DE2231775C2 - Verfahren zur Herstellung von S-Methoxycarbonylthiocysteinen oder cysteinhaltigen Peptiden und deren Verwendung - Google Patents

Verfahren zur Herstellung von S-Methoxycarbonylthiocysteinen oder cysteinhaltigen Peptiden und deren Verwendung

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Description

35
Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von S-Methoxycarbonylthiocysteinen oder cysteinhaltigen Peptiden und deren Verwendung.
Cystin kann auf zwei Arten in Peptide oder Proteine eingebaut sein: In cyclischen Cystinpeptiden bildet die Disulfidbrücke des Cystins mit dem Rückgrat der Peptidkette (oder einem Teil davon) einen Ring; in offenkettigen Cystinpeptiden verknüpft sie zwei sonst voneinander getrennte Ketten. Beispiele von in der Natur vorkommenden cyclischen Cystinpeptiden sind Oxytocin, Vasopressin, Wachstumshormon, Calcitonin, Proinsulin. Offenkettige Cystinpeptide sind z. B. oxidiertes Glutathion, Insulin.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch die Herstellung von offenkettigen asymmetrischen Cystinpeptiden, d. h. von Peptiden, in welchen zwei verschiedenartige Peptidketten durch eine Cystinbrücke miteinander verbinden sind. Bei dem Verfahren wird die in den Ausgangsmaterialien vorliegende Aminosäurekonfiguration nicht verändert
Nach bekannten Verfahren können Cystinpeptide hergestellt werden, indem man in den zwei zu verbindenden, Cysteinreste enthaltenden Aminosäuresequenzen, in welchen die Mercaptogruppen geschützt sind, beispielsweise durch Carbobenzoxy- oder Ben;tyl· gruppen oder durch die Tritylgruppe, die Mercapto-.Schutzgruppe abspaltet, Benzyl beispielsweise mit Natrium in flüssigem Ammoniak, Trityl z. B. mittels Quecksilber(ll)acetat und Schwefelwasserstoff oder mit 10-n Salzsäure, und dann die beiden, die freien Mercaptogruppen enthaltenden Peptide zum Disulfid oxidiert, beispielsweise mit 1,2-Dijodtlthan oder mit Sauerstoff (Luft). Dieses Verfahren hat den Nachteil, daß neben dem gewünschten gemischten Cystinpeptid jeweils auch die zwei symmetrischen Cystinpeptide gebildet werden.
Es sind auch Verfahren bekannt, bei welchen das gemischte Disulfid gezielt gebildet wird. So kann die Thiolseitenkette des Cysteins einer der zu verbindenden Komponenten in die S-Sulfonsäure (Buntesalz) übergeführt und diese mit der zweiten Komponente (mit der Cysteinkette als freies Thiol) unter Bildung des gemischten Disulfides umgesetzt werden.
In einem anderen Verfahren wird das Thiol des Cysteins der einen Kette zuerst in das S-Thiocyanat übergeführt und dieses mit der zweiten Cysteinkette umgesetzt Bei einem weiteren Verfahren werden Cystinmonosulfoxidpeptide mit Cysteinpeptiden umgesetzt
Die Durchführung dieses Verfahrens ist aufwendig und bei empfindlichen Peptiden führen sie zu Nebenreaktionen und beeinträchtigen dementsprechend die Ausbeute.
Es ist bekannt, daß bei der Umsetzung von Sulfenylthiocarbonaten mit Thiolen gemischte Disulfide gebildet werden [J. Amer. Chem. Soc. 92,7629 (197I)J.
Es wurde nun gefunden, daß Cystein bzw. cysteinhaltige Peptide oder deren Derivate, in denen die Mercaptogruppe durch eine Trityl- oder Acrylamidomethylgruppe geschützt ist, mit Methoxycarbonylsulfenylchlorid der Formel
Cl-S-CO-OCH3
zu Sulfenylthiocarbonaten umgesetzt werden können, ohne daß eine vorherige Abspaltung der Mercaptoschutzgruppen erforderlich ist. Diese Reaktion, welche der vorliegenden Erfindung zugrunde liegt, kann durch folgendes Formelschema (1) veranschaulicht werden:
65 R —S —X + Cl-S— CO-OCH3
—» R — S — S —CO-OCH3
(1)
50 Die erfindungsgemäße Reaktion hat gegenüber der aus J. Am. Chem. Soc, I.e., bekannten Umsetzung den besonderen Vorteil, daß aus dem Cysteinpeptid I als Endprodukt ausschließlich das entsprechende Sulfenylthiocarbonat entsteht, während bei der bekannten Umsetzung das Sulfenylthiocarbonat teilweise mit dem eingesetzten Thiol la mit freier SH-Gruppe unter Bildung des symmetrischen Disulfids weiter reagieren kann gemäß folgendem Schema (2):
R— SH + HaI-S-CO-OR3
-* R' —S-S-CO-OR3
R' —S — S —CO-OR, + R'—SH
—> R— S — S— R' + COS + R3OH (2)
Im Formelschema (1) bedeutet X die Tritylgruppe (Trt) oder eine Acylamidomethylgruppe (Acylrn) der Formel
-CH2-NH-CO-R,
worin R4 ein Niederalkylrest, z. B. Methyl-, Äthyl-, Propyl-, Isopropyl- oder n-Butylrest oder ein gegebenenfalls substituiertes Phenyl, ζ. B. ein unsubstituiertes oder durch Niederalkyl oder Niederalkoxy substituiertes Phenyl, bedeutet.
