ES2292750T3 - Procedimiento para preparar lipido ii. - Google Patents
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Abstract
Un procedimiento para preparar un sustrato lipídico de fórmula 1, que comprende: (1) proporcionar un disacárido protegido de fórmula 14 (2) introducir un fosfato anomérico para formar un compuesto de fórmula 12 (3) introducir un enlace peptídico para formar un compuesto de fórmula 7 (4) eliminar los grupos Pg6 del compuesto de fórmula 7 y tratar el compuesto resultante con una base de fórmula B para formar una sal de fosfato de fórmula 6 (5) tratar el compuesto de fórmula 6 con un éster de fosfato activado de fórmula 25 para formar un compuesto de fórmula 2 (6) eliminar los grupos Pg0 y Pg3 y desproteger el grupo P para producir dicho sustrato lipídico en el que: Ac es -C(O)CH3; Pg0 es un grupo acilo protector de hidroxi; Pg3 es un grupo acilo protector de hidroxi; Pg4 es un grupo protector de carboxi; Pg5 es un grupo protector de hidroxi; Pg6 es un grupo protector de fosfato; R2 es hidrógeno, alquilo (C1-C5) o alquil(C1-C3)-fenilo; X es un transportador de lípidos, en el que transportador de lípidos significa cadenas de hidrocarburos saturadas e insaturadas que pueden ser lineales o ramificadas, perfluoradas o no sustituidas, que tienen de 5 a 55 carbonos y de 1 a 11 unidades de prenilo; L1 es un grupo saliente; P unido al carbonilo es un resto de un aminoácido o péptido, en el que P comprende un grupo carboxi terminal protegido; y P'' es un resto de un aminoácido o péptido.
Description
Procedimiento para preparar Lípido II.
La presente invención se refiere a un
procedimiento para preparar sustratos para las enzimas
transglicosilasas de la biosíntesis de la pared celular bacteriana
y a los sustratos producidos por las mismas, en particular, a la
síntesis química del Lípido II y análogos del mismo.
Los inhibidores de la biosíntesis de la pared
celular potentes y notablemente no tóxicos han dominado los
regímenes de tratamiento para el tratamiento de infecciones
bacterianas tanto en el marco hospitalario como ambulatorio durante
más de cincuenta años. Sin embargo, recientemente la resistencia de
las bacterias a estos antibióticos ha alcanzado un nivel alarmante
y ha empezado a deteriorar su eficacia clínica antes fiable. Por
consiguiente, se necesita con urgencia el descubrimiento de nuevos
fármacos para la farmacopea antibacteriana activa de la
pared
celular.
celular.
Las enzimas biosintéticas de la pared celular
(peptidoglicano) y sus sustratos naturales pueden ser herramientas
muy útiles en estudios dirigidos a entender los mecanismos de
resistencia a nivel molecular o a la búsqueda de agentes más nuevos
y más eficaces. Aunque las enzimas transpeptidasas son conocidas por
ser diana de antibióticos \beta-lactámicos, los
estudios sobre el proceso de transglicosilación han sido limitados
debido principalmente a la poca accesibilidad del sustrato de
transglicosilación natural, el Lípido II y sus análogos. El
aislamiento del Lípido II de cultivos líquidos de bacterias
presenta varios retos formidables, siendo el más evidente la
escala. Se ha calculado que el nivel de Lípido II es de solo
1.000-2.000 moléculas por célula en Escherichia
coli. Mil quinientas moléculas por célula equivale a
aproximadamente 2,5 nM en un cultivo denso (10^{9} ufc/ml).
Aunque se han aislado 50 \mug de ^{14}C-Lípido
II de Micrococcus luteus, la cantidad aislada es minúscula,
impura y radiactiva. (Véase, Brotz, H., y col., Antimicrob.
Agents Chemother, 42,154 (1998)). En segundo lugar, la
separación completa de la minúscula cantidad de Lípido II de
cantidades relativamente grandes de lípidos celulares y componentes
de membrana es muy difícil. Por lo tanto, se necesita un suministro
abundante y sostenible de Lípido II para mantener cualquier estudio
importante del procedimiento de transglicosilación.
Aunque el Lípido II es una herramienta útil en
el estudio de los mecanismos de resistencia a nivel molecular y en
la búsqueda de agentes más nuevos y eficaces, también tiene otros
usos. Por ejemplo, el Lípido II es útil en la cuantificación de la
lisozima, una enzima que hidroliza con preferencia las uniones
beta-1,4-glucosídicas entre el
ácido N-acetilmurámico y la
N-acetilglucosamina que se encuentran, por ejemplo,
en la estructura de la pared celular de mucopéptidos de
microorganismos tales como Micrococcus lysodeikticus. Además,
algunos lantibióticos se pueden purificar por cromatografía de
afinidad en una resina que contiene Lípido II inmovilizado.
La invención proporciona un procedimiento para
preparar un sustrato lipídico (p. ej., análogos del Lípido II) que
se puede usar como sustrato para las enzimas transglicosilasas de la
biosíntesis de la pared celular bacteriana. El procedimiento
incluye las etapas de:
(1) proporcionar un disacárido protegido de
fórmula 14
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\newpage
(2) introducir un fosfato anomérico para formar
un compuesto de fórmula 12
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(3) introducir un enlace peptídico para formar
un compuesto de fórmula 7
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(4) eliminar los grupos Pg^{6} del compuesto
de fórmula 7 y tratar el compuesto resultante con una base de
fórmula B para formar una sal de fosfato de fórmula 6
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(5) tratar el compuesto de fórmula 6 con un
éster de fosfato activado de fórmula 25
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para formar un compuesto de fórmula
2
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(6) eliminar los grupos Pg^{0} y Pg^{3} y
desproteger el grupo P para producir dicho sustrato lipídico en el
que:
Ac es -C(O)CH_{3};
Pg^{0} es un grupo acilo protector de
hidroxi;
Pg^{3} es un grupo acilo protector de
hidroxi;
Pg^{4} es un grupo protector de carboxi;
Pg^{5} es un grupo protector de hidroxi;
Pg^{6} es un grupo protector de fosfato;
R^{2} es hidrógeno, alquilo
(C_{1}-C_{5}) o
alquil(C_{1}-C_{3})-fenilo;
X es un transportador de lípidos, en el que
transportador de lípidos significa cadenas de hidrocarburos
saturadas e insaturadas que pueden ser lineales o ramificadas,
perfluoradas o no sustituidas, que tienen de 5 a 55 carbonos y de 1
a 11 unidades de prenilo;
L^{1} es un grupo saliente;
P unido al carbonilo es un resto de un
aminoácido o péptido, en el que P comprende un grupo carboxi
terminal protegido; y
P' es un resto de un aminoácido o péptido.
El procedimiento para preparar el Lípido II
comprende las etapas de:
(1) proporcionar un núcleo disacárido protegido
de fórmula 14
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(2) introducir un fosfato anomérico para formar
un compuesto de fórmula 12
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(3) introducir un enlace polipeptídico para
formar un compuesto de fórmula 7a.
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\vskip1.000000\baselineskip
(4) eliminar los grupos Pg^{6} del compuesto
de fórmula 7a y tratar el compuesto resultante con una base de
fórmula B para formar una sal de fosfato de fórmula 6a
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(5) tratar el compuesto de fórmula 6a con un
éster activado de fórmula 25a
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para formar un compuesto de fórmula
2a
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(6) eliminar Pg^{0}, Pg^{3}, Pg^{7} y
Pg^{8} para formar dicho compuesto Lípido II; en el que
A es hidrógeno o un grupo carboxilo;
R^{2} es metilo;
Ac es -C(O)CH_{3};
Pg^{0} es un grupo acilo protector de
hidroxi;
Pg^{3} es un grupo acilo protector de
hidroxi;
Pg^{4} es un grupo protector de carboxi;
Pg^{5} es un grupo protector de hidroxi;
Pg^{6} es un grupo protector de fosfato;
Pg^{7} es un grupo protector de amina;
Pg^{8} es un grupo protector de carboxi; y
L^{1} es un grupo saliente.
\vskip1.000000\baselineskip
Como se ha usado antes, y a lo largo de toda la
descripción de la invención, se entenderá que las siguientes
abreviaturas, salvo que se indique lo contrario, tienen los
siguientes significados:
\newpage
Designación
\hskip 0,9cmReactivo o fragmento
- Ac
- -C(O)CH_{3}
- AcOH
- ácido acético
- Ac_{2}O
- anhídrido acético
- BOC
- t-butiloxicarbonilo
- DBU
- 1,8-diazabiciclo[5.4.0]undec-7-eno
- TsOH
- ácido p-toluenosulfónico
- NMM
- N-metilmorfolina
- THF
- tetrahidrofurano
- Bn
- Bencilo (es decir, -CH_{2}Ph)
- TFA
- ácido trifluoroacético
- Troc
- 2,2,2-tricloroetoxicarbonilo
- Cbz
- benciloxicarbonilo
- TLC
- cromatografía de capa fina
- RMN
- resonancia magnética nuclear
- EM-ESI
- espectrometría de masas de ionización por electropulverización
- EtOAc
- acetato de etilo
- IR
- espectroscopía de infrarrojos
- MeOH
- metanol
- NaOMe
- metóxido sódico
- NHS
- N-hidroxisuccinimida
- EDCI
- Clorhidrato de 1-[3-(dimetilamino)propil]-3-etilcarbodiimida
- Ph
- fenilo
- CDI
- 1,1'-carboxildiimidazol
- h
- hora(s)
- min
- minutos
Como se ha usado antes y se usa a lo largo de la
descripción de la invención, se entenderá que los siguientes
términos, salvo que se indique lo contrario, tienen los siguientes
significados:
"Aminoácido" significa un aminoácido
seleccionado del grupo constituido por aminoácidos naturales y no
naturales como se definen en este documento. Se entiende que
aminoácido también incluye aminoácidos que tienen estereoquímica L
o D en el carbono \alpha. Los aminoácidos preferidos son los que
tienen un grupo \alpha-amino. Los aminoácidos
pueden ser neutros, positivos o negativos dependiendo de los
sustituyentes en la cadena lateral. "Aminoácido neutro"
significa un aminoácido que contiene sustituyentes sin carga en la
cadena lateral. Los aminoácidos neutros de ejemplo incluyen
alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina,
triptófano, metionina, glicina, serina, treonina y cisteína.
"Aminoácido positivo" significa un aminoácido en el que los
sustituyentes de la cadena lateral tienen carga positiva a pH
fisiológico. Los aminoácidos positivos de ejemplo incluyen lisina,
arginina e histidina. "Aminoácido negativo" significa un
aminoácido en el que los sustituyentes de la cadena lateral llevan
una carga neta negativa a pH fisiológico. Los aminoácidos negativos
de ejemplo incluyen ácido aspártico y ácido glutámico. Los
aminoácidos preferidos son los \alpha-aminoácidos.
Los aminoácidos naturales de ejemplo son isoleucina, prolina,
fenilalanina, triptófano, metionina, glicina, serina, treonina,
cisteína, tirosina, asparagina, glutamina, lisina, arginina,
histidina, ácido aspártico y ácido glutámico. "Aminoácido no
natural" significa un aminoácido para el que no hay codón de
ácido nucleico. Los ejemplos de aminoácidos no naturales incluyen,
por ejemplo, los isómeros D de los
\alpha-aminoácidos naturales como se ha indicado
antes; Aib (ácido aminobutírico), \betaAib (ácido
3-amino-isobutírico), Nva
(norvalina), \beta-Ala, Aad (ácido
2-aminoadípico), \betaAad (ácido
3-aminoadípico), Abu (ácido
2-aminobutírico), Gaba (ácido
\gamma-aminobutírico), Acp (ácido
6-aminocaproico), Dbu (ácido
2,4-diaminobutírico), ácido
\alpha-aminopimélico, TMSA
(trimetilsilil-Ala), aIle
(alo-isoleucina), Nle (norleucina),
terc-Leu, Cit (citrulina), Orn, Dpm (ácido
2,2'-diaminopimélico), Dpr (ácido
2,3-diaminopropionico), \alpha- o
\beta-Nal, Cha (ciclohexil-Ala),
hidroxiprolina, Sar (sarcosina), o similares; aminoácidos cíclicos;
aminoácidos N^{a}-alquilados tales como MeGly
(N^{a}-metilglicina), EtGly
(N^{a}-etilglicina) y EtAsn
(N^{a}-etilasparagina); y aminoácidos en los que
el carbono \alpha lleva dos sustituyentes en la cadena lateral.
Los nombres de los aminoácidos naturales y no naturales y los
restos de los mismos usados en el presente documento siguen los
convenios de nomenclatura sugeridos por la Comisión IUPAC de
nomenclatura de química orgánica y la Comisión
IUPAC-IUB de nomenclatura bioquímica como se expone
en "Nomenclature of a-Amino Acids
(Recommendations, 1974)" Biochemistry, 14(2),
(1975). En la medida en que lo nombres y abreviaturas de
aminoácidos y los restos de los mismos usados en esta memoria
descriptiva y reivindicaciones adjuntas difieran de los indicados,
se aclararán los nombres y abreviaturas que difieran.
"Grupo protector de aminoácido" y "grupo
protector de péptido" significa un grupo que protege un resto
ácido o amina del aminoácido/péptido u otro resto reactivo en la
cadena lateral de un aminoácido/resto de aminoácido, p. ej.,
hidroxi o tiol. Para ejemplos de los "derivados protegidos
correspondientes" de las cadenas laterales de aminoácidos, véase
T.W. Green and P.G.M. Wuts en "Protective Groups in Organic
Chemistry" John Wiley and Sons, 1991. Los grupos protectores
para un grupo ácido en un aminoácido se describen en el presente
documento en la sección de "grupo protector de carboxi". Los
grupos protectores para un grupo amina en un aminoácido se
describen en la sección "grupo protector de amina".
"Resto de aminoácido" significa las
unidades de aminoácidos individuales incorporadas en un péptido o
porción de péptido de una molécula, por un enlace amida.
"Grupo protector de amina" significa un
grupo que se elimina fácilmente que se conoce en la técnica para
proteger un grupo amino frente a reacciones indeseadas durante los
procedimientos sintéticos y que se elimina selectivamente. En la
técnica se conoce bien el uso de grupos protectores de amina para
proteger grupos frente a reacciones indeseables durante un
procedimiento sintético y muchos de dichos grupos protectores son
conocidos, por ejemplo, T.H. Green and P.G.M. Wuts, "Protective
Groups in Organic Synthesis", 2ª edición, John Wiley and Sons,
New York (1991). El grupo protector de amina también incluye grupos
protectores de amina lábiles frente a ácidos (p. ej. BOC) y grupos
protectores de amina lábiles frente a la hidrogenación (p. ej.,
Cbz). Un grupo protector de amina Pg^{7} preferido es
trifluoroacetilo. En la presente invención, Pg^{2} es un grupo que
no conduce a la generación de subproductos de oxazolina indeseables
(es decir, Pg^{2} no puede ser un grupo acilo). Los grupos
protectores de amina Pg^{2} adecuados incluyen grupos carbamato e
imida. Los grupos imida particulares incluyen ftalimida,
tetracloroftalimida y (Ac)_{2}N-. Los grupos carbamato
particulares incluyen metoxi-carbonilo,
9-fluorenilmetoxicarbonilo,
2,2,2-trifluoroetoxicarbonilo,
2-trimetilsililetoxicarbonilo, viniloxicarbonilo,
aliloxicarbonilo, t-butiloxicarbonilo (BOC),
1,1-dimetil-propiniloxicarbonilo,
benciloxicarbonil (CBZ), p-nitrobenciloxicarbonilo,
2,4-dicloro-benciloxicarbonilo,
trimetilsililoxicarbonilo,
2,2,2-tricloroetoxicarbonilo,
1,1-dimetil-2,2,2-tricloroetoxicarbonilo
o similares. Un grupo protector de amina Pg^{2} preferido es el
2,2,2-tricloroetoxicarbonilo.
