DE10350965A1

DE10350965A1 - Verwendung aktivierter Linker mit1-amino-2-mercapto Funktionalität zur Modifizierung von Komponenten für die Kupplung mit Thioestern durch chemische Ligation

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Publication number: DE10350965A1
Application number: DE10350965A
Authority: DE
Inventors: Christof M. Prof. Dr. Niemeyer; Marina Lovrinovic; Carl Deutsch
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2003-10-31
Filing date: 2003-10-31
Publication date: 2005-05-25

Abstract

Verwendung aktivierter Linker der Formel 1 oder einer Substanzmischung, die eine oder mehrere Verbindungen der Formel 1 umfasst,

Formel 1.
wobei eine 1-amino-2-mercapto Funktionalität durch die Gruppen R₁S und R₂NH gebildet wird, in der
R₁S eine Mercaptogruppe wie S-t-Butyl, S-t-Butylthio, S-Acetamidomethyl, S-Benzyl, S-p-Methylbenzyl, S-p-Methoxybenzyl, S-Trityl, S-p-Metoxytrityl, S-Phenyl, S-Diphenylmethyl, S-Carboxymethyl, S-Alkyl und S-Acetyl, oder eine andere geschützte, partiell geschützte oder ungeschützte Mercaptogruppe ist,
R₂NH eine Aminogruppe wie NHFmoc-Schutzgruppe (Fluorenyl-methoxycarbonyl), NHBoc (t-Butyloxycarbonyl), NHAc (Acetyl), NHiBut (Isobutyryl), NHTrt (Trityl) und NHZ (Benzyloxycarbonyl), oder eine andere geschützte, partiell geschützte oder ungeschützte Aminogruppe ist,
Spacer eine aliphatische und aromatische Kette, wie beispielsweise eine oligo- und poly-Ethylenglykole, deren Schwefel und Stickstoffanaloga, Oligo- und Polyamide, Oligo- und Polyester und andere langkettige Molekülgruppe ist, und
Reaktive Gruppe eine chemische Funktionalität aus der Gruppe der Carbonsäuren, aktivierten Carbonsäurederivate, Säurehalogenide, Aktivester,...

Description

Beschrieben werden neue Verwendungen von Verbindungen der Formel 1, wobei eine 1-amino-2-mercapto Funktionalität durch die Gruppen R₁S und R₂NH gebildet wird, in der R₁S eine Mercaptogruppe, R₂NH eine Aminogruppe darstellen und der Spacer eine aliphatische oder aromatische Kette und die Reaktive Gruppe eine chemisch reaktive Funktionalität darstellen.
Bei der Mercaptogruppe handelt es sich typischerweise um Gruppen wie S-t-Butyl, S-t-Butylthio, S-Acetamidomethyl, S-Benzyl, S-p-Methylbenzyl, S-p-Methoxybenzyl, S-Trityl, S-p-Metoxytrityl, S-Phenyl, S-Diphenylmethyl, S-Carboxymethyl, S-Alkyl und S-Acetyl, oder eine andere geschützte, partiell geschützte oder ungeschützte Mercaptogruppe. Der Fachmann kennt eine Vielzahl solcher Funktionalitäten, wie sie auch in zahlreichen Lehrbüchern beschrieben sind (siehe beispielsweise: T.W. Green and P.G.M.Wuts: Protective Groups in Organic Synthesis, John Wiley & Sons, Inc., 1999).
Bei der Mercaptogruppe handelt es sich typischerweise um Gruppen wie NHFmoc-Schutzgruppen (Fluorenyl-methoxycarbonyl), NHBoc (t-Butyloxycarbonyl), NHAc (Acetyl), NHiBut (Isobutyryl), NHTrt (Trityl) und NHZ (Benzyloxycarbonyl), oder eine andere geschützte, partiell geschützte oder ungeschützte Aminogruppe. Der Fachmann kennt eine Vielzahl solcher Funktionalitäten, wie sie auch in zahlreichen Lehrbüchern beschrieben sind (siehe beispielsweise: T.W. Green and P.G.M.Wuts: Protective Groups in Organic Synthesis, John Wiley & Sons, Inc., 1999).
Bei dem Spacer handelt es sich beispielsweise um oligo- oder poly-Ethylenglykole, Oligo- und Polyamide oder andere langkettige Molekülgruppen, die dem Fachmann als Abstandshalter (englisch: Spacer) bekannt sind.
Die Reaktive Gruppe ist eine chemische Funktionalität aus der Gruppe der Carbonsäuren, aktivierten Carbonsäurederivate, Säurehalogenide, Aktivester, Aldehyde, Ketone, Amine und Hydrazine, die eine spezifische Reaktivität für eine komplementäre chemische Gruppe aufweist. Typische Beispiele für die Reaktive Gruppe und die chemisch komplementäre Gruppe der ersten Komponente sind in Tabelle 1 aufgelistet.
Tabelle 1
Die genannten Verbindungen der Formel 1 sind als Mittel zur Modifizierung von einer ersten Komponente verwendbar, um die erste Komponente mit einer 1-amino-2-mercapto-Funktionalität zu versehen. Dieses Vorgehen ist in 1 dargestellt.
Das Produkt (bzw. die Produkte) der wie in 1 dargestellt modifizierten ersten Komponente kann dann in einer nachfolgenden Umsetzung mit einer zweiten Komponente zur Reaktion gebracht werden, die eine Thioester-Gruppierung enthält. Diese in 2 dargestellte Art von Reaktion, die dem Fachmann als „native chemical ligation" (NCL) bekannt ist, ermöglicht eine selektive und effiziente Kupplung zweier Komponenten unter chemisch milden Bedingungen, die auch für die Herstellung empfindlicher Konjugate aus Biomolekülen, z.B. Proteine und Nucleinsäuren, geeignet ist.
