DE1445450A1 - Verfahren zur Herstellung von Peptiden - Google Patents
Verfahren zur Herstellung von PeptidenInfo
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Description
Patentanmeldung P I1* ^5 450,3
■-I American Cyanamid Company, Wayne, i.'ew Jersey, V.St.A.
Verfahren zur Herstellung von Peotiden
Die Entwicklung neuer und besserer Verfahren für Peptidsynthesen ist eine wichtige Aufgabe der modernen Forschung
auf dem Gebiet der organischen Chemie. Hohe Ausbeuten und einfache Maßnahmen für die Entfernung von
Nebenprodukten sind wesentliche Voraussetzungen für jede fortschrittliche Peptidsynthese, weil für die Herstellung
großer Peptide viele Stufen erforderlich sind. Jede Aminosäure muß in der richtigen Folge angebaut werden,
damit man die jeweils erwünschte Struktur erhält. Da den erzielbaren Ausbeuten und der Entfernung von
Nebenprodukten eine außerordentlich hohe Bedeutung zukommt, stellt jede Verbesserung in dieser Hinsicht einen
wesentlichen Fortschritt bei der Peptidsynthese dar. Ein solcher Fortschritt wird durch die erfindungsgemäße Peptidsynthese
erreicht, die mit M-Hydroxysuccinimidestern
durchgeführt wird.
Die für das erfindungsgemäße Verfahren verwendeten II-Ilydroxysuccinimidester
können durch folgende Formel dargestellt werden:
9 09848/1313
hvi-.ii. .._,',. .'r1 ·'♦ ■ ... 'ra-js./.4.!M1Mv.
| O | 0 | |
| ti | ;ι | |
| R | r% | |
| ι | ||
| I | ||
| R1 | C- | |
| Il | ||
2Hp
In dieser Formel bedeuten: X eine einwertige -Schutiijrup-■
pe, nämlich die Benzyloxycarbonyl-j tert.-Butoxycarbonyl-,
Triphenylmethyl- oder Trifluoracetyl-Gruppe, -Y 'Wasserstoff
öder zusammen mit X eine zv/eiv/ertige Schutzgruppe,
v/ie die Phthaloylgruppe, und R und R1 den von einer '
^-Aminosäure' noch verbleibenden Rest.
Diese Ester leiten sich von 06-Aminostiuren ab. Eine" grö^e
Gruppe solcher'X-Aminosäuren besteht aus den in der Natur
vorkommenden "^.-Aminosäuren, die beispielsweise von P,
Karrer in Organic Chemistry, 2. Englische Aufl., Elsevier Publishing Company, Inc., "ev/ York, 19'»o, beschrieberi sind.
Als Beispiele für in der Natur vorkommende Aminosäuren
seien genannt: Alanin, Sarin, Arainobuttersäure, Cystin,
Cystein, Methionin, Morvalin, Valin, Morleucin, Leucin,.
Isoleucin, Phenylalanin, Tyrosin, Dihydroxyphenylalanin,
Tryptophan, Arginin, Lys-in, HydroxyIysin, 0rnithin5 Asparaginsäure (^-Aminobernsteinsäure), Asparagin, Glutaminsäure,
Hydroxylglutaminsäure, Glutamin, Glycin, Histidin,
Thiolhistidin, Prolin, Hydroxyprolin, Tyrosin, Diiodüyrosin,
Thyroxin und Threonin. Da es sich hierbei um ·Χ-Aminocarbonsäuren
handelt, können sie durch folgende Formel dargestellt werden: ■
90 9 848/1313
BAD
NH.
■ο η
'R1
C-OH
worin R und Rf die den oben beschriebenen ^-Aminosäuren
eigenen Reste bedeuten.
Die für das erfindungsgemäße Verfahren verwendeten
N-Hydroxysuccinirnidester sind neu. Sie können hergestellt werden, indem man N-Hydroxysuccinimid mit einer
am Stickstoff geschützten c£-Aminosäure in Gegenwart von
NjN'-Dicyclohexylcarbodiimid nach folgender Reaktionsgleichung
| + HON ' | 0 II |
|
| R | , C | |
| "'N-C-COH | ||
| R' | C Il |
|
--CH,
-CH.
N,N'-Bicyclohexylcarbodiimid
R 0
I TI
•n-c-c-o-n:
e-
It
-CH.