"Grupo protector de carboxi" significa un
grupo que se puede eliminar fácilmente que se sabe en la técnica
que protege un hidrógeno ácido de un grupo carboxilo frente a
reacciones indeseables durante los procedimientos sintéticos, p.
ej., bloquea o protege el grupo funcional ácido mientras se llevan a
cabo las reacciones que implican otros sitios de grupos funcionales
del compuesto, y se elimina selectivamente. Dichos grupos
protectores de ácido son bien conocidos por los expertos en la
materia, y se han usado ampliamente en la protección de grupos
carboxilo, como se describe en la patente de EE.UU. nº 3.840.556 y
3.719.667. Para los grupos protectores de ácido adecuados véase,
T.W. Green and P.G.M. Wuts en "Protective Groups in Organic
Chemistry", John Wiley and Sons, 1991. El grupo protector de
ácido también incluye grupos protectores de ácido lábiles frente a
la hidrogenación tales como el bencilo. Los ejemplos de grupos
protectores de ácido incluyen ésteres tales como alquilo C_{1} a
C_{8} sustituido o no sustituido, p. ej., metilo, etilo,
t-butilo, metoximetilo, metil-tiometilo,
2,2,2-tricloroetilo o similares, tetrahidropiranilo,
fenilalquilo sustituido o no sustituido tal como bencilo y
derivados sustituidos del mismo tales como grupos alcoxibencilo o
nitrobencilo o similares, cinamilo, dialquilaminoalquilo, p. ej.
dimetilaminoetilo o similares, trimetilsililo, amidas e hidrazidas
sustituidas y no sustituidas, p. ej., amidas e hidrazidas de
N,N-dimetilamina, 7-nitroindol,
hidrazina, N-fenilhidrazina o similares, grupos
aciloxialquilo tales como pivaloiloximetilo o propioniloximetilo o
similares, aroiloxialquilo tales como benzoiloxietilo o similares,
alcoxicarbonilalquilo tales como metoxicarbonilmetilo,
ciclohexiloxicarbonilmetilo o similares, alcoxicarboniloxialquilo
tales como t-butiloxicarboniloximetilo o similares,
alcoxicarbonilaminoalquilo tales como
t-butiloxicarbonilaminometilo o similares,
alquilaminocarbonilaminoalquilo, tales como
metilaminocarbonilaminometilo o similares, acilaminoalquilo tales
como acetilaminometilo o similares, heterociclilcarboniloxialquilo
tales como 4-metilpiperazinilcarboniloximetilo o
similares, dialquilaminocarbonilalquilo tales comos
dimetilaminocarbonil-metilo o similares,
(5-(alquilo
inferior)-2-oxo-1,3-dioxoten-4-il)alquilo
tales como
(5-t-butil-2-oxo-1,3-dioxolen-4-il)metilo
o similares, y
(5-fenil-2-oxo-1,3-dioxolen-4-il)alquilo
tales como
(5-fenil-2-oxo-1,3-dioxolen-4-il)metilo
o similares. Los grupos protectores de carboxi particulares
incluyen metilo, 9-fluorenilmetilo,
2-(trimetilsilil)etilo, 2-(trimetilsilil)etoximetilo,
2-metiltioetilo,
1,3-ditianil-2-metilo,
2-(p-toluenosulfonil)etilo,
2-(p-nitrofenilsulfenil)etilo,
2-(2'-piridil)etilo,
2-(difenilfosfino)etilo, p-(metilmercapto)fenilo,
nitroetilo, alilo o similares. Un grupo protector de carboxi
Pg^{4} preferido es -CH_{2}CH_{2}SO_{2}F. Un grupo protector
de carboxi Pg^{8} preferido es metilo.
"Grupo protector de hidroxi" significa un
grupo que se elimina fácilmente que se sabe en la técnica que
protege un grupo hidroxilo frente a reacciones indeseables durante
los procedimientos sintéticos y se elimina selectivamente. El uso
de grupos protectores de hidroxi es bien conocido en la técnica para
proteger grupos frente a reacciones indeseables durante un
procedimiento sintético y se conocen muchos de dichos grupos
protectores, por ejemplo, T.H. Green and P.G.M. Wuts, "Protective
Groups in Organic Synthesis", 2ª edición, John Wiley and Sons,
New York (1991). En la presente invención, los grupos protectores
de hidroxi Pg^{0}, Pg^{1} y Pg^{5} son ortogonales entre sí,
como se describe en el presente documento. Pg^{1} no puede ser un
grupo atractor de electrones, puesto que dichos grupos desactivan
la reacción de acoplamiento entre el compuesto de muramulamida de
fórmula 18 y el compuesto de glucosopiranosilo de fórmula 17. Los
grupos Pg^{1} adecuados incluyen grupos aralquilo, aralquenilo y
sililo. Los grupos aralquilo y alquenilo particulares incluyen
bencilo y alilo, respectivamente. Los grupos sililo particulares
incluyen grupos trialquilsililo, tales como trimetilsililo y
(t-butil)dimetilsililo. Los grupos Pg^{1}
preferidos son alilo y bencilo; un grupo más preferido es bencilo.
Los grupos Pg^{5} adecuados incluyen aralquilo y alquenilo. Los
grupos Pg^{5} preferidos incluyen alilo,
n-pentenilo y bencilo; un grupo más preferido es
bencilo. Además, Pg^{0} y Pg^{3} se deben poder eliminar por
saponificación (es decir, Pg^{0} y Pg^{3} deben ser grupos
acilo). Los grupos acilo particulares incluyen formilo, acetilo,
cloroacetilo, tricloroacetilo, o-nitrofenilacetilo,
o-nitrofenoxi-acetilo,
trifluoroacetilo, acetoacetilo, 4-clorobutirilo,
isobutirilo, o-nitrocinamoilo, picolinilo,
acilisotiocianato, aminocaproilo, benzoilo o similares. Los grupos
Pg^{0} y Pg^{3} son cloroacetilo y acetilo; un grupo más
preferido es acetilo.
"Grupo protector de fosfato" significa un
grupo que se elimina fácilmente que se sabe en la técnica que
protege un grupo fosfato frente a reacciones indeseables durante
procedimientos sintéticos y se elimina selectivamente. El uso de
grupos protectores de fosfato se conoce bien en la técnica para
proteger grupos frente a reacciones indeseables durante un
procedimiento sintético y muchos de dichos grupos protectores son
conocidos, por ejemplo, T.H. Green and P.G.M. Wuts, "Protective
Groups in Organic Synthesis", 2ª edición, John Wiley and Sons,
New York (1991). Un grupo protector de fosfato Pg^{6} preferido
es bencilo.
"Grupo saliente" de un éster activado
significa un sustituyente que es suficientemente lábil de modo que
pueda ser sustituido por un buen nucleófilo (p. ej., un grupo amino
de una unidad peptídica). La labilidad de un sustituyente
particular variará dependiendo de los sustituyentes en el mismo y/o
en átomos de carbono adyacentes y de la naturaleza del grupo lábil.
Los expertos en la materia valorarán los tipos de grupos salientes
capaces de sustitución por un nucleófilo amino. Para grupos
salientes adecuados, véase M. Bodanszky and A. Bodanszky en "The
Practice of Peptide Synthesis" Springer-Verlag,
1984; y M.Bodanszky en "Principles of Peptide Synthesis"
Springer-Verlag, 1984. En la presente invención, por
ejemplo, el grupo saliente activa el carbonilo unido de modo que el
grupo aminoácido terminal actúa como un conector para unir el
disacárido con la unidad peptídica. Los grupos salientes
particulares preferidos incluyen pentafluorofenoxi,
N-oxisuccinimida, N-oxiftalimida y
N-oxibenzotriazol. Un grupo saliente preferido es
N-oxisuccinimida.
"Grupos protectores ortogonales" significa
grupos protectores para los cuales existe un conjunto de condiciones
en la que uno de los grupos se puede eliminar sin eliminar el o los
otros. La expresión comprende grupos protectores para diferentes
restos (p. ej., grupos protectores de amina e hidroxi ortogonales)
así como del mismo resto (p. ej., grupos protectores de hidroxi
ortogonales). No es un requisito que los grupos protectores
ortogonales sean necesariamente diferentes. Por ejemplo, cuando la
expresión se usa para describir grupos protectores para el mismo
resto, los grupos pueden ser diferentes (p. ej., grupos protectores
de hidroxi acetilo y bencilo ortogonales) o iguales (p. ej., grupos
protectores bencilo ortogonales).
"Grupo atractor de electrones" significa un
grupo que es un atractor de electrones más potente que el hidrógeno.
Los grupos atractores de electrones presentan efectos inductivos
negativos, mientras que los grupos que son peores atractores de
electrones que el hidrógeno presentan efectos inductivos positivos
(véase, p. ej., E. S. Gould, "Mechanism and Structure in Organic
Chemistry", Holt, Rinehart and Winston, New York (1959)).
"Acilo" significa un grupo
R-C(O)-, en el que R está unido al grupo CO
por un enlace carbono-carbono.
"Alquilo" significa un grupo hidrocarburo
alifático que puede ser lineal o ramificado que tiene de
aproximadamente 1 a aproximadamente 20 átomos de carbono en la
cadena. Los grupos alquilo preferidos tienen de 1 a aproximadamente
12 átomos de carbono en la cadena, y es más preferido el alquilo
inferior como se define en el presente documento. Ramificado
significa que uno o más grupos alquilo inferior tales como metilo,
etilo o propilo están unidos a una cadena de alquilo lineal.
"Alquilo inferior" significa de aproximadamente 1 a
aproximadamente 4 átomos de carbono en la cadena que puede ser
lineal o ramificada.
"Alquenilo" significa un grupo hidrocarburo
alifático que contiene un doble enlace
carbono-carbono y que puede ser lineal o ramificado
y que tiene de aproximadamente 2 a aproximadamente 15 átomos de
carbono en la cadena. Los grupos alquenilo preferidos tienen de 2 a
aproximadamente 12 átomos de carbono en la cadena; y más
preferiblemente de aproximadamente 2 a aproximadamente 4 átomos de
carbono en la cadena. Ramificado significa que uno o más grupos
alquilo inferior tales como metilo, etilo o propilo están unidos a
una cadena de alquenilo lineal. "Alquenilo inferior" significa
de aproximadamente 2 a aproximadamente 4 átomos de carbono en la
cadena que puede ser lineal o ramificada. Los grupos alquenilo de
ejemplo incluyen etenilo, propenilo, n-butenilo,
i-butenilo,
3-metilbut-2-enilo,
n-pentenilo, heptenilo, octenilo, ciclohexilbutenilo
y decenilo.
\newpage
"Arilo" significa un sistema anular
monocíclico o multicíclico aromático de aproximadamente 6 a
aproximadamente 14 átomos de carbono, preferiblemente de
aproximadamente 6 a aproximadamente 10 átomos de carbono. Los grupos
arilo de ejemplo incluyen fenilo o naftilo, o fenilo sustituido o
naftilo sustituido.
"Base de fórmula B" y "base de fórmula
B^{2}" significa un compuesto que comprende un nitrógeno
hibridado SP^{2} y SP^{3} que tiene un par de electrones no
unido que se puede protonar. Los ejemplos de bases de fórmula B o
B^{1} incluyen compuestos que comprenden grupos imino
opcionalmente sustituido, amino opcionalmente sustituido y amidino
opcionalmente sustituido.
"Carboxi" significa un grupo
HO(O)C- (ácido carboxílico o sal del mismo).
"N-oxisuccinimida"
significa un resto de la siguiente estructura
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
"Transportador de lípidos" significa
cadenas de hidrocarburo saturadas o insaturadas. Las cadenas pueden
ser lineales o ramificadas. El hidrocarburo también puede estar
sustituido (perfluorado) o no sustituido. La cadena de hidrocarburo
contiene de 5 a 55 carbonos y de 1 a 11 unidades de prenilo,
preferiblemente de 25 a 55 carbonos y de 5 a 11 unidades de
prenilo, más preferiblemente de 40 a 55 carbonos y de 8 a 11
unidades de prenilo.
"Péptido" significa un polímero que
comprende restos de aminoácidos unidos entre sí por enlaces amida.
Las unidades de péptido y polipéptido adecuadas incluyen péptidos
que contienen 2 o más, preferiblemente de 2 a 4 restos de
aminoácidos. P también puede ser un solo resto de aminoácido.
Preferiblemente P es un polipéptido que contiene 4 restos de
aminoácidos. Las unidades de polipéptido particularmente útiles son
D-iGln-L-Lys-D-Ala-D-Ala
o
D-iGIn-Dap-D-Ala-D-Ala.
Se pueden usar otras combinaciones de aminoácidos y número de
aminoácidos incluidos en la unidad de aminoácido o péptido
dependiendo de la enzima seleccionada para interaccionar con el
sustrato lipídico. Los restos de aminoácidos adecuados incluyen
aminoácidos naturales, aminoácido no habituales y aminoácidos
modificados como se define en el World Intellectual Property
Organization (WIPO) Handbook on Industrial Property Information and
Documentation, Standard ST.25: Standard for the Presentation of
Nucleotide and Amino Acid Sequence Listings in Patent Applications
(1998), incluyendo las Tablas 1 a 6 en el apéndice 2.
"Lípido II" significa un compuesto de la
siguiente estructura:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en la que A es un hidrógeno o un
grupo carboxilo (-CO_{2}H o sal del mismo); Ac es
-C(O)CH_{3} y W^{+} son cada uno
independientemente un protón o catión seleccionado del grupo
constituido por un metal alcalino (p. ej., sodio o potasio), metal
alcalinotérreo (p. ej., magnesio o calcio), amonio, alquilamonio (p.
ej., metilamonio o etilamonio) y dialquilamonio (p. ej.,
dimetilamonio, metiletilamonio o dietilamonio). Preferiblemente, el
grupo pirofosfato no está protonado. Para el Lípido II
gram-positivo, A generalmente es hidrógeno; mientras
que para el Lípido II gram-negativo, A generalmente
es un grupo
carboxilo.
"Sustancialmente puro" significa una pureza
aislada de más de o igual a 99% de pureza.
\global\parskip0.900000\baselineskip
La fig. 1 ilustra el proceso de
transglicosilación usando el Lípido II como un sustrato en forma
gráfica.
La fig. 2 ilustra la detección fluorescente de
cadenas de glicano generadas por incubación de un derivado de
Lípido II sintetizado marcado con dansilo con una transglicosilasa
monofuncional (MtgA) de Staphylococcus aureus.
El Lípido II es útil en la cuantificación de la
lisozima, una enzima que hidroliza con preferencia las uniones
beta-1,4-glucosídicas entre el ácido
N-acetilmurámico y la
N-acetilglucosamina que se encuentran, por ejemplo,
en la estructura de pared celular del mucopéptido de microorganismos
tales como Micrococcus lysodeikticus.
La lisozima puede ser el mediador en la función
antitumoral de macrófagos (Osserman y col. (1973) Nature
243: 45 331) los cuales se ha mostrado que segregan esta enzima
(Gordon y col. (1974) J. Exp. Med. 139:1228). La lisozima de
cartílago puede tener una función en la calcificación del cartílago
(Kuettner y col. (1974) Biochim. Biophys. Acta 372:335). Se
ha mostrado interés en la lisozima como un antibiótico
"natural" y como una ayuda en el diagnóstico de enfermedades
(Glynn (1968) Sci. Basis Med. Ann. Rev. 31; Pruzanski y col.
(1969) Amer. J. Med. Sci. 258:405). Hay presentes niveles
elevados de lisozima sérica y urinaria en la leucemia monocítica y
monomielocítica (Osserman y col. (1966) J. Exp. Med. 124:921;
Brierre y col. (1974) Clin. Chim. Acta 50:265). La presencia
de esta enzima en el líquido cefalorraquídeo es indicativa de
tumores del sistema nervioso central (Newman y col. (1974) Lancet
II 756). Normalmente, la actividad de lisozima está
prácticamente ausente de la orina, bilis y líquido espinal
(Hankiewicz y col. (1974) Clin. Chim. Acta 57:205). La
enzima también se usa para la lisis de E. coli y
Streptomycetes con propósitos de extracción (Haas y col.
