DE2234798A1

DE2234798A1 - 9-nieder-alkyl-9-fluorenyloxycarbonylderivate, verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendung als aminogruppenschutzreagentien bei der peptidsynthese

Info

Publication number: DE2234798A1
Application number: DE2234798A
Authority: DE
Inventors: Ken Inouye; Hideo Otsuka
Original assignee: Shionogi and Co Ltd
Current assignee: Shionogi and Co Ltd
Priority date: 1971-07-15
Filing date: 1972-07-14
Publication date: 1973-01-25
Also published as: CH574387A5; GB1346035A; FR2146044A5; US3839396A

Description

¹¹ 9~niedcr~AIkyI-9~iluorenyloxycarbonylderivate_T Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung als Aminogruppenschutz-

reagen t i en *" b e / der

i In

e se

Priorität: 15. Juli 1971, Japan, Nr. 52 709/1971 22, Juli 1971, Japan, Nr. 54 815/1971 19. Auguot 1971, Japan,. Nr. 63 181/1971

Die Erfindung betrifft neue 9-nioder-Alkyl-9~.tluorenyloxycarbc-■nylderivate der allgemeinen Formel I

(D

in der R, einen niederen Alk'ylrest, z.B. die Methyl-, Äthyloder Propylgruppe und Rp eine Azidogruppe oder einen substituierten oder nicht substituierten Phenqxyrest der allgemeinen Formel II bedeutet .

.(Y)m

(II)

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wobei m eine ganze Zahl mit einem Wert von 1 bis 5 und Y ein Wasserstoff- oder Halogenatom, v/ie Fluor, Brom odor Chlor, oder die Nitrogruppe bedeutet.

Der Ausdruck "niederer Alkylrest" bedeutet unverzweigte oder ver zweigte Alkylreste mit 1 bis 6, vorzugsweise 1 bis 4 und insbesondere 1 bis 3 Kohlenstoffatomen.

Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung der Verbindungen der allgemeinen Formel I, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man
(a) ein 9-nieder-Alkyl~9-fluorenol der allgemeinen Formel III

(in)

in der Ry, die vorstehende Bedeutung hat, mit einem Halogenameisensäureester der allgemeinen Formel IV

X-C-O-R, (IV)

in der X ein Halogenatom, wie Fluor, Brom oder Chlor, und R-einen substituierten oder nicht substituierten Phenylrest der allgemeinen Formel V bedeutet

(V)

in der Y und m die vorstehend angegebene Bedeutung haben_? zu einem Kohlensäureester der allgemeinen DOriaci Vl

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SA0 ORIGINAL

ίνΐ)

in der RJ. und R- die vorstehend angegebene Bedeutung haben» und gegebenenfalls

(b) den Kohlensäureester der allgemeinen Formel VI mit Hydrazin zu einem Kohlensäureesterhydrazid der allgemeinen Formel ¥11. umsetzt ... r, .-,

SS //

O-C-NMH^

in der R, die vorstehend angegebene Bedeutung hat, und die* ses in einem sauren Medium mit einem Nitrit der allgemeinen Formel VIII ,

R₅-ONO (VIII)·

in der R_r ein Wasserstoifatom, .einen niederen Alkylrest» wie die Isoamyl- oder tert. ^Butylgruppe, oder ein Alkillimetallkation, wie das Natrium- oder Kaliumion^ bedeutet* zn einem Kohlensäureesteraaid der allgeffleifteil Funnel IX unt« setzt

in der R₁ die vorstehend angegebene Bedeutung hat*

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Die Umsetzung der 9-n.ieder--Alkyl-9~fluorenole der allgemeinen Formel 3"II mit Halogenanieisensäureestern der allgemeinen Formel

vorzugsweise IV zu Kohlensäureestern der allgemeinen Formel VI wii'd/1 Mg 6 Stunden bei Temperaturen von -10 bis +5O⁰C in Gegenwart einer Base in einem Lösungsmittel, vorzugsv/eise in Dichlormethan oder Chloroform, durchgeführt. Beispiele für Basen sind organische Basen, wie Pyridin, Chinolin, Dimethylanilin, Triäthylamin oder Trimethylbenzylammoniumhydroxid.

Die Umsetzung der Kohlensäureester der allgemeinen Formel VI mit Hydrazin zu den entsprechenden Kohlensäureesterhydraziden

vorzugsweise

der allgemeinen Formel VII wird/1 bis 24 Stunden bei Temperaturen von 0 bis AO C in einem polaren Lösungsmittel durchgeführt. Vorzugsv/eise beträgt das Molverhältnis von Hydrazin zum Kohlensäureester der allgemeinen Formel VI 1 : 1 bis 4:1. Beispiele für bevorzugt verwendete polare Lösungsmittel sind Methanol, Äthanol, Dimethylformamid oder Dimethylsulfoxid.

Die Umsetzung der Kohlensäureesterhydrazide der allgemeinen .Formel VII mit Nitriten der allgemeinen Formel VIII zu Kohlen-

vorzugcweise

säureesteraziden der allgemeinen Formel IX wird/10 bis 60 Minuten bei Temperaturen von -40⁰C bis Raumtemperatur in einem sauren Reaktionsmedium durchgeführt. Bevorzugte Lösungsmittel sind beispielsweise Acetonitril, Dimethylformamid, Dimethylsulfoxid, Essigsäure oder wäßrige Lösungen dieser Lösungsmittel. Vorzugsweise werden anorganische Säuren, z.B. Salzsäure, oder organische Säuren, z.B. Essigsäure, zugesetzt.

D.'Js al» AiKJtfnn^\n-rbindung verwendete 9-n.tcöer-Alkyl-9-fluorom>l der allgemeinen Formel III kann beispielsweise hergestellt- werden, indem man 9-Fl^uor^non der Formel X

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(χ)

mit einem Grignard-Reagens der allgemeinen Formel XI

. R₁MgX ' (XI)

in der R. und X die vorstehend angegebene Bedeutung haben, um-· setzt und das erhaltene Produkt auf übliche Weise hydrolysiert.

Der als Ausgangsverbindimg verwendete Chlorameisensäureester der allgemeinen Formel IV kann beispielsweise durch Behandlung des entsprechenden Phenols mit Phosgen oder einem Chlorameisensäurehalogenid auf übliche Weise erhalten werden.

Die so erhaltenen Verbindungen der allgemeinen Formel I (VI,

IX) eignen sich als N-Acylierungsmittel und sind deshalb wertvolle Amino gruppenschutzreagentien für Aminosäuren oder Peptide. Außer zum Schutz von Aminogruppen können diese Verbindungen auch zum Schutz von anderen funktionellen Gruppen, beispielsweise zum Schutz der Hydroxylgruppe im' Tyrosin oder der Mercaptogruppe im Cystein verwendet werden.

Der charakteristische Vorgang bei der Peptidsynthese ist die Ausbildung einer Amidbindung zwischen der Carboxylgruppe einer Aminosäure oder eines Peptids und der Aminogruppe einer zweiten Aminosäure oder eines Peptids. Dabei müssen.funktionelle Gruppen, die nicht an der Bildung der Amidbirdung beteiligt sein sollen, geschützt werden, um die Bildung von unerwünschten Nebenprodukten zu verhindern. Aus diesem Grund muß eine Schutzgruppe den folgenden Anforderungen genügen:

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(1) Sie muß sich leicht und möglichst in quantitativer Ausbeute in die Aminosäure oder das Peptid einführen lassen.

(2) Bei ihrer .Einführung darf sich keine Racemisierung der "zu schützenden Aminosäure ergeben.

(3) Sie muß ihre Schutzfunktion behalten und zwar vorzugsweise unter allen Kupplungsbedingungen.

(4) Sie darf nicht das Auftreten von Nebenreaktionen veranlassen.

(5) Sie muß sich leicht und selektiv auf solche Weise entfernen lassen, daß andere Schutzgruppen für die gleichen oder andere funktioneile Gruppen nicht in unerwünschter Weise beeinträchtigt werden.

