WO2003040093A2 - Isotopencodierte affinitätsmarker 2 - Google Patents

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WO2003040093A2
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Oswald Lockhoff
Dorian Immler
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    • B82Y5/00—Nanobiotechnology or nanomedicine, e.g. protein engineering or drug delivery

Definitions

  • the invention relates to new, isotope-coded affinity markers for the mass spectrometric analysis of proteins as well as their production and use.
  • Proteomics technology opens up the possibility of identifying new biological targets and markers by analyzing biological systems at the protein level. It is known that only a certain part of all possible proteins of the proteins encoded in the genome is expressed, whereby, for example, tissue type, development status, activation of receptors or cellular interactions influence the expression patterns and rates. In order to determine differences in the expression of proteins in healthy or diseased tissue, various comparative methods for analyzing protein expression patterns can be used ((a) S.P. Gygi et al., Proc. ⁇ atl.
  • Isotope coding is implemented.
  • the protein mixtures are then combined, if necessary fractionated or proteolytically treated and purified by affinity chromatography. After the bound fragments have been eluted, the eluates are analyzed by combining liquid chromatography and mass spectrometry (LC-MS). Couples or groups of with themselves only in the
  • Isotope coding distinguishing affinity markers are labeled peptides are chemically identical and are eluted almost simultaneously in HPLC, but they differ in the mass spectrometer by the respective molecular weight differences due to different isotope patterns of the affinity markers. Relative protein concentrations can be obtained directly by measuring the peak areas. Suitable affinity markers are conjugates from
  • Affinity ligands that are covalently linked to protein-reactive groups via bridge members. Different isotopes are built into the bridge members. The method was described using affinity markers in which hydrogen atoms were replaced by deuterium atoms ( 1 H / 2 D isotope coding sequence).
  • the object of the present invention was to provide improved affinity markers.
  • the invention relates to organic compounds suitable as affinity marker reagents for the mass spectrometric analysis of proteins of the formula (I),
  • PRG stands for a protein-reactive group and L stands for an A and PRG covalently linking linker, wherein the linker L is an acid-cleavable group S of the formula
  • Y for an optionally branched spacer group with a chain length of 1 to 10, preferably 1 to 5 non-hydrogen atoms and
  • SK stands for the side chain of an amino acid
  • the invention furthermore relates to the use of one or more differently isotope-labeled compounds according to the invention as a reagent for the mass spectrometric analysis of proteins, in particular for the identification of one or more proteins or protein functions in one or more protein-containing samples and for determining the relative expression levels of one or more proteins in one or more protein-containing samples.
  • the acid-cleavable group S ensures a cleavage of the affinity marker as a predetermined breaking point under the action of acid.
  • the predetermined breaking point enables the peptide fragments to be decomplexed by a much more efficient streptavidin-based affinity chromatography for biotin-modified peptide fragments. It is also advantageous that the tags remaining on the peptide fragments after acid cleavage have a significantly lower molecular weight and have a higher isotope density. Furthermore, the handling of the affinity markers is improved compared to the prior art by better solubility and by a crystalline or amorphous appearance.
  • spacer group Y contained in the acid-cleavable group S is bonded to the benzene ring in the ortho, meta or ⁇ » ⁇ r ⁇ position to the nitrogen atom, the ⁇ r ⁇ position being preferred.
  • Suitable spacer groups Y are, for example, chains composed of the building blocks NH, CH 2 and / or CO, in which one or more hydrogen atoms can be substituted by identical or different, optionally heteroatom-containing hydrocarbon radicals, in particular C 1 -C 4 -alkyl radicals , Y preferably contains at least one NH group, in particular at its end facing away from the benzene ring.
  • Particularly preferred spacer groups Y are NH, NH-CH 2 and NH-CH 2 -CH 2 -NH-CO, the latter two preferably being bonded to the benzene ring with the CH2 or CO group.
  • the amino acid side chain SK is the side chain of an ⁇ -amino acid of the formula SK-CH (NH 2 ) -COOH, which may be present in the D, L or racemic form for other SK than an H atom.
  • Suitable SK are, for example, the side chains of the 20 natural amino acids and their D-
  • Forms and racemates e.g. B. the side chains of L-glycine, L-histidine, L-valine, D-valine, L-proline, L-asparagine, L-aspartic acid and L-glutamic acid.
  • Any other functional groups present in SK for example in the case of amino acids such as histidine or aspartic acid, can optionally be present freely or protected with a protective group.
  • Affinity level A is used for the selective enrichment of samples with the aid of affinity chromatography.
  • the affinity columns are provided with the corresponding complementary partners to the affinity ligands, which enter into covalent or non-covalent bonds with the affinity ligands.
  • An example of a suitable affinity ligand is biotin or a biotin derivative which is strong, non-covalent with the complementary peptides avidin or streptavidin Binds.
  • the affinity hand A can represent a functional group which enables the affinity marker reagent to be covalently fixed to a polymer matrix.
  • A represents the acyl radical of an affinity ligand, for example biotinyl or a biotin derivative.
  • Protein-reactive groups PRG are used for the targeted labeling of proteins on selected functional groups. PRGs have a specific reactivity for terminal functional groups of the proteins.
  • Amino acids as elements of proteins which are frequently used for targeted labeling are, for example, mercaptoaminomonocarboxylic acids such as cysteine, diaminomonocarboxylic acids such as lysine or arginine or monoaminodicarboxylic acids such as aspartic acid or glutamic acid.
  • Protein-reactive groups can also include phosphate-reactive groups such as metal chelates and aldehyde-reactive and ketone-reactive groups such as amines
  • Sodium borohydride or sodium cyanoborohydride can also be groups which react with the reaction products after targeted protein derivatization, such as, for example, a bromine cyanide cleavage or an elimination of phosphate groups etc.
  • PRG stands for the rest of a protein-reactive group which is characterized by an electrophilic group and a suitable bridge which enables or facilitates the connection of the electrophilic group to the linker L, preferably bridged electrophiles such as
  • existing acidic and / or basic functional groups in the form of their salts preferably their hydrochlorides, trifluoroacetates or alkali metal salts, can be prepared and used.
  • the protein-reactive group PRG has solubility-improving functional groups.
  • Preferred compounds according to the invention are those of the formula (II)
  • acyl residue of an affinity ligand for example biotinyl or a biotin derivative
  • PRG stands for the rest of a protein-reactive group, which is characterized by an electrophilic group and a suitable bridge which enables or facilitates the attachment of the electrophilic group to X 4 , preferably bridged electrophiles such as
  • X 1 , X 2 , X 3 independently of one another and also for X 2 independently of other X 2 each for O, S, NH, NR, CO, CO-O, O-CO, CO-S, S-CO, SS, SO, SO 2 , CO-NR, NR-CO, CS-NR, NR-CS, Si-O, O-Si, arylene 1 9 "or diarylene groups, where X, X or X may also be partially or completely absent,
  • Diarylene groups particularly preferably NH, NR, O or S,
  • n, p, q, r, z, s, x each independently represent a number from 0 to 100, the sum n + xm + p preferably being less than 100 and particularly preferably between 5 and 30,
  • Connectivity S-NRR'-X 1 which is linked as a bridge S to X 1 , where B 1 together with X 1 can be part of an amino acid derivative, and
  • R, R 'independently of one another each represent hydrogen, alkyl, alkenyl,
  • Alkynyl, alkoxy or aryl or both together with N represent an N-heterocycle NRR ', where R' is additionally bonded to X 1 and therefore cannot stand for hydrogen, where R and R 'in addition to X 1 can also be modified by functional ones
  • B carboxyl or amino groups, and where R and R 'may be substituted in the form that B ⁇ X 1 together give the derivative of an amino acid, and wherein the functional groups not involved in the bond with S or with CH 2 , for example contribute to improved solubility.
  • alkyl, alkenyl, alkynyl, alkoxy, aryl, arylene and N-heterocyclyl have the following meanings:
  • Alkyl per se and "alk" in alkoxy stand for a linear or branched alkyl radical with generally 1 to 6, preferably 1 to 4, particularly preferably 1 to 3 carbon atoms, by way of example and preferably methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl, tert-butyl, n-pentyl and n-hexyl.
  • Alkenyl stands for an alkyl radical with at least 2 carbon atoms and usually 1, 2 or 3 double bonds, for example and preferably for ethenyl, n-propenyl and methylethenyl.
  • Alkynyl represents an alkyl radical with at least 2 carbon atoms and in
  • Rule 1 2 or 3 triple bonds, for example and preferably for ethynyl and propynyl.
  • Alkoxy is exemplary and preferably methoxy, ethoxy, n-propoxy, isopropoxy, tert-butoxy, n-pentoxy and n-hexoxy.
  • Aryl stands for a mono- to tricyclic aromatic, carbocyclic radical with generally 6 to 14 carbon atoms, for example and preferably for phenyl, naphthyl and phenanthrenyl.
  • Arylene stands for a bivalent aryl radical, for example and preferably for phenylene, naphthylene and phenanthrenylene.
  • N-heterocyclyl stands for a mono- or polycyclic, preferably mono- or bicyclic, non-aromatic heterocyclic radical with generally 4 to 10, preferably 5 to 8 ring atoms and at least one N-hetero atom and a total of up to 3, preferably up to 2 heteroatoms and / or hetero groups from the series N, O, S, SO, SO 2 .
  • the N-heterocyclyl residues can be saturated or partially unsaturated.
  • N-heterocyclyl radicals having a total of up to two heteroatoms from the O, N and S series, such as, for example and preferably, pyrrolidin-2-yl, pyrrolidin-3-yl, pyrrolinyl, piperidinyl, morpholinyl and perhydroazepinyl, in particular
  • Marking the isotopes D, N, O, O and / or S can also be used.
  • C-labeled compounds are additionally labeled with at least one nitrogen atom of the 15 N isotope, preferably one to three 15 N atoms, in particular one 15 N atom.
  • the isotope markings are usually carried out in L and / or PRG, in particular in L and in the case of compounds of the formula (II) in CH 2 groups, B 1 and / or X 1 .
  • the acid-cleavable group S is preferably arranged at the PRG-terminal end of the linker L and the spacer group Y is bonded directly to the protein-reactive group PRG, for example in the form of compounds of the formula (II).
  • the degree of acid cleavage of the acid cleavable group S depends on the structure of the respective linker L and can be modulated and thus adapted to the requirements of the particular use of the compounds. If, for example, acid cleavage is desired under mild conditions, compounds of the formula (II) in which B 1 represents an amine group NRR 'in which R is not hydrogen, in which R and R' in particular both represent alkyl or, together with N, represent N-heterocyclyl, for example and preferably the amine groups N (CH 3 ) CH 2 , pyrrolidin-2-yl and piperidin-4-yl.
  • Such mild conditions are given, for example, in dilute trifluoroacetic acid, e.g. B. when diluted to a content of less than 50% by volume, in particular less than 20 vol .-%, in a mixture of acetonitrile and water in a volume ratio of 1 to 1.
  • the compounds of the invention can be prepared, for example, by a group consisting of:
  • V H or OH, preferably H
  • SG a protective group common in peptide chemistry, preferably Boc and with SK the rest of an amino acid side chain in the D or L configuration or in the racemic form.
  • affinity ligand A-OH or an activated form thereof for example an activated ester or an acid chloride, is combined with a compound under suitable coupling conditions
  • any protective groups still present can optionally be split off in order to obtain conjugates of the formula (II).
  • (IV) comprises a compound of the formula
  • a protective group SG can be retained or simultaneously with the Boc protective group or in a separate one
  • Suitable protective groups are, for example, the Boc protective group which can be cleaved with trifluoroacetic acid or the one with piperidine or Morpholine cleavable Fmoc protecting group.
  • Other suitable protecting groups and the corresponding methods for introduction and separation were z. B. described in (a) Jakubke / Jeschkeit: amino acids, peptides, proteins; Verlag Chemie 1982 or (b) Houben-Weyl, Methods of Organic Chemistry, Georg Thieme Verlag Stuttgart, Fourth Edition; Volume 15.1 and 15.2, edited by E. Wünsch.
  • affinity markers according to the invention can also be built up in reverse order, initially in a derivative of the formula
  • a suitable further protective group SG ' preferably the Fmoc protective group, according to standard methods ((a) Jakubke / Jeschkeit: amino acids, peptides, proteins; Verlag Chemie 1982; (b) Houben-Weyl, methods of organic chemistry, Georg Thieme Verlag Stuttgart, Fourth edition; Vol. 15.1 and 15.2, edited by E.
  • the coupling with the derivative of a protein-reactive group or the activated precursor of a protein-reactive group is carried out in the last step
  • the reactions can be carried out at various pressure and temperature ratios, usually at 0.5 to 2 bar, preferably under normal pressure, ie at about 1 bar, and -30 to +100 ° C, preferably -10 to + 80 ° C, in particular 0 to 30 ° C. It is carried out in suitable solvents such as dimethylformamide (DMF), tetrahydrofuran (THF), dichloromethane, chloroform, CC 4 alcohols, acetonitrile, dioxane, water or in mixtures of the solvents mentioned.
