-
Verfahren zur Herstellung eines Tetrapeptid-Derivates Die Erfindung
betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines Tetrapeptid-Derivates. Die Erfindung
betrifft insbesondere ein Verfahren zur Herstellung von L-2ryptophanyl-L-methionyl-L-asparaginyl-L-phenylalaninamid
mit einer Schutzgruppe an dem Aminorest.
-
Das genannte Detrapeptid-Derivat weist eine überlegene Wirksamkeit
bezüglich der Stimulierung der Magensekretion auf und ist ein nützliches Medikament.
Es ist bekannt, daß die Verbindung durch Kondensation von L-Tryptophan, L-Methionin,
L-Asparaginsäure und L-Phenylalanin-ester (oder -amid) in der angegebenen
Reihenfolge
hergestellt werden kann, und zwar mittels herkömmlicher Methoden zur Synthese von
Peptiden, wie der Azidmethode, der Carbodiimidmethode und der Aktive-Ester-Methode
(britische Patentschrift Nr. 1 063 728). Die bekannten Verfahren sind jedoch kompliziert
und die dabei verwendeten Reagenzien für eine Herstellung des Tetrapeptid-Derivates
in großem Maßstab zu teuer.
-
Bei Arbeiten zum Auffinden eines einfacheren Verfahrens zur Herstellung
des genannten Tetrapeptid-Derivates wurde Jetzt gefunden, daß das Derivat in großem
Maßstab und zudem in großer Reinheit und mit hohen Ausbeuten hergestellt werden
kann, wenn man Aziridinon-Derivate der zu kondensierenden Aminosäuren verwendet.
-
Erfindungsgemäß kann L-Tryptophanyl-L-methionyl-L-asparaginyl-L-phenylalaninamid
mit einer Schutzgruppe am Aminorest (1) hergestellt werden, indem man 3-(Benzyloxycarbonylmethyl)-aziridinon
mit einer Schutzgruppe am Iminorest mit L-Phenylalaninamid kondensiert, die Schutzgruppe
an dem Aminorest und die Benzylgruppe von dem geschützten Dipeptid entfernt, das
erhaltene L-Asparaginyl-L-phenylalaninamid mit 3-(2-Methylthioäthyl)-aziridinon
mit einer Schutzgruppe an dem Iminorest kondensiert, die Schutzgruppe von dem geschützten
Tripeptid entfernt und das erhaltene Produkt mit 3-(3-Indolylmethyl)-aziridinon
mit einer Schutzgruppe an dem Iminorest kondensiert.
-
Alternativ kann das Tetrapeptid-Derivat (I) hergestellt werden, indem
man 3-(Benzyloxycarbonylmethyl)-aziridinon mit einer Schutzgruppe an dem Iminorest
mit L-Phenylalaninamid kondensiert, die Schutzgruppe an dem Aminorest und die Benzylgruppe
von dem geschützten Dipeptid entfernt, das erhaltene L-Asparaginyl-L-phenylalaninamid
mit I,Tryptophanyl-L-methioninazid mit einer Schutzgruppe am Aminorest, hergestellt
durch Kondensation von -(3-Indolylmethyl)-aziridinon mit einer Schutzgruppe am Iminorest
T£it Methionin-ester, kondensiert und das erhaltene Produkt in das Azid überführt.
-
Die genannten Verfahren können durch das folgende Reaktionsschema
wiedergegeben werden.
-
In diesem Reaktionsschema bedeuten Y, Y1 und Y2 eine Schutzgruppe
eines Amino- oder Iminorestes, R der Rückstand einer Estergruppe, z.B. Methyl oder
Äthyl, und Phe, Asp, Met und Try Phenylalanyl, Asparaginyl, Methionyl bzw. Tryptophanyl.
-
Geeignete Beispiele für die Schutzgruppe eines Amino- oder Iminorestes
sind Benzyloxycarbonyl-, p-Brombenzyloxycarbonyl-, p-Chlorbenzyloxyearbonyl- und
Tosylgruppen.
-
In den genannten Verfahren wird die Kondensationsreaktion eines Aziridinon-Derivates
mit einer Aminosäure oder einem Peptid vorzugsweise unter Kühlen bei Temperaturen
unterhalb von -20°C in einem geeigneten Lösungsmittel durchgeführt. Das Lösungsmittel
kann beispielsweise Tetrahydrofuran, Chloroform, Tetrachlorkohlenstoff, Methylenchlorid,
Äther od. dgl. sein.
