DE60017413T2 - Neuartiges paramagnetisches ß-Aminosäurederivat und Verfahren zur Markierung eines Makromoleküls für eine paramagnetische Resonanzuntersuchung - Google Patents

Description

• Die vorliegende Erfindung betrifft ein neuartiges paramagnetisches β-Aminosäurederivat.
• Der naheliegendste Stand der Technik ist beschrieben bei
• • Marchetto R u.a.: „Ein neuartiges spinmarkiertes Aminosäurederivat für die Verwendung in der Peptidsynthese: (9-Fluorenylmethyloxycarbonyl)-2,2,6,6-Tetramethylpiperidin-N-Oxyl-4-Amin-4-Carbonsäure" Journal of the American Chemical Society, American Chemical Society, Washington, D.C. US, Bd. 115, 1993, Seiten 11042–11043, XP002931214, ISSN: 0002-7863,
• • Barbosa S R u.a.: "Erstmalige Synthese eines vollaktiven spinmarkierten Peptidhormons" Febs Letters, Elsevier Science Publishers, Amsterdam, NL, Bd. 446, Nr. 1, 5. März 1999, Seiten 45–48, XP004259317 ISSN: 0014-5793
• Die neuartige Verbindung wird in Anspruch 1 dargelegt.
• Die Erfindung betrifft ebenfalls ein Verfahren zur Markierung eines Makromoleküls für eine paramagnetische Resonanzuntersuchung, die die o. g. Verbindung, wie sie in Anspruch 2 dargelegt ist, benutzt.
• Bevorzugte Ausführungsbeispiele des Verfahrens werden in den abhängigen Ansprüchen 3 bis 6 dargelegt.
• Die Erfindung betrifft insbesondere die chemische Synthese eines neuen paramagnetischen β-Aminosäurederivats, das einen stabilen Stickoxidradikal-Anteil enthält, der in seine Pyrrolidin-Struktur eingeführt wird und in dem die 9-Fluorenylmethyloxycarbonylgruppe (FMOC) als eine die Aminfunktion schützende Gruppe gewählt wurde. Diese paramagnetische Verbindung ist ein neuer Typ einer Spinmarkierung und kann als ein alternatives Anzeigemolekül für die Markierung von Peptidsequenzen, anderer Makromoleküle und Systeme benutzt werden, wo die elektronische paramagnetische Resonanzspektroskopie (EPR) verwendet werden kann.
• Diese Verbindung kann auch für andere Spektroskopieverfahren, wie die Fluoreszenz- und kernmagnetische Resonanz eingesetzt werden, da ihr Paramagnetismus die Spektren dieser Methodologien beeinflussen kann. Durch die Anwesenheit sowohl der Karbon- als auch der Amingruppe in ihrer Struktur kann diese organische Verbindung für die Markierung einer Vielzahl anderer Moleküle oder Systeme verwendet werden, die reaktive Funktionen für diese beiden Gruppen besitzen.
• Hintergrund und Zusammenfassung der Erfindung
• Die Zwischenverbindung für die Synthese des Aminosäurederivats der vorliegenden Erfindung besitzt die Struktur 2,2,5,5-Tetramethylpyrrolidin-1-Oxyl-3-Amin-4-Karbonsäure, seither als POAC bezeichnet, die vor mehr als zwei Jahrzehnten synthetisiert wurde (s. Tetrahedron 491–499 [1965] und Bull. Frankreich,3, 815–817 [1967]).
• Das POAC-Derivat, das die FMOC-Schutzgruppe (2, 2, 5, 5-Tetramethylpyrrolidin-1-Oxyl-3-(9-Fluorenylmethyloxycarbonyl)-Amin-4-Karbonsäure) enthält, ist das neuartige Spinmarkierungsderivat der vorliegenden Erfindung, die ebenfalls die Synthese und die Verwendung dieses Spinmarkierungsderivats in der EPR umfasst. Die neue Verbindung ermöglicht auch die Einführung von POAC als gewöhnliche Aminosäure an jeder Position einer Peptidsequenz. In der vorliegenden Anmeldung wird sie als FMOC-POAC oder EPM-5 bezeichnet. Die chemische Struktur dieses paramagnetischen Moleküls wird in 1 dargestellt.