Halbsynthetische Konjugate aus Nucleinsäuren und Proteinen, Peptiden oder niedermolekularen Verbindungen spielen eine ausserordentlich wichtige Rolle in vielen Anwendungsbereichen der biomedizinischen Diagnostik and Analytik wie auch den modernen Material- und Nanowissenschaften. Ein Überblick über halbsynthetische Konjugate Nucleinsäure-Protein Konjugate findet sich beispielsweise in Niemeyer, C. M. (2002) The developments of semisynthetic DNA-protein conjugates. Trends Biotechnol. 20, 395–401. Eine grundlegende Problemstellung bei der Synthese solcher Konjugate aus Nucleinsäuren und Proteinen, Peptiden oder niedermolekularen Verbindungen besteht darin, die Kupplung zwischen der Nucleinsäure und der Nichtnucleinsäure dahingehend zu bewerkstelligen, dass diese (1) effizient, (2) regiospezifisch und (3) unter chemisch milden Bedingungen abläuft. Letzteres ist insbesondere für Nucleinsäure-Protein Konjugate von entscheidender Bedeutung, da Proteine in aller Regel sehr empfindlich auf chemische und thermische Belastungen reagieren indem sie partiell denaturieren und damit ihre biologische Aktivität verlieren.
Sämtliche der oben unter 1–3 genannten Bedingungen werden durch eine Methode erfüllt, die kürzlich von Lovrinovic et al. vorgestellt wurde (Lovrinovic, M., Seidel, R., Wacker, R., Schroeder, H., Seitz, O., Engelhard, M., Goody, R., Niemeyer, C. M. (2003) Synthesis of protein-nucleic acid conjugates by expressed protein ligation. Chem. Commun. 822 – 823). Die dort beschriebene Methode basiert auf der sogenannten „native chemical ligation" (NCL), die ihrerseits auf den Arbeiten von Kent et al. (P.E. Dawson, T.W. Muir, I. Clark-Lewis, S.B.H. Kent, Science 1994, 266, 776–779) beruht. In der NCL werden 1-Amino-2-mercapto-Verbindungen mit einem Thioester umgesetzt wodurch unter sehr milden Bedingungen in einer hochspezifischen Reaktion eine Peptidbindung entsteht. Ein besonderer Vorteil der NCL liegt darin, dass diese Reaktion nicht nur in organischen und wässrigen Systemen möglich ist, sondern selbst in der Gegenwart von denaturierenden Reagenzien effizient durchgeführt werden kann.
In der oben genannten Methode von Lovrinovic et al. wurde die NCL erstmalig eingesetzt, um Peptidnucleinsäuren spezifisch mit Proteinen zu kuppeln, die am C-terminalen Ende über eine Thioesterfunktion verfügen. Die Thioester-modifizierten Proteine sind über rekombinante Expressionsverfahren zugänglich, die dem Fachmann geläufig sind (siehe z.B. Goody, R. S., Alexandrov, K., Engelhard, M. (2002) Combining chemical and biological techniques to produce modified proteins. ChemBioChem 3, 399–403). Da Konjugate aus natürlich vorkommenden Nucleinsäuren (z.B. DNA, RNA) und den in der NCL benötigten 1-Amino-2-mercapto-verbindungen synthetisch nur schwer zugänglich sind, nutzten Lovrinovic et al. eine Peptid-Nucleinsäure (PNA), die synthetisch einfach mit einer Amino-2-mercapto-gruppe verknüpfbar ist. Im konkreten Fall wurde hier eine Cystein-Gruppe an das N-terminale Ende der PNA gekuppelt (vgl. Lovrinovic et al. (2003) Chem. Commun. 822).
Peptidfragmente, die typischerweise zur Bereitstellung der Amino-2-mercapto-verbindung für die NCL verwendet werden, lassen sich im Zuge einer direkten Synthese über automatisierte Festphasenmethoden nur sehr schwierig mit Nucleinsäuren kuppeln. So sind nur wenige Beispiele für diese An der Darstellung von Konjugaten bekannt, in denen beispielsweise mittels eines trägergebundenen bifunktionalen Linkers zuerst unter basischen Bedingungen die Fmoc-Schutzgruppe (Fluorenyl-methoxycarbonyl) abgespalten wird, um das Peptid zu synthetisieren, und anschließend die säurelabile DMT-Schutzgruppe (Dimethoxytrityl) entfernt wird, um die DNA zu synthetisieren (vgl. z.B. C.D. Juby, C.D. Richardson, R. Broussear, Tetrahedron Lett. 1991, 32, 879–882, S. Basu, E. Wickstrom, Tetrahedron Lett. 1995, 36, 4943–4946). Ein solches Vorgehen ist jedoch aufwendig und mit intrinsischen Problemen (z.B. Depurinierung der DNA-Nucleotide) verknüpft, wie Tung und Stein in einem Übersichtsartikel darstellen (Tung, C. H., Stein, S. (2000) Preparation and applications of peptide-oligonucleotide conjugates. Bioconjug. Chem. 11, 605–618).