R stellt den Rest des Cystein bzw. eines Cysteinpep-
tids oder eines Derivates davon dar. Unter Cysteinpeptiden sind Peptide zu verstehen, welche einen Cysteinrest und gegebenenfalls außerdem einen oder mehrere Cystinreste enthalten. Peptide sind in erster Linie in der Natur vorkommende Peptide und synthetische Analoge davon, sowie Teilsequenzen solcher Peptide. Diese Peptide sind aus in der Natur vorkommenden Aminosäuren aufgebaut, vor allem aus den 20 Code-Aminosäuren, ferner aus ihren Homologen, Strukturisomeren und optischen Isomeren; z. B. können die Peptide außer den Code-Aminosäuren und ihren optischen Isomeren Aminoniederalkansäuren mit 3—7 Kohlenstoffatomen wie ^-Alanin, a-Aminobuttersäure, y-Aminobuttersäure, «,0-Diaminopropionsäure, Norvalin, Norleucin, ferner beispielsweise Hydroxyprolin, Normethionin, Phenylglycin, Ornithin, Citrullin, oder N-AlIcyl-aminosäuren wie N-Methyltyrosin oder entsprechende D-Verbindungen enthalten.
Derivate von Peptiden sind z. B. Amide, wie C-terminale N-unsubstituierte oder N-substituicrte Amide, beispielsweise N-Monoalkyl- oder N-aminoalkyl-substituierte C-terminale Amide, worin Alkyl 1 — 18 Kohlenstoffatome aufweist, ferner C-terminale Ester, z.B. Alkylester, worin Alkyl 1 — 18 Kohlenstoffatome aufweist, weiter N-Ä-Substitutionsprodukte, vor allem Ν-Λ-Acylderivate, worin Acyl ein Rest mit 1 — 18 Kohlenstoffatomen ist, und schließlich bei der Synthese von Peptiden gebräuchliche Zwischenprodukte wie Peptide mit aktivierter Amino- oder Carboxylgruppe, z. B. aktivierte Ester, Hydrazide, Azide, gemischte Anhydride, sowie entsprechende Verbindungen, in denen funktionell Gruppen wie Amino-, Carbonyl-, Hydroxyl-, Mercapto- und/oder Guanidinogruppen in bekannter Weise durch Schutzgrup^en blockiert sind.
Weiter wurde gefunden, adß ein durch die Gruppe —S—COOCH3 geschütztes Cystein I zw. Cysteinpeptid oder Derivat davon mit Cystein bzw. einem cysteinhaltigen Peptid oder einem Derivat davon, wobei die Mercaptogruppe dieser zweiten Cysteinkomponente in freier Form vorliegt, zur entsprechenden Cystinverbindung umgesetzt werden kann. Gegenstand der Erfindung ist daher auch die Verwendung der gemäß dem obigen Verfahren hergestellten S-Methoxycarbonylthio-Verbindungen (Sulfenylthiocarbonaten) zur Herstellung von Cystin oder Cystinpeptiden oder ihren 4-, Derivaten durch deren Umsetzen mit Cystein bzw. einem cysteinhaltigen Peptid oder einem Derivat davon mit freier Mercaptogruppe.
Diese Kombination hat den Vorteil, daß mit Trityl oder Acylamidomethyl geschütztes Cystein bzw. Cysteinpeptide oder Derivate davon selektiv in ein Cystinpeptid übergeführt werden können, ohne daß die Mercaptoschutzgruppe zuvor abgespalten werden muß und daß keine störenden Nebenprodukte, z. B. Säuren, gebildet werden.
Dabei ist es nicht notwendig, daß die -SCOOCH3-Gruppe unmittelbar vor der weiteren Umsetzung mit der zweiten Cysteinkomponente in die erste Cysteinkomponente (S-Trityl- oder S-Acylamidomethyl-substituiert) eingeführt wird. Sie kann vielmehr wie übliche Schutzgruppen auf einer früheren Stufe der Peptidsynthese durch die beschriebene Reaktion in diese Cysteinderivate eingeführt und das erhaltene Derivat zu weiteren Peptidaufbauschritten verwendet werden. Zu einem beliebigen Zeitpunkt der Synthese kann eine 6i -SCOOCHa-geschützte Cysteinverbindung mit einer eine freie Mercaptogruppe aufweisenden Cysteinverbindung umgesetzt werden.
Als Aminoschutzgruppen sind beispielsweise zu nennen Benzyl, Trifluormethyl, Phthaloyl, p-Toluolsulfonyl, Trityl, oder vor allem von der Kohlensäure sich ableitende Gruppen wie gegebenenfalls im aromatischen Rest durch Halogenatome, Niederalkyl- oder Niederalkoxy- oder Niedercarbalkoxygruppen substituierte Benzyloxycarbonylgruppen, farbige Benzyloxycarbonylgruppen wie p-Phenylazo-benzyloxycarbonyl und p-ip'-Methoxy-phenylazoJ-benzyloxycarbonyl.Tolyloxycarbonyl, 2-Phenyl-isopropy!oxycarbonyl, 2-Twyl-isopropyloxycarbonyl, und vor allem 2-p-(Biphenylyl)-2-propyloxycarbonyl (vgl. FR-PS 15 54 051), ferner aliphatische Oxycarbonylgruppen wie z. B. Allyloxycarbonyl, Cyclopentyloxycarbonyl, tert Amyloxycarbonyl, Adamantyloxycarbonyl und in erster Linie tert Butyloxycarbonyl.
Die Reaktion kann auch durchgeführt werden, wenn die Aminogruppen als Salze, z.B. als Hydrochloride vorliegen.
