabicyclo[5.4.0]undec-7-en
TsOH	p-Toluolsulfonsäure
NMM	N-Methylmorpholin
THF	Tetrahydrofuran
Bn	Benzyl (das heißt -CH₂Ph)
TFA	Trifluoressigsäure
Trac	2,2,2-Trichlorethoxycarbonyl
Cbz	Benzyloxycarbonyl
TLC	Dünnschichtchromatographie
NMR	Kernmagnetresonanz
ESI-MS	Elektrosprayionisationsmassenspektrometrie
EtOAc	Ethylacetat
IR	Infrarotspektrometrie
MeOH	Methanol
NaOMe	Natriummethoxid
NHS	N-Hydroxysuccinimid
EDCI	1-[3-(Dimethylamino)propyl]-3-ethylcarbodiimidhydrochlorid
Ph	Phenyl
CDI	1,1'-Carboxyldiimidazol
h	Stunden
min	Minuten

Wie oben und während der Beschreibung der Erfindung erwähnt sollen die folgenden Ausdrücke so verstanden werden, dass sie die folgenden Bedeutungen haben, falls nichts anderes angegeben ist:
"Aminosäure" meint eine Aminosäure, die aus der Gruppe ausgewählt ist, welche besteht aus natürlichen und unnatürlichen Aminosäuren, wie sie hierin definiert sind. Aminosäure soll auch Aminosäuren mit L oder D Stereochemie am α-Kohlenstoff umfassen. Bevorzugte Aminosäuren sind jene, die eine α-Aminogruppe aufweisen. Die Aminosäuren können neutral, positiv oder negativ in Abhängigkeit der Substituenten in der Seitenkette sein. "Neutrale Aminosäure" steht für eine Aminosäure, die ungeladene Seitenkettensubstituenten enthält. Beispielhafte neutrale Aminosäuren umfassen Alanin, Valin, Leucin, Isoleucin, Prolin, Phenylalanin, Tryptophan, Methionin, Glycin, Serin, Threonin und Cystein. "Positive Aminosäure" meint eine Aminosäure, worin die Seitenkettensubstituenten positiv bei einem physiologischen pH geladen sind. Beispielhafte positive Aminosäuren umfassen Lysin, Arginin und Histidin. "Negative Aminosäure" meint eine Aminosäure, worin die Seitenkettensubstituenten eine negative Nettoladung bei physiologischem pH aufweisen. Beispielhafte negative Aminosäuren umfassen Asparaginsäure und Glutaminsäure. Bevorzugte Aminosäuren sind α-Aminosäuren. Beispielhafte neutrale Aminosäuren sind Isoleucin, Prolin, Phenylalanin, Tryptophan, Methionin, Glycin, Serin, Threonin, Cystein, Tyrosin, Asparagin, Glutamin, Lysin, Arginin, Histidin, Asparaginsäure und Glutaminsäure. "Unnatürliche Aminosäure" meint eine Aminosäure für die kein Nukleinsäurecodon existiert. Beispiele für unnatürliche Aminosäuren umfassen beispielsweise die D-Isomere der natürlichen α-Aminosäuren, wie sie oben erwähnt sind, Aib (Aminobuttersäure), βAib (3-Aminoisobuttersäure), Nva (Norvalin), β-Ala, Aad (2-Aminoadipinsäure), βAad (3-Aminoadipinsäure), Abu (2-Aminobuttersäure), Gaba (γ-Aminobuttersäure), Acp (6-Aminocapronsäure), Dbu (2,4-Diaminobuttersäure), α-Aminopimelinsäure, TMSA (Trimethylsilyl-Ala), alle (allo-Isoleucin), Nle (Norleucin), tert-Leu, Cit (Citrullin), Orn, Dpm (2,2'-Diaminopimelinsäure), Dpr (2,3-Diaminopropionsäure), α- oder β-Nal, Cha (Cyclohexyl-Ala), Hydroxyprolin, Sar (Sarcosin) oder dergleichen, cyclische Aminosäuren, N^α-alkylierte Aminosäuren, wie MeGly (N^α-Methylglycin), EtGly (N^α-Ethylglycin) und EtAsn (N^α-Ethylasparagin) und Aminosäuren, worin das α-Kohlenstoff zwei Seitenkettensubstituenten trägt. Die Namen der natürlichen und unnatürlichen Aminosäuren und Reste hiervon, die hierin verwendet werden, folgen den von der IUPAC Kommission vorgeschlagenen Namenskonventionen bezüglich der Nomenklatur der organischen Chemie und der IUPAC-IUB Kommission über Biochemische Nomenklatur, wie dies in "Nomenclature of α-Amino Acids (Recommendations, 1974)", Biochemistry, 14 (2), (1975) ausgeführt ist. Falls die Namen und Abkürzungen von Aminosäuren und Resten hiervon, die in der Beschreibung und den Patentansprüchen verwendet werden, sich von den angegebenen unterscheiden, werden die unterschiedlichen Namen und Abkürzungen klar gemacht.
"Aminosäureschutzgruppe" und "Peptidschutzgruppe" meint eine Gruppe, die eine Säure oder einen Aminrest der Aminosäure/des Peptids oder einen anderen reaktiven Rest auf der Seitenkette der Aminosäure/des Aminosäurerests schützt, beispielsweise Hydroxy oder Thiol. Beispiele für "entsprechend geschützte Derivate" von Aminosäureseitenketten siehe T. W. Green und P. G. M. Wuts in "Protective Groups in Organic Chemistry", John Wiley and Sons, 1991. Schutzgruppen für eine Säuregruppe in einer Aminosäure werden hierin im Abschnitt "Carboxyschutzgruppe" beschrieben. Schutzgruppen für eine Amingruppe in einer Aminosäure sind im Abschnitt "Aminschutzgruppe" beschrieben.
"Aminosäurerest" meint die einzelnen Aminosäureeinheiten, die in ein Peptid oder einen Peptidteil eines Moleküls über eine Amidbindung eingebaut sind.
"Aminschutzgruppe" meint eine leicht entfernbare Gruppe, von der in der Technik bekannt ist, dass sie eine Aminogruppe gegenüber einer unerwünschten Reaktion während Syntheseverfahren schützen kann und selektiv entfernbar ist. Die Verwendung von Aminschutzgruppen ist in der Technik zum Schutz von Gruppen gegen unerwünschte Reaktionen während eines Syntheseverfahrens gut bekannt und viele solcher Schutzgruppen sind bekannt, beispielsweise T. H. Greene und P. G. M. Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, 2. Ausgabe, John Wiley & Sons, New York (1991). Aminschutzgruppen umfassen auch säurelabile Aminschutzgruppen (beispielsweise BOC) und Hydrierungs-labile Aminschutzgruppen (beispielsweise Cbz). Eine bevorzugte Pg⁷ Aminschutzgruppe ist Trifluoracetyl. In der vorliegenden Erfindung ist Pg² eine Gruppe, die nicht zur Erzeugung der unerwünschten Oxazolinnebenprodukte führt (das heißt Pg² kann keine Acylgruppe sein). Geeignete Pg² Aminschutzgruppen umfassen Carbamat und Imidgruppen. Bestimmte Imidgruppen umfassen Phthalimid, Tetrachlorphthalimid und (Ac)₂N-. Bestimmte Carbarnatgruppen umfassen Methoxycarbonyl, 9-Fluorenylmethoxycarbonyl, 2,2,2-Trifluorethoxycarbonyl, 2-Trimethylsilylethoxycarbonyl, Vinyloxycarbonyl, Allyloxycarbonyl, t-Butyloxycarbonyl (BOC), 1,1-Dimethylpropinyloxycarbonyl, Benzyloxycarbonyl (CBZ), p-Nitrobenzyloxycarbonyl, 2,4-Dichlorbenzyloxycabonyl, Trimethylsilyloxycarbonyl, 2,2,2-Trichlorethoxycarbonyl, 1,1-Dimethyl-2,2,2-trichlorethoxycarbonyl oder dergleichen. Eine bevorzugte Pg² Aminoschutzgruppe ist 2,2,2-Trichlorethoxycarbonyl.
"Carboxyschutzgruppe" meint jede leicht entfernbare Gruppe, die in der Technik bekannt ist, um einen sauren Wasserstoff einer Carboxylgruppe gegen eine unerwünschte Reaktion während der Syntheseverfahren zu schützen, beispielsweise die Säurefunktionalität zu blockieren oder zu schützen, während Reaktionen, die andere funktionelle Stellen der Verbindung umfassen, ausgeführt werden, und die selektiv entfernbar ist. Solche Säureschutzgruppen sind dem Fachmann gut bekannt und wurden ausgiebig zum Schutz von Carboxylgruppen verwendet, wie dies in US 3 840 556 A und US 3 719 667 A beschrieben ist. Bezüglich geeigneter Schutzgruppen siehe T. W. Green und P. G. M. Wuts in "Protective Groups in Organic Chemistry", John Wiley and Sons, 1991. Säureschutzgruppen umfassen auch gegenüber einer Hydrierung labile Säureschutzgruppen, wie Benzyl. Beispiele für Säureschutzgruppen umfassen Ester, wie substituiertes und unsubstituiertes C₁-C₈ Niederalkyl, beispielsweise Methyl, Ethyl, t-Butyl, Methoxymethyl, Methylthiomethyl, 2,2,2-Trichlorethyl oder dergleichen, Tetrahydropyranyl, substituiertes und unsubstituiertes Phenylalkyl, wie Benzyl und substituierte Derivate hiervon, wie Alkoxybenzyl- oder Nitrobenzylgruppen oder dergleichen, Cinnamyl, Dialkylaminoalkyl, beispielsweise Dimethylaminoethyl oder dergleichen, Trimethylsilyl, substituierte und unsubstituierte Amide und Hydrazide, beispielsweise Amide und Hydrazide von N,N-Dimethylamin, 7-Nitroindol, Hydrazin, N-Phenylhydrazin oder dergleichen, Acyloxyalkylgruppen, wie Pivaloyloxymethyl oder Propionyloxymethyl oder dergleichen, Aroyloxyalkyl, wie Benzoyloxyethyl oder dergleichen, Alkoxycarbonylalkyl, wie Methoxycarbonylmethyl, Cyclohexyloxycarbonylmethyl oder dergleichen, Alkoxycarbonyloxyalkyl, wie t-Butyloxycarbonyloxymethyl oder dergleichen, Alkoxycarbonylaminoalkyl, wie t-Butyloxycarbonylaminomethyl oder dergleichen, Alkylaminocarbonylaminoalkyl, wie Methylaminocarbonylaminomethyl oder dergleichen, Acylaminoalkyl, wie Acetylaminomethyl oder dergleichen, Heterocyclylcarbonyloxyalkyl, wie 4-Methylpiperazinylcarbonyloxymethyl oder dergleichen, Dialkylaminocarbonylalkyl, wie Dimethylaminocarbonylmethyl oder dergleichen, (5-(Niederalkyl)-2-oxo-1,3-dioxolen-4-yl)alkyl, wie (5-t-Butyl-2-oxo-1,3-dioxolen-4-yl)methyl oder dergleichen und (5-Phenyl-2-oxo-1,3-dioxolen-4-yl)alkyl, wie (5-Phenyl-2-oxo-1,3-dioxolen-4-yl)methyl oder derglei chen. Bestimmte Carboxyschutzgruppen umfassen Methyl, 9-Fluorenylmethyl, 2-(Trimethylsilyl)ethyl, 2-(Trimethylsilyl)ethoxymethyl, 2-Methylthioethyl, 1,3-Dithianyl-2-methyl, 2-(p-Toluolsulfonyl)ethyl, 2-(p-Nitrophenylsulfenyl)ethyl, 2-(2'-Pyridyl)ethyl, 2-(Diphenylphosphino)ethyl, p-(Methylmercapto)phenyl, Nitroethyl, Allyl oder dergleichen. Eine bevorzugte Pg⁴ Carboxyschutzgruppe ist -CH₂CH₂SO₂Ph. Eine bevorzugte Pg⁸ Carboxyschutzgruppe ist Methyl.
"Hydroxyschutzgruppe" meint eine leicht entfernbare Gruppe, die in der Technik bekannt ist, um eine Hydroxygruppe gegenüber einer unerwünschten Reaktion während Syntheseverfahren zu schützen und die selektiv entfernt werden kann. Die Verwendung von Hydroxyschutzgruppen ist in der Technik für Schutzgruppen gegen unerwünschte Reaktionen während eines Syntheseverfahrens gut bekannt und viele solcher Schutzgruppen sind bekannt, beispielsweise T. H. Greene und P. G. M. Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, 2. Ausgabe, John Wiley & Sons, New York (1991). In der vorliegenden Erfindung sind die Pg⁰, Pg¹ und Pg⁵ Hydroxyschutzgruppen gegenseitig orthogonal, wie dies hierin beschrieben ist. Pg¹ kann eine elektronenziehende Gruppe sein, da solche Gruppen die Kupplungsreaktion zwischen der Muramylamidverbindung der Formel 18 und der Glycosopyranosylverbindung der Formel 17 deaktivieren. Geeignete Pg¹ Gruppen umfassen Aralkyl-, Aralkenyl- und Silylgruppen. Bestimmte Aralkyl- und Alkenylgruppen umfassen jeweils Benzyl und Allyl. Bestimmte Silylgruppen umfassen Trialkylsilylgruppen, wie Trimethylsilyl und (t-Butyl)dimethylsilyl. Bevorzugte Pg¹ Gruppen sind Allyl und Benzyl, wobei eine bevorzugtere Gruppe Benzyl ist. Geeignete Pg⁵ Gruppen umfassen Aralkyl und Alkenyl. Bevorzugte Pg⁵ Gruppen umfassen Allyl, n-Pentenyl und Benzyl, wobei eine bevorzugtere Gruppe Benzyl ist. Zusätzlich müssen Pg⁰ und Pg³ durch eine Verseifung entfernbar sein (das heißt Pg⁰ und Pg³ müssen für Acylgruppen stehen). Bestimmte Acylgruppen umfassen Formyl, Acetyl, Chloracetyl, Trichloracetyl, o-Nitrophenylacetyl, o-Nitrophenoxyacetyl, Trifluoracetyl, Acetoacetyl, 4-Chlorbutyryl, Isobutyryl, o-Nitrocinnamoyl, Picolinoyl, Acylisothiocyanat, Aminocaproyl, Benzoyl oder dergleichen. Bevorzugte Pg⁰ und Pg³ Gruppen sind Chloracetyl und Acetyl, wobei eine bevorzugtere Gruppe Acetyl ist.
"Phosphatschutzgruppe" meint eine leicht entfernbare Gruppe, von der in der Technik bekannt ist, dass sie eine Phosphatgruppe gegen eine unerwünschte Reaktion während Syntheseverfahren schützt und selektiv entfernbar ist. Die Verwendung der Phosphatschutzgruppen ist in der Technik zum Schutz von Gruppen gegen unerwünschte Reaktionen während eines Syntheseverfahrens gut bekannt und viele solche Schutzgruppen sind bekannt, beispielsweise T. H. Greene und P. G. M. Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, 2. Ausgabe, John Wiley & Sons, New York (1991). Eine bevorzugte Pg⁶ Phosphatschutzgruppe ist Benzyl.
"Abgangsgruppe" eines aktivierten Esters meint einen Substituenten mit einer ausreichenden Labilität, so dass er durch ein gutes Nukleophil substituiert werden kann (beispielsweise eine Aminogruppe einer Peptideinheit). Die Labilität eines bestimmten Substituenten variiert in Abhängigkeit der Substituenten am selben und/oder benachbarten Kohlenstoffatomen und der Art der Abgangsgruppe. Der Fachmann kennt die Typen an Abgangsgruppen, die zur Substitution eines Aminonukleophils geeignet sind. Für geeignete Abgangsgruppen siehe M. Bodansky und A. Bodansky in "The Practice of Peptide Synthesis", Springer Verlag, 1984 und M. Bodansky in "Principles of Peptide Synthesis", Springer Verlag, 1984. In der vorliegenden Erfindung aktiviert beispielsweise die Abgangsgruppe das gebundene Carbonyl so, dass die terminale Aminosäuregruppe als Linker für die Verbindung des Disaccharids mit der Peptid einheit wirkt. Bestimmte Abgangsgruppen umfassen Pentafluorphenoxy, N-Oxysuccinimid, N-Oxyphthalimid und N-Oxybenzotriazol. Eine bevorzugte Abgangsgruppe ist N-Oxysuccinimid.
"Orthogonale Schutzgruppen" meint Schutzgruppen, für die ein Satz an Bedingungen existiert, worin eine der Gruppen ohne Entfernung der anderen entfernt werden kann. Der Ausdruck umfasst Schutzgruppen für verschiedene Reste (beispielsweise orthogonale Amin- und Hydroxyschutzgruppen) wie auch am selben Rest (beispielsweise orthogonale Hydroxyschutzgruppen). Es ist nicht erforderlich, dass orthogonale Schutzgruppen notwendigerweise unterschiedlich sind. Wenn beispielsweise der Ausdruck verwendet wird, um Schutzgruppen für denselben Rest zu beschreiben, können die Gruppen unterschiedlich sein (beispielsweise orthogonale Acetyl- und Benzylhydroxyschutzgruppen) oder gleich sein (beispielsweise orthogonale Benzylschutzgruppen).
"Elektronenziehende Gruppe" meint eine Gruppe, die ein stärkerer Elektronenzieher ist, als Wasserstoff. Elektronen-ziehende Gruppen zeigen negativ induktive Effekte, während Gruppen, die schlechtere Elektronenzieher sind als Wasserstoff positiv induktive Effekte zeigen (siehe beispielsweise E. S. Gould, Mechanism and Structure in Organic Chemistry, Holt, Rinehart and Winston, New York (1959).
"Acyl" steht für eine R-C(O)- Gruppe, worin R an die CO Gruppe durch eine Kohlenstoff-Kohlenstoff-Bindung gebunden ist.
"Alkyl" steht für eine aliphatische Kohlenwasserstoffgruppe, die gerade oder verzweigt ist und etwa 1 bis 20 Kohlenstoffatome in der Kette aufweist. Bevorzugte Alkylgruppen haben 1 bis 12 Kohlenstoffatome in der Kette, bevorzugter ist hierin definiertes Niederalkyl. Verzweigt meint, dass eine oder mehrere Niederalkylgruppen, wie Methyl, Ethyl oder Propyl, an eine lineare Alkylkette gebunden sind. "Niederalkyl" steht für etwa 1 bis etwa 4 Kohlenstoffatome in der Kette, die gerade oder verzweigt sein können.
"Alkenyl" steht für eine aliphatische Kohlenwasserstoffgruppe, die eine Kohlenstoff-Kohlenstoff-Doppelbindung enthält und die gerade oder verzweigt ist mit etwa 2 bis etwa 15 Kohlenstoffatomen in der Kette. Bevorzugte Alkenylgruppen haben etwa 2 bis etwa 12 Kohlenstoffatome in der Kette und bevorzugter etwa 2 bis etwa 4 Kohlenstoffatome in der Kette. Verzweigt meint, dass eine oder mehrere Niederalkylgruppen, wie Methyl, Ethyl oder Propyl an eine lineare Alkenylkette gebunden sind. "Niederalkenyl" steht für etwa 2 bis etwa 4 Kohlenstoffatome in der Kette, die gerade oder verzweigt sein kann. Beispielhafte Alkenylgruppen umfassen Ethenyl, Propenyl, n-Butenyl, i-Butenyl, 3-Methylbut-2-enyl, n-Pentenyl, Heptenyl, Octenyl, Cyclohexylbutenyl und Decenyl.
"Aryl" steht für ein aromatisches, monocyclisches oder multicyclisches Ringsystem mit etwa 6 bis etwa 14 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise etwa 6 bis etwa 10 Kohlenstoffatomen. Beispielhafte Arylgruppen umfassen Phenyl oder Naphthyl oder substituiertes Phenyl oder substituiertes Naphthyl.