Es wurde nun erfindungsgemäß festgestellt, daß sich 9-nieder-Alkyl-9-fluorenyloxycarbonylreste zum Schutz von Aminogruppen während der Peptidsynthese eignen, da sie die vorgenannten Bedingungen in ausreichendem Maße erfüllen. Diese Schutzgruppen lassen sich leicht in Aminogruppen von Aminosäuren oder Peptiden einführen und können leicht durch Behandlung mit einer Säure in jedem beliebigen Stadium der Peptidsynthese entfernt werden.

Die Erfindung betrifft deshalb auch die Verwendung der 9-nieder~ Alkyl-9-fluorenyloxycarbonylderivate der allgemeinen Formel I als Aminogruppenschutzreagentien bei der Peptidsynthese.

N_(9«nieder-Alkyl-9-fluorenyloxycarbonyl)-aminosäuren werden 'durch Acylierung einer Aminosäure oder eines Aminosäureesters mit 9~nieder~Alkyl-9-fluorenyloxycarbonylderivaten der allgemeinen Formel I hergestellt.

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Diese Acylierungsreaktion durch Verbindungen der allgemeinen Formel I ist vollkommen analog der Einführung der N-(Benzyloxy·- carbonyl)- oder N-(tert.-Butyloxycarbonyl)-Gruppen in Aminosäuren oder Peptide /vgl. Ber. dtsch. ehem. Ges. Bd. 65 (1932), S. 1192; Helv.Chim.Acta, Bd. 42 (1959), S. 2622; Ann.N.Y.Acad. Sei., Bd. 88.(1960), S..6767. Diese Acylierung wird im allgemeinen 1 bis 24 Stunden bei Temperaturen von 0 bis 60^öC, vorzugsweise in Gegenwart eines Lösungsmittels und einer organischen oder anorganischen Base durchgeführt. Als Lösungsmittel können organische Lösungsmittel, wie Dimethylformamid, Dimethylsulfoxid, Dioxan, Methanol, Äthanol, Aceton oder wäßrige' Lösungen dieser Lösungsmittel verwendet werden. Beispiele für Basen, die die Reaktion beschleunigen, sind Alkalimetallhydroxide, wie Natrium- oder Kaliumhydroxid, Alkalimetallcarbonate, wie Natrium- oder Kaliumcarbonat, Alkalimetallhydrogencarbonate, wie Natrium- oder Kaliumhydrogencarbonat, Erdalkalimetalloxide, wie Magnesiumoxid, organische tertiäre Amine, wie Pyridin, Chinoiin, Trimethylarain oder Triäthylamin, und- Trimethylbenzylammoniumhydroxid. Vorzugsweise beträgt das Molverhältnis von Acylierungsmittel zu der zu schützenden Aminogruppe etwa 1 : 1 bis 1,5:1.

Eine.andere Ausführungsform der.Einführung der erfindungsgemäs- · sen Schutzgruppen besteht in der Umsetzung des 9-nieder-Alkyl-9-fluorenols der allgemeinen Formel III mit einem Isocyanat der allgemeinen Formel XI

O=C=N-R₅ . " Ul)

in -der U, den um die Aminogruppe verminderten Rest eines Aminoaäureesters bedeutet, zu einem N-(9-nieder-Alkyl-9-fluorenyloxy-

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SAD OR(QfNAL

carbonyl)-·aminosäureester der allgemeinen Formel XII

(XII)

0-C-NH-R₃

in der R^ und R, die vorstehend angegebene Bedeutung haben.

Auch diese Isocyanatreaktion ist ein Analogverfahren /vgl. Z.Naturforsch., Bd. 5b (1950), S. 170; Liebigs Ann.Chem., Bd. 575 (1952), S. 2177. Die Umsetzung wird im allgemeinen 1/2 bis 6 Stunden bei Temperaturen von 50 bis 130⁰C in einem Lösungsmittel und gegebenenfalls in Anwesenheit' einer organischen Base durchgeführt. Beispiele für Lösungsmittel sind Benzol, Toluol, Xylol, Anisol und Diisopropyläther. Als organische Basen werden vorzugsweise Pyridin, Triäthylamin, Collidin oder

ι Chinolin verwendet, die auch zugleich als Lösungsmittel dienen können. Die als Ausgangsverbindungen verwendeten Isocyanate der allgemeinen Formel XI können auf übliche Weise durch Behandeln eines Aminosäureesters mit Phosgen erhalten werden /vgl. Liebigs Ann.Chem., Bd. 575 (1952), S. 217/. Bevorzugte Aminosäureester sind dabei niedere Alkylester, z.B. die Methyl-, Äthyl- oder Propylester, und niedere Arylalkylester, z.B. die Benzyl- oder

, p-Nitrobenzylester.

: Beispiele für Aminosäuren, in die sich die erfindungsgemäßen Schutzgruppen einführen lassen., sind Glycin, Alanin, Valin, Norvalin, Leucin, Norleucin, Isoleucin, Serin, Threonin, Cystein, Cystin, Methionin, Asparaginsäure, Asparagin, Glutaminsäure, Glutamin, Lysin, Ornithin, Citrullin, Arginin, Phenylalanin,

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Tyrosin, Histidin, Tryptophan, Prolin, Hydroxyprolin, ß-Alanin,

i Γι o
γ-Aminobuttersäure, a-Aminb/öuttersäure, Sarcosin, a,ß-Diarainopropionsäure, α,γ-Diaminobuttersäure und andere natürlich vor~ kommende oder synthetische Aminosäuren. Diese Aminosäuren können in der L-, D- oder DL-Konfiguration vorliegen. Enthalten die mit den Schutzgruppen der Erfindung zu versehenden Aminosäuren oder Peptide weitere funktionelle Gruppen, wie Amino-, Carboxyl-, Hydroxyl-, Mercapto-, Guanidino- oder I'minogruppen, so können diese gegebenenfalls mit in der Peptidchemie üblichen Schutzgruppen versehen werden. Die Carboxylgruppe wird vorzugsweise verestert, z.B. mit Methanol, Äthanol, tert.-Butanol, Benzylalkohol, p-Nitrobenzylalkohol oder Phenolen, oder sie wird durch Amidbildung geschützt. Aminogruppen werden beispielsweise durch Einführung einer Benzyloxycarbonyl-, p-Nitrobenzyloxycarbonyl-, p-Brombenzyloxycarbonyl-, · tert. -Butyloxycar-bonyl-, tert.-Amyloxycarbonyl-, p-Methoxybenzyloxycarbonyl-, 2-(p-Diphenyl)-isopropyloxycarbonyl-, Trityl-, Tosyl- oder Formylgruppe geschützt. Die Hydroxylgruppe von Tyrosin oder Serin kann durch die Acetyl-, Benzyl- oder tert.-Butylgruppe maskiert v/erden. Zum Schutz der Mercaptogruppe von Cystein kann die Ben-' zyl-, p-Methoxybenzyl- oder SuIfenylgruppe verwendet werden. .Die Guanidinogruppe von Arginin läßt sich durch Einführung der Nitro- oder Tosylgruppe schützen. Zum Schutz der Iminogruppe von Histidin kann die Benzyl-, Benzyloxycarbonyl-, Tosyl- oder tert.-Butyloxycarbonylgruppe verwendet werden. Diese bekannten Schutzgruppen lassen sich durch Hydrolyse, Reduktion oder Abspaltung durch Säure auf übliche Weise in jedem beliebigen Stadium der Peptidsynthese entfernen. Die so erhaltenen

