DE2632396A1

DE2632396A1 - Bestatinderivate und verfahren zu ihrer herstellung

Info

Publication number: DE2632396A1
Application number: DE19762632396
Authority: DE
Inventors: Takaaki Aoyagi; Rinzo Nishizawa; Tetsushi Saino; Tomohisa Takita; Hamao Umezawa
Original assignee: Microbial Chemistry Research Foundation
Current assignee: Microbial Chemistry Research Foundation
Priority date: 1975-07-22
Filing date: 1976-07-19
Publication date: 1977-02-03
Also published as: CS201034B2; CA1104156A; JPS5823654A; JPS52136118A; FR2318863A1; AU1591276A; JPS5758338B2; DE2632396C2; HU183048B; SE8306145L; SE452318B; FR2318863B1; DK331276A; SE8306145D0; DE2660626C2; DK149110C; NL7608064A; AU506003B2; SE431642B; JPS6050780B2

Description

Anmelder: Zaidan Hojin Biseibutsu Kngaky Kenkyu Kai

3-14-23 Kamiosaki, Shinagawa-ku, Tokyo / Japan

Bestatinderivate und Verfahren zu ihrer Herstellung

Die Erfindung betrifft Bestatin und verwandte Verbindungen, die Aminopeptidase B, Leucin-aminopeptidase und Bleomycinhydrolase inhibieren, die Antitumorwirkung von Bleomycin verstärken und Antifertilitätswirkungen besitzen·

Gegenstand der Erfindung sind die im Anspruch 1 definierten Verbindungen der Formel I₁ Soweit nichts anderes angegeben ist, bezeichnet der Ausdruck "niedere" Gruppen mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, und der Ausdruck "Alkyl", auch

ear
dann,wenn/in Zusammenhang mit anderen Gruppierungen gebraucht wird, z. B. Alkoxy, bezeichnet Alkylgruppen oder -Reste mit 1 bis 6, vorzugsweise 1 bis 4 Kohlenstoffatomen. Arylgruppen sind bevorzugt 5-und/oder 6-gliedrige monocyclische oder 9- oder 10-gliedrige bicyclische Gruppen, die vorzugsweise nur Kohlenstoffringatome enthalten. Als Substituenten sind bevorzugt diejenigen Gruppen, die Substiuenten in den Verbindungen sind, die in der Beschreibung, den Beispielen und/oder Ansprüchen konkret genannt sind.

Bestatin ist (2S,3R)-3-Amino-2-hydroxy-4-phenylbutanoyl-(S)-leucin; diese Verbindung wird durch die Formel(I) dargestellt, worin R-j eine Benzylgruppe und R₂ eine Isobutylgruppe bedeuten. Diese Klasse von Verbindungen einschließlich

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" ² "* 2R32396

Bestatin kann aus einem gezüchteten Medium aus einem Bestatin bildenden Pilz, der zu Actinomyces gehört, hergestellt werden. Es sind neue Verbindungen, und es wurde gefunden, daß sie die oben erwähnten physiologischen Eigenschaften besitzen.

Gegenstand der Erfindung ist ebenfalls ein Verfahren zur Herstellung der Verbindungen der Formel (I) auf folgende. Weise.

Ein Nitrilderivat, das durch die Formel (II) dargestellt wird,

R.-CH-CH-CN (II)

¹ ι ι

NH₂ OH

worin R₁ die zuvor gegebene Bedeutung besitzt, oder ein Nitrilderivat, dessen Aminogruppe geschützt ist, wird mit einer Säure zur Herstellung einer Aminosäure der Formel (III)

R.-CH-CH-COOH (III)

' t ι

NH₂ OH

worin R^ die zuvor gegebene Bedeutung besitzt, hydrolysiert. Diese Aminosäure und eine Aminosäure, die durch die Formel (IV) dargestellt wird

NH₉-CH-COOH (IV)

R₂

worin R₂ die zuvor gegebene Bedeutung besitzt, werden, nachdem gegebenenfalls die funktioneilen Gruppen, die nicht an der Reaktion teilnehmen, geschützt wurden, nach einem üblichen Peptid-Kondensationsverfahren kondensiert. Nach der Entfernung der Schutzgruppen werden Verbindungen, die durch die Formel (I) dargestellt werden, erhalten.

Typische Beispiele von Nitrilderivaten, die durch die Formel (II) dargestellt werden, sind 3-Amino-3-hydroxypropionitril, 3-Amino-2-hydroxy-methylhexanonitril_f 3-Amino-

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2-hydroxy-3-phenylpropionitril, 3-Amino-2-hydroxy-4-p-chlorphenylbutyronitril, 3-Amino-2-hydroxy-4-phenylbutyronitril, 3-Amino-2-hydroxy-4-o-chlorphenyΓbutyronitril, 3-Amino-2-hydroxy-4-p-methylphenylbutyronitril und 3-Amino-2-hydroxy-4-p-benzyloxyphenylbutyronitril. Zum Schutz der Aminogruppen kann man irgendwelche Aminoschutzgruppen, wie sie üblicherweise in der Peptidchemie eingesetzt werden, verwenden. Bevorzugte Beispiele von Aminoschutzgruppen des Acyltyps sind eine Formylgruppe, eine Acetylgruppe, eine Trifluoracetylgruppe, substituierte oder nichtsubstituierte Benzoylgruppenj Beispiele von Aminoschutzgruppen des Urethantyps sind substituierte oder nichtsubstituierte Benzyloxycarbonyle, eine AIkoxycarbonylgruppe mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen und eine Cycloalkanoxycarbonylgruppe; bevorzugte Beispiele anderer Aminoschutzgruppen sind substituierte oder nichtsubstituierte Arylsulfonylgruppen, eine Phthalylgruppe, eine o-Nitrophenylsulfenylgruppe oder eine Tritylgruppe. Bei der vorliegenden Erfindung können für die Hydrolyse irgendwelche Arten von Säuren verwendet werden, die üblicherweise für die Hydrolyse von Nitrilen verwendet werden. Beispiele anorganischer Säuren sind Chlorwasserstoffsäure, Bromwasserstoffsäure und Schwefelsäure; Beispiele von organischen Säuren sind Alkylsulfonsäuren wie Methansulfonsäure, Äthansulfonsäure, Acrylsulfonsäuren wie Benzolsulfonsäure und Toluolsulfonsäure. Diese Säuren können in irgendeiner beliebigen Konzentration verwendet werden, wie sie für die Hydrolyse gewöhnlicher Nitrile üblich sind. Eine Konzentration über 1n ist jedoch bevorzugt.

Zu den Verbindungen, deren Aminogruppe geschützt ist und die sich in wäßriger Säurelösung nicht leicht lösen, kann man ein organisches Lösungsmittel, das mit Wasser mischbar ist, wie Tetrahydrofuran, Dioxan, niedrige Alkohole, Aceton-Dimethylformamid, Dimethylacetamid oder Dimethylsulfoxid zur Verbesserung der Löslichkeit der Verbindungen in der wäßrigen Lösung zugeben.

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Wird eine Schutzgruppe verwendet und wird die Schutzgruppe während der Hydrolyse unter Bildung elektrophiler Species entfernt, so kann ein Kationen-Einfangmittel wie Anisol zugegeben werden. Die Hydrolysetemperatur kann bei irgendeinem Wert innerhalb des Bereichs von Zimmertemperatur bis zu der Temperatur liegen, die erforderlich ist, das Reaktionsgemisch am Rückfluß zu erwärmen. Zur Isolierung der gewünschten Aminosäure aus dem Reaktionsgemisch kann man ein übliches Verfahren zur Isolierung von Aminosäuren verwenden. Wird beispielsweise die Hydrolyse mit einer flüchtigen Säure durchgeführt, so kann überschüssige Säure durch Konzentration des Reaktionsgemisches bei vermindertem Druck entfernt werden. Der Rückstand kann in Wasser gelöst und mit wäßriger Alkalilösung neutralisiert werden, bis der isoelektrische Punkt erreicht ist. Gegebenenfalls kann man Aceton, Methanol oder Äthanol zu dem Reaktionsgemisch zur Kristallisation der gewünschten Verbindung, die durch die Formel (III) dargestellt wird, zugeben. Diese Verbindung wird dann abfiltriert. Wird andererseits eine nichtflüchtige Säure verwendet, so kann das Reaktionsgemisch mit Wasser auf einen Säuregehalt unter 1n verdünnt werden und durch ein stark saures Ionenaustauschharz geleitet werden, so daß die gewünschte Aminosäure an dem Ionenaustauschharz adsorbiert wird. Die adsorbierte Aminosäure wird von dem Ionenaustauschharz mit einem flüchtigen Alkali wie ammoniakalisehern Wasser eluiert und bei vermindertem Druck kondensiert. Gegebenenfalls werden Aceton, Methanol oder Äthanol zur Kristallisation der gewünschten Verbindung, die durch die Formel (III) dargestellt ist, zugegeben. Diese Verbindung wird dann abfiltriert.

Wird bei der zuvor beschriebenen Reaktion ein (R)-Nitrilderivat als Ausgangsmaterial verwendet, so wird eine (2RS,3R)-Aminosäure erhalten; wird ein (S)-Nitri!derivat verwendet, so wird eine (2RS,3S)-Aminosäure erhalten; wird ein (RS)-Nitrilderivat verwendet, so wird eine (2RS,3RS)-Aminosäure erhalten.

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Die erhaltenen Verbindungen, die durch die Formel (III) dargestellt werden, können als Rohmaterial bei dem im folgenden beschriebenen Verfahren verwendet werden. Beispielsweise ist 3-Amino-2-hydroxy-4-phenylbutansäure (die im folgenden als AHPA abgekürzt wird) eine Vorstufe von Bestatin in der (2S,3R)-Form. Zur Herstellung dieser Verbindung ist es daher erforderlich, (2RS,3R)-AHPA zu (2S,3R)- und (2R,3R)-AHPA aufzuspalten.