(1975) Methods in Enzymology, XLIII (Hash, J., ed.), Academic
Press, N.Y., p. 621), tal como extracción de antígeno específico de
grupo (Watson y col. (1975) J. Clin. Microbiol. 1:274).
Así pues, la lisozima tiene una serie de
implicaciones y usos médicos y de investigación importantes, y por
lo tanto la cuantificación precisa de la misma es importante en
estas aplicaciones.
Inicialmente, la actividad de la lisozima se
calculó por ensayo turbidimétrico celular usando Micrococcus
luteus como sustrato. La tasa de lisis de las células por la
lisozima se determina por espectrofotometría midiendo la
disminución de turbidez de la solución celular. Sin embargo, este
procedimiento no se puede reproducir con fiabilidad debido a la
falta de uniformidad del polvo celular de M. luteus. El
resultado también varía ampliamente con las diferentes fuerzas
iónicas del tampón.
Actualmente, se puede adquirir un sustrato
disponible comercialmente par la evaluación colorimétrica de la
actividad de lisozima en Sigma Chemical Company (St. Louis, MO). El
sustrato es el azúcar trímero sintético
p-nitrofenil-beta-D-N,N',N''-triacetilquitotriosa
(PNP-(GlcNac)_{3}) (Producto del catálogo de Sigma nº
N-8638). También se han usado
acetilquitooligosacáridos más largos y más cortos para el ensayo de
la lisozima, es decir PNP-(GlcNAc)_{n}, en el que n =
2-5. En todos los casos, el sitio de escisión
favorecido para la lisozima da como resultado la formación de
PNP-Glc-NAc. La actividad que se
mide en este ensayo es el aumento de absorbancia a 405 nm del
p-nitrofenol liberado. Sin embargo, la escisión del
sustrato por la lisozima a
PNP-Glc-NAc no da como resultado
directamente la liberación de p-nitrofenol. Para
obtener mediciones colorimétricas fiables de la actividad de
lisozima, se debe acoplar el ensayo a una segunda enzima, la
\beta-acetilhexosaminidasa (NAHasa). La NAHasa
escinde la PNP-Glc-NAc para liberar
el p-nitrofenol, que después se cuantifica (Nanjo y
col. (1988) J. Biochem. 104:255-258). Este
ensayo, aunque es más preciso que los ensayos previos, todavía da
como resultado un nivel de error alto debido a la escisión por la
lisozima del sustrato, que produce productos de escisión distintos
de la PNP-Glc-NAc. Además, es menos
preferido dos sistemas de enzimas que un sistema que mida
directamente la actividad de interés. Un ensayo nuevo y mejorado que
fuera muy preciso y fácil de usar sería valioso en el marco del
laboratorio para la determinación rutinaria de la lisozima en las
preparaciones farmacéuticas/de diagnóstico y materiales biológicos.
Dicho ensayo se puede usar como una herramienta de diagnóstico
precisa para el diagnóstico de la leucemia y tumores del sistema
nervioso central. La detección de la actividad de la lisozima en el
suero, orina o líquido cefalorraquídeo humanos ayudaría rápidamente
y con precisión al diagnóstico de determinados cánceres, como se ha
indicado antes, y sería una adición valiosa al arsenal de las
herramientas de diagnóstico del cáncer. El Lípido II se puede usar
en ensayos de la lisozima como sigue.
El Lípido II marcado con Verde de Oregón en la
amina \varepsilon del aminoácido lisina del pentapéptido de
acuerdo con las instrucciones del fabricante (Molecular Probes,
Eugene, OR) es una molécula fluorescente. Este derivado de Lípido
II marcado se puede polimerizar usando la transglicosilasa A
monofuncional de Staphylococcus aureus (MtgA; patentes de
EE.UU. nº 6.143.868 y 5.922.540) en cadenas de peptidoglicanos que
no son fluorescentes. La polimerización se logra usando Lípido II
marcado con Oregno Green 100 \muM, MtgA 5 \muM, MES 50 mM (pH
5,9), MgCl_{2} 25 mM, NaCl 16,7 mM y CHAPS 0,27 mM. La
polimerización se completa después de aproximadamente 5 horas a
25ºC.
Los fluoróforos adyacentes (sean los colorantes
vecinos o las cuatro unidades de disacárido que se repiten más
lejos) del polímero interaccionan cuando están muy próximos, dando
como resultado la autoatenuación. La adición de lisozima al
material de peptidoglicano marcado da como resultado la escisión de
los mismos enlaces formados por MtgA en la reacción de
polimerización. Tras la escisión de estos enlaces, los colorantes
empiezan a separarse físicamente, dando como resultado la pérdida
de interacción entre las moléculas de colorante y un posterior
aumento de fluorescencia debido a la disminución de la
autoatenuación. El seguimiento de la fluorescencia de la reacción
catalizada por lisozima (Excitación: 495 nm; Emisión: 521 nm) con el
tiempo comparado con la de una curva patrón permite cuantificar la
actividad de la lisozima presente en la preparación objetivo.
Así, un kit de ensayo de lisozima puede contener
cadenas prepolimerizadas de peptidoglicano marcadas con Verde de
Oregón, para las que el Lípido II es un material de partida
obligatorio, fraccionadas por tamaños en longitudes que dan como
resultado inmediatamente un aumento de la fluorescencia tras la
escisión inicial de la lisozima. Por ejemplo, cuando se escinden
los dímeros es seguro que dan como resultado un aumento de la
fluorescencia. Alternativamente, los polímeros de peptidoglicano se
pueden marcar con Verde de Oregón de modo que los restos marcados
estén espaciados suficientemente cerca para dar como resultado la
atenuación completa, pero suficientemente alejados para que la
escisión inicial de como resultado la reducción inmediata de la
atenuación. La cantidad de marcaje de Verde de Oregón incorporado
en el polímero se puede controlar variando la relación de Lípido II
marcado y no marcado usado en la reacción de polimerización. El
peptidoglicano marcado puede estar presente en el kit en forma de
una solución acuosa o de un polvo sólido. Una solución acuosa de
dicho peptidoglicano marcado con Verde de Oregón se puede preparar
en un tampón que se elija, y después se pueden añadir partes
alícuotas de la preparación de lisozima que se va a cuantificar. El
seguimiento del aumento de la intensidad de la fluorescencia con el
tiempo (Excitación 495 nm; Emisión 521 nm) y la comparación de los
resultados con los obtenidos de una curva patrón, proporciona una
medición cuantitativa de la actividad de la lisozima en la
preparación enzimática.
Los lantibióticos son una clase de antibióticos
peptídicos caracterizados por modificaciones postraduccionales
específicas que dan como resultado la formación de los
tioéter-aminoácidos raros lantionina y/o
3-metil-lantionina con estas
moléculas, y de ahí el nombre de "lantibióticos" (antibióticos
que contienen lantionina). Los lantibióticos epidermina,
gardimicina (actagardina), mersacidina y nisina tienen actividad
antibacteriana frente a organismos
gram-positivos.
Comercialmente la Nisina Z se ha usado como un
conservante alimentario durante varias décadas, en particular en la
industria de productos lácteos. No es tóxica para los seres humanos,
y a pesar de su uso prolongado no se ha observado el desarrollo de
resistencia a este antibiótico. Actualmente la Nisina Z se considera
un candidato de fármaco tanto para uso humano como para la
inclusión en dispositivos médicos y superficies de máquinas de
procesamiento de alimentos para prevenir el crecimiento microbiano.
La epidermina, gardimicina y mersacidina son potencialmente útiles
como fármacos antibacterianos para el tratamiento de infecciones
bacterianas en seres humanos.
La epidermina, mersacidina y nisina
interaccionan específicamente con el Lípido II (Broetz y col. (2000)
Journal of Antimicrobial Chemotherapy
46:1-6; Breukink y col, (1999) Science
286:2361-2364; Broetz y col. (1998)
Antimicrobial Agents and Chemotherapy 42(1):
154-160). Aunque no hay una prueba directa de la
unión de la gardimicina al Lípido II, se espera que dicha unión se
produzca en vista de las similitudes estructurales entre la
gardimicina y la mersacidina. Por lo tanto, se podría esperar que
todos estos lantibióticos se pudieran purificar de una mezcla de
compuestos, tal como un líquido sobrenadante de cultivo de una cepa
microbiana que produce lantibiótico, por cromatografía de afinidad
en una resina que contiene Lípido II inmovilizado. Los ejemplos de
cepa que producen lantibiótico incluyen Lactococcus lactis
ssp. lactis (nisina); Staphylococcus epidermidis
(epidermina); Bacillus sp. cepa HIL
Y-85,54728 (mersacidina); y Actinoplanes
liguriae (gardimicina). Para este propósito, el Lípido II se
acopla a resinas activadas, por ejemplo las disponibles
comercialmente de proveedores tales como Amersham Pharmacia Biotech.
El acoplamiento se hace de acuerdo con las instrucciones del
fabricante. En general, se mezcla simplemente una solución del
ligando deseado, en este caso el Lípido II, con una suspensión de
la resina activada en un disolvente o tampón adecuado (determinado
por la solubilidad del ligando y por la química de acoplamiento
usada), se incuba y se quita por lavado el exceso del ligando
Lípido II.
Si este procedimiento de acoplamiento da como
resultado una orientación del Lípido II respecto a la superficie de
la resina que no permite la unión de lantibióticos, entonces el
Lípido II se une a perlas hidrófobas para superar este problema. De
esta forma, el Lípido II se presenta de la misma forma que se
encuentra en su entorno natural de membrana. Se forma una monocapa
de Lípido II sobre perlas hidrófobas como describen para una
monocapa de fosfolípido Retzinger y col. ((1985) Analytical
Biochemistry 150:131-140) o Kim y col. ((1997)
Analytical Biochemistry
250(1):109-116). Por ejemplo, se tratan con
ultrasonidos las perlas de
poliestireno-divinilbenceno junto con el Lípido II
en hexano/etanol (aproximadamente 1/1, v/v), y se secan. Las perlas
se vuelven a dispersar en agua y se lavan con agua, dando como
resultado una monocapa de lípido sobre la superficie de las perlas
hidrófobas. Si la forma molecular del Lípido II es incompatible con
la formación de una monocapa sólo de Lípido II sobre la superficie
de las perlas, las perlas se recubren con una mezcla de fosfolípidos
y Lípido II.
Después la mezcla que contiene lantibiótico se
pasa por la columna que contiene la resina de Lípido II en
condiciones que permiten la unión de los lantibióticos al Lípido II
inmovilizado. Por ejemplo, las condiciones mostradas (Broetz y col.
(1998) Antimicrobial Agents and Chemotherapy
42(1):154-160) para permitir la unión de
mersacidina, y supuestamente gardimicina, al Lípido II incluyen:
a) Tris-HCl 50 mM, pH 7,8,
MgCl_{2} 10 mM, 23ºC; o
b) caldo de Mueller-Hinton
semiconcentrado.
Las condiciones en la que la epidermina y
nisina se unen al Lípido II (Broetz y col. (1998) Molecular
Microbiology 30 (2):317-327) incluyen:
a) Tris-HCl 69 mM, pH 8,8,
MgCl_{2} 58 mM, NH_{4}Cl 11,6 mM, SDS 5,8 mM; o
b) Tris-HCl 10 mM, pH 7,2, NaCl
al 0,85%.
Las condiciones adicionales en las que la nisina
se une al Lípido II (Wiedemann y col. (2001) Journal of
Biological Chemistry 276(1): 1772-1779)
incluyen MES-KOH 25 mM, pH 6,0, K_{2}SO_{4} 50
mM, o MES-KOH 50 mM, pH 6,0, K_{2}SO_{4} 100
mM.
Los materiales no lantibióticos no unidos se
separan eluyendo la columna con el mismo tampón usado para la unión
del lantibiótico al Lípido II inmovilizado en la resina.
Se espera que la mersacidina y gardimicina se
puedan eluir de la columna lavando la resina con un tampón, p. ej.,
Tris-HCl 50 mM, pH 7,8, que contiene EDTA, para
separar los cationes divalentes. Alternativamente, el Lípido II
unido se puede hidrolizar con ácido con el fin de romper la unión
entre MurNAc y el fosfato, generando fragmentos que ya no
interaccionan con la mersacidina o gardimicina.
También se espera que las interacciones de la
nisina y/o epidermina con el Lípido II unido covalentemente a la
resina se rompan con un disolvente orgánico, p. ej., acetonitrilo al
100% o un detergente. También se pueden usar pH extremo,
concentraciones salinas altas o tampones acuosos que contienen
EDTA.
La diversidad de elementos estructurales que se
encuentra en el Lípido II presenta varios retos importantes para la
síntesis total. El núcleo central del Lípido II consiste en un
disacárido con unión \beta-[1,4] que contiene subunidades de
N-acetilglucosamina (NAG) y de ácido
N-acetilmurámico (NAM). El resto de muramilo tiene
además una cadena de pentapéptido (p. ej.,
L-Ala-D-iGln-L-Lys-D-Ala-D-Ala
o
L-Ala-D-iGln-meso-DAP-D-Ala-D-Ala)
unida a la posición 3 por una unión lactilo, así como un resto de
\alpha-glicosil-difosfato unido a
undecaprenilo químicamente sensible.
La síntesis del propio fragmento del núcleo de
disacárido central en forma ortogonalmente protegida presentaba un
reto sintético importante. Por ejemplo, la identificación de un
esquema de protección que tiene triple ortogonalidad es muy
conveniente para llevar a cabo el desenmascaramiento selectivo de
los tres tipos de grupos hidroxilo colgantes (es decir, OH
anomérico, OH periférico y OH del carboxilo). Además, se esperaba
que la construcción estereoselectiva de la unión
\beta-[1,4]-glicosídica fuera difícil
independientemente del procedimiento usado para generar un dador de
catión glicosilo reactivo. Por ejemplo, con respecto al catión
glicosilo, cada una de las siguientes propiedades inherentes
contribuye a una pérdida de reactividad del aceptor de catión
glicosilo; (i) la falta intrínseca de nucleofilicidad del grupo
C(4)-hidroxilo de los aceptores basados en
glucopiranosa, (ii) el impedimento estérico adicional entorno al
C(4)-hidroxilo de los aceptores basados en
ácido murámico, y (iii) la desactivación electrónica adicional de
los aceptores
2-desoxi-2-acilaminoglucopiranosa
respecto a sus homólogos basados en glucopiranosa. Con respecto al
dador de catión glicosilo, era necesario un procedimiento de
activación con un predisposición hacia la formación de una unión
\beta-[1,4]-glicosídica. También era necesario
que las condiciones de reacción para la generación del catión
glicosilo fueran compatibles con los grupos funcionales que se
encontraban tanto en el dador como el aceptor. Se ha abordado cada
uno de los problemas sintéticos asociados con la construcción
estereoselectiva de un precursor del disacárido
NAG-NAM (véase el siguiente esquema II) y se ha
desarrollado un protocolo para su síntesis en una escala de
multigramos en forma completamente diferenciada. El procedimiento
sintético para preparar el precursor del disacárido
NAG-NAM se ilustra en los siguientes ejemplos. El
núcleo de disacárido se puede preparar alternativamente usando los
procedimientos generales descritos por Kantoci, D., y col.,
Carbohydrate Research, 162, 227 (1987).
Además de la síntesis del núcleo de disacárido,
los solicitantes han abordado con éxito otros retos de la síntesis
total del Lípido II que incluyen: (1) un procedimiento para
introducir un fosfato anomérico en un precursor de disacárido
adecuadamente protegido de una forma selectiva en \alpha, (2) un
procedimiento suave para introducir el difosfato unido a
undecaprenilo químicamente sensible, (3) ortogonalidad de los grupos
protectores usados en la cadena lateral de pentapéptido y la
periferia del hidrato de carbono con los usados para enmascarar
temporalmente los grupos funcionales reactivos en el centro
anomérico del fragmento de muramilo, (4) coordinación del esquema
de grupos protectores entero para permitir la desprotección global
en condiciones de reacción suaves como etapa final en la síntesis,
y (5) desarrollo de un protocolo de cromatografía líquida de alto
rendimiento (HPLC) para purificar el producto final. La síntesis del
Lípido II descrita a continuación aborda con éxito cada uno de los
problemas señalados antes.
