DE2528984A1 - Bestatin und verfahren zu dessen herstellung - Google Patents
Bestatin und verfahren zu dessen herstellungInfo
- Publication number
- DE2528984A1 DE2528984A1 DE19752528984 DE2528984A DE2528984A1 DE 2528984 A1 DE2528984 A1 DE 2528984A1 DE 19752528984 DE19752528984 DE 19752528984 DE 2528984 A DE2528984 A DE 2528984A DE 2528984 A1 DE2528984 A1 DE 2528984A1
- Authority
- DE
- Germany
- Prior art keywords
- bestatin
- methanol
- soluble
- culture
- aminopeptidase
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
- C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
- C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Pain & Pain Management (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
Description
Bestatin und Verfahren zu dessen Herstellung
Die Erfindung betrifft einen Bestatin genannten Inhibitor für Aminopeptidase B, Leucin-aminopeptidase und Bleomycin-hydrolase,
sowie ein Verfahren zur Herstellung dieser biologisch wirksamen Substanzen mittels Fermentation und Extraktion.
Bestatin ist eine Substanz, die aus einer Kulturbrühe von Streptomyces isoliert wird und die interessante biologische
und physikalische Wirkungen zeigt. Bestatin hat im wesentlichen keine antibakterielle Wirksamkeit, zeigt aber eine schwache
Inhibierung des Zalienwachsturns bei Säugetieren einschließlich
von Krebszellen und eine starke Inhibierung von Aminopeptidase B, Leucin-aminopeptidase und Bleomycin-hydrolase. Aufgrund der
Inhibierung von Bleomycin-hydrolase zeigt es mit Bleomycin eine
starke synergistische Wirkung bei der Hinderung von Tumorbildungen. Demzufolge ist Bestatin nicht nur bei der Behandlung
von squamosen Zellkarzinomen durch Bleomycin sondern
509885/1295
auch bei der Analyse von biologischen Funktionen und Krankheitsprozessen
äußerst wichtig.
Die erfindungsgemäße Verbindung (und deren Salze), die die Hydrolysewirkung von Aminopeptidase B, Leucin-aminopeptidase
und Bleomycin-hydrolase inhibieren und die Antitumorwirksamkeit von Bleomycin steigern, hat die folgenden Eigenschaften: sie
ist löslich in Wasser, Essigsäure, Pyridin, Dimethylsulfoxid, Methanol und Äthanol, gering löslich in Propanol und Butanol
und praktisch unlöslich in Äthylacetat, Butylacetat, Äthyläther, Hexan, Petroläther, Benzol und Chloroform; sie hat
einen Schmelzpunkt von 203 bis 2O6°C, eine Linksdrehung von
[θ6Ϊρ2=-15,100 (c=0,861, Methanol) und zeigt eine starke
1 %
Endabsorption mit Maxima bei 241,5 nm (E1 =3,8), 248 nm
ι cm
(e]I =4,0)j 253 nm (E1J =5,0); 258 nm (eJ* =6,0), 264,5 nm
ι cm ι cm ι cm
1 % 1 %
(E' =4,6) und 268 nm (E' =2,7); sie zeigt eine positive Rydon-Smith- und Ninhydrin-Reaktion und eine negative
Sakaguchi-Reaktion und hat die folgenden Bänder im Infrarotbereich des Spektrums, wenn das Produkt mit Kaliumbromid
pelletisiert ist: 3400, 3300, 3200, 2920, 2850, 1685, 1635, 1530, 1400, 1315, 1265, 1245, 1175, 1125, 1100, 850, 735,
700 cm ; sie hat die aufgrund massenspektroskopischer Untersuchungen und Elementaranalysen gefundene allgemeine Formel
C16H24H3O4 (gef.: C 60,86 %, H 7,79 %, N 8,61 %); die Verbindung
ergibt L-Leucin und eine neue Aminosäure ((2S,3R)-3-Amino-
509885/ 1295
2-hydroxy-4-pheny!buttersäure), deren Struktur durch Röntgenkristallanalyse
des entsprechenden Hydrobromids geklärt wurde; die sauren Salze des Bestatins sind wasserlöslicher als
Bestatin. Die eine Inhibierung von Aminopeptidase B, Leucinaminopeptidase
und Bleomycin-hydrolase zeigende Verbindung hat die folgende Strukturformel, die sich aus NMR, Strukturen des
Hydrolyseproduktes und chemischer Synthese ergab:
-CH0-C—C—CO-NH-C-COOH
2II i H OH CH2
CH H3C CH3
Die vorliegende Erfindung umfaßt außer Bestatin auch dessen Salze. Die sauren Salze von Bestatin können leicht durch Zugabe
äquimolarer Säuren erhalten werden; die Salze wie Hydrochlorid, Acetat und dergleichen sind mehr wasserlöslich als Bestatin.
Fig. 1 zeigt das UV-Spektrum von Bestatin in Methanol.
Fig. 2 zeigt das Infrarotabsorptionsspektrum von Bestatin mit Kaliumbromid pelletisiert.
Gemäß Erfindung wird ferner ein Verfahren zur Herstellung von
Bestatin vorgeschlagen, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß man einen Bestatin erzeugenden Stamm von Streptomyces in
509885/1295
einer wässrigen Lösung, die Kohlenstoff- und Stickstofflieferanten
enthält, unter aeroben Bedingungen kultiviert, bis sich eine wesentliche Menge Bestatin in der Lösung angesammelt hat,
worauf man aus dieser das Bestatin extrahiert und isoliert.
Die Erfindung geht aus von der Annahme, daß Mikroorganismen Proteaseinhibitoren produzieren können; nachdem festgestellt
wurde, daß Leupeptin Trypsin inhibiert und Chymostatin Chymotrypsin inhibiert und ferner Pepstatin saure Proteasen
inhibiert und Phosphoramidon Metalloendopeptidasen inhibiert, wurde im Verfolg der Untersuchungen Bestatin in Kulturfiltraten
eines Streptomyces entdeckt. Darüber hinaus wurde festgestellt, daß Bestatin die enzymatische Inaktivierung von Bleomycin in
•Säugetierzellen inhibiert und den therapeutischen Bleomycineffekt bei squamosen Zellkarzinomen steigert. Nach H. Umezawa
in "Enzyme Inhibitors of Microbial Origin", Tokyo Press, Bunkyo-ku, Tokio 1972, erhält man Proteaseinhibitoren von
verschiedenen Streptomycesarten. Das gleiche gilt bezüglich
Bestatin.
