DE2518256A1

DE2518256A1 - Verfahren zur herstellung eines peptids

Info

Publication number: DE2518256A1
Application number: DE19752518256
Authority: DE
Inventors: Yoshikazu Isowa; Fukushima Koriyama; Katsumasa Kuroiwa; Takeshi Nagasawa; Koichi Narita
Original assignee: Nitto Boseki Co Ltd; Sagami Chemical Research Institute
Current assignee: Nitto Boseki Co Ltd; Sagami Chemical Research Institute
Priority date: 1974-04-24
Filing date: 1975-04-24
Publication date: 1975-11-06
Also published as: DE2518256B2; FR2268792A1; JPS50140686A; JPS5443076B2; CA1046441A; DE2518256C3; FR2268792B1; NL7504254A; NL173183C

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines Peptids der Formel

X-A-B-C-Y (III)

wobei A Ala., GIn., Asn., öJ-BOC-Lys., Leu., GIy., GIu., GIu. oder Pro.; bedeutet oder wobei

A A₁-Ap ist, wobei A₁ einen hydrophilen Aminosäurerest bedeutet und Ap VaI.J Met., Leu. oder GIn. bedeutet und wobei B Phe., Tyr., Leu., Met., GIu., Asp., Gin., Asn. oder Trp. bedeutet und wobei C Phe., Leu., Heu., Tyr., Cys-SBzl., Ser-OBzl., Trp., oder Met. bedeutet und wobei X eine α-Aminosäure-Schutzgruppe, einen am N-Ende eine Schutzgruppe tragenden Aminosäurerest oder einen am N-Ende eine Schutzgruppe tragenden Peptidrest bedeutet und wobei Y eine Carboxyl-Schutzgruppe oder einen am C-Ende eine Schutzgruppe tragenden Aminosäurerest oder einen am C-Ende eine Schutzgruppe tragenden Peptidrest bedeutet, wobei der hydrophile Aminosäurerest A₁ vorzugsweise Ala., GIn., Asn., t^

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Leu., GIy., G-Iu., GIu. oder Pro. ist.

OMe

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren wird ein Peptid der Formel

X-A-B-OH (I)

mit einer Aminosäure oder einem Peptid der Formel

H-C-Y (II)

in Gegenwart des Enzyms Pepsin umgesetzt.

Es sind in jüngster Zeit verschiedenste Peptide mit physiologischer Aktivität untersucht worden und es besteht ein großes Interesse, solche Peptide zu synthetisieren. Typische herkömmliche Verfahren zur Peptidsynthese sind die Azidmethode; die mit gemischten Säureanhydriden arbeitende Methode; die Dicyclohexyl-carbodiimidmethode und die mit aktivem Ester arbeitende Methode. Bei den herkömmlichen Verfahren treten jedoch verschiedenste Schwierigkeiten auf, z. B. Racemisierungen, Nebenreaktionen, komplizierte Temperatursteuerung, lange Reaktionsdauer usw.. Insbesondere bei der Methode der Fragmentkondensation fällt der Nachteil der nicht-vermeidbaren Racemisierung stark ins Gewicht. Das Racemisierungsproblem ist bei Peptid-Synthesen allgemein schwerwiegend. Wenn Racemisierung eintritt, so ist die Reinheit des gebildeten Produkts herabgesetzt und die Abtrennung des verunreinigenden Isomeren ist mit großen Schwierigkeiten verbunden und bei der industriellen Durchführung des Verfahrens nachteilig.

Neben den rein organisch-chemischen Verfahren sind bereits Peptidsynthesen bekannt, bei denen das Enzym Papain eingesetzt wird (z. B. O.K. Behrens und M. Bergmann; J. Biol. Chem., 129, 587 (1939) und H.B. Milne und Warren Kilday; J. Org.

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Chem., 30, 64 (1965)). Der hier verwendete Ausdruck "Peptid" folgtder Definition von Harry D. Law; "The Org. Chem. of Peptides" (Willy Interscience 1970), Seite 6. Es ist bevorzugt, Peptide (einschließlich Polypeptide und Oligopeptide) als Ausgangsmaterial einzusetzen, welche in dem Medium eine mindestens geringe Löslichkeit aufweisen, da Peptide ohne Löslichkeit in dem Medium inaktiv sind. Der Ausdruck "Pepsin" und insbesondere der Pepsintiter sind in Anson, M. "J. Gen. Physiol.", Band 22, Seite 79, 1938 erläutert. Mit diesem bekannten Verfahren wird das Racemisierungsproblem gelöst. Es werden jedoch nur Di-peptide oder Tri-peptide erhalten.

Bei der Synthese von Tetra-peptiden oder höheren Peptiden unter Verwendung von Papain mit verschiedener Substratspezifität treten Nebenreaktionen ein (Hydrolyse des Peptids; Transpeptidisierung; Bildung von Plastein). Daher eignet sich dieses Verfahren nicht zur industriellen Peptid-Synthese.

Den Erfindern ist es nun gelungen, Polypeptide und insbesondere höhere Peptide als Tri-peptide durch Verwendung des Enzyms Pepsin herzustellen. Die proteolytischen Enzyme (Protease) üben auf Peptide eine hydrolysierende Wirkung aus und zwar mit guter Reproduzierbarkeit und bei Anwendung milder Bedingungen ohne Nebenreaktionen. Daher werden proteolytische Enzyme zur Strukturaufklärung von Polypeptiden und Proteinen eingesetzt. Unter Verwendung solcher Enzyme wurden die Primärstrukturen verschiedener natürlicher Polypeptide, wie Insulin, aufgeklärt. Das Pepsin (Verdauungsenzym) gehört zu den proteolytischen Enzymen und speziell zu den Endopeptidasen (Enzyme, welche an einer inneren Bindung der Peptidkette angreifen). Es wurde festgestellt, daß Pepsin sich zur Synthese von Peptiden eignet und bei einfacher Arbeitsweise zu hohen Ausbeuten führt. Insbesondere eignet sich das erfindungsgemäße Verfahren für die Methode der sequentiellen Peptidsynthese und für die Methode der mit Fragmentkondensation arbeitenden Peptidsynthese.

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Gegenüber der sequentiellen Methode weist die Fragmentkondensationsmethode erhebliche Vorteile auf. Das erfindungsgemäße Verfahren ist nun insbesondere von Bedeutung für die Fragmentkondensationsmethode.

Bei der erfindungsgemäßen Peptidsynthese wird ein Peptid der Formel (I) (im folgenden als C-Komponente bezeichnet) als Ausgangsmaterial eingesetzt. Die C-Komponente sollte eine Partiaistruktur haben, bei der zwei oder drei spezifische Aminosäuren in spezifischer Verknüpfung kondensiert sind, d. h. die Bindung -A-B- sollte in der Formel (i) in der reaktiven Position vorliegen. Es können die verschiedensten Peptide eingesetzt werden, solange nur diese spezifische Partialstruktur vorliegt. Die End-Gruppe der C-Komponente, d. h. die Aminogruppe in α-Position, sollte durch eine Schutzgruppe für die Aminogruppe geschützt sein, z. B. durch eine Carbobenzoxygruppe (Z); eine substituierte Carbobenzoxygruppe, wie p-Methoxybenzyloyycarbonyl (pMZ); t-Butyloxycarbonyl (BOC) oder Tosyl (TOS) oder dgl..