La introducción del resto de difosfato unido a
undecaprenilo en la etapa final de la síntesis proporcionaba
distintas ventajas. Por ejemplo, evitaba potenciales complicaciones
de solubilidad en posteriores reacciones que pudieran darse por el
carácter lipófilo potenciado del sustrato unido a undecaprenilo.
Además, la introducción en la etapa final del difosfato unido a
lípido también minimizaba el número de posteriores operaciones
sintéticas que tenía que aguantar la unión difosfato alílica
químicamente sensible.
Los solicitantes también descubrieron que el uso
de grupos protectores escindibles con base para todos los grupos
funcionales que se desenmascaran después de su incorporación les
permite evitar cualquier potencial sensibilidad a ácido del
difosfato anomérico.
\global\parskip1.000000\baselineskip
En la técnica no se ha reconocido totalmente la
descomposición del producto intermedio del Lípido II debido a la
sensibilidad al ácido del grupo pirofosfato. Los solicitantes
descubrieron que una vez que el resto de pirofosfato estaba
presente en el compuesto, los subproductos de la descomposición se
podrían minimizar manteniendo un pH mayor que aproximadamente 6.
Preferiblemente el pH se mantiene de 6 a 12, más preferiblemente de
7 a 10, incluso más preferiblemente de 7 a 9. Se cree que incluso
el producto natural se podría aislar con rendimientos y pureza
mayores si el pH se mantuviera a un pH mayor que 6 en lugar de la
práctica actual de usar piridinio/acetato 6 M en el procedimiento
de aislamiento, que tiene un pH de 4,2. Para una descripción
detallada de los procedimientos actuales de aislamiento de
productos naturales, véase: Van Heuenoort, Y., y col., "Membrane
intermediates in the Peptidoglycan Metabolism of Escherichia
coli: Possible Roles of PBP 1b and PBP 3," J.
Bacteriol., 174(11), 3549-3557 (1992); y
Anderson, J.S., y col., "Biosynthesis of the Peptidoglycan of
Bacterial Cell Walls," J. Biol. Chem., 242(13),
3180-3190 (1967).
El Lípido II se puede purificar usando
procedimientos de cromatografía convencionales conocidos para los
expertos en la materia. En los ejemplos se ilustra un conjunto
particular útil de condiciones de cromatografía. El Lípido II se
aísla con purezas mucho mayores que las disponibles en la
actualidad. Se puede aislar el Lípido II con purezas mayores de
50%. En general, el Lípido II se puede aislar con una pureza mayor o
igual de 60%, 70%, 80%, 90%, 95% o 98% y en condiciones óptimas en
forma sustancialmente pura (\geq 99%).
Hay que entender que esta invención cubre todas
las combinaciones apropiadas de agrupaciones particulares y
preferidas, y etapas del procedimiento individuales o combinadas
como se refieren en el presente documento.
Un compuesto de fórmula 1, en la que las
variables son como se describen en el presente documento, se puede
preparar por eliminación de los grupos Pg^{0} y Pg^{3} y
desprotección del grupo P de un compuesto de fórmula 2, en la que
las variables son como se describen en el presente documento,
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en presencia de un agente de
desprotección en condiciones adecuadas. Los grupos Pg^{0} y
Pg^{3} particulares son acetilo o similares. Un agente de
desprotección particular es el hidróxido sódico acuoso o similar.
Las condiciones de desprotección particulares comprenden llevar a
cabo la desprotección en una solución aproximadamente 1:1 de
1,4-dioxano:agua, o similar, mientras se agita
durante aproximadamente 2
h.
Un compuesto de fórmula 2, en la que las
variables son como se describen en el presente documento, se puede
preparar por tratamiento de un fosfato activado de fórmula 4, en la
que L^{1} es un grupo saliente y las otras las variables son como
se describen en el presente documento, con un monofosfato de fórmula
3, en la que B^{2} es una base y X es como se describe en el
presente documento, en condiciones de acoplamiento adecuadas.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Un L^{1} particular es imidazolilo o similar.
Las condiciones particulares comprenden exponer el fosfato activado
al monofosfato (sal de Et_{3}NH^{+}) o similar, en presencia de
1H-tetrazol o similar (1 equivalente), a lo largo de
aproximadamente 4 días en DMF/THF en atmósfera de argón o
similar.
Un compuesto de fórmula 3, en la que las
variables son como se describen en el presente documento, se puede
preparar por (1) desprotección de un compuesto de fórmula 22, en la
que Pg^{9} es un grupo protector de fosfato y X es como se
describe en el presente documento, en presencia de un agente de
desprotección en condiciones adecuadas, y (2) tratamiento del
compuesto resultante con una base de fórmula B^{2}, en la que
B^{2} es como se describe en el presente documento.
Un grupo protector de fosfato Pg^{9}
particular es el 2,2,2-tricloroetilo o similar. Una
base particular de fórmula B^{2} es trietilamina o similar. Un
agente de desprotección particular es polvo de Zn, o similar, en
presencia de una fuente de protones (p. ej., HCl) o similar. Las
condiciones particulares comprenden añadir gota a gota HCl 0,1 M o
similar, en THF (2-5 ml) o similar, en dos porciones
a lo largo de aproximadamente una hora a una solución o suspensión
agitada en THF o similar, del compuesto de fórmula 22
(aproximadamente 1 equiv.) y polvo de cinc (aproximadamente 12
equiv.) o similar, a aproximadamente 0ºC. La mezcla de reacción se
agita a aproximadamente 0ºC y se sigue por TLC hasta completarse.
Tras completarse, la mezcla de reacción se reparte entre Et_{2}O
o similar y HCl 1 N o similar, y se agita que el polvo de cinc o
similar, se ha disuelto completamente. Las capas se separan y la
capa acuosa se extrae con Et_{2}O (x3) o similar. Las capas de
Et_{2}O combinadas se secan con Na_{2}SO_{4} y se filtran. Se
añade trietilamina (1-3 ml) o similar y la capa
orgánica se concentra a vacío para dar el compuesto 3
(80-95%).
Un compuesto de fórmula 22, en la que las
variables son como se describen en el presente documento, se puede
preparar por acoplamiento de un compuesto de fórmula 23, en la que
L^{3} es un grupo saliente y Pg^{9} es como se describe en el
presente documento, con un lípido-alcohol de fórmula
24, en la que X es como se describe en el presente documento, en
condiciones adecuadas.
Un grupo -L^{3} particular es Cl o similar. Un
grupo Pg^{9} particular es el 2,2,2-tricloroetilo
o similar. Las condiciones particulares comprenden añadir el
compuesto de fórmula 23 (aproximadamente 1,5 equiv.) y
N,N-dimetilamino-piridina
(aproximadamente 0,2 equiv.) o similar, a una solución del
lípido-alcohol (aproximadamente 1 equiv.) o similar,
en CH_{2}Cl_{2} anhidro (aproximadamente 0,1 M) o similar. Se
añade gota a gota trietilamina (aproximadamente 3 equiv.) o
similar, y la reacción se agita a temperatura ambiente. Tras
completarse la reacción, puesto de manifiesto por TLC, la mezcla de
reacción se reparte entre CH_{2}Cl_{2} o similar y HCl 1 N o
similar. La capa acuosa se extrae con CH_{2}Cl_{2} (x3) o
similar. La capa orgánica se lava secuencialmente con H_{2}O y
salmuera o similar, se seca (Na_{2}SO_{4}) o similar, y se
concentra a vacío. El residuo se purifica por cromatografía
ultrarrápida en gel de sílice eluyendo con un gradiente de hexanos a
aproximadamente EtOAc al 10% en hexanos. La concentración de las
fracciones relevantes da el compuesto de fórmula 22 (aproximadamente
80 - aproximadamente 90%) en forma de un aceite incoloro.
Un compuesto de fórmula 4, en la que las
variables son como se describen en el presente documento, se puede
preparar por acoplamiento de un compuesto de fórmula 6 en la que B
es una base y las otras variables son como se describen en el
presente documento, con un agente activante de fórmula 5 en
condiciones adecuadas.
La reacción de acoplamiento inicialmente da un
diéster de fosfato intermedio, que emite CO_{2} para dar el
fosfato activado de fórmula 4. Un agente activante particular es la
CDI o similar. Un contraión base particular BH^{+} es
C_{5}H_{5}NH^{+} o similar. Las condiciones particulares
comprenden llevar a cabo la reacción en DMF/THF anhidro o similar,
durante aproximadamente 2 h. La activación electrófila del fosfato
anomérico por conversión al correspondiente derivado de
fosforimidazolato se describe en Fang, X., y col., Bioorg. Med.
Chem. Lett., 5, 2701 (1995).
Un compuesto de fórmula 6, en la que las
variables son como se describen en el presente documento, se puede
preparar por (1) eliminación de los grupos Pg^{6} de un compuesto
de fórmula 7, en la que las variables son como se describen en el
presente documento, en presencia de un agente de hidrogenación en
condiciones adecuadas, y (2) tratamiento del compuesto resultante
con una base de fórmula B para formar una sal de fosfato.
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Un grupo Pg^{6} particular es el bencilo o
similar. Un agente de hidrogenación particular es Pd/C o similar.
Las condiciones de hidrogenación particulares comprenden añadir el
compuesto 7 a una suspensión de Pd/C aproximadamente al 10% o
similar en un alcohol (preferiblemente metanol) o similar, enfriado
en un baño de hielo para ayudar a desgasificar la solución de la
reacción. Después la solución se calienta a temperatura ambiente y
se hidrogena a presión atmosférica durante aproximadamente 1,5 h.
Una base particular de fórmula B es piridina o similar.
Un compuesto de fórmula 7, en la que las
variables son como se describen en el presente documento, se puede
preparar por acoplamiento de un éster activado de fórmula 9, en la
que -OL es un grupo saliente y las otras variables son como se
describen en el presente documento, con un aminoácido/péptido de
fórmula 8, en la que P es como se describe en el presente
documento, en condiciones adecuadas.
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Un -OL particular es
N-oxisuccinimida o similar. Las condiciones
particulares comprenden disolver los compuestos de las fórmulas 8 y
9 junto con iPr_{2}NEt o similar, en DMF o similar, y agitar a
aproximadamente temperatura ambiente en argón o similar, durante 18
h.
Un compuesto de fórmula 8, en la que las
variables son como se describen en el presente documento, se prepara
por procedimientos sintéticos de péptidos convencionales conocidos
en la técnica.
Un éster activado de fórmula 9, en la que las
variables son como se describen en el presente documento, se puede
preparar por esterificación de un ácido de fórmula 11, en la que las
variables son como se describen en el presente documento, con un
compuesto de fórmula 10 en condiciones adecuadas.
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Un LOH particular es la
N-hidroxisuccinimida o similar. Las condiciones
particulares comprenden disolver el compuesto de fórmula 11, EDCI o
similar y N-hidroxisuccinimida o similar en DMF
anhidra o similar, y agitar durante 18 h.
Un ácido de fórmula 11, en la que las variables
son como se describen en el presente documento, se puede preparar
por eliminación del grupo Pg^{4} de un compuesto de fórmula 12, en
la que las variables son como se describen en el presente
documento, en presencia de un agente de desprotección de carboxi
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en condiciones adecuadas. La
desprotección del carboxi se lleva a cabo usando un agente de
desprotección adecuado que depende de la naturaleza del grupo
protector de carboxi, es decir, si se puede eliminar (lábil) en
condiciones ácidas, básicas o de hidrogenación, y de otros restos
reactivos en el compuesto que sufren desprotección, es decir, se
elige un agente de desprotección para llevar a cabo la desprotección
sin afectar a otros restos reactivos salvo que se desee una
reacción concomitante. Un grupo Pg^{4} particular es
-CH_{2}CH_{2}SO_{2}Ph o similar. Un agente de desprotección
particular es el DBU o similar. Las condiciones particulares
comprenden disolver el compuesto 12 en CH_{2}Cl_{2} o similar y
añadir gota a gota DBU o similar, en atmósfera de argón o
similar.
Un fosfotriéster de fórmula 12, en la que las
variables son como se describen en el presente documento, se pueden
preparar por (1) acoplamiento de un lactol de fórmula 13, en la que
las variables son como se describen en el presente documento, con
un compuesto de fórmula L^{2}P(OPg^{6})_{2}, en
la que L^{2} es un grupo saliente y las otras variables son como
se describen en el presente documento, en condiciones de
fosfitilación adecuadas y (2) oxidación del fosfito resultante a un
fosfato en presencia de un agente de oxidación en condiciones de
oxidación adecuadas.
Un compuesto particular de fórmula
L^{2}P(OPg^{6})_{2} es
Et_{2}NP(OBn)_{2} o similar. Las condiciones de
fosfitilación particulares comprenden la adición rápida de la
lactona en CH_{2}Cl_{2} anhidro o similar a una suspensión
vigorosamente agitada de tetrazol o similar y
Et_{2}NP(OBn)_{2} o similar en CH_{2}Cl_{2}
anhidro en atmósfera de argón a aproximadamente 25ºC. Un agente
oxidante particular es H_{2}O_{2} o similar. Las condiciones de
oxidación particulares comprenden disolver el fosfato en THF o
similar y enfriar a aproximadamente -80ºC. Después, se añade gota
a gota H_{2}O_{2} o similar a la solución vigorosamente agitada.
Tras completarse la adición, se quita el baño de hielo y la mezcla
se deja calentar a aproximadamente temperatura ambiente a lo largo
de aproximadamente 2 h. La secuencia de fosfitilación/acoplamiento
se describe, por ejemplo, en Wong, C.-H, y col., J. Am. Chem.
Soc. 115, 2260 (1993); Hitchcock, S. A., y col., J. Am. Chem.
Soc 120, 1916 (1998); y Walker, S., y col., J. Am. Chem.
Soc. 120, 2484 (1998).
Un lactol de fórmula 13, en la que las variables
son como se describen en el presente documento, se puede preparar
por eliminación del grupo Pg^{5} de un éter de bencilo anomérico
de fórmula 14, en la que las variables son como se describen en el
presente documento, en presencia de un agente de desprotección de
hidroxi en condiciones
adecuadas.
adecuadas.
Un grupo Pg^{5} particular es el bencilo o
similar. Un agente de desprotección de hidroxi particular es
H_{2}/(Pd/C) o similar. Las condiciones particulares comprenden
disolver el éter de bencilo en HCl/ácido acético o similar, y
añadir la solución resultante a una suspensión de Pd/C
aproximadamente al 10% o similar, en HCl/ácido acético o similar.
La mezcla de reacción se agita en una atmósfera de hidrógeno a
aproximadamente 25ºC durante 1,5 h.
De acuerdo con la presente invención, un
compuesto de fórmula 2, en la que las variables son como se
describen en el presente documento, se prepara por tratamiento del
compuesto de fórmula 6, en el que las variables son como se
describen en el presente documento, con un éster de fosfato activado
de fórmula 25, en la que las variables son como se describen en el
presente documento, en condiciones de acoplamiento adecuadas.
Un grupo -L^{1} particular es imidazolilo o
similar. Una base particular de fórmula B es piridina o similar.
Las condiciones particulares comprenden añadir
4,5-dicianoimidazol (3 equiv.) o similar a una
solución agitada de la sal de monopiridilo del fosfato de
disacárido (1 equiv.) y el lípido-fosfoimidazolato
(2 equiv.) en THF anhidro (0,1 M) o similar. La reacción se agita
durante 1-2 d hasta que se ha consumido toda la sal
de piridilo del fosfato de disacárido, puesto de manifiesto por
HPLC. Este procedimiento preferido se describe en Whitman and Wong,
Journal of Organic Chemistry, 62, no. 7, 2144 (1997).
Un compuesto de fórmula 25, en la que las
variables son como se describen en el presente documento, se puede
preparar por tratamiento de un compuesto de fórmula 3, en la que las
variables son como se describen en el presente documento, con un
agente activante de fórmula 5 en condiciones de acoplamiento
adecuadas.
Un agente activante particular es CDI o similar.