> ι

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N-(9-nieder~Alkyl~9-fluorenyloxycarbonyl)-aminosäuren können als Zwischenprodukte in der Peptidsynthese verwendet v/erden. Ein neues Peptid, das die 9~nieder-Alkyl~9-fluorenyloxycarbonylgruppe als Aminoschutzgruppe enthält, kann durch Kondensation einer N-(9~nieder-Alkyl-9-fluorenyloxycarbonyl)-aminosäure mit einer anderen Aminosäure oder einem Peptid nach bekannten Verfahren hergestellt werden. Zu dieser Kondensation wird vorzugsweise das Carbodiimidverfahren /vgl. J.Am.Chem.Soc,Bd. 77 (1955), S. 1067; ibid., Bd. 78 (1956), S. 1367/, das Carbonyldiimidazolverfahren /vgl. Liebigs Ann.Chem., Bd. 609 (1957), S. 75/» das Verfahren mit aktivierten Estern, wie p-Nitrophenylester, N-Hydroxysuccinimidester, Pentachlorphenylester, Cyanine thylester oder p-Nitrophenylthiolester, /vgl. Nature, Bd. 175 (1955), S. 685; Helv.Chim.Acta, Bd. 40 (1957), S. 373; J. Am. Chem. Soc, Bd. 86 (1966), S. 1Ö39; Chem.Abstr,, Bd. 57 (1962), S. 7373; Helv.Chim.Acta, Bd. 38 (1955), S. 80; Liebigs Ann. Chem., Bd. 573 (1951), S. 99; Helv.Chim.Acta, Bd. 39, (1955), S. 872/, das Azidverfahren /vgl. J.Prakt.Chem., Bd. 70 (1904), S. 73, 89; Collection Czechoslov.Chem.Communs., Bd. 26 (1961), S. 23337 oder das Verfahren mit gemischten Anhydriden /vgl. J.Am.Chem.Soc, Bd. 74 (1952), S. 676/ verwendet. Peptide mit einer durch die genannten Schutzgruppen geschützten Aminogruppe können auch in fester Phase hergestellt werden /vgl. . J. Am.Chem. Soc, Bd. 85 (1964), S. 2149/. Gegebenenfalls können funktionelle Gruppen von Aminosäuren oder Peptiden, die an der Kupplungsreaktion nicht teilnehmen, mit den vorgenannten Schutzgruppen versehen werden. Es ist festzuhalten, daß bei

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dieser Kupplungsreaktion die durch die vorbeschriebene Acylierung als Ester, erhaltenen N-(9-nieder~Alkyl-9-fluorenyloxycarbonyl)-verbindungen zuerst nach üblichen Verfahren mit Basen ' hydrolysiert und anschließend die erhaltenen N-acylierten, freien Säuren als Carboxylkomponente nach bekannten Verfahren mit einer anderen Aminosäure oder einem.Peptid als Aminokomponente kondensiert werden. Liegen aber die N-(9-nieder-Alkyl~9-fluorenyloxycarbonyl)-verbindungen als N-acylierte, freie Säuren vor, so können sie ohne v/eitere HydroIysemaßnahmen zur anschließenden Peptidsynthese verwendet werden. Wird die ω-Aminogruppe von basischen Aminosäure, wie Lysin oder Ornithin,mit einem Aminogruppenschutzreagens der Erfindung acyliert, so kann, das erhaltene N^-acylierte Produkt als Aminkomponente bei der Kupplungsreaktion ungeachtet seiner Esterförm verwendet werden.-Auf diese Weise erhält man durch wiederholte Kupplungsreaktionen längerkettige Peptide.

In jedem beliebigen Stadium der Peptidsynthese kann die g-nieder-Alkyl-g-fluorenyloxycarbonylgruppe von der geschützten Aminosäure oder dem Peptid durch Behandlung mit einer Säure oder durch katalytisch^ Reduktion abgespalten werden. Bei der Entfernung der Schutzgruppe mit Säuren wird eine Lösung oder Suspension der geschützten Aminosäure oder des Peptids mit einer anorganischen oder organischen Säure behandelt. Als Saurer; können beispielsweise Halogenwasserstoffsäuren, wie Fluorwasserstoffsäure, Bromv/asserstoff säure oder Salzsäure, Schwefelsäure, Phosphorsäure, Trifluoressigsäure, Essigsäure, Ameisensäure, Monochloressigsäure, Methansulfonsäure, p-Toluolsulfonsäure oder Gemische dieser Säuren verwendet werden. Bei der Verwendung

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dieser Säuren lauft die Reaktion glatt bei Raumtemperatur unter Entwicklung von Kohlendioxid ab. Im allgemeinen ist die Entfernung der 9-nieder-Alkyl-9-fluorenyloxycarbonylgruppe bei 0 • bis 60⁰C innerhalb von 30 bis 120 Minuten beendet. Ira allgemeinen wird die Schutzgruppe vorzugsweise bei niedrigen, oder mäßigen Temperaturen entfernt, da Peptide bekanntlich bei erhöhten Temperaturen beeinträchtigt werden können. Man nimmt deshalb die Entfernung der Schutzgruppen vorteilhafterweise bei Temperaturen von 0 bis 30⁰C, insbesondere bei Raumtemperatur vor. Die Säure kann in Lösungsmitteln, die die Reaktion nicht beeinflussen, wie Wasser, Methanol, Dichlormethan, Essigsäure, Essigsäureäthylester oder Acetonitril, gelöst werden. Vorzugsweise setzt man die zum Entfernen der Schutzgruppe verwendete Säure in einem" 3 "bis lOfachen molaren Überschuß

ein, bezogen auf die geschützte Aminosäure oder das Peptid.

Die Aminoschutzgruppen der Erfindung können auch durch Hydrogenolyse in Gegenwart eines Katalysators, wie Palladiumkatalysatoren, z.B. Palladium-auf-Aktivkohle, Palladium-Mohr oder Palladium-auf-Bariumsulfat, Platinkatalysatoren, z.B. Platinoxid, Rutheniumkatalysatoren, z.B. Ruthenium-auf-Aktivkohle, oder Nickelkatalysatoren, z.B. Raney-Nickel, entfernt werden. Diese katalytische Hydrierung kann nach in der Peptidchemie . üblichen Verfahren durchgeführt werden. Vorzugsweise werden die ■ Schutzgruppen der Erfindung durch 30m.inütige bis östündige katalytische Hydrierung in einem Lösungsmittel bei Temperaturen nahe der Raumtemperatur abgespalten. Als Lösungsmittel werden dabei vorzugsweise Methanol, Äthanol, Essigsäure oder Gemische dieser'Lösungsmittel verwendet.

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carbonyl
Da die 9-nieder-Alkyl-9-fluorehyloxji£ruppen durch Behandlung mit Säure wesentlich schneller als Benzyloxycarbonyl- oder tert.-Butyloxycarbonylgruppen abgespalten werden können, lassen sich die Aminoschutzgruppen der Erfindung auch in Gegenwart dieser bekannten Aminoschutzgruppen selektiv entfernen. Beispielsweise kann eine Aminosäure oder ein Peptid mit zwei Aminogruppen zum Schutz der einen Aminogruppe mit der 9-nieder-Alkyl-9-■ fluorenyloxycarbonylgruppe versehen sein, während die andere ; Aminogruppe mit der Benzyloxycarbonylgruppe geschützt ist. Die

erstgenannte Schutzgruppe kann durch Behandlung mit Säure unter, milden Bedingungen unter Verwendung von Ameisensäure, Essigsäure j oder Trifluoressigsäure, gegebenenfalls in Anwesenheit eines • Lösungsmittels, wie Dichlormethan oder Wasser, entfernt v/erden, ; wobei die zweitgenannte Schutzgruppe nicht reagiert. Diese kann ( dann durch anschließende katalytische Hydrierung entfernt werden. Da die Aminoschutzgruppen der Erfindung unter alkalischen

Bedingungen stabil sind, werden sie bei der Verseifung von Aminosäureestern oder -peptiden nicht beeinträchtigt. Dies stellt einen besonderen Vorteil der Schutzgruppen der Erfindung dar. Außerdem können die Aminoschutzgruppen der Erfindung leicht in eine Aminogruppe von Aminosäuren oder Peptiden in zufrieden- \ stellender Ausbeute eingeführt werden, ohne daß Nebenreaktionen und Racemisierungserscheinungen auftreten. Ihre Schutzeigenschaften behalten sie auch während der Kupplungsreaktionen. Die Schutzgruppen der Erfindung weisen charakteristische UV-Absorptionsmaxima bei 208 bis 210 und 272 bis 275 mn■auf. Aufgrund dieser Eigenschaft kann das gewünschte Reaktionsprodukt \ im Verlauf dor ,Synthese oder Reinigung leicht nachgewiesen wer- den. " ■

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Die durch Verwendung der Verbindungen der Erfindung erhaltenen geschützten Aminosäuren und Peptide sind wertvolle Zwischenprodukte zur Herstellung von biologisch aktiven Polypeptiden.