Die Aminosäure oder das Peptid der Formel (II) (im folgenden als N-Komponente bezeichnet), welche bzw. welches als weiteres Ausgangsmaterial dient, sollte in der reaktiven Position eine spezifische Aminosäure tragen, wie Phenylalanin, Leucin, Isoleucin, Tyrosin, S-Benzyl-cystein, O-Benzyl-serin, Tryptophan oder Methionin. Die endständige Carboxylgruppe der N-Komponente sollte durch eine Schutzgruppe für die Carboxylgruppe geschützt sein, z. B. in Form einer Estergruppe (Methylester, Ä'thylester, Benzylester, t-Butylester oder p-Nitrobenzylester); in Form einer Amidgruppe oder einer substituierten Amidgruppe, wie der 2,4,6-Trimethylbenzylamidgruppe (TMB), der Hydrazidgruppe oder einem Derivat derselben. Die N-Komponente kann in freier Form eingesetzt werden oder als Salz (vom Typ des Hydrochlorids, des Hydrobromids, des Trifluoracetats, des p-Toluolsulfonats oder eines anderen anorganischen oder organischen Salzes).

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_ 5 —

Die N-Komponente und die C-Komponente können innerhalb des angegebenen Rahmens als Struktureinheiten des angestrebten Peptids ausgewählt werden. Die gewünschten Peptide können somit nach der Fragmentkondensationsmethode erhalten werden. Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren können die "beiden Komponenten (die C-Komponente und die N-Komponente) in äquivalenter Menge eingesetzt werden oder eine der Komponenten kann im Überschuß eingesetzt werden. Das Molverhältnis der N-Komponente zur C-Komponente liegt gewöhnlich im Bereich von 1:5 bis etwa 5'-1 und vorzugsweise im Bereich von 1:2 bis etwa 2:1.

Bei Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens ist es bevorzugt, die N-Komponente in einem alkalischen Medium aufzulösen, welches als Alkali z. B. ein Alkalimetallhydroxid oder ein Erdalkalimetallhydroxid enthalten kann. Es ist erforderlich, die Umsetzung in einer Pufferlösung bei einem pH von etwa 2 bis etwa 6 und bei einer Temperatur von etwa 20 bis etwa 50 ⁰C durchzuführen. Als Pufferlösungen kommen Zitronensäure-Pufferlösung, Michaelis-Pufferlösung, Mcllvaine-Pufferlösung oder andere Pufferlösungen für den pH-Bereich von 2 - 6 in Frage. Es ist nicht bevorzugt, eine Pufferlösung mit einem pH unterhalb 2 oder oberhalb 6 einzusetzen, da in diesem Falle die Ausbeute gering ist. Bevorzugt ist ein pH-Bereich von etwa. 3 bis etwa 5 und optimal ist ein pH-Wert von etwa 4. Wenn die Temperatur unterhalb 20 C liegt, so bedarf es bis zur Vervollständigung der Umsetzung einer langen Zeitdauer. Wenn die Temperatur oberhalb 50 ⁰C liegt, so ist die Aktivität des Pepsins merklich herabgesetzt, und die Ausbeute ist gering. Die bevorzugte Temperatur beträgt 30 bis 40 ⁰C. Das erfindungsgemäß eingesetzte Pepsin ist ein Verdauungsenzym vom Typ der Endopeptidasen. Pepsin mit einem Pepsintiter von 1: 5 000; 1: 10 000; und 1: 60 000 kann leicht erhalten werden. Man kann auch Rohpepsin einsetzen, solange die Aktivität hoch ist. Pepsin wird in katalytischen Mengen eingesetzt.

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*■■ O ""~

Vorzugsweise verwendet man 0,4 - 400 mg Pepsin pro 1 mmol der Ausgangsmaterialien. Die Umsetzung findet glatt in einem wässrigen Medium statt oder in einem mit Wasser mischbaren Medium, wie Methanol, Äthanol, Dioxan, Dimethylformamid oder dgl.. Das Produkt ist in Wasser oder in dem mit Wasser mischbaren Medium schwäch löslich und es fällt somit aus dem Reaktionssystem in Kristallform aus. Die ausgeschiedenen Kristalle werden abfiltriert und mit einer erwünschten schwachalkalischen wässrigen Lösung, schwach-sauren v/ässrigen Lösung und Wasser gewaschen, wobei das reine Produkt erhalten wird. Die endständige Schutzgruppe der N-Komponente und die endständige Schutzgruppe der C-Komponente des Produkts werden, falls erwünscht, in herkömmlicher Weise entfernt.

Im folgenden wird die Erfindung anhand von Ausführungsbeispielen näher erläutert.

Beispiel 1

Eine Lösung von 0,753 g (1,5 mmol) Hcl^H-Phe-Gly-Leu-Met-NH (Molekulargewicht 502,1) in 40 ml Zitronensäure-Pufferlösung (pH=4,0) wird zu einer Lösung von 1,26 g (2,5 mmol) α ,w-Boc-Lys-Phe-OH (Molekulargewicht 505,6) in 5 ml 1N-NaOH gegeben und dann gibt man 30 ml Wasser unter Rühren hinzu. Danach gibt man 0,2 g Pepsin (1:5 000, hergestellt durch Mikuni Kagaku Sangyo K.K.) zu der Mischung (unter Rühren bei 40 ⁰C während 24 h), wobei die Umsetzung stattfindet. Der erhaltene weiße Niederschlag wird mit einem Glasfilter (G-3) abfiltriert und mit 5^-igem Ammoniakwasser, 5%-iger wässriger Zitronensäurelösung und Wasser nacheinander gewaschen und dann unter vermindertem Druck bei 50 ⁰C über P₂ ⁰R getrocknet, wobei 1,25 g a,&KBoc-Lys-Phe-Phe-Gly-Leu-Met-NH₂ in einer Ausbeute von 88,2 % erhalten werden (Fp. 207 - 216 ⁰C (Zersetzung) und [α] |⁵ = -38,8 (c = 0,5 DMF)).

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Elementaranalyse: (C₄₇H₇₂O₁₀NgS = 941,210)

H N

berechnet (%) 59,98 7,71 11,91 3,41 gefunden (%) 59,74 7,71 11,74 3,42

Yergleichsbeispiel

4,0 g α, o;-Boe-Lys-Phe-Phe-Gly-Leu-Met-NH_? werden in 100 ml Eisessig aufgelöst und HCl-Gas wird unter Rühren während 40 min eingeleitet, um die Schutzgruppe (Boc) zu entfernen. Nach der Umsetzung wird die Reaktionsmischung in 500 ml gekühlten Äther gegossen, wobei ein Niederschlag gebildet wird. Der Niederschlag wird abfiltriert und bei vermindertem Druck über NaOH getrocknet, wobei man 2,70 g 2HC1-H-Lys-Phe-Phe-Gly-Leu-Met-NH₂ in einer Ausbeute von 78,0 # erhält(Fp. 168 - 170°C (Zersetzung); [a]j⁵ = -16,0 (C = 0,5 50 % MeOH)).