"Base der Formel B" und "Base der Formel B²" meint eine Verbindung, die einen SP² und SP³ hybridisierten Stickstoff mit einem ungebundenen Elektronenpaar aufweist, das zur Protonierung fähig ist. Beispiele für Basen der Formel B oder B¹ umfassen Verbindungen, die optional substituiertes Imino, optional substituiertes Amino und optional substituierte Amidinogruppen umfassen.
"Carboxy" meint eine HO(O)C-(Carbonsäure oder Salz hiervon) Gruppe.
"N-Oxysuccinimid" meint einen Rest der folgenden Struktur:
"Lipidträger" meint gesättigte und ungesättigte Kohlenwasserstoffketten. Die Ketten können gerade oder verzweigt sein. Der Kohlenwasserstoff kann auch substituiert (perfluoriert) oder unsubstituiert sein. Die Kohlenwasserstoffkette enthält 5 bis 55 Kohlenstoffe und 1 bis 11 Prenyleinheiten, vorzugsweise 25 bis 55 Kohlenstoffe und 5 bis 11 Prenyleinheiten, vor allem 40 bis 55 Kohlenstoffe und 8 bis 11 Prenyleinheiten.
"Peptid" meint ein Polymer, das Aminosäurereste umfasst, die miteinander über Amidbindungen verbunden sind. Geeignete Peptid- und Polypeptideinheiten umfassen Peptide, die 2 oder mehr, vorzugsweise 2 bis 4 Aminosäurereste enthalten. P kann auch ein einzelner Aminosäurerest sein. P steht vorzugsweise für ein Polypeptid, das 4 Aminosäurereste enthält. Besonders brauchbare Polypeptideinheiten sind D-iGln-L-Lys-D-Ala-D-Ala oder D-iGln-Dap-D-Ala-D-Ala. Andere Kombinationen an Amiosäuren und die Anzahl an Aminosäuren, die in der Aminosäure oder der Peptideinheit enthalten sind, können in Abhängigkeit des zur Wechselwirkung mit dem Lipidsubstrat ausgewählten Enzyms verwendet werden. Geeignete Aminosäurereste umfassen natürliche Aminosäuren, ungewöhnliche Aminosäuren und modifizierte Aminosäuren, wie dies in World Intellectual Property Organization (WIPO) Handbook an Industrial Property Information and Documentation, Standard ST.25: Standard for the Presentation of Nucleotide and Amino Acid Sequence Listings in Patent Applications (1998), einschließlich der Tabellen 1 bis 6 in Appendix 2 definiert ist.
"Lipid II" meint eine Verbindung der folgenden Struktur:
worin A für Wasserstoff oder eine Carboxylgruppe (-CO₂H oder ein Salz hiervon) steht, Ac für -C(O)CH₃ steht und W⁺ jeweils unabhängig für ein Proton oder Kation steht, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die besteht aus einem Alkalimetall (beispielsweise Natrium oder Kalium), Erdalkalimetall (beispielsweise Magnesium oder Calcium), Ammonium, Alkylammonium (beispielsweise Methylammonium oder Ethylammonium) und Dialkylammonium (beispielsweise Dimethylammonium, Methylethylammonium oder Diethylammonium). Vorzugsweise ist die Pyrophosphatgruppe nicht geschützt. Für gram-positives Lipid II steht A im allgemeinen für Wasserstoff, während für gram-negatives Lipid II A im allgemeinen für eine Carboxylgruppe steht "Im wesentlichen rein" meint eine isolierte Reinheit von größer oder gleich 99% Reinheit.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
Die 1 erläutert den Transglykosylierungsprozess unter Verwendung von Lipid II als Substrat in Form einer Zeichnung.
Die 2 erläutert die Fluoreszenzdetektion der Glykanstränge, die durch die Inkubation eines synthetisierten Dansyl-verbundenen Lipid II Derivats mit einer monofunktionellen Transglykosylase (MtgA) von Staphylococcus aureus, erzeugt werden.
Brauchbarkeit von Lipid II und Analoga hiervon
I. Quantifizierung des Lysozyms mittels Lipid II
Das Lipid II ist zur Quantifizierung von Lysozym brauchbar, einem Enzym, das vorzugsweise die β-1,4-glucosidischen Bindungen zwischen N-Acetylmuraminsäure und N-Acetylglucosamin hydrolysiert, die beispielsweise in der Mucopeptidzellwandstruktur der Mikroorganismen hydrolysiert, wie Micrococcus lysodeikticus.
Lysozym kann der Mediator bei der Antitumorfunktion von Makrophagen sein (Osserman et al., (1973) Nature 243: 331), von denen gezeigt wurde, dass sie das Enzym sekretieren (Gordon et al. (1974) J. Exp. Med. 139: 1228). Knorpellysozym spielt eine Rolle bei der Knorpelverkalkung (Kuettner et al. (1974) Biochim. Biophys. Acta 372: 335). Es gab ein Interesse an Lysozym als "natürliches" Antibiotikum und als Hilfe bei der Krankheitsdiagnose (Glynn (1968) Sci. Basis Med. Ann. Rev. 31, Pruzanski et al. (1969) Amer. J. Med. Sci. 258: 405). Erhöhte Mengen an Serum- und Harnlysozym sind bei monocytärer und monomyeloischer Leukämie vorhanden (Osserman et al. (1966) J. Exp. Med. 124: 921, Brierre et al. (1974) Clin. Chim. Acta 50: 265). Das Vorkommen dieses Enzyms in der cerebrospinalen Flüssigkeit zeigt Tumoren des zentralen Nervensystems an (Newman et al. (1974) Lancet II 756). Normalerweise ist die Lysozymaktivität in Urin, Gallenflüssigkeit und Spinalflüssigkeit praktisch abwesend (Hankiewicz et al. (1974) Clin. Chim. Acta 57: 205). Das Enzym wird auch zur Lyse von E. coli und Streptomyceten für Extraktionszwecke (Haas et al. (1975) Methods in Enzymology XLIII (J. Hash, Herausgeber) Academic Press, N. Y., Seite 621), wie als Extraktionsgruppen-spezifisches Antigen verwendet (Watson et al. (1975) J. Clin. Microbiol. 1: 274).
Daher weist Lysozym mehrere wichtige medizinische und forschungsorientierte Implikationen und Verwendungen auf und eine genaue Quantifizierung hiervon ist bei diesen Anwendungen wichtig.
Anfänglich wurde die Lysozymaktivität über einen turbimetrischen Zellrest mittels Micrococcus luteus als Substrat abgeschätzt. Die Geschwindigkeit der Lyse der Zellen durch Lysozym wird spektrophotometrisch durch Messen der Abnahme der Turbidität der Zelllösung bestimmt. Jedoch ist dieses Verfahren aufgrund der fehlenden Uniformität von M. luteus Zellpulver nicht verlässlich reproduzierbar. Die Ergebnisse variieren auch breit mit den Unterschieden der Ionenstärke im Puffer.
Derzeit kann ein im Handel erhältliches Substrat für eine colorimetrische Untersuchung der Lysozymaktivität von Sigma Chemical Company (St. Louis, MO) bezogen werden. Das Substrat ist der synthetische trimere Zucker p-Nitrophenyl-β-D-N,N',N''-triacetylchitotriose (PNP-(GlcNac)₃) (Sigma Katalog nummer N-8638). Längere und kürzere Acetylchitooligosaccharide wurden auch für Lysozymtests verwendet, das heißt PNP-(GlcNAc)_n, worin n = 2 – 5. In allen Fällen führt die bevorzugte Spaltstelle für Lysozym zur Bildung von PNP-GlcNAc. Die Aktivität, die in dem Test gemessen wird, ist die Zunahme der Absorption bei 405 nm des freigesetzten p-Nitrophenols. Jedoch führt die Spaltung des Substrats durch Lysozym zu PNP-GlcNAc nicht direkt zur Freisetzung von p-Nitrophenol. Um verlässliche colorimetrische Messungen der Lyozymaktivität zu bekommen, muss man den Test an ein zweites Enzym, nämlich β-N-Acetyl-Hexosaminidase (NAHase) kuppeln. NAHase spaltet PNP-GlcNAc unter Freisetzung von p-Nitrophenol, das dann quantifiziert wird (Nanjo et al (1988), J. Biochem. 104: 255–258). Dieser Test führt, obwohl er akurater ist als frühere Tests, immer noch zu einer großen Fehlerbreite aufgrund der Lysozymspaltung des Substrats, das andere Spaltprodukte als PNP-GlcNAc bildet. Zweienzymsysteme sind ebenfall weniger bevorzugt als ein System, das direkt die Aktivität von Interesse misst. Ein neuer und verbesserter Test, der sehr genau und leicht zu verwenden ist, wäre in der Laborumgebung für die Routinebestimmung von Lysozym in pharmazeutischen/diagnostischen Präparationen und biologischen Materialien wertvoll. Ein solcher Test kann als genaues Werkzeug für die Diagnose von Leukämie und Tumoren des zentralen Nervensystems verwendet werden. Die Detektion der Lysozymaktivität in humanem Serum, Urin oder cerebrospinaler Flüssigkeit würde schnell und genau bei der Diagnose bestimmter Krebsarten helfen, wie dies oben erwähnt ist, und würde ein wertvoller Zusatz im Arsenal der diagnostischen Krebswerkzeuge sein. Das Lipid II kann folgendermaßen in Lysozymtests verwendet werden.
Lipid II, das mit Oregon Green am ε-Amin des Lysinaminorests des Pentapeptids gemäß den Anleitungen des Herstellers (Molecular Probes, Eugene, OR) markiert wird, ist ein fluoreszierendes Molekül. Dieses markierte Lipid II Derivat kann mittels Staphylococcus aureus monofunktioneller Transglykosylase A (MtgA, US 6 143 868 A und US 5 922 540 A ) in die Peptidoglykanstränge, die nicht fluoreszierend sind. Die Polymerisation wird mittels 100 μM Oregon Green-markiertem Lipid II, 5 μM MtgA, 50 mM MES (pH 5,9), 25 mM MgCl₂, 16,7 mM NaCl und 0,27 mM CHAPS erreicht, polymerisiert werden. Die Polymerisation ist nach etwa 5 Stunden bei 25°C vollständig.
Die angehängten Fluorophore (entweder benachbarte Farbstoffe oder jene, die vier wiederholte Disaccharideinheiten voneinander entfernt wird) des Polymers Wechselwirken aufgrund der Selbstlöschung, wenn sie nahe zusammengebracht werden. Die Zugabe von Lysozym zum markierten Peptidoglycanmaterial führt zu einer Spaltung derselben Bindungen, die durch MtgA bei der Polymerisationsreaktion gebildet werden. Nach der Spaltung dieser Bindungen werden die Farbstoffe physikalisch getrennt, was zu einem Verlust der Wechselwirkung zwischen den Farbstoffmolekülen führt und so zu einer anschließenden Zunahme der Fluoreszenz aufgrund der Abnahme der Selbstlöschung. Die Verfolgung der Fluoreszenz der Lysozym-katalysierten Reaktion (Anregung: 495 nm, Emission: 521 nm) über die Zeit im Vergleich zu der einer Standardkurve erlaubt es einem die Aktivität des Lysozyms zu quantifizieren, das in der Zielpräparation vorhanden ist.
Daher kann ein Lysozymtestkit vorpolymerisierte Ketten des Oregon Green markierten Peptidoglykans, für das Lipid II ein erforderliches Ausgangsmaterial ist, größenfraktioniert in Längen enthalten, die unmittelbar zu einer Erhöhung der Fluoreszenz nach der anfänglichen Lysozymspaltung führen. Beispielsweise führen Dimere bei einer Spaltung sicherlich zu einer Zunahme der Fluoreszenz. Alternativ dazu können Peptidoglycanpolymere mit Oregon Green so markiert werden, dass die Markierungsreste nahe genug zusammengebracht werden, um zu einer vollständigen Löschung zu führen, aber ausrei chend weit voneinander entfernt sein, dass die erste Spaltung zu einer unmittelbaren Milderung der Löschung führt. Die Menge an Oregon Green Markierung, die in das Polymer eingearbeitet wird, kann durch die Variation des Verhältnisses an markiertem und nicht-markiertem Lipid II kontrolliert werden, das in der Polymerisiationsreaktion verwendet wird. Das markierte Peptidoglycan kann im Kit entweder als wässrige Lösung oder als festes Pulver vorkommen. Eine wässrige Lösung eines solchen Oregon Green markierten Peptidoglycans kann in einem Puffer der Wahl hergestellt werden und Aliquots der zu quantifizierenden Lysozympräparation können dann zugegeben werden. Die Überwachung der Zunahme der Fluoreszenzintensität über die Zeit (Anregung: 495 nm, Emission: 521 nm) und der Vergleich der Ergebnisse mit denen, die aus einer Standardkurve erhalten werden, liefert ein quantitatives Maß der Lysozymaktivität in der Enyzmpräparation.
II. Reinigung von Lantibiotika mittels Lipid II
Lantibiotika sind eine Klasse an Peptidantibiotika, die durch spezifische posttranslationale Modifikationen gekennzeichnet sind, die zur Bildung der seltenen Thioetheraminosäuren Lanthionin und/oder 2-Methyllanthionin innerhalb dieser Moleküle führen und so diesen Namen "Lantibiotika" (Lanthioninenthaltende Antibiotika) erhalten. Die Lantibiotika Epidermin, Gardimycin (Actagardin), Mersacidin und Nisin haben eine antibakterielle Aktivität gegen gram-positive Organismen.
Kommerziell wurde Nisin Z als Konservierungsstoff für mehrere Jahrzehnte verwendet, insbesondere in der Milchindustrie. Es ist für den Mensch untoxisch und die Entwicklung einer Resistenz gegenüber diesem Antibiotikum wurde trotz der ausgedehnten Verwendung nicht beobachtet. Nisin Z wird derzeit sowohl als Arzneimittelkandidat für die Humananwendung als auch für die Einarbeitung in medizinische Vorrichtungen und Oberflächen der Nahrungsmittelprozessierungsmaschinen in Betracht gezogen, um mikrobiologisches Wachstum zu verhindern. Epidermin, Gardimycin und Mersacidin sind potentiell brauchbar als antibakterielle Arzneimittel zur Behandlung der bakteriellen Infektionen beim Menschen.
Epidermin, Mersacidin und Nisin Wechselwirken spezifisch mit Lipid II (Broetz et al. (2000) Journal of Antimicrobial Chemotherapy 46: 1–6, Breukink et al. (1999) Science 286: 2361–2364, Broetz et al., (1998) Antimicrobial Agents and Chemotherapy 42 (1): 154–160). Während es keine direkte Evidenz für die Bindung von Gardimycin an Lipid II gibt dürfte eine solche Bindung in Anbetracht der strukturellen Ähnlichkeiten zwischen Gardimycin und Mersacidin auftreten. Man dürfte daher erwarten, dass alle diese Lantibiotika aus einem Gemisch an Verbindungen gereinigt werden können, wie einem Kulturüberstand aus einem Lantibiotikum-produzierenden mikrobiellen Stamm durch Affinitatschromatographie auf einem Harz, das immobilisiertes Lipid II enthält. Beispiele für Lantibiotika-bildende Stämme umfassen Lactococcus lactis ssp. lactis (Nisin), Staphylococcus epidermidis (Epidermin), Bacillus sp. Stamm HIL Y-85,54728 (Mersacidin) und Actinoplanes liguriae (Gardimycin). Für diesen Zweck wird das Lipid II an aktivierte Harze gekuppelt, beispielsweise an jene, die von Lieferanten erhältlich sind, wie Amersham Pharmacia Biotech. Die Kupplung wird gemäß den Anleitungen des Herstellers ausgeführt. Im allgemeinen wird eine Lösung des gewünschten Liganden, in diesem Fall Lipid II, einfach mit einer Suspension des aktivierten Harzes in einem geeigneten Lösemittel oder Puffer gemischt (bestimmt durch die Löslichkeit des Liganden und durch die verwendete Kupplungschemie), inkubiert und der überschüssige Lipid II Ligand wird weggewaschen.
Falls das Kupplungsverfahren zu einer Orientierung des Lipids II relativ zur Oberfläche des Harzes führt, die keine Bindung von Lantibiotika erlaubt, dann wird Lipid II an hydrophobe Kügelchen gebunden, um dieses Problem zu überwinden. Auf diese Weise wird Lipid II auf dieselbe Weise präsentiert, wie es in der natürlichen Membranumgebung gefunden wird. Eine Monoschicht von Lipid II wird auf den hydrophoben Kügelchen gebildet, wie dies für eine Phospholipidmonoschicht von Retzinger et al. ((1985) Analytical Biochemistry 150: 131–140) oder Kim et al. ((1997) Analytical Biochemistry 250 (1): 109–116) beschrieben ist. Beispielsweise werden Polystyroldivinylbenzolkügelchen zusammen mit Lipid II in Hexan/Ethanol (etwa 1/1, V/V) ultrabeschallt und getrocknet. Die Kügelchen werden in Wasser redispergiert und mit Wasser gewaschen, was zu einer Lipidmonophase auf der Oberfläche der hydrohoben Kügelchen führt. Falls die molekulare Form von Lipid II nicht mit der Bildung einer reinen Lipid II Monoschicht auf der Oberfläche der Kügelchen kompatibel ist, werden die Kügelchen mit einem Gemisch der Phospholipide und Lipid II beschichtet.
Das Lantibiotika-enthaltende Gemisch passiert dann die Säule, die das Lipid II Harz enthält, unter Bedingungen, die die Bindung der Lantibiotika an das immobilisierte Lipid II erlauben. Beispielsweise erlauben gezeigte Bedingungen (Broetz et al. (1998) Antimicrobial Agents and Chemotherapy 42 (1): 154–160) die Bindung von Mersacidin und vermutlich Gardimycin an Lipid II und umfassen die folgenden:

a) 50 mM Tris-HCl, pH 7,8, 10 mM MgCl₂, 23°C oder
b) halbkonzentriertes Müller-Hinton Medium.

Bedingungen, unter denen Epidermin und Nisin an Lipid II binden (Broetz et al. (1998) Molecular Microbiology 30 (2): 317–327) umfassen:

a) 69 mM Tris-HCl, pH 8,8, 58 mM MgCl₂, 11,6 mM NH₄Cl, 5,8 mM SDS oder
b) 10 mM Tris-HCl, pH 7,2, 0,85% NaCl.

Zusätzliche Bedingungen, unter denen Nisin an Lipid II bindet (Wiedemann et al. (2001) Journal of Biological Chemistry 276 (1): 1772–1779) umfassen 25 mM MES-KOH, pH 6,0, 50 mM K₂SO₄ oder 50 mM MES-KOH, pH 6,0, 100 mM K₂SO₄.
Ungebundene Nicht-Lantibiotikamaterialien werden durch Elution der Säule mit demselben Puffer entfernt, der für die Lantibiotikabindung an Harz-immobilisiertes Lipid II verwendet wird.
Es wird erwartet, dass Mersacidin und Gardimycin von der Säule durch Waschen des Harzes mit einem Puffer, beispielsweise 50 mM Tris-HCl, pH 7,8 eluiert werden, worin EDTA enthalten ist, um divalente Kationen zu entfernen. Alternativ dazu kann gebundenes Lipid II säurehydrolysiert werden, um die Bindung zwischen MurNAc und Phosphat aufzubrechen, was Fragmente erzeugt, die nicht mehr mit Mersacidin oder Gardimycin Wechselwirken.
Es wird auch erwartet, dass die Wechselwirkungen von Nisin und/oder Epidermin mit Lipid II, das kovalent an das Harz gebunden ist, mit einem organischen Lösemittel aufgebrochen werden, beispielsweise 100% Acetonitril oder einem Detergenz. Extreme pH Werte, hohe Salzkonzentrationen oder wässrige Puffer, die EDTA enthalten, können ebenfalls verwendet werden.
Überblick über den synthetischen Ansatz
Die Diversität der Strukturelemente, die in Lipid II vorkommen, stellen mehrere signifikante Herausforderungen für eine Totalsynthese dar. Der zentrale Kern von Lipid II besteht aus einem β-[1,4]-verbundenem Disaccharid, das N-Acetylglucosamin (NAG) und N-Acetylmuraminsäure (NAM) Unterein heiten enthalten. Der Muramylrest wird ferner mit einer Pentapeptidkette (beispielsweise L-Ala-D-iGln-L-Lys-D-Ala-D-Ala oder L-Ala-D-iGln-meso-DAP-D-Ala-D-Ala) an die Position 3 über eine Lactylbindung wie auch als chemisch empfindlicher Undecaprenyl-verbundener α-Glycosyldiphosphatrest gebunden.
Die Synthese des zentralen Disaccharidkernfragments selbst in orthogonal geschützter Form stellt eine signifikante Syntheseherausforderung dar. Beispielsweise ist die Identifizierung eines Schutzschemas mit einer Dreifachorthogonalität hocherwünscht, um eine selektive Demaskierung der drei Typen an vorhandenen Hydroxylgruppen (das heißt anomeres OH, peripheres OH und Carboxyl OH) zu erreichen. Zusätzlich dürfte die stereoselektive Konstruktion der β-[1,4]-glycosidischen Bindung unabhängig von der zur Erzeugung eines reaktiven Glycosylkationendonors schwierig sein. In Bezug auf beispielsweise das Glycosylkation trägt jede der folgenden inhärenten Eigenschaften zu einem Verlust der Reaktivität des Glycosylkationenakzepors bei (i) der intrisische Verlust der Nukleophilizität der C(4)-Hydroxylgruppe der Glucopyranose-basierten Akzeptoren, (ii) zusätzliche sterische Ansammlungen um das C(4)-Hydroxyl der Muraminsäure-basierten Akzeptoren und (iii) zusätzliche elektronische Deaktivierung der 2-Desoxy-2-acylaminoglucopyranoseakzeptoren relativ zu ihren Glucopyranose-basierten Gegenstücken. In Bezug auf den Glycosylkationendonor ist ein Aktivierungsverfahren mit einer Prädisposition für die Bildung einer β-[1,4]-glycosidischen Bindung erforderlich. Die Reaktionsbedingungen für die Glycosylkationerzeugung müssen auch mit der sowohl im Donor als auch im Akzeptor vorhandenen Funktionalität kompatibel sein. Jedes der Syntheseprobleme, das mit einer stereoselektiven Konstruktion eines NAG-NAM Disaccharidvorläufers assoziiert ist (siehe Schema II später) wurde adressiert und es wurde ein Protokoll für deren Synthese im mehrfachen Grammmaßstab in einer vollkommen ausdifferenzierten Form entwickelt. Das Syntheseverfahren für die Herstellung des NAG-NAM Disaccharidvorläufers ist in den Beispielen dargestellt. Der Disaccharidken kann alternativ dazu mittels der allgemeinen Verfahren hergestellt werden, die in D. Kantoci et al., Carbohydrate Research 162, 227 (1987) beschrieben sind.
Zusätzlich zur Synthese des Disaccharidkerns wurden auch andere Herausforderungen bei der Totalsynthese von Lipid II erfolgreich adressiert, die umfassen: (1) ein Verfahren zur Einführung eines anomeren Phosphats in einen geeignet geschützten Disaccharidvorläufer in einer α-selektiven Weise, (2) ein mildes Verfahren zur Einführung des chemisch empfindlichen Undecaprenyl-gebundenen Diphosphats, (3) die Orthogonalität der in der Pentapeptidseitenkette und der Kohlenhydratperipherie verwendeten Schutzgruppen mit denen, die zur vorübergehenden Maskierung der reaktiven Funktionalität am anomeren Zentrum des Muramylfragments verwendet werden, (4) die Koordination des gesamten Schutzgruppenschemas, um eine umfassende Schutzgruppenabspaltung unter milden Reaktionsbedingungen als letzten Schritt in der Synthese zu erlauben und (5) Entwicklung eines Hochleistungsflüssigchromatographieprotokolls (HPLC) zur Reinigung des Endprodukts. Die später beschriebene Synthese von Lipid II adressiert jedes dieser oben aufgeführten Probleme erfolgreich.
Die Einführung des Undecaprenyl-gebundenen Diphosphatrests in einer späteren Stufe der Synthese liefert bestimmte Vorteile. Beispielsweise vermeidet sie potentielle Löslichkeitskomplikationen in anschließenden Reaktionen, die aus dem verstärkten lipophilen Charakter des Undecaprenylgebundenen Substrats entstehen können. Zusätzlich minimiert die Einführung des Lipid-gebundenen Diphosphats zum späteren Zeitpunkt auch die Anzahl der anschließenden Syntheseoperationen, die die chemisch empfindliche allylische Diphosphatbindung widerstehen muss.
Es wurde auch festgestellt, dass die Verwendung von Basen-abspaltbaren Schutzgruppen für alle funktionellen Gruppen, die nach ihrem Einbau unmaskiert sind, es erlaubt, jede potentielle Säureempfindlichkeit des anomeren Diphosphats zu vermeiden.
Eine Zersetzung des Lipid II Zwischenprodukts aufgrund der Säureempfindlichkeit der Pyrophosphatgruppe wurde in der Technik nicht vollkommen erkannt. Es wurde nun festgestellt, dass wenn der Pyrophosphatrest in der Verbindung vorhanden ist, die Nebenprodukte aus der Zersetzung durch die Aufrechterhaltung des pH über etwa 6 minimiert werden können. Vorzugsweise wird der pH zwischen 6 und 12, bevorzugter 7 bis 10, noch bevorzugter 7 bis 9 gehalten. Es wird angenommen, dass sogar das natürliche Produkt in höheren Ausbeuten und höherer Reinheit isoliert werden kann, falls der pH bei einem pH gehalten wird, der größer als 6 ist, anstelle der derzeitigen Praxis, bei der 6 M Pyridinium/Acetat im Isolierungsverfahren verwendet wird, das einen pH von 4,2 aufweist. Für eine detaillierte Beschreibung der derzeitigen Isolierungsverfahren für das natürliche Produkt siehe: Y. Van Heuenoort et al., "Membrane Intermediates in the Peptidoglycan Metabolism of Escherichia coli: Possible Roles of PBP 1b und PBP 3,", J. Bacteriol., 174 (11), 3549–3557 (1992) und J. S. Anderson et al., "Biosynthesis of the Peptidoglycan of Bacterial Cell Walls", J. Biol. Chem., 242 (13), 3180–3190 (1967).
Das Lipid II kann mittels herkömmlicher Chromatographieverfahren gereinigt werden, die dem Fachmann bekannt sind. Ein besonders brauchbarer Satz an Chromatographiebedingungen ist in den Beispielen erläutert. Das Lipid II wird in Reinheiten isoliert, die viel höher sind als die derzeit verfügbaren. Man kann das Lipid II in Reinheiten von mehr als 50% isolieren. Im allgemeinen kann das Lipid II mit einer Reinheit von größer oder gleich 60%, 70%, 80%, 90%, 95% oder 98% und unter optimalen Bedingungen in im wesentlichen reiner Form (≥ 99%) isoliert werden.
Es ist verständlich, dass die Erfindung alle geeigneten Kombinationen der bestimmten und bevorzugten Gruppierungen und individuellen oder kombinierten Verfahrensschritte abdeckt, wie dies hierin beschrieben ist.
Allgemeine Herstellung von Lipid II Analoga
Eine Verbindung der Formel 1, worin die Variablen wie oben beschrieben sind, kann durch Entfernung der Pg⁰ und Pg³ Gruppen und der Abspaltung der P Gruppe einer Verbindung der Formel 2, worin die Variablen wie hierin beschrieben sind,
in Gegenwart eines Schutzgruppenabspaltungsmittels unter geeigneten Bedingungen hergestellt werden. Bestimmte Pg⁰ und Pg³ Gruppen sind Acetyl oder dergleichen. Ein bestimmtes Schutzgruppenabspaltungsmittel ist wässriges Natriumhydroxid oder dergleichen. Bestimmte Schutzgruppenabspaltungsbedingungen umfassen die Ausführung der Schutzgruppenabspaltung in einer etwa 1:1 Lösung aus 1,4-Dioxan:Wasser oder dergleichen, während für etwa 2 Stunden gerührt wird.
Eine Verbindung der Formel 2, worin die Variablen wie hierin beschrieben sind, kann durch die Behandlung eines aktivierten Phosphats der Formel 4 hergestellt werden, worin 1¹ für eine Abgangsgruppe steht und die anderen Variablen wie hierin beschrieben sind, mit einem Monophosphat der Formel 3, worin B² für eine Base steht und X wie hierin beschrieben ist, unter geeigneten Kupplungsbedingungen.
Ein bestimmtes L¹ ist Imidazolyl oder dergleichen. Bestimmte Bedingungen umfassen die Exposition des aktivierten Phosphats gegenüber dem Monophosphat (Et₃NH⁺ Salz) oder dergleichen in Gegenwart von 1H-Tetrazol oder dergleichen (1 Äquivalent) über etwa 4 Tage in DMF/THF unter etwa einer Argonatmosphäre oder dergleichen.
Eine Verbindung der Formel 3, worin die Variablen wie hierin beschrieben sind, kann hergestellt werden durch (1) Schutzgruppenabspaltung an einer Verbindung der Formel 22, worin Pg⁹ für eine Phosphatschutzgruppe steht und X wie hierin beschrieben ist, in Gegenart eines Schutzgruppenabspaltungsmittels unter geeigneten Bedingungen und (2) Behandlung der entstehenden Verbindung mit einer Base der Formel B², worin B² wie hierin beschrieben ist.
Eine bestimmte Pg⁹ Phosphatschutzgruppe ist ein 2,2,2-Trichlorethyl oder dergleichen. Eine bestimmte Base der Formel B² ist Triethylamin oder dergleichen. Ein bestimmtes Schutzgruppenabspaltungsmittel ist Zn Staub oder dergleichen in Gegenwart einer Protonenquelle (beispielsweise HCl) oder dergleichen. Bestimmte Bedingungen umfassen die Zugabe von 0,1 M HCl oder dergleichen in THF (2–5 ml) oder dergleichen tropfenweise in 2 Portionen über etwa 1 Stunde zu einer gerührten Lösung oder Suspension in THF oder dergleichen einer Verbindung der Formel 22 (etwa 1 Äquivalent) und Zinkstaub (etwa 12 Äquivalente) oder dergleichen bei etwa 0°C. Das Reaktionsgemisch wird bei etwa 0°C gerührt und wird bis zur Vollständigkeit durch TLC verfolgt. Nach der Vollständigkeit wird das Reaktionsgemisch zwischen Et₂O oder dergleichen und 1 N HCl oder dergleichen aufgeteilt und gerührt, bis der Zinkstaub oder dergleichen vollständig aufgelöst ist. Die Phasen werden getrennt und die wässrige Phase wird mit Et₂O (× 3) oder dergleichen extrahiert. Die vereinigten Et₂O Phasen werden mit Na₂SO₄ getrocknet und filtriert. Triethylamin oder dergleichen (1–3 ml) oder dergleichen wird zugegeben und die organische Phase wird im Vakuum unter Bildung der Verbindung 3 konzentriert (80–95%).
Eine Verbindung der Formel 22, worin die Variablen wie oben beschrieben sind, kann durch Kupplung einer Verbindung der Formel 23, worin L³ für eine Abgangsgruppe steht und Pg⁹ wie hierin beschrieben ist, mit einem Lipidalkohol der Formel 24, worin X wie hierin beschrieben ist, unter geeigneten Bedingungen hergestellt werden.
Eine bestimmte -L³ Gruppe ist Cl oder dergleichen. Eine bestimmte Pg⁹ Gruppe ist 2,2,2-Trichlorethyl oder dergleichen. Bestimmte Bedingungen umfassen die Zugabe einer Verbindung der Formel 23 (etwa 1,5 Äquivalente) und N,N-Dimethylaminopyridin (etwa 0,2 Äquivalente) oder dergleichen, zu einer Lösung des Lipidalkohols (etwa 1 Äquivalent) oder dergleichen in wasserfreiem CH₂Cl₂ (etwa 0,1 M) oder dergleichen). Triethylamin (etwa 3 Äquivalente) oder dergleichen wird tropfenweise zugegeben und die Reaktion wird bei Raumtemperatur gerührt. Nach Vervollständigung der Reaktion, wie dies durch TLC gezeigt wird, wird das Reaktionsgemisch zwischen CH₂Cl₂ oder dergleichen und 1 N HCl oder dergleichen aufgeteilt. Die wässrige Phase wird mit CH₂Cl₂ (3 ×) oder dergleichen extrahiert. Die organische Phase wird nacheinander mit H₂O und Kochsalzlösung oder dergleichen gewaschen, getrocknet (Na₂SO₄) oder dergleichen und im Vakuum konzentriert. Der Rückstand wird durch Blitzchromatohgraphie über Silicagel gereinigt, wobei mit einem Gradienten aus Hexan bis etwa 10% EtOAc in Hexan eluiert wird. Die Konzentrierung der relevanten Fraktionen ergibt die Verbindung der Formel 22 (etwa 80 bis etwa 90%) als farbloses Öl.
Eine Verbindung der Formel 4, worin die Variablen wie hierin beschrieben sind, kann durch Kupplung einer Verbindung der Formel 6, worin B für eine Base steht und die anderen Variablen wie hierin beschrieben sind, mit einem Aktivierungsmittel der Formel 5 unter geeigneten Bedingungen hergestellt werden.
Die Kupplungsreaktion ergibt anfänglich ein Phosphatdiesterzwischenprodukt, das CO₂ unter Bildung des aktivierten Phosphats der Formel 4 abgibt. Ein bestimmtes Aktivierungsmittel ist CDI oder dergleichen. Eine bestimmtes Basengegenion BH⁺ ist C₅H₅NH⁺ oder dergleichen. Bestimmte Bedingungen umfassen die Ausführung der Reaktion in wasserfreiem DMF/THF oder dergleichen für etwa 2 Stunden. Eine elektrophile Aktivierung des anomeren Phosphats durch Umwandlung zum entsprechenden Phoshorimidazolatderivat ist in X. Fang et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 5, 2701 (1995) beschrieben.
Eine Verbindung der Formel 6, worin die Variablen wie hierin beschrieben sind, kann hergestellt werden durch (1) Entfernung der Pg⁶ Gruppen einer Verbindung der Formel 7, worin die Variablen wie hierin beschrieben sind, in Gegenart eines Hydrierungsmittels unter geeigneten Bedingungen und (2) Behandlung der entstehenden Verbindung mit einer Base der Formel B unter Bildung eines Phosphatsalzes.
Eine bestimmte Pg⁶ Gruppe ist Benzyl oder dergleichen. Ein bestimmtes Hydrierungsmittel ist Pd/C oder dergleichen. Bestimmte Hydrierungsbedingungen umfassen die Zugabe der Verbindung 7 zu einer Suspension mit etwa 10% Pd/C oder dergleichen in einem Alkohol (vorzugsweise Methanol) oder dergleichen, der in einem Eisbad unter Erleichterung der Entgasung der Reaktionslösung, gekühlt wird. Die Lösung wird dann auf Raumtemperatur erwärmt und bei atmosphärischem Druck für etwa 1,5 Stunden hydriert. Eine bestimmte Base der Formel B ist Pyridin oder dergleichen.
Eine Verbindung der Formel 7, worin die Variablen wie oben beschrieben sind, können durch Kupplung eines aktivierten Esters der Formel 9, worin -OL für eine Abgangsgruppe steht und die anderen Variablen wie hierin beschrieben sind, mit einer Aminosäure/einem Peptid der Formel 8, worin P wie hierin beschrieben ist, unter geeigneten Bedingungen hergestellt werden.
Ein bestimmtes -OL ist N-Oxysuccinimid oder dergleichen. Bestimmte Bedingungen umfassen die Auflösung der Verbindungen der Formel 8 und 9 zusammen mit iPr₂NEt oder dergleichen in DMF oder dergleichen und Rühren etwa bei Raumtemperatur unter Argon oder dergleichen für 18 Stunden.
Eine Verbindung der Formel 8, worin die Variablen wie oben beschrieben sind, wird durch herkömmliche Peptidsyntheseverfahren hergestellt, die in der Technik bekannt sind.
Ein aktivierter Ester der Formel 9, worin die Variablen wie hierin beschrieben sind, können durch Veresterung einer Säure der Formel 11, worin die Variablen wie hierin definiert sind, mit einer Verbindung der Formel 10 unter geeigneten Bedingungen hergestellt werden.
Ein bestimmtes LOH ist N-Hydroxysuccinimid oder dergleichen. Bestimmte Bedingungen umfassen die Auflösung der Verbindung der Formel 11, EDCI oder dergleichen und N-Hydroxysuccinimid oder dergleichen in wasserfreiem DMF oder dergleichen und das Rühren für 18 Stunden.
Eine Säure der Formel 11, worin die Variablen wie hierin beschrieben sind, kann durch Entfernung der Pg⁴ Gruppe einer Verbindung der Formel 12, worin die Variablen wie hierin beschrieben sind, in Gegenwart einer Carboxyschutzgruppe unter geeigneten Bedingungen hergestellt werden.
Die Schutzgruppenabspaltung am Carboxy wird mittels eines geeigneten Schutzgruppenabspaltungsmittels ausgeführt, das von der Art der Carboxyschutzgruppe, das heißt ob sie unter Säure-, Base- oder Hydrierungsbedingungen entfernbar (labil) ist und anderen reaktiven Resten in der Verbindung abhängt, die der Schutzgruppenabspaltung unterzogen werden, das heißt ein Schutzgruppenabspaltungsmittel wird so ausgewählt, dass es die Schutzgruppenabspaltung ohne Beeinflussung der anderen reaktiven Reste ausführt, falls nicht eine gleichzeitige Reaktion erwünscht ist. Eine bestimmte Pg⁴ Gruppe ist -CH₂CH₂SO₂Ph oder dergleichen. Ein bestimmtes Schutzgruppenabspaltungsmittel ist DBU oder dergleichen. Bestimmte Bedingungen umfassen das Lösen der Verbindung 12 in CH₂Cl₂ oder dergleichen und die Zugabe von DBU oder dergleichen tropfenweise unter Argonatmosphare oder dergleichen.
Ein Phosphotriester der Formel 12, worin die Variablen wie hierin beschrieben definiert sind, kann hergestellt werden durch (1) Kupplung eines Lactols der Formel 13, worin die Variablen wie hierin beschrieben sind, mit einer Verbindung der Formel L²P(OPg⁶)₂, worin 1² für eine Abgangsgruppe steht und die anderen Variablen wie hierin beschrieben sind, unter geeigneten Phosphitylierungsbedingungen und (2) Oxidation des entstehenden Phosphits zu einem Phosphat in Gegenwart eines Oxidationsmittels unter geeigneten Oxidationsbedingungen.
Eine bestimmte Verbindung der Formel L²P(OPg⁶)₂ ist Et₂NP(OBn)₂ oder dergleichen. Bestimmte Phosphitylierungsbedingungen umfassen die schnelle Zugabe des Lactons in wasserfreiem CH₂Cl₂ oder dergleichen zu einer stark gerührten Suspension an Tetrazol oder dergleichen und Et₂NP(OBn)₂ oder dergleichen in wasserfreiem CH₂Cl₂ unter Argon bei etwa 25°C. Ein bestimmtes Oxidationsmittel ist H₂O₂ oder dergleichen. Bestimmte Oxidationsbedingungen umfassen das Lösen des Phosphats in THF oder dergleichen und das Abkühlen auf etwa –80°C. Dann wird H₂O₂ oder dergleichen tropfenweise zur stark gerührten Lösung zugegeben. Nachdem die Zugabe vollständig ist, wird das Eisbad entfernt und das Gemisch kann sich über etwa 2 Stunden auf etwa Raumtemperatur erwärmen. Die Phosphitylierungs-/Kupplungssequenz ist beispielsweise in C. H. Wong et al., J. Am. Chem. Soc. 115, 2260 (1993), S. A. Hitchcock et al., J. Am. Chem. Soc. 120, 1916 (1998) und S. Walker et al., J. Am. Chem. Soc. 120, 2484 (1998) beschrieben.
