DE2652686A1

DE2652686A1 - Verfahren zur herstellung nocardicin a

Info

Publication number: DE2652686A1
Application number: DE19762652686
Authority: DE
Inventors: Hatsuo Aoki; Hiroshi Imanaka; Shigeru Mori; Shigeyoshi Ohsawa
Original assignee: Fujisawa Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Fujisawa Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1975-11-19
Filing date: 1976-11-19
Publication date: 1977-06-02
Also published as: ATA851376A; NL7612667A; FR2332324A1; US4110166A; DK520676A; BE848430A; JPS58876B2; JPS5264494A; CA1067435A; FR2332324B1; AR211940A1

Description

50 608-Dr.T

Anmelder: FÜJISAWA PiIARMACEUTTCAL CO. , LTD.

No. 3, 4-chome, Doshomachi, Higashi-ku Osaka-shi / Japan

Verfahren zur Herstellung von- Ifocardicin A

Die Erfindung betrifft ein verbessertes Verfahren zur Herstellung des Antibiotikums Nocardicin A durch Fermentation; sie betrifft insbesondere ein verbessertes Verfahren zur Herstellung des Antibiotikums Nocardicin A durch Fermentation in einem Uährmedium, dem ein wirksamer Zusatz zugegeben worden ist, mit einem geeigneten Stamm von Nocardicin A bildenden Mikroorganismen, wie Noeardia.

Ein Ziel der vorliegenden Erfindung ist es daher, ein Verfahren zur Erhöhung der Ausbeute des Antibiotikums Nocardicin A in einem Fermentationsverfahren zu entwickeln. Ziel der Erfindung ist es ferner, ein Verfahren zur Erhöhung der Ausbeute des Antibiotikums Nocardicin A unter Verwendung verhältnismäßig billiger, leicht zugänglicher chemischer Zusätze

709822/0921

in dem Fermentationsverfahren anzugeben.

Bei dem Antibiotikum Hbcardicin A handelt es sich um eine "bekannte Verbindung mit einer antibakteriellen Aktivität (Wirksamkeit) gegen grampositive Bakterien und graninegative Bakterien, die unter dem Code-Namen des Antibiotikums Substanz FR-I923 in der Literatur, beispielsweise in der US-Patentschrift 3 923 977 lind in der deutschen Offenlegungsschrift 2 242 699 beschrieben ist, worin dieses Antibiotikum durch seine verschiedenen physikalisch-chemischen Eigenschaften, jedoch ohne seine chemische Struktur, definiert ist ,wobei letztere jedoch als Ergebnis weiterer Untersuchungen identifiziert und wie nachfolgend angegeben festgelegt wurde:

HOOC-CHCH₀ CH₀O -f y— C CONH

1 LL NH₂

In der oben genannten US-Patentschrift und m der genannten deutschen Offenlegungsschrift ist ferner ein Verfahren zur Herstellung des Antibiotikums Nocardicin A (d.h. der antibiotischen Substanz FR-1923) durch Fermentation eines zu dem Genus ITocardia gehörenden Mikroorganismus beschrieben.

Als Mikroorganismus kann erfindungsgemäß jeder Mikroorganismus verwendet werden, der in der Lage ist, Kocardicin A zu bilden. Ein Beispiel für einen solchen Mikroorganismus ist ein Nocardicin A bildender Stamm, der zu dem Genus Focardia gehörte

Ein bevorzugter Vertreter eines solchen Organismus ist iTocardia tiniformis subsp«, tsuyamanensis, von dem ein Stamm am 13. J"uni 1972 bei der American Type Culture Collection (ATCC) in 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852/USA, hinter-

7Q9822/092S

legt worden ist und der die ATCC-Nummer 21806 hat. Dieser hinterlegte Mikroorganismenstamm Nocardia uniformis subsp. tsuyamanensis ATCC 21806 ist heute für jedermann zugänglich und seine Details, d.h. die mikrobiologischen Eigenschaften und dgl., sind ebenfalls in der oben genannten US-Patentschrift und in der oben genannten deutschen Offenlegungsschrift beschrieben.

Selbstverständlich ist die vorliegende Erfindung bezüglich der Herstellung des Antibiotikums Nocardicin A nicht auf die Verwendung des hier beschriebenen (spezifischen) Organismus beschränkt, der nur zur Erläuterung der Erfindung genannt wurde. Die vorliegende Erfindung umfaßt auch die Verwendung von natürlichen Mutanten sowie von künstlichen Mutanten, die von dem hier beschriebenen Mikroorganismus auf übliche Weise abgeleitet werden können, wie z.B. durch Bestrahlung mit Röntgenstrahlen oder ultravioletten Strahlen, durch Behandlung mit N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin (KTG), 2-Aminopurin oder Stickstofflost und dgl.