Elementaranalyse: (C₅₇H₅₆O₆NgS♦2HCl·1 1/2 H₃O = 841,915)

	2	C	97 84	H	04 33	N	31 33	S	,52 ,81	Cl	66 42
berechnet gefunden	52, 52,		7, 7,		13, 13,		to to		8, 8,
Beispiel

Eine Lösung von 0,753 g (1,5 mmol) HC1*H-Phe-Gly-Leu-Met-NH₂ (Molekulargewicht 502,1) in 40 ml Zitronensäure-Pufferlösung (pH=4,0) wird zu einer Lösung von 1,0 g (2,5 mmol) pMZ-Ala-Phe-OH (Molekulargewicht 400,4) in 5 ml 1N-NaOH gegeben und dann gibt man noch 30 ml Wasser unter Rühren hinzu, worauf man 0,2 g Pepsin (1:5 000, hergestellt durch Mikuni Kagaku Sangyo K.K.) unter Rühren in einem Inkubator bei 40⁰C

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hinzugibt. Die Umsetzung findet während 24 h statt. Der erhaltene weiße Niederschlag wird abfiltriert und mit 5$-igem wässrigen NH.OH, 5%-iger wässriger Zitronensäurelösung und Wasser nacheinander gewaschen und dann wird das Produkt bei vermindertem Druck, bei 50 ⁰G über P₂°5 getrocknet. Man erhält 1,14 g pMZ-Ala-Phe-Phe-Gly-Leu-Met-WH₂ mit dem Schmelzpunkt 229 - 233 ⁰C in einer Ausbeute von 89,2 % £⁵ = -55,0 (c = 0,5 DMP)).

Elementaranalyse:	G	«^H57	o₉s	= 847	,031	)	S	,92 ,78
	60 60		H		N		3 3
berechnet (56) gefunden ($)		,81 ,90	VD VD	,92 ,77	11, 11,	43 56
Beispiel 3

1,14 g (2,5 mmol) pMZ-Gln-Phe-OH (Molekulargewicht 457,5) und 0,75 g (1,5 mmol) HCl-H-Phe-Gly-Leu-Met-HHg (Molekulargewicht 502,1) werden gemäß Beispiel 1 bei 40⁰C während 24 h umgesetzt, wobei 1,05 g pMZ-Gln-Phe-Phe-Gly-Leu-Met-NH₂ mit dem Schmelzpunkt 236 - 237 ⁰G und Γα] S⁵ = -22,8 (c = 1, DMSO)

D
in einer Ausbeute von 77,5 $ erhalten werden.

Elementaranalyse: (C₄₅Hg₀O₁₀FgS = 905,092)

C HNS

berechnet {%) 59,71 6,68 12,38 3,54 gefunden (%) 59,89 6,58 12,31 3,46

Beispiel 4

Gemäß Beispiel 1 werden 1 g (2,5 mmol) pMZ-Ala-Phe-OH (Molekulargewicht 400,4) und 0,93 g (1,5 mmol) HCl'H-Ileu-Gly-

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Leu-Met-NHDmB (Molekulargewicht 618,2) umgesetzt, wobei 1,30 g pMZ-Ala-Phe-Ileu-Gly-Leu-Met-NHDmB mit dem Schmelzpunkt 225 - 227 ⁰C und [α] ψ = -25,4 (c = 1, DMF) in einer Ausbeute von 82,2 % erhalten werden. Bei diesem Beispiel werden 0,4 g Pepsin eingesetzt. DmB bedeutet 2,4-Dimethoxybenzyl.

Elementaranalyse: (C.QH₆₉N₇O₁ ^S = 964,192)

C HNS

berechnet (#) 61,04 7,21 10,17 3,33 gefunden (%) 61,17 7,35 10,09 3,33

Beispiele 5-11

Gemäß Beispiel 1 werden 2,5 mmol der C-Komponente und 2,5 mmol der N-Komponente gemäß Tabelle 1 umgesetzt, wobei die entsprechenden Peptide erhalten werden. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 zusammengestellt.

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Bsp.

C-Komponente

N-Komponente

tt

Tabelle

1

65

,4

Schmelz
punkt
rc)

opti
sche
Drehung
/al²⁵

Elementaranalyse {$>)

N

o^s

S

to

5

α, CJ-Bo c-Lys-
Phe-OH

H-Ileu-Gly-
Leu-Met-NH_O

It

242 bis
etwa

-25,6°
(c=0,5

C H

,25

cn
OO

6

Bo c-Ala-
Phe-OH

d.

Produkt

Ausbeute

pMZ-Leu-Met-
Ileu-Gly- 96

246

DMP)

°44^H74
berechnet:

12

,24

3,53

256

7

pMZ-Leu-Met-
OH

α ,cC^-Boc
Lys-Phe-

i- 94

Leu-Met-

58,26 8,22
gefunden:

12

/3 H

3,41

Ileu-Gly-
Leu-Met-

,3

231 ~
238

-26,6°
(c=0,5

58,29 8,37

,97

2°

5098

NH₂

-HH₂

247 —
250

DMP)

^C36^H59^N7°
berechnet:

12

,80

4,23

en
"ν.

,9

57,20 7,96
gefunden:

12

4,12

100/

Boc-Ala-Phe-
Ileu-Gly-Leu-

-39,2°
(c=0,5

57,16 8,05

9^S5

,67

Met-HH₂

DMP)

39 65 7
berechnet:

11

,57

7,63

55,76 7,80
gefunden:

11

7,84

55,58 7,83

Fortsetzung Tabelle 1

CX) -C--CJl

Bsp.	C-Komponente	N-Komponente	Produkt	Ausb.	Schmelz punkt (⁰C)	opti sche Drehung	Elementaranalyse ($)
8	Boc-Gly-Ala- Phe-OH	H-Ileu-Gly- Leu-Met-NH₂	Boc-Gly-j Phe-Ileu GIy-Leu- Met-NH₂	Qa- 83,7	260 - 265	-30,0° (c=0,5 DMF)	CHNS
9	Boc-Gln-Gln- Phe-OH	H-Phe-Gly- Leu-Met-NH₂	Boc-Gln- Phe-Phe- Gly-Leu- Met-NH₂	62,0	249 - 252	-19,6° (c=1 DMSO)	π τι η w Q ^C38^H62°9^N8^S ber.: 56,56 7,74 13,88 3,97 gef.: 56,46 7,78 13,57 4,12
10	Boc-Ala-Phe- OH	H-Phe-Gly- Leu-Met-NH₂	Boc-Ala- Phe-Phe- Leu-Met-1	47,9 .T I "V^w 1 Xi Λ	240 - 245	-53,4° (c=0.5 DMF)	^C46-^H68^H10^O11^S'^H2⁰ ber.: 55,97 7,15 14,19 3,52 gef.: 55,90 7,10 14,21 3,48
11	Boc-Pro-Ala- Phe-OH	H-Ileu-Gly- Leu-Met-NH₂	Boc-Pro- Ala-Phe- Ileu-Gly- Met-NH₂	81,2 -Leu-	243 - 247	-45,3° (c=0.5 DMSO)	C₃₉H₅₇O₈N₇S ber.: 59,75 7,33 12,50 4,09 gef.: 59,49 7,33 12,24 4,18
^C41^H66^N8°9^S'^H2° ber.: 56,92 7,92 12,95 3,71 gef.: 56,80 7,68 13,00 3,46