-
In dem obigen zuerst genannten Verfahren wird nach der Kondensation
von 3-(Benzyloxyearbonylmethyl)-aziriditon mit einer Schutzgruppe am Iminorest mit
L-Phenylalaninamid das erhaltene L-Asparaginyl-L-phenylalaninamid mit Schutzgruppen
am Aminorest und dem Carboxylrest in ß-Stellung einer herkömmlichen katalytischen
Reduktion zur Entfernung der Schutzgruppen unterworfen.
-
Das so erhaltene Dipeptid wird dann mit 3-(2-Methylthioäthyl)-aziridinon
mit einer Schutzgruppe am Iminorest kondensiert, wobei man L-Methionyl-L-asparaginyl-L-phenylalaninamid
mit einer Schutzgruppe am Aminorest erhält. Die Schutzgruppe an dem Aminorest des
so erhaltenen Tripeptids kann mittels einer herkömmlichen
katalytischen
Reduktion oder der folgenden unterschiedlichen Verfahren in Abhängigkeit von der
Natur der Schutzgruppe entfernt werden. enn die Schutzgruppe ein Tosylrest ist,
kltm sie in leichter Weise durch Behandlung des Peptids mit Trifluoressigsäure,
Salzsäure/Dioxan, Salzsäure/Essigsäure od. dgl. entfernt werden. Wenn die Schutzgruppe
eine Benzyloxycarbonyl-, p-Brombenzyloxycarbonyl- oder p-Chlorbenzyloxycarbonyl-Gruppe
ist, kann sie in leichter Weise durch Behandlung des Peptids mit einem Halogenwasserstoff,
z.B. Fluorwasserstoff oder Bromwasserstoff, in Essigsäure entfernt werden. I)as
freie Tripeptid wird mit 3-(3-Indolylmethyl)-aziridinon mit einer Schutzgruppe am
Iminorest kondensiert, wobei das gewünschte Tetrapeptid-Derivat (I) erhalten wird.
-
In dem letzteren oben genannten Verfahren kondensiert man 3-(3-Indolylmethyl)-aziridinon
mit einer Schutzgruppe an dem Iminorest mit L-Methionin-ester und aktiviert den
erhaltenen L-Tryptophanyl-L-methionin-ester durch Umwandlung des Esterteils des
Dipeptids in ein Azid. Die so erhaltene Azidverbindung kondensiert man mit L-Asparaginyl-L-phenylalaninamid,
hergestellt durch Kondensation von 3-(Benzyloxycarbonylmethyl)-aziridinon mit einer
Schutzgruppe am Iminorest mit L-Phenylalaninamid, wobei man das gewünschte Tetrapeptid-Derivat
(I) erhält.
-
Gemäß den Verfahren der Erfindung kann die Kondens:ttionsreaktion
im Gegensatz zu den herkömmlichen Verfahren otine Bildung irgendwelcher ungünstiger
Nebenprodukte durchgeführt werden.
Die Operationen sind daher äußerst
einfach. Außerdem treten im Verlauf der Reaktion keinerlei Racemisierungen auf.
Demgemäß können die Verfahren der Erfindung im Vergleich zu den herkömmlichen Verfahren
das gewünschte Produkt in höherer Ausbeute und Reinheit liefern.
-
Das Ausgangsmaterial, die Aziridinon-Deriyate der Erfindung können
in leichter Weise erhalten werden, und zwar in der gleichen Weise wie in "The Abstracts
of The 8th Peptide Chemical Debate", Seite 36, beschrieben, d.h. durch Behandlung
der entsprechenden Aminosäure mit einem iehydratisierungsreagenz, d.h.
-
Phosgen, Phosphorpentachlorid, Thionylchlorid oder Phosphoroxychlorid,
in einem inerten Lösungsmittel, z.B. Tetrahydrofuran oder Äther.
-
Die Verfahren der Erfindung zur Herstellung des Tetrapeptid-Derivates
(I) werden in den folgenden Beispielen erläutert.
-
Beispiel 1 a) N-3enzyloxycarbonyl-ß-benzyl-L-asparaginsäure (35,7
g) wurde in Tetrahydrofuran (300 ml) gelöst. Die Lösung wurde auf -250C gekühlt.