Im folgenden werden die Eigenschaften eines typischen Bestatin erzeugenden Stammes beschrieben, wobei die Angaben in () dem
Farbstandard gemäß "Color Harmony Manual" der "Container Corporation of America" entsprechen. Die Charakteristika des
Stammes MD976-C7 sind:
509885/1295
Der Stamm wurde isoliert aus einer Erdprobe, die bei Kaitamura-Nishino,
Kisogun, Nagano, entnommen und am 18. Mai 1974 unter der Nummer 2590 in Kogyo Gijutsuin Hakko Kenkyusho deponiert
wurde. Dieser Stamm wurde bei der American Type Culture Collection hinterlegt und der folgenden Nummer zugeordnet: ATCC 31159.
Mikroskopisch sind die Substratmycelen wohlverzweigt und besitzen Luftfäden oder Hypae bzw. Hyphen ohne Spiralformen
jedoch in Schneckenformen. Die Oberfläche der Sporen ist glatt.
Die Eigenschaften in den verschiedenen Medien ist wie folgt:
(1) Auf einem Sucrose/Nitrat/Agarmedium bei 27°C gereift ist das Wachstum schlecht und farblos; weiße (a, White) Luftmycelen
entwickeln sich gering; kein lösliches Pigment.
(2) Auf einem Glucose/Asparagin/Agarmedium bei 27°C kultiviert
ist die Pilzkultur blaßgelbbräunlich (1 2/2 ic, Lt Antique Gold) und weiß (a, White) bis grauweiß (b, Oyster White); Luftmycelen
entwickeln sich; kein lösliches Pigment.
(3) Auf Glycerin/Asparagin/Agarmediüm (ISP-5 bei 27°C kultiviert)
ist die Pilzkultur blaßgelbbraun (1 1/2 ic, Lt Antique Gold) und um diese entwickeln sich weiße (a, White) bis grauweiße
(b, Oyster White) Luftmycelen; kein lösliches Pigment.
50908 6/12 CJ S
(4) Auf anorganischem Salze/Stärke/Agarmedium (ISP-4 bei 27°C
ist die Pilzkultur blaßgelbbraun (1 1/2 ic, Lt Antique Gold) bis gelbbraun (2 Ic, Gold); auf der Kultur entwickeln sich
hellbräunlich-graue (4 ec, Bisque Lt Rose Beige) Luftmycelen; kein lösliches Pigment.
(5) Auf Tyrosin/Agarmedium (ISP-7 bei 27°C) ist die Pilzkultur
blaßgelb (1 1/2 ia, Sunlight Yellow, Daffodil, Forsythia, Jonquil) bis blaßgelblichbraun (1 1/2 ic, Lt Antique Gold)
und auf der Kultur entwickeln sich grauweiße (b, Oyster White) Luftmycelen; kein lösliches Pigment.
(6) Auf Pepton/Fleischextrakt/Agarmedium (kultiviert bei 27°C) ist die Pilzkultur blaßgelblichbraun (1 1/2, Lt Antique
White), um die Kultur entwickeln sich grauweiße (b, Oyster White) Luftmycelen; geringe Produktion von einem gelbbraunen
löslichen Pigment.
(7) Auf Hefeextrakt/Malzextrakt/Agarmedium (ISP-2, kultiviert
bei 27°C) ist die Pilzkultur trüb gelb (2 Ic, Gold) bis gelblichbraun (2 pg, Mustard Gold); auf der Kultur entwickeln sich
grauweiße (b, Oyster White) bis hellbräunlichgraue (4 ec.
Bisque, Lt Rose Beige) Luftmycelen, geringe Produktion eines blaßgelbbraunen löslichen Pigments.
509885/1295
(8) Auf Weizenmehl/Agarmedium (ISP-3 bei 27°C kultiviert) ist
die Pilzkultur blaßgelb (1 1/2 ia, Sunlight Yellow, Daffodil, Forsythia, Jonquil) und auf der Kultur entwickeln sich gering
grauweiße (bf Oyster White) Luftmycelen; kein lösliches Pigment.
(9) Auf Calciummaleat/Agarmedium (bei 27 C) ist die Kultur farblos und auf der Kultur entwickeln sich weiße (a, White)
Luftmycelen; kein lösliches Pigment.
(10) Auf Glucose/Pepton/Geratin/Agarstab bildet sich eine
gelbbraune (2 Ic, Gold) Kultur auf der sich hell-bräunlichgraue (4 ec, Bisque, Lt Rose Beige) Luftmycelen entwickeln;
es wird ein braunschwarzes lösliches Pigment produziert.
(11) Auf einem Milchmedium wird bei 27°C eine blaßgelbe
(1 1/2 ia, Sunlight Yellow, Daffodil, Forsythia, Jonquil) bis blaßgelblichbraune (1 1/2 ic, Lt Antique Gold) Kultur erhalten,
auf der keine Luftmycelen sich entwickeln; es wird ein blaßgelblichbraunes Pigment erzeugt.
(12) Auf Pepton/Hefeextrakt/Eisen/Agarmedium (ISP-6, bei 27°C)
wird eine dunkelbraun-graue (3 Ii, Beaver) Kultur erhalten, auf der eine geringe Entwicklung von grauweißen (b, Oyster
White) Luftmycelen festgestellt wurde; es wird ein braunschwarzes Pigment erzeugt.
0 9 8 8 5/1295
Physiologische und biochemische Eigenschaften:
1) Wachstumstemperatur: Die Kultur wächst auf einem Maltose/
Hefeextrakt/Agarmedium in einem Bereich von 15 bis 37 und vorzugsweise 22 bis 32 C.
2) Verflüssigung von Gelatine: Auf einem Glucose/Pepton/ Gelatinemedium bei 20 C wurde keine Verflüssigung von
Gelatine beobachtet.
3) Hydrolyse von Stärke (untersucht auf einem anorganischen Salz/Stärke/Agarmedium ISP-4 bei 27°C): Nach vier Tagen
wurde eine Hydrolyse von mittlerer Stärke beobachtet.
4) Koagulation und Peptisierung von Milch (untersucht bei 37 C): Vollständige Koagulation trat nach drei Tagen
auf und anschließend wurde eine mittelstarke Peptisierung beobachtet.
5) Erzeugung von Melanoidpigment: untersucht wurde die Pigmentbildung
in den folgenden Medien bei 27°C:
Tryptone/Hefeextrakt-Brühe (ISP-1): positiv
Peptone/Hefeextrakt/Eisen/Agarmedium (ISP-6): positiv Tyrosine/Agarmedium (ISP-7): negativ
509885/1295
6) Einsatz von Kohlenstofflieferanten (untersucht an einem
Pridham Gottlieb-Medium): Glucose und Fructose wurden aufgenommen und ergaben ein gutes Wachstum; L-Arabinose,
D-Xylose, Sucrose, L-Rhamnose, Raffinose und D-Mannitol
wurden nicht aufgenommen. Die Inositolaufnähme war zweifelhaft.