Una base particular de fórmula B^{2} es Et_{3}N o similar. Las
condiciones de acoplamiento particulares comprenden la adición de
CDI (1,05 equiv.) o similar a una solución agitada de la sal de
trietilamonio del fosfato del lípido (1 equiv.) en THF anhidro (0,1
M) o similar. Después la mezcla de reacción se agita durante toda
la noche.
El Lípido II, en el que A es como se describe en
el presente documento, se puede preparar por eliminación de los
grupos Pg^{0}, Pg^{3}, Pg^{7} y Pg^{8} de un compuesto de
fórmula 2a, en la que las variables son como se describen en el
presente documento, en presencia de
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un agente de desprotección en
condiciones adecuadas. Los grupos Pg^{0} y Pg^{3} particulares
son acetilo y similar. Un grupo Pg^{7} particular es
trifluoroacetilo o similar. Un grupo Pg^{8} particular es metilo
o similar. Un agente de desprotección particular es hidróxido sódico
acuoso o similar. Las condiciones particulares comprenden llevar a
cabo la desprotección en una solución de
1,4-dioxano:agua aproximadamente 1:1 o similar
mientras se agita durante aproximadamente 2 h. Se tiene que tener
cuidado cundo se expone el pentapéptido a las condiciones de
desprotección mediadas por ion hidróxido durante periodos de tiempo
sustancialmente más largos, puesto que se han observado
transposiciones catalizadas por base de isoglutamina a glutamina en
estructuras relacionadas con el peptidoglicano (véase, p. ej.,
Keglevic, D. and A. E. Derome, Carbohydrate Res., 186, 63
(1989); y Keglevic, D. and J. Kidric, J. Carbohydrate Res.,
11, 119
(1992)).
Un compuesto de fórmula 2a, en la que las
variables son como se describen en el presente documento, se puede
preparar por tratamiento de un fosfato activado de fórmula 4a, en la
que las variables son como se describen en el presente documento,
con un monofosfato de undecaprenilo de fórmula 3a, en la que B^{2}
es como se describe en el presente documento, en condiciones de
acoplamiento adecuadas.
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Un -L^{1} particular es imidazolilo o similar.
Un compuesto particular de fórmula 3a es monofosfato de
undecaprenilo (sal de bis-NH_{4}^{+}). Las
condiciones particulares comprenden exponer el fosfato activado al
monofosfato de undecaprenilo (sal de
bis-NH_{4}^{+}) en presencia de
1H-tetrazol o similar, a lo largo de aproximadamente 4 días
en DMF/THF o similar, en atmósfera de argón o similar.
Un compuesto de fórmula 4a, en la que las
variables son como se describen en el presente documento, se puede
preparar por acoplamiento de un compuesto de fórmula 6a, en la que
las variables son como se describen en el presente documento, con
un agente activante de fórmula 5 en condiciones adecuadas.
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La reacción de acoplamiento inicialmente forma
un diéster de fosfato intermedio, que emite CO_{2} para dar el
fosfato activado de fórmula 4a. Un agente activante particular es
CDI o similar. Un contraión base particular BH^{+} es
C_{5}H_{5}NH^{+} o similar. Las condiciones particulares
comprenden llevar a cabo la reacción en DMF/THF anhidro o similar,
durante aproximadamente 2 h. La activación electrófila del fosfato
anomérico por conversión al correspondiente derivado de
fosforimidazolato se describe en Fang, X., y col., Bioorg. Med.
Chem. Lett., 5, 2701 (1995).
Un compuesto de fórmula 6a, en la que las
variables son como se describen en el presente documento, se puede
preparar por (1) eliminación de los grupos Pg^{6} de un compuesto
de fórmula 7a, en la que las variables son como se describen en el
presente documento, en presencia de un agente de hidrogenación en
condiciones adecuadas, y (2) tratamiento del compuesto resultante
con una base de fórmula B para formar una sal de fosfato.
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Un grupo Pg^{6} particular es bencilo o
similar. Un agente de hidrogenación particular es Pd/C o similar.
Las condiciones de hidrogenación particulares comprenden añadir el
compuesto de fórmula 7a a una suspensión de Pd/C aproximadamente al
10% o similar, en alcohol (preferiblemente metanol) o similar,
enfriado en un baño de hielo para ayudar a desgasificar la
solución. Después la solución se calienta a aproximadamente
temperatura ambiente y se hidrogena a presión atmosférica durante
aproximadamente 1,5 h. Una base particular de fórmula B es la
piridina o similar.
Un compuesto de fórmula 7a, en la que las
variables son como se describen en el presente documento, se puede
preparar por acoplamiento de un éster activado de fórmula 9a, en la
que las variables son como se describen en el presente documento,
con un péptido de fórmula 8a, en la que las variables son como se
describen en el presente documento, en condiciones adecuadas.
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Un grupo -OL particular es la
N-oxisuccinimida o similar. Las condiciones
particulares comprenden disolver los compuestos de fórmulas 8a y 9a
junto con iPr_{2}NEt o similar, en DMF o similar, y agitar a
temperatura ambiente en atmósfera de argón o similar, durante
aproximadamente 18 h. No hay pruebas de la epimerización del
estereocentro \alpha de la L-Ala durante el
transcurso de la secuencia de activación de
carboxilo-acoplamiento de péptido.
Un compuesto de fórmula 8a, en la que las
variables son como se describen en el presente documento, se prepara
por procedimientos sintéticos de péptidos convencionales conocidos
en la materia.
De acuerdo con la presente invención, un
compuesto de fórmula 2a, en la que las variables son como se
describen en el presente documento, se prepara por tratamiento de
un compuesto de fórmula 6a, en la que las variables son como se
describen en el presente documento, con un éster de fosfato activado
de fórmula 25a, en la que las variables son como se describen en el
presente documento, en condiciones de acoplamiento adecuadas.
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Un grupo -L^{1} particular es imidazolilo o
particular. Una base particular de fórmula B es piridina o similar.
Las condiciones particulares comprenden añadir
4,5-dicianoimidazol (3 equiv.) a una solución
agitada de la sal de monopiridilo del fosfato de disacárido (1
equiv.) y el lípido-fosfoimidazolato (2 equiv.) en
THF anhidro (0,1 M) o similar. La reacción se agita durante
1-2 d hasta que se ha consumido toda la sal de
piridilo del fosfato de disacárido, puesto de manifiesto por HPLC.
El procedimiento preferido se describe en Whitman and Wong,
Journal of Organic Chemistry, 62, no. 7, 2144 (1997).
Un compuesto de fórmula 25a, en la que las
variables son como se describen en el presente documento, se puede
preparar por tratamiento de un compuesto de fórmula 3a, en la que
las variables son como se describen en el presente documento, con
un agente activante de fórmula 5 en condiciones de acoplamiento
adecuadas.
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Un agente activante particular es CDI o similar.
Una base particular de fórmula B^{2} es trietilamonio o similar.
Las condiciones de acoplamiento particulares comprenden la adición
de CDI (1,05 equiv.) a una solución agitada de la sal de
trietilamonio del fosfato del lípido (1 equiv.) en THF anhidro (0,1
M) o similar. Después la mezcla de reacción se agita durante toda
la noche.
Un compuesto de fórmula 14, en la que las
variables son como se describen en el presente documento, se puede
preparar por intercambio del grupo Pg^{2} de un compuesto de
fórmula 15, en la que las variables son como se describen en el
presente documento, con un grupo acetilo en presencia de
un agente de desprotección de amina
y un agente de acilación en condiciones adecuadas. La desprotección
de amina se lleva a cabo usando un agente de desprotección adecuado
que depende de la naturaleza del grupo protector de amina, es
decir, si se puede eliminar (lábil) en condiciones ácidas, básicas o
de hidrogenación, y si otros restos reactivos en el compuesto
sufren desprotección, es decir, se elige un agente de desprotección
para llevar a cabo la desprotección sin afectar a los otros restos
reactivos salvo que se desee una reacción concomitante. Un grupo
protector de amina particular es el
2,2,2-tricloroetoxicarbonilo o similar. Un agente de
desprotección particular es el polvo de Zn o similar, en presencia
de una fuente de protones (p. ej., ácido acético) o similar. Un
agente de acilación particular es el anhídrido acético o similar.
Las condiciones particulares incluyen añadir polvo de Zn o similar,
y una mezcla de THF:Ac_{2}O:AcOH 3:2:1 a una solución del
compuesto de fórmula 8 en una mezcla de Ac_{2}O:AcOH
aproximadamente 2:1 o
similar.
Un compuesto de fórmula 15, en la que las
variables son como se describen en el presente documento, se puede
preparar por intercambio del grupo Pg^{1} de un compuesto de
fórmula 16, en la que las variables son como se describen en el
presente documento, con un grupo Pg^{3} en presencia de
un agente de solvolisis y agente de
acilación en condiciones adecuadas. La solvolisis se lleva a cabo
usando un agente de solvolisis adecuado que depende de la
naturaleza del grupo protector de hidroxi, es decir, se elige un
agente de solvolisis para llevar a cabo la solvolisis sin afectar a
los otros restos reactivos salvo que se desee una reacción
concomitante. Un grupo protector de hidroxi particular es el bencilo
o similar. Un grupo protector de hidroxi particular es bencilo o
similar. Un agente de solvolisis particular es ZnCl_{2} o
similar. Un agente de acilación particular es el anhídrido acético o
similar. Las condiciones particulares incluyen llevar a cabo la
solvolisis/acilación en una mezcla de Ac_{2}O:AcOH aproximadamente
2:1 o
similar.
La síntesis de un compuesto de fórmula 16, el
núcleo de disacárido central, en forma ortogonalmente protegida
presenta un reto sintético importante. Por ejemplo, es muy
conveniente la identificación de un esquema de protección que tenga
triple ortogonalidad para llevar a cabo el desenmascaramiento
selectivo de los tres tipos de grupos hidroxilo colgantes (es
decir, OH anomérico, OH periférico u OH carboxílico). Además, se
espera que la construcción estereoselectiva de una unión
\beta-[1,4]-glicosídica sea difícil
independientemente del procedimiento usado para generar un dador de
catión glicosilo reactivo. Por ejemplo, con respecto al catión
glicosilo, cada una de las siguientes propiedades inherentes
contribuye a una pérdida de reactividad del aceptor de catión
glicosilo; (i) la falta intrínseca de nucleofilicidad del grupo
C(4)-hidroxilo de los aceptores basados en
glucopiranosa, (ii) el impedimento estérico adicional entorno al
C(4)-hidroxilo de los aceptores basados en
ácido murámico, y (iii) la desactivación electrónica adicional de
los aceptores
2-desoxi-2-acilaminoglucopiranosa
respecto a sus homólogos basados en glucopiranosa. Con respecto al
dador de catión glicosilo, era necesario un procedimiento de
activación con un predisposición hacia la formación de una unión
\beta-[1,4]-glicosídica. También era necesario
que las condiciones de reacción para la generación del catión
glicosilo fueran compatibles con los grupos funcionales que se
encontraban tanto en el dador como el aceptor.
Un compuesto de fórmula 16, en la que las
variables son como se describen en el presente documento, se puede
preparar por acoplamiento de un compuesto de muramilamida de fórmula
17, en la que A^{1} es Br o Cl (preferiblemente Br) y las otras
variables son como se describen en el presente documento,
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con un compuesto de glucopiranosilo
de fórmula 17, en la que las variables son como se describen en el
presente documento, en condiciones adecuadas. Las condiciones
particulares incluyen llevar a cabo la reacción de acoplamiento en
condiciones de Konigs-Knorr escrupulosamente
anhidras (p. ej., en una solución de triflato de plata/diclorometano
que incluye tamices moleculares) o
similar.
Un compuesto de fórmula 17 se prepara de acuerdo
con los procedimientos descritos en Imoto, M., Bull. Chem. Soc.
Jpn., 60, 2205 (1987).
Un compuesto de fórmula 18, en la que las
variables son como se describen en el presente documento, se puede
preparar por acoplamiento de un ácido de fórmula 20, en la que las
variables son como se describen en el presente documento,
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con un compuesto aminoácido/péptido
protegido de fórmula 19, en la que las variables son como se
describen en el presente documento, en condiciones adecuadas. Las
condiciones particulares comprenden llevar a cabo la reacción de
acoplamiento en una solución de NMM o similar, y
2-cloro-4,6-dimetoxi-1,3,5-triazina
o similar, en CH_{2}Cl_{2} o similar, en el que el compuesto 19
se añade en forma de la sal de tosilato o
similar.
Un compuesto de fórmula 18a, en la que Pg^{1}
es bencilo y las otras variables son como se describen en el
presente documento, se puede preparar por tratamiento de un
compuesto de fórmula 21, en la que las variables son como se
describen en el presente documento,
con un agente de reducción en
condiciones adecuadas. Un agente de reducción particular es el
trietilsilano o similar. Las condiciones particulares incluyen
llevar a cabo la reducción en CH_{2}Cl_{2} o similar, y TFA o
similar, aproximadamente a 0ºC. Esta reacción proporciona medios
eficaces para la introducción regioselectiva de protección de
bencilo/activación en el C(6)OH del derivado del ácido
murámico.
Se sabe que cuando un derivado de éster de un
compuesto de fórmula 21 se trata con ácido trifluoroacético y
trietilsilano como se describe en DeNinno, M.P., y col.,
Tetrahedron Lett., 36, 669 (1995), se observa sólo una
pequeña cantidad del compuesto análogo de fórmula 18a. El producto
mayoritario formado es la lactona, como se muestra en el esquema
I.
Esquema
I
La lactonización catalizada por ácido se
desarrolla a una velocidad competitiva con la apertura reductora
del anillo, conduciendo así a la lactona no deseada. Sin embargo, en
la presente invención la introducción de un enlace amida en lugar
del enlace éster elimina la conversión de la lactona, permitiendo
así aislar el producto deseado (compuesto 18a) con rendimientos
mucho mayores.
Un compuesto de fórmula 21, en la que las
variables son como se describen en el presente documento, se puede
preparar por acoplamiento de un ácido de fórmula 20a, en la que las
variables son como se describen en el presente documento,
con un aminoácido protegido de
fórmula 19, en la que las variables son como se describen en el
presente documento, en condiciones adecuadas. Las condiciones
particulares comprenden llevar a cabo la reacción de acoplamiento
en una solución de NMM o similar, y
2-cloro-4,5-dimetoxi-1,3,5-triazina
o similar, en CH_{2}Cl_{2} o similar, en el que el aminoácido
protegido se añade en forma de la sal de tosilato o
similar.
Las reacciones se llevan a cabo con agitación
continua con presión de nitrógeno positiva excepto cuando se
indique. Los reactivos y disolventes se adquieren y se usan sin más
purificación. La TLC se lleva a cabo usando placas de gel de sílice
60 de 0,25 mm con un indicador fluorescente a 254 nm de E. Merck.
Las placas se desarrollan en una cámara cubierta y se visualizan
por luz ultravioleta o por tratamiento con ácido fosfomolíbdico al
5% (o alternativamente CAM) en etanol seguido de calentamiento. La
cromatografía ultrarrápida se lleva a cabo en gel de sílice 60, nº
de malla 230-400 (tamaño de partículas
0,040-0,063) adquirido en EM Science. Los análisis
y purificaciones por HPLC se llevan a cabo usando columnas Dynamax
C8 con el sistema de disolventes y caudal especificados. Los
espectros de RMN se dan como desplazamientos químicos en partes por
millón (ppm) a campo bajo del patrón interno tetrametilsilano (0
ppm). Los espectros de RMN ^{1}H se registran en el disolvente
indicado en un espectrómetro Bruker Avance a 500,18 MHz, un
espectrómetro Varian Mercury a 400,21 MHz o un espectrómetro GE
QE-300 a 300,15 MHz. Los espectros de RMN ^{13}C
se registran en los disolventes indicados en los espectrómetros
previamente mencionados a 127,78 MHz, 100,15 MHz y 75,48 MHz,
respectivamente. Los espectros de IR se registran en un
espetrómetro FT-IR Nicolet 510P; los espectros de
masas de ionización por electropulverización
(EM-ESI) se registran en un espectrómetro Micromass
Platform LCZ. Los espectros de masas de alta resolución se
registran en un espectrómetro de masas Micromass QTOF.