(2RS,3R)-AHPA in Diastereoisomerenform kann optisch.in Äthylacetat gespalten werden» Diese wird erhalten, indem man zuerst (2RS,3R)-AHPA auf übliche Weise unter Herstellung von Benzyloxycarbonyl-(2RS,3R)-AHPA der Benzyloxycarbonylierung unterwirft und die letztere Verbindung dann mit Brucin umsetzt (im folgenden wird die Benzyloxycarbonylgruppe als Z abgekürzt). Z-(2RS,3R)-AHPA und eine äquivalente oder eine etwas größere Menge an Brucin werden in Äthylacetat unter Erwärmen gelöst und dann gegebenenfalls filtriert. Wenn das Filtrat abkühlt oder abgekühlt wird, werden Kristalle abgeschieden. Diese Kristalle werden abfiltriert und gegebenenfalls ein oder mehrere Male aus Äthylacetat für die Herstellung des optisch reinen Brucinsalzes von Z-(2S,3R)-AHPA umkristallisiert. Wird dieses Brucinsalz auf übliche Weise behandelt, so erhält man optisch reine Z-(2S,3R)-AHPA. Sonst kann optisch reine Z-(2R,3R)-AHPA folgendermaßen hergestellt werden. Eine Lösung aus Äthylacetat, die ein Brucin säure von Z-(2R,3R)-AHPA und eine geringe Menge Z-(2S,3R )-AHPA enthält, wird mit verdünnter Chlorwasserstoffsäure zur Entfernung von Brucin geschüttelt. Die Äthylacetatschicht wird mit einem Entwässerungsmittel wie wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und bei vermindertem Druck konzentriert. Der Rückstand wird dann in einer geringen Menge Äthylacetat gelöst. Nach der Zugabe von Petroläther erhält man Kristalle, die zur Herstellung von optisch reiner Z-(2R,3R)-AHPA abfiltriert werden können.

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Die (2R,3R)-Form der Z-AHPA besitzt geringere Löslichkeit in einem organischen Lösungsmittel als die (2S,3R)-Form. Z-(2RS,3R)-AHPA wird zuerst in einem Lösungsmittel, in dem es löslich ist, bei Zimmertemperatur oder unter Erwärmen gelöst. Dann wird ein zweites Lösungsmittel, in dem es unlöslich ist, zur Ausfällung der Kristalle zugegeben. Diese werden abfiltriert. Gegebenenfalls wird das zuvor beschriebene Verfahren wiederholt, bis optisch reine Z-(2R,3R)-AHPA erhalten wird.

Als erstes Lösungsmittel, in dem die Verbindungen löslich sind, kann man verwenden: niedrige Alkohole wie Methanol, Äthanol oder Propanol; Äther wie Diäthylather, Diisopropyläther, Tetrahydrofuran oder Dioxanj Ester wie Methylacetat oder Äthylacetat; Ketone wie' Aceton oder Methyläthylketon; halogenierte Kohlenwasserstoffe wie Methylenchlorid oder Chloroform; Amide wie Dimethylformamid oder Dimethylacetamid, und Nitrile wie Acetonitril usw. Als zweites Lösungsmittel, in dem die Verbindungen unlöslich sind, kann man verwenden: Kohlenwasserstoffe aus Erdöl wie Petroläther, Petrolbenzol oder Ligroin; aromatische Kohlenwasserstoffe wie Benzin oder Toluol; Alkane wie Pentan oder Hexan; und Cycloalkane wie Cyclopentan oder Cyclohexan. Verwendet man dieses Diastereoisomer-Verfahren, bei dem Brucin verwendet wird, so kann die optisch unreine Z-(2S,3R)-AHPA, das in dem Filtrat vorhanden ist, zu optisch reiner (2S,3R)-AHPA gereinigt werden.

Z-AHPA, die bei dem oben beschriebenen Aufspaltungsverfahren verwendet wird, kann nach dem Schotten-Baumann-Verfahren in.Anwesenheit eines Alkalis durch Umsetzung von (2RS,3R)-AHPA und Benzyloxycarbonylchlorid oder sonstwie in Anwesenheit einer organischen tertiären Base^wie Triäthylamin und N-Methylmorpholin durch Umsetzung mit einem BenzyloxycarbonyIierungsreagens wie Benzyloxycarbonyl-p-nitrophenylester, Benzyloxycarbonylazid, Benzyloxycarbonyl-N-hydroxysuccinimidester und Benzyloxycarbonyl-^o-dimethyl^-mercapto-

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pyrimidin in einem Lösungsmittel, das durch Vermischen von Dioxan, Tetrahydrofuran, Acetonitril oder Dimethylformamid mit Wasser hergestellt wird, erhalten werden.

Obgleich das zuvor beschriebene optische Aufspaltungsverfahren im Hinblick auf AHPA beschrieben wurde, kann gegebenenfalls mit den anderen Aminosäuren eine ähnliche optische Aufspaltung durchgeführt werden.

Zur Herstellung von Bestatin und seinen verwandten Verbindungen, die durch die Formel (I) dargestellt werden, wird eine Aminosäure, wie sie durch die Formel (III) dargestellt wird, mit einer Verbindung kondensiert, die durch die Formel (IV) dargestellt wird. Dazu verwendet man ein übliches Peptidkondensationsverfahren, und anschließend werden die Schutzgruppen, die gegebenenfalls zum Schutz von funktionellen Gruppen, die nicht an der Reaktion teilnehmen, verwendet wurden, entfernt.

Typische Beispiele von Aminosäuren sind Glycin, Alanin, 2-Amino-butansäure, Valin, Norvalin, Leucin, Norleucin, Isoleucin, tert.-Leucin, 2-Aminoheptansäure, 2-Amino-5-methylhexansäure, 2-Aminooctansäure, 2-Amino-6-methylheptansäure, Serin, Threonin, Allothreonin, Cystein, Homocystein, Asparagin, Glutamin, O-Methylserin, O-Äthylserin, O-Propylserin, Methionin, Äthionin, Asparaginsäure, Glutaminsäure, Phenylglycin, p-Methoxyphenylglycin, Phenylalanin, Tyrosin, p-Methoxypheny!alanin und p-Nitrophenylalanin.

Das Verfahren zur Kondensation einer Aminosäure, die durch die Formel (III) dargestellt wird, und einer Aminosäure, die durch die Formel (IV) dargestellt wird kann ein Carbodiimid-Verfahren sein, bei dem Dicyclohexylcarbodiimid oder 1-Äthyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimid verwendet wird; man kann weiterhin das Azidverfahren verwenden, bei dem Salpetrigsaure oder Alkylnitrit verwendet wird; man kann auch ein gemischtes Anhydridverfahren, bei dem Äthylchlor-

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formiat oder Isobutylchlorformiat eingesetzt wird, -·.-- ■rsn-; ein aktives Esterverfahren, bei dem Cyanomethylester, Vinylester, substituierte und nichtsubstituierte Phenylester, Thiophenylester oder N-Hydroxysucciniraidester verwendet werden; ein 0-Acylhydroxylaminderivat-Verfahren, bei dem O-Acylacetoxim oder O-Acylcyclohexanonoxim verwendet wird, oder ein N-Acylderivat-Verfahren, bei dem Carbonyldiimidazol verwendet wird, verwenden.

Organische Lösungsmittel, die bei der obigen Kondensationsreaktion verwendet werden, können Äther wie Diäthyläther, Tetrahydrofuran oder Dioxan; Ester wie Äthylacetat oder Methylacetat; Ketone wie Aceton oder Methyläthy!keton; halogenierte Kohlenwasserstoffe wie Methylenchlorid oder Chloroform; Amide wie Dimethylformamid oder Dimethylacetamid, Nitrile wie Acetonitril sein.

Wenn eine Aminosäure, die durch die Formel (III) dargestellt wird und deren Aminogruppe geschützt ist, und eine Aminosäure, die durch die Formel (IV) dargestellt ist und deren Carboxylgruppe nicht geschützt ist, nach dem aktiven Esterverfahren kondensiert werden, kann eine Lösungsmittelmischung aus Wasser und einem mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittel in Anwesenheit einer anorganischen Base wie Natriumbicarbonat oder Magnesiumoxid, einer organischen tertiären Base wie Triäthylamin oder N-Methylmorpholin verwendet werden.

Schutzgruppen in den entstehenden Verbindungen können nach üblichen Verfahren der Peptidchemie entfernt werden wie katalytische Hydrierung mit Palladium, Verseifung mit einem Alkali,Säurespaltung mit Bromwasserstoff in Essigsäure, mit Trifluoressigsäure, mit Chlorwasserstoff in Dioxan, Tetrahydrofuran oder Äthylacetat, mit flüssigem Fluorwasserstoff, Hydrazinolyse mit Hydrazin oder Behandlung mit Natrium und flüssigem Ammoniak. Man erhält so die gewünschte Verbindung der Formel (I).

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Die Nitrilderivate, die durch die Formel (II) dargestellt werden und die bei der vorliegenden Erfindung als Ausgangsmaterial verwendet werden, können durch Reduktion einer α-Aminosäure erhalten werden, deren Aminogruppe geschützt ist und deren Carboxylgruppe in das Amid überführt wurde,durch Umsetzung mit einem sekundären Amin bei niedrigen Temperaturen unter O⁰C mit einem Metallhydrid in Ä'thern wie Diäthyläther oder Tetrahydrofuran zur Herstellung eines Aminoaldehyds, dessen Aminogruppe geschützt ist. Der entstehende Amino-aldehyd wird dann in das Addukt mit Natriumbisulfit überführt und dann mit einem Alkalimetallcyanid reagieren gelassen oder er kann direkt mit Cyanwasserstoff reagieren, wobei man Cyanohydrin oder 3-Amino-2-hydroxynitril erhält.

Bevorzugte Beispiele für das sekundäre Amin sind Ν,Ν-Dimethylamin, Azir.idin, N-Methylanilin, Carbazol, 3,5-Dimethylpyrazol und Imidazol. Bevorzugte Beispiele für das Metallhydrid sind Lithium-aluminiumhydrid, Lithium-di- und -tri-alkoxyaluminiumhydrid und Natrium-bis-(2-methoxyäthoxy)-aluminiumhydrid. Beispiele von Schutzgruppen für die Aminogruppe sind die Schutzgruppen, die üblicherweise in der Peptid·· chemie verwendet werden. Bevorzugt werden Schutzgruppen des Urethantyps verwendet,und am meisten bevorzugt sind Benzyloxycarbonylgrupp en.

Nach einem zweiten Verfahren wird ein niedrig-Alkylester einer α-Aminosäure, deren Aminogruppe durch eine Aminoschutzgruppe geschützt ist, ähnlich wie sie zuvor erwähnt wurden, bei einer Temperatur unter -40⁰C in aromatischen Kohlenwasserstoffen wie Benzol oder Toluol und Äthern wie Diäthyläther oder Tetrahydrofuran mit Metallhydriden wie Natrium-aluminiumhydrid, Diisobutyl-aluminiumhydrid oder Natrium-bis-(2-methoxyäthoxy)-aluminiumhydrid reduziert. Dabei wird ein Aminoaldehyd mit geschützter Aminogruppe erhalten. Wird ein solcher Aminoaldehyd wie auf obige Weise beschrieben behandelt, so wird 3-Amino-2-hydroxynitril erhalten.