Ein Lactol der Formel 13, worin die Variablen wie hierin beschrieben sind, kann durch Entfernung der Pg⁵ Gruppe eines anomeren Benzylethers der Formel 14, worin die Variablen wie hierin beschrieben sind, in Gegenwart eines Hydroxyschutzgruppenabspaltungsmittels unter geeigneten Bedingungen hergestellt werden.
Eine besondere Pg⁵ Gruppe ist Benzyl oder dergleichen. Ein bestimmtes Hydroxyschutzgruppenabspaltungsmittel ist H₂ (Pd/C) oder dergleichen. Bestimmte Bedingungen umfassen die Auflösung des Benzylethers in HCl/Essigsäure oder dergleichen und die Zugabe der entstehenden Lösung zu einer Suspension von etwa 10% Pd/C oder dergleichen in HCl/Essigsäure oder dergleichen. Das Reaktionsgemisch wird unter einer Wasserstoffatmosphäre bei etwa 25°C für 1,5 Stunden gerührt.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird eine Verbindung der Formel 2, worin die Variablen wie hierin oben beschrieben sind, durch die Behandlung einer Verbindung der Formel 6, worin die Variablen wie hierin beschrieben sind, mit einem aktivierten Phosphatester der Formel 25, worin die Variablen wie hierin beschrieben sind, unter geeigneten Kupplungsbedingungen hergestellt werden.
Eine bestimmte -L¹ Gruppe ist Imidazolyl oder dergleichen. Eine bestimmte Base der Formel B ist Pyridin oder dergleichen. Bestimmte Bedingungen umfassen die Zugabe von 4,5-Dicyanoimidazol (3 Äquivalente) oder dergleichen zu einer gerührten Lösung des Disaccharidphosphatmonopyridylsalzes (1 Äquivalent) und des Lipidphosphoimidazolat (2 Äquivalente) in wasserfreiem THF (0,1 M) oder dergleichen. Die Reaktion wird für 1 bis 2 Tage gerührt, bis das gesamte Disaccharidphosphatpyridylsalz verbraucht ist, wie dies durch HPLC gezeigt wird. Das bevorzugte Verfahren ist in Whitman und Wong, Journal of Organic Chemistry, 62, Nr. 7, 2144 (1997) beschrieben.
Eine Verbindung der Formel 25, worin die Variablen wie hierin beschrieben sind, kann durch die Behandlung einer Verbindung der Formel 3, worin die Variablen wie hierin beschrieben sind, mit einem Aktivierungsmittel der Formel 5 unter geeigneten Kupplungsbedingungen hergestellt werden.
Ein bestimmtes Aktivierungsmittel ist CDI oder dergleichen. Eine bestimmte Base der Formel B2 ist Et₃N oder dergleichen. Bestimmte Kupplungsbedingungen umfassen die Zugabe von CDI (1,05 Äquivalente) oder dergleichen zu einer gerührten Lösung des Lipidphosphattriethylammoniumsalzes (1 Äquivalent) in wasserfreiem THF (0,1 M) oder dergleichen. Das Reaktionsgemisch wird dann über Nacht gerührt.
Allgemeine Herstellung von Lipid II
Lipid II, worin A wie hierin beschrieben ist, kann durch Entfernung der Pg⁰, Pg³, Pg⁷ und Pg8 Gruppen einer Verbindung der Formel 2a, worin die Variablen wie hierin beschrieben sind, in Gegenwart eines Schutzgruppenabspakungsmittels unter geeigneten Bedingungen hergestellt werden.
Bestimmte Pg⁰ und Pg³ Gruppen sind Acetyl oder dergleichen. Eine bestimmte Pg⁷ Gruppe ist Trifluoracetyl oder dergleichen. Eine bestimmte Pg⁸ Gruppe ist Methyl oder dergleichen. Ein bestimmtes Schutzabspaltungsmittel ist wässriges Natriumhydroxid oder dergleichen. Bestimmte Bedingungen umfassen die Ausführung der Schutzgruppenabspaltung in einer etwa 1:1 Lösung aus 1,4-Dioxan:Wasser oder dergleichen, während für etwa 2 Stunden gerührt wird. Es muss sorgfältig vorgegangen werden, wenn das Pentapeptid gegenüber den durch Hydroxidionen-vermittelten Schutzgruppenabspaltungsbedingungen für längere Zeiträume ausgesetzt wird, da die Basen-katalysierte Umlagerung von Isoglutamin zu Glutamin in Peptidoglycan-verwandten Strukturen beobachtet wurde (siehe beispielsweise D. Keglevic und A. E. Derome, Carbohydrate Res., 186, 63 (1989) und D. Keglevic und J. Kidric, J. Carbohydrate Res., 11, 119 (1992).
Eine Verbindung der Formel 2a, worin die Variablen wie hierin beschrieben sind, kann durch die Behandlung eines aktivierten Phosphats der Formel 4a, worin die Variablen wie hieirn beschrieben sind, mit einem Undecaprenylmonophosphat der Formel 3a, worin B² wie hierin beschrieben ist, unter geeigneten Kupplungsbedingungen hergestellt werden.
Ein bestimmtes -L¹ ist Imidazolyl oder dergleichen. Eine bestimmte Verbindung der Formel 3a ist Undecaprenylmonophosphat (Bis-NH₄ ⁺ Salz). Bestimmte Bedingungen umfassen die Exposition des aktivierten Phosphats gegegnüber Undecaprenylmonophosphat (Bis-NH₄ ⁺ Salz) in Gegenwart von 1H-Tetra zol oder dergleichen über etwa 4 Tage in DMF/THF oder dergleichen unter einer Argonatmosphäre oder dergleichen.
Eine Verbindung der Formel 4a, worin die Variablen wie hierin beschrieben sind, kann durch eine Kupplung einer Verbindung der Formel 6a, worin die Variablen wie hierin beschrieben sind, mit einem Aktivierungsmittel der Formel 5 unter geeigneten Bedingungen hergestellt werden.
Die Kupplungsreaktion bildet anfänglich ein Phosphatdiesterzwischenprodukt, das unter Bildung des aktivierten Phosphats der Formel 4a CO₂ abgibt. Ein bestimmtes Aktivierungsmittel ist CDI oder dergleichen. Ein bestimmtes Basengegenion BH⁺ ist C₅H₅NH⁺ oder dergleichen. Bestimmte Bedingungen umfassen die Ausführung der Reaktion in wasserfreiem DMF/THF oder dergleichen für etwa 2 Stunden. Eine elektrophile Aktivierung des anomeren Phosphats durch Umwandlung zum entsprechenden Phosphorimidazolatderivat ist in X. Fang et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 5, 2701 (1995) beschrieben.
Eine Verbindung der Formel 6a, worin die Variablen wie hierin beschrieben sind, kann hergestellt werden durch (1) Entfernung der Pg⁶ Gruppen einer Verbindung der Formel 7a, worin die Variablen wie hierin beschrieben sind, in Gegenwart eines Hydrierungsmittels unter geeigneten Bedingungen und (2) Behandlung der entstehenden Verbindung mit einer Base der Formel B unter Bildung eines Phosphatsalzes.
Eine bestimmte Pg⁶ Gruppe ist Benzyl oder dergleichen. Ein bestimmtes Hydrierungsmittel ist Pd/C oder dergleichen. Bestimmte Hydrierungsbedingungen umfassen die Zugabe der Verbindung 7a zu einer Suspension mit etwa 10% Pd/C oder dergleichen in einem Alkohol (vorzugsweise Methanol) oder dergleichen, der in einem Eisbad unter Erleichterung der Entgasung der Lösung gekühlt wird. Die Lösung wird dann auf Raumtemperatur erwärmt und bei atmosphärischem Druck für etwa 1,5 Stunden hydriert. Eine bestimmte Base der Formel B ist Pyridin oder dergleichen.
Eine Verbindung der Formel 7a, worin die Variablen wie oben beschrieben sind, kann durch Kupplung eines aktivierten Esters der Formel 9a, worin die Variablen hierin beschrieben sind, mit einem Peptid der Formel 8a, worin die Variablen wie hierin beschrieben sind, unter geeigneten Bedingungen hergestellt werden.
Eine bestimmte -OL Gruppe ist N-Oxysuccinimid oder dergleichen. Bestimmte Bedingungen umfassen die Auflösung der Verbindungen der Formel 8a und 9a zusammen mit iPr₂NEt oder dergleichen in DMF oder dergleichen und Rühren etwa bei Raumtemperatur unter Argon oder dergleichen für etwa 18 Stunden. Es besteht keine Evidenz für die Epimerisierung des L-Ala α-Stereozentrums während des Verlaufs der Carboxylaktivierungspeptidkupplungssequenz.
Eine Verbindung der Formel 8a, worin die Variablen wie oben beschrieben sind, wird durch herkömmliche Peptidsyntheseverfahren hergestellt, die in der Technik bekannt sind.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird eine Verbindung der Formel 2a, worin die Variablen wie hierin beschrieben sind, durch die Behandlung einer Verbindung der Formel 6a, worin die Variablen wie hierin beschrieben sind, mit einem aktivierten Phosphatester der Formel 25a, worin die Variablen wie hierin beschrieben sind, unter geeigneten Kupplungsbedingungen hergestellt.
Eine bestimmte -L¹ Gruppe ist Imidazolyl oder dergleichen. Eine bestimmte Base der Formel B ist Pyridin oder dergleichen. Bestimmte Bedingungen umfassen die Zugabe von 4,5-Dicyanoimidazol (3 Äquivalente) oder dergleichen zu einer gerührten Lösung des Disaccharidphosphatmonopyridylsalzes (1 Äquivalent) und des Lipidphosphoimidazolats (2 Äquivalente) in wasserfreiem THF (0,1 M) oder dergleichen. Die Reaktion wird für 1 bis 2 Tage gerührt, bis das gesamte Disaccharidphosphatpyridylsalz verbraucht ist, wie dies durch HPLC gezeigt wird. Das bevorzugte Verfahren ist in Whitman und Wong, Journal of Organic Chemistry, 62, Nr. 7, 2144 (1997) beschrieben.
Eine Verbindung der Formel 25a, worin die Variablen wie hierin beschrieben sind, kann durch die Behandlung einer Verbindung der Formel 3a, worin die Variablen wie hierin beschrieben sind, mit einem Aktivierungsmittel der Formel 5 unter geeigneten Kupplungsbedingungen hergestellt werden.
Ein bestimmtes Aktivierungsmittel ist CDI oder dergleichen. Eine bestimmte Base der Formel B2 ist Triethylammonium oder dergleichen. Bestimmte Kupplungsbedingungen umfassen die Zugabe von CDI (1,05 Äquivalente) zu einer gerührten Lösung des Lipidphosphattriethylammoniumsalzes (1 Äquivalent) in wasserfreiem THF (0,1 M) oder dergleichen. Das Reaktionsgemisch wird dann über Nacht gerührt.
Allgemeine Herstellung des NAG-NAM Disaccharids
Ausgangsmaterial
Eine Verbindung der Formel 14, worin die Variablen wie hierin beschrieben sind, kann durch Austausch der Pg² Gruppe einer Verbindung der Formel 15, worin die Variablen wie hierin beschrieben sind, mit einer Acetylgruppe in Gegenwart eines Aminschutzgruppenabspaltungsmittels und eines Acylierungsmittels unter geeigneten Bedingungen hergestellt werden.
Die Aminschutzgruppenabspaltung wird mittels eines geeigneten Schutzgruppenabspaltungsmittels ausgeführt, das von der Art der Aminschutzgruppe abhängt, das heißt ob sie unter Säure-, Basen- oder Hydrierungsbedingungen entfernbar (labil) ist und andere reaktive Gruppen in der Verbindung einer Schutzgruppenabspaltung unterzogen werden, das heißt ein Schutzgruppenabspaltungsmittel wird so ausgewählt, um die Schutzgruppenabspaltung ohne der Beeinflussung der anderen reaktiven Reste auszuführen, falls keine gleichzeitige Reaktion erwünscht ist. Eine bestimmte Aminschutzgruppe ist 2,2,2-Trichlorethoxycarbonyl oder dergleichen. Ein bestimmtes Schutzgruppenabspaltungsmittel ist Zn Staub oder dergleichen in Gegenwart einer Protonenquelle (beispielsweise Essigsäure) oder dergleichen. Ein bestimmtes Acylierungsmittel ist Essigsäureanhydrid oder dergleichen. Bestimmte Bedingungen umfassen die Zugabe von Zn Staub oder dergleichen und ein 3:2:1 Gemisch aus THF: Ac₂O:AcOH zu einer Lösung der Verbindung 8 in einem etwa 2:1 Gemisch aus Ac₂O:AcOH oder dergleichen.
Eine Verbindung der Formel 15, worin die Variablen wie hierin beschrieben sind, kann durch Austausch der Pg¹ Gruppe einer Verbindung der Formel 16, worin die Variablen wie hierin beschrieben sind, mit einer Pg³ Gruppe in Gegenwart eines Solvolysierungsmittels und Acylierungsmittels unter geeigneten Bedingungen hergestellt werden.
Die Solvolyse wird unter Verwendung eines geeigneten solvolysierenden Mittels ausgeführt, das von der Art der Hydroxyschutzgruppe abhängt, das heißt es wird ein Solvolysierungsmittel ausgewählt, um die Solvolyse ohne Beeinflussung der anderen reaktiven Reste auszuführen, falls keine gleichzeitige Reaktion erwünscht ist. Eine bestimmte Hydroxyschutzgruppe ist Benzyl oder dergleichen. Ein bestimmtes Solvolysierungsmittel ist ZnCl₂ oder dergleichen. Ein bestimmtes Acylierungsmittel ist Essigsäureanhydrid oder dergleichen. Bestimmte Bedingungen umfassen die Ausführung einer Solvolyse/Acylierung in einem etwa 2:1 Gemisch an Ac₂O:AcOH oder dergleichen.
Die Synthese einer Verbindung der Formel 16, dem zentralen Disaccharidkern, in orthogonal geschützter Form stellt eine signifikante Syntheseherausforderung dar. Beispielsweise ist die Identifizierung eines Schutzschemas mit einer Dreifachorthogonalität sehr erwünscht, um eine selektive Demaskierung der drei Typen an anhängenden Hydroxylgruppen (das heißt anomeres OH, peripheres OH und Carboxyl OH) zu erreichen. Zusätzlich dürfte die stereoselektive Konstruktion der β-[1,4]-glycosidischen Bindung unabhängig von der zur Erzeugung eines reaktiven Glycosylkationendonors schwierig sein. In Bezug auf beispielsweise das Glycosylkation trägt jede der folgenden inhärenten Eigenschaften zu einem Verlust der Reaktivität des Glycosylkationenakzeptors bei (i) der intrisische Verlust der Nukleophilizität der C(4)-Hydroxylgruppe der Glucopyranose-basierten Akzeptoren, (ii) zusätzliche sterische Ansamm lungen um das C(4)-Hydroxyl der Muraminsäure-basierten Akzeptoren und (iii) zusätzliche elektronische Deaktivierung der 2-Desoxy-2-acylaminoglucopyranoseakzpetoren relativ zu ihren Glucopyranosebasierten Gegenstücken. In Bezug auf den Glycosylkationendonor ist ein Aktivierungsverfahren mit einer Prädisposition für die Bildung einer β-[1,4]-glycosidischen Bindung erforderlich. Die Reaktionsbedingungen für die Glycosylkationerzeugung müssen auch mit der sowohl im Donor als auch im Akzeptor vorhandenen Funktionalität kompatibel sein.
Eine Verbindung der Formel 16, worin die Variablen wie hierin beschrieben sind, kann durch die Kupplung einer Muramylamidverbindung der Formel 17, worin A¹ für Br oder Cl (vorzugsweise Br) steht und die anderen Variablen wie hierin beschrieben sind, mit einer Glycopyranosylverbindung der Formel 17, worin die Variablen wie hierin beschrieben sind, unter geeigneten Bedingungen hergestellt werden.
Bestimmte Bedingungen umfassen die Ausführung der Kupplungsreaktion unter bedingungslos wasserfreien Konigs-Knorr Bedingungen (beispielsweise in einer Silbertriflat/Dichlormethanlösung einschließlich Molekularsieben) oder dergleichen.
Eine Verbindung der Formel 17 wird gemäß der in M. Imoto, Bull. Chem. Soc. Jpn., 60, 2205 (1987) beschriebenen Verfahren hergestellt.
Eine Verbindung der Formel 18, worin die Variablen wie hierin beschrieben sind, kann durch Kuppeln einer Säure der Formel 20, worin die Variablen wie hierin beschrieben sind, mit einer geschützten Aminosäure-/Peptidverbindung der Formel 19, worin die Variablen wie hierin beschrieben sind, unter geeigneten Bedingungen hergestellt werden.
Bestimmte Bedingungen umfassen die Ausführung der Kupplungsreaktion in einer Lösung aus NMM oder dergleichen und 2-Chlor-4,6-dimethoxy-1,3,5-triazin oder dergleichen in CH₂Cl₂ oder dergleichen, worin die Verbindung der Formel 19 zum Tosylatsalz oder dergleichen gegeben wird.
Eine Verbindung der Formel 18a, worin Pg¹ für Benzyl steht und die anderen Variablen wie hierin beschrieben sind, kann durch die Behandlung einer Verbindung der Formel 21, worin die Variablen wie hierin definiert sind, mit einem Reduktionsmittel unter geeigneten Bedingungen hergestellt werden.
Ein bestimmtes Reduktionsmittel ist Triethylsilan oder dergleichen. Bestimmte Bedingungen umfassen die Ausführung der Reduktion in CH₂Cl₂ oder dergleichen und TFA oder dergleichen bei etwa 0°C. Diese Reaktion liefert ein effizientes Mittel zur regioselektiven Einführung der Benzylschutzgruppe/-aktivierung am C(6)OH des Muraminsäurederivats.
Es ist bekannt, dass wenn ein Esterderivat einer Verbindung der Formel 21 mit Trifluoressigsäure und Triethylsilan behandelt wird, wie dies in M. P. DeNinno et al., Tetrahedron Lett., 36, 669 (1995) beschrieben ist, nur eine kleine Menge der analogen Verbindung der Formel 18a beobachtet wird. Das gebildete Hauptprodukt ist ein Lacton, wie dies in Schema I gezeigt ist.
Schema I
Die säurekatalysierte Lactonisierung läuft mit einer Geschwindigkeit, die mit der reduktiven Ringöffnung konkurriert und so zum unerwünschten Lacton führt. In der vorliegenden Erfindung eliminiert die Einführung einer Amindbindung anstelle der Esterbindung die Umwandlung zum Lacton und erlaubt so das gewünschte Produkt (Verbindung 18a) in viel höheren Ausbeuten zu isolieren.
Eine Verbindung der Formel 21, worin die Variablen wie hierin beschrieben sind, kann durch Kupplung einer Säure der Formel 20a, worin die Variablen wie hierin beschrieben sind, mit einer geschützten Aminosäure der Formel 19, worin die Variablen hierin beschrieben sind, unter geeigneten Bedingungen hergestellt werden.
Bestimmte Bedingungen umfassen die Ausführung der Kupplungsreaktion in einer Lösung aus NMM oder dergleichen und 2-Chlor-4,6-dimethoxy-1,3,5-triazin oder dergleichen in CH₂Cl₂ oder dergleichen, worin die geschützte Aminosäure als Tosylatsalz oder dergleichen zugegeben wird.
Allgemeine Experimentaldaten
Die Reaktionen werden mit kontinuierlichem Rühren unter einem positiven Stickstoffdruck ausgeführt, falls nichts anderes angegeben ist. Reagenzien und Lösemittel werden ohne weitere Reinigung bezogen und verwendet. Die TLC wird mittels 0,25 mm Silicagel 60 Platten mit einem 254 nm Fluoreszenzindikator von E. Merck ausgeführt. Die Platten werden in einer geschlossenen Kammer entwickelt und durch ultraviolettes Licht oder durch die Behandlung mit 5% Phosphomolybdänsäure (oder alternativ CAM) in Ethanol, gefolgt von einem Erhitzen sichtbar gemacht. Es wird eine Blitzchromatographie mit Silicagel 60, 230–400 Mesh (0,040–0,063 mm Partikelgröße) ausgeführt, die von EM Science bezogen wird. HPLC Analysen und Reinigungen werden mittels Dynamax C8 Säulen mit dem angegebenen Lösemittelsystem und der Flussrate ausgeführt. Die NMR Spektren werden als chemische Verschiebungen in Teile-pro-Million (ppm) feldabwärts eines internen Tetramethylsilanstandards (0 ppm) angegeben. Die ¹H NMR Spektren werden im angegebenen Lösemittel entweder auf einem Bruker Avance Spektrometer bei 500,18 MHz, einem Varian Mercury Spektrometer bei 400,21 MHz oder einem GE QE-300 Spektrometer bei 300,15 MHz aufgezeichnet. ¹³C Spektren werden in den angegebenen Lösemitteln auf den vorher erwähnten Spektrometern jeweils bei 125,78 MHz, 100,15 MHz und 75,48 MHz aufgezeichnet. Die IR Spektren werden auf einem Nicolet 510P FT-IR Spektrometer aufgezeichnet, die Elektrosprayionisationsmassenspektren (ESI-MS) werden auf einem Micromass Platform LCZ Spektrometer aufgezeichnet. Hochauflösende Massenspektren werden auf einem Micromass QTOF Massenspektrometer aufgezeichnet.
Herstellung des NAG-NAM Disaccharidausgangsmaterials
Ein Syntheseverfahren zur Herstellung des NAG-NAM Disaccharidausgangsmaterials wird in Schema II dargestellt und im folgenden beispielhaft gezeigt.
Schema II I: Regioselektive Anbringung der Benzylschutzgruppen und Anbringung des Peptidlinkers
Ein Gemisch aus (L)-Alanin (15,0 g, 168 mmol), Phenylsulfonylethanol (37,6 g, 202 mmol) und TsOH × H₂O (35,2 g, 185 mmol) in Benzol (750 ml) wird mittels einer Dean-Stark Apparatur am Rückfluss erhitzt. Nach 16 h werden zusätzlicher Phenylsulfonylethanol (25 g, 135 mmol) und TsOH × H₂O (25 g, 134 mmol) gemeinsam mit Benzol (180 ml) zugegeben und das Reaktionsgemisch wird am Rückfluss über Nacht erhitzt. Eine Konzentration im Vakuum ergibt das Produkt, Verbindung i in quantitativer Ausbeute als weißen Feststoff.
Analytik (Verbindung i):