Die Carboxylgruppen können z. B. durch Amidierung oder Veresterung geschützt sein. Als Ester sind z. B. diejenigen von Methanol, Äthanol, Benzylalkohol, p-Methoxybenzylalkohol, 2,4,5-Trichlorphenol, N-Hydroxysuccinimid, N-Hydroxyphthalimid, oder vor allem von tert. Butanol oder Silanol, z. B. Trimethylsilanoi zu nennen. Hydroxygruppen, z. B. von Serin- oder Tyrosinresten, können z. B. durch Verätherung, beispielsweise mit Benzylalkohol od.'.r vorzugsweise mit tert. Butanoi geschützt sein. In Argininresten kann die Guanidinogruppe beispielsweise durch die Tosylgruppe geschützt sein. Die bei dem vorliegenden Verfahren erhaltenen, Schutzgruppen aufweisenden Disulfid-Peptide können direkt für die Synthese von Peptiden mit längerer Aminosäurekette verwendet werden oder, wenn erwünscht, können die Schutzgruppen in bekannter Weise, z. B. mit Säuren abgespalten werden.
Die Reaktion kann auch durchgeführt werden, wenn die Carbonylgruppen als Salze vorliegen, z. B. als Salze mit Alkalimetallen, Ammoniak oder organischen Stickstoffbasen, ζ. B. Äthanolamin. Diethylamin, Triäthylamin.Tributylamin, Pyridin, Pyrrolidin.
Bei der Herstellung des Sulfenylthiocarbonat-Derivates können beispielsweise folgende Lösungsmittel verwendet werden: Kohlenwasserstoffe wie Petroläther, Hexan, Benzol, Toluol; chlorierte Kohlenwasserstoffe wie Methylenchlorid, Chloroform, Dichloräthan; Alkohole wie Methanol, Äthanol, Äther wie Diäthyläther und Tetrahydrofuran, Amide wie Dimethylformamid. Die Zugabe eines Akzeptors für den bei der Reaktion entstehenden Halogenwasserstoff, z. B. Triäthylamin, ist nicht nötig, kann jedoch erwünscht sein, wenn stark säurelabile Gruppen im Peptidderivat vorhanden sind. Die Umsetzung findet bei Temperaturen von ca. -40 bis +6O0C statt, wird aber vorzugsweise bei 0° durchgeführt.
Bei der Umsetzung des SuIfenylthiocarbonat- Derivates mit der Thiolkomponente können neben den oben erwähnten Lösungsmitteln auch Eisessig sowie wäßrige Essigsäure verwendet werden. Die Umsetzung kann bei den genannten Temperaturen, vorzugsweise bei Raumtemperatur durchgeführt werden.
Die Erfindung wird in den nachfolgenden Beispielen beschrieben. Die Temperaturen sind in Celsiusgraden angegeben. Die Rf-Werte beziehen sich auf Dünnschichtchromatographie auf Silicagel-Platten; System 100 =Essigester-n-Butanol-Pyridin-Eisessig-Wasser (42:21 :21 :6 :10).
Folgende Abkürzungen werden verwendet:
OMe = Methylester
OtBu = tert Butylester
OSu = N-Hydroxysuccinimidester
BOC = tert Butyloxycarbonyl
Trt = Trityl
Bpoc = 2-(p-Biphenylvl)-2-propyloxycarbonyl
Acm = Acetylaminomethyl
SCM = Methoxycarhonylsulfenyl
(-S-CO-OCH3)
DCHA = Dicyclohexylammoniumsalz
Die Beispiele zeigen die Herstellung von geschützten Fragmenten von Insulin im Bereich der Disulfidbrücke Am— B|9.
Beispiel 1
BOC - Cys - Asn - OtBu
BOC - VaI - Cys - GIy - GIu(OtBu)2
1.BOC-CyS(SCM)-ASn-OtBu
a) aus BOC-Cys(Trt)—Asn—OtRu
Zu 700 mg Cl-S—CO-OCH3 in 2 ml CHCl3 werden bei 0° 3,2 g BOC-Cys(Trt)—Asn—OtBu in 15 ml CHCI3 und 5 ml MeOH gegeben. Nach 45 Minuten bei O" werden 150 ml CHCI3 zugegeben und die Lösung mit Wasser extrahiert. Die über Natriumsulfat getrocknete Lösung wird im Wasserstrahlvakuum eingedampft. Das dabei anfallende öl ist ein Gemisch von BOC-CyS(SCM)-Asn—OtBu und Triphenylmethylmethyläther. Letzterer braucht nicht abgetrennt zu werden, da es in der folgenden Umsetzung zu keinen Nebenreaktionen Anlaß gibt Kristallisiert aus einem CHCb-Petroiäther-Gemisch, ergibt das Rohprodukt 1,94 g (80%) des gewünschten Endstoffes.
b)aus BOC-CyS(ACm)-ASn-OtBu
700 mg Cl-S-CO-OCHjund
2,32 g BOC-CyS(ACm)-ASn-OtBu
werden wie unter a) beschrieben umgesetzt und analog aufgearbeitet. Es resultieren 2,4 g dünnschichtchromatographisch reines
BOC - Cys(SCM)- Asn - OtBu.
Rf = 0,4 ir. Chloroform-Methanol (? : 1). Ausbeute 1,87 g (78%).
Das Ausgangsmaterial kann wie folgt hergestellt werden:
585 mg BOC-Cys(Atm)-OHund
377 mg H—Asn-OtBu
werden in 10 ml Essigester und 5 ml Dimethylformamid bei 0° mit 452 mg Dicyclohexylcarbodiimid versetzt und 24 Stunden bei dieser Temperatur reagieren gelassen. Es wird abfiltriert, das Filtrat zur Trockne eingedampft, der Rückstand in Essigester aufgenommen und mit 1-n Citronensäure, 1-n Natriumbicarbonat und Wasser gewaschen. Die organische Phase wird mit Natriumsulfat getrocknet und eingedampft. Kristallisation aus Essigester und η-Hexan liefert
BOC - Cys(Acm) - Asn—OtBu
vomF97-100°.