Vom Fachmann als deutlich leistungsfähiger beurteilt wird die sogenannte „Fragment-Kupplung", bei der nicht nur das Problem der Schutzgruppen umgangen wird, indem sowohl das Peptidfragment wie auch das DNA Oligonucleotid zunächst einzeln synthetisiert und anschließend miteinander verknüpft werden. Ein weiterer Vorteil der Fragment-Kupplung besteht darin, dass auf häufig kommerziell verfügbare Bausteine, insbesondere DNA Oligonucleotide, zurückgegriffen werden kann. Hierdurch erlangen auch chemisch ungeübte Anwender einen Zugriff auf Peptid-Oligonucleotid Konjugate, ohne dass aufwendige Synthesen durchgeführt werden müssen. Für die Fragment-Kupplung werden typischerweise kommerziell verfügbare Oligonucleotide eingesetzt, die am 5'-Ende, 3'-Ende oder an ausgewählten Nucleotiden mit einer primären Amino-, Hydrazin- oder Mercapto-alkylgruppe ausgestattet sind. Diese Gruppen können nun mit chemisch-komplementären Funktionalitäten umgesetzt werden, um die Kupplung zwischen Oligonucleotid und Peptidfragment zu erhalten. Der Fachmann kennt mittlerweile eine Reihe von Variationen, um die Kupplung durchzuführen (vgl. Tung & Stein, sowie Zubin E.M., Romanova E.A, Oretskaya T.S. (2002) Modern methods for the synthesis of peptide-oligonucleotide conjugates. Russ. Chem. Rev., 71, 239–264).
Ungelöst ist jedoch das Problem, einen chemischen Linker zu entwickeln, der (i) eine spezifische Reaktivität für Amino- und/oder Mercapto-funktionalisierte Nucleinsäuren aufweist und (ii) nach erfolgter Kupplung mit der Nucleinsäure eine 1-Amino-2-mercapto-Gruppe bereitstellt, die für die NCL geeignet ist.
Diese Problemstellung wird durch die vorliegende Erfindung gelöst, indem chemische Linker benutzt werden, die

1. eine reaktive Kupplungsgruppe besitzen, die eine spezifische Reaktivität für Amino- und/oder Mercapto-funktionalisierte Nucleinsäuren aufweist,
2. eine 1-Amino-2-Mercaptogruppe enthalten, die während der Kupplung mit der Nucleinsäure als geschützte und damit inaktive Funktionalität vorliegt, und
3. einen Abstandshalter zwischen den zwei zuvor bezeichneten Gruppen enthalten.

Der allgemeine chemische Aufbau der oben bezeichneten chemischen Linker ist in Formel 1 dargestellt:
Formel 1: Allgemeiner Aufbau der erfindungsgemäßen chemischen Linker.
Als Reaktive Gruppe kommen beispielsweise chemische Funktionalitäten in Frage, die eine Reaktivität für primäre Amino- oder Thiolgruppen aufweisen, da diese zwei Gruppen besonders häufig in kommerziell erhältlichen Nucleinsäuren verwendet werden. Typischerweise sind dies für Aminogruppen insbesondere aktivierte Carbonsäurederivate wie Säurehalogenide oder Aktivester. Eine Alternative besteht in der Verwendung einer Aldehyd-Funktion (CHO) als Reaktive Gruppe, da diese spezifisch und effizient sowohl mit Amino- wie auch mit Hydrazin-modifizierten Nucleinsäuren reagiert. Thiolgruppen lassen sich spezifisch und effizient mit Säurehalogeniden und Maleinsäureimiden umsetzen, wobei insbesondere Maleinsäureimide für die Kupplung besonders geeignet sind, da deren Reaktion mit Thiolen selbst in wäßrigen Lösungen und in Gegenwart einer Vielzahl anderer chemischer Funktionalitäten hochspezifisch und effizient verläuft. Neben solchen Thioethern können auch Disulfidbrücken über Reaktionen von Pyridyldisulfiden mit thiomodifizierter DNA gebildet werden. Eine Alternative zur Amino- und Thiolgruppen bieten Phosphoramidite, welche in Form eines Phosphordiesters oder -amids an das DNA-Rückgrat gebunden werden. Als Spacer finden typischerweise aliphatische und aromatische Ketten, oligo- und poly-Ethylenglykole, deren Schwefel- und Stickstoffanaloga, Oligo- und Polyamide, Oligo- und Polyester und andere langkettige Molekülgruppen Verwendung.
Als 1-amino-2-mercapto-Funktionalität sind typischerweise geschützte Cysteinderivate zu nennen, in denen R₂NH- beispielsweise eine geschützte Aminogruppe wie NHFmoc (Fluorenyl-methoxycarbonyl), NHBoc (t-Butyloxycarbonyl), NHAc (Acetyl), NHTrt (Trityl) oder NHZ (Benzyloxycarbonyl) und R₁S- eine geschützte Mercaptogruppe wie S-t-Butyl, S-t-Butylthio, S-Acetamidomethyl, S-Benzyl, S-p-Methoxybenzyl, S-Trityl, S-Phenyl, oder S-Carboxymethyl darstellt.
Das allgemeine Vorgehen zur Verwendung der erfindungsgemäßen Linker ist für das Beispiel der Umsetzung von Amino-modifizierter DNA in 3 dargestellt.
Die Erfindung wird nachfolgend anhand der Figuren und einiger Ausführungsbeispiele näher beschrieben. Es stellen dar:
1: Umsetzung von Verbindungen der Formel 1 mit einer chemisch komplementären ersten Komponente zu einem Produkt, das mit einer zweiten Komponente zur Reaktion gebracht werden kann, die eine Thioester-Gruppierung enthält.
2: Umsetzung des Produktes der wie in 1 dargestellt modifizierten ersten Komponente mit einer zweiten Komponente die eine Thioester-Gruppierung enthält im Sinne der „native chemical ligation (NCL)".
3: Kupplung des aktivierten Linkers mit Amino-modifizierter DNA.
4: Darstellung des Azidoalkohols.
5: Williamsonsche Ethersynthese.
6: Staudinger Reduktion des Azids 5.
7: Kupplung des Amins 6 an die aktivierte Aminosäure 8.