Es wurde nun gefunden, daß durch Zugabe eines wirksamen Zusatzes, wie er weiter unten näher erläutert wird, zu dem Ferment atiοnsmedium die Bildung des Antibiotikums Uocardicin A verbessert werden kann.

Zu wirksamen Zusätzen gehören zwei Arten von chemischen Verbindungen und sie werden nachfolgend der Einfachheit halber als "Zusatz der Gruppe A" und "Zusatz der Gruppe B" bezeichnet. Es bedeuten:

"ein Zusatz der Gruppe A" eine Verbindung, die ausgewählt wird aus der Gruppe
Shikiminsäure;
einer Carbonsäure der Formel

7098?2/09?5

worin A einen Alkylenrest mit einer Hydroxy-, Amino-, Acylamino- oder Oxogruppe und η eine ganze Zahl von 0 bis 4-bedeuten;
und ihr Derivat an der Carboxygruppe^

"ein Zusatz der Gruppe B" eine Verbindung, die ausgewählt wird aus der Gruppe

Glycin, Alanin, Serin, Homoserin, a-Aminobuttersäure und/oder a,ß-Diaminopropionsäure₀

Die charakteristischen Merkmale der Erfindung beruhen daher auf einer Verbesserung des Verfahrens zur Herstellung von Nocardicin A durch Kultivieren eines Nocardicin A bildenden Mikroorganismus in einem Fermentationsmedium, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man dem Fermentationsmedium mindestens einen Zusatz zugibt, der aus den oben angegebenen Verbindungen ausgewählt wird, um die Bildung von Nocardicin A zu verbessern (zu erhöhen)ο Dagegen stellen der Mikroorganismus selbst und die anderen Fermentationsbedingungen keine charakteristischen Merkmale der Erfindung dar und sie sind dem Fachmanne an sich bekannt.

Nachfolgend werden die Einzelheiten der vorstehend angegebenen Definitionen der Carbonsäure der Formel I näher erläutert:

Unter "Alkylen" in dem Alkylenrest mit einer Hydroxy-, Amino-, Acylamino- oder Oxogruppe kann es sich um einen solchen mit 1 bis 6, vorzugsweise 1 bis 2 Kohlenstoffatomen handeln und geeignete Beispiele dafür sind Methylen, Äthylen und dgl.

"Acyl" in der Acylamino gruppe kann aliphatisch.es Acyl, aromatisches Acyl und heterocyclisches Acyl umfassen. !Repräsentative Beispiele für Acyl sind Alkanoyl mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, insbesondere Alkanoyl mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen, wie Formyl, Acetyl, Eropionyl und dgl.

7098 2 2/092 5

Repräsentative Beispiele für die Carbonsäure der Formel I sind Tyrosin, F-Acetyltyrosin, p-Hydr oxyp he n;y !glycin, p-Hydroxypheny!brenztraubensäure, p-Hydroxyphenylglyoxylsäure, p-Hydroxyphenylglykolsäure und dgl.

Geeignete Beispiele für das Derivat an der Carboxygruppe des oben definierten Zusatzes sind ein Ester, z.B. ein C^-Cg-Alkylester, insbesondere ein C^-C₇-Alkylester (?/ie der Methyl-, Äthyl-, Propylester und dgl.) und dgl., ein Säureamid und ein Säurehydrazid. Repräsentative Beispiele für dieses Derivat sind der Tyrosinäthylester, IT-Acetyltyrosinamid, 2-AcetamidQ-3-(p-hydroxyphenyl)propionhydrazid, 2-Amino-3-(p-hydroxyphenyl)propionhydroxamidsäure.

Die oben angegebenen Zusätze können auch in Form eines Salzes verwendet werden. Diese Salze können umfassen ein anorganisches Salz, wie z.B. ein Natrium-, Kaliumsalz und dgl«, ein organisches Salz, wie z.B. ein Ethanolamin-, Hexylaminsalz und dglo Außerdem kann im Falle des Zusatzes der Gruppe A und im Falle des Zusatzes der Gruppe B mit einer Aminogruppe der Zusatz in Form eines Salzes mit einer Säure, wie z.B. Chlorwasserstoff säure, verwendet werden.

Das erfindungsgemäße Verfahren wird in der Weise durchgeführt, daß man mindestens einen Zusatz, der aus den oben angegebenen Verbindungen ausgewählt wird, dem Fermentationsmedium zugibt.