2. BOC - Cys - Asn - OtBu
BOC - VaI - Cys - GIy - GIu(OtBu)2
1,45 g BOC-CyS(SCM)-ASn-OtBu und
1,85 g BOC - VaI - Cys - GIy - GIu(OtBu)2
werden in 30 ml CHCI3-MeOH (1 :1) gelöst und 45 Minuten bei Raumtemperatur gehalten. Die Lösung wird dann im Wasserstrahlvakuum bei 35° eingedampft und der resultierende Schaum zweimal mit je 5 m-i Petroläther verrieben. Es werden 3,0 g dünnschichtchromatographisch reines Produkt der obigen Formel als lu farbloses Pulver erhalten. Rf=0,47 in Chloroform-Methanol (9:1). Ausbeute 2,87 g (94%).
Das als Ausgangsmaterial verwendete
BOC-VaI-CyS-GIy-GIu(OtBu)2
kann wie folgt hergestellt werden:
Zu 1,72 g
BOC-VaI-CyS(Tn)-GIy-GIu(OtBu)2
in 20 ml Essigester und 10 ml Methanol werden 700 mg
2(1 Quecksiloer(II)acetat gegeben und 3 Stunden bei Zimmertemperatur stehen gelas;>cfl. Durch die klare Lösung wird dann während 15 Minuten ein Strom von H2S geleitet, vom ausgeschiedenen Quecksilbersulfid abfiltriert und das Filtrat eingedampft. Der resultierende Schaum besteht aus
BOC-VaI-CyS-GIy-GIu(OtBu)2
[Rf=0,55 in Chloroform-Methanol (1 :1)] und Triphenylmethylmethyläther. Letzter stört bei der folgenden Umsetzung nicht.
Beispiel 2
H - Cys - Asn - OtBu · HCl
I
BOC - Cys - GIy - GIu(OtBu)2
l.H-Cys(SCM)-Asn-Ot3u · HCl
a) aus H-CyS(Tn)-ASn-OtBu-HCl
Zu 670 mg CI-S-CO-OCH3 in 10 ml Methanol werden bei 0° 1,82 g
H-Cys(Trt)-Asn-OtBu · HCI
in 15 ml Methanol gegeben. Nach 45 Minuten bei 0° fällt man mit 250 ml Äther aus, dekantiert ab und trocknet den Rückstand im Wasserstrahlvakuum bei 35°. Es resultieren 1,2 g (87%) dünnschichtchromatographisch
reines
H-CyS(SCM)-ASn-OtBu · HCI
als gelbliches Pulver - Rf = 0,32 in Chloroform-Methanol (8 :2).
ija& Ausgangsmaterial kann wie folgt hergestellt werden:
7,76 g Trt-Cys(Trt)-Asn-OtBu werden in 60 ml Eisessig und 15 ml Wasser eine Stunde bei Raumtemperatur stehen gelassen. Es werden dann 45 ml Wasser zugegeben, vom ausgeschiedenen Triphenylcarbinol abfiltriert und das Filtrat bei 40° und 0,01 Torr eingedampft. Der Rückstand wird in 200 ml Essigester aufgenommen und die Lösung mit 1-n Bicarbonat und Wasser extrahiert. Die Essigesterphase wird über Natriumsulfat getrocknet im Wasserstrahlvakuum auf ca. 30 ml eingeergt, mit 10 ml 1-n HCl in Essigester versetzt und dann vollständig zur Trockne eingedampft. Es resultieren 5,7 g dünnschichtchromatographisch reines
H-Cys-(Trt)-Asn-OtBu · HCI Rf = 0,55 in Chloroform-Methanol (8 : 2).
b) aus H-CyS(ACm)-ASn-OtBu · HCI
Ausl.6gH-Cys(Acm)-Asn-OtBu ■ HCIund 790 mg CI-S-CO-OCH,
werden wie unter a) beschrieben 1,5 g (90%) H-CyS(SCM)-ASn-OtBu · HCI
erhalten.
Das Ausgangsmaterial kann wie folgt hergestellt werden:
Zu einer Lösung von 2.3 g H —Cys(Acm) —OH und 2.8 ml Triälhylamin in 50 ml Dimethylformamid werden 4.2 g Tritylchlorid in 20 ml Dimethylformamid gegeben und 24 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Ks wird dann auf ca. IO ml eingeengt, in 100 ml F.ssigester und 50 ml Wasser aufgenommen und mit In Zitronensäure auf pH 3 gestellt. Die Essigesterphase wird mit Wasser gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und eingedampft. Kristallisation aus Chloroform-Petroläther gibt Trt-Cvs(Acm)-OH vom F 143- 145".
2.17 g
0.9 g
,-J) Trt -Cys(Acm)- Asn - Ot Bu
Trt-Cys(Acm)-OH und
H-Asn-OtBu
werden in 30 ml Dimethylformamid gelöst und bei 0" mit !.ig Dicyclohexylcarbodiimid versetzt. Nach 15 Stunden bei 5" wird abfiltriert, das Filtrat bei 35" und 0.01 Torr eingedampft, der Rückstand in 200 ml Essigester aufgenommen und mit halb gesättigter Kochsalzlösung gewaschen. Nach dem Trocknen über Natriumsulfat wird eingedampft und das erhaltene Produkt aus Essi^ester-Hexan umgelöst. Rf = 0,25 in Chloroform-Methanol (49 : 1).
V)H-CyS(ACm)-ASn-OtBu · HC!