En el esquema II se indica un procedimiento
sintético para preparar el material de partida el disacárido
NAG-NAM y se ilustra a continuación.
Esquema
II
Una mezcla de (L)-alanina (15,0
g, 168 mmol); fenilsulfonil-etanol (37,6 g, 202
mmol) y TsOH.H_{2}O (35,2 g, 185 mmol) en benceno (750 ml) se
calienta a reflujo usando un aparato Dean-Stark.
Después de 16 h se añaden fenilsulfonil-etanol (25
g, 135 mmol) y TsOH\cdotH_{2}O (25 g, 134 mmol) adicionales
junto con benceno (180 ml), y la mezcla de reacción se calienta a
reflujo durante toda la noche. La concentración a vacío da el
producto, compuesto i, con rendimiento cuantitativo en forma de un
sólido blanco.
Análisis (compuesto i): RMN ^{1}H
(DMSO-d_{6} 300 MHz) \delta 8,25 (s ancho, impurezas,
TsOH), 7,94-7,88 (m, 2H), 7,81-7,74
(q, J= 6,2 Hz, 1H), 7,71-7,62 (m, 2H), 7,49
(d, J= 8,1 Hz, 1H), 7,12 (d, J= 8,1 Hz, 1H), 5,39 (s
ancho, 2H), 4,52-4,44 (m, 1H),
4,41-4,33 (m, 1H), 3,90-3,82 (m,
1H), 3,78 (t, J= 5,5 Hz, 2H), 3,67 (t, J= 6,2 Hz, 1H), 3,44
(t, J= 6,6 Hz, 1H), 2,29 (s, 3H + impurezas, TsOH), 1,20 (d,
J= 7,3 Hz, 3H). RMN ^{13}C (DMSO-d_{6}, 75 MHz)
\delta 169,5, 145,5, 139,3, 137,7, 134,1, 133,6, 129,5, 129,3,
128,0, 127,7, 127,6, 125,5, 58,9, 57,5, 54,9, 53,6, 47,7, 20,7,
15,2; EM (ESI) m/z 258,1 (100%,
M-TsOH-H); IR (KBr) \nu_{max}
3424 (ancho), 2927 (ancho), 1745 (m), 1309 (m), 1224 (m), 1195 (m),
1147 (f), 1124 (m), 1087(m), 1007 (m) cm^{-1}; Anal. Calc.
para C_{18}H_{25}NO_{4}S: C, 50,10; H, 5,84; N, 3,25; S,
14,86. Encontrado: C, 48,49; H, 5,31; N, 2,56; S, 14,72.
A una suspensión de ácido
bencil-N-acetil-4,6-bencilidin-murámico
(20,0 g, 42,5 mmol) en CH_{2}Cl_{2} (300 ml) a 0ºC se añade
N-metilmorfolina (NMM) (4,67 ml, 42,5 mmol) y
2-cloro-4,6-dimetoxi-1,3,5-triazina
(8,94 g, 51,0 mmol). Después de agitar durante 45 min a 0ºC, se
añaden CH_{2}Cl_{2} (300 ml) seguido de NMM (9,34 ml, 83,0
mmol) y L-alanina(éster de fenilsulfoniletilo, sal
de tosilato) (15,4 g, 51,0 mmol) (es decir, compuesto i) a la
mezcla de reacción anterior. La solución resultante se calienta
lentamente a temperatura ambiente y se agita durante 3 días.
Después la mezcla de reacción se filtra. El filtrado se lava primero
con HCl 1 N y después con salmuera, y se seca (MgSO_{4}). Después
el filtrado se concentra a presión reducida, se evapora con tolueno
(x2) y se seca a vacío durante toda la noche para dar el producto,
compuesto ii (23,5 g, 95%) en forma de un sólido blanco.
Análisis (compuesto ii): RMN ^{1}H
(CDCl_{3}, 400 MHz) \delta 7,44 (d, J= 3,0 Hz, 2H), 7,35
(m, 8H), 6,95 (d, J= 6Hz, 1H), 6,15 (d, J= 6,0 Hz,
1H), 5,85 (m, 1H), 5,47 (s, 1H), 5,21 (dd, J= 3,0, 12,0 Hz,
1H), 5,30 (dd, J= 3,0,15,0 Hz, 1H), 4,90 (d, J= 3,0Hz,
1H), 4,72 (d, J = 12,0Hz, 1H), 4,60 (m, 2H), 4,42 (m, 2H),
4,30-4,20 (m, 2H), 4,15 (q, J = 3,0 Hz, 1H),
4,00 (q, J= 3,0 Hz, 1H), 3,82 (m, 1H), 3,75 (d, J=
9,0Hz, 1H), 3,65 (m, 1H), 1,93 (s, 3H), 1,43 (d, J = 3,0, 9,0
Hz, 3H), 1,38 (d, J = 3,0, 9,0 Hz, 3H); RMN ^{13}C
(CDCl_{3}, 75 MHz) \delta 173,2, 172,2, 170,6, 131,6, 129,0,
128,9, 128,4, 128,3, 125,9, 101,4, 97,5, 81,7, 78,3, 76,6, 75,6,
75,1, 70,1, 68,9, 65,8, 64,1, 63,2, 55,3, 53,2, 48,1, 23,0, 17,4,
17,8. EM (ESI) m/z 583,2 (86%, M+H), 581,3 (100%,
M-H); IR \nu_{max} (CHCl_{3}) 3010(m),
1740(m), 1681(f), 1616(m), 1569(f),
1523(m), 1470(m), 1377(f), 1333(m),
1119(m), 1090(m) cm^{-1}; Anal. Calc. para
C_{31}H_{38}N_{2}O_{9}: C, 63,90; H, 6,57; N, 4,81.
Encontrado: C, 63,78; H, 6,55; N, 4,89.
Se añade trietilsilano (16,4 ml, 103 mmol) a una
solución del compuesto ii (12,0 g, 20,6 mmol) en CH_{2}Cl_{2}
(150 ml) a 0ºC, seguido de la adición gota a gota de TFA (8,1 ml,
103 mmol). La mezcla se deja agitar durante 5 h, después de lo cual
se añaden gota a gota 3 equivalentes adicionales de TFA (5,0 ml), y
se agita a 0ºC durante toda la noche. Tras completarse la reacción,
puesto de manifiesto por TLC (EtOAc), la mezcla de reacción se
diluye con CH_{2}Cl_{2}, y después se añade lentamente
NaHCO_{3} para neutralizar el TFA. La capa acuosa se extrae con
CH_{2}Cl_{2}. La capa orgánica se lava con salmuera (x2),
después se seca (MgSO_{4}) y se concentra a vacío. La
purificación por CL-prep (eluyendo con EtOAc:hexano
70:30 a EtOAc), seguido de recristalización en CH_{2}Cl_{2} y
éter isopropílico da el producto, compuesto iii, (7,4 g, 61%) en
forma de un sólido blanco.
Análisis (compuesto iii): RMN ^{1}H
(CDCl_{3}, 300 MHz) \delta 7,38-7,26 (m, 10H),
6,99 (d, J= 7,3 Hz, 1H), 6,16 (d, J= 8,8Hz, 1H),
5,94-5,81 (m, 1H), 5,30 (dd, J= 1,1, 17,2 Hz,
1H), 5,22 (dd, J= 1,1, 10,6 Hz, 1H), 4,92 (d, J = 3,7 Hz,
2H), 4,68 (t, J= 11,7 Hz, 1H), 4,59 (d, J= 7,7 Hz,
4H), 4,49 (q, J= 6,2 Hz, 1H), 4,46 (dd, J= 2,2, 11,7
Hz, 2H), 4,21 (dq, J= 3,7, 9,9 Hz, 1H), 4,17 (q, J=
7,0 Hz, 1H), 3,83-3,75 (m, 1H), 3,71 (t, J=
5,1 Hz, 1H), 3,68-3,65 (m, 1H), 3,54 (t, J=
10,2 Hz, 1H), 1,89 (s, 3H), 1,44 (d, J= 7,0 Hz, 3H), 1,40
(d, J= 7,0 Hz, 3H); RMN ^{13}C (CDCl_{3}, 75 MHz)
\delta 173,0, 1,72,3, 170,3, 167,7, 137,8, 137,1, 131,7, 128,6,
128,5, 128,1, 127,8, 127,7, 118,5, 97,1, 80,5, 77,7, 73,7, 71,6,
70,5, 70,2, 69,8, 65,8, 55,1, 52,5, 48,0, 24,5, 23,3, 19,2, 17,7; EM
(ESI) m/z 585,2 (100%, M+H), 583,2 (100%, M-H); IR
\nu_{max} (CHCl_{3}) 3433(m), 3010(m),
1741(m), 1677(f), 1522 (m), 1454(m), 1124 (m),
1058 (m) cm^{-1}; Anal. Calc. para C_{31}H_{40}N_{2}O_{9}:
C, 63,68; H, 6,90; N, 4,79; Encontrado: C, 63,67; H, 6,58; N,
4,83.
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El compuesto iv se prepara usando los
procedimientos descritos en Imoto, M., Bull. Chem. Soc. Jpn.,
60, 2205 (1987).
A una solución del compuesto iii (4,59 g, 6,43
mmol) en CH_{2}Cl_{2} (30 ml) se añaden tamices moleculares de
4\ring{A} (10 g) y triflato de plata (5,12 g, 20,0 mmol). A esta
mezcla se añade una solución recién preparada del compuesto iv
(10,8 g, 20,0 mmol) en CH_{2}Cl_{2} (9,5 ml) en cuatro porciones
a lo largo de un periodo de 1 h. Cada uno de los materiales de
partida se seca antes de usarlo, y la reacción se lleva a cabo en
condiciones anhidras controladas. Después de agitar a temperatura
ambiente durante 24 h, la mezcla de reacción se filtra a través de
Celita y se lava con CH_{2}Cl_{2}. La capa orgánica se lava con
NaHCO_{3}, salmuera, se seca (Na_{2}SO_{4}) y se concentra a
vacío. La purificación por cromatografía en columna en sílice
(sistema Flash Elute) usando un gradiente de disolvente de hexano
al 50% en EtOAc, hexano al 15% en EtOAc, EtOAc, y MeOH al 5% en
EtOAc, da el producto, compuesto v (5,73 g, 76%) en forma de un
sólido blanco, junto con material de partida sin reaccionar,
compuesto iii (630 mg, 14%).
Análisis (compuesto v): RMN ^{1}H
(CDCl_{3}, 300 MHz) \delta 7,91 (d, J= 7,0 Hz, 2H), 7,66
(t, J= 7,3 Hz, 1H),7,58-7,50 (m, 4H),
7,45 (t, J= 7,3 Hz, 2H), 7,33-7,26 (m, 6H),
6,83 (d, J= 7,3 Hz, 1H), 6,52 (d, J= 7,0 Hz, 1H),
5,09 (d, J= 2,9 Hz, 1H), 4,97 (t, J= 9,5 Hz, 1H), 4,87
(d, J= 12,1 Hz, 1H), 4,79-4,73 (m, 2H), 4,60
(dd, J= 7,3, 12,1 Hz, 2H), 4,53-4,29 (m, 5H),
4,26-4,04 (m, 7H), 4,00-3,88 (m,
2H), 3,70-3,50 (m, 4H), 3,42 (t, J= 10,6 Hz,
4H), 2,03 (s, 3H), 1,98 (s, 6H), 1,89 (s, 3H), 1,34 (d, J=
6,6 Hz, 3H), 1,24 (d, J= 7,3 Hz, 3H); RMN ^{13}C
(CDCl_{3}, 75 MHz) \delta 173,4, 171,8, 170,6, 170,3, 169,4,
154,1, 137,3, 134,0, 129,4,129,1, 128,5, 128,1, 100,0, 97,1, 96,9,
77,4, 77,0, 76,6, 75,7, 74,5, 73,8, 72,2, 71,2, 70,4, 70,3, 68,3,
67,2, 61,5, 58,1, 26,2, 54,9, 53,6, 47,7, 23,2, 20,6, 18,3, 17,5;
EM (FAB) m/z 1176,3 (73%, M+H), (ESI) m/z 1174,5 (62%,
M-H) IR (KBr) \nu_{max} 3385(ancho),
3067(d), 2939(d), 1753(f), 1669(m),
1537(m), 1233(f), 1145(m), 1045(f)
cm^{-1}; UV-vis (95% EtOH) \lambda_{max} 264
(1223,11) nm; Anal. Calc. para
C_{51}H_{64}Cl_{3}N_{3}O_{20}S : C, 52,02; H, 5,48; N,
3,57; S, 2,72; Cl, 9,03. Encontrado: C, 51,72; H, 5,40; N, 3,64; S,
2,72; Cl, 9,07.
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A una solución del compuesto v (1,9 g, 1,57
mmol) en Ac_{2}O:AcOH (2:1, 11 ml) se añade una solución de
ZnCl_{2} (2,1 g, 15,7 mmol) en Ac_{2}O:AcOH (2:1,5 ml) en una
porción. Tras completarse la reacción (24 h), evaluado por TLC
(EtOAc), se elimina el Troc por adición de polvo de Zn (4,1 g, 62,8
mmol) y una mezcla de TFA:Ac_{2}O:AcOH (3:2:1, 25 ml) a la mezcla
de reacción anterior y se agita hasta que no se observa material de
partida por TLC (EtOAc). La mezcla de reacción se filtra a través de
Celita, se lava con EtOAc, y después se concentra a presión
reducida. El residuo se evapora repetidamente con tolueno para
separar cualquier Ac_{2}O y AcOH restante, y después se diluye
con EtOAc. La capa orgánica se lava con NaHCO_{3} (x2), H_{2}O
(x2) y salmuera. Después la capa orgánica se seca
(Na_{2}SO_{4}) y se concentra a vacío. La purificación por
cromatografía en columna en sílice (sistema Flash Elute) eluyendo
con MeOH en EtOAc al 2% da el producto, compuesto vi (1,0 g, 67%)
en forma de un sólido
blanco.
blanco.
Análisis (compuesto vi): RMN ^{1}H
(CDCl_{3}, 300 MHz) \delta 7,89 (d, J= 7,0 Hz, 2H), 7,66
(t, J= 7,3 Hz, 1H), 7,56 (t, J= 7,7 Hz, 2H),
7,34-7,23 (m, 6H), 7,16 (d, J= 7,7 Hz, 1H),
6,88 (d, J= 7,0 Hz, 1H), 6,12 (d, J= 9,5 Hz, 1H),
5,12-5,07 (m, 3H), 4,56 (dd, J= 12,1, 40,0
Hz, 2H), 4,45 (d, J= 9,0 Hz, 1H), 4,39 (d, J= 8,4 Hz,
1H), 4,35-4,23 (m, 4H), 4,17 (d, J= 12,0 Hz,
2H), 4,09-3,95 (m, 3H), 3,78 (d, J= 5,5 Hz,
2H), 3,60-3,48 (m, 3H), 3,41-3,30
(m, 2H), 2,12 (s, 3H), 2,01 (s, 3H), 2,00 (s, 3H), 1,99 (s, 3H),
1,94 (s, 3H), 1,92 (s, 3H), 1,38 (d, J= 6,6 Hz, 3H), 1,28 (d,
J= 7,3 Hz, 3H); RMN ^{13}C (CDCl_{3}, 75 MHz) \delta
173,8, 171,9, 171,2, 170,9, 170,8, 170,6, 169,3, 139,2, 137,3,
134,1, 129,4, 128,9, 128,5, 128,1, 128,0, 127,8, 100,2, 96,9, 77,1,
76,6, 75,9, 75,6, 72,5, 71,8, 70,2, 69,5, 68,2, 62,3, 61,6, 58,0,
54,9, 54,6, 53,6, 47,8, 23,2, 23,1, 20,9, 20,6, 18,4, 17,3; EM (ESI)
m/z 994,7 (100%, M-H); IR (KBr) \nu_{max}
3384(ancho), 3301(ancho), 3068(d),
2939(d), 1748(f), 1670 (f), 1540(m),
1372(m), 1236(f), 1144(m), 1041(f)
cm^{-1}; Anal. Calc. para C_{45}H_{61}N_{3}O_{20}S: C,
54,26; H, 6,17; N, 4,22; S, 3,22. Encontrado: C, 53,96; H, 5,78; N,
4,17; S,
3,09.