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Die physiologischen Aktivitäten von Bestatin und seinen verwandten Verbindungen, die durch die Formel (I) dargestellt werden und die erfindungsgemäß hergestellt werden, sind die folgenden:

(A) Inhibitoraktivität gegenüber Aminopeptidase B Testverfahren:

Es wird das von V.K.Hopusu, K.K. Makinen und G.G.Glenner in Archives of Biochemistry and Biophysics 114, 557(1966), beschriebene Verfahren in modifizierter Form verwendet. Zu einem Gemisch aus 0,3 ml (1 mMol) Argin-ß-naphthylamid und 1,0 ml (0,1 Mol) Tris-hydrochloridpuffer (pH 7,0) gibt man 0,7 ml destilliertes Wasser mit oder ohne Testmaterial und erwärmt 3 Minuten auf 37⁰C. Die Reaktion wird durch Zugabe von 0,2 ml Aminopeptidase B-LÖsung in Gang gebracht, die nach dem Sephadex 100-Chromatographieverfahren, wie von Hopusu et al beschrieben, hergestellt wurde. Nach 30 Minuten bei 37⁰C werden 0,6 ml eines 1,0 M Acetatpuffers (pH 4,2), der das Diazoniumsalz von o-Aminoazotoluol (1,0 mg/ml) und Tween 20 (1,O#) enthält, zugegeben. Nach 15 Minuten bei Zimmertemperatur wird die Absorption (a) bei 530 nm mit einem Spektrophotometer bestimmt. Zum Vergleich wird die Absorption (b) nach der Umsetzung in Abwesenheit einer Probe gemessen. Der Prozentgehalt Inhibierung wird folgendermaßen berechnet: (b-a)/b χ 100.

Der Prozentgehalt der Inhibierung bei verschiedenen Konzentrationen wird bestimmt,und aus den gemessenen Prozentgehalten der Inhibierung wird die 50$ Inhibierung (ID₅₀) berechnet. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle I aufgeführt.

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	1 263239J5	Verbindung	ID₅₀ (/ug/ml)	= Glutamin; GIu = Glutaminsäure; VaI	Glycin; Ser = Serin;
		(2S,3R)-AHPA-(S)-Leu	0,10	valin; Met = Methionin; He = Isoleucin;	= Valin; Nva = Nor-
- 11 -	Inhibitoraktivität von Bestatin und seiner verwandten Ver	(2S,3S)-AHPA-(S)-Leu	1,25	Ao c	NIe = Norleucin;
Tabelle I	bindungen gegenüber Aminopeptidase B	(2S,3R)-AHPA-(R)-Leu	0,56	= 2-Aminoctansäurey Phe = Phenylalanin; Me-Ise = ß-Me-
Nr.	(2S,3S)-AHPA-(R)-Leu	0,04	thylisoserin(3-Amino-2-hydroxypropionsäure); iso-Bu-Ise =
1	(2S,3R)-AHPA-GIy	21,5	ß-Isobutylisoserin-(3-amino-2-hydroxy-5-methylhexansäure);
2	(2S,3R)-AHPA-(S)-VaI	0,55
3	(23,3R)-AHPA-(S)-IIe	0,05
4	(2S,3R)-AHPA-(S)-Met	0,22
5	(2S,3R)-AHPA-(S)-GIn	1,2
6	(2S,3R)-AHPA-(S)-Nva	0,17
7	(2S,3R)-AHPA-(S)-Nie	0,13
8	(2S,3R)-AHPA-(S)-Phe	4,2
9	(2S,3R)-AHPA-(S)-Ser	0,72
10	(2S,3R)-AHPA-(S)-GIu	25
11	(2S,3R)-AHPA-(RS)-Aoc	3,1
12	(2RS,3R)-Me-Ise-(S)-Leu	16
13	(2RS,3R)-iso-Bu-Ise-(S)-Leu	12
14	(2RS,3R)-Ph-Ise-(S)-Leu	56
15	(2RS,3RS)-AHPA(p-Cl)-(S)-Leu	0,07
16	(2RS,3RS)-AHPA(o-Cl)-(S)-Leu	0,48
17	(2RS,3RS)-AHPA(p-Me)-(S)-Leu	0,01
18	(2S,3R)-AHPA(p-N0₂)-(S)-Leu	0,01
19	(2S,3R)-AHPA(P-NH₂)-(S)-Leu	0,10
20	(2S,3R)-AHPA(6H)- (S)-Leu	1,05
21		In der Tabelle haben die gewählten Abkürzungen die
22	folgende Bedeutung: Leu = Leucin; GIy =
23	GIn
24

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Ph-Ise = ß-Phenylisoserin-(3-amino-2-hydroxy-3-phenylpropionsäure); AHPA(p-Cl) = 3-Amino-2-hydroxy-4-p-chlorphenylbutansäure; AHPA(o-Cl) = 3-Amino-2-hydroxy-4-o-chlorphenylbutansäure; AHPA(p-Me) = 3-Amino-2-hydroxy-4-p-meth3%)henylbutansäure; AHPA(p-N0₂) = 3-Amino-2-hydroxy-4-p-nitrophenylbutansäure; AHPA(p-NH₂) = 3-Amino-2-hydroxy-4-p-aminophenylbutansäure; ΑΗΡΑ(βΗ) = 3-Amino-2-hydroxy-4-cyclohexylbutansäure.

(B) Verteilung in den Organen von Bleomycin in Anwesenheit von Bestatin

100 mg/kg Bleomycin Bp werden subkutan je drei männlichen Mäusen des ICR Stamms (4 Wochen alt) verabreicht, und 100 mg/kg Bleomycin Bp und 100 mg/kg Bestatin werden subkutan gleichzeitig an drei ähnliche Mäuse verabreicht. Diese sechs Mäuse werden 1 Stunde nach der Verabreichung getötet und die Menge an Bleomycin B₂, die im Serum-und in den Organen verbleibt, wird nach dem Dünnschichtscheibenverfahren bestimmt, wobei man Bacillus subtilis PCI219 als Testmikroorganismus verwendet. Die Ergebnisse sind in Tabelle II aufgeführt, wobei die Zahlen die durchschnittlichen ¥erte angeben.

Tabelle II

Wirkung der simultanten Verabreichung von Bestatin und Bleomycin Bp oder die Organverteilung von Bleomycin bei Mäusen

Serum Lunge Haut Leber Niere Milz Magen Gehirn

100mg/kg 110 11,2 4,5 0 68,0 4,0 1,6 0

100mg/kg+

100 mg/kg 140 21,2 42,0 0 84,0 5,8 2,5 2,4

Bemerkungen: BLM = Bleomycin B₂,* BST = Bestatin

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(C) Konzeptionsverhütende Eigenschaften Antifertilität von Bestatin

Unmittelbar nach der subkutanen Verabreichung von Bestatin (10 mg/kg) an weibliche ICR JCL Mäuse im Pubertätsalter werden diese Mäuse mit männlichen Mäusen eines ähnlichen Stamms zusammengebrachte Die weiblichen Mäuse, die begattet wurden, werden zwei Tage nach der Bildung von Vaginaltampons bzw. Vaginalfüllungen getötet und die Ova werden aus den Uteruseileitern gesammelt für die Prüfung, ob eine Befruchtung stattgefunden hat oder nicht. Die befruchteten Ova befinden sich im 8- bis 16-zelligen Stadium.

Mäusegruppe, der Bestatin verabreicht wurde

Anzahl von corpus luteum Anzahl d.isolierten Ova befruchtete Ova nichtbefruchtete Ova

Weiblich	Weiblich	Insgesamt	,6%)	= 2
Nr. 1	Nr.2	N	,4%)
10	19			29
10	19			10(34,5%
4(40°/o)	6 (31	7%)	19(65,5%
6(60%)	13 (68	3%)	" 26
13	13	20
9	11	14(70%)
6(66,7%)	8(72,	6(30%)
3(33,3%)	3(27,

Vergleich

Die Versuche zeigen, daß die Fertilität der Ova, die von Mäusen stammen, die 4 bis 16 Stunden nach der Verabreichung von Bestatin kopuliert hatten, 34,5% beträgt, wohingegen die Fertilität von Ova, die aus der Vergleichsmäusegruppe stammen, 70% beträgt. Aus diesen Ergebnissen ist offensichtlich, daß Bestatin Antifertilitätseigenschaften besitzt.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung. Es sei jedoch ausgeführt, daß auch irgendwelche anderen geeigneten Verfahren zur Einführung funktioneller Schutzgruppen, Verfahren zur Entfernung der funktionellen Schutzgruppen und Verfahren zur Bildung von Peptidbindungen außer den beschriebenen verwendet werden können.

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Zusätzlich zu den zuvor beschriebenen Abkürzungen werden die folgenden Abkürzungen in den Beispielen verwendet: HOBt = N-Hydroxybenzotriazol; DCCD = Ν,Ν'-Dicyclohexylcarbodiimid; HOSu = N-Hydroxysuccinimid; -OBzl.TosOH = Benzylesterp-Toluolsulfonat; -OSu = N-Hydroxysuccinimidester; -OMe = Methylester; -ONb = p-Nitrobenzylester; Boc = t-Butoxycarbonyl; DCHA = Dicyclohexylamin; -OBu = t-Butylester.

Der Rf-Wert wird an Silikagel-Platten GF₂₅^, hergestellt von Merck Corp.,unter Verwendung von η BuOH:AcOH:H₂O (4:1:1) als Entwicklungslösungsmittel, bestimmt.

Einige 3-Amino-2-hydroxycarbonsäuren und Peptide, in denen sie enthalten sind, besitzen zwei Rf-Werte, da sie Ge mische aus den Threo- und Erythro-Konfigurationen sind.

B e i s ρ i e 1 1

Stufe 1

35,4 g öliges Z-(2RS,3R)-3-amino-2-hydroxy-4-phenylbutyronitril werden in einem Gemisch aus 300 ml konz.Chlorwasserstoffsäure und 300 ml Dioxan gelöst. Nach Zugabe von 21,2 g Anisol wird das Reaktions gemisch 12 Stunden am Rückfluß erwärmt. Das Dioxan wird bei vermindertem Druck abdestilliert, die entstehende Lösung aus Chlorwasserstoffsäure wird mit Äther gewaschen und die Wasserschicht wird bei vermindertem Druck konzentriert und zur Trockene eingedampft. Anschließend werden 200 ml Wasser zu dem Rückstand gegeben und J die unlösliche Verbindung wird abfiltriert. Nach Zugabe einer gleichen Menge Aceton wird der pH-Wert des Gemisches mit ammoniakalischem Wasser auf 5,5 eingestellt. Das Gemisch wird in einem Eisschrank stehengelassen. Die abgeschiedenen Kristalle werden abfiltriert. Man erhält 13,66 g der gewünschten (2RS,3R)-AHPAo -

²^ + 16,8° (C 1,25, N HCl); Rf = 0,23 und 0,26

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Analyse für C₁₀H₁₃NO₃

berechnet: C 61,52% H 6,71% N 7,18% gefunden : 61,06 6,55 6,80

Stufe 2

13,66 g der in Stufe 1 erhaltenen (2RS,3R)-AHPA werden in 70 ml einer 1n Natriumhydroxidlösung gelöst. Unter heftigem Rühren und Kühlen der Lösung mit Eis werden 15 ml Z-C1 und 70 ml 1n Natriumhydroxidlösung in drei Teilen im Verlauf von 30 Minuten zugegeben. Das Reaktionsgemisch wird dann 1 Stunde unter Kühlen mit Eis weiter heftig gerührt und dann 3 Stunden bei Zimmertemperatur.