Die Erfindung betrifft deshalb auch N-(9-nieder-Alkyl-9-fluorenyloxycarbonyl)-aminosäuren oder -peptide.

Die Beispiele erläutern die Erfindung.

I: Reapentien zur r.'infunrund der 9-Alkyl-9--fluorenyloxycar·- bonylgruppe

Beispieli

Kohl en s äur e -9 - ia ethy 1 - 9 - flu ο ren_y 1 -pheny 1 e s t er Eine unter Verwendung von 0,36 mMol Methyljodid auf übliche V/eise hergestellte Lösung von Methylmagnesium j odid in Diäthyläther wird bei einer Temperatur unter 10°C innerhalb von 2 Stunden tropfenweise zu einer Lösung von 54,0 g 9-Fluorenon in 350 ml Diäthyläther gegeben. Das Gemisch wird 2 Stunden bei Raumtemperatur gerührt und anschließend 16 bis 18 Stunden stehengelassen. Die erhaltene Lösung wird auf Eis gegossen. Anschließend wird das Gemisch mit Salzsäure angesäuert und mit Diäthyläther extrahiert. Die Ätherextrakte werden vereinigt, über Magnesiumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck zur Trockene eingedampft. Der erhaltene feste Rückstand wird mit Chloroform behandelt. Man erhält 47,8 g reines 9-Methyl-9-fluorenol in kristalliner Form. Aus dem FiI-trat lassen sich v/eitere 8,0 g Kristalle gewinnen. Die Gesamtausbeute beträgt 55,B g und der F. 174 bis 175°C. Das nach dem Umkristallisieren aus Tetrachlorkohlenstoff erhaltene Produkt

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weist &en gleichen Schmelzpunkt auf. UV-Spektrums ^{20S nm} ^ ^{= Z+0 300}^ ^{und 275}^m (£ = 13 600).

C₁₄H₁₂O; ■■'■■'- C- H
bei%: 85,68; 6,16;
gef.: 85,87; 6,07.

19,6 g des vorstehend erhaltenen Produktes werden in 200 ml Dichlormethan gelost,- und die Lösung wird mit 10,6 ml Pyridin versetzt. Anschließend kühlt man in einem Eisbad und versetzt innerhalb von 60 Minuten tropfenweise mit einer Lösung von 20,4 g Chloranieisensäurephenylester in 50 ml Dichlormethan. Das Gemisch wird 2 Stunden bei O⁰C und 1 Stunde bei Raumtemperatur gerührt. Anschließend wird das Reaktionsgemisch mit eiskaltem Wasser gewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet und unter'vermindertem Druck eingedampft. Der erhaltene feste Rückstand wird aus einer Mischung von Tetrachlorkohlenstoff und η-Hexan umkristallisiert. Man erhält 28,7 g Produkt vom

F.	98 Ms	99 C.	C	73j	H
C₂	1^H16°3^;		79,	75;	5,1O₅
	ber.:		79,		5,07.
	gef.:

Beispiel 2

Kohlensäure-g-methyl-g-fluorenyl-hydrazid und kohlensäure.-g-methvl-g-fluorenyl-äzid "^>r -'-^: ------^f-28,5 g des gemäß Beispiel 1 erhaltenen Kohlensäurephenylesters werden in 400 ml warmem Äthanol gelöst. Die Lösung wird auf Raumtemperatur abgekühlt und mit 18,2 ml 1OOprozentigem Hydrazinhydrat versetzt. Das Gemisch v/ird i Stunde bei Raumtemperatur gerührt und anschließend 16 bis 18 Stunden stehengelassen. Wach dem Entfernen des Lösungsmittels unter vermin- '

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■ -16- 223A7-98

dertera Druck wird der erhaltene Rückstand in Diäthyläther gelöst und die Lösung zweimal mit je 100 ml n-Natriumhydroxidlösung und zweimal mit je 100 ml V/asser gewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck zu einem kristallinen Rückstand eingedampft. Nach wiederholtem Umkristallisieren aus einer Mischung von Di chlorine than, Diäthyläther und η-Hexan erhält man 18,5 g reines Kohlensäure-9-methyl-9-fluorenyi-hydrazid vom F. 124 Ms 125°C. UV-Spektrum: /I ™3^0H 210 nm (£ = 43 600) und 272 nm

Ola X

*( r _*	14 400).	70	C	5	H	N
C₁₅H	14^N2°2^;	71	,85;	5	,55;	11,02;
	ber.:		,16;		,59;	11,28.
	gef.:

Eine Lösung von 1,27 g des vorstehend erhaltenen Hydrazids in 15 ml Acetonitril und ein Gemisch aus 2,5 ml 6n Salzsäure und 5 ml Acetonitril werden getrennt in einem Trockeneis-Acetonbad auf -30 bis -35°C gekühlt und anschließend vereinigt. Das Gemisch wird vorsichtig innerhalb von 10 Minuten mit 1,1 ml 5m Natriumnitrit versetzt und anschließend 10 Minuten bei der gleichen Temperatur gerührt. Sodann wird das Reaktionsgemisch mit 2n Natriumhydroxidlösung auf den ρττ-Wert 7 bis 8 gebracht. Nach dem Entfernen des Kühlbades läßt man die Temperatur auf O⁰C steigen. Anschließend wird mit 10 ml eiskaltem Wasser versetzt. Der entstandene Niederschlag wird abfiltriert, gründlich mit kaltem Wasser gewaschen und über Phosphorpentoxid in einem kühlen Raum getrocknet. Man erhält 1,25 g Kohlensäure-9-methyl-9-fluorenyl-azid vom F. 109 bis 110⁰C (Zersetzung), UV-Spektrum: Λ ^|°^{Η 21}° ^nm (£* 37 500) und 273 nm ( £= 14 400).

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	67	C	- 17	H	—	•	18;	tr	N	,84;	2234798
N-O₂;	67	,92;	4,	29;	15	,01.
t>er.:		,89;	4,	16
gef.:

Beispiel 3

Kohlensäure-g-raethyl-g-fluorenyl-p-nitrophenylester 1,96 g 9~Methyl-9-fluorenol werden in 20 ml Dichiormethan gelöst, und die Lösung wird mit 1,06 ml Pyridin versetzt. Anschließend wird die Lösung mit einem Eis.bad. gekühlt und mit einer Lösung von 2,62 g Chlorameisensäure-p-nitrophenylester in 5 ml Dichlormethan versetzt. Das Gemisch wird 2 Stunden bei · O⁰C und 1 Stunde bei Raumtemperatur gerührt. Anschließend wird das Reaktionsgemisch mit eiskaltem Wasser geVaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck eingedampft. Man erhält kristallinen Kohlensäure-9-methyl-9~fluorenylp-nitrophenylester. Nach dem Behandeln mit einer Mischung von Diäthyläther und η-Hexan und anschließendem Trocknen erhält

man 2,89 g Produkt. IR-Spektrum (Nujol): 1773 (C=O) und 1263 (-0-C-O-) cm"¹. ■

It

Ils N-(9-Methyl-9-fluorenyloxycarbonvl)-aminosäuren und -peptide

Beispiel 4

N-(9-Methyl-9~fluorenyloxvcarbonyl)-L-phenylalanin-methylester (a) Isocyanatverfahren: .