-CH,
(X, Y, R und Rf haben die oben angegebenen Bedeutungen)
umsetzt.
909848/1313
BAD ORIGINAL
Die vorstehend angegebene Umsetzung wird gewöhnlich durchgeführt, indem man etwa äquimolare Mengen des N-Hydroxysuccinimids
und der am Stickstoff in üblicher
.Weise geschützten (.^-Aminosäure in einem geeigneten Lösungsmittel,
vorzugsweise einem nicht wäßrigen Lösungsmittel, bei Zimmertemperatur oder darunter löst, worauf
man unter Aufrechterhaltung der verminderten Temperatur
NjN.'-Dicyclohexylcarbodiimid in einem Überschuß über
die äquimolare Menge von etwa 10 % in dieser Lösung auflöst
und schließlich die Umsetzung gleichfalls bei verminderter Temperatur in einem Zeitraum von einer Stunde
bis zu mehreren Tagen praktisch vollständig ablaufen
läßt. Geeignete Lösungsmittel sind beispielsweise Tetrahydrofuran, Dioxan, Dimethoxyäthan und Dimethylformamid.
Im allgemeinen liegt die Temperatur, bei welcher die Um-setzung durchgeführt wird, zwischen etwa -5°C und etwa
25°C. Nach dem praktisch vollständigen Ablauf der Umsetzung lassen sich etwa gebildete Nebenprodukte, wie N,N'-Dicyclohexylharnstoff,
von dem gebildeten Ester in der · Regel durch übliche Methoden abtrennen, bei denen die
unterschiedlichen Löslichkeiten ausgenutzt werden. Die vorstehend beschriebene Umsetzung wird durch die in den
Beispielen 1 bis 7 beschriebenen Arbeitsweisen näher
erläutert.
Die erhaltenen N-Hydroxysuccinimidester sind im allgemeinen
kristalline beständige aktivierte Ester (vergleiche Beispiele 0 und 7), die mit besonderem Vorteil
für Peptidsynthesen, vor allem unter wäßrigen Bedingungen, wie weiter unten beschrieben, verwendet werden
können.
909848/1313
HA5450
Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren zur,-Herstellung von
Peptiden wird ein solcher N-Hydroxysuccinimidester mit;
einem Derivat einer C6-Aminosäure oder eines Peptids.
zu einem Peptidderivat umgesetzt.
Unter den Bezeichnungen "Aminosäurederivate." und "Pep- . ;·
tidderivate" sind jeweils zu verstehen: übliche Ester, -..
beispielsweise der Methyl-, Äthyl-,. n-Propyl-,Isopropyl-,
tert-Butyl-, Benzyl-, Phenyläthyl- oder ß-iiitrobenzylester,
oder Verbindungen mit salzbildenden Kationen, wie denen der Alkalimetalle, Natrium, Kalium und Lithium
und tertiären Amine, z»B. Trimethy!ammonium, Triäthylammonium
und Tripropylammonium.
BAD ORIGINAL 909848/1313
| 0 Il |
/ | It | PTJ | 2 | + | - ?.2- . ·. | - - - ' ■ . ■ | |
| R I |
ρ | 0 | v_ | H0N-C-COGZ- έ t |
- ·· ■ - - | |||
| N-C-COON^ | 2 | ■■■■■■■ R3 : | -CH^ : ■■■■' I - - ' - - - - -r |
|||||
| R | »11 | |||||||
| .:■■-■ .0 it |
||||||||
| 1 } |
p | |||||||
| R I | ||||||||
N-C-CONH-C-COOZ ι t
JR' - R^
+ HON'
■Q-—
II
-CH:
| 0 | ^CH0 | |
| It | ||
| R | C—— | |
| t | ||
| R · ■ · -.."- | Il | -CH2 |
^-C-CONH-peptld-COOZ
Ή0Ν'
-CH.
II
I 909848/1313
BAD
U45450
In den vorstehenden Formeln haben X, Y, R und R! die
oben angegebenen Bedeutungen, R2 und R, bedeuten die
die ci-Aminosäure kennzeichnenden Reste, und Z bedeutet
eine übliche Estergruppe oder ein Salzkation.