Nach Beendigung der Reaktion wird 6n ChIorwasserstoffsäure zur Einstellung des pH-Wertes des Reaktionsgemisches auf 1 zugegeben. Es trennt sich ein öliges Material ab, das zweimal mit 100 ml Äthylacetat extrahiert wird. Die Äthylacetatschicht wird mit Wasser gewaschen und unter Verwendung von wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet. Magnesiumsulfat wird abfiltriert, und das Filtrat wird bei vermindertem Druck konzentriert. Der Rückstand wird in Äthylacetat-Petroläther zur Herstellung von 8,48 g optisch unreiner Z-(2R,3R)-AHPA kristallisiert. Wird die Mutterlauge bei vermindertem Druck konzentriert und der Rückstand in Petroläther kristallisiert, so erhält man 8,07 g optisch unreine Z-(2S,3R)-AHPA; Fp.142 bis 143⁰C; [a]^₈ + 70,2° (c 1,44, AcOH).

8,00 g optisch unreine Z-(2S,3R)-AHPA und 10,35 g Brucin-dihydrat werden unter Erwärmen in einem Lösungsmittelgemisch aus 300 ml Äthylacetat und 10 ml Methanol gelöst und filtriert. Das Filtrat kann sich abkühlen, wobei sich das Brucinsalz von Z-(2S,3R)-AHPA abtrennt. Die Kristalle werden abfiltriert und zweimal aus Äthylacetat umkristallisiert. Man erhält 13,51 g reines Brucinsalz von Z-(2S,3R)-AHPA; Fp. 144°C, [a]|^₈ + 33,8° (c 1,12, AcOH).

13f5 g der erhaltenen Kristalle werden in 150 ml Äthyl acetat suspendiert und Brucin wird mit 30 ml 1n Chlorwasserstoffsäure entfernt. Dann wird die Äthylacetatschicht mit Wasser gewaschen und unter Verwendung von wasserfreiem Magnesiumsulfat entwässert. Anschließend wird das Magnesiumsulfat abfiltriert und das Äthylacetat wird bei vermindertem Druck abdestilliert. Der Rückstand wird aus Äthylacetat-Petroläther wiederausgefällt; man erhält 6,21 g Z-(2S,3R)-AHPAi Fp. 154,5°C, M^₃ + 83,5° (c 1,34, AcOH).

Stufe 3

2,25 g Z-(2S,3R)-AHPA und 945 mg HOBt werden in 70 ml Tetrahydrofuran gelöst. Nach Zugabe von 2,75 g Leu-OBzl.TosOH wird die Mischung mit 0,98 ml Triäthylamin neutralisiert und auf -5⁰C gekühlt. Dann werden 1,40 g DCCD zugegeben und das Reaktionsgemisch wird über Nacht für die Umsetzung stehengelassen. Tetrahydrofuran wird bei vermindertem Druck abdestilliert und 200 ml Äthylacetat werden zugegeben. Nach Abfiltrieren der unlöslichen Verbindungen wird das Filtrat mit 1n Schwefelsäure, Wasser, 5%iger wäßriger Natriumbicarbonatlösung und Wasser in der angegebenen Reihenfolge gewaschen und mit wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet. Der beim Konzentrieren des Filtrats bei vermindertem Druck erhaltene Rückstand verfestigt sich in Äthylacetat-Petroläther. Umkristallisation aus dem gleichen Lösungsmittel ergibt 3,26 g Z-(2S,3R)-AHPA-(S)-Leu-0Bzlj Fp. 122 bis 123⁰C, P + 14,2° (c 1, AcOH).

Analyse für C₅₁E₅₆N₂O₆

berechnet: C 69,90# H 6,81% N 5,26?6 gefunden : 69,66 7,01 5,13

Stufe 4

3,22 g Z-(2S,3R)-AHPA-(S)-LeU-OBzI werden in 100 ml Methanol gelöst und 3 Stunden mit 100 mg Palladiumschwarz hydriert. Der Katalysator wird abfiltriert und das Lösungsmittel wird bei vermindertem Druck konzentriert. Erfolgt

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das Umkristallisationsverfahren mit Methanol-Äthylacetat, so erhält man 889 mg (2S,3R)-3-Amino-2-hydroxy-4-phenylbutanoyl-(S)-leucin; Fp. 208 bis 213°C (Zers.), [⁰O^₈ - 23,5° (c 0,48, AcOH), Rf = 0,48.

Analyse für C₁₆H₂₄N₂O₄

berechnet: C 62,31% H 7,85% N 9,09% gefunden : 62,61 7,86 8,83

Beispiel 2

Stufe 1

11,0 g (2RS,3R)-3-Amino-2-hydroxy-4-phenylbutyronitrilhydrochlorid werden 4 Stunden in 200 ml 6n Chlorwasserstoffsäure am Rückfluß erwärmt. Die Chlorwasserstoffsäure wird bei vermindertem Druck abdestilliert. 200 ml Wasser werden zugegeben und das Reaktionsgemisch wird erneut bei vermindertem Druck konzentriert. 100 ml Wasser werden zu dem festen Material zugegeben. Das unlösliche Material wird abfiltriert. 100 ml Aceton werden zugegeben und das Reaktionsgemisch wird mit ammoniakalischem Wasser auf einen pH-Wert von 5,5 eingestellt und in einem Kühlschrank über Nacht stehengelassen. Die abgetrennten Kristalle werden abfiltriert und mit Wasser/ Aceton(1:1)-Lösung gespült. Man erhält 6,19 g der gewünschten (2RS,3R)-AHPA.

Stufe 2

Auf ähnliche Weise wie in Beispiel 1, Stufe 2, beschrieben, wird (2RS,3R)-AHPA benzyloxycarbonyliert und mit Brucin unter Herstellung von Z-(2S,3R)-AHPA gespalten. Wenn die entstehende Z-(2S,3R)-AHPA mit einer äquimolaren Menge HOSu und DCD .umgesetzt wird, erhält man Z-(2S,3R)-AHPA-OSu; Fp. 111 bis 112⁰C, O]J^₈ + 87,7° (c 0,52, AcOH).

Analyse für ^C22^H22^N2°7

berechnet: C 61,96% H 5,20% N 6,57% gefunden : 61,27 5,25 6,47

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Stufe 3

85 mg Z-(2S,3R)-AHPA-OSU und 86 mg (S)-Leu-OBzl.TosOH werden 12 Stunden in 5 ml Dioxan bei Zimmertemperatur in Anwesenheit von 0,03 ml Triäthylamin umgesetzt. Das Reaktionsgemisch wird dann bei vermindertem Druck konzentriert. Der Rückstand wird mit Äthylacetat extrahiert und mit 1n Schwefelsäure, Wasser, 5%iger wäßriger Natriumbicarbonatlösung und Wasser in der angegebenen Reihenfolge gewaschen. Der Rückstand wird dann über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet und das Lösungsmittels wird zur Herstellung eines festen Materials abdestilliert. Wird das feste Material aus Äthylacetat-Petroläther umkristallisiert, so erhält man 90 mg des gewünschten Z-(2S,3R)-AHPA-(S)-Leu-0Bzl; Fp. 122⁰C, [α]§°₈ + 15,1° (c 0,77, AcOH).

75 mg Z(2S,3R)-AHPA-(S)-Leu-0Bzl werden dann auf ähnliche Weise wie in Beispiel 1, Stufe. 4, beschrieben behandelt. Man erhält 33 mg (2S,3R)-3-Amino-2-hydroxy-4-phenyTbutanoyl-(S)-leucin,· [α]||₈ - 21,8° (c 0,45, AcOH), Rf = 0,48.

Beispiel 3

Stufe 1

330 mg 2-(2S,3R)-AHPA, hergestellt auf ähnliche Weise, wie in Beispiel 1, Stufe 1, beschrieben, 162 mg HOBt, 217 mg Hydrochlorid von (S)-Leu-OME, 0,17 ml Triäthylamin und 206 mg DCCD werden auf ähnliche Weise wie in Beispiel 1, Stufe 3, beschrieben umgesetzt. Man erhält 293 mg Z-(2S,3R)-AHPA-(S)-Leu-OMe; Fp. 120⁰C, [a]^₈ - 22,1° (c 1,09, AcOH).

Analyse für C₂₅H₅₂N₂O₆

berechnet: C-65,77% H 7,07% N 6,14% gefunden : 65,91 7,16 6,28

Stufe 2

250 mg Z-(2S,3R)-AHPA-(S)-Leu-OMe werden in 10 ml Methanol gelöst und 0,6 ml 1n wäßrige Natriumhydroxidlösung werden zu der Lösung gegeben. Die entstehende Mischung wird

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6 Stunden bei Zimmertemperatur gerührt. Dann wird Methanol bei vermindertem Druck abdestilliert und Wasser wird zu der verbleibenden Flüssigkeit zugegeben, die mit 1n Schwefelsäure auf einen pH-Wert von 2 eingestellt wird. Der abgetrennte Niederschlag wird mit Äthylacetat extrahiert, mit Wasser gewaschen, mit wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet und das Lösungsmittel wird entfernt. Das entstehende feste Material wird aus Äthylacetat-Petroläther kristallisiert. Werden die Kristalle aus den gleichen Lösungsmitteln umkristallisiert, so erhält man 150 mg Z-(2S,3R)-AHPA -(S)-Leu; Fp. 209°C, I ^{+ 27}»²° (° °'⁷¹> ^Ac0H)·

Analyse für ^C24^H30^N2°6

berechnet: C 65,14% H 6,75% N 6,46%

gefunden : 65,29 6,75 6,33

Stufe 3

120 mg Z-(2S,3R)-AHPA-(S)-Leu werden in 30 ml Methanol gelöst und 3 Stunden mit 50 mg Palladiumschwarz hydriert. Der Katalysator wird dann abfiltriert und Methanol wird abdestilliert. Nach Kristallisation aus .Methanol-Äthylacetat erhält man 54 mg (2S,3R)-3-Amino-2-hydroxy-4-phenylbutanoyl-(S)-leucin; Ea]^₈ - 22,7° (c 0,95, AcOH), Rf = 0,48.