In dem erfindungstiemäßen Verfahren wird die Art der Zugabe des Zusatzes zu dem Fermentationsmedium ausgewählt in Abhängigkeit von der Art des jeweils verwendeten Stammes der Mikroorganismen einschließlich der Mutanten davon, von den Fermentationsbedingungen (z.B. der Art des Mediums, dem Volumen des Mediums, der Fermentationstemperatur, der Fermentationsdauer und dgl.) und von der Zeit für die Zugabe dieses Zusatzes und dgl. Daher kann diese Art der Zugabe des

7 09822/0921

Zusatzes zu dem Fermentationsmedium von dem Fachnieinne auf dem Gebiet der Antibiotika unter Zuhilfenahme seines Fachwissens leicht ausgewählt werden.

Eine bevorzugte Ausführungsforn der Art der Zugabe des Zusatzes zu dem Fermentationsmeaiuni wird beispielsweise nachfolgend näher erläutert.

Eine der bevorzugten Arten der Zugabe besteht darin, daß man einen Zusatz-, der unter dem oben angegebenen "Zusatz der Gruppe A" ausgewählt wird, dem Fermentationsmeaiuni zugibt. Eine andere bevorzugte Art der Zugabe besteht darin, daß man dem Fermentationsmedium eine Kombination aus einem Zusatz, der aus dem oben definierten "Zusatz der Gruppe A" ausgewählt wird, und einem Zusatz, der aus dem oben definierten "Zusatz der Gruppe B" ausgewählt wird, zugibt.

Die Fermentation wird erfindungsgemäß nach einem bekannten Verfahren oder einem Äquivalent davon durchgeführt, wie sie beispielsweise in der Literatur, z.B. in der US-Patentschrift 3 923 977 und in der deutschen Offenlegungsschrift 2 242 699, beschrieben sind. Ein solches Fermentationsverfahren wird nachfolgend zur Erläuterung näher beschrieben.

Die erfindungsgemäße Fermentation wird in der Weise durchgeführt, daß man einen ITocardicin A bildenden Mikroorganismus in einem Nährmedium kultiviert, dem der oben angegebene Zusatz auf die vorstehend erläuterte Weise unter aeroben Bedingungen zugegeben worden ist, beispielsweise einer Submerskultur, einer Schüttelkultur und dgl. Das oben angegebene Nährmedium enthält Kohlenstoff- und Stickstoffquellen, die von dem Mikroorganismus assimiliert werden können.

Bevorzugte Kohlenstoffquellen sind Kohlehydrate, wie Glukose Saccharose, Maltose, Glycerin·, Stärke und dgl.

709822/092

-JT-AA

Bevorzugte Stickstoffquellen sind organische Stickstoffquellen, wie Hefe extrakte, Pepton, Glutenmehl, Baumwollsamenmehl, Sojabohneninehl, Maismehl, getrocknete Hefe, Rindfleischextrakte, Caseinhydrolysat, Maisquellwasser, Harnstoff und dgl., sowie anorganische Stickstoffquellen, wie Ammoniumsalze (z.B. Ammoniumnitrat, Ammoniumsulfat, Ammoniumphosphat und dgl.) und dgl.

Gewünschtenfalls können dem Medium Mineralsalze, wie CaI-ciumcarbonat, Natrium- oder Kaliumphosphat, Magnesiumchlorid oder -sulfat und dgl., zugesetzt werden.

Die Menge des "Zusatzes", der dem Hährmedium zugegeben werden soll, die für die Stimulierung und Verbesserung (Erhöhung) der Bildung von TTocardicin A benötigt wird, variiert in Abhängigkeit von der Art des verwendeten Kulturmediums und der Art des zugegebenen Zusatzes. Im allgemeinen wird die Menge des Zusatzes so gewählt", daß sie innerhalb des Bereiches von 10 bis 0,0001, vorzugsweise innerhalb des Bereiches von 2 bis 0,001 Gew.-% liegto

Wenn es sich bei dem dem Nährmedium zugegebenen Zusatz um eine Kombination aus "einem Zusatz der Gruppe A" und "einem Zusatz der Gruppe B" handelt, können bevorzugte Kombinationsverhältnisse von "dem Zusatz der Gruppe A" zu "dem Zusatz der Gruppe B" innerhalb des Bereiches von 1:10 bis 10:1, vorzugsweise von 1:5 "bis 5:1, ausgewählt werden.

Die !Fermentation wird in der Regel bei einer Temperatur zwischen etwa 20 und etwa 57°C, vorzugsweise bei etwa 30°C, für einen Zeitraum von 50 bis I50 Stunden bei einem pH-V/ert von 5 bis 8, vorzugsweise bei pH 5,5 bis 7,0, durchgeführt.