oo ro cn

- 12 Beispiel 12

Eine lösung von 0,539 g (2,5 mmol) HCl·H-PlIe-OCH₅ (Molekulargewicht 215,67) in 40 ml Zitronensäure-Pufferlösung (pH=4,0) wird zu einer Lösung von 1,00 g (2,5 mmol) pMZ-Ala-Phe-OH (Molekulargewicht = 400,42) in 5 ml 1N-NaOH gegeben und dann gibt man noch 20 ml Wasser unter Rühren hinzu. Danach gibt man 0,2 g Pepsin (1:5000) unter Rühren bei 40 ⁰C zu der Mischung und die Umsetzung wird bei 40 ⁰C während 24 h durchgeführt. Der erhaltene weiße Niederschlag wird mit einem Glasfilter (G-3) abfiltriert und mit 5$-igem Ammoniakwasser, und danach mit Wasser gewaschen. Dann wird das Produkt unter vermindertem Druck getrocknet und aus Methanol umkristallisiert. Man erhält pMZ-Ala-Phe-Phe-OCH^ mit dem Schmelzpunkt 189-192 ⁰C und Γα]^⁰ = -17,2 (c = 1, DMF) in einer Ausbeute von 59,3 i°.

Elementaranalyse: (C, .H^₅₅N₅O₇ = 561,641)

CHN

berechnet	(*)	66,	30	6	,28	7,	48
gefunden	(*)	66,	23	6	,23	7,	53

Beispiele 15 - 21

Gemäß Beispiel 12 werden 2,5 mmol der C-Komponente und 2,5 mmol der N-Komponente gemäß der Tabelle 2 umgesetzt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 zusammengestellt.

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- 13 Tabelle 2

Bsp. C-Komponente	pMZ-Ala-Phe- OH	N-Componente	Produkt
I 13 i	tt	HC1'H-Tyr-OCH₃	pMZ-Ala-Phe-Tyr-OC^
t 14	Il	HCl-H-Cy₈-OCH₃ S-BzI	pMZ-Ala-Phe-Cys-OC^ S-BzI
15	Il	HCl-H-IIeU-OCH₃.	pMZ-Ala-Phe-Ileu-OCH₃
16	Il	HCl-H-Ser-OCH₃ OCH₂/	pMZ-Ala-Phe-Ser-OCHs OCH₂ φ
17	Il	Tos-OH-H-Phe- OCH₂/	pMZ-Ala-Phe-Phe-OCH^
18	Il	HBr-H-Phe-NH₂	ρ MZ- Ala- Phe - Phe -NH₂
!9	Il	TFA-H-Phe - NHOCH₂/	pMZ-Ala-Phe-Phe- NHOCH₂/
20	Il	2HBr-H-Phe-NHNI	I₂ pMZ-Ala-Phe-Phe- NHNH₂
21	HCl-H-Phe-Gly- NH₂	pMZ-Ala-Phe-Phe-Gly- NH₂

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Fortsetzung Tabelle

Ausbeu
te

(⁰C) Elementar analyse
CHN

umkristallisiert aus

45.6

179— 183

+3.7° (c=0. DMF) C 63.80 6.16 7.70 F 63.87 6.13 7.19

DMF-MeOH-

H₂O

48.4

164-166

-27.8" ( ")

C 63.24 F 63.09 6.14
5.98

6.91 5.28 6.97 5.15

MeOH

7.0

170-175

-14.2°

(c=l

DMF)

C 64.15 F 63.99 6.98
7.00

8.08 8.22

Athylacetat-Petroläther

18.8

158-163

-23.0°

(c=l

MeOH)

C 64.9.6 F 65.09 6.30
6.45

7.10 7.41

AcOEt-

Petrol-

äther

90.4

158-163

55.6

241-w 242

-14.6°

(c=l

DMF)

C 69.69 F 69.76 6.16
5.99

6.59 6.49

-3

C 65.92 F 65.64 6.27 10.25 6.23 10.14

DMF-AHier -Petroläther

DMF-MeOH

13.9

242-244

-14.8° (c=0.5 DMF)

C 68.08 F 68.00 6.18
6.29

8.58 8. 79

DMF-MeOH -H₂O

52.9

228-230

-21.8'

(c=l

DMF)

C 64.16 F 63.93 6.28
6.29

12.47 12.29

DMF-MeOH

51.4

232-233

-34.1° ( ")

C 63.69 F 63.43 6.18 11.60 6.14 11.43

DMF-MeOIi -Äther

Bemerkungen:

BzI = Benzylgruppe ; jf = Phenylgruppe

C = "berechnet F = gefunden

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Beispiel 22

Das Verfahren gemäß Beispiel 12 wird wiederholt, wobei 30 ml Wasser und 0,1 g Pepsin ( 1 : 10 000) eingesetzt werden. Die Umsetzung erfolgt während 18 h. Man erhält pMZ-Ala-Phe-Phe-OCfU mit dem Schmelzpunkt 189 - 193 ⁰O in einer Ausbeute von 51,3 Ιο.

Beispiel 23

Das Verfahren gemäß Beispiel 12 wird wiederholt, wobei 30 ml Wasser eingesetzt werden. Die Umsetzung erfolgt während 18 h. Man erhält pMZ-Ala-Phe-Phe-OCH, mit dem Schmelzpunkt von
187 - 192 ⁰C in einer Ausbeute von 59 %.

Beispiel 24

Das Verfahren gemäß Beispiel 22 wird wiederholt, wobei 0,2 g Pepsin (1 : 1000) eingesetzt werden. Man erhält pMZ-Ala-Phe-Phe-OCH, mit dem Schmelzpunkt 188 - 193 ⁰C in einer Ausbeute von 65,8 5^.

Beispiel 25

Das Verfahren gemäß Beispiel 12 wird wiederholt, wobei 30 ml Wasser eingesetzt werden und wobei die Umsetzung während 10 h durchgeführt wird. Man erhält das gleiche Produkt in einer Ausbeute von 50,0 $>.

Beispiel 26

Eine Lösung von 2,5 mmol HCl*H-Leu-Met-NHp in 40 ml Zitronensäure-Pufferlösung (pH =4,0) wird zu einer Lösung von 2,5 mmol pMZ-Ala-Phe-OH in 5 ml 1N-NaOH und dann gibt man 0,2 g Pepsin gemäß Beispiel 8 hinzu. Die Umsetzung findet bei 40 ⁰C während 24 h statt. Der erhaltene weiße Niederschlag wird gemäß Beispiel 8 gewaschen und getrocknet und aus MeOH-HpO umkristalli-

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siert, wobei man 1,02 g pMZ-Ala-Phe-Leu-Met-NH₂ mit dem Schmelzpunkt 218 - 219 ⁰G und [ocj^⁰ = 31,6 (c=0,5;DMF) in einer Ausbeute von 63,3 % erhält.