¹H NMR (DMSO-d₆, 300 MHz) δ N 8,25 (br s, Verunreinigungen TsOH), 7,94–7,88 (m, 2H), 7,81–7,74 (q, J = 6,2 Hz, 1H), 7,71–7,62 (m, 2H), 7,49 (d, J = 8,1 Hz, 1H), 7,12 (d, J = 8,1 Hz, 1H), 5,39 (br s, 2H), 4,52–4,44 (m, 1H), 4,41–4,33 (m, 1H), 3,90–3,82 (m, 1H), 3,78 (t, J = 5,5 Hz, 2H), 3,67 (t, J = 6,2 Hz, 1H), 3,44 (t, J = 6,6 Hz, 1H), 2,29 (s, 3H + Verunreinigungen TsOH), 1,20 (d, J = 7,3 Hz, 3H) ¹³C NMR (DMSO-d₆, 75 MHz) δ 169,5, 145,5, 139,3, 137,7, 134,1, 133,6, 129,5, 129,3, 128,0, 127,7, 127,6, 125,5, 58,9, 57,5, 54,9, 53,6, 47,7, 20,7, 15,2: MS (ESI) m/z 258,1 (100%, M-TsOH-H); IR KBr) V_max 3424 (br), 2927 (br), 1745 (m), 1309 (m), 1224 (m), 1195 (m), 1147 (s), 1124 (m), 1087 (m), 1007 (m) cm^–1. Analyse berechnet für C₁₈H₂₅NO₄S: C 50,10, H 5,84, N 3,25, S 14,86. Gefunden: C 48,49, H 5,31, N 2,56, S 14,72.