7) Hydrolyse von Calciummaleat: Auf einem Calciummaleat/ Agarmedium bei 27 C wurde keine Hydrolyse festgestellt.
8) Nitratreduktion: Mit einem 1 % Nitrat/Pepton/Wasser bei 27°C wurde eine negative Reduktion erhalten.
Die obigen Eigenschaften können wie folgt zusammengefaßt werden: Der Stamm MD976-C gehört zu Streptomyces, der auf Sucrosenitrat/Agarmedium
und mit Glucose versetztem Pridham Gottlieb-Medium schneckenförmige aber nicht spiralförmige Mycelen bildet;
die Sporenoberfläche ist glatt. Auf verschiedenen Medien ist das Wachstum blaßgelb, blaßgelblichbraun oder stumpfbraun und
die Luftmycelen auf der Kultur sind weiß, hellbraungrau oder grau-weiß; gelegentlich wird ein blaßgelbbraunes Pigment erzeugt.
Melanoidpigment wird in einem organischen Stickstoffmedium
aber nicht: in Tyrosin/Agar produziert; eine schwache proteolytische Aktivität ist vorhanden sowie eine mittlere
Stärkehydrolyse. Ein Vergleich dieser Eigenschaften mit denen
509885/1295
bekannter Stämme zeigt, daß der Stamm MD976-C eng verwandt
mit Streptomyces olivoreticuli ist, wie er von Arai et al in "Antibiotics and Chemotherapy", 7, 435-442, 1957, beschrieben
ist. Die Beschreibung dieser Arten, der ISP-Typ Kultur 5105 und des Stammes MD976-C wurden direkt verglichen und
es wurde bestätigt, daß kein wesentlicher Unterschied zwischen dem Stamm MD976-C4 und Streptomyces olivoreticuli besteht,
so daß dieser Stamm in dieser Gattung eingeordnet wurde.
Da Inhibitoren für alle Proteasen durch verschiedene Arten von Streptomyces erzeugt werden und die Erzeugung nicht auf
eine einzige Art beschränkt ist, wird im vorliegenden Fall anstelle der Namen der obigen Arten das Produkt als Bestatin
erzeugender Streptomyces bezeichnet.
Zur Bestimmung der Aktivität von Aminopeptidase B inhibierendem Bestatin wurde die Methode von V.K. Hopusu, K.K. Makinen
und G.G. Glenner in Archives of Biochemistry and Biophysics, 114, 557, 1966 wie folgt modifiziert: Zu einer Mischung aus
0,3 ml von 1 mM Arginin-ß-naphthylamid und 1,0 mM von 0,1 M
Tris-hydrochloridpuffer (pH =7,0) wurden 0,7 ml destilliertes
Wasser mit oder ohne Untersuchungsmaterial gegeben und dann drei Minuten auf 37°C erwärmt. Die Reaktion wird durch Zugabe
von 0,2 ml Aminopeptidase B-Lösung ausgelöst, die durch eine Sephadex 1OO-Chromatographie wie bei Hopusu et al beschrieben,
. 509885/ 1 295
hergestellt wurde. Nach 30 Minuten bei 37 C wurden 0,6 ml eines 1,0 molaren Acetatpuffers (pH = 4,2) zugegeben, der
1,0 mg/ml eines Diazoniumsalzes von o-Aminoazotoluol und 1 %
"Tween 20" enthielt. Nach 15 Minuten Aufbewahren bei Zimmertemperatur
wurde die Absorption (a) bei 530 nm mit einem Spektrophotometer gemessen. Als Kontrolle wurde die Absorption
(b) auf ähnliche Weise nach der Reaktion in Abwesenheit von Bestatin bestimmt. Die prozentuale Inhibierung wird nach der
Formel (b-a)/b.iOO berechnet. Die 50 % Inhibitionsdosis (ID^0)
des Bestatinkristalls betrug 0,1/ug.
Ein Bestatin erzeugender Stamm erzeugt nach Kultivierung unter geeigneten Bedingungen Bestatin. Für die Bestatin-Erzeugung
ist die Kultivierung auf einem festen Medium möglich, jedoch wird zur Erzeugung von größeren Mengen eine Kultur in flüssigem
Medium bevorzugt. Zur Erzeugung von Bestatin kann man bei jeder Fermationstemperatur arbeiten, innerhalb der der
Bestatin erzeugende Organismus wachsen kann, wobei allerdings 25 bis 35 C bevorzugt werden. Zur Erzeugung von Bestatin
können Medien benutzt werden, die als Nährboden für Actinomyceten bekannt sind, wie beispielsweise handelsübliche Produkte
wie Pepton, Fleischextrakt, Hefeextrakt, Maisquellbrühe, Baumwollsaatmehl, Sojabohnenmehl, N-Z-Amin, Casein, Natriumnitrat,
Ammoniumnitrat, Ammoniumsulfat und andere Stickstoff
509885/1295
enthaltende Produkte wie die äußeren Hüllen von Weizen und Reis, Fischmehl und dergleichen. Als Kohlenstofflieferant
können Lactose, Glycerin, Sucrose, Stärke, Glucose, Maltose, Melasse und andere Kohlenwasserstoffe oder Fette in reiner
oder roher Form verwendet werden. Ferner können Natriumchlorid, Natrium- oder Kaliumphosphat, Calciumcarbonat oder Magnesiumionen
liefernde Salze zugesetzt werden sowie letztlich alle Stoffe, die für Actxnomycetenkulturen geeignet sind.
Die Fermentation wird durchgeführt bis sich genügend Bestatin angesammelt hat. Beispielsweise wurde ein Stamm MD976-C in
ein Medium aufgeimpft, das 0,3 % NaCl, 0,1 % MgSO4.7H2O, 0,1 %
K9HPO4, 0,1 ml/100 ml Metallösung, organische Stickstofflieferanten
und Kohlenstofflieferanten enthielt. Als Stickstofflieferant
wurde das Medium mit den folgenden Produkten versetzt: 0,75 % Fleischextrakt und 0,75 % Pepton; 1,0 % N-Z-Amin
und 0,2 % Hefeextrakt; 1,5 % Sojabohnenmehl. Als Kohlenstofflieferanten
wurden dem Medium die folgenden Stoffe zugesetzt: 2,0 % Glycerin; 2,0 % Lactose; 1,0 % Glucose und 1,0 % Lactose.