1,08 g L-Phenylalanin-methylester-hydrochlorid werden in 15 ml wasserfreiem Toluol suspendiert, und in die Suspension wird

wasserfreien 90 Minuten bei einer Badtemperatur von .120 bis 130 Ct'Phosgen eingeleitet. Die erhaltene klare Lösung wird unter vermindertem Druck eingedampft. Man erhält das entsprechende Isocyanat₅als

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Öl. Ein Gemisch aus 0,90 g 9-Methyl-9-fluorenol, 2 ml Pyridin und dem vorstehend erhaltenen Isocyanat werden 2 Stunden unter Rückfluß erwärmt und anschließend unter vermindertem Druck eingedampft. Der Rückstand wird in Chloroform gelöst und die Lösung auf eine mit 40 g Kieselgel (0,05 bis 0,2 mm, E. Merck) beschickte und mit Chloroform äquilibrierte Säule aufgesetzt. Die Säule wird mit Chloroform, das 1 Prozent Methanol enthält, eluiert, und 10 ml-Fraktionen werden abgenommen. Die das gewünschte Produkt enthaltenden Fraktionen 5 bis 13 v/erden vereinigt und unter vermindertem Druck eingedampft. Der erhaltene Rückstand wird aus einer Mischung von Diäthyläther und Petroläther umkristallisiert. Man erhält 1,24 g Produkt vom F. 100 bis 105⁰C /Ö7q² + 73,0 + 1,2° (c = .1,0; Chloroform). UV-Spektrum: Λ S^{0H 210 nm} (£ = 44 900) und 272 nm (£ = 13 950).

^NO, :.	C	80;	5	H-	N
ber.:	74,	66;	5	,78;	3,49;
gef.:	74,		,89;	3,41.

(b) Acylierung mit Kohlensäureesterazid:

0,87 g L-Phenylalanin-methylester-hydrochlorid werden in 10 ml Dimethylformamid gelöst, und die Lösung wird mit 1,4 ml Triäthylamin versetzt. Anschließend wird die in einem Eisbad gekühlte Lösung mit einer Lösung von 1,25 g Kohlensäure-9-raethyl-9-fluorenyl-azid in 5 ml Dimethylformamid versetzt. Das Gemisch wird einige Stunden bei O⁰C gerührt, 16 bis 18 Stunden bei Raumtemperatur stehengelassen und anschließend unter vermindertem Druck eingedampft. Der erhaltene Rückstand wird in Dichlormethan gelöst und die Lösung mit V/asser gewaschen, über Magne~ siumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck eingedampft.

2-09884/1412

Der erhaltene kristalline Rückstand wird aus einer Mischung
von Dläthyläther und Petroläther umkristallisiert. Man-erhält 1,21 g Produkt vom F. 100 bis 105⁰C /a/j^ + 72,3 -f 1,1°

(c	= 1,0;	Chloroform). -	H	78;	N	49;
C₉	TT JM f\	; C	5,	87;	3,	41.
	ber.	: 74,80;	5,		3,
	gef.	: 74,77;

(c) Acylierung mit Kohlensäure-p-nitrophenylester:
Eine Lösung von 0,43 g L-Phenylalanin-methylester-hydrochlorid und 0,56 ml Triethylamin in 0,6 ml eines zu gleichen Volumenteilen aus Dimethylformamid und Di chlorine than bestehenden
Gemisches wird mit 0,72 g Kohlensäure-9-methyl-9-fluorenyl-pnitrophenylester versetzt. Das Gemisch wird 3 Tage bei Raumtemperatur gerührt. Anschließend wird das Lösungsmittel unter vermindertem Druck abgedampft, der Rückstand in Dichiormethan gelöst und die Lösung mit V/asser gewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck eingedampft. Der erhaltene Rückstand wird gemäß Beispiel 4 (a) an einer Kieselgel-Säule chromatographiert. Man erhält 0,45 g Produkt vom
F. 100 bis 102⁰C. /cc/J^ + 72,6 + 1,2° (c = 1,0; Chloroform).
C₂₅H₂₃HQ₄; ^ - C .H N

ber.:	74,80;	5,	78;	3,49;
gef.:	74,75;	5,	80;.	3,45.

■-.,..- „.._:,- Beispiel 5

picyclohexyl'amjnsalz von N-(9-Methyl-9-fluorenyloxycarbonyl)-L-phenylalanin . - - . .

1,65 g L-Phenyüalanin v;erden in 4,7 ml 40prozentigem Triton B (Methanollösung von Trimethylbenzylammonium-hydroxid) gelöst^

209884/U12

und die Lösung\unter vermindertem Druck eingedampft. Anschließend versetzt man das Gemisch mit 2,1 ml Triethylamin und einer Lösung von 2,65 g Kohlensäure^-raethyl-S-fluorenylazid in 7 ml Dimethylformamid. Das Reaktionsgemisch wird 6 Stunden bei Raumtemperatur gerührt und schließlich unter vermindertem Druck eingedampft. Der Rückstand wird in einem Eisbad gekühlt und in Gegenwart von Diäthyläther mit eiskalter 1m Citronensäure angesäuert. Die wäßrige Phase wird zweimal mit kaltem Diäthyläther extrahiert. Die Ätherlösungen werden vereinigt, über Magnesiumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck eingedampft. Man erhält N-(9-Methyl-9~fluorenyloxycarbonyl)-L-phenylalariin als sirupösen Rückstand. Der Sirup wird in 100 ml Diäthyläther gelöst und die Lösung zu 2,0 ml Dicyclohexylamin gegeben. Das ausgefallene kristalline Aminsalz dos gewünschten Produktes wird abfiltriert, mit Diäthyläther gewaschen und im Vakuumexsikkator getrocknet. Nach dem Umkristallisieren aus einer Mischung von Methanol und Diäthyläther erhält man 5,25 g Produkt vom F. 177 bis 179°C (Zersetzung). A/q⁴ + "54-,3 + 1,0° (c = 1,0; Methanol).

C₂₄H₂₁NO₄X₁₂H₂₃N; CH N

ber.: 76,02; 7,80; 4,93; gef.: 76,05; 7,76; 5,21.

Beispiel 6 N-(9-Methyl-ft-fluorenyloxycarbonyl)-glycin

0,75 g Glycin werden gemäß Beispiel 4 (b) mit 2,65 g Kohlensäure~9-methyl-9--fluorenyl-azid acyliert. Die gewünschte Verbindung wird aus Dichlormethan kristalliert und anschließend aus Äthanol umkristallisiert. Man erhält 0,78 g Produkt vom

2Q9884/U12

F. 157 bis 159°C (Zersetzung).

C₁₇H₁₅NO₄; C H '" N ber.: ' 68,68; 5,09; -4,71; gef.: 68,77; 5,22; 4,74.

Beispiel 7

Cyclohexylaminsalz von N-(9-Methyl-9-fluorenyloxycarbonyl) -γ-benzyl-L-glutaminsäure ■

Eine Suspension von 2,37 S L-Glutaminsäure-y-benzylester in 40 ml Dimethylformamid wird mit 3,5 ml Triäthylamin und einer Lösung von 3Λ5 g Kohlensäure-9-methyl-9-fluorenyl-azid in 10 ml Dimethylformamid versetzt und 48 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Nach dem Abdampfen des Lösungsmittels unter vermindertem Druck bei einer Badtemperatur von 45⁰C wird der Rückstand in Diäthyläther gelöst. Die Lösung wird mit eiskalter lOprozentiger Citronensäure gewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet und anschließend unter vermindertem Druck eingedampft. Man erhält N-(9-Methyl-9-fluorenyloxycarbonyl)-L-glutaminsäure-y-benzylester als sirupösen Rückstand. Der Rückstand wird in Diäthyläther gelöst und die Lösung mit 1,0 g Cyclohexylamin versetzt-. Das nach 16 bis 18stündigem Stehen bei 4⁰C ausgefallene kristalline Aminsalz wird abfiltriert, mit kaltem Diäthyläther gewaschen und getrocknet. Nach dem Um-

kristallisieren aus einer Mischung von Methanol und Diäthyläther erhält man 3,48 g des gewünschten CyclohexylaminsalZes vom F. 109 bis 111⁰C /q/S⁵ + 11,5 + 0,6° (c = 1,0; Methanol).