Dazu wurde tropfenweise eine Lösung von Phosgen in Äther (50 ml, Phosgengehalt:
10 g) gegeben. Zu der Lösung wurde unter Rühren allmählich eine Lösung von Triäthylamin
in Tetrahydrofuran (40 ml, Triäthylamingehalt: 14 ml) ixiiierhalb einer Zeitspanne
von 40 Minuten bei -250C gegeben. Nach 30 Minuten
langem Rühren
wurde weiterhin eine Lösung von Triäthy-lamin in Tetrahydrofuran (40 ml, Triäthylamingehalt:
14 ml) ininnerhalb einer Zeitspanne von 40 Minuten gegeben, um die Neutralisation
zu vervollständigen. Das Ende der Reaktion konnte durch Dünnschichtchromatographie
bestätigt werden (Trägers Silicagel G; Eluierungsmittel: Chloroform : Äthylacetat
: Essigsäure = 85 : 15 : 3; Rf-Wert des Produktes: 0,9; Rf-Wert des unreagierten
Ausgangsmaterials: 0,5; Ninhydrin-Reaktion: +). Man erhielt eine Lösung von N-Benzyloxycarbonyl-3-(benzyloxycarbonylmethyl)
aziridinon in nahezu quantitativer Ausbeute.
-
Zu der Lösung des vorstehend erhaltenen Aziridinon-Derivates fügte
man tropfenweise unter Rühren eine Lösung von L-Phenylalaninamid (16,4 g) in Chloroform
(400 ml) bei -250C hinzu. Nach 30 Minuten langemtRühren bei derselben Temperatur
ließ man die Lösung bei Raumtemperatur unter Rühren 2 weitere Stunden lang stehen.
Zu der Lösung wurde Chloroform (300 ml) gegeben. Dann wurde die Mischung mit Wasser,
5 %iger wässriger Natriumbicarbonatlösung und g °,'oiger Salzsäure in der angegebenen
Reihenfolge gewaschen. Die Chloroformschicht wurde abgetrennt und zur Entfernung
des Chloroforms unter vermindertem Druck destilliert.
-
Der erhaltene Rückstand wurde aus Äthanol umkristallisiert, wobei
man N-Benzyloxycarbonyl-ß-benzyl-L-asparaginyl-L-phenylalaninamid (40,7 g) erhielt.
Ausbeute: 81 %, Schmelzpunkt 169 bis 1710C, [J20: -21,40 (C = 1, Dimethylformamid).
-
Das vorstehend erhaltene Produkt (40 g) wurde in Methanol (800 ml)
gelöst. Dazu wurde 5N Salzsäure (20 ml) gegeben. Die Mischung wurde 4 Stunden lang
bei Raumtemperatur einer katalytischen Reduktion an Palladium-Aktivkohle unterworfen.
Nach dieser Reaktion wurde zu der Reaktionsinischung Wasser (200 ml) gegeben. Der
Katalysator wurde dann durch Filtration abgetrennt.
-
Zu dem Filtrat wurde eine wässrige Natriumbicarbonat-Lösung gegeben,
um den pH-Wert bei 5 einzustellen. Dann wurde das Lösungsmittel unter vermindertem
Druck abdestilliert. Der erhaltene Rückstand wurde in iN Salzsäure (200 ml) gelöst
und mit Äthylacetat (50 ml) gewaschen. Der pH-Wert der wässrigen Lösung wurde mittels
Natriumbicarbonat bei 5 eingestellt. Die ausgefällten Kristalle wurden durch Filtration
gesammelt und mit gekühltem Wasser und Methanol gewaschen, wobei man L-Asparaginyl-L-phenylalaninamid
(18,5 g) erhielt. Ausbeute: 82 , Schmelz punkt 186 bis 18800.
-
b) N-Benzyloxycarbonyl-L-methionin (14,2 g) wurde in Tetrahydrofuran
(150 ml) gelöst. Die Lösung wurde auf 2000 gekühlt.