Die Metallösung hatte die folgende Zusammensetzung:
CuSO4.5H2O 700 mg
FeSO4.7H2O 100 mg
MnCl2.4H2O 800 mg
ZnSO4.7H2O 200 mg
destilliertes Wasser 100 ml
509885/1295
Es wurden Schüttelkolben mit einem Volumen von 500 ml jeweils
mit 100 ml der betreffenden Medien versetzt und bei Temperaturen von 27 bis 29 C auf einer Schüttelvorrichtung mit einer
Amplitude von 8 cm und 200 Gängen je Minute geschüttelt. Nach zwei Tagen wurde eine Bestatinentwicklung festgestellt, wobei
eine maximale Ausbeute zwischen dem zweiten und sechsten Tag des Bebrütens erzielt wurde. Bei Anwesenheit von Stickstofflieferanten
wurden die besseren Ausbeuten mit Kulturen erzielt, die 0,75 % Fleischextrakt und 0,75 % Pepton, 1 % N-Z-Amin und
0,2 % Hefeextrakt oder 1,5 % Sojabohnenmehl enthielten, während
die Ausbeute mit 1,5 %iger Maisbrühe weniger gut war. Bestatin wurde in jedem Medium erzeugt, das Glycerin, Lactose oder
Glucose enthielt, wobei die Ausbeuten in diesen Medien kaum voneinander abwichen.
Während der Fermentation konnte keine Abnahme an Bestatin im Medium festgestellt werden, was dessen Stabilität untermauert.
Zur Bestatinerzeugung durch Fermentation können die für Antibiotika
üblichen Verfahren verwendet werden. Beispielsweise kann ein Medium von 100 bis 150 Liter j η einem Kessel aus rostfreiem
Stahl von 200 Liter sterilisiert und mit einem Bestatin erzeugenden Organismus beimpft werden, wobei die Fermentation
durch Belüftung mit 200 Litern steriler Luft je Minute und einer Rührgeschwindigkeit von 200 U/Min, erfolgte. Nach 48 bis
50988B/1295
72 Stunden erreichte die Bestatinerzeugung den Höchstwert.
Bestatin ist eine stabile Verbindung, bei der kein Aktivitätsabfall beobachtet wurde, wenn das Bestatin enthaltende Filtrat
der Kultur auf einen pH-Wert von 2,0 oder einen pH-Wert von 9,0 gebracht und 30 Minuten bei 60°C erhitzt wurde.
In der Kulturbrühe enthalten sowohl die flüssigen Teile als auch die festen Anteile Bestatin. Aus den festen Bestandteilen,
das heißt aus dem Mycelkuchen, kann das Bestatin mit Äthanol extrahiert werden. Wenn die Fermentationsausbeute an
Bestatin gesteigert wird, steigt das Verhältnis des Bestatingehaltes im Mycelkuchen zu dem des Filtrats an.
Da Bestatin eine stabile Verbindung ist, kann das Kulturfiltrat
durch Destillation vorzugsweise unter verringertem Druck konzentriert werden; aus der konzentrierten Lösung oder aus dem
getrockneten Rückstand kann das Bestatin mit organischen Lösungsmitteln wie Methanol, Äthanol, Butanol und dergleichen
extrahiert werden, also mit Lösungsmitteln, in denen Bestatin hinreichend löslich ist. Die das Pilzmycel enthaltende Kulturlösung
kann mit einem mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel wie Propanol, Butanol oder Amylalkohol extrahiert werden,
wobei das Bestatin aus den flüssigen Anteilen und dem Pilzmycel
509885/1295
gleichzeitig extrahiert wird. Wenn große Mengen des Kulturfiltrats
mit organischen Lösungsmitteln extrahiert werden sollen, wird Butanol bevorzugt. Zur Reinigung von Bestatin
kann man im Gegenstromverfahren arbeiten. Rohbestatin kann
man durch Konzentrierung der Lösungsmittelextrakte unter verringertem Druck erhalten. Gewöhnlich enthält dieses Rohprodukt
mehr als 1 % Bestatin. Die Reinheit schwankt je nach der in dem Kulturfiltrat erzeugten Bestatinmenge.
Zur Extraktion und Reinigung von Bestatin kann man auch nach dem Adsorptionsverfahren arbeiten, wobei Aktivkohle, Ionenaustauscherharze,
Aluminiumoxid, Kieselgel und dergleichen verwendet werden. Beispielsweise kann das Bestatin aus Kultur-.filtraten
durch Aktivkohle adsorbiert und anschließend mit Wasser gewaschen werden, wobei Bestatin mit Methanol oder
wässrigem Methanol eluiert wird. Durch Temperaturerhöhung steigt die Ausbeute bei der Eluierung. Beispielsweise wurde
das Kulturfiltrat mit 2 % Aktivkohle versetzt, die anschließend zweimal mit dem 20-fachen Volumen Methanol bei 400C unter
Rühren behandelt wurde. Die Ausbeute an eluiertem Bestatin betrug etwa 80 %. Rohes Bestatinpulver kann durch Konzentrieren
des Methanolextraktes unter verringertem Druck erhalten werden. Zur Reinigung von Bestatin kann man chromatographisch
mit Aluminiumoxid oder Kieselsäuregel arbeiten, wobei Kieselgelsäulen für die letzte Reinigung besonders geeignet sind.
509885/ 1295
In diesem Fall kann man besonders gut mit einem Gemisch aus
n-Butanol/Essigsäure/Wasser/Butylacetat in einem Volumenverhältnis
von 4:1:1:6 arbeiten. Das so erhaltene Bestatin kann aus einem geeigneten organischen Lösungsmittel wie Methanol/
Benzol kristallisiert werden. Wenn Ionenaustauscherharze zur Reinigung von Bestatin verwendet werden, werden am besten
starke und schwache Kationenaustauscherharze eingesetzt.
starke und schwache Kationenaustauscherharze eingesetzt.
Die Eigenschaften des Bestatin sind wie folgt: Bestatin
kristallisiert in Form von weißen nadelartigen Kristallen und besitzt einen Schmelzpunkt von 203 bis 206 C. Es ist optisch aktiv und hat in 0,861 %iger Methanollösung einen 0^n -Wert von -15,1°. Die Werte der Elementaranalyse für c-icH24N2°4 s^-n^ wie folgt:
kristallisiert in Form von weißen nadelartigen Kristallen und besitzt einen Schmelzpunkt von 203 bis 206 C. Es ist optisch aktiv und hat in 0,861 %iger Methanollösung einen 0^n -Wert von -15,1°. Die Werte der Elementaranalyse für c-icH24N2°4 s^-n^ wie folgt:
berechnet: C = 62,32, H = 7,82, N = 9,08, 0 = 20,75;
gefunden: C = 60,86, H = 7,79, N = 8,61, 0 = 21,06.
gefunden: C = 60,86, H = 7,79, N = 8,61, 0 = 21,06.