C₂₇H₂₅NO₆. (	C	95;	H	5	N-
	70,	89;	6,86;	5	,01;
	70,	6,88;	,10.
'6^H13^Ni
ber»:
gef.:

2098B4/U12

Beispiele Dicyclohexylaminsalz von N- (9-Methy1-9-fluorenyloxycarbonyl)-

L-tryptophan und einige M-geschützte Aminosäurederivate ·

, werden , ,

2,04 g L-Tryptophan in 4,7 ml Triton B (Methanollösung von Tribenzylammoniumhydroxid) gelöst, und die Lösung wird unter vermindertem Druck eingedampft. Der erhaltene Rückstand wird in 4 ml Dimethylformamid gelöst und anschließend bei Raumtemperatur mit 2,65 g Kohlensäure-9-methyl-9-fluorenyl~ azid, 7 ml Dimethylformamid und 2,75 ml Triäthylamin versetzt. Das Gemisch wird 5 Stunden bei Raumtemperatur gerührt und anschließend 16 bis 18 Stunden bei 0⁰C stehengelassen. Sodann wird das Reaktionsgemisch unter vermindertem Druck eingedampft. Der erhaltene ölige Rückstand wird mit 50 ml Essigsäureäthylester und 50 ml Wasser vermischt und das Gemisch mit 1m Citronensäure auf den pp-Wert 3 bis 4 gebracht. Die angesäuerte Lösung wird mit Essigsäureäthylester extrahiert, und die organischen Extrakte werden vereinigt, über Magnesiumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck eingedampft. Man erhält N-(9-Methyl-9-fluorenyloxycarbonyl)-L-tryptophan als Öl. Dieses Öl wird in 50 ml Essigsäureäthylester gelöst und die. Lösung mit 1,8 g Dicyclohexylamin versetzt. Nach dem Abdampfen des Lösungsmittels unter vermindertem Druck wird der Rückstand mit Diäthyläther behandelt. Man erhält das Dicyclohexylaminsalz von N-(9-Methyl-9-fluorenyloxycarbonyl)-L-tryptophan als

von 23 ο

amorphes Produkt in einer Ausbeutel 5,54 g. L⁰¹J-Q + 54,1 + 1,0 (c = 1,0; Methanol).

-209884/1412

	C	09;.	- 23 -	N	2234798
	75,	72;	- Ή	6,91;
ber.:	74,	7,46;	6,70.
gef-. V		7,54;

Gemäß dem vorstehend beschriebenen Verfahren erhält man folgende Verbindungen:

Dicyclohexylarainsalz von N- (9-^Methyl-9-fluorenyloxycarbonyl)-O-benzyl-L-serin vom F. 155 bis 1-59⁰C in einer Ausbeute von 92 Prozent der Theorie, /<s7jp + 22,3 + 1,0° (c = '1,0; Methanol),

C₃₇H₄₆N₂O₅; C . H Ν' ber.: 74,22; 7,74; 4,68;' gef.: 73,88; 7,96; 4,80.

Dicyclohexylarainsalz von N- (9-Me thyl-9-f luorenyloxycarbonyl) -L-alanin vom F. 148 bis 150°C in einer Ausbeute von 75 Prozent

	C	*	—.- *	18;	5	■,"",
^C3O^H4O^N2°4'·	73,		H	3o;	5	N
ber.:	73,	14	; 8,		,69;
gef.:	24	; 8,		,56.

Cyclohexylaminsalz von U^a~(9-Methyl-9-fluorenyloxycarbonyl)-

N"-benzyloxycarbonyl-L-lysin in einer Ausbeute von 63 Prozent der Theorie als amor
(c= 0,6; Methanol).

der Theorie als amorpher Feststoff, /ö/^² +12,3+1,0°

C_7rH.^N-,0₆; CH N ber.: ,69,86; 7,20; 6,98; gef.: 68,87; 7,33; 6,88.'

Dicyclohexylaminsalz von N -(9-Methyl-9-fluorenyloxycarbonyl)-N -benzyloxycarbonyl-L-lysin in einer Ausbeute von 62 Prozent der Theorie als amorpher Feststoff, /o/q/ + 10,9 +. 1,0° (c = 1,0; Methanol).

209884/U12

C₄₁H₅₃N₃O₆.H₂O; C HN

ber.: 71,07; 7,86; 6,06; gef.: 70,57; 7,71; 6,07,

Dicyclohexylaminsalz von N-(9-Methyl-9-fluorenyloxycarbonyl)-L-glutamin in einer Ausbeute von 83 Prozent der Theorie als amorpher Feststoff, /α/ρ + 1,1 + 1,0 (c = 1,0; Methanol).

C₃₂H₄₃N₃O₅.1/2H₂O; C. H N ber.: 68,79; 7,94; 7,52; gef.: '68,86; 7,94; 7,53.

B e i s ρ i e 1 9

N-(9-Methyl-9-fluorenyloxvcarbonvl)-L--phenylalanyl-L-phenyl·- alanin-methylester

2,84 g Dicyclohexylaminsalz von N-(9-Methyl-9-fluorenylbxycarbonyl)-L-phenylalanin werden in einem Gemisch aus 20 ml · V/asser und 40 ml Diethylether suspendiert, und die Suspension wird in einem Eisbad gekühlt. Anschließend wird die Suspension mit 1m Citronensäure versetzt und das Gemisch solange geschüttelt, bis der Feststoff vollkommen gelöst ist. Die wäßrige Phase wird abgetrennt und zweimal mit je 20 ml Diäthylather extrahiert. Die vereinigten Ätherextrakte werden über Magnesiumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck eingedampft. Der erhaltene ölige Rückstand wird mit einer Lösung von L-Phenylalaninmethylester (auf übliche Weise aus 5 mMol des entsprechenden Hydrochlorids hergestellt) in 20 ml Methylendichlorid und anschließend mit 1,03 g. N,N¹-Dicyclohexylcarbodiimid versetzt. Das Gemisch wird 16 bis 18 Stunden bei O⁰C gerührt. Das Reaktionsgemisch wird vom ausgefallenen Dicyclohexylharnstoff abfiltriert und das Filtrat

209884/1412

VNSPECTfcD

unter vermindertem Druck eingedampft. Das erhaltene farblose Öl wird in 40 ml- Essigsäureäthylester gelöst und die Lösung mit lOprozentiger Citronensäure und anschließend 50prozentiger Natriumhydrogencarbonatlösung gewaschen. Die organische Phase wird über Magnesiumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck zu einem schaumigen Rückstand eingedampft. Nach dem Trocknen über Phosphorpentoxid erhält man 2,56 g N-(9-Methyl-9-f luor enyl oxycarbönyl) -^L-phenylalanyl-L-phenylalanin-methylester als farbloses .Pulver. Dieses Produkt ergibt bei der Dünnschichtchromatographie an Kieselgel mit einer Mischung aus Chloroform und Methanol (9:1 Volumenteile) einen einzigen Flecken. £α.]ψ - 10,4 + 0,5° (c = 1,0; Methanol}. .

B e i s ρ i e.l 10 ■ ■

Dieyclohexylaminsalz von N-(9-Methyl-9-fluorenyloxycarbonyl)-L-phenylalanin (Verseifung des entsprechenden Esters) 0,40 g N-(9-Methyl-9-fluorenyloxycarbonyl)-L-phenylalaninmethylester werden in 4 ml Methanol gelöst, und die Lösung wird mit 1 ml 2n Natriumhydroxidlösung versetzt. Das Gemisch wird 30 Minuten bei Raumtemperatur gerührt. Anschließend v/ird das Reaktionsgemisch unter Eiskühlung mit 1m Citronensäure neutralisiert. Nach dem Abdampfen des organischen Lösungsmittels unter vermindertem Druck wird die erhaltene Lösung unter Kühlung mit 1m Citronensäure angesäuert und anschließend mit Essigsäureäthylester extrahiert. Die organischen Extrakte werden vereinigt, gründlich mit Wasser gewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck eingedampft. Das als sirupöser Rückstand erhaltene N-(9-Methyl-9-fluarenyloxycarbonyl)-L-phenylalanin wird in 20 ml Diäthyläther gelöst. Die .LS-

209884/1412

sung wird mit 0,2 ml Dicyclohexylamin versetzt. Beim Stehenlassen fällt das Dicyclohexylaminsalz von N-(9-Methyl-9-fluorenyloxycarbonyl)-L~phenylalanin in einer Ausbeute von 0,36 g aus. Der F. beträgt 177 bis 178°C (Zersetzung). ⁴ + 65_rO + 1,0° (c = 1,0; Methanol).