8: Esterspaltung und Aktivierung der Säure.
9: Kupplung des Linkers 11 mit DNA.
10: Entschützung des aktivierten Linkers 13.
11: Kupplung der modifizierten DNA mit Thioestern.
12: Bindung der DNA-MBP-Konjugate an die immobilisierten Fängeroligonucleotide 16 und 17. NK entspricht der Negativkontrolle ohne Konjugat
13: Synthese eines typischen Vertreters (22) der erfindungsgemäßen aktivierten Linker der Formel 1.
Ausführungsbeispiele
Beispiel 1: Synthese eines aktivierten Linkers mit 1-amino-2-mercapto Funktionalität
In diesem Beispiel wird die Synthese eines typischen Vertreters der erfindungsgemäßen aktivierten Linker der Formel 1 beschrieben. Die Synthese des aktivierten Linkers erfolgt ausgehend von Hexaethylenglykol 1, wobei im ersten Schritt eine der beiden primären Hydroxylgruppen in den Methansulfonsäureester 2, eine potentielle Abgangsgruppe, umgewandelt wird. (4) Hierzu wird folgendermaßen verfahren: Zu einer Suspension von 1,41 g (5,00 mmol) Hexaethylenglykol und 1,30 g (5,50 mmol) Ag₂O in 10 ml Dichlormethan wurde unter Stickstoff über 30 Minuten 0,650 g (6,00 mmol) Methansulfonsäurechlorid in 1 ml Dichlormethan getropft. Nachdem die Reaktionsmischung für 48 Stunden bei Raumtemperatur rührte, wurde die Reaktion über Celite filtriert und das Lösungsmittel im Vakuum entfernt. Das farblose Rohprodukt wurde einer Säulenchromatographie an Kieselgel (Ethylacetat/Methanol = 10 : 1) unterworfen, wonach 533 mg (24%) des Dimesyliertengykols (R_f = 0,45) und 1,313 g (73%) des gewünschten mono-mesylierten Oligoglykols 2 (R_f = 0,22) als farbloses Öl isoliert wurden. Das Produkt zeigt folgende Signale im ¹H-NMR (500 MHz, CDCl₃) δ (ppm) = 4.35 (m, 2H, -CH ₂OSO₂-), 3.71 (m, 2H, CH ₂OH), 3.66 (m, 2H, CH ₂CH₂OH), 3.60 (m, 16H, CH ₂CH ₂), 3.55 (m, 2H, CH ₂CH ₂), 3.05 (s, 3H, CH₃), 2.00 (s, 1H, OH) und im ¹³C-NMR (125 MHz, CDCl₃) δ (ppm) = 72.4; 70.5; 70.4; 70.3; 70.2 (–, CH₂ CH₂), 69.3 (–, CH₂CH₂OSO₂), 68.9 (–, HOCH₂ CH₂), 61.6 (–, HOCH₂), 60.2 (–, CH₂OSO₂), 37.6 (+, CH₃).
Das Mesylat 2 wird dann in einer weiteren Substitution mit Natriumazid (NaN₃) in N,N-Dimethylformamid (DMF) umgesetzt, wodurch der Azidoalkohol 3 in fast quantitativen Ausbeuten erhalten wird. Hierzu wird wie folgt verfahren: Eine Lösung von 1,083 g (3,00 mmol) des mesylierten Glykolys 2 und 293 mg (4,5 mmol) Natriumazid (NaN₃) in 5 ml DMF wurde für 2,5 Stunden bei 110°C gerührt. Nach Entfernen des DMF durch Koevaporieren mit Toluen wurde das Lösungsmittel im Vakuum entfernt und das Rohprodukt durch Säulenchromatographie an Kieselgel (Ethylacetat/Methanol = 10 : 1) gereinigt. Man erhält in annährend quantitativer Ausbeute (99%) das Azidol 3 (R_f = 0,22) als blaß-gelbes Öl.
Das Produkt zeigte folgende Signale im ¹H-NMR (500 MHz, CDCl₃) δ (ppm) = 3.66 (m, 2H, CH ₂CH ₂), 3.60 (m, 18H, CH ₂CH ₂), 3.57 (t, 2H, CH ₂OH), 3.36 (t, 2H, CH ₂N₃), 2.14 (s, 1H, OH) und im ¹³C-NMR (125 MHz, CDCl₃) δ (ppm) = 72.5; 70.6; 70.5; 70.4; 70.3. 70.2 (–, CH₂ CH₂), 69.9 (CH₂CH₂N₃), 61.6 (–, CH₂OH), 50.6 (–, CH₂N₃).
Mittels Williamsonscher Ethersynthese wird im nächsten Schritt eine Kettenverlängerung unter gleichzeitiger Einführung einer Esterfunktion durchgeführt. (5).