Die Molekularformel wurde massenspektroskopisch bestimmt. Das
UV-Absorptionsspektrum von Bestatin mit einer Konzentration
von 500,ug/ml in Methanol ist in Fig. 1 gezeigt.
Das in Fig. 2 gezeigte Infrarotabsorptionsspektrum hat die
folgenden Banden: 3400, 3300, 3200, 2920, 2850, 1685, 1635, 1530, 1400, 1315, 1265, 1245, 1175, 1125, 1100, 850, 735, 700 cm"1. Die magnetischen Kernresonanzwerte bzw. das NMR-Spektrum von
folgenden Banden: 3400, 3300, 3200, 2920, 2850, 1685, 1635, 1530, 1400, 1315, 1265, 1245, 1175, 1125, 1100, 850, 735, 700 cm"1. Die magnetischen Kernresonanzwerte bzw. das NMR-Spektrum von
5 09885/12 95
Bestatin wurde mittels eines Varian HA-100 Apparates in Tetradeut
eromethanol unter Verwendung von Trimethylsilan als innerer Standard bestimmt, wobei die folgenden Signale erhalten wurden:
0,9 - 1,05 (6H), 1,6 - 1,8 (3H), 2,9 - 3,15 (2H), 3,6 - 3,9 (1H), 4,13 - 4,2 (1H), 4,3 - 4,55 (1H), 7,35 (5H).
Die Hydrolyse von Bestatin in 6 normaler HCl ergab bei 100°C
nach 18 Stunden L-Leucin und eine ungewöhnliche Aminosäure,
wobei das Verhältnis der Aminosäuren 1:1 war. Bestatin ergibt positive Rydon-Smith und Ninhydrin-Reaktionen. Die Aminosäure-Polge
des Bestatin in der Struktur wurde durch Bruchstückmuster im Massenspektrum von Bestatinmethylesterhydrochlorid
aufgeklärt, und zwar als (2S,3R) -S-Amino^-hydroxy^-phenylbutyry1-L-leucin.
Wegen der Carboxylgruppe lassen sich Ester von Bestatin leicht synthetisch herstellen, indem man Bestatin mit Alkoholen unter
üblichen Bedingungen behandelt. Ebenfalls kann Bestatinamid auf übliche Weise hergestellt werden. N-Acyl-Derivate lassen
sich herstellen, indem man Bestatin mit einem Säureanhydrid oder einem Säurechlorid behandelt. Bestatin ist in Essigsäure,
Pyridin, Dimethylsulfoxid, Methanol, Äthanol und Wasser löslich, in Propanol und Butanol gering löslich und in Äthylacetat,
Butylacetat, Äthyläther, Hexan, Petroleumäther, Benzol und Chloroform kaum löslich. Die Zugabe von Säuren in äquimolaren
5Q9885/1295
Mengen führt zu sauren Salzen des Bestatin, die in Wasser leichter löslich sind als Bestatin selbst.
Es wurden die folgenden Rf-Werte mit einer Dünnschichtchromatographie
unter Verwendung von Kieselsäuregel G mit den folgenden Lösungsmitteln bestimmt:
Butylacetat/Butanol/Essigsäure/Wasser (4:4:1:1) 0,24 Butylacetat/Butanol/Essigsäure/Wasser (6:4:1:1) 0,13
Bei einer Hochspannungselektrophorese mit einem sauren Lösungsmittel
wie Ameisensäure/Essigsäure/Wasser (Volumenverhältnis 25:75:900) ergab sich bei 3500 Volt im Verlaufe von 15 Minuten
eine Bewegung von Bestatin zur Kathode mit einem Rm-Wert von 0,68, wobei L-Alanin als 1,0 zugrunde gelegt wurde.
Bestatin zeigt eine 50 %ige Inhibierung von Aminopeptidase B von Rattenleber und Leucinaminopeptidase von Schweinenieren
bei Konzentrationen von O,O55,ug/ml bzw. 0,01 ,ug/ml. Dennoch
zeigt Bestatin eine nur schwache Inhibierung gegenüber Aminopeptidase A aus menschlichem Serum, nämlich 26,4 % Inhibierung
bei 100/ug/ml. Bestatin hat eine geringe Toxizität und eine
intraperitoneale Injektion von 295 mg Bestatin je kg Gewicht,
zeigte bei Mäusen keine toxische Wirkung.
&098 8S/T29 5
Die Art der Inhibierung von Aminopeptidase B und Leucinaminopeptidase
durch Bestatin ist vergleichbar mit Substraten wie L-Arginyl-ß-naphthylamid oder L-Leucyl-ß-naphthylamid, wobei
der Ki-Wert 6 χ 10 M und 2 χ 10 M war. Die Zugabe von Bestatin
in einer Menge von 6,25 ,ug/ml zu einer Gewebekultur steigerte
die Aktivität von Bleomycin bei der Inhibierung von Yoshida-Rattensarkomzellen
um das 4- bis 8-fache. Gleichzeitige tägliche subcutane Injektionen von 5 mg/kg Bestatin mit 5 mg/kg
Bleomycin steigerten den Bleomycineffekt bei mit Methylcholanthren
induzierten squamosen Zellkarzinomen von Ratten um das 4-fache.
100 ml eines Mediums mit einem Gehalt von 2 % Glucose, 2 % Stärke, 2 % Sojabohnenmehl, 0,5 % Hefeextrakt, 0,25 % NaCl,
0,32 % CaCO3, 0,0005 % CuSO4.5H2O, 0,0005 % MnCl2.4H2O und
0,05 % ZnSO..7H2O wurden in einem 500 ml Schüttelkolben 20 Minuten
bei 120°C sterilisiert; der pH-Wert wurde nach der Sterilisation
auf 7,0 eingestellt. Dieses Medium wurde mit auf Agar gezogenen Sporen und Mycelen des Stammes MD976-C7 beimpft und
bei 27°C mit einer Schüttelfrequenz von 180 U/Min, gereift. Die Schüttelkultur hatte am ersten Tag einen pH-Wert von 6,5,
der sich im folgenden auch nicht änderte. Die Bestimmung von reduzierendem Zucker nach der Anthron-Methode zeigte eine
optische Dichte von 0,855/0,01 ml am zweiten Tag und von
509885/12 95
0,79/0,01 ml am fünften Tag. Die maximale Produktion von
Bestatin wurde in fünf Tagen erreicht und blieb 10 bis 12 Tage
danach erhalten. Die Kulturbrühe von 50 Schüttelflaschen wurde am fünften Tag filtriert und mit 2 normaler HCl auf einen pH-Wert
von 2,0 eingestellt. Der Niederschlag wurde entfernt und das Filtrat wurde nacheinander einmal mit 2400 ml und dann mit
2000 ml n-Butanol extrahiert. Die vereinigten Butanolextrakte wurden unter verringertem Druck abgedampft, wobei ein braunes
Rohpulver in einer Menge von 2,5 g erhalten wurde. Es wurde eine 50 %ige Inhibierung von Aminopeptidase B erhalten, wenn
man 57 ,ug dieses Pulvers der Testlösung zusetzte.