  • suitable solvents such as dimethylformamide (DMF), tetrahydrofuran (THF), dichloromethane, chloroform, CC 4 alcohols, acetonitrile, dioxane, water or in mixtures of the solvents mentioned.
  • suitable solvents such as dimethylformamide (DMF), tetrahydrofuran (THF), dichloromethane, chloroform, CC 4 alcohols, acetonitrile,
  • composition of solvent and eluent mixtures is indicated by a "/" separator
  • Mono-Fmoc-protected p-phenylene diamine was prepared using standard methods such as those described in e.g. B. in Houben Weyl; Methods of organic chemistry; Fourth edition; Volume XV parts 1 and 2; Georg Thieme Verlag Stuttgart 1974, or in Hans-Dieter Jakubke and Hans Jeschkeit: amino acids, peptides, proteins; Verlag Chemie, Weinheim 1982 are produced.
  • Boc protective group was removed from the 790 mg (1.35 mmol) of compound E.2.5 using standard conditions with trifluoroacetic acid in dichloromethane (800 mg, 98%).
  • Raney nickel 2.5 g was added to the solution of compound E.2.7 (5.0 g; 22.9 mmol) in methanol (115 ml) and concentrated aqueous ammonia solution (68 ml) and for 5 h at 100 ° C and 100 bar hydrogenated with hydrogen. After cooling to room temperature, the catalyst was suctioned off. The filtrate was concentrated. The residue was taken up three times in ethanol and concentrated. Yield:
  • Educts E.2.11; Boc-glutamic acid- ⁇ -butyl ester; E.l.l variant C.
  • Educts E.2.17; Boc-glycine N-carboxylic acid; E.l.l
  • Educts E.2.13; Boc-glycine; E.l.l variant C.
  • Educts E.2.15; Boc-glycine N-carboxylic acid; E.l.l
  • Buffer 1 50 mM Tris-HCl, pH 8.3; 5mM EDTA; 0.5% (w / v) SDS
  • Buffer 2 10 mM NE acetate, pH 7
  • Buffer 3 50 mM Tris-HCl, pH 8.3; 5mM EDTA
  • the affinity columns (Monomeric Avidin, Perbio Science GmbH, Bonn) with a column volume of 200 ⁇ l were freshly prepared before the purification and prepared by the following washing steps: - Two column volumes 2xPBS
  • the sample was eluted with the following steps:
  • the eluate was evaporated to dryness and only dissolved again shortly before the analysis with mass spectrometry.
  • PBS stock solution lOx, GibcoBRL, Cat. No. 14200-067
  • ThermoFinnigan San Jose
  • LC-MS high pressure liquid chromatography
  • a reversed Phase column C 18 phase used.
  • the peptides were dissolved in eluent A (0.025% (v / v) trifluoroacetic acid) and injected. They were eluted with a gradient of eluent B (0.025% (v / v) trifluoroacetic acid / 84% (v / v) acetonitrile).
  • the eluting peptides were automatically recognized by the device's acquisition software and fragmented for identification. The identity of the peptides could thus be clearly determined.
  • the mass of the peptide and its fragmentation confirm that the affinity marker was cleaved by acid in the expected manner.
  • FIG. 1 shows an example of the peptides identified from bovine trypsin.
  • FIG. 3 a the ion traces of the light and heavy variants of the labeled peptide LFTFHADICTLPDTEKD from bovine albumin are shown as an example. There is no difference in retention time.
  • Fig. 3 b) and c) are the ion traces of the light and heavy variants of the labeled peptide LFTFHADICTLPDTEKD from bovine albumin.
  • Fragment spectra of the doubly charged peptide ions are shown. Both are identical except for the shift of the cysteine-containing fragments by 6 Da due to the iosotope labeling.
  • Fig. 2 Sequence coverage of bovine trypsin that was achieved using the compound from Example 2.
  • Fig. 3 MS analysis of a protein mixture after derivatization with the examples
  • Fig. 4 MS analysis of a protein mixture after derivatization with the examples

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Abstract

Die Erfindung betrifft neue, isotopencodierte Affinitätsmarker zur massenspektrometrischen Analyse von Proteinen sowie deren Herstellung und Verwendung.

Description

Isotopencodierte Affϊnitätsmarker 2
Die Erfindung betrifft neue, isotopencodierte Affinitätsmarker zur massenspektro- metrischen Analyse von Proteinen sowie deren Herstellung und Nerwendung.
Die Proteomics-Technologie eröffnet die Möglichkeit, durch Analyse von biologischen Systemen auf der Proteinebene neue biologische Targets und Marker zu identifizieren. Es ist bekannt, dass von den im Genom codierten Proteinen nur jeweils ein bestimmter Teil aller möglichen Proteine exprimiert wird, wobei beispielsweise Gewebetyp, Entwicklungsstand, Aktivierung von Rezeptoren oder zelluläre Interaktionen die Expressionsmuster und -raten beeinflussen. Um Unterschiede der Expression von Proteinen in gesundem oder krankem Gewebe festzustellen, können verschiedene vergleichende Methoden zur Analyse von Protein-Expressionsmustern herangezogen werden ((a) S. P. Gygi et al., Proc. Νatl.
Acad. Sei. U. S. A., 2000, 97, 9390; (b) D. R. Goodlett et al, Proteome Protein Anal., 2000, 3; (c) S. P. Gygi et al, Curr. Opin. Biotechnol., 2000, 11, 396).
Eine leistungsfähige Methode ist dabei die massenspektrometrische Detektion von Proteinen. Bei Nerwendung von unterschiedlich isotopencodierten Affinitätsmarker
(ICAT® = Isotope Coded Affmity Tags) und Tandem-Massenspektrometrie kann dieses. Verfahren zur quantitativen Analyse von komplexen Proteinmischungen herangezogen werden ((a) S. P. Gygi et al., Νature Biotechnology, 1999, 17, 994; (b)
R. H. Aebersold et al., WO 00/11208). Das Verfahren beruht darauf, dass jede von zwei oder mehr zu vergleichenden Proteinmischungen, die in verschiedenen
Zeilzuständen erhalten worden sind, mit einem Affinitästmarkern anderer
Isotopencodierung umgesetzt wird. Die Proteinmischungen werden danach kombiniert, gegebenenfalls fraktioniert oder proteolytisch behandelt und affinitätschromatographisch gereinigt. Nach Elution der gebundenen Fragmente werden die Eluate durch Kombination von Flüssigkeitschromatographie und Massen- spektrometrie (LC-MS) analysiert. Paare bzw. Gruppen von mit sich nur in der
Isotopencodierung unterscheidenden Affinitätsmarkern markierten Peptiden sind chemisch identisch und werden in der HPLC nahezu zeitgleich eluiert, sie unterscheiden sich im Massenspektrometer jedoch um die jeweiligen Molekulargewichtsdifferenzen aufgrund unterschiedlicher Isotopenmuster der Affinitätsmarker. Relative Proteinkonzentrationen können direkt durch Messungen der Peakflächen erhalten werden. Geeignete Affinitätsmarker sind Konjugate aus
Affmitätsliganden, die über Brückenglieder kovalent mit proteinreaktiven Gruppen verknüpft sind. Dabei werden in die Brückenglieder unterschiedliche Isotope eingebaut. Das Verfahren wurde anhand von Affinitätsmarkern, in denen Wasserstoff-Atome durch Deuterium-Atome ersetzt wurden (1H/2D- Isotopencodierang) beschrieben.
Die im Stand der Technik beschriebene Methode mit H/ D-isotopencodierten Affinitätsmarkern weist verschiedene Nachteile auf, insbesondere einen Isotopeneffekt der unterschiedlich markierten, aber ansonsten identischen Peptidfragmente im LC, eine nicht ausreichende Stabilität der Affinitätsmarker im allgemeinen und speziell im LC-MS/MS und eine mangelnde Effizienz der Avidin- Monomer-basierten Affinitätschromatographie.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung war die Bereitstellung verbesserter Affinitätsmarker.
Gegenstand der Erfindung sind organische Verbindungen, geeignet als Affinitätsmarker-Reagenzien zur massenspektrometrischen Analyse von Proteinen, der Formel (I),
A-L-PRG (I)
in der
A für einen Affinitätsliganden-Rest,
PRG für eine proteinreaktive Gruppe und L für einen A und PRG kovalent verknüpfenden Linker steht, wobei der Linker L eine säurespaltbare Gruppe S der Formel
Figure imgf000004_0001
enthält, in der
Y für eine optional verzweigte Abstandhaltergruppe mit einer Kettenlänge von 1 bis 10, bevorzugt 1 bis 5 Nicht- Wasserstoff- Atomen und
SK für die Seitenkette einer Aminosäure steht,
oder deren Salze.
Gegenstand der Erfindung ist weiterhin die Verwendung einer oder mehrerer unterschiedlich isotopenmarkierter erfindungsgemäßer Verbindungen als Reagenz zur massenspektrometrischen Analyse von Proteinen, insbesondere zur Identifikation von einem oder mehreren Proteinen oder Protein-Funktionen in einer oder mehreren Protein-haltigen Proben und zur Bestimmung der relativen Expressions-Niveaus von einem oder mehreren Proteinen in einer oder mehreren Protein-haltigen Proben.
Die säurespaltbare Gruppe S gewährleistet als Sollbruchstelle unter Säureeinwirkung eine Spaltung des Affinitätsmarkers, um so z. B. die Freisetzung von der Affinitätssäule zu erleichtern, den am Peptid verbleibenden Rest zu verkleinern und/oder die Arbeitsabläufe insgesamt effizienter zu gestalten. Diese säurelabile
Sollbruchstelle ermöglicht eine Dekomplexierung der Peptidfragmente durch eine wesentlich effizientere Streptavidin-basierte Affinitätschromatographie für Biotin- modifizierte Peptidfiragmete. Vorteilhaft ist auch, dass die nach Säurespaltung an den Peptidfragmenten verbleibenden Tags ein deutlich niedrigeres Molekulargewicht sowie eine höhere Isotopendichte aufweisen. Weiterhin wird die Handhabung der Affinitätsmarker durch bessere Löslichkeit und durch eine kristalline oder amorphe Erscheinungsart gegenüber dem Stand der Technik verbessert.
Die in der säurespaltbaren Gruppe S enthaltene Abstandhaltergruppe Y ist in ortho-, meta- oder ^»αrα-Stellung zu dem Stickstoff- Atom an den Benzolring gebunden, wobei die αrα-Stellung bevorzugt ist. Geeignete Abstandhaltergruppen Y sind beispielsweise aus den Bausteinen NH, CH2 und/oder CO aufgebaute Ketten, in denen ein oder mehrere Wasserstoff-Atome durch gleiche oder verschiedene, optional Heteroatom-haltige Kohlenwasserstoffreste, insbesondere C1-C4-Alkyheste, substituiert sein können. Bevorzugt enthält Y mindestens eine NH-Gruppe, insbesondere an ihrem vom Benzolring abgewandten Ende. Besonders bevorzugte Abstandhaltergruppen Y sind NH, NH-CH2 und NH-CH2-CH2-NH-CO, wobei die beiden letzteren vorzugsweise mit der CH2- bzw. CO-Gruppe an den Benzolring gebunden sind.
Bei der Aminosäure-Seitenkette SK handelt es sich um die Seitenkette einer α- Aminosäure der Formel SK-CH(NH2)-COOH, die für andere SK als ein H-Atom in der D-, L- oder racemischen Form vorliegen kann. Geeignete SK sind beispielsweise die Seitenketten der 20 natürlichen Aminosäuren sowie deren D-
Formen und Racemate, z. B. die Seitenketten von L-Glycin, L-Histidin, L-Valin, D- Valin, L-Prolin, L-Asparagin, L-Asparaginsäure und L-Glutaminsäure. Gegebenenfalls in SK vorhandene weitere funktionelle Gruppen, beispielsweise bei Aminosäuren wie Histidin oder Asparaginsäure, können optional frei oder mit einer Schutzgruppe geschützt vorliegen.
Der Affinitätshgand A dient zur selektiven Anreicherung von Proben mit Hilfe der Affinitätschromatographie. Die Affinitätssäulen sind mit den entsprechenden komplementären Partnern zu den Affinitätsliganden versehen, welche kovalente oder nicht kovalente Bindungen mit den Affinitätsliganden eingehen. Ein Beispiel für einen geeigneten Affinitätsliganden ist Biotin oder ein Biotin-Derivat, das mit den komplementären Peptiden Avidin oder Streptavidin starke, nicht kovalente Bindungen eingeht. Auf diese Weise können zu untersuchende Proben mit Hilfe der Affinitätschromatographie selektiv aus Probenmischungen isoliert werden. Im gleichen Sinn können beispielsweise auch Kohlenhydrat-Reste, die nicht kovalente Wechselwirkungen mit beispielsweise fixierten Lektinen eingehen können, als Affinitätshgand verwendet werden. Weiterhin kann im gleichen Sinn die
Wechselwirkung von Haptenen mit Antikörpern oder die Interaktion von Übergangsmetallen mit entsprechenden Liganden als Komplexbildner genutzt werden oder andere Systeme die miteinander in Wechselwirkung treten. In noch einer weiteren Ausführungsform kann der Affinitätshgand A eine funktionelle Gruppe darstellen, die eine kovalente Fixierung des Affinitätsmarker-Reagenzes an eine polymere Matrix ermöglicht.