Das in der Kulturbrühe gebildete Nocardicin A kann auf konventionelle Weise gewonnen (abgetrennt) werden, beispielsweise durch Behandlung mit Adsorbentien (wie Aktivkohle, e.i-

709822/0926

nem makroporösen nicht-ionischen Adsorptionsharz), durch Einengung unter vermindertem Druck, durch Kristallisation und dglo Bezüglich der Einzelheiten solcher Gewinnungsstufen (Abtrenmmgsstuf en) sei auf die Literatur, beispielsweise die US-Patentschrift 3 923 977 und die deutsche Offenlegungsschrift 2-24-2 699?verwiesen.

Das in der Ferment at ionsbrühe gebildete Nocardicin A kann unter Anwendung eines biologischen Nachweisverfahrens (Bioassay) wie nachfolgend angegeben bequem bestimmt werden.

Eine Test-Agarplatte wird hergestellt durch Einbringen von 20 ml eines^l!Grundmediums"(pH 7,2), das 0,3 % Bacto-Tryptone' (Handelsname für ein Prodiikt der Firma DIPCO Laboratories, USA) und 2,0 % Agar enthält, in eine Petrischale (Durchmesser der Schale: 85 nun) und anschließendes Aufbringen von 5 ml eines'oberen Mediums"(pH 7»2), das 0,3 % Bacto-Tryptone, 0,5 mg Nicotinsäure, 0,5 % Agar und 2 % Impfkultur (1 χ ΊΟ⁸ Zellen/ ml) eines pathogenen Mikroorganismus, der auf dem Grundmedium getestet werden soll, enthält, auf. das Grundmedium«,

Einerseits tränkt man eine Papierscheibe (Durchmesser der Scheibe: 8 mm) r,iit einer Standardlösung von Nocardicin A (die Menge ihres Gehaltes wird vorher festgelegt) und andererseits tränkt man eine Papierscheibe mit einer Testlösung. Nach dem Trocknen beider Scheiben, um die überschüssige Lösung davon zu entfernen, legt man jede dieser Scheiben auf die Oberfläche der wie oben hergestellten Test-Agarplatte und dann wird die Platte 18 Stunden lang bei 30°C inkubiert.

Nach der Inkubation wird der Durchmesser der Hemmzone (Inhibierungszone) gemessen, aus dem der Gehalt des Nocardicins A in der Testlösung errechnet wird.

Die nachfolgend angegebenen Beispiele sollen die Erfindung näher erläutern, ohne sie jedoch darauf zu beschränken.

709822/092S

In den nachfolgend beschriebenen Beispielen wurden die folgenden Medien verwendet:

1.) Wäßriges ImOfmedium	Konzentration in Gew.-%	(D	Konzentration in Gev/.-%	(II)
Komponente	2	2	Konzentration in Gew.-^
Saccharose	2	0,4·	1
Baumwollsamenmehl	1	0,35	0,5
getrocknete Hefe	2,18	0,15	1
KH₂Po₄	1,4-3	0,1	0,2
Na₂HPO^oI2H₂O	pH 6,0	pH 6,0	0,02
eingestallt auf	1,8
2.) Wäßriges Produktionsmedium	1,2
KoETDonente	0,5
lösliche Stärke	pH 6,0
Hefeextrakt
IHI₂PO₄
Na₂HPO₄.12H₂O
MgSO₄.7H₂O
eingestellt auf ...
3.) Wäßriges Produktionsmedium
Komponente
lösliche Stärke
Glukose
Pepton
Hefeextrakt
CaIciumpantothenat
KH₂PO₄
Na₂HPO₄ο12H₂O
MgSO₄₀7H₂O
eingestellt auf

709822/0921

4.2. Wäß_rj_g£s_Produkt^nj3m£3dium £1.11).

Komponente Konzentration in Gew.-%

Stärke 1

Baiimwollsamenmehl 2

getrocknete Hefe 2

' 2,18

.12H₂O 1,43

MgSO₄.7H₂O · 0,5

eingestellt auf pH 6,0

Beispiel 1

100 ml des wäßrigen Impf mediums wurden in jeden von 10 500 ml~Sakaguchi-Kolben gegossen und 20 Minuten lang "bei 120⁰C sterilisiertο Eine Ösenfüllung einer Schrägkultur von Uocardia uniformis subsp«, tsuyamanensis ATCC 21806 wurde in jedes der Medien inokuliert (überimpft) und 48 Stunden lang "bei 30°C kultiviert.

Andererseits wurden 20 1 eines wäßrigen Mediums, das hergestellt worden war durch Zugabe von 0,2 &ew.-/s L-Tyrosin und 0,2 Gew.-% Glycin zu dem wäßrigen Produktionsmedium LEU), in eine 30 I-Flaschen-Fermentiervorrichtung gegossen und 20 Minuten lang bei 120° C sterilisiert. Zu dem Medium wurde das gesainte Volumen der oben hergestellten Impfkultur zugegeben. Der Organismus wurde 6 Tage lang bei 30⁰C gezüchtet. Während der Wachstumsperiode wurde die Brühe(BouüLon) mit 27O TJpM gerührt und es wurde sterile Luft in einem Verhältnis von 20 1 pro Minute durch die Brühe geleitet.