Dazu wurde der Alkohol 3 mit Natriumhydrid (NaH) deprotoniert und mit Bromessigsäureester 4 in einer nucleophilen Substitution umgesetzt. Hier führten Reaktionsbedingungen, wie sie zur Synthese von Kronenethern verwendet werden, in guten bis sehr guten Ausbeuten zu dem gewünschten Ester 5. Im Detail wurde die Synthese wie folgt durchgeführt:
Zu einer Suspension von 70,3 mg (2,93 mmol) Natriumhydrid (NaH aus 55%iger Suspension) in 10 ml absolutiertem THF wurden langsam 600 mg (1,95 mmol) des Alkohol 3 getropft und eine Stunde nachgerührt. Anschließend wurden langsam 583 mg (2,93 mmol) Bromessigsäure-tert-butylester 4 zugegeben und die Reaktionsmischung bei 60°C über Nacht gerührt. Nach Umsatzkontrolle mittels DC (Ethylacetat/Methanol, 10:1) wurde die Lösung vorsichtig mit 5 ml H₂O hydrolysiert, die Phasen getrennt und die wässrige Phase dreimal mit 5 ml Ethylacetat extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden mit MgSO₄ getrocknet, das Lösungsmittel im Vakuum entfernt und das Rohprodukt mittels Säulenchromatographie an Kieselgel (Ethylacetat/Methanol, 10:1) gereinigt, wonach 660 mg (79%) des Azidoesters 5 (R_f = 0,35) isoliert werden konnten. Es wurden folgende Signale im ¹H-NMR (400 MHz, CDCl₃) δ (ppm) = 4.09 (s, 2H, OOCCH ₂) 3.61 (bm, 20H, CH ₂CH ₂), 3.35 (t, 2H, CH ₂N₃), 1.43 (s, 9H, C(CH ₃) ₃ ) und ¹³C-NMR (100 MHz, CDCl₃) δ (ppm) = 171.0 (×, OOCCH₂), 81.40 (–, OOCCH₂), 70.60; 70.59; 70.56; 70.52; 70.47, 70.4; 69.9 (–, CH₂ CH₂ und ×, C(CH₃) ₃ ), 68.9 (–, CH₂CH₂N₃), 50.6 (–, CH₂N₃), 28.1 (+, C(CH₃) ₃ ) gefunden.
Im nächsten Schritt erfolgt die Reduktion des Azidoesters 5 zum Amin 6 mittels einer Staudinger-Reduktion. (6) Hierzu wurde das Azid 5 mit Triphenylphosphin (PPh₃) umgesetzt und das intermediäre Phosphazen 7 zum Amin 6 hydrolysiert. Im Detail wurde die folgende Vorschrift verwendet:
Zu einer Lösung von 390 mg (0,91 mmol) des Azidoesters 5 in 7 ml absolutiertem THF wurden bei 0°C 262 mg (1,00 mmol) Triphenlyphosphin (PPh₃) gegeben, die Lösung auf Raumtemperatur aufgewärmt und über Nacht unter Stickstoff gerührt. Nach Zugabe von 2 Äquivalenten Wasser wurde für weitere 8 Stunden gerührt, bevor die Reaktionslösung mit 5 ml H₂O hydrolysiert wurde. Nach Waschen mit 3 ml Toluen, Trennung der Phasen und Entfernen des Wassers im Vakuum wurden 270 mg (84 %) des Amins 6 als gelbliches Öl isoliert. Das Produkt zeigte die folgenden Signale im ¹H-NMR (500 MHz, CDCl₃) δ (ppm) = 3.94 (s, 2H, OOCCH ₂) 3.62–3.56 (bm, 20H, CH ₂CH ₂), 3.46 (t, ³J = 6,5 Hz , 2H, CH ₂NH₂), 2.81 (t, ³J = 6,5 Hz, 2H, NH ₂), 1.40 (s, 9H, C(CH ₃) ₃ ) und ¹³C-NMR (125 MHz, CDCl₃) δ (ppm) = 169.5 (–, OOCCH₂), 81.4 (–, OOCCH₂), 72.5; 70.49; 70.35; 70.33; 70.30. 70.0; 68.8 (–, CH₂ CH₂ und ×, C(CH₃) ₃ ), 41.3 (–, CH₂NH₂), 27.9 (–, C(CH₃) ₃ ).
Um die für die NCL benötigte 1-amino-2-mercapto-Funktionalität einzuführen, wird der Aminoester 6 mit dem aktivierten Cysteinester 8 umgesetzt. (7) Hierzu wurde eine Lösung von 100 mg (0,17 mmol) des Amins 6 und 66 mg (0,17 mmol) des Pentafluorphenol-N-Fmoc-S-S-tert-butyl-cysteins 8 unter Argon drei Stunden bei 70°C gerührt. Nach Entfernen des Lösungsmittels im Vakuum und Aufnehmen des Rohproduktes in 5 ml Dichlormethan wurde die organische Phase mit ges. NaHCO₃-Lösung gewaschen, mit MgSO₄ getrocknet und das Lösungsmittel im Vakuum entfernt. Nach Reinigung durch Säulenchromatographie (SiO₂, Ethylacetat/Methanol, 10 : 1) wurden 106 mg (77 %) des Amids 9 isoliert.