Die vorstehend beschriebene Umsetzung wird, wenn das
Aminosäure- oder Peptidderivat ein Ester ist» vorzugsweise in einem Lösungsmittel bei etwa 10 bis 4O0C, insbesondere
etwa 15 bis 300C durchgeführt,-wobei sie dann
in 20 Minuten bis h Stunden praktisch vollständig abläuft.
Das als Nebenprodukt gebildete N-Hydroxysucciniinid wird unter Ausnutzung des Umstands, daß es in Wasser
löslich ist, von dem Reaktionsgemisch abgetrennt, während der gebildete, in herkömmlicher Weise geschützte
Peptidester in Wasser unlöslich ist. So kann beispielsweise bei Verwendung eines mit Wasser nicht mischbaren
Lösungsmittels das N-Hydroxysuccinimid mit Wasser aus
dem Reaktionsgemisch extrahiert werden. Bei Verwendung eines mit Wasser mischbaren Lösungsmittels wird das
Reaktionsgemisch mit Wasser verdünnt, wodurch der gewünschte Peptidester aus der Lösung ausfällt und das
als Nebenprodukt gebildete K-Hydroxysuccinimid in der
Lösung verbleibt. Diese Reinigungen sind in den Beispielen 8 bis 13 näher erläutert.
Wird ein Aminosäure- oder Peptidderivat in Form eines
Salzes verwendet, dann wird die oben beschriebene Umsetzung
in einem wäßrigen Medium durchgeführt. Hierbei wird vorzugsweise eine Temperatur von etwa 10 bis ^00C
angewandt. Die Umsetzung ist in 20 Minuten bis k Stunden
909Ö48/1313 ^0 0FUG»NAL
praktisch vollständig. Eine längere Reaktionszeit, zum Beispiel Stehenlassen über Nacht bei Zimmertemperatur
führt in manchen Fällen zu einer geringfügigen Verbesserung der Ausbeuten und ist deshalb zweckmäßig;
durch Ansäuern des Reaktionsgemischs mit Säure wird das Produkt gefällt, während das als Nebenprodukt gebildete N-Hydroxysuccinimid in Lösung verbleibt. Diese
Art der Reinigung ist in den Beispielen 14 bis 18 näher
erläutert. .-
Aus den Beispielen 19 und 20 ist zu ersehen, daß Ester
von N-Hydroocyphthalimid den Estern von N-Hydroxysuccinimid
für die Peptidsynthese sehr stark unterlegen sind, hauptsächlich wegen der Schwierigkeiten, denen man bei
der Entfernung des wasserunlöslichen Nebenprodukts N-Hydroxyphthalimid begegnet.
Die folgenden Beispiele erläutern die Herstellung der
neuen Ester und das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung von Peptiden.
qxyglycin
26 g (0,126 Mol) N1N'-Dicyclohexylcarbodiimid werden
unter Kühlen zu einer Lösung von 26,3 g (0,126 Mol)
Carbobenzoxyglycin und Hydroxysuccinimid in 250 ml Dioxan gegeben. Man läßt das Reaktionsgemisch über Nacht
im Eisschrank stehen. Der gebildete Dicyclohexy!harnstoff
9 0984871313
wird abfiltriert und mit Dioxan gewaschen. Das Filtrat
wird unter vermindertem Druck eingeengt, bis ein gelbes
öl erhalten wird, das alsbald kristallisiert. Die Verbindung wird mit Äther verrieben und filtriert,"wodurch
man 37,5 g (97 /O Substanz-vom P.= 108 bis Hl0C erhält. Umkristallisieren aus Methylenchlorid und Petrol-1
äther liefert 33 g (36-?) Substanz vom P. =113 bis
Weitere Carbobenzoxyaminosäurederivate werden auf ähnliche Weise hergestellt (Beispiel 6). Anstelle von
Dioxan kann man gelegentlich auch Dimethoxyäthan und Dimethylformamid verwenden. Als Lösungsmittel zum Umkristallisieren
wird häufig Tsopropanol eingesetzt.
■""■-' Beispiel 2
Butoxycarbonyl-L-alanin
1,32 g (0,007 Mol) tert.-Butoxycarbonyl-L-alanin und
0,805 g (0,007 Mol) N-Hydroxysuccinimid werden bei .-·■-.