Danach wurde die erhaltene Kulturbrühe mit verdünnter Chlorwasserstoff säure auf pH 4,0 eingestellt und dann unter Verwendung von 6 Gew. —% Diatomeenerde filtriert. Ein Teil des Piltrats (3 l) wurde durch eine mit Diaion HP 20 gefüllte Säule geleitete Fachdem die Säule mit Wasser gewaschen

709822/092

worden war, wurde das Nocardicin Λ mit 20 tigern wäßrigem Methanol eluiert, wobei man 3 1 Eluat erhielt, das unter vermindertem Druck eingeengt wurde.

Der dabei erhaltene Rückstand wurde auf pH 2,5 eingestellt und stehen gelassen unter Bildung von Kristallen, die durch Filtrieren abgetrennt wurden, und nach dem Trocknen erhielt man 2,9 g Nocardioin A in Form von farblosen Kristallen. Das IR-Spektrum der dabei erhaltenen Kristalle war identisch mit demjenigen einer authentischen Probe von Nocardicin A₀

Beispiel 2

Das wäßrigem Impfmedium (50 ml) wurde in einen 500 ml-Sakaguchi-Kolben gegossen und 20 Minuten lang bei 120 C sterilisiert. Eine Ösenfüllung der Schrägkultur von Nocaridia uni~ formis subsp. tsuyamanensis ATCC 21806 wurde in das Medium inokuliert und dann wurde der Organismus 48 Stunden lang bei 30°C auf einem Schüttler gezüchtet.

Pur die zweite Stufe wurden 10 ml eines wäßrigen Mediums, das hergestellt worden war durch Zugabe einer vorgeschriebenen Menge in einer vorgeschriebenen Konzentration zu dem wäßrigen ProduktionsmediumCl), in jeden der 50 ml-Erlenmeyer-Kolben gegossen und 20 Minuten lang bei 120⁰C sterilisiert. In jedes der Medien wurden 0,5 ml eier oben hergestellten Impfkultur inokuliert. Der Organismus wurde 6 Tage lang bei 30°C auf einem Schüttler gezüchtet. Nach Beendigung der Fermentation wurde die Bildung von Nocardicin A durch den Rf- Wert bestätigt, der in der DünnschichtChromatographie bei fast 0,4 lag [Träger: Eastman Chromagram Sheet Cellulose Nr. 6065, Entwicklung lösungsnittel: ein n-Propanol/Wasser (7/3)-Gemisch, Nachweis: Bioautograptie unter Verwendung von Pseudomonas aeruginosa NCTC 10490]. Das in den Brühen gebildete Nocardicin A wurde durch ein Bionachweisverfahren (Bioassay) unter Verwendunr? von Pseudomonas aeruginosa NCTC 10490 bestimmt. Die dabei erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle I angegeben.

709Ö22/092S

Tabelle I

[ j Zusatz i	Menge des Zusatzes (yg/mfc)	Bildung von Nocardicin A (yg/mfc)
i L-Tyrosin I	200	310
1 D-Tyrosin	300	310
ρ-Hydroxyphenyl-	200	365
"br enz tr auto ens äur e	300	410
D,L-p—Hydroxyphenyl- glycolsäure	200	180
ρ-Hydroxyphenyl-	300	200
glyoxyl säure	100	170
L-p-Hydroxy-	200	220
phenylglycin	100	345
Shikiminsäure	200	340
Eontrolle	200	330
300	440
200	200
300	260
O	110

709822/092B

Beispiel 3

50 ml des wäßrigem Empfmediums wurden in einen 500 ml-Sakaguchi-Kolben gegossen und 20 Minuten lang bei 120⁰G sterilisiert. Eine ösenfüllung der Schrägkultur von Nocardia uni— formis subsp. tsuysmanensis ATCC 21806 wurde in das Medium inokuliert und dann wurde der Organismus 4-8 Stunden lang bei 30°C auf einem Schüttler gezüchtet.

Für die zweite Stufe wurden 10 ml eines wäßrigen Mediums, das hergestellt worden war durch Zugabe einer vorgeschriebenen Verbindung in einer vorgeschriebenen Konzentration zu dem wäßrigen Produktionsmedium(ll\ Jeweils in 5O ml-Erlenmeyer-Kolben gegossen und 20 Minuten lang bei 120°C sterilisiert. In jedes der Medien wurden 0,5 ml der oben hergestellten Impfkultur inokuliert. Der Organismus wurde 6 Tage lang bei 30 C auf einem Schüttler gezüchtet. Nach Beendigung der Fermentation wurde die Bildung von Nocardicin A in den Brühen praktisch auf die gleiche Weise wie in Beispiel 2 bestätigt und bestimmt. Die dabei erhaltenen Ergebnisse sind in der fol genden Tabelle II angegeben.