C₂₄H₂₁NO₄-C₁₂H₂₃M; CHN

ber.t 76,02; . 7,80; 4,93; gef.: 76,11; 7,73; 4,90.

III: Entfernung der Schutzgruppe

Beispiel 11

L-Phenylalanyl-L-phenylalanin-methylester-formiat (Abspaltung unter Säureeinwirkung)

0,2.0 g gemäß Beispiel 9 erhaltener N-(9-Methyl-9-fluorenyloxycarbonyl)-L-phenylalanyl-L-phenylalanin-methylester werden in 1 ml einer 20prozentigen Lösung von Ameisensäure in Dichlormethan gelöst. Die Lösung wird 30 Minuten bei Räumtemperatur stehengelassen. Nach Zusatz von je 10 ml V/asser und Diäthyläther wird das Reaktionsgemisch geschüttelt und die wäßrige Phase abgetrennt. Die wäßrige Lösung wird mit Diäthyläther gewaschen und lyophilisiert. Das dabei erhaltene Pulver wird aus einer Mischung von Äthanol und Diäthyläther kristallisiert und aus dem gleichen Lösungsmittel umkristallisiert. Man erhält 0,08 g Produkt vom F. 113 bis 114⁰C. /ö/^⁵ +3,8 +1,0 (ca 1_fO; Methanol).

209*84/1412

"■■""'. B e i s pie 1 12 -

Bildung vori L-Alanin aus dem Dicyclohexylaminsalz von N-(9~Methyl~9"fluorenyloxycarbonyl)-L-alanin (durch katalytisehe Hydrierung) ,

493 mg Dicyclohexylaminsalz von N-(9-Methyl-9-fluorenyloxycarbonyl)-L-alanin werden in 10 ml eines Gemisches aus Essigsäureäthylester und lOprozentiger Essigsäure suspendiert. Die Suspension wird unter Eiskühlung bis zur vollständigen Lösung geschüttelt. Die organische Phase wird abgetrennt, mit Wasser gewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck eingedampft. Die in Form eines Öles erhaltene freie Säure wird in 10 ml Methanol gelöst-und 3 Stunden bei.Raumtemperatur unter Verwendung von PäHadiüft-Eohr 41s. Katalysator hydriert. Nach dem Abfiltrieren des Katalysators wird, das FiI-trat unter vermindertem Drück eingedampft. Der erhaltene Rückstand wird mit Diäthyläthei* und Wasser versetzt'. Die wäßrige Phase wird unter vermindertem Druck eingedampft. Der erhaltene kristalline Rückstand wird, aus einer Mischung von Äthanol und V/asser in quantitativer Ausbeute zu L-Alanin umkristallisiert. Dieses Produkt ergibt nach Dünnschichtchromatographie einen einzigen ninhydrin-positiven Flecken, der mit dem Ninhydrinflecken einer authentischen L-Älaninprobe, identisch ist. Die Ausbeute beträgt 86 mg und-der F. 296⁰C (Zersetzung).-

IV: Kinetik der Abspaltung der Aminoschutzgruppen durch Säuren

B e i s ρ i e 1 13 '

Die Kinetik der Abspaltung der Aminoschutzgruppen durch Säuren wird im Vergleich zu den bekannten Aminoschutzgruppen, der

2 0 9 8 8 A /U \2. OBMHAL INSPECTED

ϊ- U'" ι Ή. if- iii^: ^;&* V *ί-ί ,'/*-

2-(p-Diphenyl)-isopropyloxycarbonyl- und tert.-Butyloxycarbonylgruppe, die durch Behandlung mit Säure unter milden Bedingungen entfernbar sind," untersucht.

Un t e r su . c hte^ Vo rb imlung Bn₁:

Dicyclohexylarninsalz von N- (9-Methyl-9-fluorenyloxycarbonyl )-L-phenylalanin (Mfoc. Phe. I)CHA)',

N- (9-Methyl-9-f luorenyloxycarbonyl) -L-phenylalanyl-L-phenylalanin-methylester (Mfοc.Phe.Phe.OHe),

Dicyclohexylaminsalz von N-/2-(p-Diphenyl)-isopropyloxycarbonyl7~L-phenylalanin (Bpoc.Phe.DCHA),

j\j_/2-(p-Diphenyl )-isoj)roxjyloxycarbonyl7-L-phenylalanyl-L·-
phenylalanin-methylester (Bpoc.Phe.Phe.OMe),

Dicyclohexylaminsalz von N- (tert. -Butj-l oxy carbonyl) -L-phenylalanin (Boc.Phe.DCHA).

Verfahren zur^Bestimmung der Kinetik
/Ά/ Verfolgung der optischen Drehung:

20 rag der zu untersuchenden Verbindung werden mit einer Säure auf ein Volumen von 1 ml gebracht. Die Lösung wird sofort in eine Meßzelle gebracht und die optische Drehung bei 25⁰C in
gleichbleibenden Zeitabständen gemessen, um die Konzentration der im sauren Medium verbleibenden Testverbindung festzustellen. Die Geschv/indigkcitskonstante der sauren Hydrolyse wird nach folgender Gleichung berechnet:

_β K₁ (a-x) —> Ic₁ = ~L _ln _JL_ ^^L. _log _S_ dt t a-x t a-x

209884/1412

in der k^ die Geschwindigkeitskonstante erster Ordnung, a die Anfangskonzentration der Testverbindung und χ die in der Zeit t umgesetzte Menge der Verbindung ist. Aus obiger Gleichung läßt sich die Halbwertszeit T der Schutzgruppe bei saurer Hydrolyse bestimmen, wenn, für χ a/2 eingesetzt wird. Man erhält folgende Gleichung: Ln 2/k^ = (2,303)log 2/k^.

~/17 Pptentiornetrische, Titration;

0,2 mllol der zu untersuchenden Verbindung werden mit einer Säure auf ein Volumen von 2 ml gebracht, und das Gemisch wird bei 25 C gehalten. In bestimmten Zeitabständen werden jeweils 0,2 ml Lösung aus dem Gemisch entnommen und mit 1,5 ml Eisessig verdünnt. Die verdünnte Lösung wird sofort mit einer 0,02 η Perchlorsäurelösung in Eisessig titriert, um die Konzentration der freigesetzten Aminogruppe zu bestimmen. Die daraus erhaltenen Werte werden zur Bestimmung der Geschwindigkeitskonstante und der Halbwertszeit in die vorstehende Gleichung eingesetzt. ,

209884/U12

Ergebnisse:

Säure

80 % CII_xCOOH Unterauchte Verbindung· . ■>

Mfoc.Phe.DCHA iMIoc.Phe.Phe«OMe

!Mfoc.Phe.DCHA IMfoc.Phe.Phe.OMe

Maßeinheiten:

-3

k₁=9,45x1O

T=73.3

(Verfahren A) |

20 % HCOOH in CH^COOH

= 14,7

(Verfahren A)

=9,89x10~³

=70,1
(Verfahren B)

"³

Z= 14,7

(Verfahren A)

"*²

,=6,91x10"-" i ^ =4,38x10"

(Verfahren B) (Verfahren B)

k^ /min"_/; 'C /min/»

* Die Abspaltung der Boc-Gruppe läßt sich dünnschichtchroinatographisch nach 42stündigem Stehen bei 25°C feststellen.

Bpοc.Phe.DCHA	OMe	k_iS3,23x10-²"	A)	ί
		"T =21,6 (Verfahren
Bpoc.Phe.Phe.	OHe	-		k =1 29x10 I
				(Verfahren A)
Bpoc.Phe.Phe.		-		^=2,12χ10"¹
				·ΐ=3,27 (Verfahren B)
Boc.Phe.DCHA	*		-

209884/U12

Claims

P a t e η t a μ V₁O rjue to e

•lyea'rbonyl'derlvate der a 1 !gemeiner; Formel I

"~ ^Rl

a ² -

in der R^ einen niederen Alkylrest und R₀ eine Azidogruppe oder einen substituierten oder nicht substituierten Plienoxyrest der allgemeinen F'orrael II bedeutet

wobei m eine ganze Zahl mit einem ¥ert von 1 bis 5 "und Y ein Wasserstoff« oder Halogenatora oder die Nitrogruppe ist,

2. Verbindungen der allg-omeinen Formel X, dadurch gekennzeichnet, daß R,- die !-!ethylgruxjpe und Rp den Rest der allgemeinen Formel II bedeutet, wobei m die gleiche Bedeutung wie in Anspruch 1 hat und Y ein Wasserstoffatom oder die Nitrogruppe ist.