Elementaranalyse: (C₅₂H₄₅N₅O₇S = 643,809)

C HNS

berechnet gefunden

59,	70	7	,05	10	,88	4,	98
59,	94	7	,19	10	,78	4,	92

Beispiel 27

Eine Lösung von 0,995 g (2,5 mmol) 2HBr'H-₂ (Molekulargewicht = 398,105) in 40 ml Zitronensäure-Pufferlösung gemäß Beispiel 12 wird zu einer Lösung von 1,50 g (3,75 mmol) pMZ-Ala-Phe-OH in 7,5 ml 1N-NaOH gegeben und dann gibt man noch 30 ml Wasser unter Rühren hinzu. Die Reaktion wird gemäß Beispiel 12 durchgeführt. Der erhaltene Niederschlag wird gewaschen und getrocknet und aus DMF-MeOH-Et₂O umkristallisiert. Man erhält 0,945 g pMZ-Ala-Phe-Phe-Gly-NHNH₂ mit dem Schmelzpunkt 208 - 210 ⁰G und der optischen Drehung P = -31,8 (c=1, DMF) in einer Ausbeute von 61,2 $>.

Elementaranalyse: (C₅₂H₅₈N₆O₇* 1/3 H₃O = 624,701)

CH N

berechnet (#) 61,52 6,23 13,45

gefunden (#) 61,38 6,25 13,38

Beispiel 28

Eine Lösung von 2,5 mmol HCl-H-Phe-OCH- in 40 ml Zitronensäure-Pufferlösung gemäß Beispiel 8 wird zu einer Lösung von 1,47 g (40 mmol) pMZ-Ala-Leu-OH (Molekulargewicht = 366,4) in 5 ml 1N-NaOH gegeben und dann wird die Umsetzung gemäß Beispiel durchgeführt. Der erhaltene Niederschlag wird gewaschen und getrocknet und man erhält 0,302 g pMZ-Ala-Leu-Phe-OCH

5098A5/1007

mit dem Schmelzpunkt 187 - 191 ⁰G und der optischen Drehung F⁰OlP ⁼ ~¹⁸'⁰ (^c=0»5> ^DM]p) ⁱⁿ einer Ausbeute von 22,9 $>. Elementaranalyse: (C₂₈H, N₃O₇* 1/3 H₃O = 533,628)

CHN

"berechnet (#) 63,02 7,11 7,87

gefunden (#) 62,90 6,97 7,97

Beispiel 29

Eine Lösung von 0,793 g (2,5 mmol) HBr-H-Phe-Gly-OCH, (Molekulargewicht = 317,18) in Zitronensäure-Pufferlösung gemäß Beispiel 8 wird zu einer Lösung von 1,50 g (3,75 mmol) pMZ-Ala-Phe-OH in 5 ml 1N-NaOH gegeben und dann gibt man noch 20 ml Wasser hinzu. Die Umsetzung wird gemäß Beispiel 8 durchgeführt. Der erhaltene Niederschlag wird gewaschen, getrocknet und umkristallisiert, wobei man 1,46 g pMZ-Ala-Phe-Phe-Gly-OCE, mit dem Schmelzpunkt 227 - 229 ⁰C und der optischen Drehung L⁰G D ⁼ ~²⁶»7 (c = 1, DMF) in einer Ausbeute von 94,9 1° erhält.

Elementaranalyse: (C₅₅H₅₅N₄O₈ = 618,693)

CHN

berechnet gefunden

Beispiel 30

Gemäß Beispiel 28 wird die Umsetzung mit 4,0 mmol pMZ-Ala-Met-OH und 2,5 mmol HCl-H-Phe-OCH, durchgeführt, wobei man 0,3413 g pMZ-Ala-Met-Phe-OCH₅ mit einem Schmelzpunkt von 153 - 167 ⁰C

64	,07	6	,19	9,	06
63	,79	6	,32	8,	96

509845/1007

23
und der optischen Drehung jV|^ = -17,4 (c=0,5 , DMF) in einer Ausbeute von 24,6 % erhält.

Elementaranalyse: (C₂ H₅₅N₃O₇S = 545,660)

C HNS

berechnet gefunden

59,	43	6	,47	7	,70	5	,88
59,	82	6	,38	7	,78	5	,54

Beispiel 31

Die Umsetzung gemäß Beispiel 28 wird wiederholt, wobei man 2,5 mmol HCl-H-Phe-GIy-OEt anstelle von HCl-H-Phe-OC^ (2,5 mmol) einsetzt. Das Produkt wird mit 5/°-igen Ammoniakwasser gewaschen und dann mit Wasser gewaschen und dann über Pp^c S^e' trocknet. Man erhält 0,8153 g pMZ-Ala-Leu-Phe-Gly-OEt mit dem Schmelzpunkt 175 - 192 ⁰C und der optischen Drehung p = -23,4 (c = 0,5, DMG) in einer Ausbeute von 54,5 1°. Elementaranalyse: (^C3i^H42^N4°8 ⁼ 598,703)

CHN

berechnet gefunden

62,	19	7	,07	9,	36
62,	06	7	,01	9,	20

Beispiel 32

Eine Lösung von 1,5 mmol HCl'H-Ileu-Gly-Leu-Met-NHp (Molekulargewi ent=468,1) in 40 ml Zitronensäure-Pufferlösung gemäß Beispiel 12 wird zu einer Lösung von 2,5 mmol pMZ-Ala-Phe-OH in 5 ml 1N-NaOH gegeben und die Umsetzung wird während 48 h bei 40 ⁰C in Gegenwart von 0,2 g Pepsin gemäß Beispiel 12 durchgeführt. Der erhaltene Niederschlag wird über PpO₁. bei 60 ⁰C während 18 h getrocknet und man erhält 1,10 g

509845/1007

pMZ-Ala-Phe~Ileu-Gly-Leu-Met-NH_o mit dem Schmelzpunkt 253, 5 255 °C und der optischen Drehung [cc] ^ = -42,4 (c=1, AcOH) in einer Ausbeute von 90 %.

Beispiel 35

Eine Lösung von 0,702 g (1,5 mmol) HCl*H-Ileu-Gly-Leu-Met-N^ (Molekulargewicht = 468,1) in 40 ml Zitronensäure-Pufferlösung gemäß Beispiel 12 wird zu einer Lösung von 1,15 g (2,5 mmol) BOC-Asn-Ala-Phe-OH (Molekulargewicht = 450,5) in 5 ml 1N-NaOH gemäß Beispiel 22 gegeben und der Niederschlag wird mit 5$-igem Ammoniakwasser, 5%-iger wässriger Zitronensäurelösung und Wasser nacheinander gewaschen und dann über ^<S>c getrocknet, wobei man 1,052 g BOC-Asn-Ala-Phe-Ileu-Gly-Leu-Met-NHg mit dem Schmelzpunkt 256 - 260 ⁰C und [a]^³ = -56,2 (c=0,5, DMP) in einer Ausbeute von 81,0 % erhält.