7098 2 2/0925

Tabelle II

Zusatz	Menge des Zusatzes (yg/mA)	Bildung von Nocardicin A (yg/mA)
L-Tyrosin ι I	125	425
I D-Tyrosin ι	250	555
ρ-Hydroxyphenyl- "breiiztraubens äur e	500	660
ρ-Hydroxyphenyl- glyoxylsäure	1000	580
DL-P-Hydroxy- phenylglycin	125	445
Kontrolle	250	555
500	530
1000	540
125	410
250	440
500	435
125	475
250	510
500	660
1000	555
250	455
500	580
1000	660
7Ö9822/092S	370

Beispiel 4

50 ml des wäßrigem Impfmediums wurden in einen .500 ml-Sakaguchi-Kolben gegossen und 20 Minuten lang "bei 120 C sterilisiert. Eine Ösenfüllung der Schrägkultur von Nocardia uniformis subsp. tsuyamanensis ATCC 21806 wurde in das Medium inokuliert und dann wurde der Organismus 48 Stunden lang "bei 30⁰C auf einem Schüttler gezüchtet.

Mir die zweite Stufe wurden 10 ml eines wäßrigen Mediums, das hergestellt worden war durch Zugabe einer vorgeschriebenen Verbindung· in einer vorgeschriebenen Konzentration zu dem wäßrigen ProduktionsmediumCl), jeweils in 50 ml-Erlenmeyer-Kolben gegossen und 20 Minuten lang bei 120 C sterilisiert.

In jedes der Medien wurden 0,5 ml der oben hergestellten Impfkultur inokulierte Der Organismus wurde 6 Tage lang bei 3O⁰C auf einem Schüttler gezüchtet. Hach Beendigung der Fermentation wurde die Bildung von Uocardicin A in den Brühen praktisch auf die gleiche Weise wie in Beispiel 2 bestätigt und bestimmt.

Die dabei erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle III angegebene

709B22/092S

Tabelle III

Zusatz	Menge des Zusatzes (yg/mfc)	Bildung von Nocardicin A (ug/mA)
L-2-Amino-3-(ρ-hydroxy phenyl) ρ ropiono - hydroxamidssUire "	100	190
N-Acetyl-L-tyrosinamid	1000	250
L-2-Acetoamido-3-(p- hydroxyphenyl)- propionohydrazid	100	180
N-Acetyl-L-tyrosin	1000	300
L-Tyrosin- ethyl-ester	100	120
Kontrolle	1000	170
100	150
1000	200
250	250"
500	300
1000	250
0	80

709822/0925

Beispiel 5

50 ml des wäßrigen Impfmediums wurden in einen 500 ml-Sakaguchi-Kolben gegossen und 20 Minuten lang bei 120⁰C sterilisiert _o Eine Ösenfüllung der Gclirägkultur von Nocardia uniformis subsp. tsuyamanensis ATCC 21806 wurde in das Medium inokuliert und dann v/urde der Organismus 48 Stunden lang bei 30⁰C auf einem Schüttler gezüchtet.

Für die zweite Stufe wurden 10 ml eines wäßrigen Mediums, das hergestellt worden war durch Zugabe einer vorgeschriebenen Menge in .einer Endkonzentration von 600 .^g/ml zu dem wäßrigen Produktionsmedium (I), das L-Tyrosin in einer Endkonzentration von 300 ng/ml enthielt, jeweils in 50 ml-Erlenmeyerkolben gegossen und 20 Minuten lang bei 120⁰C sterilisiert. Zu -der Medien wurden 0,5 ml der oben hergestellten Impfkultur zugegeben. Der Organismus mirde 6 Tage lang bei 30°C auf einem Schüttler gezüchtet« Nach Beendigung der Fermentation wurde die Bildung von Nocardicin A in jeder der Brühen praktisch auf die gleiche Weise wie in Beispiel 2 bestätigt und bestimmt, Die dabei erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle IV angegeben.