In einer bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Verbindungen steht A für den Acylrest eines Affinitätsliganden, beispielsweise Biotinyl oder ein Biotin- Derivat.
Proteinreaktive Gruppen PRG dienen der gezielten Markierung der Proteine an ausgewählten funktionellen Gruppen. PRGs haben eine spezifische Reaktivität für endständige funktionelle Gruppen der Proteine. Aminosäuren als Elemente von Proteinen, die häufig für gezielte Markierungen verwendet werden, sind beispielsweise Mercaptoaminomonocarbonsäuren wie Cystein, Diaminomono- carbonsäuren wie Lysin oder Arginin oder Monoaminodicarbonsäuren wie Asparaginsäure oder Glutaminsäure. Weiterhin können proteinreaktive Gruppen auch phosphatreaktive Gruppen wie beispielsweise Metallchelate sowie aldehydreaktive und ketonreaktive Gruppen wie beispielsweise Amine mit
Natriumborhydrid oder Natriumcyanoborhydrid sein. Ebenso können es Gruppen sein, die nach einer gezielten Proteinderivatisierung wie beispielsweise einer Bromcyanspaltung oder einer Elimination von Phosphatgruppen etc. mit den Umsetzungsprodukten reagieren.
In einer bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Verbindungen steht PRG für den Rest einer proteinreaktiven Gruppe steht, die charakterisiert ist durch eine elektrophile Gruppe und eine geeignete Brücke, die die Anbindung der elektrophilen Gruppe an den Linker L ermöglicht oder erleichtert, vorzugsweise verbrückte Elektrophile wie
Figure imgf000007_0001
Figure imgf000007_0002
-CO-[CH2]r-Cl r = l-10,
-CO-CH=CH2
oder eine andere bekannte proteinreaktive Gruppe, wie sie z. B. von W. H. Scouten in Methods in Enzymology, Volume 135, edited by Klaus Mosbach, AcademicPress Inc. 1987, S. 30ff beschrieben und zusammengefasst wurden.
Zur Verbesserung der Löslichkeit der erfindungsgemäßen Affinitätsmarker können vorhandene saure und/oder basische funktionelle Gruppen in Form ihrer Salze, bevorzugt ihrer Hydrochloride, Trifluoracetate oder Alkalimetall-Salze, hergestellt und eingesetzt werden.
In einer besonderen Ausfuhrungsform der Erfindung weist die proteinreaktive Gruppe PRG löslichkeitsverbessernde funktionelle Gruppen auf.
Bevorzugte erfindungsgemäße Verbindungen sind solche der Formel (II)
A-S-B1-X1-(CH2)n-[X2-(CH2)m]x-X3-(CH2)p-X4-PRG (II) in welcher
für den Acylrest eines Affinitätsliganden steht, beispielsweise Biotinyl oder ein Biotin-Derivat,
PRG für den Rest einer proteinreaktiven Gruppe steht, die charakterisiert ist durch eine elektrophile Gruppe und eine geeignete Brücke, die die Anbindung der elektrophilen Gruppe an X4 ermöglicht oder erleichtert, vorzugsweise verbrückte Elektrophile wie
Figure imgf000008_0001
Figure imgf000008_0002
-CO-[CH2]r-Cl 1-10,
-CO-CH=CH2
oder eine andere bekannte proteinreaktive Gruppe, wie sie z. B. von W. H. Scouten in Methods in Enzymology, Volume 135, edited by Klaus Mosbach, AcademicPress Inc. 1987, S. 30ff beschrieben und zusammengefasst wurden,
die erfindungsgemäße säurespaltbare Gruppe ist,
X1, X2, X3 unabhängig voneinander und auch für X2 unabhängig von anderen X2 jeweils für O, S, NH, NR, CO, CO-O, O-CO, CO-S, S-CO, S-S, SO, SO2, CO-NR, NR-CO, CS-NR, NR-CS, Si-O, O-Si, Arylen- 1 9 " oder Diarylengruppen stehen, wobei auch X , X , oder X teilweise oder vollständig nicht vorhanden sein können,
X4 für O, S, NH, NR, CO-NR, NR-CO, CS-NR, NR-CS, Arylen- oder
Diarylengruppen steht, besonders bevorzugt NH, NR, O oder S,
m, n, p, q, r, z, s, x unabhängig voneinander jeweils für eine Zahl von 0 bis 100 stehen, wobei die Summe n + xm + p bevorzugt kleiner als 100 ist und besonders bevorzugt zwischen 5 und 30 liegt,
B1 für eine optional vorhandene Amin-Gruppe NRR' mit der
Konnektivität S-NRR'-X1 steht, die als Brücke S mit X1 verknüpft, wobei B1 zusammen mit X1 Teil eines Aminosäure-Derivats sein kann, und
R, R' unabhängig voneinander jeweils für Wasserstoff, Alkyl, Alkenyl,
Alkinyl, Alkoxy oder Aryl oder beide gemeinsam mit N für einen N-Heterocyclus NRR' stehen, wobei R' zusätzlich an X1 gebunden ist und daher nicht für Wasserstoff stehen kann, wobei R und R' neben X1 weiterhin modifiziert sein können durch funktionelle
Gruppen, die beispielsweise die Löslichkeit verbessern, wie z. B. Carboxyl- oder Aminogruppen, und wobei R und R' in der Form substituiert vorliegen können, dass B^X1 zusammen das Derivat einer Aminosäure ergeben, und wobei die nicht an der Bindung mit S oder mit CH2 beteiligten funktioneilen Gruppen beispielsweise zur verbesserten Löslichkeit beitragen.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung haben Alkyl, Alkenyl, Alkinyl, Alkoxy, Aryl, Arylen und N-Heterocyclyl, soweit nicht anders spezifiziert, die folgende Bedeutung: Alkyl per se und "Alk" in Alkoxy stehen für einen linearen oder verzweigten Alkylrest mit in der Regel 1 bis 6, vorzugsweise 1 bis 4, besonders bevorzugt 1 bis 3 Kohlenstoffatomen, beispielhaft und vorzugsweise für Methyl, Ethyl, n-Propyl, Isopropyl, tert.-Butyl, n-Pentyl und n-Hexyl.
Alkenyl steht für einen Alkylrest mit mindestens 2 Kohlenstoffatomen und in der Regel 1, 2 oder 3 Doppelbindungen, beispielsweise und vorzugsweise für Ethenyl, n- Propenyl und Methylethenyl.
Alkinyl steht für einen Alkylrest mit mindestens 2 Kohlenstoffatomen und in der
Regel 1, 2 oder 3 Dreifachbindungen, beispielsweise und vorzugsweise für Ethinyl und Propinyl.
Alkoxy steht beispielhaft und vorzugsweise für Methoxy, Ethoxy, n-Propoxy, Isopropoxy, tert.-Butoxy, n-Pentoxy und n-Hexoxy.
Aryl steht für einen mono- bis tricyclischen aromatischen, carbocyclischen Rest mit in der Regel 6 bis 14 Kohlenstoffatomen, beispielhaft und vorzugsweise für Phenyl, Naphthyl und Phenanthrenyl. Arylen steht für einen bivalenten Aryhest, beispielhaft und vorzugsweise für Phenylen, Naphthylen und Phenanthrenylen.
N-Heterocyclyl steht für einen mono- oder polycyclischen, vorzugsweise mono- oder bicyclischen, nicht-aromatischen heterocyclischen Rest mit in der Regel 4 bis 10, vorzugsweise 5 bis 8 Ringatomen und mindestens einem N-Heteroatom und insgesamt bis zu 3, vorzugsweise bis zu 2 Heteroatomen und/oder Heterogruppen aus der Reihe N, O, S, SO, SO2. Die N-Heterocyclyl-Reste können gesättigt oder teilweise ungesättigt sein. Bevorzugt sind 5- bis 8-gliedrige, monocyclische gesättigte N-Heterocyclylreste mit insgesamt bis zu zwei Heteroatomen aus der Reihe O, N und S, wie beispielhaft und vorzugsweise Pyrrolidin-2-yl, Pyrrolidin-3-yl, Pyrrolinyl, Piperidinyl, Morpholinyl und Perhydroazepinyl, insbesondere
Pyrrolidin-2-yl und Piperidin-4-yl. Die nicht-isotopenmarkierten Verbindungen stellen bereits eine Isotopencodierung dar. Zur weiteren Isotopencodierung werden die erfindungsgemäßen Verbindungen
1 Q vorzugsweise mit mindestens einem Kohlenstoff- Atom des Isotops C, insbesondere
1 "X 1 vier bis 15 C- Atomen, isotopenmarkiert. Der mit H/ D- Affinitätsmarkern beobachtete nachteilige Isotopeneffekt in der LC wird durch die 12C/13C-
Isotopenkodierung deutlich verringert. Alternativ oder zusätzlich können zur
9 1 ^ 19 1 iß "\Δ.
Markierung auch die Isotope D, N, O, O und/oder S eingesetzt werden.
1 o t
In einer besonderen Ausfuhrungsform der Erfindung werden C-markierte Verbindungen zusätzlich mit mindestens einem Stickstoff- Atom des Isotops 15N, vorzugsweise ein bis drei 15N- Atomen, insbesondere einem 15N-Atom, isotopenmarkiert.
Die Isotopenmarkierungen werden üblicherweise in L und/oder PRG vorgenommen, insbesondere in L und bei Verbindungen der Formel (II) in CH2-Gruppen, B1 und/oder X1.
Die säurespaltbare Gruppe S ist bevorzugt am PRG-terminalen Ende des Linker L angeordnet und die Abstandhaltergruppe Y direkt an die proteinreaktive Gruppe PRG gebunden, beispielsweise in Form von Verbindungen der Formel (II).
Der Grad der Säurespaltbarkeit der säurespaltbaren Gruppe S hängt von der Struktur des jeweiligen Linker L ab und kann moduliert und somit den Erfordernissen der jeweiligen Verwendung der Verbindungen angepasst werden. Wird beispielsweise Säurespaltbarkeit unter milden Bedingungen angestrebt, so haben sich als besonders günstig Verbindungen der Formel (II) erwiesen, in der B1 für eine Amin-Gruppe NRR' steht, in der auch R ungleich Wasserstoff ist, in der insbesondere R und R' beide für Alkyl oder gemeinsam mit N für N-Heterocyclyl stehen, beispielsweise und vorzugsweise die Amin-Gruppen N(CH3)CH2, Pyrrolidin-2-yl und Piperidin-4-yl. Solche milden Bedingungen sind beispielsweise in verdünnter Trifluoressigsäure gegeben, z. B. bei Verdünnung auf einen Gehalt von weniger als 50 Vol.-%, insbesondere weniger als 20 Vol.-%, in einem Gemisch von Acetonitril und Wasser im Volumenverhältnis von 1 zu 1.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen können beispielsweise hergestellt werden indem eine Gruppe
H-B1-X1-(CH2)n-[X2-(CH2)m]x-X3-(CH2)p-X4-V (III)
mit V = H oder OH, bevorzugt H,
zunächst mit einem an der N-terminalen Aminogruppe geschützten Aminosäurederivat nach in der Peptidchemie gängigen Kupplungsmethoden umgesetzt wird zu einem Konjugat
SG-NH-CH(SK)-CO-B1-X1-(CH2)n-[X2-(CH2)m]x-X3-(CH2)p-X4-V (IN)
mit SG einer in der Peptidchemie gängigen Schutzgruppe, bevorzugt Boc und mit SK dem Rest einer Aminosäureseitenkette in der D- oder L-Konfiguration oder in der racemischen Form.
Anschließend kann (IV) mit dem Derivat einer proteinreaktiven Gruppe oder der aktivierten Vorstufe einer proteinreaktiven Gruppe der Formel
U-PRG (V)
mit U einer Gruppe, die die Verknüpfung von PRG mit X A ermöglicht, indem sie zum Beispiel zusammen mit dem Rest V in (IV) zu einer Abgangsgruppe wird,
umgesetzt werden. Beispiele für solche Gruppen sind aktivierte Ester wie z. B. Ν- Hydroxysuccinimid-ester oder Chloride oder Gruppen, aus denen während der
Kupplung eine Abgangsgruppe generiert werden kann. In einem weiteren Schritt wird dann die Aminoschutzgruppe SG abgelöst, wobei ein Konjugat der Formel (VI) erhalten wird
H2N-CH(SK)-CO-B1-X1-(CH2)n-[X2-(CH2)m]x-X3-(CH2)p-X4-PRG (VI)
Parallel dazu wird der Affmitätsligand A-OH oder eine aktivierte Form desselben, beispielsweise ein aktivierter Ester oder ein Säurechlorid, unter geeigneten Kupplungsbedingungen mit einer Verbindung
Figure imgf000013_0001
die optional auch eine Schutzgruppe tragen kann, zur Verbindung
Figure imgf000013_0002
umgesetzt. Die Verbindung (VIII) wird dann ggf. nach vorheriger Abspaltung einer optional eingeführten Schutzgruppe mit aktivierten Kohlensäurederivaten wie Thiophosgen oder Thiocarbonylbisimidazol in ein entsprechendes Isothiocyanat überführt und anschließend mit (VI) zum Thioharnstoff (IX) gekuppelt.