Elementaranalyse: (C₄₀Hg₅N₉ ⁰-]-|^S = 864,082)

C HNS

berechnet {%) 55,60 7,58 14,59 5,71

gefunden (%) 55,45 7,69 14,51 5,65

Beispiel 54

Das Verfahren gemäß Beispiel 28 wird wiederholt, wobei man 1,52 g (2,5 mmol) pMZ-Gln-Ala-Phe-OH (Molekulargewicht = 528,5) und 0,702 g (1,5 mmol) 2HC1«H-Ileu-Gly-Leu-Met-NH₂ (Molekulargewicht = 468,1) anstelle von pMZ-Ala-Leu-OH und HC1«H-Phe-OCH₅ einsetzt. Man erhält 1,04 g pMZ-Gln-Ala-Phe-Ileu-Gly-Leu-Met-NH₂ mit dem Schmelzpunkt von 258 - 260 ⁰C (Zersetzung) in einer Ausbeute von 74,5 %.

Elementaranalyse: (C₇₄Hg₇N₇O₁₁S) = 950,142)

C H NS.

berechnet OJ 56,82 TT^ 15,55 3745

gefunden (#) 56,56 7,16 15,49 5,25

509845/1007

25Ί8256

Beispiel 35

1,60 g (4 mmol) pMZ-Ala-Phe-OH werden in 1N-NaOH aufgelöst und andererseits werden 0,54 g (2,5 mmol) HCl-H-Phe-OCH^ jeweils in 40 ml Zitronensäure-Pufferlösung mit verschiedenen pH-Werten aufgelöst. Beide Lösungen werden jeweils vermischt und mit 30 ml Wasser versetzt und danach mit 0,2 g Pepsin gemäß Beispiel 12 und die Mischung wird "bei 40 ⁰C während 24 h umgesetzt. Der erhaltene Niederschlag wird mit 5^-igem Ammoniakwasser und danach mit 5^-iger wässriger 7Λ !,ronensäurelösung und danach mit Wasser gewaschen und ucta Produkt wird über PpOc bei 50 ⁰C getrocknet, wo "bei aazi pMZ-Ala-Phe-Phe-OCH, erhält. Die nachstehende T_abelle zeigt die Ausbeuten und den pH-Wert der eingesetzten Zitronensäure-Pufferlösung.

Tabelle 3

pH	Ausbeute ($>)	Pp.	(c= 1, DMP)
		(⁰C)	-18,4°
2,38	61,1	170-173	-16,7°
3,28	74,6	185-189	-18,0°
4,08	99,9	186-189	-17,2°
5,02	64,0	189-190

Beispiel 36

Eine Lösung von 2 mmol 2HBr·H-Phe-Gln-NHNHp in 40 ml Zitronensäure-Pufferlösung (pH = 4,0) wird zu einer Lösung von 3,75 mmol pMZ-Ala-Tyr-OH in 1N-NaOH gegeben und dann gibt man noch 0,2 g Pepsin bei 25 °C während 48 h zu der Mischung und die Umsetzung erfolgt gemäß Beispiel 8, wobei man pMZ-Ala-Tyr-Phe-Gln-NHNH₂ mit dem Schmelzpunkt 245 - 248 ⁰C

509845/1007

(Zersetzung) und jVj_D = -4,6 (c=1, DMSO) in einer Ausbeute von 57,8 % erhält.

Elementaranalyse: (C₅₅H₄₅N₇Og-H₂O = 725,806)

H N

berechnet
gefunden

57,	92	6	,52	13,	52
57,	98	6	,35	13,	54

Beispiel 37

Das Verfahren gemäß Beispiel 12 wird wiederholt, wobei 2,5 mmol pMZ-Ala-Phe-Ala-Phe-OH und 2,5 mmol HCl'H-Leu-Met-NH-DMB eingesetzt werden. Die Umsetzung erfolgt während 14 h. Man erhält pMZ-Ala-Phe-Ala-Phe-Leu-Met-NH-DMB mit einem Schmelzpunkt von 250 -2 68 ⁰C und |a]jp = -21,0 (c=0,4, DMP) in einer Ausbeute von 70 56.

Beispiel 38

Das Verfahren gemäß Beispiel 12 wird wiederholt, wobei 2,5 mmol pMZ-Ala-Phe-Ala-Phe-OH und 2,5 mmol HCl-H-IIeU-GIy-OEt während 9 h umgesetzt werden. Man erhält pMZ-Ala-Phe-Ala-Phe-Ileu-GIy-OEt mit dem Schmelzpunkt 248 - 252 ⁰C in einer Ausbeute von 63 1°.

Beispiel 39

Eine Lösung von 0,216 g (10 mmol) HCl-H-PlIe-OCH₅ (Molekulargewicht 215,5) in 40 ml Zitronensäure-Pufferlösung (pH=4,0) wird zu einer Lösung von 0,495 g (10 mmol) Z-Pro-Val-Phe-OH (Molekulargewicht 495) in 10 ml 1N-NaOH gegeben und dann gibt man noch 30 ml Wasser unter Rühren hinzu und dann 0,1 g Pepsin (1 : 10 OOO). Die Mischung wird während 24 h bei 40 ⁰C unter Rühren umgesetzt. Der erhaltene weiße Niederschlag wird mit

509845/1007

einem Glasfilter (G-3) abfiltriert und mit 5%-igem Ammoniakwasser, 5$-iger wässriger Zitronensäurelösung und Wasser nacheinander gewaschen und dann wird das Produkt unter vermindertem Druck bei 50 ⁰C über Pp⁰C getrocknet, wobei man 0,244 g Z^Pro-Val-Phe-Phe-OCH, mit dem Schmelzpunkt 199 - 201 ⁰C und ° ⁼ ~⁵⁵»² (^c=1t ^DMF) ⁱⁿ einer Ausbeute von 37,2 # erhält.

Beispiel 40

Eine Lösung von 0,216 g (10 mmol) HCl'H-Phe-OCH- (Molekulargewicht 215,5) in 40 ml Zitronensäure-Pufferlösung (pH=4,0) wird zu einer.Lösung von 0,421 g BOC-Gly-Val-Phe-OH (Molekulargewicht 421) in 10 ml 1N-NaOH gegeben und dann gibt man noch 30 ml Wasser unter Rühren hinzu. Sodann gibt man zu der Mischung unter Rühren in einem Inkubator bei 40 C 0,1 g Pepsin (1:10000) und die Umsetzung erfolgt während 24 h. 0,414 g BOC-Gly-Val-Phe-Phe-OCEL mit dem Schmelzpunkt 193 196 ⁰C undjccj^⁰ = -14,8 Cc=I₁ DMF) in einer Ausbeute von 71,2 % werden erhalten.