In einem 30-Liter-Produktionsfermenter wurden 15 Liter Nährlösung
mit 1 Liter einer in dem Medium gemäß Beispiel 1 nach drei Tagen erhaltenen Schüttelkultur des Stammes MD976-C7 beimpft.
Das Nährmedium enthielt 1,5 % Maltose, 0,3 %.Hefeextrakt, 1,0 % N-Z-Ämin, 0,3 % NaCl. Es wurde zwei Tage bei 30°C mit
15 Litern/Minute belüftet und mit 250 U/Min, gerührt. 0,04 ml des Kulturfiltrats erzeugten eine 50 %ige Inhibierung von
Aminopeptidase.
Am zweiten Tag wurden die Kulturbrühen von vier Fermentern filtriert; das Filtrat wurde durch eine vier Liter fassende
Säule mit einem Durchmesser von 10 cm mit Amberlite XAD-4
5Q988S/12 95
geführt. Anschließend wurde die Säule mit destilliertem Wasser gewaschen. Das Bestatin wurde mit vier Liter Methanol eluiert.
Das Eluat wurde unter verringertem Druck eingedampft, wonach das getrocknete Produkt in 2 Liter destilliertem Wasser
aufgelöst und nach Einstellung des pH-Wertes auf 2,0 mit 2 Litern n-Butanol extrahiert wurde. Nach Waschen mit destilliertem
Wasser wurde die Butanollösung unter verringertem Druck abgedampft, wobei 30 g eines Rohpulvers erhalten wurden.
Eine Zugabe von 21 ,ug dieses Pulvers ergab eine 50 %ige Inhibierung von Aminopeptidase B.
Zur weiteren Reinigung von Bestatin in einem Rohpulver gemäß Beispiel 2 wurden 30 g des Pulvers in 3 Liter einer 0,2 molaren
Pyridin/Essigsäure/Puffer-Mischung (pH 3,0) gelöst und auf 500 ml Dowex 50 X8 (Maschenzahl 100 bis 200) gegeben, wobei
mit 0,2 molarem Pyridin/Essigsäure (pH 3,0) ausgeglichen und mit 2 Liter des gleichen Puffers gewaschen wurde. Die abgestufte
Eluierung erfolgte zwischen 1,0 Liter 0,2 molarer Pyridin/Essigsäure (pH 3,0) und 1,0 Liter 1,0 molarer Pyridin/
Essigsäure (pH 4,75). Die aktiven Fraktionen wurden aufgenommen und unter verringertem Druck konzentriert, wobei ein
Rohpulver in einer Menge von 2,6 g anfiel. Um bei einer Testlösung eine 50 %ige Inhibierung von Aminopeptidase B zu erhalten,
genügten 2 ,ug.
50988 i>/1295
Das gemäß Beispiel 3 erhaltene Rohpulver wurde in 5 ml Methanol
awtgelöst λχηο. au.£ ei_n.<a Λ , 5 Liter Sephadex LH-2O Säule gegeben
und mit Methanol eluiert. Die aktiven Fraktionen wurden unter verringertem Druck konzentriert, wobei ein hellgelbes Pulver
in einer Menge von 0,5 g anfiel, das in einer Menge von 0,4 ,ug eine 50 %ige Inhibierung von Aminopeptidase B erzielte.
Das leicht gelbliche Pulver gemäß Beispiel 4 wurde mit einer Kieselsäuregelkolonne chromatisch mittels Butylacetat/Butanol/
Essigsäure/Wasser in einem Volumenverhältnis von 6:4:1:1 getrennt. Die gesammelten Fraktionen wurden unter verringertem
Druck konzentriert, wobei ein weißes Pulver anfiel, das in geringer Menge Methanol gelöst wurde und durch Zutropfen von
Äthylacetat auskristallisierte. Es wurden weiße Kristallnadeln von Bestatin erhalten, die in einer Menge von 0,10,ug eine
50 %ige Inhibierung von Aminopeptidase B ergaben.
20 mg Bestatin wurden in 20 ml Methanol gelöst und mit 0,5 ml konzentrierter Salzsäure versetzt und sechs Stunden bei 40 C
gerührt. Diese Lösung wurde unter verringertem Druck konzentriert und mit einer geringen Menge Methanol aufgenommen und
anschließend in einer Sephadex LH-20 Säule mit Methanol als
509885/12 95
Lösungsmittel chromatographisch gereinigt. Die aktiven Fraktionen wurden unter verringertem Druck konzentriert, wobei
weiße Kristalle erhalten wurden, die wiederum in einer kleinen Menge Methanol gelöst und durch Zutropfen von Äthylacetat auskristallisiert
wurden. Es wurden 15 mg an weißen nadeiförmigen Kristallen mit einem Schmelzpunkt von 213 bis 216°C erhalten,
die in einer Menge von 8,4 ,ug eine 50 %ige Inhibierung von Aminopeptidase B bewirkten. Durch Infrarotanalyse und NMR-Spektrum
wurde bestätigt, daß es sich hier um den Methylester von Bestatin handelte.
Eine Lösung von 20.mg Bestatin in 4 ml Methanol wurde mit 2 ml
Essigsäureanhydrid versetzt und zwei Tage bei Zimmertemperatur gerührt. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 10 ml destilliertem
Wasser unterbrochen, das Reaktionsgemisch unter verringertem Druck getrocknet und als Endprodukt ein roher N-Acetyl-bestatinmethylester
erhalten. Dieser Ester wurde in Methanol gelöst und in einer Sephadex LH-20 Säule gereinigt. Die Struktur des
reinen Esters wurde durch IR, NMR und massenspektrometrisch bestimmt. Der ID^-Wert für Aminopeptidase B betrug 8/Ug. Eine
Modifizierung von endständigen C- und/oder N-Gruppen des
Bestatin verringerte die Inhibierungsaktivität von Aminopeptidase B.