2.5 g Trt — Cys(Acm) — Asn — OtBu werden in 25 ml 800/oiger Essigsäure wie unter la) beschrieben, detrityliert und aufgearbeitet. Es resultieren 1.85 g reines
H-Cys(Acm)-Asn-OtBu ■ HCl
Rf = 0.30 in Chloroform-Methanol (8 : 2).
2 Il -C ys - Asn -OtBu HCl
BO<" - Cys - Giy - GIu<0tBui:
1.25 g H-Cys(SCM)-Asn-OtBu ■ HC! und
1.56 g BOC-CyS-GIy-GIu(OtBu)2
werden in 30 ml Chloroform-Methanol (1:1) eine Stunde bei Raumtemperatur stehen gelassen. Die klare Lösung wird dann bei 35° im Wasserstrahlvakuum eingedampft und der Rückstand zweimal mit je 5 ml Petroläther verrieben. Man erhält das dünnschichtchromatographisch reine Produkt als farbloses Pulver. Ausbeute 2.45 g (100%). Rf = 0,50 in Chloroform-Methanol (8 :2).
Das Produkt kann beispielsweise wie folgt zur Peptidsynthese verwendet werden:
BOC - Tyr - Cys - Asn - OtBu
BOC - Cys - GIy - G!u(OtBu);
Zu 620 mg HOC-Tyr-OH in 10 ml Tetrahydrofuran gibt man bei -15° 2,2 ml l-nTriäthylamin in Tetrahydrofuran und 2,2 rnl 1-n Isobutylchlorocarbonat in Tetrahydrofuran. Nach IO Minuten bei - 10" werden
Il-Cys-Asu-OtBu · HCI BOC -- Cys - GIy - GIu(OtBu),
1,69 g und 229 ml Triäthylamin in 15 ml Tetrahydrofuran zugegeben und 1 Stunde bei - 10° und 15 Stunden bei Raumtemperatur stehen gelassen. Die Lösung wird filtriert, das Filtrat eingedampft, der Rückstand in 200 ml Essige sler aufgenommen und mit 0,1-n Zitronensäure. 0.1-n i\'atriumbicarbonat und Wasser gewaschen. Nach dem Trocknen über Natriumsulfat wird eingc dampft und der Rückstand aus Essigester-Hexan umgefällt. Es resultieren 1.9 g (95%) reines Produkt der obigen Formel. Rf = 0,46in Chloroform-Methanol(9 : I).
Bpo
0.83 g
1.70 g
Il - Cys Asn -OtBu · HCI
Leu VuI Cys GIy - GIu(OtBu);
H-CyS(SCM)-ASn-OtBu · HCI und
lipoc- leu -VnI -C ys -CiIy -CiIu(Ol Bu).
werden in 2n ml Chloroform Methanol (1:1) gelöst und die Lösung nach 1 Stunde bei 20" eingedampft. Der Rückstand wird aus Methanol-Äther umgefällt. Rf = 0,45 in Chloroform-Methanol (8 : 2). Ausbeute 2,23 g (95%). Das AusgEingsmaterial kann wie folgt hergestellt werden:
a) Bppc - Leu - VaI - OMe
36,9 g Bpoc: — Leu — OH und 13.9 ml Triäthylamin in 300 ml Acetonitril werden bei -10° mit 13.3 m! Isobutylchlorcarbonat versetzt. Nach 10 Minuten bei -10' gibt man 16.8 g HCl · H-VaI-OMe und 13,9 ml
ι.· Triäthylamin ir 170 ml Acetonitril zu und läßt 1 Stunde bei -10° und 10 Stunden bei Raumtemperatur stehen. Es wird dann abfiltriert, das Filtrat eingedampft, der Rückstand in Essigester aufgenommen, die Lösung mit verdünnter Zitronensäure. 0,5-ri Natriumbicarbonat und
■i" Wasser gewEischen. Nach dem Trocknen über Natriumsulfat wird eingedampft und der Rückstand aus Essigester-Hexan umgefällt. Rf = 0.45 in Essigester-Hexan(l :1).
b) Bpoc -Leu -VaI -OH
39 g Bpoc - Leu-VaI-OMe werden in 400 ml Di.x-n gelöst. 100 ml Wasser und 130 ml 1-n NaOH zugegeben und 1 Stunde bei 20° stehen gelassen. Im Rotationsverdampfer dampft man dann bei 30° das Dioxan weitgehend ab, gibt je 300 ml Eiswasser und Chloroform hinzu und versetzt unter Rühren bei 0° mit 130 ml 1-n HCI. Die Chloroformlösung wird abgetrennt und dreimal mit halb gesättigter Kochsalzlösung gewaschen. Nach dem Trocknen über Natriumsulfat und Abdamp-
eo fen des Lösungsmittels erhält man
Bpoc-Leu-VaI-OH
in dünnschichtchromatographisch reiner Form. Rf=0,40 in Chloroform-Methanol (7 :3).
^ c) BpOC-LeU-VaI-CyS(Tn)-GIy-GIu(OtBu)2
Zu 4,5 g Bpoc-Leu-Val-OHund 6.6 g H-CyS(Tn)-GIy-GIu(OtBu)2
IO
in 100 ml Dimethylformamid gibt man bei 0" 2,47 g Dicyclohexylcarbodiimid und 1,6 g 1-Hydroxybenzotriazol. Nach 1 Stunde bei 0° und 15 Stunden bei 20° filtriert man und dampft das Filtrat bei 40° und 0,01 Torr ein. Der Rückstand wird in Essigester aufgenommen -, und mit 0,5-n Zitronensäure, 0,5-n Bicarbonat und Wasser gewaschen. Nach dem Trocknen über Natriumsv-'fat wird eingedampft und der Rückstand aus Essigester-Hexan umgefällt. Rf = 0,55 in Chloroform-Methanol (19 : I). K)
d) BpOC-LeU-VaI-CyS-GIy-GIu(OtBu)2
Zu 2,2 g
BpOC-LeU-VaI-CyS(TrI)-GIy-GIu(OtBu)2
in 15 ml Essigester und 7 ml Methanol gibt man 0.7 g Quecksilber(II)acetat und läßt 4 Stunden bei 20° stehen. Man leitet dann während 15 Minuten einen Strom von Schwefelwasserstoff durch, filtriert und dampft das Filtrat ein..