Beispiel 41

.Das Verfahren gemäß Beispiel 39 wird wiederholt, wobei das Molverhältnis Z-Pro-Val-Phe-OH : HCl*H-Phe-0CH- mit 2 : 1 gewählt wird. Man erhält 0,297 g des Produkts gemäß Beispiel in einer Ausbeute von 51 i°.

Beispiel 42

Das Verfahren gemäß Beispiel 40 wird wiederholt, wobei Weinsäure-Pufferlösung CpH=4) anstelle von Zitronensäure-Pufferlösung eingesetzt wird. Man erhält 0,426 g des Produkts gemäß Beispiel 40 in einer Ausbeute von 73,3 Ί°.

Beispiel 43

Das Verfahren gemäß Beispiel 40 wird wiederholt, wobei man

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Dinatriumhydrogenphosphat-Zitronensäure-Pufferlösung (pH=4) anstelle der Zitronensäure-Pufferlösung einsetzt. Man erhält 0,396 g des Produkts gemäß Beispiel 40 in einer Ausbeute von 68 Io.

Beispiel 44

Das Verfahren gemäß Beispiel 39 wird wiederholt, wobei man 0,2 g Pepsin (1:5000) einsetzt. Die Umsetzung wird während 20 h durchgeführt. Man erhält 0,230 g des Produkts gemäß Beispiel 35 in einer Ausbeute von 35 i°.

Beispiele 45 - 65

Das Verfahren gemäß Beispiel 39 wird wiederholt, wobei 10 mmol der C-Komponente und 10 mmol der N-Komponente gemäß Tabelle 4 eingesetzt werden und wobei die entsprechenden Peptide erhalten werden. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 zusammengestellt.

509845/1007

Tabelle

Bsp

C-Komponente

N-Komponente Produkt

45

pMZ-Gly-Val-Phe-OH

HGe-H-PlIe-OCH₃ pMZ-Gly-Val-Phe-Phe-OCH₃

-15.1° (c=l, DMF)

co
oo
-c^-
cn

46

Z-Pro-Val-Phe-OH

HCi · H-Phe-Gly-OC₂H5 Z-Pro-Val-Phe-Phe
GIy-OC₂H₅

67.2

j -31.2° _>

^: (c=0. 5,DMF) OO K) ' cn

-46.8° CD

(c-0.5,DMF)

47

BOC-Pro-Val-Phe-OH

H-Phe-Gly-OC₂H₅ BOC-Pro-Val-Phe-Phe
GIy-OC₂H₅

34.4

208 210

48

BOC-Gly-Val-Phe-OH

HCi · H-PlIe-GIy-OC₂H₅ BOC-Gly-Val-Phe-Phe
GIy-OC₂H₅

45.1

185 187

-14..4⁰ V.

(c=0. 5,DMF) ^

49

pMZ-Gly-Val-Phe-OH

HCi-H-Phe-Gly-OC₂H₅ pMZ-GIy-VaI-Phe-Phe-GIy-OC₂H₅

75.0

200 212

-18.6° (c=0.5,DMF)

50

pMZ-Gly-Leu-Phe-OH

HCi-H-Phe-OCH₃ pMZ-Gly-Leu-Phe
Phe-OCH₃

77.0

181

-26.4° (c=l, DMF)

BO€-Pro-Leu-Phe-OH

HCi-H-PlIe-GIy-OC₂H₅ BOC-Pro-Leu-Phe-Phe- | 62.9
GIy-OC₂H₅

219

-48.2° (c=l, DMF)

Fortsetzung Tabelle 4

CD CO OO

Bsp.	C-Komponente	N-Komponente	Produkt	BOC-GIy-Leu-Phe-Phe- GIy-OC₂H₅	Ausbeu- te(tf)	Fp. (⁰C)	-34.8° (c=0.5,DMF)
52	BOC-Gly-Leu-Phe-OH	HC?-H-Ph^-GIy-OC₂H₅	pMZ-Gly-Leu-Phe-Phe- GIy-OC₂H₅-	54.5	' 160 - 164.	-29.2° (c=0. 5,DMF)
53	pMZ-Gly-Leu-Phe-OH	HC£-H-Phe-Gly-OC₂H₅	BOC-Pro-Met-Phe-Phe- OCH₃	59.0	170 - 172	-39.4° (c=0.5,DMF)
54	BOC-Pro-Met-Phe-OH	HCi-H-Phe-OCH₃	BOC-Gly-Met-Phe-Phe- OCH₃	45.7	145 - 149	-12.6° (C=O₁S₁DMF)
55	BOC-Gly-Met-Phe-OH	HGCH-PhLe-OCH₃	pMZ-GIy-M et-Phe-Phe- OCH₃	44.3	153 - 154	-17.2° (c=l,DMF)
56	PMZ-Gly-Met-Phe-OH	HCi-H-Phe-OCH₃	BOC-Pro-Met-Phe-Phe- GIy-OC₂H₅	69.6	175 - 179	-33.2° (c=0.5,DMF)
57	BOC-Pro-Met-Phe-OH	HCi-H-PlIe-GIy-OC₂H₅	pMZ -Gly-Met-Phe-Phe- GIy-OC₂H₅	51.2 ■	208 - 210	-27.0° (c=l, DMF)
58	pMZ-Gly-Met-Phe-OH	HCi.H-Phe-Gly-OC₂H₅	61.9	175 - 177

Fortsetzung Tabelle 4

Bs	p. C-Komponente	N-Komponente	Produkt \AusbeuX Pp. V W V³C)	60.8 ! 211 - j 214.5	-25.1° (c=l, DMF)	-25.0° (c=l, DMF)
59	BOC-AIa-M et-Phe-OH	HC£-H-Phe-Gly-OC₂H5	BOC-Ala-Met-Phe-Phe- GIy-OC₂H₅	71.8	216 - -60.0° 220 (C=I, DMF) i
60	BOC-Asn-Met-Phe-OH	HO«. H-Phe-Gly-OC₂H₅	BOC-Asn-Met-Phe-Phe- GIy-OC₂H₅	72.0	220 - 222
51	BOC-Gln-Met-Phe-OH	HCi-H-PlIe-GIy-OC₂H₅	BOC-Gln-Met-Phe-Phe- GIy-OC₂H₅

Tabelle 4¹

•C-CTI

Bs	D. C-Komponente	N-Komponente	Produkt	Ausb.	Fp. (⁰C)	Π²⁴
62	BOC-Ala-Leu-Tyr-OH	H-LeU-VaI-OCH₃	BOC-Ala-Leu-Tyr- Leu- VaI-OCH₃	37.1	199 - 201	-40.6° (C=I₁DMF)
63	BOC-Ala-Leu-Tyr-OH	H-Leu-Val- CyS-GIy-NHNH₂ SPMBzI	BOC-Ala-Leu-Tyr-Leu- VaI-CyS-GIy-NHNH₂ SPMBzI	76. 5	>250 (dec.)	-50.1° (c = l, DMF)
64	BOC-Arg-Gly-Phe-OH NO₂	H-Phe-Tyr-NHNH₂ OBzI	BOC-Arg-Gly-Phe-Phe- NO₂ Tyr-NHNH₂ OBzI	87.3	205 - 207	-19.6° (c=l, DMF)
65	BOC-Arg-Gly-Phe-OH NO₂	H-Phe-Tyr-Thr-NHNH₂ I OBzI	BOC-Arg-Gly-Phe-Phe- NO₂ Tyr-Thr-NHNH₂ OBzI	85.2	219 - 220	-16.0° (c=l, DMF)