Zu einer Aufschlämmung aus Benzyl-N-acetyl-4,6-benzylidinmuraminsäure (20,0 g, 42,5 mmol) in CH₂Cl₂ (300 ml) bei 0°C werden N-Methylmorpholin (NMM) (4,67 ml, 42,5 mmol) und 2-Chlor-4,6-dimethoxy-1,3,5-triazin (8,94 g, 51,0 mmol) gegeben. Nach dem Rühren für 45 min bei 0°C wird CH₂Cl₂ (300 ml) gefolgt von NMM (0,34 ml, 83,0 mmol) und L-Alanin(phenylsulfonylethylestertosylatsalz) (15,4 g, 51,0 mmol) (Verbindung i) zu dem obigen Reaktionsgemisch gegeben. Die entstehende Lösung wird langsam auf Raumtemperatur erwärmt und für 3 Tage gerührt. Das Reaktionsgemisch wird dann filtriert. Das Filtrat wird zuerst mit 1 N HCl und dann Kochsalzlösung gewaschen und getrocknet (MgSO₄). Das Filtrat wird dann unter verringertem Druck konzentriert, mit Toluol (2 ×) verdampft und im Vakuum unter Bildung des Produkts, der Verbindung ii (23,5 g, 95%) als weißer Feststoff konzentriert.
Analytik (Verbindung ii):

¹H NMR (CDCl₃, 400 MHz) δ 7,44 (d, J = 3,0 Hz, 2H), 7,35 (m, 8H), 6,95 (d, J = 6Hz, 1H), 6,15 (d, J = 6,0 Hz, 1H), 5,85 (m, 1H), 5,47 (s, 1H), 5,21 (dd, J = 3,0, 12,0 Hz, 1H), 5,30 (dd, J = 3,0, 15,0 Hz, 1H), 4,90 (d, J = 3,0 Hz, 1H), 4,72 (d, J = 12,0 Hz, 1H), 4,60 (m, 2H), 4,42 (m, 2H), 4,30–4,20 (m, 2H), 4,15 (q, J = 3,0 Hz, 1H), 4,00 (q, J = 3,0 Hz, 1H), 3,82 (m, 1H), 3,75 (d, J = 9,0 Hz, 1H), 3,65 (m, 1H), 1,93 (s, 3H), 1,43 (d, J = 3,0, 9,0 Hz, 3H), 1,38 (d, J = 3,0, 9,0 Hz, 3H). ¹³C NMR (CDCl₃, 75 MHz) δ 173,2, 172,2, 170,6, 131,6, 129,0, 128,9, 128,4, 128,3, 125,9, 101,4, 97,5, 81,7, 78,3, 76,6, 75,6, 75,1, 70,1, 68,9, 65,8, 64,1, 63,2, 55,3, 53,2, 48,1, 23,0, 17,4, 17,8. MS (ESI) m/z 583,2 (86%, M + H), 581,3 (100%, M – H). IR V_max (CHCl₃) 3010 (m), 1740 (m), 1681 (s), 1616 (m), 1569 (s), 1523 (m), 1470 (m), 1377 (s), 1333 (m), 1119 (m), 1090 (m) cm^–1. Analyse berechnet für C₃₁H₃₈N₂O₉: C 63,90, H 6,57, N 4,81. Gefunden: C 63,78, H 6,55, N 4,89.

Triethylsilan (16,4 ml, 103 mmol) wird zu einer Lösung der Verbindung ii (12,0 g, 20,6 mmol) in CH₂Cl₂ (150 ml) bei 0°C gegeben, gefolgt von der tropfenweisen Zugabe von TFA (8,1 ml, 103 mmol). Das Gemisch kann für 5 h rühren, wonach weitere 3 Äquivalente an TFA (5,0 ml) tropfenweise zugegeben und über Nacht bei 0°C gerührt werden. Nachdem die Reaktion vollständig ist, wie dies durch TLC (EtOAc) gezeigt wird, wird das Reaktionsgemisch mit CH₂Cl₂ verdünnt und dann wird NaHCO₃ langsam zur Neutralisation des TFA zugegeben. Die wässrige Phase wird mit CH₂Cl₂ extrahiert. Die organische Phase wird mit Kochsalzlösung (2 ×) gewaschen, dann getrocknet (MgSO₄) und im Vakuum konzentriert.
Eine Reinigung durch Präp LC (Elution mit 70:30 EtOAc: Hexan bis EtOAc) gefolgt von der Umkristallisation aus CH₂Cl₂ und Isopropylether ergibt das Produkt, Verbindung iii, (7,4 g, 61%) als weißen Feststoff.
Analytik (Verbindung iii):

¹H NMR (CDCl₃, 300 MHz) δ 7,38–7,26 (m, 10H), 6,99 (d, J = 7,3 Hz, 1H), 6,16 (d, J = 8,8 Hz, 1H), 5,94–5,81 (m, 1H), 5,30 (dd, J = 1,1, 17,2 Hz, 1H), 5,22 (dd, J = 1,1, 10,6 Hz, 1H), 4,92 (d, J = 3,7 Hz, 2H), 4,68 (t, J = 11,7 Hz, 1H), 4,59 (d, J = 7,7 Hz, 4H), 4,49 (q, J = 6,2 Hz, 1H), 4,46 (dd, J = 2,2, 11,7 Hz, 2H), 4,21 (dq, J = 3,7, 9,9 Hz, 1H), 4,17 (q, J = 7,0 Hz, 1H), 3,83–3,75 (m, 1H), 3,71 (t, J = 5, 1 Hz, 1H), 3,68–3,65 (m, 1H), 3,54 (t, J = 10,2 Hz, 1H), 1,89 (s, 3H), 1,44 (d, J = 7,0 Hz, 3H), 1,40 (d, J = 7,0 Hz, 3H). ¹³C NMR (CDCl₃, 75 MHz) δ 173,0, 172,3, 170,3, 167,7, 137,8, 137,1, 131,7, 128,6, 128,5, 128,1, 127,8, 127,7, 118,5, 97,1, 80,5, 77,7, 73,7, 71,6, 70,5, 70,2, 69,8, 65,8, 55,1, 52,5, 48,0, 24,5, 23,3, 19,2, 17,7. MS(ESI) m/z 585,2 (100%, M + H), 583,2 (100%, M – H), IR V_max(CHCl₃) 3433 (m), 3010 (m), 1741 (m), 1677 (s), 1522 (m), 1454 (m), 1124 (m), 1058 (m) cm^–1. Analyse berechnet für C₃₁H₄₀N₂O₉: C 63,68, H 6,90, N 4,79, Gefunden: C 63,67, H 6,58, N 4,83.

II. Glycosidierung
Die Verbindung iv wird mittels des in M. Imoto, Bull. Chem. Soc. JPN., 60, 2205 (1987) beschriebenen Verfahrens, hergestellt.
Zu einer Lösung der Verbindung iii (4,59 g, 6,43 mmol) in CH₂Cl₂ (30 ml) werden 4Å Molekularsiebe (10 g) und Silbertriflat (5,12 g, 20,0 mmol) gegeben. Zu diesem Gemisch wird eine Lösung der frisch hergestellten Verbindung iv (10,8 g, 20,0 mmol) in CH₂Cl₂ (9,5 ml) in vier Portionen über eine Zeitraum von 1 h gegeben. Jedes Ausgangsmaterial wird vor der Verwendung getrocknet und die Reaktion wird unter kontrollierten wasserfreien Bedingungen hergestellt. Nach dem Rühren bei Raumtemperatur für 24 h wird das Reaktionsgemisch durch Celite filtriert und mit CH₂Cl₂ gewaschen. Die organische Phase wird mit NaHCO₃ und Kochsalzlösung gewaschen, getrocknet (Na₂SO₄) und im Vakuum konzentriert. Eine Reinigung durch Säulenchromatographie auf Silica (Blitzelutionssystem) mittels eines Lösemittelgradienten von 50% Hexan in EtOAc, 15% Hexan in EtOAc, EtOAc und 5% MeOH in EtOAc ergibt das Produkt, die Verbindung v, (5,73 g, 76%) als weißen Feststoff, gemeinsam mit nicht umgesetztem Ausgangsmaterial, Verbindung iii (630 mg, 14%).
Analytik (Verbindung v):

¹H NMR (CDCl₃, 300 MHz) δ 7,91 (d, J = 7,0 Hz, 2H), 7,66 (t, J = 7,3 Hz, 1H), 7,58–7,50 (m, 4H), 7,45 (t, J = 7,3 Hz, 2H), 7,33–7,26 (m, 6H), 6,83 (d, J = 7,3 Hz, 1H), 6,52 (d, J = 7,0 Hz, 1H), 5,09 (d, J = 2,9 Hz, 1H), 4,97 (t, J = 9,5 Hz, 1H), 4,87 (d, J = 12,1 Hz, 1H), 4,79–4,73 (m, 2H), 4,60 (dd, J = 7,3, 12,1 Hz, 2H), 4,53–4,29 (m, 5H), 4,26–4,04 (m, 7H), 4,00–3,88 (m, 2H), 3,70–3,50 (m, 4H), 3,42 (t, J = 10,6 Hz, 4H), 2,03 (s, 3H), 1,98 (s, 6H), 1,89 (s, 3H), 1,34 (d, J = 6,6 Hz, 3H), 1,24 (d, J = 7,3 Hz, 3H). ¹³C NMR (CDCl₃, 75 MHz) δ 173,4, 171,8, 170,6, 170,3, 169,4, 154,1, 137,3, 134,0, 129,4, 129,1, 128,5, 128,1, 100,0, 97,1, 96,9, 77,4, 77,0, 76,6, 75,7, 74,5, 73,8, 72,2, 71,2, 70,4, 70,3, 68,3, 67,2, 61,5, 58,1, 26,2, 54,9, 53,6, 47,7, 23,2, 20,6, 18,3, 17,5. MS (FAB) m/z 1176,3 (73%, M + H), (ESI) m/z 1174,5 (62%, M – H) IR (KBr) V_max 3385 (br), 3067 (w), 2939 (w), 1753 (s), 1669 (m), 1537 (m), 1233 (s), 1145 (m), 1045 (s) cm^–1, UV-vis (95% EtOH) λ_max 264 (1223,11) nm. Analyse berechnet für C₅₁H₆₄Cl₃N₃O₂₀S: C 52,02, H 5,48, N 3,57, S 2,72, Cl, 9,03. Gefunden: C 51,72, H 5,40, N 3,64, S 2,72, Cl 9,07.

III. Schutzgruppenaustausch
Zu einer Lösung der Verbindung v (1,9 g, 1,57 mmol) in Ac₂O:AcOH (2:1, 11 ml) wird eine Lösung aus ZnCl₂ (2,1 g, 15,7 mmol) in Ac₂O:AcOH (2:1, 5 ml) in einer Portion gegeben. Nachdem die Reaktion vollständig ist, (24 h), wird dies durch TLC (EtOAc) nachgewiesen ist, wird Troc durch die Zugabe von Zn Staub (4,1 g, 62,8 mmol) und einem Gemisch aus THF: Ac₂O:AcOH (3:2:1), 25 ml) zu dem obigen Reaktionsgemisch entfernt und gerührt, bis kein Ausgangsmaterial durch TLC (EtOAc) nachweisbar ist. Das Reaktionsgemisch wird durch Celite filtriert, mit EtOAc gewaschen und dann unter verringertem Druck konzentriert. Der Rückstand wird wiederholt mit Toluol eingedampft, um jedes verbleibende Ac₂O und AcOH zu entfernen und wird dann mit EtOAc verdünnt. Die organische Phase wird mit NaHCO₃ (2 ×), H₂O (2 ×) und Kochsalzlösung gewaschen. Die organische Phase wird dann getrocknet (Na₂SO₄) und im Vakuum konzentriert. Eine Reinigung mittels Säulenchromatographie auf Silica (Blitzelutionssystem) unter Elution mit 2% MeOH in EtOAc ergibt das Produkt, Verbindung vi, (1,0 g, 67%) als weißen Feststoff.
Analytik (Verbindung vi):

¹H NMR (CDCl₃, 300 MHz) δ 7,89 (d, J = 7,0 Hz, 2H), 7,66 (t, J = 7,3 Hz, 1H), 7,56 (t, J = 7,7 Hz, 2H), 7,34–7,23 (m, 6H), 7,16 (d, J = 7,7 Hz, 1H), 6,88 (d, J = 7,0 Hz, 1H), 6,12 (d, J = 9,5 Hz, 1H), 5,12–5,07 (m, 3H), 4,56 (dd, J = 12,1, 40,0 Hz, 2H), 4,45 (d, J = 9,0 Hz, 1H), 4,39 (d, J = 8,4 Hz, 1H), 4,35–4,23 (m, 4H), 4,17 (d, J = 12,0 Hz, 2H), 4,09–3,95 (m, 3H), 3,78 (d, J = 5,5 Hz, 2H), 3,60–3,48 (m, 3H), 3,41–3,30 (m, 2H), 2,12 (s, 3H), 2,01 (s, 3H), 2,00 (s, 3H), 1,99 (s, 3H), 1,94 (s, 3H), 1,92 (s, 3H), 1,38 (d, J = 6,6 Hz, 3H), 1,28 (d, J = 7,3 Hz, 3H). ¹³C NMR (CDCl₃, 75 MHz) δ 173,8, 171,9, 171,2, 170,9, 170,8, 170,6, 169,3, 139,2, 137,3, 134,1, 129,4, 128,9, 128,5, 128,1, 128,0, 127,8, 100,2, 96,9, 77,1, 76,6, 75,9, 75,6, 72,5, 71,8, 70,2, 69,5, 68,2, 62,3, 61,6, 58,0, 54,9, 54,6, 53,6, 47,8, 23,2, 23,1, 20,9, 20,6, 18,4, 17,3. MS (ESI) m/z 994,7 (100%, M – H), IR (KBr) V_max 3384 (br), 3301 (br), 3068 (w), 2939 (w), 1748 (s), 1670 (s), 1540 (m), 1372 (m), 1236 (s), 1144 (m), 1041 (s) cm^–1. Analyse berechnet für C₄₅H₆₁N₃O₂₀S: C 54,26, H 6,17, N 4,22, S 3,22. Gefunden: C 53,96, H 5,78, N 4,17, S 3,09.

Herstellung des Tetrapeptidausgangsmaterials
I. Herstellung von Cbz-D-iBln (Verbindung ix)
Eine Lösung aus Z-D-Glu(O-t-Bu)-OH (5,00 g, 14,82 mmol der Verbindung vii), 1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimidhydrochlorid (2,85 g, 14,87 mmol) und N-Hydroxysuccinimid (1,71 g, 14,86 mmol) in 1,4-Dioxan (60 ml) und N,N-Dimethylformamid (10 ml) wird für 6 h unter N₂ gerührt. Ammoniumhydroxid (0,7 ml, 17,78 mmol) wird zugegeben, dann wird die Lösung für 16 h gerührt und im Vakuum konzentriert. Das erhaltene Öl wird zwischen Ethylacetat (200 ml) und Kochsalzlösung (200 ml) aufgeteilt. Die organische Phase wird über Natriumsulfat getrocknet, filtriert und im Vakuum zu einem Feststoff konzentriert. Der Feststoff wird über Bitzsilicagel (Ethylacetat:Hexan – 1:1) unter Bildung von Cbz-D-iGln(O^tBu) (3,2 g, 64% Ausbeute der Verbindung iii) als weißer Feststoff chromatographiert.
Analytik (Verbindung viii)

Smp 134–135°C IR(CHCl₃) 2985, 1717, 1695, 1155, cm^–1. ¹H NMR (DMSO-d₆, 300 MHz) δ 7,35 (s, 5H), 7,30 (brs, 1H), 5,02 (s, 2H), 3,94 (m, 1H), 2,22 (t, J = 7,7 Hz, 2H), 1,86 (m, 1H), 1,69 (m, 1H), 1,38 (s, 9H). MS (ESI) m/z 337 (80%, M + H), Analyse berechnet für C₁₇H₂₄N₂O₅: C 60,70, H 7,19, N 8,33., Gefunden C 60,41, H 7,15, N 8,16.