3,09.
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Una solución de
Z-D-Glu(O-t-Bu)-OH
(5,00 g, 14,82 mmol de compuesto vii), clorhidrato de
1-(3-dimetilaminopropil)-3-etil-carbodiimida
(2,85 g, 14,87 mmol), y N-hidroxisuccinimida (1,71
g, 14,86 mmol) en 1,4-dioxano (60 ml) y
N,N-dimetilformamida (10 ml) se agita durante 6 h
en atmósfera de N_{2}. Se añade hidróxido de amonio (0,7 ml, 17,78
mmol), después la solución se agita 16 h y se concentra a vacío. El
aceite obtenido se reparte entre acetato de etilo (200 ml) y
salmuera (200 ml). La capa orgánica se seca sobre sulfato sódico, se
filtra y se concentra a vacío hasta un sólido. El sólido se
cromatografía en gel de sílice ultrarrápida (acetato de
etilo:hexanos - 1:1) para dar
Cbz-D-iGln(O^{t}Bu) (3,2 g,
64% de rendimiento del compuesto viii) en forma de un sólido
blanco.
Análisis (compuesto viii): p.f.
134-135ºC. IR (CHCl_{3}) 2985, 1717, 1695, 1155
cm^{-1}; RMN ^{1}H (DMSO-d_{6}, 300 MHz)
\delta 7,35 (s, 5H), 7,30 (s ancho, 1H), 5,02 (s, 2H), 3,94 (m,
1H), 2,22 (t, J= 7,7 Hz, 2H), 1,86 (m, 1H), 1,69 (m, 1H), 1,38 (s,
9H); EM (ESI) m/z 337 (80%, M+H); Anal. Calc. para
C_{17}H_{24}N_{20}5: C, 60,70; H, 7,19; N, 8,33. Encontrado
C, 60,41; H, 7,15; N, 8,16.
Se añade ácido trifluoroacético (25 ml) a una
solución de
Cbz-D-iGln(O^{t}Bu) (3,20
g, 9,52 mmol del compuesto viii) en cloruro de metileno (25 ml) y
la mezcla se agita durante 3 h en atmósfera de N_{2}. La solución
se evapora para dar un sólido blanco, se filtra con ayuda de éter
etílico y se seca con alto vacío para proporcionar
Cbz-D-iGln homogéneo (2,2 g, 82% de
rendimiento del compuesto ix).
Análisis (compuesto ix): p.f.
174-176ºC. IR (KBr) 3314, 1699, 1658, 1254
cm^{-1}; RMN ^{1}H (DMSO-d_{6}, 300 MHz) \delta 7,35
(s, 5H), 7,31 (s, 1H), 7,01 (s, 1H), 5,02 (s, 2H), 3,93 (m, 1H),
2,25 (t, J= 8,0 Hz, 2H), 1,92 (m, 1H), 1,73 (m, 1H); EM
(ESI) m/z 281 (100%, M+H); Anal. Calc. para
C_{13}H_{16}N_{2}O_{5}\cdot0,25H_{2}O; C, 54,83; H,
5,79; N, 9,84. Encontrado C, 55,12; H, 5,53; N, 9,88.
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Se disuelve
Cbz-D-Ala-D-Ala
(1,20 g, 3,9 mM del compuesto x, disponible en Advanced Chem Tech.,
Louisville, KY) en 10 ml de metanol y se añade a una suspensión de
500 mg de Pd(OH)_{2} en 15 ml de metanol que
contiene 0,3 ml de TFA (3,9 mM). La mezcla se agita vigorosamente
en una atmósfera de hidrógeno (presión con balón) durante 2 h, se
filtra a través de talco, se concentra a vacío y el compuesto xi
resultante (la sal de TFA de
D-Ala-D-Ala) se
almacena a vacío. Por separado se disuelven
N\alpha-Boc-N\gamma-(TFA)-L-Lisina
(1,40 g, 4 mM de compuesto xii, disponible en Bachem, Torrance, CA)
y 830 mg de DCC (4,0 mM) en 15 ml de THF seco y se agitan a 0ºC
durante 3 h. Después se añade N-hidroxisuccinimida
(460 mg, 4,0 mM), después de lo cual el matraz se deja calentar a
temperatura ambiente y se agita durante una hora adicional para dar
el compuesto xiii, el éster activado con NHS del compuesto xii.
Después la mezcla de reacción se filtra directamente en un matraz
que contiene el compuesto xi, seguido de la adición de 1,4 ml de
diisopropiletilamina (0,8 mM). Después de 30 minutos, la mezcla de
reacción se concentra a vacío, se disuelve en acetato de etilo, se
lava con solución acuosa saturada de NaHCO_{3} y agua, se seca
con MgSO_{4} y después se concentra a vacío hasta una espuma
blanca (1,4 g, 2,8 mM, 72% de rendimiento del compuesto xiv). El
material aislado se usó en la siguiente etapa sin más
purificación.
Análisis (compuesto xiv): ^{1}H
(CDCl_{3}): \delta 1,37 (d. 3H, J= 7,5 Hz). 1,39
(d, 3H, J = 7,2 Hz) 1,4 (s, 9H), 1,75 (m, 6H), 3,35 (t, 2H,
J = 6,3 Hz), 3,75 (s, 3H), 4,15 (m, 1H), 4,48 (m, 2H), 5,1
(d, 1H), 6,67 (d, 1H), 6,78 (d, 1H). EM (FD^{+}): 499. EA calc.
para C_{20}H_{33}F_{3}N_{4}O_{7}; C, 48,2; H, 6,7; N,
11,2 Encontrado: C, 47,9; H, 6,5; N, 11,1.
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(Esquema pasa a página
siguiente)
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Se añade ácido trifluoroacético (10 ml) a una
solución del compuesto xiv (2,5 g, 5,0 mmol) en cloruro de metileno
(10 ml) y la mezcla se agita durante 2,5 h. La solución se concentra
a vacío y se seca con alto vacío para proporcionar el compuesto xv,
la sal de trifluoroacetato del compuesto xiv, en forma de un aceite.
Por separado, se añaden clorhidrato de
1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida
(1,88 g, 9,81 mmol) y N-hidroxisuccinimida (1,13 g,
9,81 mmol) a una solución de
Cbz-D-iGln (2,20 g, 7,85 mmol del
compuesto xvi) en N,N-dimetilformamida (25 ml). La
mezcla se agita durante 3 h, se diluye con 100 ml de agua y se
extrae con acetato de etilo (100 ml). La solución de acetato de
etilo se lava con solución saturada de NaHCO_{3} (100 ml), seguido
de salmuera (100 ml) y se seca sobre sulfato sódico. La capa
orgánica se evapora para dar
Cbz-D-iGln(NHS) (1,96 g, 5,19
mmol del compuesto xvii), el éster activado con NHS del compuesto
xvi, en forma de un sólido blanco. El sólido así obtenido se añade
a una solución del compuesto xv preparado antes (2,60 g, 5,07 mmol)
en DMF anhidra (25 ml), después de lo cual se añade
N,N-diisopropiletilamina (2,00 ml, 11,40 mmol). La
mezcla se agita durante 72 h en atmósfera de N_{2}. Se añade agua
(200 ml) y la mezcla se agita durante 2 h. El sólido resultante se
filtra, se lava con agua (50 ml), y se seca con alto vacío para dar
el compuesto xviii (2,20 g, 66% de rendimiento).
Análisis (compuesto xviii): p.f.
237-240ºC; IR (KBr) 3302, 1699, 1669, 1630, 1184
cm^{-1}; RMN ^{1}H (DMSO-d_{6}, 300 MHz)
\delta 9,36 (t, J= 5,0 Hz, 1H), 8,20 (d, J= 7,0 Hz,
1H), 8,13 (d, J= 7,7 Hz, 1H), 7,98 (d, J= 7,3 Hz,
1H), 7,35 (m, 5H), 7,29 (s ancho, 1H), 7,00 (s ancho, 1H), 5,01 (s,
2H), 4,25 (m, 3H), 3,90 (m, 1H), 3,60 (s, 3H), 3,15 (q, J =
6,0, 12,0 Hz, 2H), 2,18 (m, 2H), 1,85 (m, 1H), 1,70 (m, 1H), 1,55
(m, 1H), 1,50 (m, 3H), 1,28 (d, J= 7,3Hz, 3H), 1,27 (m, 2H),
1,18 (d, J= 7,3Hz, 3H); EM (ESI) m/z 661 (100%, M+H); Anal.
Calc. para C_{28}H_{39}N_{6}O_{9}F_{3}: C, 50,91; H, 5,95;
N, 12,72. Encontrado C, 51,13; H, 6,21; N, 12,47.
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Una mezcla del compuesto xviii (2,15 g, 3,25
mmol), ácido p-toluenosulfónico (662 mg, 3,25 mmol),
y Pd/C al 5% (500 mg) en cloruro de metileno:etanol - 1:1 (100 ml)
se hidrogena a temperatura ambiente durante 1,5 h a 4,2
kg/cm^{2}. El catalizador se filtra y la solución se evapora hasta
una espuma. La espuma se seca con alto vacío para proporcionar el
compuesto xix homogéneo (2,20 g, 97% de rendimiento).
Análisis (compuesto xix): IR (KBr) 3296,
1702, 1632, 1177 cm^{-1}; RMN ^{1}H (DMSO-d_{6}, 300
MHz), \delta 9,37 (t, J= 5,0 Hz, 1H), 8,23 (d, J=
6,6 Hz, 1H), 8,14 (m, 2H), 8,04 (s ancho, 3H), 7,79 (s, 1H), 7,60
(s, 1H), 7,46 (d, J= 8,0 Hz, 2H), 7,10 (d, J= 8,0 Hz,
2H), 4,25 (m, 3H), 3,72 (t, J= 5,0 Hz, 1H), 3,61 (s, 3H),
3,14 (q, J= 6,0, 12,0 Hz, 2H), 2,28 (s, 3H), 2,25 (m, 2H),
1,94 (q, J= 6,0, 12,0 Hz, 2H), 1,55 (m, 4H), 1,2 8(d,
J= 7,3 Hz, 3H), 1,24 (m, 2H), 1,18 (d, J= 7,09 Hz,
3H); EM (ESI) m/z 527 (100%, M+H). Anal. Calc. para
C_{27}H_{41}N_{6}O_{10}F_{3}S.0,5 H_{2}O: C, 45,83; H,
5,93; N, 11,87. Encontrado C, 45 56; H, 5,73; N, 11,60.
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El compuesto xx, monofosfato de undecaprenol
(C_{55}), sal de diamonio, se adquiere en Polish Academy of
Sciences, Warsaw, Polonia.
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En el esquema III se resume un procedimiento
sintético para preparar el lípido II, y productos intermedios
clave, a partir del material de partida discutido antes y se ilustra
a continuación.
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Esquema
III
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El compuesto vi (1,0 g, 1,0 mmol) se disuelve en
HCl 0,23 M en ácido acético (5 ml) y se añade a una suspensión de
Pd/C al 10% (0,50 g) en HCl 0,23 M en ácido acético (5 ml). La
mezcla de reacción se agita en atmósfera de hidrógeno (balón, 1,05
kg/cm^{2}) a 25ºC durante 1,5 h. El análisis de la mezcla de
reacción por cromatografía en capa fina (MeOH/CHCl_{3} al 5%)
muestra el consumo completo del material de partida. La mezcla de
reacción se diluye con EtOAc y el catalizador se recoge por
filtración a través de una almohadilla de Celita. El filtrado se
lava con cuidado con solución acuosa de NaHCO_{3} (x3) y agua
(x2). Los extractos acuosos se combinan y se extraen con EtOAc. Las
capas orgánicas combinadas se lavan con salmuera, se secan con
Na_{2}SO_{4}, y se concentran a vacío para dar el producto de
lactol en forma de un sólido blanco (808 mg, 89% de rendimiento del
compuesto xxi).
Análisis (compuesto xxi): RMN ^{1}H
(DMSO-d_{6}) \delta 1,02 (d, J= 6,84,
3H), 1,80 (d, J= 6,80, 3H), 1,70 (s, 3H), 1,71 (s,3H), 1,84
(s, 3H), 1,86 (s, 3H), 1,89 (s, 3H), 1,98 (s, 3H), 3,30 (m, 2H),
3,45 (m, 2H), 3,6 (m, 4H), 3,9 (m, 4H), 4,2-4,4 (m,
5H), 4,59 (d, J= 8,31, 1H), 4,81 (t, J= 9,77, 1H),
5,01 (d, J= 2,93, 1H), 5,12 (t, J= 9,77, 1H), 6,68 (d,
J= 4,4,1H), 7,60 (m, 2H), 7,70 (m, 1H), 7,83 (d, J=
8,31, 2H), 8,02 (d, J= 7,82, 2H), 8,23 (d, J=
5,86, 1H); RMN ^{13}C (DMSO-d_{6}, 300
MHz) \delta 16,71(q), 18,56(q), 20,24(q),
20,72(q), 22,57(q), 24,30(t), 30,36(q),
47,12(d), 53,67(t), 54,09(d), 58,09(t),
61,61(1), 62,45(t), 68,01 (d), 68,33(d),
70,31(d), 72,37(d), 74,86(d), 75,76(d),
76,73(d), 89,73(d), 89,54(d),
124,84(d), 127,68(d), 129,40(d), 133,98 (d),
139,30(s), 169,25(s), 169,36(s),
169,42(s), 169,54(s), 169,89(s),
169,98(s), 171,52(s), 173,90(s). HRMS calc.
para C_{38}H_{54}N_{3}O_{20}S, 904,3021, encontrado
904,3011.
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El compuesto xxi (1,4 g, 1,55 mmol) en
diclorometano anhidro (10 ml) se añade rápidamente con jeringuilla
a una suspensión vigorosamente agitada de tetrazol (517 mg, 7,31
mmol) y dibencil-N,N'-dietilfosforamidita (1,4 ml, 4,70
mmol) en diclorometano anhidro (10 ml) en atmósfera de argón a 25ºC.
La mezcla de reacción se hace homogénea en unos minutos. Después de
2 h, la cromatografía de placa fina (MeOH/CHCl_{3} al 10%) muestra
una reacción completa. La mezcla se diluye con diclorometano (10
ml), después se lava con solución saturada de NaHCO_{3} (5 ml),
agua (5 ml) y salmuera (5 ml). La solución orgánica se seca sobre
Na_{2}SO_{4} y se concentra a vacío hasta un aceite incoloro
que se recristaliza tras trituración con éter dietílico/hexanos
1:1. Los sólidos se filtran, se disuelven en THF (30 ml) y se
enfrían a -78ºC. Se añade gota a gota peróxido de hidrógeno (al
30%, 2,8 ml) con jeringuilla a la solución vigorosamente agitada.
Tras completarse la adición, el baño de hielo se quita y la mezcla
se deja calentar a temperatura ambiente a lo largo de 2 h. La TLC
(EtOAc/acetona 4:1) muestra la reacción completa. La mezcla se
diluye con solución saturada de Na_{2}S_{2}O_{3} enfriada con
hielo, seguido de acetato de etilo (10 ml), y se agita durante 5
minutos. La capa orgánica se seca sobre MgSO_{4} y se concentra a
vacío hasta un aceite incoloro, lo cual produjo un sólido blanco
tras trituración con Et_{2}O/hexanos 1:1. El sólido blanco se
seca con alto vacío a 40ºC para proporcionar el producto triéster
de monofosfato (1,4 g, 90% de rendimiento del compuesto xxii).