50988b/ 1 295
Eine Nährlösung von 300 Litern mit einem Gehalt von 2 % Glycerin, 1 % Polypepton, 0,2 % Hefeextrakt, 0,3 % NaCl, 0,1 % K2HPO4,
0,1 % MgSO4.7H2O, 0,0007 % CuSO4.5H2O, 0,0001 % FeSO4^H3O,
0,0008 % MnCl2.4H2O, 0,0002 % ZnSO^H3O, 0,1 % L-Leucin, 0,1 %
L-Phenylalanin und 0,01 % eines schaumverhindernden Mittels
(KM-72) wurde in einem 570 Liter fassenden Behälter aus rostfreiem Stahl 30 Minuten bei 115 C sterilisiert. Diese
Nährbrühe wurde mit 6 Litern einer drei Tage geschüttelten Schüttelkultur des Stammes MD976-C7 beimpft und 96 Stunden
bei 29°C fermentiert, wobei mit 300 Litern/Minute belüftet und mit einer Umdrehung von 230 je Minute gerührt wurde. Die
Kulturbrühe wurde filtriert, wobei 285 Liter Filtrat mit einem pH-Wert von 6,3 und einem IDn. -Wert von 0,05 ml erhalten wurden.
Diese Brühe wurde mit HCl auf einen pH-Wert von 2,8 eingestellt und anschließend mit 150 Liter Butanol extrahiert. Der
Butanolextrakt wurde bei verringertem Druck auf 98 Liter konzentriert und mit Wasser bei einem pH von 8,45 gewaschen. Die
Butanolschicht wurde unter verringertem Druck getrocknet, wobei 101,9 g eines rohen pulvrigen Produktes mit einem ID5 -Wert
von 26 ,ug erhalten wurden.
Das gemäß Beispiel 8 erhaltene Rohpulver wurde analog Beispiel 3 und 4 gereinigt, wobei 90,5 g des rohen Pulvers in 150 ml
50988b/ 1295
Methanol gelöst und mit Dowex 50 X8 (1500 ml mit einer Maschenzahl
von 100 bis 200) chromatographisch getrennt wurden, wo das Gleichgewicht mit 0,2 molarer Pyridin/Essigsäure (pH-Wert
von 3,0) eingestellt und mit einem linearen Gradienten zwischen 3 Liter 1,0 molarer Pyridin/Essigsäure (pH 3,0) und 3 Liter
1,0 molarer Pyridin/Essigsäure (pH 4,75) gearbeitet wurde. Die aktiven Fraktionen wurden unter verringertem Druck konzentriert,
wobei 3,89 g Rohpulver mit einem ID5O-Wert von 1,35,ug
gegen Aminopeptidase B erhalten wurden. Durch weitere Reinigung dieser Lösung mit einer Sephadex LH-20 Säule (2,6 Liter) mit
Methanol und Eluieren mit Methanol, Konzentrieren der aktiven Fraktion unter verringertem Druck wurde ein hellgelbes Pulver
in einer Menge von 1,66 g mit einem ID5 -Wert von O,52,ug
gegenüber Aminopeptidase B erhalten.
Das gemäß Beispiel 9 erhaltene rohe Pulver wurde analog Beispiel 5 gereinigt, indem 1,66 g des gelblichen Pulvers in 150 ml
Methanol gelöst und mit Kieselsäuregel vermischt wurden. Nach Entfernung des Methanols durch Abdampfen unter verringertem
Druck wurde das Pulver auf Silicagel (5 χ 40 cm) mit Butylacetat/Butanol/Essigsäure/Wasser
in einem Volumenverhältnis von 6:4:1:1 in Gleichgewicht gebracht und mit dem gleichen
Lösungsmittel eluiert. Die aktiven Fraktionen wurden unter verringertem Druck konzentriert und aus Methanol/Äthylacetat
50988b/ 1295
umkristallisiertf wobei 185 mg weiße Kristallnadeln anfielen.
Der IDc -Wert gegenüber Aminopeptidase B betrug 0,1 ,ug.
Die Erfindung erfaßt außer dem Bestatin noch die sauren Additionssalze von Bestatin mit anorganischen und organischen
Säuren wie Salzsäure, Schwefelsäure, Essigsäure, Bernsteinsäure und dergleichen sowie Ester von Bestatin wie die Methyl-,
Äthyl-, Butyl-, Isobutyl-Ester. Für therapeutische Zwecke
sind die leichter wasserlöslichen Salze geeignet, während die gegenüber Bestatin in Wasser unlöslicheren Salze und Ester,
die in organischen Lösungsmitteln leichter löslich sind, zum Extrahieren und Reinigen geeignet sind. Diese können mit Bleomycin
zur Wirkungssteigerung vermischt werden.