Figure imgf000013_0003
Im letzten Schritt können gegebenenfalls noch vorhandene Schutzgruppen optional abgespalten werden, um so Konjugate der Formel (II) zu erhalten.
A-S-B ,l'-X vl1-(ΓCITHT2 %)n- r[Xv2- r(CH2 \)m] .x-X v3- /(pCuH2 \)p- vX44-PRG (II) In einer bevorzugten Ausführungsform des Herstellungsverfahrens umfasst (IV) eine Verbindung der Formel
Boc-NH-CH(SK)-CO-NH-(CH2)3-O-(CH2)2-O-(CH2)2-O-(CH2)3-NH2 (X) '
das mit einer Verbindung der Formeln (XI a-c) reagiert
Figure imgf000014_0001
U-CO-[CH2]r-Cl r = 1 - 10 (XI b)
U-CO-CΗ=CH (XI c)
und nach Ablösung der Boc-Schutzgruppe in Gegenwart von Ethyldiisopropylamin oder einer anderen geeigneten Base mit einem aus Verbindung (VIII) generierten Isothiocyanat, beispielsweise dem Isothiocyanat
Figure imgf000014_0002
zu den Zielverbindungen der Formel (II) umgesetzt wird.
In allen Reaktionschritten können reversibel abspaltbare Schutzgruppen, wie sei in der Peptidchemie üblich sind, eingesetzt werden. Eine Schutzgruppe SG kann erhalten bleiben oder gleichzeitig mit der Boc-Schutzgruppe oder in einem separaten
Schritt abgelöst werden. Geeignete Schutzgruppen sind beispielsweise die mit Trifluoressigsäure spaltbare Boc-Schutzgruppe oder die mit Piperidin oder Morpholin spaltbare Fmoc-Schutzgruppe. Weitere geeignete Schutzgruppen und die entsprechenden Methoden zur Einführung und Abspaltung wurden z. B. beschrieben in (a) Jakubke/Jeschkeit: Aminosäuren, Peptide, Proteine; Verlag Chemie 1982 oder (b) Houben-Weyl, Methoden der Organischen Chemie, Georg Thieme Verlag Stuttgart, Vierte Auflage; Band 15.1 und 15.2, herausgegeben von E. Wünsch.
Optional können die erfindungsgemäßen Affinitätsmarker auch in umgekehrter Reihenfolge aufgebaut werden, wobei zunächst in ein Derivat der Formel
SG-NH-CH(SK)-CO-B1-X1-(CH2)n-[X2-(CH2)m]x-X3-(CH2)p-X4-V (IV)
eine geeignete weitere Schutzgrappe SG', vorzugsweise die Fmoc-Schutzgruppe, nach Standardmethoden ((a)Jakubke/Jeschkeit: Aminosäuren, Peptide, Proteine; Verlag Chemie 1982; (b) Houben-Weyl, Methoden der Organischen Chemie, Georg Thieme Verlag Stuttgart, Vierte Auflage; Band 15.1 und 15.2, herausgegeben von E.
Wünsch) eingeführt wird, wobei
SG-NH-CH(SK)-CO-B1-X1-(CH2)n-[X2-(CH2)m]x-X3-(CH2)p-X4-SG' (XIII)
entsteht.
Im nächsten Schritt wird die N-terminale Schutzgruppe SG abgelöst und das erhaltene Derivat (XIII) dann mit dem aus (VIII) generierten Isothiocyanat wie beispielsweise (XII) umgesetzt zu Verbindungen der Formel
Figure imgf000015_0001
Nach Ablösung der Schutzgruppe SG', beispielsweise der Fmoc-Schutzgruppe mit Piperidin, wird im letzten Schritt die Kupplung mit dem Derivat einer proteinreaktiven Gruppe oder der aktivierten Vorstufe einer proteinreaktiven Gruppe
U-PRG (V) vorgenommen und das Konjugat
A-S-B1-X1-(CH2)n-[X2-(CH2)m]x-X3-(CH2)p-X4-PRG (II)
erhalten.
Die Reaktionen können bei verschiedenen Druck- und Temperaturverhältnissen durchgeführt werden, üblicherweise bei 0,5 bis 2 bar, bevorzugt unter Normaldruck, d. h. bei etwa 1 bar, und -30 bis +100 °C, vorzugsweise -10 bis + 80 °C, insbesondere 0 bis 30 °C. Die Durchführung erfolgt in geeigneten Lösungsmitteln wie Dimethylformamid (DMF), Tetrahydrofuran (THF), Dichlormethan, Chloroform, C C4- Alkoholen, Acetonitril, Dioxan, Wasser oder in Gemischen der genannten Lösungsmittel. In der Regel sind Reaktionen in DMF, Dichlormethan, THF, Dioxan/Wasser oder THF/Dichlormethan bei Raumtemperatur (RT), d. h. etwa
20 °C, oder unter Eiskühlung und Normaldruck bevorzugt.
Beispiele
Verwendete Abkürzungen:
Boc - tert-Butoxycarbonyl
DIEA - Diisopropylethylamin (Hünig's base)
DMAP - Dimethylaminopyridin
DMF - Dimethylformamid
DMSO - Dimethylsulfoxid EDCI - N-(3-Dimethylaminopropyl)-N'-ethyl-carbodiimid, x HC1
EI - Elektronenstoß-Ionisation
ESI - Elektrospray-Ionisation
Fmoc - Fluorenyl-9-methoxycarbonyl
HOBT - 1-Hydroxy-lH-benzotriazol HPLC - High-performance liquid chromatography
MALDI - Matrix-unterstützte Laserdesorption-Ionisation
MS - Massenspektroskopie
MTBE - Methyl tert-butyl ether
RP - Reverse phase RT - Raumtemperatur
TCEP - Triscarboxyethylphosphin
TFA - Trifluoressigsäure
THF - Tetrahydrofuran
TLC - Thin layer chromatography (v/v) - Konzentrationsangabe in Volumen pro Volumen
(w/v) - Konzentrationsangabe in Masse pro Volumen wässr. - wässriger
Die Angabe der Zusammensetzung von Lösungsmittel- und Elutionsmittelgemischen erfolgt, soweit nicht ausdrücklich anders angegeben, durch jeweils von "/" getrennte
Angabe der Komponenten und nachgestellt der relativen Volumenteile. So bedeutet z. B. "Acetonitril/Wasser 10/1" ein Gemisch von Acetonitril und Wasser im Volumenverhältnis von 10 zu 1.
Bevorzugt verwendete Elutionsmittel (Bezugnahme durch Angabe von ]) etc.):
^ Acetonitril/Wasser 10/1
2) Acetonitril/Wasser 20/1
3) Dichlormethan Methanol 97,5/2,5
4) Acetonitril/Wasser/Eisessig 10/1/0, 1 5) Acetonitril/Wasser/Eisessig 5/1/0,2
6) Acetonitril/Wasser/Eisessig 10/3/1,5
7) Dichlormethan Methanol/wässr. Ammoniak (17 %) 15/2/0,2
Zur nachfolgend beschriebenen Herstellung beispielhafter Affinitätsmarker wurden zunächst die Biotin-Derivate der Edukt-Serie 1 und die Zwischenprodukte der Edukt-
Serie 2 hergestellt. Diese Edukte wurden anschließend zu den entsprechenden Affinitätsmarker umgesetzt.
Edukt-Serie 1: Biotin-Derivate
E.1.1
Figure imgf000018_0001
l g (4,09 mmol) Biotin, 500 mg (4,09 mmol) 4-Aminobenzylamin sowie 830 mg
(6,14 mmol) 1-Hydroxy-lH-benzotriazol, 942 mg (4,91 mmol) N-(3-Dimethyl- aminopropyl)-N'-ethylcarbodiimid Hydrochlorid und 1587 mg Ethyl-diisopropyl- amin wurden in 40 ml DMF zusammengegeben. Es wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt, eingeengt und der Rückstand aufgereinigt durch Flash- Chromatographie an Kieselgel (Elutionsgemisch: Dichlormetha /Methanol/wässr. Ammoniak (17 %) 15/3/0,3). Die entsprechenden Fraktionen wurden vereinigt und das Lösungsmittel in vacύo abgedampft. Der Rückstand wurde mit Diethylether verrührt und abgesaugt. Es wurden 1097 mg (77 %) des Zwischenproduktes erhalten [TLC: Dichlormethan/Methanol/wässr. Ammoniak (17 %) 15/4/0,5: Rf = 0,58]
[ESI-MS: m e = 349 (M+H)+].
600 mg (1,72 mmol) dieses Zwischenproduktes wurden in 40 ml Dioxan/Wasser 1/1 gelöst und mit 298 mg (2,58 mmol) Thiophosgen und 890 mg Ethyl-diisopropylamin versetzt. Es wurde 10 min bei Raumtemperatur gerührt und eingeengt. Das
Zielprodukt E.l.l wurde aus Dichlormethan/Methanol mit Diethylether ausgefällt. Ausbeute: 616 mg (92 %) [TLC: Rf = 0,56 5)] [ESI-MS: m/e = 391 (M+H)+].
E.1.2
Figure imgf000019_0001
Mono-Fmoc-geschütztes p-Phenylen-diamin wurde nach Standard-Methoden, wie sie z. B. in Houben Weyl; Methoden der Organischen Chemie; Vierte Auflage; Band XV Teil 1 und 2; Georg Thieme Verlag Stuttgart 1974, oder in Hans-Dieter Jakubke and Hans Jeschkeit: Aminosäuren, Peptide, Proteine; Verlag Chemie, Weinheim 1982 beschrieben sind, hergestellt.
200 mg (0,82 mmol) Biotin wurden in 10 ml Dichlormethan aufgenommen und mit 974 mg (8,2 mmol) Thionylchlorid versetzt. Nach 1 h Rühren wurde eingeengt und zweimal mit Dichlormethan nachdestilliert.
Das entstandene Säurechlorid (0,81 mmol) wurde in 30 ml Dichlormethan aufgenommen und mit 387 mg (4,9 mmol) Pyridin sowie mit 242 mg (0,55 mmol) von Mono-Fmoc-geschütztem p-Phenylen-diamin versetzt. Es wurde 2 Tage bei RT gerührt und das ausgefallene Produkt abfiltriert. Erhalten wurden 300 mg (99 %) des Intermediats, das ohne weitere Aufreinigung in den nächsten Reaktionsschritt eingesetzt wurde [TLC: Rf = 0,5 l)].
Das Rohprodukt wurde in 5 ml DMF aufgenommen und mit 500 μl Piperidin versetzt. Nach 15 min Rühren bei Raumtemperatur wurde eingeengt und der Rückstand durch Flash-Chromatographie an Kieselgel gereinigt (Elutionsgemisch 7-)). Die entsprechenden Fraktionen wurden vereinigt, das Lösungsmittel entfernt und der Rückstand in vacuo getrocknet. Erhalten wurden 69 mg (39 %) des entschützten
Intermediats.
65 mg (0,19 mmol) dieses Zwischenproduktes wurden in 10 ml Dioxan/Wasser 1/1 gelöst und mit 33 mg (0,29 mmol) Thiophosgen und 100 mg Ethyl-diisopropylamin versetzt. Es wurde 10 min bei Raumtemperatur gerührt und eingeengt. Das
Zielprodukt E.1.2 wurde aus Dichlormethan Methanol mit Diethylether ausgefällt. Ausbeute: 65 mg (89 %) [TLC: Rf = 0,43 υ] [ESI-MS: m/e = 377 (M+H)+].