O0C in 10 ml wasserfreiem Dimethoxyäthan gelost. In
dieser Lösung werden dann unter Rühren 1,59 g (0,007 Mol
+ 10 %) Dicyclohexylcarbodiimid gelöst, worauf die,Lösung
20 Stunden bei 0-50C gehalten'v/ird.' ''
Das gebildete flarhstoffdorivat wird abfiltriert und das'
Filtrat wird in einer'offenen Sehale sur Trockne eincedampft.
Es -hlnterbleiben- 2,33 g Rohprodukt" als k'ri- '
stalliner -Rückstand* -Durch" 'zweimaliges' Umkristallisieren
aü3 Isopropanol'"erhält mah:i,42 g (71 %) des
analysenreinen Produkt vom P. = l]t3 bis I1^I0C. Die in
90 9 848/1313
BAD ORIGINAL
- ίο -
Beispiel 7 beschriebenen Verbindungen sind auf die gleiche V/eise hergestellt worden. \. \
"■'
glycin . ' '" ■■·---·-■-·-'■■■
6,34 g (0.,02O Mol) Tritylglycin und 2,30 g (0,020 .Mol)
Hydroxysuccinimi.d werden in 125 ml wasserfreiem Dir
methoxyäthan gelöst. Die Lösung wird auf .50C abgekühlt
und mit 4,5,2.g (Q, 02Q. Mol + 10*/O Dicyclohexylcarbodiimid
versetzt. Nach 20-gtündige;n Stehenlassen bei"
50C wird das gebildete ^Harnstoff derivat^ durch Filtrieren
abgetrennt'und das Piltrat zur Trockne' eingedampft
Es hinterbleibt.einRückstand von 3,35 g Substanz, aus
der man .durch Umkristallisieren aus Isopropanol das
reine Produkt vom F. = 145,5 bis ΐ4ο,5°0 ,erhält.
Beispiel 4 .. ■
'■"."■ öylglycln
4,10 g (0,020 Mol) Phthaloylglycin und 2,30 g (0,020
Mol) Hydroxysuccinimid v/erden zusammen in 25 ml wasserfreiem
Dirnethoxyäthanr gelöst. Zu der eiskalten Lösung
gibt man unter Rühren. 4,5-2 g (0,020 Mol· + 10 '/>) Dicyclohexylcarbodiirrdd.
liach 20-stündi2em Stehenlassen bei,
O0G. .wird, ale gebildete. Harnstoff verbindung durch Filtrieren
abgetrennt und das FlItrat durch Verdampfen '"des
Lösungsmittels in einem offenen Gefäß zur Trockne gebracht, Dor Rückstand wird aus Isopropanol umkristalli-
909848/1313 ' gAß
siert, Koüurch man das analysenreine Produkt vom
F. = 182 bis 183°C erhält.
fluoracety!glycin
3,*i2 g CO,020 Mol) Trifluoraeetylgiycin und 2,30 g
(0,020 KoI) Hydroxysuccinimid vrerden in 25 ml Dimethoxyäthan
gelöst. Die Lösung wird auf 5°C abgekühlt und Kit 4,52 g (0,020 Mol +10 %) Dicyclohexylcarbodiiisid
versetzt. Nach o5-stündigem Stehenlassen bei O0C wird das gebildete Harnstoffderivat von dem Gemisch
abfiltriert und das Piltrat zur Trockne eingedampft. Die Verbindung wird zweimal aus Isopropanol
umkristallisiert, wodurch man das analysenreine Produkt vom F. - 143 bis lM°C erhält.
Herstellung von N-Hydroxysuccinimidester von Carbobenzoxyaminosäuren der Formel
It
CH2
CH2 OCONHCRR'COON^
C- ' CH0 ti ^-
909848/1313
-. 12 -
| carbobenzoxylierte Amino säure oder Peptid |
Ausbeute -On /~oi | 113-4 | -17,3 | t 2^ |
| Glycin ■ " · | se | 140-140,5 | -54 | 2,5 |
| L-Pheny!alanin | ■76 | 90 | '+0,975 | 2,5 |
| L-Prolin | 78 | 151-3 | -33,6 + | 2,4" |
| L-Isoglutamin | 48 | 116-7 | -37,2 + | 2,42 |
| L-Leucin | 51 | 123-123,5 : | -25,1 + | : 2,4 |
| L-Alanin | 65 . | 116-7 | -15,5 1 | 2,4 |
| L-Valin | 53 | 115,5-116 | -9,7 + | 2,48 |
| L-Isoleucin | 56 | 85-6 | -15,9 * | |
| L-Arginin | 80 | 101-2 | +15*9 1 | 2,42 |
| L-Methionin | 59 | 140,5-51 | 2,5 | |
| D-Phenylalanin | 76 | 124,5-6 | -36,8 + | |
| L-Nitroarginyl-L-prolin | -50 | 1.18-9 : | -23,3 + | |
| L-ß-Cyanalanin | 52 | 107-8 | ||
| L-Glutaminsäure- OC - " .. methylester |
53,3 | |||
tricarbobenzoxyliert
Dioxan diente als Lösungsmittel für alle Bestimmungen.