Neben den Signalen im ¹H-NMR (500 MHz, CDCl₃) δ (ppm) = 7.75 (d, 2H, H_Aromat), 7.60 (d, 2H, H_Aromat), 7.39 (t, 2H, H_Aromat), 7.30 (dt, 2H, H_Aromat), 4.45, (t, 2H, CH ₂CO(O)N), 4.35 (t, 1H, CHCH₂SS), 4.22 (t, 1H, 9'' H) 3.99 (s, 2H, OOCCH ₂) 3.66 (bm, 22H, CH ₂CH ₂), 3.47 (t, ³J = 6,5 Hz , 1H, CHNH), 3.09 (d, ³J = 6,5 Hz, 2H, CH ₂SS), 1.46 (s, 9H, OC(CH ₃) ₃ ), 1.33 (s, 9H, SC(CH ₃)₃) und ¹³C-NMR (125 MHz, CDCl₃) δ (ppm) = 169.5 (–, OOCCH₂), 143.7, 141.2, 127.7, 127.1, 125.1, 120.0 (+, C_Aromat) 81.4 (–, OOCCH₂), 72.5; 70.49; 70.35; 70.33; 70.30; 70.0; 68.8 (–, CH₂ CH₂ und ×, C(CH₃) ₃ ), 41.3 (–, CH₂NH), 39.5 (–, CH₂SS) 37.3 (+, C-9'') 29.8 (+, SC(CH₃) ₃ ), 28.1 (+, OC(CH₃) ₃ ) wurde folgende Masse bestimmt:
FAB-HRMS: gef. [ber.] = 809,3701 (M⁺H)⁺ [808,3639 (M⁺)]
Mittels Trifluoressigsäure (TFA) wird der tert-Butylester gespalten und die Säure 10 in fast quantitativer Ausbeute als dunkles Öl freigesetzt. (8) Dazu wurde eine Lösung von 100 mg (0,124 mmol) des Esters 7 in 3 ml Dichlormethan mit 1 ml Trifluoressigsäure versetzt und für 2 Stunden gerührt. Nach dem Entfernen des Lösungsmittels und der Trifluoressigsäure im Vakuum wurde die Säure 10 in quantitativer Ausbeute erhalten. Das Produkt zeigte die folgenden Signale im ¹H-NMR (500 MHz, CDCl₃) δ (ppm) = 9.52 (sb, 1H, COOH), 7.77 (d, 2H, H_Aromat), 7.60 (d, 2H, H_Aromat), 7.39 (t, 2H, H_Aromat), 7.31 (dt, 2H, H_Aromat), 4.44, (t, 2H, CH ₂CO(O)N), 4.22 (t, 1H, CHCH₂SS), 4.17 (s, 2H, CH ₂COOH), 3.65 (bm, 22H, CH ₂CH ₂), 3.47 (t, ³J = 6,5 Hz , 1H, CH ₂NH), 3.06 (d, ³J = 6,5 Hz, 2H, CH ₂SS), 1.33 (s, 9H, SC(CH ₃) ₃ ) und ¹³C-NMR (125 MHz, CDCl₃) δ (ppm) = 171.6 (–, OOCCH₂), 141.3, 127.8, 120.0, (+, C_Aromat), 72.5; 70.49; 70.35; 70.33; 70.30, 70.0; 68.8 (–, CH₂ CH₂ und ×, SSC(CH₃) ₃ ), 41.9 (–, CH₂NH), 39.9 (–, CH₂SS), 29.7 (+, SC(CH₃) ₃ ). Des Weiteren konnte folgende Masse ermittelt werden:
FAB-HRMS: gef. [ber.] = 775,2910 [775,3013 ([M+Na]⁺)]
Zur Darstellung des Aktivesters wird die Säure 10 mit Dicyclohexylcarbodiimid (DCC), welches in situ die Säure aktiviert, und N-Hydroxysuccinimid (HONSu) umgesetzt.
Es wurde dafür die folgende Vorschrift verwendet:
93,3 mg (0,124 mmol) der Säure 10 wurden mit 28,1 mg (0,136 mmol) Dicyclohexylcarbodiimid und 15,6 mg (0,136 mmol) N-Hydroxysuccinimid in 5 ml THF unter Rühren bei 0°C gelöst. Nach einer Stunde bei 0°C wurde das Eisbad entfernt und die Reaktionsmischung über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Nachdem mittels DC (Dichlormethan/Methanol = 10:1) kein Edukt mehr nachgewiesen werden konnte, wurde die Suspension auf 0°C gekühlt und das entstandene Harnstoffderivat abfiltriert. Nach Waschen des Filtrats mit Dichlormethan wurden die vereinigten organischen Phasen einrotiert und es wurden 100 mg (93 %) des Aktivesters 11 als gelbliches Öl isoliert. Neben den folgenden Signalen im ¹H-NMR (500 MHz, CDCl₃) δ (ppm) = 9.52 (sb, 1H, COOH), 7.77 (d, 2H, H_Aromat), 7.60 (d, 2H, H_Aromat), 7.39 (t, 2H, H_Aromat), 7.31 (dt, 2H, H_Aromat), 4.46 (s, 2H, CH ₂COON), 4.39, (t, 2H, CH ₂CO(O)N), 4.22 (t, 1H, CHCH₂SS), 4.17 (s, 2H, CH ₂COOH), 3.65 (bm, 22H, CH ₂CH ₂), 3.47 (t, ³J = 6,5 Hz , 1H, CH ₂NH ), 3.06 (d, ³J = 6,5 Hz, 2H, CH ₂SS), 2.73 (s, 4H, OCCH ₂CH ₂CON), 1.33 (s, 9H, SC(CH ₃)₃) sowie ¹³C-NMR (125 MHz, CDCl₃) δ (ppm) = 172.3 (×, NOOCCH₂), 170.6 (×, NCOCH₂N), 168.9 (×, CH₂ CON), 156.0 (×, OCOCH₂C_Ar), 143.6, 141.3, 127.8, 120.0, (+, C_Aromat), 70.8-67.8 (–, CH₂CH₂ und ×, SSC(CH₃) ₃ ), 41.9 (–, CH₂NH), 39.9 (–, CH₂SS), 29.7 (+, SC(CH₃) ₃ ), 24.7 (–, CH₂CON) wurde die folgende Masse bestimmt:
FAB-HRMS: gef. [ber.] = 850,3294 [850,3176 ([M+H]⁺)], 872,3027 [872,3176 ([M+Na]⁺)]
Beispiel 2: Kupplung des aktivierten Linkers 11 mit Amino-modifizierter DNA
In diesem Beispiel wird die Kupplung des aktivierten Linkers der Formel 1 mit 5'-Amino-modifizierter DNA beschrieben, die einen exemplarischen Vertreter der ersten Komponente darstellt. Die Kupplung des aktivierten Linkers 11 mit der DNA erfolgt durch die Reaktion des Aktivesters mit der primären Aminogruppe am 5'-Ende des DNA Oligonucleotides. (9)
Hierzu wurden 0,570 mg (670 nmol) des Linkers 11 in 100 μl DMF gelöst, mit 100 μl einer 50 μM Lösung des Oligonukleotides 12 (5'-NH₂-CCT GTG TGA AAT TG-3') in 100 mM PBS-Puffer (pH 7.3) gemischt und 3 h bei 20°C inkubiert. Nach Entfernen des Lösungsmittels im Vakuum und Aufnahme des Rückstandes in 150 μl bidest. Wasser wurde das Produkt mittels Massenspektrometrie nachgewiesen.