'E.1.3
Figure imgf000020_0001
500 mg (3,65 mmol) 4-Amino-benzoesäure wurden in 20 ml DMF aufgenommen und mit 872 mg (2,73 mmol) vom Hydrochlorid des Mono-Fmoc-geschützten Ethylendiamins sowie mit 739 mg (5,47 mmol) 1-Hydroxy-lH-benzotriazol und mit
839 mg (4,38 mmol) N-(3-Dimethylaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimid Hydrochlorid versetzt. Es wurde 2 h bei Raumtemperatur gerührt, eingeengt und der Rückstand in 200 ml Dichlormethan aufgenommen. Es wurde dreimal mit 200 ml Natriumhydrogencarbonatlösung ausgeschüttelt. Die organische Phase wurde eingeengt und der Rückstand durch Flash-Chromatographie an Kieselgel gereinigt (Elutionsmittel: Acetonitril). Die entsprechenden Fraktionen wurden vereinigt und das Lösungsmittel in vacuo abgedampft und der Rückstand getrocknet. Erhalten wurden 639 mg (59 %) des Zwischenproduktes [TLC: Rf = 0,68 2)]
400 mg (1 mmol) des Intermediats wurden in 10 ml DMF aufgenommen und mit 500 μl Piperidin versetzt. Nach 15 min Rühren bei Raumtemperatur wurde eingeengt und der Rückstand durch Flash-Chromatographie an Kieselgel gereinigt (Elutionsgemisch: Dichlormethan Methanol/wässr. Ammoniak (17 %) 15/4/0,5). Die entsprechenden Fraktionen wurden vereinigt, das Lösungsmittel entfernt und der
Rückstand in vacuo getrocknet. Erhalten wurden 147 mg (82 %) des entschützten Intermediats [TLC: Acetonitril/Wasser/Eisessig 5/1/0,2: Rf = 0,18].
191 mg (0,78 mmol) Biotin wurden in 10 ml DMF aufgenommen und mit 158 mg (1,17 mmol) 1-Hydroxy-lH-benzotriazol und 180 mg (0,94 mmol) N-(3-Dimethyl- aminopropyl)-N'-ethylcarbodiimid Hydrochlorid versetzt. Es wurde 10 min bei RT gerührt und dann 303 mg Ethyl-diisopropylamin sowie 140 mg (0,78 mmol) des entschützten Intermediats zugesetzt. Dann wurde nochmals 6 h bei RT gerührt, eingeengt und das Rohprodukt aus Dichlormethan mit Diethylether ausgefällt. Der Rückstand wurde abgetrennt und durch Flash-Chromatographie an Kieselgel gereinigt (Elutionsgemisch: Dichlormethan/Methanol/wässr. Ammoniak (17 %)
15/3/0,3). Die entsprechenden Fraktionen wurden vereinigt und das Lösungsmittel in vacuo abgedampft und der Rückstand getrocknet. Es wurden 222 mg (70 %) des
Zwischenproduktes erhalten [TLC: Dichlormethan/Methanol/wässr. Ammoniak (17 %) 15/4/0,5: Rf = 0,47].
200 mg (0,54 mmol) dieses Zwischenproduktes wurden in 15 ml Dioxan Wasser 1/1 gelöst und mit 94 mg (0,81 mmol) Thiophosgen und 210 mg Ethyl-diisopropylamin versetzt. Es wurde 15 min bei Raumtemperatur gerührt und eingeengt. Das Zielprodukt wurde aus Dichlormethan/Methanol mit Diethylether ausgefällt.
Ausbeute: 230 mg (95 %) [TLC: Acetonitril/Wasser/Eisessig 5/1/0,2: Rf = 0,44] [ESI-MS: m/e = 448 (M+H)+]. Edukt-Serie 2
E.2.1
Figure imgf000022_0001
Zu einer Lösung von 4,7,10-Trioxa-l,13-tridecandiamin (1 g, 4,54 mmol) in 30 ml Dichlormethan wurden 913,2 mg (4,54 mmol) Boc-Glycin-N-carboxy-anhydrid sowie 100 mg 4-Dimethylaminopyridin gegeben und 16 h bei RT gerührt. Der Ansatz wurde dann bei vermindertem Druck eingeengt, der Rückstand in
Dichlormethan aufgenommen und mit wenig Wasser gewaschen. Die organische Phase wurde dann über Natriumsulfat getrocknet, eingeengt und der Rückstand durch Flash-Chromatographie gereinigt (Eluent: Dichlormethan/Methanol/wässr. Ammoniak (17 %) 15/3/0,3). Die entsprechenden Fraktionen wurden gesammelt, das Lösungsmittel abgedampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Erhalten wurden 333 mg (20 %) eines Öls [TLC: Rf = 0,26 5)].
E.2.2
Figure imgf000022_0002
Zu einer Lösung von 4,7,10-Trioxa-l,13-tridecandiamin (195 mg, 0,88 mmol) in 20 ml Dichlormethan wurden 400 mg (0,88 mmol) Bis-tert-butoxycarbonyl-histidin- N-hydroxysuccinimidester gegeben und 30 min bei RT gerührt. Anschließend wurde das Lösungsmittel im Vakuum entfernt und der Rückstand durch Flash-
Chromatographie an Kieselgel (Elutionsmittel: Dichloπnethan Methanol/Ammoiiiak 17 % 15/3/0,3) gereinigt. Die entsprechenden Fraktionen wurden vereinigt, das Lösungsmittel in vacuo abgedampft. Der Rückstand wurde in Dichlormethan aufgenommen und mit Wasser ausgeschüttelt. Die organische Phase wurde über Natriumsulfat getrocknet und dann eingeengt. Erhalten wurden 165 mg (34 %) eines Öls [TLC: Rf = 0,31 5)].
E.2.3
Figure imgf000023_0001
500 mg (2,3 mmol) Boc-D-Valin sowie 467 mg (3,45 mmol) 1-Hydroxy-lH- benzotriazol und 530 mg (2,76 mmol) N-(3-Dimethylaminopropyl)-N'-ethyl- carbodiimid Hydrochlorid wurden in 25 ml DMF zusammengegeben und 30 min bei RT gerührt. Anschließend wurden 507 mg (2,3 mmol) 4,7,10-Trioxa-l,13- tridecandiamin hinzugegeben und der Ansatz über Nacht bei RT gerührt. Dann wurde eingeengt, der Rückstand in Dichlormethan aufgenommen und zweimal mit
Wasser ausgeschüttelt. Anschließend wurde die organische Phase eingeengt und der Rückstand durch Flash-Chromatographie an Kieselgel gereinigt (Elutionsmittel 7)). Die entsprechenden Fraktionen wurden vereinigt und das Lösungsmittel in vacuo abgedampft. Der Rückstand wurde in Dichlormethan aufgenommen und mit Wasser ausgeschüttelt. Die organische Phase wurde über Natriumsulfat getrocknet und dann eingeengt. Erhalten wurden 220 mg (23 %) eines Öls [TLC: Rf = 0,29 5)].
E.2.4
Figure imgf000023_0002
Zu der Lösung von 4,7,10-Trioxa-l,13-tridecandiamin (20,0 g; 90,8 mmol) in 2-Pro- panol (2000 ml) wurde bei -10 °C eine Lösung von Chlorameisensäure-(9- fluorenylmethyl)-ester (23,5 g; 90,8 mmol) in Tetrahydrofuran (500 ml) langsam zugetropft. Nach 2 h wurde der Ansatz bei vermindertem Druck eingeengt. Der Rückstand wurde in Dichlormethan (1000 ml) aufgenommen und zweimal mit gesättigter Natriumchlorid-Lösung (je 250 ml) gewaschen. Die organische Phase wurde getrocknet und eingeengt. Der Rückstand war weitgehend einheitlich und frei von dem Ausgangsprodukt 4,7,10-Trioxa-l,13-tridecandiamin. Die Ausbeute an Rohprodukt betrug 36,5 g (91 %) in Form eines Sirup [TLC: Dichlor- methan/Methanol 5/1: Rf = 0,27] [ESI-MS: m/z 443,4 (M+H)+].
E.2.5
Figure imgf000024_0001
378 mg (2,2 mmol) Boc-Glycin sowie 364 mg (2,7 mmol) 1-Hydroxy-lH-benzo- triazol und 413 mg (2,16 mmol) N-(3-Dimethylaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimid Hydrochlorid wurden in 30 ml DMF zusammengegeben und 30 min bei RT gerührt.
Anschließend wurden 1000 mg (1,8 mmol) der Verbindung E.2.4 hinzugegeben und der Ansatz 2 h bei RT gerührt. Dann wurde eingeengt, der Rückstand in Dichlormethan aufgenommen und zweimal mit Wasser ausgeschüttelt. Anschließend wurde die organische Phase eingeengt und der Rückstand durch Flash- Chromatographie an Kieselgel gereinigt (Elutionsmittel 2)). Die entsprechenden
Fraktionen wurden vereinigt und das Lösungsmittel in vacuo abgedampft. Der Rückstand wurde in Dichlormethan aufgenommen und mit Wasser ausgeschüttelt. Die organische Phase wurde über Natriumsulfat getrocknet und dann eingeengt. Erhalten wurden 797 mg (76 %) eines Öls [TLC: Rf = 0,64 1}]. E.2.6
Figure imgf000025_0001
Aus den 790 mg (1,35 mmol) der Verbindung E.2.5 wurde die Boc-Schutzgruppe nach Standardbedingungen mit Trifluoressigsäure in Dichlormethan abgelöst (800 mg, 98 %).
790 mg (1,32 mmol) des entschützten Intermediats wurden in 30 ml DMF aufgenommen und mit 514 mg (1,32 mmol) der Verbindung E.l.l sowie mit 511 mg
N,N-Diisopropylethylamin vesetzt und 16 h bei RT gerührt. Das Lösungsmittel wurde abgedampft, der Rückstand mit 30 ml Wasser verrührt und der verbleibende Feststoff abfiltriert. Er wurde in Dichlormethan/Methanol aufgenommen und anschließend mit Diethylether die Zielverbindung ausgefällt. Erhalten wurden nach Filtration und Trocknung 1077 mg (93 %) [TLC: Rf = 0,4 4)].
1070 mg (1,22 mmol) dieses Intermediats wurden in 25 ml DMF aufgenommen und mit 1 ml Piperidin versetzt. Nach 45 min Rühren bei Raumtemperatur wurde eingeengt und der Rückstand mit Dichlormethan digeriert. Anschließend wurde abfiltriert und der Filterrückstand in einer Mischung aus 10 ml Dichlormethan und
10 ml Methanol suspendiert. Nach Zugabe von 100 ml Diethylether fiel das Produkt vollständig aus und wurde abfiltriert und getrocknet. Erhalten wurden 805 mg (99 %) des Zielproduktes E.2.6 [TLC: Acetonitril/Wasser/Eisessig 10/3/1,5 Rf = 0,4].
E.2.7 Diethylenglycol (3,18 g; 30 mmol) wurde zu einer Lösung aus wässrigem Kaliumhydroxid (40 %; 120 mg) und 1,4-Dioxan (3,75 ml) getropft. Die Lösung wurde unter Eiskühlung tropfenweise mit Acrylsäurenitril-1,2,3-(13C)3 (3,36 g; 60 mmol) versetzt. Nach Erwärmen auf Raumtemperatur wurde 16 h nachgerührt. Die Lösung wurde mit Dichlormethan (30 ml) verdünnt und zweimal mit gesättigter Kochsalzlösung gewaschen. Die organische Phase wurde getrocknet und eingeengt. Der Rückstand wurde säulenchromatographisch gereinigt (Eluent: Dichlormethan/Me- thanol 50/1). Ausbeute: 6,21 g (95 %), Konsistenz: Sirup [TLC: Dichlormethan/Methanol 10/1: Rf = 0,71; MS (ESI): mlz 241,1 (M+Na)+, 219,1 (M+H)+].
E.2.8
Figure imgf000026_0001
Die Lösung der Verbindung E.2.7 (5,0 g; 22,9 mmol) in Methanol (115 ml) und konzentrierter wässriger Ammoniaklösung (68 ml) wurde mit Raney-Nickel (2,5 g) versetzt und 5 h bei 100 °C und 100 bar mit Wasserstoff hydriert. Nach Abkühlen auf Raumtemperatur wurde der Katalysator abgesaugt. Das Filtrat wurde eingeengt. Der Rückstand wurde dreimal in Ethanol aufgenommen und eingeengt. Ausbeute:
3,84 g (74 %), Konsistenz: Sirup [TLC: Dichlormethan/Methanol/Ammoniak 4/3/1: Rf = 0,27] [MS (ESI): mlz 227,3 (M+H)+; 13C-NMR (100,6 MHz, CDC13): δ = 69,48, 69,10 (13CH2-O), 39,13, 38,77 (13CH2-NH2), 32,74, 32,38, 32,36, 32,01 (13CH2- 13CH2-13CH2)]. E.2.9
Figure imgf000027_0001
Zu der Lösung der Verbindimg E.2.8 (1,0 g; 4,42 mmol) in 2-Propanol (50 l) wurde bei -10 °C eine Lösung von Chlorameisensäure-(9-fluorenylmethyl)-ester
(1,14 g; 4,42 mmol) in Tetrahydrofuran (20 ml) gegeben. Es wurde langsam auf Raumtemperatur erwärmt und 16 h gerührt. Die Mischung wurde eingeengt. Der Rückstand wurde in Dichlormethan (50 ml) aufgenommen, zweimal mit gesättigter wässriger Kochsalzlösung gewaschen, getrocknet und eingeengt. Der Rückstand ist weitgehend einheitlich und wurde ohne weitere Aufreinigung in der Folgestufe eingesetzt. Ausbeute: 1,76 g (89 %), Konsistenz: Sirup [TLC: Dichlormethan Me- thanol 5/1: R 0,27] [MS (ESI): mlz 449,4 (M+H)+].