Beispiel

85 mg Z-(2S,3R)-AHPA-OSu, hergestellt auf ähnliche Weise wie in Beispiel 2, Stufe 2, beschrieben, können mit 54 mg (S)-Leu 2 Tage bei Zimmertemperatur in 5 ml Dioxan und 5 ml Wasser in Anwesenheit von 0,03 ml Triäthylamin reagieren· Das Reaktionsgemisch wird bei vermindertem Druck konzentriert. 30 ml Wasser werden zu dem Rückstand zugegeben und die Lösung wird mit 1n Schwefelsäure auf einen pH-Wert von 2 eingestellt. Die Extraktion erfolgt mit 50 ml Äthylacetat_o Die Äthylacetatschicht wird mit 1n Schwefelsäure, Wasser, 5%iger wäßriger Natriumbicarbonatlösung und Wasser in der angegebenen Reihenfolge gewaschen und mit wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet. Äthylacetat wird entfernt und der entstehende

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Feststoff wird aus Äthylacetat-Petrolather kristallisiert. Werden die Kristalle aus den gleichen Lösungsmitteln wiederausgefällt, so erhält man 63 mg des gewünschten Z-(2S,3R)-AHPA-(S)-Leu; Fp. 209⁰C, Ea]^₈ + 26,7° (c 0,55, AcOH).

Werden 45 mg Z-(2S,3R)-AHPA-(S)-Leu auf ähnliche Weise wie in Beispiel 3, Stufe 3, behandelt, so erhält man 15 mg Bestatin; [α]²-^ - 22,3° (c 0,52, AcOH), Rf = 0,48.

Beispiel 5

330 mg Z-(2S,3R)-AHPA, hergestellt auf ähnliche Weise wie in Beispiel' 1, Stufe 2, beschrieben, werden auf ähnliche Weise wie in Beispiel 1, Stufe 3, beschrieben mit 472 mg (R)-Leu-OBzl.TosOH, 162 mg HOBt, 0,14 ml Triäthylamin und 206 mg DCCD unter Herstellung von 450 mg Z(2S,3R)-AHPA-(R)-Leu-OBzl behandelt; Fp. 118 bis 119⁰C, O!573 + ^3,O⁰ (c 1,23, AcOH).

Werden 430 mg des entstehenden Z-(2S,3R)-AHPA-(R)-LeU-OBzI auf ähnliche Weise wie in Beispiel 1, Stufe 4, behandelt, so erhält man 144 mg (2S,3R)-3-Amino-2-hydroxy-4-phenylbutanoyl-(S)-leucin; [a]|y₈ +0,9° (c 0,47, AcOH), Rf = 0,49.

Analyse für C^gHg^NgO^

berechnet: C 62,31% H 7,85% N 9,09% gefunden : 62,47 7,89 9,09

Bei spiel 6

Stufe 1

Z-(2RS,3S)-AHPA wird durch Benzyloxycarbonylierung von (2RS,3S)-AHPA hergestellt, die auf ähnliche Weise wie in Beispiel 1, Stufe 1, beschrieben erhalten wurde. -7,75 g Z-(2RS,3S)-AHPA und 6,69 g Dehydroabiethylamin können reagieren; man erhält ein Diastereoisomer, welches dann in Äther gelöst wird« Kaum lösliches Dehydroabiethylaminsalz von Z-(2R,3R)-AHPA wird abfiltriert. Die filtrierte Ätherlösung wird bei vermindertem Druck kon-

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zentriert. Das entstehende, ölige Material wird mit Äthylacetat 1n Chlorwasserstoffsäure behandelt; man erhält rohe Z-(2S,3S)-AHPA; wenn die Kristalle zweimal aus Äthylacetat-Petroläther ausgefällt werden, erhält man 2,16 g reine Z-(2S,3S)-AHPA; Fp. 175 Ms 176⁰C, [a]|y₈ + 5,6° (c 1,39, AcOH).

Stufe 2

660 mg Z-(2S,3S)-AHPA, 944 mg (S)-Leu-OBzl.TosOH, 324 mg HOBt, 0,34 ml Triäthylamin und 412 mg DCD werden auf ähnliche Weise wie in Beispiel 1, Stufe 3» behandelt, wobei man 710 mg Z-(2S,3S)-AHPA-(S)-Leu-0Bzl erhält; Fp. 128⁰C, I - 38,0° (c 0,81, AcOH).

500 mg (Z-(2S,3S)-AHPA-(S)-Leu-OBzl werden auf ähnliche Weise wie in Beispiel 1, Stufe 4, behandelt. Man erhält 270 mg (2S, 3S) ^-Amino^-hydroxy^-phenylbutanoyl-(S) -leucin; |^ - 61,3° (c 0,56, AcOH), Rf = 0,37.

Analyse für C^g

berechnet: C 62,31% H 7,85% N 9,09%
gefunden : 61,99 7,71 9,13

Beispiel 7

165 mg Z-(2S,3S)-AHPA, hergestellt auf ähnliche Weise wie in Beispiel 6, Stufe 1, 237 mg (R)-Leu-OBzl.TosOH, 81 mg HOBt, 0,08 ml Triäthylamin und 103 mg DCCD werden auf ähnliche Weise wie in Beispiel 1, Stufe 3, behandelt; man erhält 180 mg Z-(2S,3S)-AHPA-(R)-Leu-OBzl; Fp. 128 bis 129⁰C, " ¹¹'°° (° ¹'⁰²' ^Ac0H)·

155 mg" Z-(2S,3S)-AHPA-(R)-Leu-OBzl werden auf ähnliche Weise wie in Beispiel 1, Stufe 4, behandelt; man erhält 72,1 mg (2S,3S)-S-Amino^-hydroxy^-phenylbutanoyl-(R)-leucin; " ³¹»⁴° ^(c °»⁴⁷» ^Ac0H)»

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Analyse für C₁₆

berechnet: C 62,31% H 7,85% N 9,09% gefunden 1 62,07 7,63 8,80

Beispiel 8

330 mg Z-(2S,3R)-AHPA, hergestellt auf ähnliche Weise wie in Beispiel 1, Stufe 2, 405 mg Gly-OBzl.TosOH, 162 mg HOBt, 0,14 ml Triäthylamin und 206 mg DCCD werden auf ähnliche Weise wie in Beispiel 1, Stufe 3, behandelt* Man erhält öliges Z-(2S,3R)-AHPA-GIy-OBzI. Eine Prüfung durch DünnschichtChromatographie ergibt, daß dieses ölige Produkt rein ist.

Wird das ölige Produkt auf ähnliche Weise wie in Beispiel 1, Stufe 4, behandelt, so erhält man 117 mg (2S,3R)-3-Amino-2-hydroxy-4-phenylbutanoyl-glycin; M 4° (c 0,49, AcOH), Rf= 0,26.

Analyse für C₁₂H₁₆O₄N^₅

berechnet: C 54,92% H 7,09% N 9,87% gefunden : 54,33 6,87 9,69

Beispiel 9

330 mg Z-(2S,3R)-AHPA, hergestellt auf ähnliche Weise wie in Beispiel 1, Stufe 2, 440 mg Hydrochlorid von (S)-Ser-(BzI)-ONb, 162 mg HOBt, 0,14 ml Triäthylamin und 206 mg DCCD werden auf ähnliche Weise wie in Beispiel 1, Stufe 3, behandelt. Man erhält 540 mg Z-(2S,3R)-AHPA-(S)-Ser(Bzl)-0Nb; Pp. 121,5⁰C, WfjQ + 17,7° (c 1,07, AcOH).

Werden 500 mg Z-(2S,3R)-AHPA-(S)-Ser(Bzl)-0Nb auf ähnliche Weise wie in Beispiel 1, Stufe 4, behandelt, so erhält man 147 mg (2S,3R)-3-Amino-2-hydroxy-4-phenylbutanoyl-(S)-serin; M^_Q - 9,0° (c 0,50, AcOH), Rf = 0,20. Analyse für C₁₃H₁₈O₅N₂-H₂O

berechnet: C 51,99% H 6,71% N 9,33% gefunden : 51,39 6,74 8,97

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Bei spiel 10

330 mg Z-(2S,3R)-AHPA, hergestellt auf ähnliche Weise wie in Beispiel 1, Stufe 2, 400 mg Hydrochloric! von (S)-GIn-OBzI, 162 mg HOBt, 0,14 ml Triethylamin und 206 mg DCCD werden auf ähnliche Weise wie in Beispiel 1, Stufe 3» zur Herstellung von 200 mg Z-(2S,3R)-AHPA-(S)-GIn-OBzI behandelt; Fp. 155°C, [«!573 + 62,3° (c 0,75, AcOH).

Werden 180 mg Z-(2S,3R)-AHPA-(S)-GIn-OBzI auf ähnliche Weise wie in Beispiel 1, Stufe 4, behandelt, so erhält man 61 mg (2S,3R)-3-Amino-2-hydroxy-4-phenylbutanoyl-(S)-glutamin; [Cc]^₈ - 9,9° (c 0,37, AcOH), Rf = 0,17.

Analyse für C₁₅H₂₁O₅N₃. 2H_£0

berechnet: C 50,13% H 7,01% N 11,69% gefunden : 50,64 6,32 11,61

Beispiel 11

330 mg Z-(2S,3R)-AHPA, hergestellt auf ähnliche Weise wie in Beispiel 1, Stufe 2, 600 mg (S)-Glu(0Bzl)-0Bzl_oTos0H, 162 mg HOBt, 0,14 ml Triäthylamin und 206 mg DCCD werden auf ähnliche Weise wie in Beispiel 1, Stufe 3, unter Herstellung von 605 mg Z-(2S,3R)-AHPA-(S)-GIu(OBzI)-OBzI behandelt; Fp. 119 bis 120⁰C, [cc]p₈ + 28,6° (c 1,04) AcOH).

Werden 250 mg Z-(2S,3R)-AHPA-(S)-GIu(OBzI)-OBzI auf ähnliche Weise wie in Beispiel 1, Stufe 4, behandelt, so erhält man 166 mg (2S,3R)-3-Amino-2-hydroxy-4-phenylbutanoyl-(S)-glutaminsäure; O]₅I₈ - 18,4° (c 0,51, AcOH) Rf = 0,27.

Analyse für C₁₅H₂₀OgN₂

berechnet: C 55,55% H 6,22% N 8,64% gefunden : 55,20 5,90 8,20

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Beispiel 12

330 mg Z-(2S,3R)-AHPA, hergestellt auf ähnliche Weise wie in Beispiel 1, Stufe 2, 455 mg (S)-Val-OBzl.TosOH, 162 mg HOBt, 0,14 ml Triäthylamin und 206 mg DCCD werden auf ähnliche Weise wie in Beispiel 1, Stufe 3, zur Herstellung von 397 mg Z-(2S,3R)-AHPA-(S)-VaI-OBzI behandelt; Fp. 96,5 bis 97°C, ^ + 19,2° (c 0,99, AcOH).