MS (MALDI-TOF, Positiv-Ionen-Modus): gef. [ber.] = 5211 [5211]
Beispiel 3: Entschützung des aktivierten Linkers nach Kupplung mit Amino-modifizierter DNA
In diesem Beispiel wird das Produkt der Kupplung des aktivierten Linkers der Formel 1 mit 5'-Amino-modifizierter DNA entschützt, um eine 1-amino-2-mercapto-Funkionalität bereitzustellen, die für Umsetzungen im Sinne der NCL geeignet ist. Hierzu wird die basenlabile NHFmoc-Schutzgruppe mittels Piperidin abgespalten und die für NCL benötigte Aminofunktion in quantitativer Ausbeute freigesetzt. (10) Dazu wurde die Lösung der mit Linker modifizieren DNA 13 im Vakuum zur Trockene eingeengt, mit 1 ml Piperidin (20% in N,N-Dimethylformamid) versetzt und 20 min bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurde das Lösungsmittel im Vakuum entfernt, der Rückstand in 20% Acetonitril gelöst und das Produkt massenspektrometrisch charakterisiert.
MS (MALDI-TOF, Positiv-Ionen-Modus): gef. [ber.] = 4988 [4989]
Beispiel 4: Verwendung der mit Linker 11 modifizierten DNA in der NCL
In diesem Beispiel wird das Produkt der Kupplung des aktivierten Linkers der Formel 1 mit 5'-Amino-modifizierter DNA mit einer zweiten Komponente im Sinne der NCL verknüpft. Als zweite Komponente wird Maltose-Bindungsprotein eingesetzt, das durch literaturbekannte Verfahren mittels kommerziell erhältlichen Intein-basierten Vektoren rekombinant in Escherichia coli hergestellt wurde und dadurch am C-Terminus über eine Thioester-Funktion verfügt (IMPACT^TM-CN, Instruction Manual, Catalog #E6900S, Version 1.9, New England Biolabs). Als Beispiel wird Thioester-haltiges Maltose-Bindungsprotein (MBP) verwendet. Die mit Linker modifizierte DNA 14 wird durch NCL mit dem Thioestermodifizierten MBP umgesetzt. (11) Die Abspaltung der S-tButyl-Gruppe erfolgt während der Ligationsreaktion durch TCEP (Tris(2-carboxyethyl)phosphin).
Zur Bestimmung der optimalen Ligationsbedingungen wurden in verschiedenen Ansätzen (an 2–8, 12) neben den Konzentrationensverhältnissen zwischen Linker-modifizierter DNA und dem MBP auch die Zusammensetzung der Ligationspuffer, Ligationsdauer sowie Ligationstemperatur variiert. Die Bildung der DNA-MBP-Konjugate wurde nach der chromatographischen Aufreinigung (Zorbax Poroshel 300SB-C18, Agilent) in einem auf Festphasen-Hybridisierung basierenden Sandwich-Immunoassay überprüft.
Zur Durchführung des Sandwich-Immunoassays wurde die Mikrotiterplatte mit 50 μl Streptavidin (STV)-Lösung (200 nM STV in PBS) beschichtet und mit BSA-DNA-haltigem Puffer (20 mM Tris, 150 mM NaCl, 1 mg/ml BSA, 1 mg/ml DNA, pH 7,3) gegen unspezifische Bindung geblockt. Je 50 μl einer 240 nM Lösung der biotinylierten Fängeroligonuckleotide 16 (komplementär zur Basensequenz des Oligonucleotides 12: 5'-Biotin-CAA TTT CAC ACA GG-3') und 17 (nicht-komplementär: 5'-Biotin-TGA TAG GGT GCT TGC-3') wurden in die Vertiefungen der Platte gegeben und 30 min inkubiert. Zur Hybridisierung wurden 50 μl der nach der chromatographischen Aufreinigung gesammelten Fraktionen (12) zugegeben und 2 h unter Schütteln inkubiert. Anschließend wurden 50 μl einer 100 nM Lösung von anti-MBP aus Maus zugefügt und 45 min inkubiert. Nach der Inkubation der anti-Maus-IgG Lösung und anschließendem Waschen wurden jeweils 50 μl einer 1 mM AttoPhos Lösung (Roche) zugegeben und die Fluoreszenzintensität der Signale verfolgt.
Wie in 12 ersichtlich, führten die Reaktionsbedingungen des Ansatzes an 4 zur Bildung der gewünschten DNA-MPB Konjugate. Dies wird durch das Fluoreszenzsignal mit einem sehr guten Signal-Rausch-Verhältnis angezeigt. Die spezifische Bindung des gewünschten DNA-MPB Konjugates wird auch durch die Kontrollreaktion bestätigt, in der mit nicht-komplementärem Oligonucleotid 17 kein signifikantes Signal erscheint.