Análisis (compuesto xxii): RMN ^{1}H
(DMSO-d_{6}, 500 MHz) \delta 1,10 (d, 3H), 1,20
(d, 3H), 1,69 (s, 3H), 1,75 (s, 3H), 1,92 (s, 3H), 1,96 (s, 9H),
3,43 (m, 1H), 3,57 (m, 2H), 3,61 (m, 1H), 3,83 (m, 4H), 4,05 (m,
4H), 4,35 (m, 3H), 4,60 (m,1H), 4,73 (m, 1H), 4,91 (t, 1H), 5,00 (m,
4H), 5,24 (t, 1H), 5,81 (m, 1H), 7,35 (m, 10H), 7,64 (m, 2H), 7,74
(m, 1H), 7,86 (d, 2H), 8,06 (d, 1H), 8,39 (d, 1H), 8,66 (d, 1H);
Anal. Calc. para C_{52}H_{66}N_{3}O_{23}PS.2 H_{2}O: C,
52,04; H, 5,88; N, 3,50. Encontrado C 51,84; H, 5,73; N, 3,34. HRMS
calc. para C_{52}H_{66}N_{3}O_{23}PS, 1164,3624, encontrado
1164,3601.
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Se añade gota a gota DBU (120 \mul, 0,68 mmol)
a una solución del triéster de monofosfato (793 mg, 0,68 mmol del
compuesto xxii) en diclorometano (10 ml) en una atmósfera de argón.
Después de 15 minutos, el análisis cromatográfico en capa fina
(MeOH/CHCl_{3} al 15%) muestra el consumo completo del material de
partida. La solución de la reacción se diluye con diclorometano (20
ml) y se lava con HCl 1 N (30 ml). La capa orgánica se concentra,
después la espuma resultante se tritura con Et_{2}O y se deja
reposar a temperatura ambiente durante aproximadamente 2 h. Después
de filtrar el producto ácido bruto se seca a 40ºC durante 2 h (465
mg, 68% de rendimiento).
Se disuelven el ácido (465 mg, 0,47 mmol),
N-hidroxisuccinimida (81 mg, 0,7 mmol) y EDCI (134
mg, 0,70 mmol) en DMF anhidra (4 ml) y se deja agitar durante 18 h.
El análisis de la mezcla de reacción por cromatografía en capa fina
(MeOH/CHCl_{3} al 15%) pone de manifiesto el consumo completo del
material de partida. La mezcla de reacción se concentra a vacío, se
vuelve a disolver en acetato de etilo (10 ml), después se leva con
agua (10 ml) y salmuera (10 ml). La solución orgánica se seca con
MgSO_{4} y se concentra hasta una espuma, la cual después de
trituración con éter dietílico (5 ml), proporciona el éster NHS (398
mg, 78% de rendimiento).
Se disuelven el éster NHS (398 mg, 0,34 mmol),
el tetrapéptido (254 mg, 0,36 mmol del compuesto xix) y iPr_{2}NEt
(192 \mul, 1,1 mmol) en DMF (3 ml) y se agita a t.a. en atmósfera
de argón durante 18 h. La mezcla de reacción después se concentra,
se disuelve en isopropanol/cloroformo (1:9, 10 ml), se lava con
salmuera (3x5 ml), se seca con MgSO_{4} y se concentra a vacío.
El aceite resultante se tritura con éter dietílico para proporcionar
el compuesto xxiii disacaril-pentapéptido (474 mg,
46% de rendimiento global a partir del compuesto xxii) en forma de
un sólido
blanco.
blanco.
Análisis (compuesto xxiii): RMN ^{1}H
(DMSO-d_{6}, 500 MHz) \delta 1,15-1,23
(m, 12H), 1,40 (m, 3H), 1,66 (s, 3H), 1,69 (s, 3H), 1,86 (s, 3H),
1,89 (s, 3H), 1,90 (s, 3H), 1,91 (s, 3H), 2,1 (m, 2H), 3,1 (m, 4H),
3,53 (s, 3H), 3,71 (m, 4H), 3,95 (m, 3H), 4,1-4,25
(m, 10H), 4,34 (t, J= 7,33, 1H), 4,48 (d, J=6,84,
1H), 4,67 (d, J= 8,61, 1H), 4,84 (t, J= 9,77, 1H),
4,98 (m, 4H), 5,18 (t, J= 9,77, 1H), 6,57 (m, 1H), 6,97 (s,
1H), 7,25 (s, 1H), 7,30 (m, 10H), 7,97 (m, 2H), 8,13 (m, 3H), 8,15
(d, 1H), 8,56 (d, J= 5,37, 1H), 9,32 (m, 1H); Anal.
Calculado parar C_{64}H_{89}F_{3}N_{9}O_{27}P.0,5
H_{2}O: C, 50,70; H, 5,99; N, 8,33. Encontrado: C, 50,90; H, 6,38;
N, 8,33. EM (ES^{-}) m/z 1503 (25%), 751,3
([M-2]^{2-},
100%).
100%).
El compuesto xxiii también se puede preparar por
un procedimiento alternativo. A una solución de la amina libre del
compuesto tetrapéptido xx (0,068 g, 0,129 mmol) en CHCl_{3} (1,3
ml) se añaden secuencialmente H_{2}O (1,3 ml), el ácido del
disacárido (0,128 g, 0,129 mmol), y
1-hidroxibenzotriazol (HOBt) (0,017 g, 0,129 mmol).
Después la mezcla se enfría a 0ºC y se añade
N-etil-N'-[3-(dimetilamino)propil]carbodiimida
(EDCI) (0,027 g, 0,142 mmol). La reacción se agita vigorosamente
durante 2 días a 4ºC. Se añade HCl 1 N y se reparten las capas. La
capa orgánica se lava con HCl 1 N, H_{2}O, solución saturada de
NaHCO_{3}, H_{2}O y salmuera. Las fases acuosas combinadas se
extraen con CHCl_{3} (x3). La capa orgánica combinada se seca con
Na_{2}SO_{4} y se concentra a vacío hasta un aceite. El residuo
se purifica por cromatografía en fase normal sobre sílice para dar
el compuesto xxiii (57%) en forma de un aceite incoloro. Este
procedimiento alternativo se describe en Ho, G-J;
Emerson, K. M.; Mathre, D. J.; Shuman, R. F.; Grabowski, D. J.
"Carbodiimide-Mediated Amide Formation in a
Two-Phase System. A High-Yield and
Low-Racemization Procedure for Peptide
Synthesis," J. Org. Chem. 1995, 60,
3569-3570.
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Se añade el
disacaril-pentapéptido (53 mg, 0,035 mmol del
compuesto xxiii) a una suspensión de Pd/C al 10% (100 mg) en
metanol (6,0 ml), se enfría en un baño de hielo para ayudar a
desgasificar la solución de la reacción. La solución después se
calienta a temperatura ambiente y se hidrogena a presión atmosférica
durante 1,5 h. El catalizador se recoge por filtración y la
solución resultante se trata con piridina (1,0 ml). La mezcla
resultante se concentra a vacío hasta un sólido de color
blanquecino, el cual se recoge y se seca con alto vacío durante 16
h (EM-ESI m/z 1322, [M-H]).
El sólido blanquecino se añade a una mezcla de
1,1'-carbonildiimidazol (26,0 mg, 0,16 mmol) en DMF
anhidra (2,5 ml) y THF anhidro (2,0 ml). Después de agitar durante
2 horas, se determina que la reacción se ha completado por
espectroscopía de masas (EM-ESI m/z 1372,4,
[M-H]). Se añade metanol (0,6 ml) y la solución
resultante se agita durante 15 min. Después la mezcla se concentra
a vacío y se evapora en piridina (1,0 ml). El material sólido
obtenido se seca con alto vacío durante 2 h.
El residuo se disuelve en DMF (0,4 ml) y THF
seco (1,6 ml), al cual se añade una solución de la sal de diamonio
de undecaprenil-fosfato (21,4 mg, 0,024 mmol del
compuesto xx) en THF (0,5 ml) y DMF (0,1 ml). Se añade
1H-tetrazol (1,8 mg, 0,03 mmol) y la mezcla se
agita durante 4 días en atmósfera de argón. Después la solución se
concentra a vacío para dar el compuesto xxiv.
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El residuo de la etapa previa (compuesto xxiv)
se disuelve en 1,4-dioxano:agua (1:1, 2 ml). Se
añade hidróxido sódico 1 N (0,3 ml) y la mezcla resultante se agita
durante 2 h. La solución de la reacción se filtra a través de un
disco de filtro acuoso y se purifica por HPLC de fase inversa en una
columna Dynamax C8 100 \ring{A}, 5 \mu, 21,4 mm x 25 cm usando
un gradiente de elución de A:B 15:85 a A:B 0:100 a lo largo de 30
min, con un caudal de 21,6 ml/min (donde A = bicarbonato amónico
acuoso 0,05 M y B = metanol). El tiempo de retención del producto
es 18 min (detección a 214 nm). La liofilización de las fracciones
puras da 13,8 mg del Lípido II (24% de rendimiento global a partir
del compuesto xxiii). EM de ultra-alta resolución
calculado para C_{94}H_{157}N_{9}O_{25}P_{2}, 1874,07659;
encontrado, 1874,08023.
La identidad estructural del Lípido II se valida
por un ensayo bioquímico usando una versión modificada del Lípido
II que lleva un marcador dansilo en el grupo
\varepsilon-amino del resto de
L-lisina. El sustrato se prepara por dansilación
directa del Lípido II de forma análoga a las condiciones descritas
en Weppner, W.A., and F.C. Neuhaus, J. Biol. Chem.,
252(7), 2296 (1977).
Weppner y Neuhaus habían demostrado previamente
la generación in situ del Lípido II por incorporación de un
nucleótido de Park que lleva un marcador dansilo en el resto de
L-lisina en las cadenas de glicano por incubación
con una fracción de membrana preparada a partir de Gaffkya
homari. En estos experimentos, las cadenas de glicano se
detectaron fácilmente por cromatografía en papel descendente seguido
de exposición de los cromatogramas a la luz ultravioleta. También
se ha publicado un experimento similar que usa una fracción de
partículas de membrana de E. coli con una versión del Lípido
I marcado con dansilo (el precursor inmediato al Lípido II que no
tiene la subunidad de carbohidrato NAG). Véase, Auger, G., y col.,
Lett. Pept. Sci., 4, 371 (1997).
De una forma análoga, la incubación del derivado
de Lípido II marcado con dansilo con una transglicosilasa
monofuncional (MtgA) de Staphylococcus aureus (descrito en la
patente de EE.UU. nº 5.922.540) y el posterior análisis de las
mezclas de reacción por cromatografía en capa fina, en las
condiciones descritas por Weppner y Neuhaus, da como resultado la
visualización de las cadenas de glicano tras exposición a la luz
ultravioleta exactamente de la misma forma que la citada antes
(véase figura).
Aunque en los experimentos descritos antes se
usó un marcador dansilo, también se pueden usar otros marcadores
conocidos para los expertos en la materia. Tal como se usa en el
presente documento, "marcador" se refiere a un elemento o
compuesto que contiene átomos que se pueden distinguir de sus
homólogos normales por medios físicos (p. ej., ensayo de
radiactividad, espectrografía de masas o fluorescencia), y por lo
tanto se puede usar para seguir (trazador) el metabolismo de las
sustancias normales.
En la figura, se usan los siguientes protocolos
para las correspondientes bandas representadas en la tira de
cromatografía de capa fina (TLC).
Banda 1: 5 ml de solución madre de sustrato
(dansil-lípido II 300 mM en PIPES 75 mM a pH 6,1,
MgCl_{2}
37,5 mM).
37,5 mM).
Bandas 2 y 3: Banda 1 + 5 ml de solución de
enzima MtgA (solución madre 10 mM en HEPES 25 mM a pH 7,5, NaCl 150
mM, CHAPS al 0,5%); se incuba 20 min a 25ºC; se para con 30 ml de
metanol a 0ºC.
Banda 4: Se añade 1 ml de solución madre de
lisozima (lisozima de clara de huevo de gallina 1 mg/ml, HEWL).
La localización de los productos de reacción se
visualiza por exposición de la TLC a la luz UV (366 nm) (véase
figura).
Se añade una solución de cloruro de dansilo
(13,8 mg, 5,1 \mumol) en acetona (250 \mul) en una porción a
una solución de Lípido II (2,4 mg, 1,3 \mumol) en solución acuosa
de NaHCO_{3} 0,25 M (250 \mul). La mezcla, que se vuelve turbia
inmediatamente, se agita a temperatura ambiente durante 90 minutos.
La EM por electropulverización y la HPLC muestran la conversión
completa del producto. La mezcla se concentra a vacío, se vuelve a
disolver en agua/acetonitrilo 1:1 y se purifica por cromatografía
preparativa en una columna Dynamax C8 (100 \ring{A}, 5 \mu,
21,4 mm x 25 cm) usando un gradiente de metanol/bicarbonato amónico
50 mM de 85:15 a 100:0 a lo largo de 20 minutos (detección a 214
nm). Las fracciones adecuadas se combinan y se liofilizan para
proporcionar el Lípido II dansilado (1,7 mg, 63% de rendimiento). EM
de ultra-alta resolución calculado para
C_{106}H_{168}N_{10}O_{27}P_{2}S, 2107,12764; encontrado,
2107,12725.
Claims (2)
1. Un procedimiento para preparar un sustrato
lipídico de fórmula 1, que comprende:
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(1) proporcionar un disacárido protegido de
fórmula 14
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(2) introducir un fosfato anomérico para formar
un compuesto de fórmula 12
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(3) introducir un enlace peptídico para formar
un compuesto de fórmula 7
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(4) eliminar los grupos Pg^{6} del compuesto
de fórmula 7 y tratar el compuesto resultante con una base de
fórmula B para formar una sal de fosfato de fórmula 6
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(5) tratar el compuesto de fórmula 6 con un
éster de fosfato activado de fórmula 25
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para formar un compuesto de fórmula
2
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(6) eliminar los grupos Pg^{0} y Pg^{3} y
desproteger el grupo P para producir dicho sustrato lipídico en el
que:
Ac es -C(O)CH_{3};
Pg^{0} es un grupo acilo protector de
hidroxi;
Pg^{3} es un grupo acilo protector de
hidroxi;
Pg^{4} es un grupo protector de carboxi;
Pg^{5} es un grupo protector de hidroxi;
Pg^{6} es un grupo protector de fosfato;
R^{2} es hidrógeno, alquilo
(C_{1}-C_{5}) o
alquil(C_{1}-C_{3})-fenilo;
X es un transportador de lípidos, en el que
transportador de lípidos significa cadenas de hidrocarburos
saturadas e insaturadas que pueden ser lineales o ramificadas,
perfluoradas o no sustituidas, que tienen de 5 a 55 carbonos y de 1
a 11 unidades de prenilo;
L^{1} es un grupo saliente;
P unido al carbonilo es un resto de un
aminoácido o péptido, en el que P comprende un grupo carboxi
terminal protegido; y
P' es un resto de un aminoácido o péptido.
2. Un procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 1, para preparar el Lípido II, que comprende:
(1) proporcionar un núcleo disacárido protegido
de fórmula 14
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(2) introducir un fosfato anomérico para formar
un compuesto de fórmula 12
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\newpage
(3) introducir un enlace polipeptídico para
formar un compuesto de fórmula 7a.
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(4) eliminar los grupos Pg^{6} del compuesto
de fórmula 7a y tratar el compuesto resultante con una base de
fórmula B para formar una sal de fosfato de fórmula 6a
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(5) tratar el compuesto de fórmula 6a con un
éster activado de fórmula 25a
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para formar un compuesto de fórmula
2a
(6) eliminar Pg^{0}, Pg^{3}, Pg^{7} y
Pg^{8} para formar dicho compuesto de Lípido II; en el que
A es hidrógeno o un grupo carboxilo;
R^{2} es metilo;
Ac es -C(O)CH_{3};
Pg^{0} es un grupo acilo protector de
hidroxi;
Pg^{3} es un grupo acilo protector de
hidroxi;
Pg^{4} es un grupo protector de carboxi;
Pg^{5} es un grupo protector de hidroxi;
Pg^{6} es un grupo protector de fosfato;
Pg^{7} es un grupo protector de amina;
Pg^{8} es un grupo protector de carboxi; y
L^{1} es un grupo saliente.
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