Werden 376 mg Z-(2S,3R)-AHPA-(S)-VaI-OBzI auf ähnliche Weise wie in Beispiel 1, Stufe 4, behandelt, so erhält man 104 mg (2S,3R)-3-Amino-2-hydroxy-4-phenylbutanoyl -(S)-valin;

ff * ¹»⁴° (° °»⁵⁵» ^{Ac0H) Rf} = °'⁴²

Analyse für C₁AH₂₂O^N₂

berechnet: C 61,20% H 7,53% N 9,52% gefunden : 60,98 7,59 9,28

Beispiel 13

330 mg Z-(2S,3R)-AHPA, hergestellt auf ähnliche Weise wie in Beispiel 1, Stufe 2, 455 mg (S)-Nva-OBzl.TosOH, 162 mg HOBt, 0,14 ml Triäthylamin und 206 mg DCCD werden auf gleiche Weise wie in Beispiel 1, Stufe 3, zur Herstellung von 310 mg Z-(2S,3R)-AHPA-(S)-Nva-OBzl behandelt; Fp. 114 bis 115°C, [Cc]^₈ + 22,0° (c 0,49, AcOH).

Werden 250 mg Z-(2S,3R)-AHPA-(S)-Nva-OBzl auf ähnliche Weise wie in Beispiel 1, Stufe 4, behandelt, so erhält man 110 mg (2S ,3R)-3-Amino-2-hydroxy-4-phenylbutanoyl-(S)-norvalin; M^j₈ - 14,5° (c 0,50, AcOH) Rf = 0,41 Analyse für C-JcH₂₂O^N₂

berechnet: C 59,33% H 7,64% N 9,23% gefunden : 59,42 7,58 9,09

Beispiel 14

Wird (2S,3R)-AHPA auf übliche Weise unter Verwendung von t-Butyl-S-4,6-dimethylpyrimidin-2-yl-thiolcarbonat t-but-

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oxycarbonyliert, so erhält man das DCHA-SaIz von Boc-(2S,3R)-

|y₈

hält an da CHA AHPA; Fp. 158 Ms 159°C, [a]|y₈ + 51,9° (c 0,89, AcOH)

Wird DCHA aus 952 mg dieses Produktes durch Behandlung mit 1n Schwefelsäure und Äthylacetat entfernt, so erhält man ölige Boc-(2S,3R)-AHPA. Das ölige Material und 440 mg Hydrochlorid von (S)-Met-OMe werden in 20 ml Tetrahydrofuran suspendiert und mit 0,308 ml Triäthylamin neutralisiert. Die entstehende Lösung wird auf -5°C abgekühlt und nach Zugabe von 412 mg DCCD 4 Stunden bei Zimmertemperatur gerührt.

Die abgeschiedenen Kristalle werden abfiltriert und die Mutterlauge wird bei vermindertem Druck konzentriert. Der Rückstand wird in 200 ml Äthylacetat gelöst, mit 1n Schwefelsäure, Wasser, 5%iger wäßriger Bicarbonatlösung und Wasser in der angegebenen Reihenfolge gewaschen und über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet.

Der durch Konzentrierung der Mutterlauge bei vermindertem Druck erhaltene Rückstand wird in einem Gemisch aus Äthylacetat und Benzol (2:5) gelöst. Die Lösung wird in eine Chromatographiesäule gegeben, die mit Silicagel G gefüllt ist (Warenzeichen für ein Adsorptionsmittel, das in der Säulenchromatographie verwendet wird und von Merck Inc. hergestellt j wird). Die das gewünschte Produkt enthaltende Fraktion wird : gesammelt. Das Lösungsmittel wird bei vermindertem Druck abfiltriert; man erhält ein festes Material. Wird das feste Material aus Äther-Petroläther umkristallisiert, so erhält man j 380 mg Boc-(2S,3R)-AHPA-(S)-Met-OMe; Fp. 118°C, [cc]|£₈ + 51,4° ^! (c 0,56, AcOH).

Werden 280 mg Boc-(2S,3R)-AHPA-(S)-Met-OMe auf ähnliche Weise wie in Beispiel 3, Stufe 2, behandelt, so erhält man 200 mg Boc-(2S,3R)-AHPA-(S)-Met, Fp. 116°C (Schäumen),

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0,2 ml Thioglykolsäure und 50%ige wäßrige Trifluoressigsäurelösung werden zu 150 mg Boc-(2S,3R)-AHPA-(S)-Met zugegeben, und das Gemisch wird 1 Stunde "bei Zimmertemperatur gerührt.

Das durch Konzentration der Mischung bei vermindertem Druck erhaltene ölige Material wird in Wasser gelöst und an einer Säule (5 ml) adsorbiert, die mit Dowex 50X4 (H-Typ) (Warenzeichen für ein Ionenaustauscherharz, hergestellt und verkauft von Dow Chemical Co.) gefüllt ist. Das adsorbierte Material wird mit einer 2n wäßrigen Ammoniumhydroxidlösung eluiert und das Eluat wird zur Trockene eingedampft. Man erhält einen Feststoff. Wird der Feststoff aus einem Wasser-Aceton (1:1)-Gemisch umkristallisiert, so erhält man 87 mg (2S,3R)- 3-Amino-2-hydroxy-4-phenylbutanoyl-(S)-methionin; [a]§7₈ - 20,4° (c 0,49, AcOH), Rf = 0,37 Analyse für C₁5H₂₂O₄N₂S.1/2H₂O

berechnet: C 53,67% H 6,91% N 8,35% gefunden : 53,64 6,47 8,11

Beispiel 15

330 mg Z-(2S,3R)-AHPA, hergestellt auf ähnliche Weise wie in Beispiel 1, Stufe 2, 472 mg (S)-Ile-OBzl.TosOH, 162 mg HOBt, 0,14 ml Triäthylamin und 206 mg DCCD werden auf ähnliche Weise wie in Beispiel 1, Stufe 3, zur Herstellung von 466 mg Z-(2S,3R)-AHPA-(S)-IIe-OBzI behandelt; Fp. 100 bis 101⁰C, [a]||₈ + 23,6° (c 1,0, AcOH).

Werden 440 mg Z-(2S,3R)-AHPA-(S-(IIe)-OBzI auf ähnliche Weise wie in Beispiel 1, Stufe 4, behandelt, so erhält man 191 mg (2S,3R)-3-Amino-2-hydroxy-4-phenylbutanoyl-(S)-isoleucin; [a]||₈ + 6,4° (c 0,52, AcOH), Rf = 0,48.

Analyse für C₁₆H₂₄O₄N₂

berechnet: C 62,31% H 7,85% N 9,-09% gefunden : 62,31 7,70 8,99»

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Beispiel 16

330 mg Z-(2S,3R)-AHPA, hergestellt auf ähnliche Weise ■wie in Beispiel 1, Stufe 2, 472 mg (S)-Nle-OBzl.TosOH, 162 mg HOBt, 0,14 ml Triäthylamin und 206 mg DCCD werden auf ähnliche Weise wie in Beispiel 1, Stufe 3, zur Herstellung von 437 mg Z-(2S,3R)-AHPA-(S)-NIe-OBzI behandelt; Fp₀ 114 Ms 115°C, ^ + 23,3° (c 0,94, AcOH).

3)3Amin
leucin; [a]|y₈ - 8,9° Cc 0,70, AcOH), Rf = 0,47

350 mg Z-(2S,3R)-AHPA-(S)-NIe-OBzI werden auf ähnliche Weise wie in Beispiel 1, Stufe 4, "behandelt; man erhält 160 mg (2S,3R)-3~Amino-2-hydroxy-4-phenylbutanoyl-(S)-nor- |y₈

Analyse für

berechnet: C 58,88% H 8,03% N 8,58% gefunden : 58,95 7,84 8,60

Beispiel 17

330 mg Z-(2S,3R)-AHPA, hergestellt auf ähnliche Weise wie in Beispiel 1, Stufe 2, 505 mg (RS)-Aoc-OBzl.TosOH, 162 mg HOBt, 0,14 ml Triäthylamin und 206 mg DCCD werden auf ähnliche Weise wie in Beispiel 1, Stufe 3, behandelt; man erhält 430 mg Z-(2S,3R)-AHPA-(RS)-Aoc-0Bzl; Fp. 90 bis 92⁰C, || + 32,9° (c 0,94, AcOH).

Werden 250 mg Z-(2S,3R)-AHPA-(RS)-Aoc-OBzl auf ähnliche Weise wie in Beispiel 1, Stufe 4, behandelt, so erhält man 74 mg (2S,3R)-3-Amino-2-hydroxy-4-phenylbutanoyl-(RS)-2-

P1 Γι

aminooctansäure; [a]^_Q - 34,9 (c 0,53, AcOH), Rf = 0,58. Analyse für

berechnet: C 64,26% H 8,39% N 8,33% gefunden : 64,43 8,18 8,02

609885/123 7

Beispiel 18

330 mg Z-(2S,3R)-AHPA, hergestellt auf ähnliche Weise wie in Beispiel 1, Stufe 2, 513 mg (S)-Ehe-OBzl.TosOH, 162 mg HOBt, 0,14 ml Triäthylamin und 206 mg DCCD werden auf ähnliche Weise wie in Beispiel 1, Stufe 3, zur Herstellung von 378 mg Z-(2S,3R)-AHPA-(S)-Phe-0Bzl behandelt; Fp. 111 bis 112⁰C, O]^₈ + 39,6° (c 0,97, AcOH).

Werden 355 mg Z-(2S,3R)-AHPA-(S)-Phe-0Bzl auf ähnliche Weise wie in Beispiel 1, Stufe 4, behandelt, so erhält man 108 mg (2S,3R)^-Amino^-hydroxy^-phenylbutanoyl-(S)-phenylalanin; [α]||₈ + 0,4° (c 0,46, AcOH), Rf = 0,44. Analyse für C₁₉H₂₂O₄N₂-CH₃OH

berechnet: C 64,15 H 7,00 N 7,48
gefunden : 63,58 6,45 7,57

Beispiel 19

Werden 9,00 g Benzyloxycarbonyl-(2RS,3R)-3-amino-2-hydroxypropionitril auf ähnliche Weise wie in Beispiel 1, Stufe 1, behandelt, so erhält man 3,16 g (2RS,3R)-Me-Ise; M578 "" °»⁶° (° ¹»¹⁰> NHd)* ^Rf = °· Analyse für C₄H₉NO₃

berechnet: C 40,33% H 7,62% N 11,76% gefunden ϊ 40,53 7,51 11,95

Werden 1,10 g öliges Z-(2RS,3R)-Me-Ise, hergestellt durch Benzyloxycarbonylierung von (2RS,3R)-Me-Ise, 1,97 g (S)-Leu-OBzl.TosOH, 675 mg HOBt, 0,70 ml Triäthylamin und 948 mg DCCD auf ähnliche Weise wie in Beispiel 1, Stufe 3, behandelt, so erhält man öliges Z-(2RS,3R)-Me-Ise-(S)-Leu-OBzI. Dieses ölige Produkt ist rein, wie durch Dünnschichtchromatographie bestätigt wird.