50988S/1295
Claims (1)
- PatentansprücheBestatin, das Aminopeptidase B, Leucin-aminopeptidase und Bleomycin-hydrolase inhibiert und die Wirkung von Bleomycin gegen squamose Zellkarzinome steigert und die folgenden Eigenschaften und Strukturformel hat: Löslich in Wasser, Methanol, Äthanol und unlöslich in Äthylacetat, Äther, Petr ο lather ;\°fl^=-15,1° (c=O,861, Methanol); positive Rydon-Smith und Ninhydrin-Reaktion, negative Sakaguchi-Reaktion;NH_H H I 2! I CH0-C—C—CO-KH-C-COOH2 ; ι :H OH CH2CH /\ H3C CH3Saure Salze des Bestatin gemäß Anspruch 1.Verfahren zur Herstellung von Bestatin gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Bestatin erzeugenden Streptomyces in einem Nährmedium, das Kohlenstoff- und Stickstofflieferanten enthält, unter aeroben Bedingungen kultiviert und das Bestatin aus dem Medium isoliert.&0988b/1?954. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man das Bestatin aus einer Bestatin enthaltenden wässrigen Lösung durch Adsorption an einem Ionenaustauscherharz und anschließendes Eluieren isoliert.5. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man das Bestatin aus wässriger Bestatin enthaltenden Lösung durch Adsorption an Aktivkohle und anschließendes Eluieren isoliert.6. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man das Bestatin aus einer wässrigen Bestatin enthaltenden Lösung durch Extraktion mit einem mit Wasser unmischbaren Lösungsmittel isoliert, in dem das Bestatin löslicher als in Wasser ist.7. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man festes Rohbestatin mit organischen Lösungsmitteln wie Methanol, Äthanol und dergleichen, in denen Bestatin löslich ist, extrahiert.8. Verfahren nach Anspruch 3 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß man das Bestatin an den Carboxylresten mit einem Alkohol verestert.b 0 9 8 B h / 1 ') 9 59. Verwendung von Bestatin gemäß Anspruch 1 bis 2 zur Wirkungssteigerung von Bleomycin.ue:kö50988h/1295
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP7509074A JPS5439477B2 (de) | 1974-07-01 | 1974-07-01 |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
DE2528984A1 true DE2528984A1 (de) | 1976-01-29 |
DE2528984B2 DE2528984B2 (de) | 1978-10-26 |
DE2528984C3 DE2528984C3 (de) | 1979-06-13 |
Family
ID=13566108
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
DE2528984A Expired DE2528984C3 (de) | 1974-07-01 | 1975-06-28 | Bestatin, dessen Verwendung und Verfahren zu dessen Herstellung |
Country Status (5)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPS5439477B2 (de) |
CA (1) | CA1051801A (de) |
DE (1) | DE2528984C3 (de) |
FR (1) | FR2276818A1 (de) |
GB (1) | GB1510323A (de) |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE2632396A1 (de) * | 1975-07-22 | 1977-02-03 | Microbial Chem Res Found | Bestatinderivate und verfahren zu ihrer herstellung |
JPS52116435A (en) * | 1976-03-26 | 1977-09-29 | Microbial Chem Res Found | Novel bio-active substance bestatin and its derivatives |
WO1997000677A1 (fr) * | 1995-06-21 | 1997-01-09 | Sichuan Industrial Institute Of Antibiotics, The State Pharmaceutical Administration Of China | Utilisation de l'ubenimex et de la composition pharmaceutique le renfermant pour le traitement de l'hepatite virale |
Families Citing this family (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS54153868A (en) * | 1978-05-23 | 1979-12-04 | Bridgestone Corp | Mold for plastic foam |
JPS5767516A (en) * | 1980-09-24 | 1982-04-24 | Microbial Chem Res Found | Novel analgesic agent |
JPS58110553A (ja) * | 1981-12-24 | 1983-07-01 | Microbial Chem Res Found | ベスタチンのγ型結晶及びその製造法 |
JPS6083880U (ja) * | 1983-11-15 | 1985-06-10 | 松下冷機株式会社 | 断熱扉 |
-
1974
- 1974-07-01 JP JP7509074A patent/JPS5439477B2/ja not_active Expired
-
1975
- 1975-06-28 DE DE2528984A patent/DE2528984C3/de not_active Expired
- 1975-06-30 FR FR7520452A patent/FR2276818A1/fr active Granted
- 1975-06-30 CA CA230,530A patent/CA1051801A/en not_active Expired
- 1975-07-01 GB GB27771/75A patent/GB1510323A/en not_active Expired
Cited By (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE2632396A1 (de) * | 1975-07-22 | 1977-02-03 | Microbial Chem Res Found | Bestatinderivate und verfahren zu ihrer herstellung |
JPS52116435A (en) * | 1976-03-26 | 1977-09-29 | Microbial Chem Res Found | Novel bio-active substance bestatin and its derivatives |
WO1997000677A1 (fr) * | 1995-06-21 | 1997-01-09 | Sichuan Industrial Institute Of Antibiotics, The State Pharmaceutical Administration Of China | Utilisation de l'ubenimex et de la composition pharmaceutique le renfermant pour le traitement de l'hepatite virale |
US6245813B1 (en) | 1995-06-21 | 2001-06-12 | Sichuan Industrial Institute Of Antibiotics | Use of ubenimex and the pharmaceutical composition containing it for treating virus hepatitis |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
FR2276818A1 (fr) | 1976-01-30 |
JPS517187A (de) | 1976-01-21 |
DE2528984B2 (de) | 1978-10-26 |
FR2276818B1 (de) | 1979-08-10 |
DE2528984C3 (de) | 1979-06-13 |
JPS5439477B2 (de) | 1979-11-28 |
CA1051801A (en) | 1979-04-03 |
GB1510323A (en) | 1978-05-10 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
EP0366060B1 (de) | Glykosidase-Inhibitor Salbostatin, Verfahren zu seiner Herstellung und seine Verwendung | |
DE2754326C2 (de) | Antibiotikum AM 2282, seine Herstellung und Arzneimittel | |
JP2802097B2 (ja) | 新規な制癌抗生物質mi43―37f11及びその製造法 | |
DE2528984C3 (de) | Bestatin, dessen Verwendung und Verfahren zu dessen Herstellung | |
US5407826A (en) | Isolated cultures of microorganisms of Clonostachys Cylindrospora, Gliocladium and Nectria Gliocladioides | |
US4029547A (en) | Biologically active substance, bestatin, and production thereof | |
US4052449A (en) | Biologically active substance, bestatin, and production thereof | |
DE2554636C2 (de) | Desacyl-pepsidin, Verfahren zu seiner Herstellung und Arzneimittel | |
DE2120930A1 (de) | Pepsin-Inhibitor und Verfahren zu dessen Herstellung | |
DE2028403B2 (de) | Pepstatin | |
DE2445581C3 (de) | Verfahren zur Herstellung von D-Gluconsäure-dlactam | |
CH631740A5 (en) | Process for the preparation of maytansinol and its derivatives | |
DE3003359C2 (de) | ||
DE2628354A1 (de) | Bestatin und verfahren zu dessen herstellung | |
DE2725163C2 (de) | ||
CA1159000B (en) | Protease inhibitors | |
FR1465395A (fr) | Composé nouveau, la décoyinine et son procédé de fabrication | |
DE2813507C3 (de) | Amastatine, Verfahren zu ihrer Gewinnung und diese enthaltende pharmazeutische Zubereitungen | |
EP0057812A2 (de) | Neues Peptid-Antibiotikum Komponente A, Verfahren zu seiner Herstellung sowie seine Verwendung in Arzneimitteln | |
US4206283A (en) | Protease inhibitors | |
US5021549A (en) | Physiologically active substances, probestin and prostatin and production thereof | |
EP0259778B1 (de) | Antibiotisch wirksames Gentisinsäurederivat | |
DE2652686A1 (de) | Verfahren zur herstellung nocardicin a | |
JP2546239B2 (ja) | 新規物質オバリシン | |
DE2510868C3 (de) | Nanaomycin A und Verfahren zur Herstellung der Antibiorica Nanaomycin A und Nanaomycin B |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C3 | Grant after two publication steps (3rd publication) | ||
8328 | Change in the person/name/address of the agent |
Free format text: STOLBERG-WERNIGERODE, GRAF ZU, U., DIPL.-CHEM. DR.RER.NAT. SUCHANTKE, J., DIPL.-ING., PAT.-ANWAELTE, 2000 HAMBURG |