• Die elektronische paramagnetische Resonanz (EPR) [beschrieben in Biological Magnetic Resonance, Berliner, L.J. und Reuben, J. Verf., Plenum Publishing, New York, (1989)] ist ein modernes und sehr nürzliches Spektroskopie-Verfahren, da es die Untersuchung von paramagnetisch markierten Makromolekülen oder biologischer Systeme hinsichtlich ihrer Konformität, Beweglichkeit, inter- bzw. intramolekularen Wechselwirkungen, des Strukturzustands, und dergleichen ermöglicht. Das breite Anwendungsspektrum der EPR wird ausführlich in der einschlägigen Literatur beschrieben (s. Free Nitroxyl Radical, Rozantsev, E. G., Ulrich, H. Verf., Plenum Press, London, 1970), in der eine Vielzahl von Spinmarkierungen, d.h. chemischer Verbindungen, die auf Grund der Anwesenheit eines ungepaarten Elektrons in ihrer Struktur paramagnetisch sind, aufgeführt ist. Sie sind daher eine Klasse von freien Radikalen mit der erforderlichen Stabilität unter Bedingungen bei Normaltemperaturen und physiologischen pH-Werten und erlauben mehrere chemische Versuchsreaktionen, ohne deren freien Radikalanteil zu beeinflussen.
• Unter den verbreitetsten Spinmarkierungen kann man die Moleküle mit Stickoxidgruppen und dem ungepaarten Elektron hervorheben. Der bedeutendste Fortschritt in der EPR zur Markierung von relevanten biologischen Strukturen, wie Peptiden und Proteinen, wurde mit dieser Klasse von Spinmarkierungen erreicht.
• Vor etwa zwei Jahrzehnten tauchte die erste EPR-Anwendung in der Festphasen-Peptidsynthse auf [(The Peptides: Analysis, Synthesis and Biology, Bd. 2, Academic Press, New York, (1980)]. Diese Methode wurde mit unserer Gruppe eingeführt, allerdings wurde dort eine andere stickoxidhaltige Spinmarkierung verwendet, die damals als TOAC bezeichnet wurde (2, 2, 6, 6-Tetramethylpiperidin-1-Oxyl-4-Amin-4-Karbonsäure), die deren Aminfunktion mit der säureunbeständigen tert-Butyloxykarbongruppe (BOC) [s. Braz. J. Med. Biol. Res. 14, 173, (1981) und Biochim. Biophys Acta, 742, 63, (1983)] schützte. Somit war die BOC-TOAC Sipinmarkierung die erste in der Literatur beschriebene Spinmarkierung zur Markierung einer Peptidsequenz als Aminosäure. Auf Grund der chemischen Besonderheiten des Peptidsyntheseverfahrens war es nur möglich, die TOAC-Gruppe an die Peptid-N-Terminalposition zu koppeln. Um diesen Nachteil zu beseitigen, wurde eine andere Strategie veröffentlicht, mit der schließlich die Spinmarkierung in die Peptidsequenz intern eingeführt werden konnte [s. J. Am. Chem. Soc. 115, 11042 (1993)].
• Ein beeindruckender Fortschritt bei der Anwendung der EPR in der Peptidchemie wurde in Forschungsberichten sichtbar, die die Peptidkonformationseigenschaften untersuchten [vgl. J. Am. Chem. Soc. 117, 10555 (1995); FEBS Lett. 375, 239 (1995); Biopolymers 42, 821 (1997)] oder der Peptidharzsolvatation (Tetrahedron Lett. 375, 239 [1995]; Biopolymers 42, 821 [1997]). Als Aminosäure wurde TOAC an verschiedenen Positionen von einigen biologisch aktiven Peptiden eingeführt, wie Angiotensin II und Bradykinin, aber es wurde ein teil weiser oder vollständiger Verlust ihrer biologischen Wirksamkeit festgestellt, der auf die Einführung einer künstlichen Verbindung in ihrer Struktur zurückzuführen war. [Peptide 1996, R. Ramage und R. Epton, Verf. Mayflower Scientific Co. S. 673 (1998)].
• Die Synthese eines Peptidhormons, das mit TOAC markiert wurde, bei der ihre biologische Wirksamkeit völlig erhalten blieb, wurde erst vor kurzem beschrieben [s. FEBS Lett. 446, 45 (1999)]. Dieses Ergebnis wurde mit einem Tridecanpeptid α-Melanocyte stimulierenden Hormonanalog auf Grund seiner Wirkungskräfte in zahlreichen chemisch-biologischen Versuchen erzielt (dieses Analog ist paramagnetisch, natürlich fluoreszierend und voll aktiv; es wurde in der US Patentanmeldung Akt.Z. 09/935,760 beschrieben mit dem Titel „Paramagnetisches und aktives melanocytentimulierendes Hormonanalog (EPM-2), das ein aminsäureartiges stabiles Radikal enthält").