Wird dieses ölige Z-(2RS_f3R)-Me-Ise-(S)-Leu-0Bzl auf ähnliche Weise wie in Beispiel 1, Stufe 4, behandelt, so er-

1.: ι

Ü9885/1237

hält man 765 mg (2RS,3R)-3-Amino-2-hydroxypropionyl-(S)-leucin; Ca]^₈ - 28,7° (c 1,09, AcOH).

Analyse für C₁₀H₂₀N₂O^

berechnet: C 51,70% H 8,68% N 12,06% gefunden: 51,49 8,42 11,96

Beispiel 20

2,76 g öliges Z-(2RS,3R)-3-Amino-2-hydroxy-5-methylhexanonitril werden in 30 ml konz. Chlorwasserstoffsäure und 30 ml Dioxan gelöst. Nach Zugabe von 2,16 g Anisol wird die Lösung 4 Stunden am Rückfluß erwärmt. Dioxan wird bei vermindertem Druck abdestilliert und die zurückbleibende Chlorwasserstoffsäurelösung wird mit Äther gewaschen. Die Wasserschicht wird bei vermindertem Druck zur Trockene konzentriert.

Wasser wird zu dem Rückstand zugegeben und das Gemisch

(R)

wird an einer mit Dowex 50X4 (H Typ) ^{K J} gepackten Säule adsorbiert. Nach dem Waschen mit Wasser wird das adsorbierte Material mit 4n wäßriger Ammoniumhydroxidlösung eluiert. Dann wird die eluierte Lösung bei vermindertem Druck zur Trockene konzentriert.

Wird ein Wasser-Aceton(1:1)-Gemisch zu dem Rückstand zugegeben und werden die entstehenden Kristalle durch Filtration abgetrennt, so erhält man 0,82 g des gewünschten (2RS, 3R)-iso-Bu-Ise; Ca]^₈ - 8,3° (c 1,0, AcOH), Rf = 0,18.

1,32 g öliges Z-(2RS,3R)-iso-Bu-Ise, das durch Benzyloxycarbonylierung des nach dem zuvor beschriebenen Verfahren erhaltenen (2RS,3R)-iso-Bu-Ise hergestellt wird, 1,76 g (S)-Leu-OBzl.TosOH, 0,60 g HOBt, 0,63 ml Triäthylamin und 0,92 g DCCD werden auf ähnliche V/eise wie in Beispiel 1, Stufe 3, behandelt, wobei man öliges Z-(2RS,3R)-iso-Bu-Ise-(S)-Leu-OBzl erhält. Wird dieses ölige produkt auf ähnliche Weise wie in Beispiel 1, Stufe 4₉ behandelt, so erhält man 0137 g (2RS ₉ 3R) -3-"Amino-2-hydroxy-5-niethylhexanoyl- (S)-leucin;

B09885/123

- 26,6° (c 1,0, AcOH), Rf = 0,43 und 0,49 Analyse für C₁₃H₂₆N₂O₄

berechnet: C 56,91% H 9,55% N 10,21% gefunden : 57,01 9,80 10,14

Beispiel 21

Werden 3,00 g Z-(2RS,3R)-3-Amino-2-hydroxy-3--phenylpropionitril auf ähnliche ¥eise wie in Beispiel 1, Stufe 1, behandelt, erhält man 0,80 g (2RS,3R)-Ph-Isej Mf^₈ + 9,5° (c 1,0, NHCl), Rf = 0,13 und 0,17.

Analyse für C₉H₁₁NO,

berechnet: C 59,66% H 6,12% N 7,73% gefunden : 59,18 6,15 7,67

250 mg Z-(2RS,3R)-Ph-Ise (Fp. 170 Ms 171°C, [a]||₈ + 18,5° (c 0,47, AcOH)), hergestellt durch Benzyloxycarbonylierung von (2RS,3R)-Ph -Ise, 394 mg (S)-Leu-OBzl.TosOH, 130 mg HOBt, 0,14 ml Triäthylamin und 165 mg DCCD werden auf ähnliche Weise wie in Beispiel 1, Stufe 3, zur Herstellung von 285 mg Z-(2RS,3R)-Ph-Ise-(S)-Leu-OBzl behandelt;, Fp. 93 bis 95⁰C, [«!578 - 34,7° (c 0,49, AcOH).

Werden 200 mg Z-(2RS,3R)-Ph-Ise-(S)-Leu-0Bzl auf ähnliche Weise wie in Beispiel 1, Stufe 4, behandelt, erhält man 45 mg (2RS,3R)-3-Amino-2-hydroxy-3-phenylpropionyl-(S)-leucin; ^ - 2,4° (c 0,33, AcOH).

Analyse für C₁JjH₂₂O^N₂

berechnet: C 61,20% H 7,53% N 9,52% gefunden : 60,92 7,67 9,46

Beispiel 22

Werden 10,3 g Z-(2RS,3RS)-3-Amino-2-hydroxjr_4-p-chlorphenyl-butyronitril auf ähnliche ¥eise wie in Beispiel 1, Stufe 1, behandelt, erhält man 3,10 g (2RS,3RS)-AHPA(p-Cl);

603885/1237

Rf = 0,25

Analyse für C₁₀H₁₂NO₃Cl

berechnet: C 52,29% H 5,27% N 6,10% gefunden : 52,11 5,17 . 5,99

1,81 g Z-(2RS,3RS)-AHPA(p-Cl) (Fp. 147°C), hergestellt durch Benzyloxycarbonylierung von (2RS,3RS)-AHPA(p-Cl), 2,37 g (S)-Leu-OBzl.TosOH, 810 mg HOBt, 0,84 ml Triäthylamin und 1,03 g DCCD werden auf ähnliche Weise wie in Beispieli, Stufe 3 behandelt. Man erhält 2,50 g Z-(2RS,3RS)-AHPA(p-Cl)-(S)-Leu-OBzl; Fp. 122 bis 124⁰C, Ca]^y₈ - 12,3° (c 3,18, AcOH).

Werden 1,50 g Z-(2RS,3RS)-AHPA(p-Cl)-(S)-Leu-0Bzl auf ähnliche Weise wie in Beispiel 1, Stufe 4, behandelt, erhält man 65O mg (2RS,3RS)-3-Amino-2-hydroxy-4-p-chlorphenylbutanoyl-(S)-leucin; [α]||₈ - 11,3° (c 1,33, AcOH), Rf = 0,42 und 0,52.

Analyse für C₁₆H₂₃N₂O^

berechnet: C 56,05% H 6,76% N 8,17% gefunden : 55,88 7,29 8,11.

Beispiel 23

Werden 10,3 g Z-(2RS,3RS)~3-Amino-2-hydroxy-4-o-chlorphenyl-butyronitril auf ähnliche Weise wie in Beispiel 1, Stufe 1, behandelt, erhält man 4,82 g (2RS,3RS)-AHPA(ο-Cl)j Rf = 0,25 und 0,29.
Analyse für C₁₀H₁₂NO₃Cl

berechnet: C 52,29% H 5,27% N 6,10% gefunden : 52,01 5,17 5,91

726 mg Z-(2RS,3RS)-AHPA(ο-Cl) (Fp. 136,5⁰C), hergestellt durch Benzyloxycarbonylierung von (2RS,3RS)-AHPA(o-Cl), 944 mg (S)-Leu-OBzl.TosOH, 324 mg-HOBt, 0,34 ml Triäthylamin und 412 mg DCCD werden auf ähnliche Weise wie in Beispiel 1, Stufe 3, behandelt; man erhält 747 mg Z-(2RS,3RS)-AHPA(o-Cl)-

b 09885/1237

(S)-Leu-OBzl; Fp. 129 bis 132⁰C, W^j₈ - 29,1° (c 1,02, AcOH)

Werden 640 mg Z-(2RS,3RS)-AHPA(o-Cl)-(S)-Leu-0Bzl auf ähnliche Weise wie in Beispiel 1, Stufe 4, "behandelt, erhält man 107 mg (2RS,3RS)-3-Amino-2-hydroxy-4-o-chlorphenylbutanoyl-(S)-leucin; [a]|J₈ - 20,8° (c 0,48, AcOH), Rf = 0,46.

Analyse für C₁₆H₂₃N₂O₄

berechnet: C 56,05% H 6,76% N 8,17% gefunden : 56,21 6,56 7,90.

Beispiel 24

Werden 11,2 g Z-(2RS,3RS)-3-Amino-2-hydroxy-4-p-methylphenylbutyronitril auf ähnliche Weise wie in Beispiel 1, Stufe 1, behandelt, erhält man 3,41 g (2RS,3RS)-AHPA(p-Me); Rf = 0,20.
Analyse für C₁ ^ H₁-NO*

berechnet: C 63,14% H 7,23% N 6,99% gefunden : 62,94 7,01 6,79

1,57 g Z-(2RS,3RS)-AHPA(p-Me) (Fp. 166,5 bis 168°C), hergestellt durch Benzyloxycarbonylierung von (2RS,3RS)-AHPA-(p-Me), 1,42 g (S)-Leu-OBzl.TosOH, 486 mg HOBt, 0,50 ml Triäthylamin und 618 mg DCCD werden auf ähnliche Weise wie in Beispiel 1, Stufe 3, behandelt; Man erhält öliges Z-(2RS,3RS)-AHPA- (S)-Leu-OBzl.

Wird das ölige Produkt auf ähnliche Weise wie in Beispiel 1, Stufe 4, behandelt, erhält man 497 mg (2RS,3RS)-3-Amino-2-hydroxy-4-p-methylphenylbutanoyl-(s)-leucin; Rf = 0,58 und 0,53» M^₈ ' 7,2° (c 0,96, AcOH).

Analyse für C₁₇

berechnet: C 63,33% H 8,13% N 8,69% gefunden : 63,08 8,23 8,49.

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Bei spiel 25

103 mg Bestatin werden in 5 ml Essigsäure und 5 ml Äthanol gelöst und 14 Stunden mit Platinoxid katalytisch hydriert.

Der Katalysator wird abfiltriert und das Filtrat wird bei vermindertem Druck zur Trockene konzentriert. Wird der Rückstand mit Äthylacetat verrieben und durch Filtration gesammelt, erhält man 61 mg (2S,3R)-3-Amino-2-hydroxy-4-cyclohexylbutanoyl-(S)-leucin; Rf = 0,47 [⁰Op₈ - 30,5° (c 0,67, AcOH).
Analyse für C₁₆

berechnet: C 61,12% H 9,62% N 8,91% gefunden : 62,12 9,52 8,81.