E.2.10
Figure imgf000027_0002
In 15 g (68 mmol) 4,7,10-Trioxa-l,13-tridecandiamin wurde nach Standardbedingungen mit Di-tert-butyldicarbonat in Dichlormethan die Boc-Schutzgruppe eingeführt [TLC: Rf = 0,34 5)].
E.2.11
Figure imgf000027_0003
372 mg (2 mmol) Maleimidobuttersäure sowie 316 mg (2,34 mmol) 1-Hydroxy-lH- benzotriazol und 359 mg (1,87 mmol) N-(3-Dimethylammopropyl)-N'-ethylcarbodi- imid Hydrochlorid wurden in 25 ml DMF zusammengegeben und 1 h bei RT gerührt. Anschließend wurden 500 mg (1,56 mmol) der Verbindung E.2.10 und 403 mg
Ethyldiisopropylamin hinzugegeben und der Ansatz weitere 16 h bei RT gerührt. Dann wurde eingeengt, der Rückstand in Dichlormethan aufgenommen und viermal mit Wasser ausgeschüttelt. Anschließend wurde die organische Phase über Natriumsulfat getrocknet, eingeengt und der Rückstand aus Dichlormethan mit Petrolether gefällt. Der Überstand wurde abdekantiert und der verbleibende ölige
Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Erhalten wurden 577 mg (76 %) des gewünschten Produktes [TLC: Rf = 0,48 4)] .
570 mg (1,17 mmol) dieses Intermediats wurden in 10 ml Dichlormethan aufgenom- men und mit 1 ml TFA versetzt. Nach 30 min Rühren bei Raumtemperatur wurde eingeengt und der Rückstand aus Dichlormethan mit Diethylether gefällt. Nach Filtration und Trocknung wurden 90 mg (85 %) des gewünschten Produkts als Trifluoressigsäuresalz erhalten [TLC: Rf = 0,2 5)].
E.2.12
Figure imgf000028_0001
Herstellung in Analogie zu Beispiel E.2.10 und E.2.11 ausgehend von Beispiel E.2.8 [TLC: Rf = 0,l 5)]. E.2.13
Figure imgf000029_0001
Herstellung in Analogie zu Beispiel E.2.10 und E.2.11 ausgehend von Beispiel E.2.8 [TLC: Rf = 0,2 5)].
E.2.14
Figure imgf000029_0002
CF3COOH
Zu einer Lösung von 200 mg (0,4 mmol) der Verbindung E.2.11 in 15 ml Dimethylformamid wurden 125 mg (0,4 mmol) Tert-butoxycarbonyl-prolin-N- hydroxysuccinimidester sowie 155 mg Ethyldiisopropylamm gegeben und 30 min bei RT gerührt. Anschließend wurde das Lösungsmittel im Vakuum entfernt und der
Rückstand durch Flash-Chromatographie an Kieselgel (Elutionsmittel: Acetonitril/ Wasser 20/1) gereinigt. Die entsprechenden Fraktionen wurden vereinigt, das Lösungsmittel in vacuo abgedampft und der Rückstand getrocknet. Anschließend wurde nach Standardbedingungen die Boc-Schutzgruppe abgelöst. Ausbeute: 75 % über 2 Stufen [TLC: Rf = 0,22 5)]. E.2.15
Figure imgf000030_0001
CF3COOH
Herstellung analog zu E.2.14.
Ausbeute: 54 % über 2 Stufen [TLC: Rf = 0,23 5)].
E.2.16
Figure imgf000030_0002
Herstellung in Analogie zu Beispiel E.2.14 ausgehend von E.2.13. Ausbeute: 55 % über 2 Stufen [TLC: Rf = 0,1 5)].
E.2.17
Figure imgf000030_0003
CF3COOH
Herstellung durch Verknüpfung von Boc-Sarkosin mit Verbindung E.2.11 in Gegenwart von EDCI/HOBT und anschließende Boc-Abspaltung nach
Standardbedingungen. Ausbeute: 56 % über 2 Stufen [TLC: Rf = 0,14 5)]. E.2.18
Figure imgf000031_0001
Herstellung in Analogie zu Beispiel E.2.17 ausgehend von Beispiel E.2.12.
Ausbeute: 71 % über 2 Stufen [TLC: Rf = 0,1 5)].
E.2.19
Figure imgf000031_0002
CF3COOH
Herstellung durch Verknüpfung von Boc-Piperidin-4-carbonsäure mit Verbindung E.2.11 in Gegenwart von EDCI/HOBT und anschließende Boc-Abspaltung nach Standardbedingungen.
E.2.20
Figure imgf000031_0003
Herstellung in Analogie zu Beispiel E.2.19 ausgehend von Beispiel E.2.12.
Ausbeute: 51 % über 2 Stufen [TLC: Rf = 0,08 5)]. Beispiele für säurespaltbare Affinitätsmarker
Beispiel 1: Herstellungsverfahren (Variante A)
Figure imgf000032_0001
45 mg (265 μmol) Maleimidopropionsäure sowie 54 mg (0,397 mmol) 1-Hydroxy- lH-benzotriazol und 61 mg (0,318 mmol) N-(3-Dimethylaminopropyl)-N'-ethyl- carbodiimid Hydrochlorid wurden in 10 ml DMF zusammengegeben und 2 h bei RT gerührt. Anschließend wurden 100 mg (0,265 mmol) der Verbindung E.2.1 und
103 mg Ethyldiisopropylamm hinzugegeben und der Ansatz weitere 2h bei RT gerührt. Dann wurde eingeengt, der Rückstand in Dichlormethan aufgenommen und viermal mit Wasser ausgeschüttelt. Anschließend wurde die organische Phase über Natriumsulfat getrocknet, eingeengt und der Rückstand aus Dichlormethan mit Petrolether gefällt. Der Überstand wurde abdekantiert und der verbleibende ölige
Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Erhalten wurden 103 mg (74 %) des gewünschten Produktes [TLC : Rf = 0,48 4)] .
100 mg (189 μmol) dieses Intermediats wurden in 10 ml Dichlormethan aufgenommen und mit 1 ml TFA versetzt. Nach 30 min Rühren bei Raumtemperatur wurde eingeengt und der Rückstand aus Dichlormethan mit Diethylether gefällt. Nach Filtration und Trocknung wurden 90 mg (85 %) des gewünschten Produkts als Trifluoressigsäuresalz erhalten [TLC: Rf = 0,58 6)].
88 mg (158 μmol) des entschützten Intermediats und 62 mg (158 μmol) des
Isothiocyanats E.l.l aus der Edukt-Serie 1 wurden in 10 ml DMF gelöst, mit 83 μl Ethyldiisopropylamm versetzt und dann 3 h bei RT gerührt. Es wurde eingeengt, der Rückstand mit Wasser verrührt und abgesaugt. Der Rückstand wurde abgetrenntm, dann in 4 ml Dichlormethan/Methanol 1/1 und in 2 ml DMF aufgenommen und mit Diethylether gefällt. Der Niederschlag wurde abgesaugt und nach Trocknung im Hochvakuum wurden 110 mg (85 %) der Zielverbindung erhalten [TLC: Rf = 0,5 5)] [ESI-MS: m e = 819 (M+H)+].
Beispiel 2: Herstellungsverfahren (Variante B)
Figure imgf000033_0001
790 mg (1,35 mmol) der Verbindung E.2.5 wurden in 40 ml Dichlormethan aufgenommen und mit 8 ml TFA versetzt. Nach 1 h Rühren bei Raumtemperatur wurde eingeengt und der Rückstand aus Dichlormethan mit Diethylether gefällt, der
Überstand wurde abdekantiert und das harzige Produkt im Hochvakuum getrocknet. Erhalten wurden 800 mg (99 %) des gewünschten Produkts als Trifluoressigsäuresalz [TLC: Rf= 0,3 5)].
790 mg (1,32 mmol) des entschützten Intermediats wurden in 30 ml DMF vorgelegt und mit 515 mg (1,32 mmol) des Isothiocyanats E.l.l aus der Edukt-Serie 1 sowie mit 690 μl Ethyldiisopropylamm versetzt und dann über Nacht bei RT gerührt. Es wurde eingeengt, der Rückstand mit 10 ml Wasser verrührt und abgesaugt. Der Rückstand wurde abgetrennt und dann in Dichlormethan/Methanol suspendiert. Es wurden noch 50 ml Diethylether zugesetzt und der Niederschlag erneut abfiltriert.
Nach Filtration und Trocknung wurden 1077 mg (93 %) der gewünschten Verbindung erhalten [TLC : Rf = 0,44)] .
1070 mg (1,22 mmol) dieses Intermediats wurden in 25 ml DMF aufgenommen und mit 1 ml Piperidin versetzt. Nach 45 min Rühren bei Raumtemperatur wurde eingeengt und der Rückstand mit Dichlormethan digeriert. Anschließend wurde abfiltriert und der Filterrückstand in einer Mischung aus 10 ml Dichlormethan und 10 ml Methanol suspendiert. Nach Zugabe von 100 ml Diethylether fiel das Produkt vollständig aus und wurde abfiltriert und getrocknet. Erhalten wurden 805 mg (99 %) des %) des entschützten Intermediats E.2.6 [TLC: Rf = 0,4 6)]. 9,5 mg (45 μmol) Maleimidocapronsäure sowie 9,1 mg (0,067 mmol) 1-Hydroxy- lH-benzotriazol und 10,3 mg (0,054 mmol) N-(3-Dimethylaminopropyl)-N'-ethyl- carbodiimid Hydrochlorid wurden in 15 ml DMF zusammengegeben und 1,5 h bei RT gerührt. Anschließend wurden 30 mg (0,265 mmol) des in der Vorstufe entschützten Intermediats (Verbindung E.2.6) sowie 24 μl N,N-Diisopropyl- ethylamin zugegeben, und die Lösung dann über Nacht bei RT gerührt. Das Lösungsmittel wurde abgedampft und der Rückstand in 3 ml Dichlormethan/ Methanol 1/1 aufgenommen und anschließend mit 15 ml Diethylether versetzt. Das ausgefällte Rohprodukt wurde durch Flash-Chromatographie an Kieselgel
(Elutionsmittel: Acetonitril/Wasser 10/1) gereinigt. Die entsprechenden Fraktionen wurden vereinigt, das Lösungsmittel in vacuo abgedampft. Der Rückstand wurde in Dioxan/Wasser 1/1 gelöst und lyophilisiert. Erhalten wurden 6 mg (16 %) des Zielproduktes [TLC: Rf = 0,2 1}] [ESI-MS: m/e = 861 (M+H)+].
Folgende Beispiele wurden, soweit nicht anders angegeben, in analoger Weise zu Beispiel 1 (Variante A) oder Beispiel 2 (Variante B) hergestellt. Die jeweilige Variante ist nachfolgend entweder genannt oder beschrieben.
Beispiel 3
Figure imgf000034_0001
Edukte: E.2.2, E.l.l; Variante A Ausbeute: 11 % über 3 Stufen
Rf = 0,65 6)
[ESI-MS: m/e = 899 (M+H)+] Die Verbindung ist glatt wasserlöslich. Beispiel 4
Figure imgf000035_0001
Edukte: E.2.3, E.l.l; Variante A
Ausbeute: 23 % über 3 Stufen
Rf = 0,67 5)
[ESI-MS: m/e = 861 (M+H)+]
Beispiel 5
Figure imgf000035_0002
50 mg (75 μmol) der Verbindung E.2.6 wurden in Dichlormethan suspendiert und unter Argon portionsweise mit 18 μl (225 μmol) Acrylsäurechlorid sowie 12 μl
Pyridin versetzt. Die Mischung wurde dann über 2 Tage bei RT gerührt. Das Lösungsmittel wurde abgedampft und der Rückstand durch Flash-Chromatographie an Kieselgel gereinigt (Elutionsmittel !)). Die entsprechenden Fraktionen wurden vereinigt und das Lösungsmittel in vacuo abgedampft. Der Rückstand wurde in Dioxan/Wasser 1/1 gelöst und lyophilisiert. Erhalten wurden 12 mg (22 %) des
Zielproduktes [TLC: Rf = 0,14 l)] [ESI-MS: m e = 722 (M+H)+].
Beispiel 6
Figure imgf000035_0003
50 mg (75 μmol) der Verbindung E.2.6 wurden in 20 ml Dichlormethan suspendiert und unter Argon mit 24 μl (300 μmol) Chloracetylchlorid sowie 12 μl Pyridin versetzt. Die Mischung wurde dann über 2 h bei RT gerührt. Das Lösungsmittel wurde abgedampft und der Rückstand mit 5 ml Dichlormethan behandelt. Der verbleibende Feststoff wurde abgetrennt und durch Flash-Chromatographie an Kieselgel gereinigt (Elutionsmittel !)). Die entsprechenden Fraktionen wurden vereinigt und das Lösungsmittel in vacuo abgedampft. Der Rückstand wurde in Dichlormethan/Methanol aufgenommen und das Zielprodukt mit Diethylether ausgefällt. Erhalten wurden 12 mg (22 %) des Zielproduktes [TLC: Rf = 0,21 l)]
[ESI-MS: m/e - 744 (M+H)+].