• Trotz dieser Ergebnisse ist die äußerst schwierige Kopplung des nachfolgenden Aminsäurerestes der Peptidsequenz während der Synthese weiterhin ein Mangel bei der Anwendung von TOAC in der Peptidchemie. Diese Schwierigkeit scheint auf die geringe nukleophile Potenz der TOAC-Amingruppe zurückzuführen zu sein, deren pKs von 8 (im freien Zustand) auf 5.5 absinkt, wenn sie an den N-Terminalteil einer Peptidkette gekoppelt wird [vgl. Braz J. Med. Biol. Res. 14, 173 (1981) und Biochim Biophys. Acta 742, 63 (1983)]. Mehrere wiederholte Kopplungen (recouplings) und eine Temperaturerhöhung der Kopplungsreaktion sind normalerweise erforderlich, um die vollständige Inkorporation der folgenden Aminosäure der gewünschten Peptidsequenz zu sichern [J. Am. Chem. Soc. 115, 11042(1993].
• Kurzerläuterung der Zeichnungen
• 1 ist eine Beschreibung der erfindungsgemäßen FMOC-POAC oder EPM-5.
• 2 ist ein Massenspektrum von POAC.
• 3 ist ein Hochleistungsflüssigchromatografieprofil von POAC mit einem Höchstwert.
• 4A und 4B stellen EPR-Spektren von POAC in Wasser und FMOC-POAC in Dimethylformamid dar.
• 5 ist ein Massenspektrum von FMOC-POAC.
• 6 ist ein Hochleistungsflüssigchromatografieprofil von POAC⁷ mit Höchstwert.
• 7 ist ein Massenspektrum von POAC⁷- Angiotensin II bei einem pH-Wert von jeweils 3,0, 6.0 und 9.0.
• Beschreibung der Erfindung
• Um die Beschränkungen der TOAC-Probe zu beseitigen, ist nach einer alternativen Spinmarkierung gesucht worden, die erfindungsgemäß differenzierte Konformationsbeschränkungen in Peptidstrukturen bewirkt. Zu diesem Zweck wurde FMOC-POAC in den unten dargestellten Syntheseschritten synthetisiert, was teilweise in Tetrahedron, 491–499 (1965); Bull. Soc. Chim. Frankreich, 3, 815 (1967) beschrieben ist:
• 
• Schritt 1 – Synthese von 2. 2, 5, 5-Tetramethylpyrrolidin-1-Oxyl-3-Cyano (P2)
• Dieses Produkt wurde synthetisch hergestellt durch Behandeln der Verbindung P1 (aus Sigma Co) mit Tosyl (p-Toluensulfonat)chlorid in Trockenpyridin. 28,7 g (1,5 × 10^–1Mol) Tosylchlorid wurden 15,3 g (8,35 × 10^–2Mol) von P1, das in 100 ml Trockenpyridin aufgelöst wurde, zugegeben und bei Zimmertemperatur 48 Stunden stehen gelassen. Danach wurden 10 g KOH, aufgelöst in 250 ml Wasser, zugegeben und das Gemisch auf 80°C erhitzt. Nach dem Abkühlen wurde das Produkt mit Schwefelether extrahiert, mit verdünnter HCl, verdünnter NaHCO₃-Lösung und Wasser gereinigt und über wasserfreiem Na₂SO₄ getrocknet. Nach dem Verdampfen des Lösungsmittels bei verringertem Druck wurden 12,76 g (Ausbeute = 92 %) eines Orange-Pulvers gewonnen und weiter in einer Tonerde-Kolonne gereinigt, wobei Benzol als Elutionsmittel verwendet wurde. Das Produkt (P2) wies einen einzelnen Punkt in einer Dünnschichtchromatographie auf mit folgender Charakteristik: Schmelzpunkt = 62°C bis 63°C, M+ = 165; die Elementaranalyse ergab: C: 65,36 %; H: 7,50 %; N: 17,10 %; berechnet: C: 65,43 %; H: 7,93 %; N: 16,96 %.
• Schritt 2 – Synthese von 2, 2, 5, 5-Tetramethylpyrrolidin-1-Oxyl-3-Amin-4-Cyano (P3)
• In einen 3 L Rundkolben wurden 600 ml verflüssigter Ammoniak, 9 g (5,44 × 10^–2Mol) von P2 und 120 ml Wasser gegeben. Der Kolben wurde dicht verschlossen, um das Gemisch unter Druck zu halten und bei Zimmertemperatur stehen gelassen. Nach drei Tagen wurde der Ammoniak entfernt und das Produkt mit Chloroform extrahiert. Das aus Leichtbenzinäther kristallisierte Rohprodukt ergab 9,37 g (Ausbeute = 94 %) eines gelben Pulvers mit folgender Charakteristik: M+ = 182; Schmelzpunkt 84°C bis 85°C; die Elementanalyse ergab: C: 58,98 %; H: 8,37 %; N: 22,21 %; berechnet: (C₉H₁₆ON₃): C: 59,31 %; H: 8,85 %; N: 23,06 %.