Trifluoressigsäure (25 ml) wird zu einer Lösung aus Cbz-D-iGln(O^tBu) (3,20 g, 9,52 mmol der Verbindung viii) in Methylenchlorid (25 ml) gegeben und das Gemisch wird für 3 h unter N₂ gerührt. Die Lösung wird unter Bildung eines weißen Feststoffs eingedampft, mit Hilfe des Ethylethers filtriert und im Hochvakuum unter Bildung des homogenen Cbz-D-iGln (2,2 g, 82% Ausbeute der Verbindung ix) getrocknet.
Analytik (Verbindung ix):

Smp 174–176°C. IR (KBr) 3314, 1699, 1658, 1254 cm^–1, ¹H NMR(DMSO-d₆, 300 MHz) δ 7,35 (s, 5H), 7,31 (s, 1H), 7,01 (s, 1H), 5,02 (s, 2H), 3,93 (m, 1H), 2,25 (t, J = 8,0 Hz, 2H), 1,92 (m, 1H), 1,73 (m, 1H). MS (ESI) m/z 281 (100%, M + H), Analyse berechnet für C₁₃H₁₆N₂O₅ × 0,25 H₂O: C 54,83, H 5,79, N 9,84. Gefunden C 55,12, H 5,53, N 9,88. II. Herstellung von Nα-Boc-Nγ-(TFA)-L-Lys-D-Ala-D-Ala-OMe (Verbindung xvi)

Cbz-D-Ala-D-Ala (1,20 g, 3,9 mM der Verbindung x, erhältlich von Advanced Chem Tech., Louisville, KY) wird in 10 ml Methanol gelöst und zu einer Suspension aus 500 mg Pd(OH)₂ in 15 ml Methanol gegeben, das 0,3 ml THF (3,9 mM) enthält. Das Gemisch wird unter einer Atmosphäre aus Wasserstoff (Ballondruck) für 2 h kräftig gerührt, durch Talkum filtriert, im Vakuum konzentriert und die entstehende Verbindung xi (das TFA Salz von D-Ala-D-Ala) wird unter Vakuum gelagert. Getrennt davon werden Nα-Boc-Nγ-(TFA)-L-Lysin (1,40 g, 4 mM der Verbindung xii, erhältlich von Bachem, Torrance, CA) und 830 mg DCC (4,0 mM) in 15 ml trockenem THF gelöst und bei 0°C für 3 h gerührt. N-Hydroxysuccinimid (460 mg, 4,0 mM) wird dann zugegeben, wonach der Kolben sich auf Raumtemperatur erwärmen kann und es wird für eine weitere Stunde unter Bildung der Verbindung xiii gerührt, dem NHS-aktivierten Ester der Verbindung xii. Das Reaktionsgemisch wird dann direkt in einen Kolben filtriert, der die Verbindung xi enthält, gefolgt von der Zugabe von 1,4 ml Diisopropylethylamin (0,8 mM). Nach 30 Minuten wird das Reaktionsgemisch im Vakuum konzentriert, in Ethylacetat gelöst, mit gesättigtem wässrigem NaHCO₃ und Wasser gewaschen, mit MgSO₄ getrocknet und dann im Vakuum zu einem weißen Schaum (1,4 g, 2,8 mM, 72% Ausbeute der Verbindung xiv) konzentriert. Das isolierte Material wird im nächsten Schritt ohne weitere Reinigung verwendet.
Analytik (Verbindung xiv):

¹H (CDCl₃): δ 1,37 (d, 3H J = 7,5 Hz), 1,39 (d, 3H J = 7,2 Hz), 1,4 (s, 9H), 1,75 (m, 6H), 3,35 (t, 2H J = 6,3 Hz), 3,75 (s, 3H), 4,15 (m, 1H), 4,48 (m, 2H), 5,1 (d, 1H), 6,67 (d, 1H), 6,78 (d, 1H). MS(FD⁺): 499, EA berechnet für C₂₀H₃₃F₃N₄O₇: C 48,2, H 6,7, N 11,2 Gefunden: C 47,9, H 6,5, N 11,1.

III. Herstellung der Verbindung xviii
Trifluoressigsäure (10 ml) wird zu einer Lösung der Verbindung xiv (2,5 g, 5,0 mmol) in Methylenchlorid (10 ml) gegeben und das Gemisch wird für 2,5 h gerührt. Die Lösung wird im Vakuum konzentriert und unter Hochvakuum unter Bildung der Verbindung xv, dem Trifluoracetatsalz der Verbindung xiv, als Öl getrocknet. Getrennt davon werden 1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimidhydrochlorid (1,88 g, 9,81 mmol) und N-Hydroxysuccinimid (1,13 g, 9,81 mmol) zu einer Lösung aus Cbz-D-iGln (2,20 g, 7,85 mmol der Verbindung xvi) in N,N-Dimethylformamid (25 ml) gegeben. Das Gemisch wird für 3 h gerührt, mit Wasser auf 100 ml verdünnt und mit Ethylacetat (100 ml) extrahiert. Die Ethylacetatlösung wird mit gesättigtem NaHCO₃ (100 ml) gefolgt von Kochsalzlösung (100 ml) gewaschen und über Natriumsulfat getrocknet. Die organische Phase wird unter Bildung von Cbz-D-iGln (NHS) (1,96 g, 5,19 mmol der Verbindung xvii), dem NHS-aktivierten Ester der Verbindung xvi als weißer Feststoff eingedampft. Der so erhaltene Feststoff wird zu einer Lösung aus der oben hergestellten Verbindung xv (2,60 g, 5,07 mmol) in wasserfreiem DMF (25 ml) gegeben, wonach N,N-Diisopropylethylamin (2,00 ml, 11,40 mmol) zugegeben wird. Das Gemisch wird für 72 h unter N₂ gerührt. Wasser (200 ml) wird zugegeben und das Gemisch wird für 2 h gerührt. Der entstehende Feststoff wird filtriert, mit Wasser (50 ml) gewaschen und im Hochvakuum unter Bildung der Verbindung xviii (2,20 g, 66% Ausbeute) getrocknet.
Analytik (Verbindung xviii):

Smp 237–240°C. IR (KBr) 3302, 1699, 1669, 1630, 1184 cm^–1. ¹H NMR(DMSO-d₆, 300 MHz) δ 9,36 (t, J = 5,0 Hz, 1H), 8,20 (d, J = 7,0 Hz, 1H), 8,13 (d, J = 7,7 Hz, 1H), 7,98 (d, J = 7,3 Hz, 1H), 7,35 (m, 5H), 7,29 (brs, 1H), 7,00 (brs, 1H), 5,01 (s, 2H), 4,25 (m, 3H), 3,90 (m, 1H), 3,60 (s, 3H), 3,15 (q, J = 6,0, 12,0 Hz, 2H), 2,18 (m, 2H), 1,85 (m, 1H), 1,70 (m, 1H), 1,55 (m, 1H), 1,50 (m, 3H), 1,28 (d, J = 7,3 Hz, 3H), 1,27 (m, 2H), 1,18 (d, J = 7,3 Hz, 3H). MS (ESI) m/z 661 (100%, M + H). Analyse berechnet für C₂₈H₃₉N₆O₉F₃: C 50,91, H 5,95, N 12,72. Gefunden C 51,13, H 6,21, N 12,47.

IV. Herstellung der Verbindung xix
Ein Gemisch der Verbindung xviii (2,15 g, 3,25 mmol), p-Toluolsulfonsäure (662 mg, 3,25 mmol) und 5% Pd/C (500 mg) in Methylenchlorid:Ethanol – 1:1 (100 ml) wird bei Raumtemperatur für 1,5 h bei 60 psi hydriert. Der Katalysator wird filtriert und die Lösung wird zu einem Schaum eingedampft. Der Schaum wird im Hochvakuum unter Bildung der homogenen Verbindung xix (2,20 g, 97% Ausbeute) getrocknet.
Analytik (Verbindung xix):

IR(KBr) 3296, 1702, 1632, 1177 cm^–1. ¹H NMR (DMSO-d₆, 300 MHz), δ 9,37 (t, J = 5,0 Hz, 1H), 8,23 (d, J = 6,6 Hz, 1H), 8,14 (m, 2H), 8,04 (brs, 3H), 7,79 (s, 1H), 7,60 (s, 1H), 7,46 (d, J 8,0 Hz, 2H), 7,10 (d, J = 8,0 Hz, 2H), 4,25 (m, 3H), 3,72 (t, J = 5,0 Hz, 1H), 3,61 (s, 3H), 3,14 (q, J = 6,0, 12,0 Hz, 2H), 2,28 (s, 3H), 2,25 (m, 2H), 1,94 (q, J = 6,0, 12,0 Hz, 2H), 1,55 (m, 4H), 1,28 (d, J = 7,3 Hz, 3H), 1,24 (m, 2H), 1,18 (d, J = 7,09 Hz, 3H). MS (ESI) m/z 527 (100%, M + H), Analyse berechnet für C₂₇H₄₁N₆O₁₀F₃S × 0,5 H₂O: C 45,83, H 5,93, N 11,87. Gefunden C 45,56, H 5,73, N 11,60.

Herstellung des Undecaprenylphosphatdiammoniumsalzausgangsmaterial (Verbindung xx)
Die Verbindung xx, das Undecaprenol-(C₅₅)-monophosphat-diammoniumsalz wird von der Polnischen Akademie der Wissenschaften, Warschau, Polen, erhalten.
Herstellung des Lipids II
Ein synthetisches Verfahren zur Herstellung des Lipids II und der Schlüsselzwischenprodukte aus dem oben diskutierten Ausgangsmaterial ist in Schema III dargestellt und unten beispielhaft angegeben.
Schema III I. Herstellung des Lactolzwischenprodukts (Verbindung xxi)
Die Verbindung vi (1,0 g, 1,0 mmol) wird in 0,23 M HCl in Essigsäure (5 ml) gelöst und zu einer Suspension aus 10% Pd/C (0,50 g) in 0,23 M HCl in Essigsäure (5 ml) gegeben. Das Reaktionsgemisch wird unter einer Wasserstoffatmosphäre (Ballon, 15 psi) bei 25°C für 1,5 h gerührt. Eine Analyse des Reaktionsgemisches durch Dünnschichtchromatographie (5% MeOH/CHCl₃) zeigt den vollständigen Verbrauch des Ausgangsmaterials. Das Reaktionsgemisch wird mit EtOAc verdünnt und der Katalysator wird durch Filtration durch ein Kissen aus Celite gesammelt. Das Filtrat wird vorsichtig mit wässrigem NaHCO₃ (3 ×) und Wasser (2 ×) gewaschen. Die wässrigen Extrakte werden vereinigt und mit EtOAc extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen werden mit Kochsalzlösung gewaschen, mit Na₂SO₄ getrocknet und im Vakuum unter Bildung des Lactolprodukts als weißer Feststoff (808 mg 89% Ausbeute der Verbindung xxi) konzentriert.
Analytik (Verbindung xxi):

¹H NMR(DMSO-d₆) δ 1,02 (d, J = 6,84, 3H), 1,80 (d, J = 6,80, 3H), 1,70 (s, 3H), 1,71 (s, 3H), 1,84 (s, 3H), 1,86 (s, 3H), 1,89 (s, 3H), 1,98 (s, 3H), 3,30 (m, 2H), 3,45 (m, 2H), 3,6 (m, 4H), 3,9 (m, 4H), 4,2–4,4 (m, 5H), 4,59 (d, J = 8,31, 1H), 4,81 (t, J = 9,77, 1H), 5,01 (d, J = 2,93, 1H), 5,12 (t, J = 9,77, 1H), 6,68 (d, J = 4,4, 1H), 7,60 (m, 2H), 7,70 (m, 1H), 7,83 (d, J = 8,31, 2H), 8,02 (d, J = 7,82, 2H), 8,23 (d, J = 5,86, 1H). ¹³C NMR (DMSO-d₆, 300 MHz) δ 16,71 (q), 18,56 (q), 20,24 (q), 20,72 (q), 22,57 (q), 24,30 (t), 30,36 (q), 47,12 (d), 53,67 (t), 54,09 (d), 58,09 (t), 61,61 (t), 62,45 (t), 68,01 (d), 68,33 (d), 70,31 (d), 72,37 (d), 74,86 (d), 75,76 (d), 76,73 (d), 89,73 (d), 89,54 (d), 124,84 (d), 127,68 (d), 129,40 (d), 133,98 (d), 139,30 (s), 169,25 (s), 169,36 (s), 169,42 (s), 169,54 (s), 169,89 (s), 169,98 (s), 171,52 (s), 173,90 (s), HRMS berechnet für C₃₈H₅₄N₃O₂₀S 904,3021, Gefunden 904,3011.

II. Herstellung des Monophosphattriesterzwischenprodukts (Verbindung xxii):
Die Verbindung xxi (1,4 g, 1,55 mmol) in wasserfreiem Dichlormethan (10 ml) wird schnell mittels einer Spritze zu einer kräftig gerührten Suspension aus Tetrazol (517 mg, 7,31 mmol) und Dibenzyl-N,N'-diethylphosphoramidit (1,4 ml, 4,70 mmol) in wasserfreiem Dichlormethan (10 ml) unter Argon bei 25°C gegeben. Das Reaktionsgemisch wird innerhalb von wenigen Minuten homogen. Nach 2 h zeigt eine Dünnschichtchromatographie (10% MeOH/CHCl₃) eine vollständige Reaktion. Das Gemisch wird mit Dichlormethan (10 ml) verdünnt und dann mit gesättigtem NaHCO₃ (5 ml), Wasser (5 ml) und Kochsalzlösung (5 ml) gewaschen. Die organische Lösung wird über Na₂SO₄ getrocknet und im Vakuum zu einem farblosen Öl konzentriert, das während der Behandlung mit 1:1 Diethylether/Hexan kristallisiert. Die Feststoffe werden filtriert, in THF (30 ml) gelöst und auf –78°C gekühlt. Wasserstoffperoxid (30%, 2,8 ml) wird tropfenweise mittels einer Spritze zu der kräftig gerührten Lösung gegeben. Nachdem die Zugabe vollständig ist, wird das Eisbad entfernt und das Gemisch kann sich über 2 h auf Raumtemperatur erwärmen. Eine TLC (4:1 EtOAc/Aceton) zeigt, daß die Reaktion vollständig ist. Das Gemisch wird mit eiskaltem gesättigem Na₂S₂O₃ (5 ml) verdünnt, gefolgt von Ethylacetat (10 ml) und es wird für 5 Minuten gerührt. Die organische Phase wird über MgSO₄ getrocknet und im Vakuum zu einem farblosen Öl konzentriert, das einen weißen Feststoff während der Behandlung mit 1:1 Et₂O/Hexan ergibt. Der weiße Feststoff wird unter Hochvakuum bei 40°C unter Bildung des Monophosphattriesterprodukts (1,4 g, 90% Ausbeute der Verbindung xxii) getrocknet.
Analytik (Verbindung xxii):

¹H NMR(DMSO-d₆, 500 MHz) δ 1,10 (d, 3H), 1,20 (d, 3H), 1,69 (s, 3H), 1,75 (s, 3H), 1,92 (s, 3H), 1,96 (s, 9H), 3,43 (m, 1H), 3,57 (m, 2H), 3,61 (m, 1H), 3,83 (m, 4H), 4,05 (m, 4H), 4,35 (m, 3H), 4,60 (m, 1H), 4,73 (m, 1H), 4,91 (t, 1H), 5,00 (m, 4H), 5,24 (t, 1H), 5,81 (m, 1H), 7,35 (m, 10H), 7,64 (m, 2H), 7,74 (m, 1H), 7,86 (d, 2H), 8,06 (d, 1H), 8,39 (d, 1H), 8,66 (d, 1H). Analyse berechnet für: C₅₂H₆₆N₃O₂₃PS × 2 H₂O: C 52,04, H 5,88, N 3,50. Gefunden C 51,84, H 5,73, N 3,34. HRMS berechnet für C₅₂H₆₆N₃O₂₃PS 1164,3624. Gefunden 1164,3601.