Die Reaktionsbedingungen im Ansatz an 4 sind wie folgt:
Das DNA-Linker-Konjugat (2,5 μM) wurde zur Erhöhung der Ligationsgeschwindingkeit mit 60 μl Tris(2-carboxyethyl)phosphin (0.2 M, pH 6.5) gemischt und 3 h bei Raumtemperatur vorbehandelt. Die Lösung wurde anschließend mit 5 Äquivalenten des Thioestermodifizierten Maltose-bindenden-Proteins (MBP) in 80 μl Ligationspuffer (20 mM Tris(hydroxymethyl)aminomethan(Tris)-Puffer mit 500 mM NaCl und 1 mM EDTA (Ethylendiamintetraessigsäure), der jeweils 4% MESNA (Mercaptoethansulfonsäure) und Thiophenol enthielt, versetzt und 48 h bei Raumtemperatur inkubiert.
Beispiel 5: Synthese eines aktivierten Linkers mit 1-amino-2-mercapto Funktionalität
In diesem Beispiel wird eine weitere Synthese eines typischen Vertreters (Linker 22) der erfindungsgemäßen aktivierten Linker der Formel 1 beschrieben. (13)

Claims

Verwendung aktivierter Linker der Formel 1 oder einer Substanzmischung, die eine oder mehrere Verbindungen der Formel 1 umfasst,
Formel 1. wobei eine 1-amino-2-mercapto Funktionalität durch die Gruppen R₁S und R₂NH gebildet wird, in der R₁S eine Mercaptogruppe wie S-t-Butyl, S-t-Butylthio, S-Acetamidomethyl, S-Benzyl, S-p-Methylbenzyl, S-p-Methoxybenzyl, S-Trityl, S-p-Metoxytrityl, S-Phenyl, S-Diphenylmethyl, S-Carboxymethyl, S-Alkyl und S-Acetyl, oder eine andere geschützte, partiell geschützte oder ungeschützte Mercaptogruppe ist, R₂NH eine Aminogruppe wie NHFmoc-Schutzgruppe (Fluorenyl-methoxycarbonyl), NHBoc (t-Butyloxycarbonyl), NHAc (Acetyl), NHiBut (Isobutyryl), NHTrt (Trityl) und NHZ (Benzyloxycarbonyl), oder eine andere geschützte, partiell geschützte oder ungeschützte Aminogruppe ist, Spacer eine aliphatische und aromatische Kette, wie beispielsweise eine oligo- und poly-Ethylenglykole, deren Schwefel und Stickstoffanaloga, Oligo- und Polyamide, Oligo- und Polyester und andere langkettige Molekülgruppe ist, und Reaktive Gruppe eine chemische Funktionalität aus der Gruppe der Carbonsäuren, aktivierten Carbonsäurederivate, Säurehalogenide, Aktivester, Alkohole, Thiole, Isocyanate, Aldehyde, Ketone, Amine, Imide, Pyridyldisulfide, Phosphoramidite und Hydrazine ist, als Mittel zur Umsetzung mit einer oder mehreren chemisch komplementären ersten Komponente(n), die mit einer chemischen Funktionalität ausgestattet ist (sind), die zur Reaktiven Gruppe komplementär ist (sind).
Verwendung nach Anspruch 1 wobei das Produkt oder die Produkte der Umsetzung der Verbindung der Formel 1 und der chemisch komplementären ersten Komponente mit einer zweiten Komponente zur Reaktion gebracht wird, die eine Thioester-Gruppierung enthält.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei das Produkt oder die Produkte der Umsetzung der Verbindung der Formel 1 und der chemisch komplementären ersten Komponente mit einer zweiten Komponente im Sinne einer „native chemical ligation" umgesetzt wird.
Verfahren nach Anspruch 1–3, wobei es sich bei der ersten Komponente mit chemisch komplementärer Gruppe um Nucleinsäuren wie DNA oder RNA handelt.
Verfahren nach Anspruch 1–3, wobei es sich bei der ersten Komponente mit chemisch komplementärer Gruppe um nicht-natürliche Nucleinsäure-Derivate wie Peptid-Nucleinsäure (PNA), Locked-Nucleinsäuren (LNA), Pyranosyl-Ribonucleinsäuren (pRNA) oder andere Nucleinsäure-Analoga handelt, die im Vergleich zu den natürlichen Nucleinsäuren geänderte Basenpaarungs- und/oder Rückgrat-Eigenschaften aufweisen.
Verfahren nach Anspruch 1–3, wobei es sich bei der ersten Komponente mit chemisch komplementärer Gruppe um Verbindungen handelt, die ausgewählt sind aus der Gruppe, die besteht aus: bioorganischen Makromolekülen wie Peptiden, Peptoiden, Antikörpern, Enzymen, Rezeptoren, Membranproteinen, Glykoproteinen, sowie niedermolekularen Verbindungen wie pharmakologisch aktiven Substanzen, Hormonen, Antigenen, Kohlenhydraten wie auch aus makromolekularen und kolloidalen Nanopartikeln aus Metallen, Halbleitermaterialien und amphiphilen Verbindungen, Micellen, Vesikeln.
Verfahren nach Anspruch 1–3, wobei es sich bei der zweiten Komponente, die mit dem Produkt oder den Produkten der Umsetzung der Verbindung der Formel 1 und der chemisch komplementären ersten Komponente zur Reaktion gebracht wird, um eine Verbindung handelt, die ausgewählt ist aus der Gruppe, die besteht aus: bioorganischen Makromolekülen wie Peptiden, Peptoiden, Antikörpern, Enzymen, Rezeptoren, Membranproteinen, Glykoproteinen, Nucleinsäuren und deren Derivaten sowie niedermolekularen Verbindungen wie pharmakologisch aktiven Substanzen, Hormonen, Antigenen, Kohlenhydraten wie auch aus makromolekularen und kolloidalen Nanopartikeln aus Metallen, Halbleitermaterialien und amphiphilen Verbindungen, Micellen, Vesikeln.