• Schritt 3 – Synthese von 2, 2, 5, 5-Tetramethylgyrrolidin-1-Oxyl-3-Amin-4-Carbonsäure-Cyano (P4) (POAC)
• 8 g (4,38 × 10^–2 Mol) von P3 und 40 g Ba(OH)₂ wurden in 600 ml Wasser aufgeschlämmt und in einen 3 L Rundkolben gegeben. Der Kolben wurde dicht verschlossen und auf 120°C 90 Minuten lang erhitzt. Nach dem Abkühlen wurde das Gemisch mit ausreichend Kohlensäureschnee neutralisiert und gefiltert. Die wässrige Lösung wurde unter vermindertem Druck eingedickt und ergab 8 g des Rohprodukts (Ausbeute = 90 %). Dieses Produkt wurde aus 90%igem Äthanol auskristallisiert. Das Produkt wies die folgenden Eigenschaften auf: Schmelzpunkt = 212°C (Schmelzen mit Sublimation); M+ = 201 (2); Hochleistungsflüssigchromatografie-Höchstwert (3); die Elementaranalyse ergab: C: 53,1 %; H: 8,28 %; N: 13,95 %; berechnet: (C₉H₁₇N₂O₃): C, 53,71 %; H, 8,52 %; N, 13,92 % Infrarot (KBr): cm^–1: 3084, 2872, 2792, 2548 und 2132 (NH+3); 1643 v_AS (NH+3); 1574 (v_AS, C=O); 1456 (σ CH3); 1396 und 1376 (gem-Dimethyl und COO-); 782 (σ C=O).
• 4A zeigt das EPR-Spektrum von POAC in wässriger Lösung, pH 5. Die berechneten Werte für die beiden Rotationskorrelationszeiten (T_B und T_C) waren 0,509 × 10^–10 und 0,597 × 10^–10).
• Zubereitung von FMOC-POAC
• 201 mg (1 mMol) von P4 wurden in 1,5 ml Wasser in Anwesenheit von 286 mg NA₂CO₃·10H₂O aufgelöst, wozu 337 mg (1 mMol) FMOC-Succinimidylcarbonat tropfenweise in 1,5 ml aufgelöstes Aceton gegeben wurden. Die Reaktion wurde bei Zimmertemperatur unter ständigem Rühren durchgeführt, wobei der pH-Wert um 9 durch Zugeben von Natriumcarbonat aufrechterhalten wurde. Nach drei Stunden wurde das Gemisch mit 25 ml Wasser verdünnt und mit 1 N HCl angesäuert, bis der pH-Wert 2 erreicht wurde. Das gewünschte Produkt wurde mit Ethylacetat extrahiert, mit geringen Wasseranteilen gespült und über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet. Nach dem Filtern wurde das Lösungsmittel unter vermindertem Druck verdampft. Das Rohprodukt wurde zweimal mit Chloroform kristallisiert und ergab 380 mg (Ausbeute = 90 %). Es wurde mit der Massen- und Infrarotspektroskopie, Elementaranalyse und EPR untersucht mit folgenden Ergebnissen: M+ = 423 (5); die Elementaranalyse ergab: C: 67,9 %; H: 6,35 %; N: 6,60 %; berechnet (C₂₄H₂₇O₅N₂): C: 68,08 %; H: 6,28 %; N: 6,62 %;
  IR (KBr) cm^–1: 3444-3338 (Breitband OH und CONHR); ~3030 (vAr CH); 3000-2700 (vAr COOH); 1723 (R-O-C-ON- und COOH); 1543 (σ_NH und vCN); 1450 (σ CH₃); 1235-1150 (gem-Dimethylgruppe). Das EPR-Spektrum von FMOC-POAC in Dimethylformamid ist in 4B dargestellt und die errechneten T_B und T_C-Werte sind 1,14 × 10^–10 s.rad^–1 und 1,79 × 10^–10 s. rad^–1.