III. Herstellung des Disaccharylpentapeptidzwischenprodukts (Verbindung xxiii)
DBU (102 μl, 0,68 mmol) wird tropfenweise zu einer Lösung des Monophosphattriesters (793 mg, 0,68 mmol der Verbindung xxii) in Dichlormethan (10 ml) unter einer Argonatmosphäre gegeben. Nach 15 Minuten zeigt eine Dünnschichtchromatographieanalyse (15% MeOH/CHCl₃) den vollständigen Verbrauch des Ausgangsmaterials. Die Reaktionslösung wird mit Dichlormethan (20 ml) verdünnt und mit 1 N HCl (30 ml) gewaschen. Die organische Phase wird konzentriert, dann wird der entstehende Schaum mit Et₂O behandelt und kann bei Raumtemperatur für etwa 2 h stehen. Nach der Filtration wird das rohe Säureprodukt bei 40°C für 2 h getrocknet (465 mg, 68% Ausbeute).
Die Säure (465 mg, 0,47 mmol), N-Hydroxysuccinimid (81 mg, 0,7 mmol) und EDCI (134 mg, 0,70 mmol) werden in wasserfreiem DMF (4 ml) gelöst und können für 18 h rühren. Eine Analyse des Reaktionsgemisches durch Dünnschichtchromatographie (15% MeOH/CHCl₃) zeigt den kompletten Verbrauch des Ausgangsmaterials. Das Reaktionsgemisch wird im Vakuum konzentriert, in Ethylacetat (10 ml) rückgelöst und dann mit Wasseer (10 ml) und Kochsalzlösung (10 ml) gewaschen. Die organische Lösung wird mit MgSO₄ getrocknet und zu einem Schaum konzentriert, der nach einer Behandlung mit Diethylether (5 ml) den NHS-Ester (398 mg, 78% Ausbeute) ergibt.
Der NHS-Ester (398 mg, 0,34 mmol), Tetrapeptid (254 mg, 0,36 mmol der Verbindung xix) und iPr₂NEt (192 μl, 1,1 mmol) werden in DMF (3 ml) gelöst und bei RT unter Argon für 18 h gerührt. Das Reaktionsgemisch wird dann konzentriert, in Isopropanol/Chloroform (1:9, 10 ml) gelöst, mit Kochsalzlösung (3 × 5 ml) gewaschen, mit MgSO₄ getrocknet und im Vakuum konzentriert. Das entstehende Öl wird mit Diethylether unter Bildung der Disaccharylpentapeptidverbindung xxiii (474 mg, 46% Gesamtausbeute der Verbindung xxii) als weißer Feststoff behandelt.
Analytik Verbindung xxiii:

¹H NMR (DMSO-d₆, 500 MHz) δ 1,15–1,23 (m, 12H), 1,40 (m, 3H), 1,66 (s, 3H), 1,69 (s, 3H), 1,86 (s, 3H), 1,89 (s, 3H), 1,90 (s, 3H), 1,91 (s, 3H), 2,1 (m, 2H), 3,1 (m, 4H), 3,53 (s, 3H), 3,71 (m, 4H), 3,95 (m, 3H), 4,1–4,25 (m, 10H), 4,34 (t, J = 7,33, 1H), 4,48 (d, J = 6,84, 1H), 4,67 (d, J = 8,61, 1H), 4,84 (t, J = 9,77, 1H), 4,98 (m, 4H), 5,18 (t, J = 9,77, 1H), 5,57 (m, 1H), 6,97 (s, 1H), 7,25 (s, 1H), 7,30 (m, 10H), 7,97 (m, 2H), 8,13 (m, 3H), 8,15 (d, J = 8,30, 1H), 8,56 (d, J = 5,37, 1H), 9,32 (m, 1H). Analyse berechnet für C₆₄H₈₉F₃N₉O₂₇P × 0,5 H₂O: C 50,70, H 5,99, N 8,33. Gefunden: C 50,99, H 6,38, N 8,33, MS (ES^–) m/z 1503 (25%), 751,3 ([M – 2]^2–, 100%).

Die Verbindung xxiii kann ebenfalls durch ein alternatives Verfahren hergestellt werden. Zu einer Lösung des freien Amins der Tetrapeptidverbindung xx (0,068 g, 0,129 mmol) in CHCl₃ (1,3 ml) werden nacheinander H₂O (1,3 ml), die Säure des Disaccharids (0,128 g, 0,129 mmol) und 1-Hydroxybenzotriazol (HOBt) (0,017 g, 0,129 mmol) gegeben. Das Gemisch wird dann auf 0°C gekühlt und N-Ethyl-N'-[3-(dimethylamino)propyl]carbodiimid (EDCI) (0,027 g, 0,142 mmol) wird zugegeben. Die Reaktion wird für 2 Tage bei 4°C kräftig gerührt. 1 N HCl wird zugegeben und die Phasen werden aufgeteilt. Die organische Phase wird mit 1 N HCl, H₂O, gesättigtem NaHCO₃, H₂O und Kochsalzlösung gewaschen. Die vereinigten wässrigen Phasen werden mit CHCl₃ (3 ×) extrahiert. Die vereinigten organischen Phase wird mit Na₂SO₄ getrocknet und im Vakuum zu einem Öl konzentriert. Der Rückstand wird durch Normalphasenchromatographie über Silica unter Bildung der Verbindung xxiii (57%) als farbloser Feststoff gereinigt. Dieses alternative Verfahren wird in G–J Ho, K. M. Emerson, D. J. Mathre, R. F. Shuman, D. J. Grabowski "Carbodiimid-Mediated Amide Formation in a Two-Phase System. A High-Yield and Low-Racemization Procedure for Peptide Synthesis," J. Org. Chem. 1995, 60, 3569–3570, beschrieben. IV. Herstellung des geschützten Lipid II Zwischenprodukts (Verbindung xxiv)
Das Disaccharylpentapeptid (53 mg, 0,035 mmol der Verbindung xxiii) wird zu einer Suspension aus 10% Pd/C (100 mg) in Methanol (6,0 ml) gegeben und in einem Eisbad zur Unterstützung des Entgasens der Reaktionslösung gekühlt. Die Lösung wird dann auf Raumtemperatur erwärmt und bei atmosphärischem Druck für 1,5 h hydriert. Der Katalysator wird durch Filtration gesammelt und die entstehende Lösung wird mit Pyridin (1,0 ml) behandelt. Das entstehende Gemisch wird im Vakuum zu einem nicht ganz weißen Feststoff konzentriert, der gesammelt und unter Hochvakuum für 16 h getrocknet wird. (ESI-MS m/e 1322, [M – H]).
Der nicht ganz weiße Feststoff wird zu einem Gemisch aus 1,1'-Carbonyldiimidazol (26,0 mg, 0,16 mmol) in wasserfreiem DMF (2,5 ml) und wasserfreiem THF (2,0 ml) gegeben. Nach dem Rühren für 2 Stunden wird mittels Massenspektroskopie (ESI-MS m/e 1372,4, [M – H]) bestimmt, ob die Reaktion vollständig ist. Methanol (0,6 ml) wird zugegeben und die entstehende Lösung wird für 15 min gerührt. Das Gemisch wird dann im Vakuum konzentriert und aus Pyridin (1,0 ml) eingedampft. Das erhaltene feste Material wird unter Hochvakuum für 2 h getrocknet.
Der Rückstand wird in DMF (0,4 ml) und trockenem THF (1,6 ml) gelöst, wozu eine Lösung aus Undecaprenylphosphatdiammoniumsalz (21,4 mg, 0,024 mmol der Verbindung xx) in THF (0,5 ml) und DMF (0,1 ml) gegeben wird. ¹H-Tetrazol (1,8 mg, 0,03 mmol) wird zugegeben und das Gemisch wird für 4 Tage unter einer Argonatmosphäre gerührt. Danach wird die Lösung im Vakuum unter Bildung der Verbindung xxiv konzentriert. V. Herstellung des Lipids II:
Der Rückstand aus dem vorherigen Schritt (Verbindung xxiv) wird in 1,4-Dioxan:Wasser (1:1, 2 ml) gelöst. Es wird 1 N Natriumhydroxid (0,3 ml) zugegeben und das entstehende Gemisch wird für 2 h gerührt. Die Reaktionslösung wird durch eine wässrige Filterscheibe filtriert und durch Umkehrphasen HPLC auf eine Dynamax C8 100Å 5 μ, 21,4 mm × 25 cm Säule mittels einer Gradientenelution aus 15:85 A:B bis 0:100 A:B über 30 min bei einer Flußrate von 21,6 ml/min gereinigt (worin A = 0,05 M wässriges Ammoniumbicarbonat und B = Methanol). Die Retentionszeit für das Produkt beträgt 18 min (Detektion bei 214 nm). Eine Lyophilisierung der reinen Fraktionen ergibt 13,8 mg des Lipids 11 (24% Gesamtausbeute aus der Verbindung xxiii). Ultrahochauflösungs MS berechnet für C₉₄H₁₅₇N₉O₂₅P₂, 1874,07659. Gefunden 1874,08023.
Bestätigung der Lipid II Struktur
I. Biochemischer Test
Die Strukturidentität des Lipids II wird mittels eines biochemischen Tests validiert, der eine modifizierte Version des Lipids II verwendet, das einen Dansylmarker auf der ε-Aminogruppe des L-Lysinrest aufweist. Das Substrat wird durch direkte Dansylierung des Lipids II analog zu den in W. A. Weppner und F. C. Neuhaus, J. Biol. Chem., 252(7), 2296 (1977) beschriebenen Bedingungen hergestellt.
Weppner und Neuhaus haben kürzlich die in situ Generation des Lipids II mittels durch Einbau eines Park-Nukleotids gezeigt, das einen Dansylmarker auf dem L-Lysinrests in die Glycanstränge mittels Inkubation mit einer Menbranfraktion einführt, die von Gaffkya homari hergestellt wird. Bei diesen Experimenten werden die Glycanstränge leicht durch absteigende Papierchromatographie gefolgt von Aussetzen des Chromatogramms gegenüber ultraviolettem Licht detektiert. Ein ähnliches Experiment, das eine Membranpartikelfraktion aus E. Coli mit einer Dansylmarkerversion des Lipids I verwendet (der unmittelbare Vorläufer zu Lipid II dem die NAG Carbohydratuntereinheit fehlt) wird ebenfalls berichtet. Siehe G. Auger et al. Lett. Pept. Sci., 4, 371 (1997).
Auf analoge Weise resultieren die Inkubation unseres Dansyl-markierten Lipid II-Derivats mit einer monofunktionellen Transglycosylase (MtgA) aus Staphylococcus aureus (beschrieben in 5 922 540 A) und nachfolgende Analyse des Reaktionsgemisches durch Dünnschichtchromatographie unter den von Weppner und Neuhaus angegebenen Bedingungen in der Visualisierung der Glycanstränge während des Aussetzens gegenüber ultraviolettem Licht in exakter Analogie zu dem vorher zitiertem. (Siehe Figur).
Obwohl ein Dansylmarker in den oben beschriebenen Experimenten verwendet wird, können ebenfalls andere Marker verwendet werden, die dem Fachmann gut bekannt sind. Wie hierin verwendet meint "Marker" ein Element oder eine Verbindung, die Atome enthält, die aus ihren normalen Entsprechungen gemäß physikalischer Bedeutungen ausgewählt werden können (beispielsweise radioaktive Tests, Massenspektrographie oder Fluoreszenz) und so zum Verfolgen (Traktion) des Metabolismus der normalen Substanzen verwendet werden können.
II. Protokoll der biochemischen Transglycosylierung
In der Figur werden die folgenden Protokolle für die entsprechenden Spuren verwendet, die auf dem Dünnschichtchromatographiestreifen (TLC) auftreten. Spur 1:5 ml Substratstammlösung (300 mM Dansyllipid II in 75 ml PiPES bei pH 6,1, 37,5 mM MgCl₂) Spur 2 und 3: Spur 1 plus 5 ml MtgA Enzymlösung (10 mM Stammlösung in 25 mM HEPES bei pH 7,5, 150 mM NaCl, 0,5% CHAPS), Inkubation für 20 min bei 25°C, Stop mit 30 ml Methanol bei 0°C. Spur 4:1 ml Lysozymstammlösung (1 mg/ml Hühnereiweißlysozym, HEWL)
Die Lokalisation der Reaktionsprodukte wird durch Aussetzen der TLC gegenüber UV Licht (366 nm) visualisiert. (Siehe Figur). III: Herstellung des dansylierten Lipids II:
Lipid II mit Dansylmarker
Eine Lösung des Dansylchlorids (13,8 mg, 5,1 μmol) in Aceton (250 μl) wird in einer Portion zu einer Lösung aus Lipid 11 (2,4 mg, 1,3 μmol) in 0,25 M wässrigem NaHCO₃ (250 μl) gegeben. Das Gemisch, das sofort trüb wird, wird bei Raumtemperatur für 90 Minuten gerührt. Eine Elektrospray MS und HPLC zeigen die vollständige Umwandlung zum Produkt. Das Gemisch wird im Vakuum konzentriert, in 1:1 Wasser/Acetonitril rückgelöst und durch präparative Chromatographie auf einer Dynamax C8 Säule (100 Å, 5 μ, 21,4 mm × 25 cm) mittels eines Gradienten aus 85:15 bis 100:0 Methanol/50 mM Ammoniumbicarbonat über 20 Minuten (Detektion bei 214 nm) gereinigt. Die geeigneten Fraktionen werden vereinigt und unter Bildung des dansylierten Lipids 11 (1,7 mg, 63% Ausbeute) lyophilisiert. Ultrahochauflösungs MS berechnet für C₁₀₆H₁₆₈N₁₀O₂₇P₂S 2107,12764, gefunden: 2107,12725.

Claims

Verfahren zur Herstellung eines Lipidsubstrats der Formel 1
umfassend eine (1) Bereitstellung eines geschützten Disaccharids der Formel 14
(2) Einführung eines anomeren Phosphats unter Bildung einer Verbindung der Formel 12
(3) Einführung einer Peptidbindung unter Bildung einer Verbindung der Formel 7
(4) Entfernung der Gruppen Pg⁶ aus der Verbindung der Formel 7 und Behandlung der erhaltenen Verbindung mit einer Base der Formel B unter Bildung eines Phosphatsalzes der Formel 6
(5) Behandlung der Verbindung der Formel 6 mit einem aktivierten Phosphatester der Formel 25
unter Bildung einer Verbindung der Formel 2
(6) Entfernung der Gruppen Pg⁰ und Pg³ und Abspaltung der Gruppe P unter Bildung eines Lipidsubstrats, worin Ac für -C(O)CH₃ steht, Pg⁰ für eine Acylhydroxyschutzgruppe steht, Pg³ für eine Acylhydroxyschutzgruppe steht, Pg⁴ für eine Carboxyschutzgruppe steht, Pg⁵ für eine Hydroxyschutzgruppe steht, Pg⁶ für eine Phosphatschutzgruppe steht, R² für Wasserstoff, (C₁-C₅)-Alkyl oder (C₁-C₃)-Alkylphenyl steht, X für einen Lipidträger steht, wobei es sich bei diesem Lipidträger um gesättigte und ungesättigte Kohlenwasserstoffketten handelt, die geradkettig oder verzweigtkettig, perfluoriert oder unsubstituiert sein können und 5 bis 55 Kohlenstoffatome und 1 bis 11 Prenyleinheiten aufweisen, L¹ eine Abgangsgruppe ist, P an das Carbonyl gebunden ist und für einen Rest einer Aminosäure oder eines Peptids steht, wobei P eine geschützte terminale Carboxygruppe umfasst, und P' für einen Rest einer Aminosäure oder eines Peptids steht.
Verfahren nach Anspruch 1 zur Herstellung eines Lipids II, umfassend eine (1) Bereitstellung eines geschützten Disaccharidkerns der Formel 14
(2) Einführung eines anomeren Phosphats unter Bildung einer Verbindung der Formel 12
(3) Einführung einer Polypeptidbrücke unter Bildung einer Verbindung der Formel 7a
(4) Entfernung der Gruppen Pg⁶ aus der Verbindung der Formel 7a und Behandlung der erhaltenen Verbindung mit einer Base der Formel B unter Bildung eines Phsphatsalzes der Formel 6a
(5) Behandlung der Verbindung der Formel 6a mit einem aktivierten Ester der Formel 25a
unter Bildung einer Verbindung der Formel 2a
und (6) Entfernung der Gruppen Pg⁰, Pg³, Pg⁷ und Pg⁸ unter Bildung der gewünschten Lipid II Verbindung, worin A für Wasserstoff oder eine Carboxylgruppe steht, R² für Methyl steht, Ac für -C(O)CH₃ steht, Pg⁰ für eine Acylhydroxyschutzgruppe steht, Pg³ für eine Acylhydroxyschutzgruppe steht, Pg⁴ für eine Carboxyschutzgruppe steht, Pg⁵ für eine Hydroxyschutzgruppe steht, Pg⁶ für eine Phosphatschutzgruppe steht, Pg⁷ für eine Aminschutzgruppe steht, Pg⁸ für eine Carboxyschutzgruppe steht und L¹ für eine Abgangsgruppe steht.