Tabelle IV

Zusatz	Bildung von Nocardicin A (ug/raZ)
Glycin	525
L-Alanin	470 '
L-Serin	490
L-Homoserin	440
D,L-a-Aminobuttersäure	525
L-ot, $-Diaminopropion - säure	455
Kontrolle	709822/0925310

Beispiel 6

50 ml des wäßrigen Impfmediums wurden in einen 500 ml-Sakaguchi-Kolben gegossen und 20 Minuten lang bei 120⁰C sterilisierte Eine Ösenfiillung der Schrägkultur von TTocardia. unifomis subsp. tsuyamanensis ATCC 21806 wurde in das Medium inokuliert und dann wurde der Organisi
einem Schüttler gezüchtet.

und dann wurde der Organismus 4-8 Stunden lang bei 30°C auf

Für die zweite Stufe wurden 10 ml eines wäßrigen Mediums, das hergestellt worden war durch Zugabe einer vorgeschriebenen Verbindung in einer vorgeschriebenen Konzentration zu dem wäßrigen Produktionsraediumtlll), jeweils in 50 ml-Erlenmeyer-Kolben gegossen und 20 Minuten lang bei 120 C sterilisiert. In jedes der Medien wurden 0,5 ml der oben hergestellten Impfkultur inokulierte Der Organismus wurde 6 Tage lang bei 30⁰C auf einem Schüttler gezuchtet„ Fach Beendigung der Fermentation wurde die Bildung von ITocardicin A in jeder der Brühen auf praktisch die gleiche Weise wie in Beispiel 2 bestätigt und bestimmt. Die dabei erhaltenen Ergebnisse sied in der folgenden Tabelle V angegeben.

709822/0925

Tabelle V

Zugabemenge des L-Tyrosins (%)	Zugabemenge des Glycins (%)	Bildung von Nocardicin A (ug/inÄ)
0	0	540
0	0.1	550
0.1	0	900
0,1	0.1	950
0.1	0.2	1000
0.2	0	930
0.2	0.1	1000
0.2	0.2	1200
0.3	0	950
0.3	0.1	1000
0.3	0.2	1100

Beispiel 7

50 ml des wäßrigen Impfmediums wurden in einen 500 ml-Saka~ guchi-Kolben gegossen und 20 Minuten lang bei 120⁰C sterilisiert. Eine üsenfüllung der Schrägkultur von Nocardia uniformis subsp. tsuyamanensis ATCC 21806 wurde in das Medium inokuliert und dann wurde der Organismus 48 Stunden lang bei 3O°C auf einem Schüttler gezüchtet.

pur die zweite Stufe.wurden 10 ml eines wäßrigen Mediums, das

709822/0925

JLH

hergestellt worden war durch Zugabe einer vorgeschriebenen Verbindung in einer Endkonzentration von öOO^ug/ml zu dem wäßrigen Produktionsmedium (l), jeweils in 50 ml-Erleniaeyer-Kolben gegossen und 20 Minuten lang bei 120⁰C sterilisiert. In jedes der Medien wurden 0,5 ml der oben hergestellten Impfkultur'inokuliert. Der Organismus wurde 6 Tage lang bei 30⁰G auf einem Schüttler gezüchtet. Wach Beendigung der Fermentation wurde die Bildung von Uocardicin A in jeder der Brühen auf praktisch die gleiche Weise wie in Beispiel 2 bestätigt und bestimmt. Die dabei erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle VI angegeben.

Tabelle VI

Zusatz	Bildung von Nocardicin A (ug/mJt)
Glycin	170
L-Alanin	170
D,L-a-Amino but-1 er säure	180
L-a,$-Diamino- propionsäure	180
-	160

Patentansprüche:

709822/0925

Claims

Anmelder: FÜJISA'jfA PHARKiCEUTICAL CO., LTD. No. 3, 4-chonie, Doshomachim Higashi-ku Osaka-shi/ Japan

Patentansprüche

1» Verfahren zur Herstellung von üTocardicin A durch Kultivierung eines Kbcardicin A "bildenden Mikroorganismus in einem Fermentationsmedium, dadurch gekennzeichnet, daß man dem Ferment at ionsmedium mindestens einen Susatz zugibt, der ausgewählt wird aus der Gruppe Shikiminsäure, einer Carbonsäure der Formel

(PH)_n

-Ä - COOH (D

worin A einen Alkylenrest mit einer Hydroxy—, Amino—, Acylamino— oder Oxogruppe und η eine ganze Zahl von 0 bis 4- bedeuten,

Glycin., Alanin, Serin, Homoserin, a-Arainobuttersäure und a,ß-Biaminopropionsäure und ihrem Derivat an der Oarboxygruppe.

2· Verfahren nach Anspruch i, dadurch gekennzeichnet, daß man dem Fermentationsmedium einen Zusatz , der ausgewählt wird aus der Gruppe Shikiminsäure und einer Carbonsäure der in Anspruch T angegebenen Formel (I) und ihrem Derivat an der Carboxygruppe oder eine Kombination aus einem Zusatz, ausgewählt aus der Gruppe Shikiminsäure und einer Carbonsäure der in Anspruch 1 angegebenen Formel (J) und ihrem Derivat an der Oarboxygruppej und einem Zusatz, ausgewählt aus Glycin, Alanin, Serin, Homoserin, a-Aminobuttersäure und a,ß-Diaminopropionsäure und ihren Derivaten an der Carbo:cygruppe, zugibt.