20 9 884/ U \2

2234738

w&ü.

Kohlensäure -3~imetliyl-9-

4. Verfahren ζητ Herstellung der ¥eribinöiuitageiii ma<ch Ansprach 1·, dadurcti ,gekennzelclmet, daß man

(a) ein g-nleder-Alkyl-g-iluoreiiol der allgemeine© Formel III

In der R,- die glelclie Bedeutung wie In Anspruch i hat» üiit einem Halogenarnelsensäureester der allgemeinen Formel IV

X-C-O-Rfc (IV)

in der X ein Halogenatom und R^ einen substituierten oder nicht substituierten Phenylrest der allgemeinen Formel V bedeutet

, v~(Y)m

in der Y und m die gleiche Bedeutung wie in Anspruch 1 haben, zu einem Kohlensäureester der allgemeinen Formel VI umsetzt

20S8 84/U12

in der R^- und R^ die vorstehend angegebene Bedeutung haben, und gegebenenfalls

(b) den Kohlensäureester der allgemeinen Formel ¥1 mit Hydrazin zu einem Kohlensäureesterhydrazid der allgemeinen Formel VII umsetzt

(VII)

0-C-NHNH₉
0

in der R₁ die vorstehend angegebene Bedeutung hat, in einem sauren Medium mit einem Nitrit der allgemeinen Formel VIII

R₅ - ONO (VIII)

in der Rp- ein Wasser st off atom, einen niederen Alkylrest oder ein Alkalimetallkabion bedeutet, zu einem Kohlensäureesterazid der allgemeinen Formel IX umsetzt

in der R^ die vorstehend angegebene Bedeutung hat.

. Verwendung der Verbindungen nach Anspruch 1 zum Schutz von

Aminogruppen von Aminosäuren oder Peptiden bei der Peptidsynthese;

6. Verfahren zur Herstellung von N~(9-nieder-Alkyl-9-fluorenyloxycitrbonyl)-aminosäuren, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Aminogruppe einer Aminosäure oder eines Aminosäureesters mit

20988A/U12

einer Verbindung nach Anspruch 1 acyliert.

7·. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß man als Aminosäure Glycin, Alanin, Valin, Norvalin, Leucin, Norleucin, Isoleucin, Serin, Threonin, Cystein, Cystin, Methionin, Asparaginsäure, Asparagin, Glutaminsäure, Glutamin, Lysin, Ornithin, Citrullin, Arginin, Phenylalanin, Tyrosin, Histidin, Tryptophan, Prolin, Hydroxyprolin, ß-Alanin, y-Aminobuttersäure, a-Aminoisobuttersäure, α,ß-Diaminopropionsäure, a,y-Diaminobuttersäure, Sarcosin oder andere natürlich vorkommende oder synthetische Aminosäuren verwendet.

8. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß man als Aminosäureester eine mit einem niederen Alkanol oder einem nieder-Arylalkylalkohol veresterte Aminosäure verwendet.

9. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß man als Acylierungsmittel Kohlensäure-9-methyl-9-fluorenyl-phenylester, Kohlensäure-9-methyl-9-fluorenyl-azid oder Kohlensäure-9-methyl-9-fluorenyl-p-nitrophenylester verwendet.

10. Verfahren zur Herstellung von N- (9-nieder-Alkym3-fluorenyloxycarbonyl)-aminosäureestern, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Isccyanat der allgemeinen Formel XI

O=C=N-R₅ (XI)

in der R^ der um ein Wasserstoffatom de<r Aminogruppe verminderte Rest eines Aminosäureesters ist, mit einem 9-nieder-Alkyl-9-fluorenol der allgemeinen Formel III

209884/U12

, fill)

in der R^ die' gleiche Bedeutung wie in ünsprueh 1_: hat,, araasetzt.

11, Verfahren nach Anspruch 1Q_: dadurch gekennzeichnet., daß man eine mit einen* niederen JöJkanol oder einem nieder-JLspyJL-alkylalkohol veresterte /aminosäure verwendet.

12. Verfahren zur Entfernung der W-(9-nieder-JÖJkylH9-:ÖLM©renyloxycarbonyl)-Schutzgruppe von Aminosäuren oder Peptideia oder deren Derivaten, dadurch gekennzeichnet, daB man zur EntJfernung der Schutzgruppe eine Säure verwendet.

IJ). Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet;, daß man eine Halogenwasserstoffsäure, Schwefelsäure, Phosphorsäure, Trifluoressigsäure, Essigsäure, Ameisensäure,, Monochiorsssigsäui'e, Methansulf onsäure, p-Toluolsulfonsäure oder eiia Gemisch dieser Säuren verwendet.

14. Verfahren zur Entfernung von M-i9~nieder-iOL1i:yl-9-iliiorenyloxycarhoriyl)-Schutzgruppen von Aminosäuren oder Peptiden oder deren Derivaten, dadurch gekennzeichnet, daß man die Schutzgruppe durch katalytisch^ Hydrierung entfernt,

15. Verfahren nach lnspr"uch Ik₉ dadurch gekennzeichnet, daß man als Katalysator Palladium-auf-.Aktivkohle, Palladiuai-Mohr, Palladium-auf-Bariumsulfat, Platlroxid» Rutheiaiuia-auf-iilitivkohle odoi¹ Raney-Nickel verwendet.

209884/U12

16. Ν-(9-nieder-Alkyl-9-fluorenyloxycarbonyl)-aminosäuren, N- (g-nieder-Älkyl-g-fluo-renyloxycarbOnyl)-peptide und deren Derivate.

17· Verbindungen nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß sie als Aminosäurerest die Reste von Glycin, Alanin, Valin, Norvalin, Leucin, Norleucin, Isoleucin, Serin, Threonin, Cystein, Cystin, Methionin, Asparaginsäure, Asparagin, Glutaminsäure, Glutamin, Lysin, Ornithin, Citrullin, Arginin, Phenylalanin, Tyrosin, Histidin, Tryptophan, Prolin, Hydroxyprolin, ß-Alanin, γ-Aminobuttersäure, cc-Aminoisobuttersäure, α,ß-Diaminopropionsäure, α,y-Diaminobuttersäure, Sarcosin oder natürlich vorkommende oder synthetische Amino-säuren enthalten.

18. Verbindungen nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß sie als weitere Schutzgruppen die Benzyloxycarbonyl-, p-Nitrobenzyloxycarbonyl-, p-Brombenzyloxycarbonyl-, tert.-Butyloxycarbonyl-, tert.-Amyloxycarbonyl-, p-Methoxybenzyloxycarbonyl-, 2-(p-Diphenyl)-isopropyloxycarbonyl-, Trityl-, Tosyl-, Formyl-, Acetyl-, Benzyl-, tert.-Butyl-, p-Methoxybenzyl-, Sulfenyl-, Nitro-, Methylester-, Äthylester-, tert.-Butylester-, Benzylester oder p-Nitrobenzylestergruppe oder 2 oder mehr dieser Gruppen enthalten.

19. N-(9-Metbyl-9-fluorenyloxycarbonyl)-aminosäuren,

N-(9-Methyl-9-fluorenyloxycarbonyl)-peptide und deren Ester.

209884/U12

20. Verbindungen nach Anspruch 19»· dadurch gekennzeichnet, daß sie eine der in Anspruch 1 ¹J aufgeführten Aminosäurereste enthalten. . · *

21. Verbindungen nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß die Ester sich von niederen Alkanolen oder nieder-Aryl-

alkylalkoholen ableiten. " . '

209834/U12