Bemerkung: -SPMBzI = -S-Para-methoxybenzyl

- 28 Beispiel 66

Eine lösung von 0,47 g (10 mmol) HCl-H-Ileu-Gly-Leu-Met-NHp (Molekulargewicht 468,1) in 40 ml Zitronensäure-Pufferlösung

wird zu einer Lösung von 0,38 g (10 mmol) pMZ-Ala-Glu-OH

OH

(Molekulargewicht 382,4) in 10 ml 1N-NaOH gegeben und dann gi"bt man noch 30 ml Wasser unter Rühren hinzu. Dann gibt man 0,1 g Pepsin (1 : 10000) unter Rühren "bei 40 ⁰C während 24 h zu der Mischung. Der erhaltene weiße Niederschlag wird mit einem Glasfilter (G-3) abfiltriert und mit 5/&-igem Ammoniakwasser und dann mit 5$-iger wässriger Zitronensäurelösung und dann mit Wasser gewaschen und dann wird das Produkt über PpOp. unter vermindertem Druck bei 50 ⁰C getrocknet, wobei man 0,48 g pMZ-Ala-Glu-Ileu-Gly-Leu-Met-NH_o

OH

mit dem Schmelzpunkt 214 - 217 ⁰C und [a] ^⁰ = -23,8° (c=0,5, DMP) in einer Ausbeute von 60,3 1° erhält. Die Elementaranalyse des Produkts entspricht innerhalb der Toleranz dem theoretischen Wert.

Beispiel 67

Das Verfahren gemäß Beispiel 66 wird wiederholt, wobei das Molverhältnis pMZ-Ala-Glu-OH : HCl-H-Ileu-Gly-Leu-Met-NH₉

OH

mit 2:1 gewählt wird. Man erhält 0,68 g des Produkts gemäß Beispiel 66, in einer Ausbeute von 85,3 ί°.

Beispiel 68

Das Verfahren gemäß Beispiel 67 wird wiederholt, wobei Dinatriumhydrogenphosphat-Zitronensäure-Pufferlösung (pH=4) anstelle der Zitronensäure-Pufferlösung eingesetzt wird. Man erhält das Produkt gemäß Beispiel 67 in einer Ausbeute von 84 io.

509845/10 07

- 29 Beispiele 69 - 75

Das Verfahren gemäß Beispiel 66 wird wiederholt, wobei 10 mmol der G-Komponente und 10 mmol der N-Komponente gemäß Tabelle 5 eingesetzt werden. Man erhält die entsprechenden Peptide. Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 zusammengestellt.

509845/1007

Tabelle 5

cn CD co CX)

cn

CD CD

Bsp.	C-Komponente	N-Komponente	Produkt Ai O	0.Sb. 0 ,	Pp. ⁰C)	-15.4° (C=I₁DMF)
69	pMZ-Glu-Phe-OH OCH₃	HCi-H-Phe-OCH₃	pMZ-Glu-Phe-Phe-OCH₃ OCH3	59.9	183 - 187	-41.8° (C = I₁DMSO)
70	pMZ-Ala-Asn-OH	HCi-H-Ileu-Gly-Leii- Met-NH₂	pMZ-Ala-Asn-Ileu- Gly-Leu-Met-NH2	31.0	252 - 255	-32.0° (C-0.5.DMF)
71	pMZ-Ala-Trp-OH	HC£-H-Ph^-VaI-OCH₃	pMZ-Ala-Trp-Phe -VaI- OCH₃	60.0	210 - 216	-
72	pMZ-Ala-Trp-OH	HCi-H-Met-Gly-OCH₃	pMZ-Ala-Trp-Met-Gly- OCH₃	21.7	163 - 167	-1.4° (c = 0. 5,DMF)
73	pMZ-Ala-Phe-OH	HCi-H-Trp-OCH₃	PMZ-AIa-PhIe-TrP-OCH₃	65.7	186 - 187	-30.1° (C = I₁-DMF)
74	Z-Glu-Phe-OH	HOe-H-Ileu-Gly-Leu- Met-NH₂	Z-Glu-Phe-Ileu-Gly- Leu-Met-NH₂	84	245 - 248	-19.7° (c=l, DMF)
75	Z-Glu-Phe-OH	HCi-H-Phe-OCH₃	Z-Glu-Phe-Phe-OCH3	63	181 - 184

OD ro cn

Claims

- 31 PATENTANSPRÜCHE

wobei A die Formel A.-Ap haben kann, wobei A₁ einen hydrophilen Aminosäurerest und A_? VaI., Met., Leu. oder GIn. bedeutet;

wobei B Phe., Tyr., Leu., Met., GIu., Asp., Gin., Asn. oder Trp. bedeutet; wobei C Phe., Leu., Heu., Tyr., Cys-SBzl., Ser-OBzl., Trp. oder Met. bedeutet; wobei X eine α-Aminosäure-Schutzgruppe;

einen am N-Ende eine Schutzgruppe tragenden Aminosäurerest oder einen am N-Ende eine Schutzgruppe tragenden Peptidrest bedeutet;

und wobei Y eine Carboxyl-Schutzgruppe oder einen am C—Ende eine Schutzgruppe tragenden Aminosäurerest oder einen am C-Ende eine Schutzgruppe tragenden Peptidrest bedeutet, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Peptid der Formel

X-A-B-OH ■ mit einer Aminosäure oder einem Peptid der Formel

H-C-Y in Gegenwart des Enzyms Pepsin umsetzt.

509845/1007
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Peptid der Formel

X-A-B-OH

wobei A Ala., GIn., Asn., td-BOC-Lys., Leu. oder G-Iy. "bedeutet und wobei

B Phe., Tyr., Leu. oder Met. "bedeutet und wobei X die in Anspruch 1 angegebene Bedeutung hat.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Peptid der Formel

X-A-B-OH

einsetzt, wobei A GIu., GIu. oder Pro. bedeutet und wobei

OMe.
B und X die in Anspruch 1 angegebene Bedeutung haben.
4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Peptid der Formel

X-A₁ - A₂ - B -OH

einsetzt, wobei A. einen hydrophilen Aminosäurerest und A« VaI., Met., Leu. oder GIn. bedeutet und wobei B und X die in Anspruch 1 angegebene Bedeutung haben.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Aminosäure oder ein Peptid

der Formel

H-G-Y

einsetzt, wobei C Phe., Leu., Heu., Tyr., Cys-SBzl. oder Ser-OBzl. bedeutet und wobei

Y die in Anspruch 1 angegebene Bedeutung hat.

50984 5/1007
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß man die Umsetzung bei 20 - 50 ⁰C in einer Pufferlösung von pH 2 - 6 durchfuhrt.

509845/1007