-
Dazu wurde tropfenweise- eine Lösung von Phosgen in Äther (25 ml,
Phosgengehalt: 5 g) gegeben. Zu dieser Mischung wurde tropfen weise eine Lösung
von Triäthylamin in Tetrahydrofuran (40 ml, Griathylamingehalt: 14 ml) in einem
20 ml-Anteil indes unter a) beschriebenen Weise gegeben. Die Mischung wurde wie
unter a) beschrieben behandelt, wobei man eine Lösung von N-Benzyloxycarbonyl-3-(2-methylthioäthyl)-aziridinon
erhielt0
Zu der so erhaltenen Lösung wurde tropfenweise unter Rühren
eine Lösung von L-Asparaginyl-L-phenylalaninamid (14,0 g), erhalten in Stufe a),
in Dimethylformamid (100 ml) bei -200C gegeben. Man rührte 1 Stunde lang bei derselben
Temperatur und ließ die Lösung 2 weitere Stunden lang unter Rühren bei Raumtemperatur
stehen. Nach Behandlung der Lösung in der unter a) beschriebenen Weise erhielt man
N-Benzyloxycarbonyl-L-methionyl-L-asparaginyl-L-phenylalaninamid (21,1 g). Ausbeute:
75,5 %, Schmelzpunkt 198 bis 20oOC, holz 20: -40,2° (C = 1, Dimethylformamid).
-
Das so erhaltene Produkt (16,3 g) wurde in einer Lösung von Bromwasserstoff
und Essigsäure (35 g, Bromwasserstoffgehalt: 25 Gew.-%) unter EiskühN1xng gelöst.
Man rührt 1 Stunde bei der gleichen Temperatur und fügte dann Petroläther (150 ml)
hinzu.
-
Man entfernte die oben schwimmende Flüssigkeit, fügte erneut Petroläther
hinzu und entfernte wiederum die oben schwimmende Flüssigkeit. Die Niederschläge
wurden durch Filtration gesammelt und mit Äther gewaschen, wobei man pulverförmiges
L-Methionyl-L-asparaginyl-L-phenylalaninnmrd erhielt.
-
c) N-Benzyloxycarbonyl-L-tryptophan (10,1 g) wurde in Tetrahydrofuran
(150 ml) gelöst. Die Lösung wurde auf -250C gekühlt.
-
Dazu fügte man tropfenweise eine Lösung von Phosgen in Äther (15 ml,
Phosgengehalt: 3 g) hinzu. Zu dieser Lösung wurde tropfenweise eine Lösung von Triäthylümin
in Tetrahydrofuran (24 ml, Triäthylamingehalt: 8,4 ml) in einem 12 ml-Anteil in
der unter
a) beschriebenen Weise gegeben. Die mischung wurde in
der unter a) beschriebenen beise behandelt, wobei man eine Lösung von ET-Benzyloxyearbonyl-3-(3-indolylmethyl)-aziridinon
erhielt.
-
Das unter b) erhaltene L-Methionyl-L-asparaginyl-L-phenylalaninamid
wurde in DimethylSormamid (100 ml) gelöst. Die Lösung wurde mit riäthylamin neutralisiert.
Die Lösung wurde tropfenweise unter Rühren zu der oben erhaltenen Lösung des Aziridinon-Derivates
bei -25 OC gegeben. Man rührte 1 Stunde lang bei derselben Temperatur und ließ dann
die Lösung weitere 3 Stunden unter Rühren bei Raumtemperatur stehen. Die Reaktionsmischung
wurde unter Rühren und Mühlen zu 1 %iger Salzsäure (1 1) gegeben. Die entstandenen
Niederschläge wurden durch Filtration gesammelt, mit Wasser und Athylacetat in der
angegebenen Reihenfolge gewaschen und aus Xethanol/Äthylacetat umkristallisiert,
wobei man das gewünschte N-Benzylopyearbonyl-L-trypt ophanyl-L-methionyl-L-asparaginyl-L-phenylalsninamid
(14,9 g) erhielt. Ausbeute: 68,6 %, Schmelzpunkt 230 bis 232°C, [α]D20: -41,1°
(C = 1, Dimethylformamid).
-
Analyse Berechnet: G 60,80; H 5,79; N 11,50; S 4,37 Gefunden: C 60,58;
H 5,76, N 11,31; S 4,28 Beispiel 2 a) N-Benzyloxycarbonyl-L-tryptophan (33,8 g)
wurde in TetrAlydrofural (300 ml) gelöst. Die Lösung wurde auf -25°C gekühlt.