Die vorstehend aufgeführten Ester wurden nach den in.den
Beispielen 1 bis 5 beschriebenen Arbeitsvieise hergestellt,
909848/1313
Herstellen?» von N-Hydroxysuccinimidestern von tert*
Butoxycarbonylaminosäuren der Formel
ti
CH2
(CH3C)jOCONHCRR»COON^
———— Λ/ΧΙ«
Il *
tertiButyloxycarbonylami- Al.,h|iu1.p «
no-Derivat Ausbeute »
| L-Alanin | 71 | 143-144 | «49 c 2, | 02 |
| S-BenayHi-Cystein | 49 | 117-117,5 | -54,0 c | 2,46 |
| Glycin | 62 | 168-170 | - | |
| L-Isoleucln | 59, | 92-93 | -26,5 c | 2,00 |
| 61,3 | ||||
| L-Leucin | 48 | 116 | -41,8 c | 2,01 |
| DL-Methionin | 65 | 118-119 | ||
| L-Methionin | 59 | 128-129 | -20,6 | |
| D-Pheylalanln | 86 | 152-153 | +20,9 £ | 2,06 |
| L-Phenylalanin_ | 81 | 152-153 | -19,0 c | 2,03 |
| L-Proim | 74,71,69 | 135-136 | -55,3 c | 2,02 |
| L.Tryptophan | 37 | 153-154 | -22,4· 6 | 2,05 |
| L-Valin | 50 | 128-129 | -36,98 ο | 1,98 |
| 74,7 |
+ Dioxan diente als Lösungsmittel für alle Bestimmungen»
Die vorstehend angegebenen Ester wurden nach den in den
Beispielen 1 bis 5 beschriebenen Arbeitsweisen hergestellt.
909848/1313
phenylalanlnat
Der Hydroxysuccinimidester von L-Phthaloy!methionin,
der nach der in Beispiel 4 für den Phthaloylglyeinester
beschriebenen Arbeitsweise hergestellt wurde, wird-mit
einem geringfügigen Überschuß von L-Phenylalanin-tert.-butylester
in Methylenchloridlösung versetzt. Nach 20
Minuten wird die Methylenchloridlösung mit 5 $-iger Natriumbicarbonatlösung und 1-η Salzsäure extrahiert,
über imsserfreiem Natriumsulfat getrocknet und dann in
einem offenen Gefäß zur Trockne eingedampft. Es hinterbleibt
ein kristalliner Rückstand, der aus Isopropanol umkristallisiert wird und in guter Ausbeute das reine
Produkt vom P» * 87,5 bis 83,5°C liefert.
Beispiel 9
Herstellung von tert\-Butyl-trifluoracetylglycyl-L-
1,43 g (5 mMol)des Hydroxysuecinimidesters vonTrifluoracetylglyein
und 1,77 ml (10 mMol) L-Prolin^terii.-butylester
werden in 7 ml Dirnethoxyäthan eingeführt. Die Lösung
wird nach 1/2-stündigem Stehenlassen in 50 ml kalten Wassers eingegossen. Die durch Umkristallisieren aus
Methylcyclohexan in einer Ausbeute von 79 % erhaltene
reine Verbindung hat ein Drehvermögen von £&t_7 jp -81,3
* 2a5° Cc =2,04 in Äthanol).; .
909848/1313
ny IaI any 1 ftly c inat
2,'tS £ (7i>
mMol) Xthyl-L-phenylalanylglycinat-Hydrobronici,
2,0^i £ (75 mMol) des Kydroxysuccinimidesters von
tert.-Butoxycarbonylglycin und 1,05 ml (75 rnKol) Triethylamin
werden in 25 ml wasserfreies Diine thoxyäthan eingeführt.