• Synthese von Poac⁷-Angiotensin II
• Das mit der Spinmarkierung (Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Poac-Phe) gekennzeichnete Angiotensin II Analog wurde in 0,15 mMol Schuppen (scale) mit dem bereits erwähnten Festphasenverfahren synthetisiert mit der Änderung, die die Einführung dieser Markierung in die Mitte der Peptidkette ermöglicht. [(J.Am.Soc. 115, 11042 (1993)]. Es wurde ein handelsübliches FMOC-Phe-Wang-Harz (J. Am. Chem. Soc. 95, 1328 (1973) mit 0,41 mMol/g Austauschgrad verwendet. Alle Kopplungen wurden mit der 2,5fachen Menge von FMOC-Aminosäuren und dreifachen Menge von FMOC-POAC durchgeführt. Die Acylierungsreagentien für die Kupplung waren Diisopropylcarbondiimid (DIC) und 1-Hydroxibenzotriazol in einem Dichlormethan:Dimethylformamid-Gemisch (1:1, v/v) als Lösungsmittel. Die Freisetzung von Fmoc wurde 20 Minuten lang mit 20%igem Piperidin in Dimethylformamid (v/v) betrieben.
• Interessanterweise zeigte die Synthese, dass die Pyrrolidin-Struktur der Poac-Spinmarkierung eine einfachere Inkorporation des Aminosäurerestes ermöglichte, als das während der Toac⁷-All-Synthese beobachtet wurde. Im letzteren Fall waren erneute Kopplungsreaktionen erforderlich bei gleichzeitiger Erhöhung der Reaktionstemperatur. Diese Verfahrensschritte waren im Falle der POAC-Derivate nicht notwendig, was bedeutete, dass die Reaktionsfreudigkeit der POAC-Amingruppe weit höher ist als die von TOAC.
• Nach Abschluß der Synthese wurde das Peptid von dem Harz in wasserfreiem HF, die ein 10% eines p-Kresol- und Dimethylsulfid-Gemisches enthielt, bei 0°C 90 Minuten lang abgespalten. Das nach Extraktion und Tiefkühltrocknung (125 mg) gewonnene Rohpeptid wurde in 70 ml Wasser aufgelöst, und der pH-Wert wurde mit Ammoniakhydrat auf 10 erhöht und 2 Stunden lang verrührt, um die Stickoxidprotonierung, die während der HF-Behandlung auftritt, umzukehren. Nach der Tiefkühltrocknung wurde das Peptid mit der vorsorglichen HPLC mit umgekehrten Phasen C₁₈ (25 × 250 mm) und Ammoniakacetat 0,02 M, pH 5 und Acetonitril 60 % in Wasser als Lösungsmittel A und B gereinigt. Der lineare Gradient lag 135 Minuten lang bei 20% bis 65 % von B.
• Die Homogenität des Peptids wurde durch die analytische HPLC (6), die Massenspektrometrie, M+ = 1132,55 (7) bestätigt, und die Aminosäureanalyse zeigte die erwartete Zusammensetzung: Asp 0,95 (1.00); Val 0,96 (1.00); Ile 1,20 (1.00); Tyr 1,02 (1.00); Phe 1,00 (1.00); His 0,96 (1.00); Arg 1,02 (1.00).
• 8 zeigt die EPR-Spektren des 0,25 mM Poac⁷-All bei einem pH von 3, 6 und 9 der wässrigen Lösung. Keine signifikante Abweichung von den Rotationskorrelationszeiten wurde für dieses paramagnetische All-Analog beobachtet, was beweist, dass dessen Konformation durch den pH-Wert der Lösungsmittel nicht beeinflusst wird.

Claims (6)

1. 2,2,5,5-Tetramethylpyrrolidin-n-Oxyl-(9-Fluorenylmethyloxycarbonyl)-3-Amin-4-Karbonsäure (FMOC-POAC).
2. Verfahren zur Markierung eines Makromoleküls für elektroparamagnetische Resonanzuntersuchungen, dadurch gekennzeichnet, dass das Makromolekül mit 2,2,5,5-Tetramethylpyrrolidin-n-Oxyl-(9-Fluorenylmethyloxycarbonyl)-3-Amin-4-Karbonsäure verkettet wird.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Makromolekül eine reaktive Funktion eines Carboxyls oder Amins beinhaltet.
4. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die 9-Fluorenylmethyloxycarbonylgruppe zur Gewinnung eines ungeschütztes POAC-Derivates aus der 2,2,5,5-Tetramethylpyrrolidin-n-Oxyl-(9-Fluorenylmethyloxycarbonyl)-3-Amin-4-Karbonsäure entfernt wird.
5. Verfahren nach Anspruch 2, weiter dadurch gekennzeichnet, dass eine chemische Gruppe an einer freien Amingruppe des ungeschützten POAC-Derivats angekoppelt wird.
6. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass als Makromolekül Angiotensin-II verwendetet wird.