Das Produkt kann wie folgt zur Synthese von
HOC IVr -C ys Amt OtHu
HOC Viii - CiIn(OtHu) AIa Leu Tyr Leu - Viii Cys GIy GIu(OtHu). verwendet werden:
a) HOC Ty r Cys Asu OtIUi
Bpoc - Leu-VaI -Cys GIy-GIu-(OtBu)-
Zu 340 mg BOC-Tyr —OH in 5 ml absolutem carbonat in Tetrahydrofuran gegeben. Nach 15 Minuten Tetrahydrofuran werden bei -10° 1,3 ml 1 -n Triathyl- :> bei - 10° versetzt man mit amin in Tetrahydrofuran und 1,3 ml 1-n Isobutylchloro-
Il - Cys - Ami OtHu HCI
1.18 g Bpoc-Leu -VnI - Cys CiIy - GIu(OtHu),
und 1,0 ml 1-n Triäthylamin/Tetrahydrofuran in 15 ml Tetrahydrofuran. Nach 1 Stunde bei -10° und 15 Stunden bei 20° filtriert man ab, dampft das Filtrat ein und löst den Rückstand aus Chloroform-Äther um. Rf = 0.35 in Chloroform-Methanol (9 : 1).
ß) H - BOC - Tyr - Cys - Asn - OtHu Aceliit
H - Leu - VaI - Cys - GIy - GIu(OtBu),
1.5 g des unter λ) beschriebenen Produktes werden in w zu und lyophilisiert. Das resultierende Pulver wird 12 ml Eisessig und 3 ml Wnsser aufgenommen und 1 zweimal mit je 5 ml Petroläther verrieben. Rf = OZJ in Stunde bei 45° gehalten. Man gibt dann 10 ml Eisessig Chloroform-Methanol (8 : 2).
γ) BOC-Tyr-Cys-Asn-OtBu
BOC - VaI - GIn(OtBu) - AIa - Leu - Tyr - Leu - VaI - Cys - GIy - Glu(0tBu): 0.46g BOC - VaI - GIu(OtBu) - AIa - Leu - Tyr - NH - NH:
in 5 ml Dimethylformamid versetzt man bei —10° mit 0,75 ml 2-n HCl in Essigester und 0,72 ml 1-n ten. Butylnitrit in Essigester. Nach 15 Minuten bei -10° gibt man die Lösung von 0,60 g des unter ß) beschriebenen Produktes und 2 ml 1-n Triäthylamin/Essigester in 7 ml Dimethylformamid zu. Nach 1 Stunde bei -10° und 15 Stunden bei 20° tropft man die Lösung zu 100 ml gerührtem Wasser, filtriert ab und reinigt den Niederschlag durch Umfallen aus Methanol-Äther. Rf=035 in Chloroform-Methanol (8 :2).
Beispiel 4
BOC - Tyr - Cys - Asn - OtBu
Trt - Leu - V'ai - Cys - GIy - OH
1. Trt-Leu-VaI-Cys(SCM)-GIy-OH
Eine Lösung von 4,3 g
Trt-Leu-Val-Cys(Trt)-Gly-OH
und 0315 ml Diethylamin in 35 ml Chloroform und 15 ml Methanol wird bei -10° mit 0,88 ml
Cl-S-CO-OCH3
versetzt Nach 15 Min. bei -10° werden 0,6 ml Diäthylamin zugegeben, die Kühlung entfernt und nach 5 Minuten mit 150 ml Chloroform verdünnt Die Lösung wird mit verdünnter Citronensäure und Wasser gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und dann auf ca. 10 ml eingeengt Durch Zugabe von Petroläther wird 336 g (94%)
Trt-Leu-VaI-CyS(SCM)-GIy-OH
ausgefällt Es wird aus Chloroform-Petroläther umkristaliisiert; F 195—200° (Zersetzung).
60
65
Das als Ausgangsmaterial verwendete
TrI-LeU-VaI-CyS(TrI)-GIy-OH
kann wie folgt hergestellt werden:
Tn-CyS(TrO-GIy-OMc
56,24 g Trt-Cys(Trt)-OSu und 8,01 g GIy-OMe werden in 150 ml Chloroform gelöst. Nach 15 Stunden bei 20° wird die Lösung eingedampft, der Rückstand in 500 ml Essigester aufgenommen und diese Lösung mit verdünnter Citronensäure und Wasser gewaschen. Nach dem Trocknen über Natriumsulfat wird das Lösungsmittel abgedampft und der Rückstand durch Umfallen aus Essigester-n-Hexan gereinigt. Rf = OJO in Chloroform-Methanol (95 : 5).
H-Cys(Trt)-Gly-OMe
Eine Lösung von 6,8 g Trt-Cys(Trt)-Gly-OMe in 75 ml Methanol wird tropfenweise mit 7,5 ml Wasser und 5,1 ml 2,1-n Salzsäure versetzt. Nach einer Stunde bei 20" wird die Lösung auf ca. 20 ml eingedampft, in 150 ml Essigester aufgenommen und mit 0,5-n Natriumbicarbonat und Wasser gewaschen. Die über Natriumsulfat getrocknete Lösung wird eingedampft und der Rückstand mit 20 ml Petroläther verrieben. Es resultiert ein dünnschichtchromatographisch einheitliches Öl. Rf = 0,50 in Chloroform-Methanol (9fc : 5).