Beispiel 26

300 mg Bestatin werden in 10 ml konz. Schwefelsäure und 0,3 ml rauchender Salpetersäure bei O⁰C suspendiert. Die Umsetzung wird 1 Stunde bei der gleichen Temperatur fortgeführt, nachdem die suspendierten Materialien verschwunden ist. Das Reaktionsgemisch wird in 100 ml Wasser gegossen und an einer mit Dowex 50X4 (H Typ) gepackten Säule adsorbiert. Das adsorbierte Material wird mit 2n wäßriger Ammoniumhydroxidlösung eluiert und das Eluat wird zur Trockene eingedampft. Der Rückstand wird in 10 ml Wasser gelöst, filtriert und dann wird das Filtrat lyophilisiert; man erhält 213 mg (2S, 3R) ^-Amino^-hydroxy^-p-nitrophenylbutanoyl- (S) -leucin; Ca]Iy₈ + 5,2 (c 0,5, AcOH), Rf = 0,58. Analyse für C₁₆H₂₃N₃O₆

berechnet: C 54,38% H 6,56% N 11,89% gefunden : 54,28 6,58 11,88

Beispiel 27

100 mg (2S,3R)~AHPA(p-N0₂)-(S)-Leu, erhalten gemäß Beispiel 26, werden in 10 ml Methanol gelöst und katalytisch

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mit Palladiumschwarz 5 Stunden hydriert. Der Katalysator wird abfiltriert und das Filtrat wird bei vermindertem Druck konzentriert. Der Rückstand wird in 5 ml Wasser gelöst und filtriert. Das Filtrat wird lyophilisiert; man erhält 81 mg (2S,3R) ^-Amino^-hydroxy^-p-aminophenylbutanoyl- (S) -leucin; [Cc]^₈ - 23,2° (c 0,5, AcOH), Rf = 0,25 Analyse für C₁₆H₂₅N₃O₄

berechnet: C 59,42% H 7,79% N 13,00 gefunden : 59,01 7,91 12,81.

Referenzbeispiel 1

Synthese des Nitrils aus dem Aldehyd

Eine Lösung, die 20,8 g Natriumhydrogensulfit und 50 ml Wasser enthält, wird zu etwa 52,7 g öligem Z-(R)-Pftenylalaninal gegeben. Das sich abtrennende Addukt wird abfiltriert und mit Wasser und Äther in der angegebenen Reihenfolge gewaschen. Man erhält 77 g rohes 3-Benzyloxycarbonylamino-2-hydroxy-4-phenyl-butyronitril. 68 g des entstehenden Adduktes werden in 250 ml Wasser suspendiert und auf -10 bis 12⁰C gekühlt. Nach Zugabe von 500 ml Äther wird eine Lösung aus 13 g Kaliumcyanid und 100 ml Wasser tropfenweise im Verlauf von 30 Minuten zugegeben.

Das Gemisch kann 3 Stunden bei Zimmertemperatur reagieren. Die Wasserschicht wird dann verworfen» Die Ätherschicht wird mit einer wäßrigen Lösung aus Natriumchlorid gewaschen und über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet. Das Magnesiumsulfat wird abfiltriert und die Ätherschicht wird bei vermindertem Druck destilliert; man erhält 49 g öliges Benzyloxycarbonyl-(2RS,3R)-3-amino-2-hydroxy-4-phenylbutyronitril.

Die anderen, bei der vorliegenden Erfindung verwendeten Nitrilderivate werden auf ähnliche Weise wie oben beschrieben hergestellt.

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Claims

Patentansprüche

1. I Verbindung der folgenden Formel

3 2 1 2¹ 1«

R. - CH - CH - CO - NH - CH - COOH ,_Tx ' .ι ι t \±)

NH₂ OH R₂

R₁ eine niedrige Alkylgruppe, Cycloalkanoalkylgruppe, Phenylgruppe, Benzylgruppe oder substituierte Benzylgruppe bedeutet,

R₂ eine Alkylgruppe mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, Hydroxyalkylgruppe, Mercaptoalky!gruppe, Carboxamidoalkylgruppe, Alkoxyalkylgruppe, Alkylmercaptoalkylgruppe, Carboxyalkylgruppe, Arylgruppe, Aralkylgruppe oder substituierte Aralkylgruppe bedeutet, und

wenn R^ eine Benzylgruppe und R₂ eine Isobutylgruppe bedeuten, die Konfiguration der Verbindung (2S,3R,2'R), (2S,3S,2^!S) oder (2S,3S,2'R) ist.

2. Verbindung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß R^ eine Benzylgruppe oder substituierte Benzylgruppe bedeutet, R₂ eine Alkylgruppe mit 3 oder 4 Kohlenstoffatomen oder eine Hydroxymethy!gruppe bedeutet und die Konfiguration der Verbindung (2S,3R,2'R), (2S,3S,2^fS) oder (2S,3S,2'R) ist.

3. (2S, 3R) ^-Amino^-hydroxy-^phenylbutanoyl- (R) -leucin.

4. (2S, 3S) -S-Amino^-hydroxy-^-phenylbutanoyl- (R) -leucin.

5. (2S, 3R) -S-Amino^-hydroxy^-p-nitrophenylbutanoyl- (S) leucin.

6. (2S, 3R) ^-Amino^-hydroxy^-phenylbutanoyl- (S) -valin.

7. (2S, 3R) -S-Amino^-hydroxy^-phenylbutanoyl- (S) -norvalin.

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8. (2S,3R)^-Amino^-hydroxy^-phenylbutanoyl-(S)-methionin

9. (2S, 3R-) ^-Amino^-hydroxy^-phenylbutanoyl- (S) -isoleucin

10. (2S,3R)-^-Amino-Z-hydroxy-^phenylbutanoyl-(S)-norleucin

11. (2RS,3RS) ^-Amino^-hydroxy^-p-chlorphenylbutanoyl-(S)-leucin.

12. (2RS, 3RS) ^-Amino^-hydroxy^-o- chlorphenylbutanoyl- (S) leucin.

13. (2RS, 3RS) ^-Amino^-hydroxy^-p-methylphenylbutanoyl-(S)-leucin.

14. (2S, 3R) ^-Amino^-hydroxy-^p-aminophenylbutanoyl- (S)-leucin.

15. Verbindung der Formel

R₁ - CH - CH - COOH • ι ι

NH₂ OH

R₁ eine niedrige Alkylgruppe, Phenylgruppe, Benzylgruppe oder substituierte Benzylgruppe bedeutet.

16. (2S,3R)-3-Amino-2-hydroxy-4-phenylbutansäure.

17. (2RS, 3RS) ^-Amino^-hydroxy^-phenylbutansäure.

18. (2RS,3RS)-3-Amino-2-hydroxy-4-p-chlorphenylbutansäure.

19. (2RS ,3RS)-3-Amino-2-hydroxy-4-o-chlorphenylbutansäure.

20. (2RS,3RS)-3-Amino-2-hydroxy-4-p-methylphenylbutansäure.

21. (2RS, 3RS) ^-Amino^-hydroxy^-p-benzyloxyphenylbutansäurc

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22. Verfahren zur Herstellung eines Peptids der Formel

3 2 1 2¹ 1«

R₁ - CH - CH - CO - NH - CH - COOH

■ti 1

NH₂ OH R₂

worin R-. und R₂ die zuvor gegebenen Bedeutungen besitzen, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Nitrilderivat der Formel

R₁ - CH - CH - CN NH₂ OH

worin R₁ die zuvor gegebene Bedeutung besitzt, oder ein Nitrilderivat, dessen Aminogruppe geschützt ist, mit einer Säure zur Herstellung einer Aminosäure der Formel

R₁ - CH - CH - COOH NH₂ OH

worin R₁ die zuvor gegebene Bedeutung besitzt, hydrolysiert, gegebenenfalls nach Schutz der funktionellen Gruppe, die an der Reaktion nicht teilnehmen, die entstehende Aminosäure und eine Aminosäure der Formel

NH₉-CH-

COOH

R₂

worin R₂ die zuvor gegebene Bedeutung besitzt, nach einem üblichen Peptidkondensationsverfahren kondensiert und die Schutzgruppe entfernt.

23. Verfahren nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, daß R₁ eine Benzylgruppe oder substituierte Benzylgruppe bedeutet und R₂ eine Alkylgruppe oder eine Hydroxymethylgruppe mit 3 oder 4 Kohlenstoffatomen bedeutet.

24. Verfahren nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, daß R₁ eine Benzylgruppe und R₂ eine Alkylgruppe mit 4 Kohlenstoffatomen bedeuten.

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25. Verfahren nach einem der Ansprüche 22 bis 24, dadurch gekennzeichnet, daß für die Hydrolyse Chlorwasserstoffsäure, Bromwasserstoffsäure oder Schwefelsäure verwendet wird.

26. Verfahren zur Herstellung eines Antipoden, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Aminosäure der Formel

R₄ - CH - CH - COOH NH₂ OH

worin R₁ die zuvor gegebene Bedeutung besitzt, mit Benzyloxycarbonyl schützt, die so geschützte Aminosäure mit Brucin zur Herstellung eines Diastereoisomeren des Brucinsalzes umsetzt und das Diastereoisomer optisch in einem organischen Lösungsmittel spaltet.

27. Verfahren nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, daß R₁ eine Benzylgruppe bedeutet.

28. Verfahren nach Anspruch 26 oder 27, dadurch gekennzeichnet, daß als organisches Lösungsmittel Äthylacetat· verwendet wird.

29. Verfahren zur Herstellung einer Antipode , dadurch gekennzeichnet, daß man eine Aminosäure der Formel

R₁ - CH - CH - COOH

■ I t

NH₂ OH

worin R₁ die zuvor gegebene Bedeutung besitzt, mit Benzyloxycarbonyl schützt, die so geschützte Aminosäure in einem organischen Lösungsmittel aus der Gruppe Alkohole, Äther, Ester, Ketone, halogenierte Kohlenwasserstoffe, Dimethylformamid, Dimethylacetamid und Acetonitril löst, zu der entstehenden Lösung ein organisches Lösungsmittel aus der Gruppe Erdölkohlenwasserstoffe, aromatische Kohlenwasserstoffe, Hexan und Cyclohexan zur optischen Aufspaltung zugibt.

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30. Verfahren nach Anspruch 29, dadurch gekennzeichnet, daß R₁ eine Benzylgruppe bedeutet.

31. Verfahren nach Anspruch 29 oder 30, dadurch gekennzeichnet, daß als organische Lösungsmittel Äthylacetat und Petroläther verwendet werden.

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