Das Gemisch wird 20 Minuten gerührt, wonach es in 100 ml kalten Wassers gegeben wird. Das Produkt kristallisiert
und wird durch Filtrieren gewonnen. Man erhält 2,53 g Rohprodukt vom F. = 93 bis 990C. Durch Umkristallisieren
aus Alkohol-Wasser erhält man das reine Tripeptid vom F. = 100,5 bis 101,50C in einer Ausbeute von 79 %;
£~°£_7Ό = 9,75 * 2,46° (c = 2,05 in Methanol).
tyrosinat
Eine Lösung von 1,9.8 g (0,005 Mol) des N-Hydroxysuceinlnidesters
von Carbobenzoxy-L-phenylalanin in 10 ml Plmethoxyäthan
wird zu einer Lösung von 1,045 g (0,005 Mol)
L-Tyrosinäthylester in 10 ml des gleichen Lösungsmittels gegeben. Nach ^Q-mlnütigem Stehenlassen bei Zimmertemperatur,
wird das Reaktionsgemisch mit 60 ml Wasser verdünnt. Die sich unmittelbar danach bildenden Kristalle werden
abfiltriert und mit 10 #-iger Natriumbicarbonatlösung, Wasser, n-Salssüure und Wasser gewaschen= Nach dem Trocknen
erhält man 2,62 g (100 %) Rohprodukt vom F. = 151
bis 157°C. Zweimaliges Umkristallisieren aus Äthanol-V/asser
ergibt 2,08 g (85 %) Substanz vom F. = 156 bis
909848/1313
BAO
■■"..' Beispiel 12 -. -" .. ^==™
Herstellung des tert. -Butyloxycarbonyl>-L-prolyl-L·» ■ _
phenylalanln-p-nitrobenzy!esters
Aus 22,90 s (0,050 Hol) p-Nitrobenzyl-L-phenylalaninatbenzolsulfonat
VJ\ E. Shields et al., Journ« Orp;. Chem.,
26^ 1491 (19Ö1)_7, 100 ml Chloroform und 7,64 ml (5,56 g,
0,055 Mol) Triäthylamin wird eine Lösung hergestellt, die mit 800 ml Äther verdünnt wird. Durch Abfiltrieren
des*dadurch gebildeten kristallinen Niederschlags erhält
man 14,6 g Triäthylammoniumbenzolsulfonat (Theorie
l},0 g). Durch Einengen des Piltrats im Vakuum erhält man ein öl, das in 30 ml Tetrahydrofuran gelöst wird.
Die Lösung wird zu 12,48 g (0,040 Mol) tert.-Butoxycarbonyl-L-prolin-N-hydroxy-süccinimidester
zugesetzt. Hierbei geht nicht die gesamte feste Substanz in Lösung.
Nach Stehenlassen über Nacht setzt man 3 ml Triäthylamin sowie so·viel Wasser zu, daß die Lösung gerade etwas
trüb ist. Das Gemisch wird 1,5 Stunden gerührt und gegen Ende dieses Zeitraums mit weiterem Wasser versetzt.
Schließlich wird das Gemisch mit V/asser auf 400 ml verdünnt.