Trt-Leu-Val-Cys(Trt)-G!y-OMe
4,72 g Trt-Leu-Val-OH und
4,35 g H- Cys(Trt) - GIy - OM e
in 50 ml Chloroform werden mit 0,4 g 1-HyJroxyben/otriazol und 2,26 g Dicyclohexylcarbodiimid versetzt. Nach 15 Stunden bei 20° filtriert man ab. verdünnt das Filtrat mit 50 ml Chloroform und wä^-fit die Lösung mit verdünnter Citronensäure, 0,5-n Natriumbicarbonat und Wasser. Die über Natriumsulfat getrocknete Lösung wird eingedampft und der Rückstand in 30 ml Chloroform-Methanol (1:1) unter Erwärmen gelöst. Nach Zugabe von einigen Tropfen Äther kristallisiert das Produkt aus F 252-254°.
Trt-Leu-Val-Cys(Trt)-Gly-OH
7,12 g
Trt - Leu - VaI - Cys(Trt) - GIy - OMe
werden in 80 ml Dioxan unter Erwärmen gelöst. Bei 20° tropft man dann 4,5 ml 2-n Natronlauge und 10 ml Wasser zu. Nach 50 Minuten bei 20° engt man die Lösung auf ca. 30 ml ein und versetzt unter Rühren bei 0° mit 20 ml 1-n Citronensäure und 100 ml Wasser. Der Niederschlag wird abfiltriert, mit kaltem Wasser gewaschen und über Phosphorpentoxyd und Ätznatron getrocknet Es resultiert ein dünnschichtchromatographisch reines, weißes Pulver. Rf=0,60 in Chloroform-Methanoi (1 : 1).
2. H- Cys - Asn - OtBu
Trt - Leu - VaI - Cys - GIy - OH
710 mg Tn-LeU-VaI-CyS(SCM)-GIy-OH und 330 mg HCl · H-Cys-Asn-OtBu
werden, in 5 ml Chloroform und 5 ml Methanol gelöst. Nach einer Stunde bei 20° wird die Lösung eingedampft und der Rückstand bei 0° mit 10 ml Wasser verrieben
und abfiltriert. Man erhält das dünnschichtchromatographisch reine PrHukt als farbloses Pulver, Rfioo = 0,3, in einer Ausbeute von 0,79 g(90%).
3. BOC -Tyr- Cys -Asn -OtBu
Trt - Leu - VaI - Cys - GIy - OH
210 mg BOC-Tyr-OH, 87 mg N-Hydroxysuccinimid und 0,094 ml N-Äthylmorpholin in 3 m! Dimethylformamid werden bei -10° mit 155 mg N-Äthylmorpholin versetzt. Nach 2 Stunden bei 20" werden
Il -C"vs - Asu -OtBu
Trt - Leu Viii -Cys -GIy -OH
in 7 ml Dimethylformamid zugegeben und 15 Stunde,i bei 20° stehen gelassen. Man filtriert ab und dampft das Filtrat bei 0,01 Torr und 35° ein. Umfallen des Kiickstanries aus Chioroform-n-Hexan liefert das dünnschichichromatographisch reine unter 3.) genannte Produkt. Rf = 0 40 in Chloroform-Methanol (7 : 3).
Das unter 2.) verwendete Ausgangsmaterial kann wie folgt hergestellt werden:
H - Cys(Trt)- Asn - OtBu. HCI
7.76 g Trt —Cys(Trt) —Asn —OtBu werden in 60 ml Eisessig gelöst und fopfenweise 15 ml Wasser zugegeben. Nach einer Stunde bei 20° gibt man 45 ml Wasser zu, filtriert und dampft das Filtrat ein. Der Rückstand wird in 150 ml Essigester aufgenommen und die Lösung mit 0,5-n Natriumbicarbonat und Wasser gewaschen. Nach dem Trocknen über Natriumsulfat wird das Lösungsmittel abgedampft, der Rückstand in 10 ml Essigester gelöst und bei 0° mit 5 ml 2-n Chlorwasserstoff in Essigester und 150 ml Petroläther versetzt. Der Niederschlag wird abfiltriert und mit Petroläther nachgewaschen. Es resultiert ein dünnschichtchromatographisch einheitliches weißes Pulver. Rf = 0.50 in Chloroform-Methanol (8 :2).
H-Cys-Asn-OtBu, HCI
IUOg H-Cys(Trt)-Asn-OtBu ■ HCI werden in 80 ml Methanol und 80 ml Essigester gelöst und mit 7,3 g Quecksilber(II)acetat versetzt. Nach 4 Stunden bei 20° leitet man während 15 Minuten einen Strom von Schwefelwasserstoff durch die Lösung, filtriert und dampft das Filtrat ein. Der Rückstand wird dreimal mit je 20 ml Petroläther verrieben, das unlösliche zähe öl in 20 ml Chloroform gelöst und durch Zugabe von 110 ml Petroläther das Produkt als weißes Pulver ausgefällt. Rf = 0,35 in Chloroform-Methanol (1 :1).