Dazu
fügte man tropfenweise eine Lösung von Phosgen in Äther (50 ml, Phosgengehalt: 10
g). Zu der Mischung wurde allmählich unter Rühren eine Lösung von Triäthylamin in
Tetrahydrofuran (40 ml, Triäthylamingehalt: 14 ml) innerhalb einer Zeitspanne von
40 Minuten bei -25 0C gegeben. Nach 30minutigem Rühren wurde weiterhin eine Lösung
von Triäthylamin in Tetrahydrofuran (40 ml, Triäthylamingehalt: 14 ml) innerhalb
einer Zeitspanne von 40 Minuten gegeben, um die Neutralisation zu vervollständigen.
Das Ende der Reaktion konnte durch Dünnschichtchromatographie in der in Beispiel
1 beschriebenen Weise sichergestellt werden. Man erhielt eine Lösung von N-Benzyloxycarbonyl-3-(3-indolylmethyl)-aziridinon
in nahezu quantitativer Ausbeute.
-
Getrennt hierzu wurde L-Methionin-methyl e et er-hydrochlorid (20,0
g) in Chloroform (250 ml) gelöst und dann mit Triäthylamin (14 ml) neutralisiert.
Die Lösung wurde tropfenweise unter Rühren zu der Lösung des oben erhaltenen Aziridinon-Derivates
bei -25°C gegeben. Nach 30 Minuten langem Rühren ließ man die Lösung weitere 2 Stunden
bei Raumtemperatur unter Rühren stehen.
-
Man fügte Chloroform (500 ml) zu der Lösung. Die Mischung wurde in
der angegebenen Reihenfolge mit Wasser, 3 %iger Salzsäure und 5 °Oiger wässriger
Natriumbicarbonat-Lösung gewaschen. Die Chloroformschicht wurde abgetrennt, über
wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und bei vermindertem Druck zur Entfernung
des Chloroforms destilliert. Der erhaltene Rückstand wurde aus Äthylacetat/Petroläther
umkristallisiert, wobei man N-Benzyloxyearbonyl
-X-tryptophanyl-L-methionin-methylester
(38,0 g) erhielt. Ausbeute: 78,6 , Schmelzpunkt 137 bis 138°C,X] DO -24,oO (C =
1, Methanol).
-
Das so erhaltene Produkt (38,0 g) wurde in Methanol (150 ml) gelöst.
Dazu wurde Hydrazinhydrat (30 g) gegeben, wobei man N-Benzyloxyearbonyl-L-tryptophanyl-X-methionin-hydrazid
(29,0 g) erhielt. Schmelzpunkt 185 bis 187°C, [α]D20: 23,00 (C = 1, Dimethylformamid).
-
Das so erhaltene Produkt (29,0 g) wurde in Dimethylformamid (g00
ml) gelöst. Dazu wurde 2N Salzsäure (100 ml) gegeben. Die Lösung wurde auf -1OOC
gekühlt. Dazu fügte man allmählich unter Rühren eine wässrige Natriumnitrit-Lösung
(20 ml, Natriumnitritgehalt: 4,35 g) hinzu, wobei man das entsprechende Azid erhielt.
-
Danach neutralisierte man mit Triäthylamin (14 ml).
-
b) Zu der oben erhaltenen Lösung wurde tropfenweise eine Lösung von
L-Asparaginyl-L-phenylalaninamid, hergestellt in der unter a) beschriebenen Weise,
in Dimethylformamid (300 ml, L-Asparaginyl-L-phenylalaninamid-Gehalt: 16,8 g) und
Triäthylamin (8,4 ml) gegeben. Die Lösung wurde 1 Stunde lang bei -1OOC gerührt.
Danach ließ man die Lösung unter Rühren 1 Tag lang bei Raumtemperatur stehen. Die
Reaktionsmischung wurde mit Triäthylamin schwach alkalisch gehalten. Nach der Reaktion
wurde 1 «ige Salzsäure (1,5 1) zu der Reaktionsmischung gegeben. Die ausgefällten
Kristalle wurden durch Filtration unter Eiskühlung gesammelt,
mit
Wasser und Methanol/Äthylacetat (1 : 1) gewaschen und aus Methanol/Äthylacetat umkristallisiert,
wobei man N-Benzyloxycarbonyl-L-tryptophanyl-L-methionyl-L-asparaginyl L-phenylalaninamid
(30,9 g) erhielt. Ausbeute: 69,2 %, Schmelzpunkt 230 bis 232°C, [α]D20: 40,80
(C = 1, Dimethylformamid).
-
Analyse Berechnet: C 60,80; H 5,79; N 11,50; S 4,37 Gefunden: C 60,69;
H 5,86; N 11,16; S 4,31