Beispiel 7 : Herstellungsverfahren (Variante C)
Figure imgf000036_0001
Die Verbindung E.2.11 wurde wie in Beispiel E.2.5 beschrieben mit Boc-Glycin umgesetzt. Ausbeute: 61 % [TLC: Rf = 0,52 4)]
Anschließend wurde die Boc-Schutzruppe mit Trifluoressigsäure in Dichlormethan abgelöst. Ausbeute: 98 % [TLC: R = 0,2 5)]
Dieses entschützte Intermediat und 62 mg (158 μmol) des Isothiocyanats E.l.l aus der Edukt-Serie 1 wurden dann wie in Beispiel 1 beschrieben miteinander zur Reaktion gebracht, um das Zielprodukt zu erhalten. [TLC: Rf = 0,4 5)] Beispiel 8
Figure imgf000037_0001
Edukte: E.2.11 ; Boc-Glycin; E.1.2 Variante C
[TLC: Rf = 0,5 5)]
Beispiel 9
Figure imgf000037_0002
Edukte: E.2.11 ; Bis-Boc-Histidin; E.1.1 Variante C
[TLC: Rf = 0,35 6)]
Beispiel 10
Figure imgf000037_0003
Edukte: E.2.11 ; Bis-Boc-Histidin; E.1.2 Variante C [TLC: Rf = 0,35 6)] Beispiel 11
Figure imgf000038_0001
Edukte: E.2.11; Boc-Glutaminsäure-δ-tert.butylester; E.l.l Variante C
[TLC: Rf = 0,5 5)]
Beispiel 12
Figure imgf000038_0002
Edukte: E.2.11 ; Boc-Glutaminsäure-δ-tert.butylester; E.1.2 Variante C
[TLC: Rf = 0,7 6)]
Beispiel 13
Figure imgf000038_0003
Edukte: E.2.11 ; Boc-Glutaminsäure-δ-tert.butylester; E.l.l Variante C und anschließende Überführung in das Natriumsalz mit 1 Äquivalent wässriger Natriumhydroxidlösung. Ausbeute: 38 % über 4 Stufen [TLC: Rf = 0,4 5)] [ESI-MS: m/e = 905 (M+H)+]. Beispiel 14
Figure imgf000039_0001
Edukte: E.2.11 ; Boc-Glutaminsäure-δ-tert.butylester; E.1.2
Variante C und anschließende Überführung in das Natriumsalz mit 1 Äquivalent wässriger Natriumhydroxidlösung. ' Ausbeute: 52 % über 4 Stufen [TLC: Rf = 0,5 5)] [ESI-MS: m/e = 891 (M+H)+].
Beispiel 15
Figure imgf000039_0002
Edukte: • E.2.17; Boc-Glycm-N-carbonsäureanhydrid; E.1.2 Variante C, wobei anstelle der Aktivierung über EDCI/HOBT als aktivierter
Aminosäurebaustein Boc-Glycin-N-carbonsäureanhydrid eingesetzt wurde. Ausbeute: 55 % über 3 Stufen [TLC: Rf = 0,45 5)] [ESI-MS: m e = 890 (M+H)+].
Beispiel 16
Figure imgf000040_0001
Edukte: E.2.18; Boc-Glycin; E.1.2 Variante C
Ausbeute: 37 % über 3 Stufen [TLC: Rf = 0,4 5)] [ESI-MS: m/e = 896 (M+H)+].
Beispiel 17
Figure imgf000040_0002
Edukte: E.2.14; Boc-Glycin-N-carbonsäureanhydrid; E.1.2
Variante C, wobei anstelle der Aktivierung über EDCI/HOBT als aktivierter
Aminosäurebaustein Boc-Glycin-N-carbonsäureanhydrid eingesetzt wurde. Ausbeute: 47 % über 3 Stufen [TLC: Rf = 0,45 5)] [ESI-MS: m e = 916 (M+H)+].
Beispiel 18
Figure imgf000040_0003
Edukte: E.2.19; Boc-Glycin; E.1.2 Variante C
Ausbeute: 47 % über 3 Stufen [TLC: Rf = 0,5 5)] [ESI-MS: m/e = 930 (M+H)+].
Beispiel 19
Figure imgf000041_0001
Edukte: E.2.20; Boc-Glycin; E.1.2 Variante C
Ausbeute: 32 % über 3 Stufen [TLC: Rf = 0,5 5)] [ESI-MS: m/e = 936 (M+H)+].
Beispiel 20
Figure imgf000041_0002
Edukte: E.2.17; Boc-Glycin-N-carbonsäureanhydrid; E.l.l
Variante C, wobei anstelle der Aktivierung über EDCI/HOBT als aktivierter Aminosäurebaustein Boc-Glycin-N-carbonsäureanhydrid eingesetzt wurde. Ausbeute: 55 % über 3 Stufen [TLC: Rf = 0,46 5)] [ESI-MS: m/e = 904 (M+H)+]. Beispiel 21
Figure imgf000042_0001
Edukte: E.2.17; Boc-Glycin-N-carbonsäureanhydrid; E.1.3
Variante C, wobei anstelle der Aktivierung über EDCI/HOBT als aktivierter
Aminosäurebaustein Boc-Glycin-N-carbonsäureanhydrid eingesetzt wurde. Ausbeute: 38 % über 3 Stufen [TLC: Rf = 0,4 5)] [ESI-MS: m/e = 961 (M+H)+].
Beispiel 22
Figure imgf000042_0002
Edukte: E.2.17; Boc-Glutaminsäure-δ-tert.butylester; E.1.2 Variante C
Ausbeute: 19 % über 3 Stufen [TLC: Rf = 0,46 5)] [ESI-MS: m/e = 962 (M+H)+].
Beispiel 23
Figure imgf000042_0003
Edukte: E.2.14; Boc-Glycin-N-carbonsäureanhydrid; E.l.l
Variante C, wobei anstelle der Aktivierung über EDCI/HOBT als aktivierter
Aminosäurebaustein Boc-Glycin-N-carbonsäureanhydrid eingesetzt wurde. Ausbeute: 47 % über 3 Stufen [TLC: Rf = 0,44 5)] [ESI-MS: m/e = 930 (M+H)+].
Beispiel 24
Figure imgf000043_0001
Edukte: E.2.13; Boc-Glycin; E.l.l Variante C
Ausbeute: 42 % über 3 Sttifen [TLC: Rf = 0,57 5)] [ESI-MS: m e = 867 (M+H)+].
Beispiel 25
Figure imgf000043_0002
Edukte: E.2.15 ; Boc-Glycin-N-carbonsäureanhydrid; E.l.l
Variante C, wobei anstelle der Aktivierung über EDCI/HOBT als aktivierter Aminosäurebaustein Boc-Glycin-N-carbonsäureanhydrid eingesetzt wurde. Ausbeute: 37 % über 3 Stufen [TLC: Rf = 0,5 5)] [ESI-MS: m/e = 958 (M+H)+]. Proteinanalytische Untersuchungen
Kupplung der Affinitätsmarker an SDS-7 und Beschreibung des Arbeitsablaufs an Hand von Beispiel 2
Als Probe wurde eine Mischung von sieben Proteinen verwendet, die auch Verwendung als Größenstandard in der Gelelektrophorese findet (SDS-7-Marker, Sigma-Aldrich GmbH, Taufkirchen).
24 μg der Proteinmischung wurden in 5 μl Puffer 1 gelöst und mit 135 μl Puffer 3 verdünnt. Durch Erhitzen auf 100 °C für 3 Minuten wurden die Proteine denaturiert. Zur Reduktion der vorhandenen Cysteine wurde 3 μl Reduktionslösung zugegeben und der Ansatz 10 Minuten bei 100 °G ihkubiert. Zur Umsetzung der freien Cysteine mit dem Affimtätsmarker wurde dann 5 μl Derivatisierungslösung zugesetzt und für 90 Minuten bei 37 °C inkubiert.
Nach der Derivatisierung wurden 3 μl Trypsinlösung zugesetzt. Die Spaltung der Proteine erfolgt über Nacht (ca. 17 Stunden) bei 37 °C.
Puffer 1 : 50 mM Tris-HCl, pH 8,3; 5 mM EDTA; 0,5 % (w/v) SDS
Puffer 2: 10 mM NE Acetat, pH 7
Puffer 3: 50 mM Tris-HCl, pH 8,3; 5 mM EDTA
Reduktionslösung: 50 mM TCEP in Puffer 2
Derivatisierungslösung: 30 μg/μl Affinitätsmarker in DMSO Trypsinlösung: 1 mg/ml Trypsin (Promega GmbH, Mannheim) in Puffer 3
Affinitätsreinigung derivatisierter Peptide
Die Affinitätssäulen (Monomeric Avidin, Perbio Science Deutschland GmbH, Bonn) mit einem Säulenvolumen von 200 μl wurden vor der Aufreinigung frisch hergestellt und durch folgende Waschschritte vorbereitet: - Zwei Säulenvolumina 2xPBS
- Vier Säulenvolumina 30 % (v/v) Acetonitril / 0,4 % (v/v) Trifluoressigsäure
- Sieben Säulenvolumina 2xPBS
- Vier Säulenvolumina 2 mM Biotin in 2xPBS - Sechs Säulenvolumina 100 mM Glycin, pH 2,8
- Sechs Säulenvolumina 2xPBS
30 μl Probe wurden vor dem Auftragen mit 30 μl 2xPBS verdünnt und dann auf die Säule aufgetragen. Danach wurden zum Entfernen der nicht-biotinylierten Peptide folgende Waschschritte durchgeführt:
- Sechs Säulenvolumina 2xPBS
- Sechs Säulenvolumina PBS
- Sechs Säulenvolumina 50 mM Ammoniumhydrogencarbonat / 20 % (v/v) Methanol
- Ein Säulenvolumen 0,3 % (v/v) Ameisensäure
Die Probe wurde mit folgenden Schritten eluiert:
- Drei Säulenvolumina 0,3 % (v/v) Ameisensäure
- Drei Säulenvolumina 30 % (v/v) Acetonitril / 0,4 % (v/v) Trifluoressigsäure
Das Eluat wurde bis zur Trockenheit eingedampft und erst kurz vor der Analyse mit Massenspektrometrie wieder gelöst.
PBS: Stammlösung lOx, GibcoBRL, Cat. No. 14200-067
Massenspektrometrische Analyse
Zur Analyse der Peptide wurde ein Ionenfallen-Massenspektrometer (LCQdeka,
ThermoFinnigan, San Jose) eingesetzt, das direkt mit einer Hochdruckflüssig- keitschromatographie verbunden ist (LC-MS). Als Trennsäule wurde eine Reversed- Phase-Säule (C18-Phase) benutzt. Die Peptide wurden in Eluent A (0,025 % (v/v) Trifluoressigsäure) gelöst und injiziert. Sie wurden mit einem Gradienten von Eluent B (0,025 % (v/v) Trifluoressigsäure / 84 % (v/v) Acetonitril) eluiert. Die eluierenden Peptide wurden durch die Akquisitions-Software des Gerätes automatisch erkannt und für eine Identifizierung fragmentiert. Damit konnte die Identität der Peptide eindeutig bestimmt wurden.
Fig. 1 zeigt ein Beispiel für ein Fragmentspektrum eines Peptides aus dieser Analyse. Das beobachtete Muster identifiziert das Peptid eindeutig als das Peptid mit der Sequenz FLDDDLTDDTMCVK aus Lactalbumin, das Bestandteil der Probe war. Die
Masse des Peptides und seine Fragmentierung bestätigen, dass der Affinitätsmarker in der erwarteten Weise durch Säure gespalten wurde.
Insgesamt wurden in einer Analyse 18 unterschiedliche Peptide aus der Probe identifiziert, die alle in der gleichen Weise die erwartete Masse des Adduktes mit säuregespaltenem Rest des Affinitätsmarkers trugen. Es wurde kein einziges Cystein- haltiges Peptid identifiziert, das einen noch vollständigen Rest des Affinitätsmarkers trug. Fig. 2 zeigt als Beispiel die Peptide, die aus Rindertrypsin identifiziert wurden.
In Fig. 3 wird anhand der Beispiele 15 und 16 gezeigt, dass die isotopenmarkierten
Affinitätsmarker sich in ihren chromatographischen und massenspektrometrischen Eigenschaften unabhängig vom Markierungsgrad identisch verhalten. In Fig. 3 a) sind exemplarisch die Ionenspuren der leichten und der schweren Variante des markierten Peptids LFTFHADICTLPDTEKD aus Rinderalbumin gezeigt. Ein Retentionszeitunterschied ist nicht zu erkennen. In Fig. 3 b) und c) sind die
Fragmentspektren der doppelt geladenen Peptidionen gezeigt. Beide sind identisch bis auf die Verschiebung der Cystein-haltigen Fragmente um 6 Da aufgrund der Iosotopenmarkierung.