Beispiel 5
BOC - CyS(SMC)- Asn - OtBu
634 mg BOC-CyS(Tn)-ASn-OtBu in 6 ml Chloroform und 3 ml Methanol werden bei 0° mit 0,18 ml Cl-S-CO-OCH3 versetzt Nach einer Stunde bei 0° werden 23 ml 1 -n Diethylamin zugegeben und mit verdünnter Citronensäure und Wasser gewaschen. Die organische Phase wird nach dem Trocknen über Natriumsulfat eingeengt und mit Petroläther versetzt Der Niederschlag
BOC-CyS(SCM)-ASn-OtBu
wird aus Chloroform-Petroläther kristallisiert F 102-104°. Ausbeute 465 g (96%),
Beispiel 6
BOC-Cys(SCM)-OH, DCHA
Beispiel 7
Zu 5,37 g BOC-Cys(Trt)-OH, Diäthylanimoniumsalz in 35 ml Chloroform und 9 ml Methanol werden 4,2 ml Triäthylamin gegeben, die Lösung auf O" abgekühlt und mit 3,5 ml Cl-S-CO-OCH3 versetzt. Nach einer Stunde bei 0° wird die Lösung mit verdünnter Citronensäure und Wasser gewaschen, die organische Phase über Natriumsulfat getrocknet und eingedampft. Das resultierende öl wird zweimal mit Petroläther verrieben, in 10 ml Äther aufgelöst und mit 2,5 ml Dicyclohexylamin versetzt. Es werden 4,8 g (97%) Kristalle vom F 145— 146° erhalten.
Die Verbindung kann wie folgt in das in Beispiel 5 beschriebene Produkt übergeführt werden:
725 mg BOC-Cys(SCM)-OH ■ DCHA werden in 30 Γϊΐ! Chloroform mit verdünnter Citronensäure 11P^ Wasser versetzt, die organische Phase wird abgetrennt, über Na\:iumsulfat getrocknet und zu einem Öl eingedampft. Dieses wird in IO ml Essigester aufgenommen und bei 0° mit 190 mg H —Asn —OtBu und 226 mg Dicyclohexylcarbodiimid versetzt. Nach 15 Stunden bei 5° wird abfiltriert, das Filtrat mit 30 ml Essigester verdünnt und die Lösung mit verdünnter Citronensäure, 0,5-n Natriumbicarbonat und Wasser gewaschen. Nach Trocknen der Essigesterlösung über Natriumsulfat und Abdampfen des Lösungsmittels liefert Umkristallisation aus Chloroform-Petroläther das in Beispiel 5 beschriebene Produkt.
BOC-CyS(SCN)-GIy-GIu(OtBu)2
l,96g BOC -Cys(Bam)- GIy -GIu(OtBu)2 (Bam
-, = Benzoylamidomethyl) in 15 ml CHCl3 und 5 ml McOH werden bei 0° mit 0,53 ml CI-S-CO-OCH3 versetzt. Nach 1 Stunde bei O" verdünnt man mit 100 m!
CHCl3, wäscht 3mal mit je 20 ml Wasser und trocknet über Natriumsulfat. Die Lösung wird auf ca. 20 ml
in eingeengt und bis zur Trübung mit Petroläther versel Λ Innerhalb kurzer Zeit kristallisiert
BOC-CyS(SCM)-GIy-GIiI(OtBu),
aus; F 87-88°; Ausbeute 1,59 g (87%).
·> Das Ausgangsmaterial kann wie folgt hergestellt werden:
1,54 g BOC-Cys(Bam)-OH [P. K. Chakravartv und R. K. Olsen, J. Org. Chem. 43, 1270 (1978)] und 1,37 g H-GIy-GIu(OtBu)2 werden in 30ml Dimethylform-
:■ smid gelöst und bei 0° mit !.07 g Picyc!ohpxy!carbod!- imid und 0,73 g 1-Hydroxybenzotriazol versetzt. Nach 24 Stunden bei 20° wird abfiltriert, das Filtrat zur Trockene eingedampft, der Rückstand in 100 ml Äthylacetat aufgenommen und die Lösung mit verdünnter Citronensäure, 0.5 N Natriumhydrogencarbonat und Wasser gewaschen. Nach Trocknen der Lösung über Natriumsulfat wird das Lösungsmittel abgedampft und der Rückstand aus CHCh-Petroläther umkristallisiert, womit 2,15 g (76%)
BOC-Cys(Bam)-Gly-Glu(OtBu)2,
F 137 bis 139', resultiert.

Claims (2)

Patentansprüche:
1. Verfahren zur Herstellung von S-Methoxycarbonylthiocysteinen oder cysteinhaltigen Peptiden oder deren Derivaten, in denen die Mercaptogruppe jeweils durch die Gruppe
-S-CO-OCH3
geschützt ist, dadurch gekennzeichnet, daß man Cystein oder cysteinhaltige Peptide oder deren Derivate, in denen die Mercaptogruppe jeweils durch eine Trityl-, Niederalkanoylamidomethyl- oder eine am Benzolring gegebenenfalls durch Niederalkyl oder Niederalkoxy substituierte Benzoylamidomethylgruppe substituiert ist, mit Methoxycarbonylsulfenylchlorid der Formel
Cl-S-CO-OCH3
in einem Kohlenwasserstoff, chlorierten Kohlenwasserstoff, Alkohol, Äther und/oder Carbonamid bei Temperaturen von ca. —40 bis ca. -t-60°C umsetzt
2. Verwendung der nach dem Verfahren gemäß Anspruch 1 hergestellten S-Methoxycarbonylthio-Verbindungen zur Herstellung von Cystin oder cystinhaltigen Peptiden oder ihren Derivaten durch Umsetzung mit Cystein oder einem cysteinhaltigen Peptid oder einem Derivat davon, in denen die Mercaptogruppe jeweils in freier Form vorliegt, in den im Anspruch 1 angegebenen Lösungsmitteln oder in Eisessig oder wäßriger Essigsäure bei den angegebenen Temperaturen.
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