3* Verfahren, nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man dem FeriaentationsHediust einen Zusatz zugibt, der ausgeleählt wird aus der Gruppe Shikiminsäure und einer Ga.rbonsäure der in Anspruch i angegebenen Formel (I) und ihrem Derivat an der Carboxygruppe.

703822/0925

_ 2 —

4-. Verfahren nach Anspruch 3j dadurch gekennzeichnet, daß man als Zusatz Shikiminsäure oder ihr Derivat an der verwendet.

5. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man als Zusatz eine Carbonsäure der in Anspruch 1 angegebenen Forael (I) oder ihr Derivat an der Carboxygruppe verwendet.

6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß man als Zusatz eine Carbonsäure öler in Anspruch 1 angegebenen Formel (I) verwendet, in der A einen Alkylenrest mit einer Aiainogruppe und η die Zahl 0 bedeuten.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß man als Carbonsäure Tyrosin verwendet.

8· Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß man als Carbonsäure p-Hydroxyphenylglycin verwendet.

9. Verfahren nach Anspruch 5» dadurch gekennzeichnet, daß man als Zusatz eine Carbonsäure der in Anspruch 1 angegebenen Formel (I) verwendet, worin A einen Alkylenrest mit einer Hydroxylgruppe und η die Zahl 0 bedeuten.

10. Verfahren nach Anspruch 9₅ dadurch gekennzeichnet, daß man als Carbonsäure p-Hydroxyphenylglykolsäure verwendet.

11. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß man als Zusatz eine Carbonsäure der in Anspruch 1 angegebenen Formel (I) verwendet, worin A einen Alkylenrest mit einer Aminogmppe und η die Zahl 0 bedeuten.

12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß man als Zusatz eine Carbonsäure der in Anspruch 1 angegebenen Formel (I) verwendet, worin A einen Alkylenrest mit einer Alkanoylaiainogruppe und η die Zahl 0 bedeuten.

709822/0921

13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß man als Carbonsäure IT-Acetyltyrosin verwendet.

14-, Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß man als Zusatz eine Garbonsäure der in Anspruch 1 angegebenen Formel (I) verwendet, worin A einen Alkylenrest mit einer Oxogruppe und η die Zahl 0 bedeuten.

15. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß man als Carbonsäure p-Hydroxyphenylbrenztraubensäure verwendet.

16. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet,

daß man als Carbonsäure p-Hydroxyphenylglyoxylsäure verwendet.

17. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß man als Zusatz ein !Derivat an der Carboxygruppe einer Carbonsäure der in Anspruch 1 angegebenen Formel (I) verwendet.

18. Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß man als Derivat einen Ester verwendet»

19· Verfahren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß man als Ester einen Alkylester verwendet.

20. Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß man als Alkylester den Tyrosinäthylester verwendet.

21. Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß man als Derivat ein Amid verwendet.

22. Verfahren nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, daß man als Amid IT-Acetyltyrosinai-iid verwendet.

23. Verfahren nach Anspruch 21 _? dadurch gekennzeichnet, daß man als Hydroxamidsäure 2-Amino-3-(p-hydroxyphenyl)propionohydroxamidsäure verwendet„

24. Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß man als Derivat ein Hydrazid verwendet.

25. Verfahren nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, daß man als Hydrazid 2-Acetamido-3-(p-hydroxyphenyl)propionohydrazid verwendet.

26. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man dem Fermentationsmedium eine Kombination aus einem Zusatz, ausgewählt aus der Gruppe Shikiminsäure, einer Carbonsäure der in Anspruch 1 angegebenen Formel (I) und ihrem Derivat an der Carboxygruppe, und einem Zusatz, ausgewählt aus Glycin, Alanin, Serin, Homoserin, α-Aminobuttersäure und <x,ß-Diaminopropionsaure und ihrem Derivat an der Cärboxygruppe, zugibt.

27. Verfahren nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Kombination von Zusätzen verwendet, die aus (Tyrosin und Glycin besteht.

28. Verfahren nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Kombination von Zusätzen verwendet, die aus Tyrosin und Serin besteht.

29. Verfahren nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Kombination von Zusätzen verwendet, die aus Tyrosin und Homoserin besteht.

30. Verfahren nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Kombination aus Zusätzen verwendet, die aus Tyrosin und cc-Aminobuttersäiire besteht.

31. Verfahren nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, d'-.ß man eine Kombination von Eusätzen verwendet, die aus Tyrosin und α,β-Diaminopropionsilure besteht.

709822/092?