Die gleichen Ergebnisse erhält man auch für andere Affinitätsmarker und Peptide, wie Fig. 4 für die Beispiele 18 und 19 belegt. Es handelt sich um das Peptid APILSDSSCK aus Rindertrypsin. Auch hier ist eine exakte Koelution auf der Chromatographie und identisches Verhalten bei der Fragmentierung im Massenspektrometer zu beobachten.
Fig. 1: Fragmentspektrum eines mit der Verbindung aus Beispiel 2 derivatisierten Peptides nach Isolierung über Avidin, d. h. mit säuregespaltenem Affinitätsmarker.
Fig. 2: Sequenzabdeckung von Rindertrypsin, die bei Benutzung der Verbindung aus Beispiel 2 erreicht wurde.
Fig. 3: MS-Analyse einer Proteinmischung nach Derivatisierung mit den Beispielen
15 und 16 in einem einzigen Ansatz. Anhand der Ionenchromatogramme (Fig. 3 a)) sieht man, dass die beiden Varianten exakt zur gleichen Zeit eluieren und gleich intensiv auftreten. Die Fragmentspektren der leichten (Fig. 3 c)) und schweren (Fig.
3 c)) Variante des markierten Peptids LFTFHADICTLPDTEK sind bis auf die erwarteten Verschiebungen von 6 Da identisch.
Fig. 4: MS-Analyse einer Proteinmischung nach Derivatisierung mit den Beispielen
18 und 19 in einem einzigen Ansatz. Anhand der Ionenchromatogramme (Fig. 4 a)) sieht man, dass die beiden Varianten exakt zur gleichen Zeit eluieren und gleich intensiv auftreten. Die Fragmentspektren der leichten (Fig. 4 b)) und schweren (Fig.
4 c)) Variante des markierten Peptids APILSDSSCK sind bis auf die erwarteten Verschiebungen von 6 Da identisch.

Claims

Patentansprüche
Organische Verbindung der Formel (I),
A-L-PRG (I)
in der
A für einen Affmitätsliganden-Rest,
PRG für eine proteinreaktive Gruppe und
L für einen A und PRG kovalent verknüpfenden Linker steht,
dadurch gekennzeichnet, dass der Linker L eine säurespaltbare Gruppe S der Formel
Figure imgf000048_0001
enthält, in der
Y für eine optional verzweigte Abstandhaltergruppe mit einer Kettenlänge von 1 bis 10, bevorzugt 1 bis 5 Nicht- Wasserstoff- Atomen und
SK für die Seitenkette einer Aminosäure steht,
oder deren Salz. Verbindung gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Abstandhaltergruppe Y in ^αrα-Stellung zu dem Stickstoff-Atom an den Benzolring gebunden ist.
Verbindung gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Abstandhaltergruppe Y eine aus den optional substituierten Bausteinen NH, CH2 und/oder CO aufgebaute Kette ist, bevorzugt mindestens NH-Gruppe aufweist und insbesondere ausgewählt ist aus sind NH, NH-CH2 und NH- CH2-CH2-NH-CO.
Verbindung gemäß einem vorstehenden Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die proteinreaktive Gruppe PRG eine selektive Reaktivität für eine oder mehrere endständige funktionelle Gruppen einer Aminosäure- oder Phosphatgruppe des Proteins und/oder für daraus generierte Aldehyd- oder Keto-Gruppen aufweist.
Verbindung gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die proteinreaktive Gruppe -PRG ausgewählt ist aus
Figure imgf000049_0001
Figure imgf000049_0002
-CO-[CH2]r-Cl mit r = 1-10,
-CO-CH=CH2.
6. Verbindung gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Affinitätsliganden-Rest A der Rest von Biotin, eines Biotin-Derivats, eines Kohlenhydrats, eines Haptens, eines Komplexbildners oder einer funktionellen, eine kovalente Fixierung der Verbindung an eine polymere Matrix ermöglichende Gruppe, insbesondere von Biotin oder eines
Biotin-Derivats, ist.
7. Verbindung gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass sie zur Isotopencodierung mit mindestens einem Kohlenstoff- Atom des Isotops 13C, vorzugsweise vier bis 15 13C-Atomen, isotopenmarkiert ist.
8. Verbindung gemäß dem vorstehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, dass sie zur Isotopencodierung zusätzlich mit mindestens einem Stickstoff- Atom des Isotops 15N, vorzugsweise ein bis drei 15N- Atomen, insbesondere einem 15N-Atom, isotopenmarkiert ist.
9. Verbindung gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass sie eine Verbindung der Formel (II) ist,
A-S-B1-X1-(CH2)n-[X2-(CH2)m]x-X3-(CH2)p-X4-PRG (II)
in der
A der Affinitätsliganden-Rest,
PRG die proteinreaktive Gruppe
S die säurespaltbare Gruppe ist, deren Abstandhaltergruppe Y bevorzugt in rα-Stellung zu dem Stickstoff- Atom an den
Benzolring gebunden und besonders bevorzugt NH, NH-CH2 oder NH-CH2-CH2-NH-CO ist, X , X , X unabhängig voneinander und jedes X unabhängig von anderen X2 für O, S, NH, NR, CO, CO-O, O-CO, CO-S,
S-CO, S-S, SO, SO2, CO-NR, NR-CO, CS-NR, NR-CS, Si-O, O-Si, eine Arylen- oder Diarylengruppe oder für eine
Einfachbindung stehen,
X4 für O, S, NH, NR, CO-NR, NR-CO, CS-NR, NR-CS, eine
Arylen- oder Diarylengruppe steht, bevorzugt für NH, NR, O oder S,
m, n, p, x unabhängig voneinander jeweils für eine Zahl von 0 bis 100 stehen, wobei die Summe n + xm + p vorzugsweise kleiner als 100 ist und besonders bevorzugt zwischen 10 und 30 liegt,
B1 für eine optionale Amin-Gruppe NRR' mit der Konnektivität
S-NRR'-X1 steht, und
R, R' unabhängig voneinander jeweils für Wasserstoff oder Alkyl,
Alkenyl, Alkinyl, Alkoxy oder Aryl oder beide gemeinsam mit N für einen N-Heterocyclus NRR1 stehen, wobei R' zusätzlich an X1 gebunden ist und daher nicht für Wasserstoff stehen kann.
10. Verbindung gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass sie eine proteinreaktive Gruppe PRG gemäß Anspruch 5 und einen Linker L gemäß Anspruch 9 aufweist, wobei die Summe von n + xm + p und q, z, r oder s vorzugsweise kleiner als 100 ist und besonders bevorzugt zwischen 5 und 30 liegt.
1. Verfahren zur Herstellung einer Verbindung der Formel (II) gemäß Anspruch 9 oder 10, bei dem
i) eine Verbindung der Formel (III),
H-B1-X1-(CH2)n-[X2-(CH2)m]x-X3-(CH2)p-X4-V (III) •
in der V für ein Wasserstoff- Atom oder eine Hydroxy-Gruppe stehen und die übrigen Variablen die gleiche Bedeutung wie in Formel (II) haben,
zunächst mit einem an der N-terminalen Aminogruppe geschützten Aminosäurederivat umgesetzt wird zu einem Konjugat der Formel (IV),
SG-NH-CH(SK)-CO-B1-X1-(CH2)n-[X2-(CH2)m]x-X3-(CH2)p-X4-V (IV)
in der SG für eine Schutzgruppe und SK für die Seitenkette einer Aminosäure steht,
ii) anschließend das Konjugat der Formel (ΣV) mit dem Derivat einer proteinreaktiven Gruppe oder der aktivierten Vorstufe einer proteinreaktiven Gruppe der Formel (V),
U-PRG (V)
in der U für eine Gruppe steht, die die Verknüpfung von PRG mit X4 ermöglicht, indem sie zum Beispiel zusammen mit dem Rest V des Konjugats der Formel (IV) zu einer Abgangsgruppe wird,
umgesetzt wird,
iii) dann die Aminoschutzgruppe SG abgelöst wird, wobei ein Konjugat der Formel (VI) H2N-CH(SK)-CO-B >11- vXl1-(CH2)„-[Xz-(CH2)m]x-XJ-(CH2)p-X't-PRG (VI)
erhalten wird,
iv) der Affinitätshgand A-OH oder eine aktivierte Form desselben mit einer Verbindung der Formel (VII),
Figure imgf000053_0001
in der Y für die optional verzweigte Abstandhaltergruppe steht,
die optional eine Schutzgruppe tragen kann, zur Verbindung der Formel
(vπi)
Figure imgf000053_0002
umgesetzt wird,
v) die Verbindung der Formel (VIII) dann nach vorheriger Abspaltung einer optional eingeführten Schutzgruppe in ein entsprechendes Isothiocyanat überführt wird,
vi) das Isothiocyanat anschließend mit dem Konjugat der Formel (VI) zum Thioharnstoff der Formel (IX) gekuppelt wird und
Figure imgf000054_0001
vii) in einem optionalen letzten Schritt gegebenenfalls noch vorhandene Schutzgruppen abgespalten werden,
wobei die aufeinanderfolgenden Schritte iv) und v) zu einem beliebigen Zeitpunkt vor Schritt vi) durchgeführt werden können.
12. Verfahren zur Herstellung einer Verbindung der Formel (II) gemäß Anspruch 10, bei dem
i) eine Verbindung der Formel (III),
H-B1-X1-(CH2)n-[X -(CH2)m]x-X3-(CH2)p-X4-V (III)
in der V für ein Wasserstoff- Atom oder eine Hydroxy-Gruppe stehen und die übrigen Variablen die gleiche Bedeutung wie in Formel (II) haben,
zunächst mit einem an der N-terminalen Aminogruppe geschützten Aminosäurederivat umgesetzt wird zu einem Konjugat der Formel (IV),
SG-NH-CH(SK)-CO-B >11-X vl1-(CH2)n-[X -(CH2)m]x-XJ-(CH2)p-X4-V (IV)
in der SG für eine Schutzgruppe und SK für die Seitenkette einer Aminosäure steht,
ii) das Konjugat der Formel (IV) durch Einführung einer weiteren Schutzgruppe SG' in das Derivat der Formel (XIII)
SG- H-C^S -CO-B^X^^Hz ^-^H^πJ^-^H^p^-SG' (XDI) überführt und anschließend die N-terminale Schutzgruppe SG abgelöst wird,
iii) der Affimtätsligand A-OH oder eine aktivierte Form desselben mit einer Verbindung der Formel (VII),
Figure imgf000055_0001
in der Y für die optional verzweigte Abstandhaltergruppe steht,
die optional eine Schutzgruppe tragen kann, zur Verbindung der Formel
(viπ)
Figure imgf000055_0002
umgesetzt wird,
iv) die Verbindung der Formel (VIII) dann nach vorheriger Abspaltung einer optional eingeführten Schutzgruppe in ein entsprechendes Isothiocyanat überführt wird,
v) das Isothiocyanat mit dem Derivat der Formel (XIII) zum Konjugat der Formel (XIV)
A-S-B1-X1-(CH2)n-[X/-(CH2)m]x-XJ-(CH2)p-X4-SG' (XIV)
umgesetzt wird, vi) das Konjugat der Formel (XIN) nach Ablösung der Schutzgruppe SG' mit dem Derivat einer proteinreaktiven Gruppe oder der aktivierten Vorstufe einer proteinreaktiven Gruppe der Formel (V),
U-PRG (V)
in der U für eine Gruppe steht, die die Verknüpfung von PRG mit X4 ermöglicht, indem sie zum Beispiel zusammen mit dem Rest V des Konjugats der Formel (IV) zu einer Abgangsgruppe wird,
zum Thioharnstoff der Formel (IX) gekuppelt wird und
Figure imgf000056_0001
vii) in einem optionalen letzten Schritt gegebenenfalls noch vorhandene Schutzgruppen abgespalten werden,
wobei die aufeinanderfolgenden Schritte iii) und iv) zu einem beliebigen Zeitpunkt vor Schritt v) durchgeführt werden können.
13. Verwendung einer oder mehrerer unterschiedlich isotopenmarkierter Verbindungen gemäß einem der vorstehenden Ansprüche als Reagenz zur massenspektrometrischen Analyse von Proteinen.
14. Verwendung gemäß dem vorstehenden Anspruch zur Identifikation von einem oder mehreren Proteinen oder Protein-Funktionen in einer oder mehreren Protein-haltigen Proben.
5. Verwendung gemäß Anspruch 13 zur Bestimmung der relativen Expressions- Niveaus von einem oder mehreren Proteinen in einer oder mehreren Protein- haltigen Proben.
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