Es bildet sich ein öl, und nach Stehenlassen über Nacht bei O0C haben sich Kristalle gebildet. Die Kristalle
werden abfiltriert und mit 0,3 η-Schwefelsäure und
dann mit Wasser gewaschen. Die blaßgelbe feste Substanz wird in 50 ml Tetrahydrofuran gelöst und mit 300 ml
Wasser verdünnt. Durch Abkühlen wird das ausgefallene
Öl zur Kristallisation gebracht. Das Dipeptid wird abfiltriert und an der Luft getrocknet. Man erhält 20,3 g
(100 £-ige Ausbeute) Substanz vom F. = 53 bis 590C
(Erweichung bei 5l°C) Und folgenden Kennzahlen:
909848/1313
= -37,a ± 2y4° (c 2, Äthanol), Ultraviolett
(E =
sinäthylesters
7,52 g (0,03b Mol) Äthyl-L-tyrosinat werden in βθ ml
Tetrahydrofuran gelöst und mit 9,42 g (0,030 Mol) tert.-Butoxyearbonyl-L-valin-N-hydroxysucciniraidester
versetzt, Nach Stehenlassen über Nacht werden einige wenige ml Triethylamin und soviel Wasser zugesetzt, daß eine getrübte
Lösung entsteht. Nach einstündigem Rühren zur Verseifung von etwa nicht umgesetztem Valinester wird
das Gemisch mit V/asser auf 400 ml verdünnt» Animpfen
und Kühlen bewirkt die Kristallisation des öligen Niederschlags. Die feste Substanz wird abfiltriert und mit
0,5 η Salzsäure, wäßriger Natriumbicarbonatlösung und Wasser gewaschen. Durch Trocknen in einem mit Dampf
beheizten Ofen erhält man 11,3 g (91 %) des Dipeptids
vom P. = 138 bis l4l°C, Umkristallisieren aus Essigsäureäthylester-Petroläther
liefert 10,70 g (87 %) des Dipeptids vom F. = IkQ bis 1^0,5°C und I~U 7^5 =
""™. —mm ^J
-19,9 - 2,5° (c = 2 in Äthanol). Die Verbindung wurde nach der NjN'-Carbonyldiimidazolmethode /~R. Paul,
Journ. org. Ghem., 28. 23ό (Ι9ό3)_7 in einer Ausbeute
von 67 % mit einem Schmelzpunkt von l4o bis 140,50C und
Z~üC7d5 = -20,0 i 1,25° (c = 2 in Äthanol) erhalten.
BAD ORIGINAL
909848/1313
- 13 -
Beispiel l4
Herstellung von Carbobenzoxy^lycyl-L-prolin
Eine Lösung; von 1,53 g (OjOOS Hol) des IJ-IIy droxysuccin-Imidesters
von Carbobenzoxyglycin in 10 ml Diraethoxyäthan wird zu einer Lösung von 0,365 g (0,0075 Γίοΐ)
Prolin und 0,63 g (0,0075 Mol) ilatriumbiearbonat In
.3 ml Wasser von Zimmertemperatur zugesetzt. Nach einer
Stunde werden weitere 5 ml V/asser zugegeben und die Lösung wird mit konzentrierter Salzsäure auf einen pH-Wert
von 2 angesäuert. Nach 30 minütigem Stehenlassen in der Kälte wird von den gebildeten Kristallen abfiltriert. r-Ta.n erhält 0,93 S Substanz vom P . = 157
bis 159 C. Durch weiteres Stehenlassen des Piltrats in
der Kälte werden zwei weitere Anteile Substanz vom P. =
157 bis 1530C erhalten, die zusammen 0,2 g ausmachen.
Die drei Fraktionen.werden vereinigt und aus 50 ml
heißem Essigsäureäthylester umkristallisiert.' Man erhält 0,97 g Substanz vom P. = 153 bis 159°C und
durch weiteres Abkühlen eine zweite Ausbeute von 0,13 g Substanz vom P. = 157 bis 1530C. Die Gesamtausbeute
beträgt 75 Jf. "
Beispiel 15 Herstellung von Carbobenzoxyglyeyl-L-tryptophan
2,01J g L-Tryptophan, 1,63 g Natriümbicarbonat und 2p ml
V/asser vrerden vermischt. Die Substanzen gehen teilweise
in Lösung- Der pH-Wert liegt bei etwa 8. Dann wird eine
Lösung von 3>O6 g des M-Hydroxysuccinimidesters von
BAO 909848/1313
Carbobenzoxyglycin in 15 ml Acetonitril von Zimmertemperatur
zugesetzt. Alle Substanzen gehen vorübergehend in Lösung. Nach einer Stunde wird die Lösung
auf etwa 3/4 des ursprünglichen Volumens unter Verwendung
eines Drehverdampfers im Vakuum unter leichten Erwärmen-mit Hilfe eines Wasserbads eingeengt. Beim
Ansäuern mit konzentrierter Salzsäure auf einen pH-Wert von etwa 1 fällt eine Schmiere aus. Der Niederschlag
wird in 25 ml Essigsäureäthylester extrahiert und die erhaltene Lösung wird kurz über Natriumsulfat
getrocknet. Dann \*ird die klare Lösung bis zur beginnenden
Trübung mit Petroläther (etwa 35 ml) verdünnt und kaltgestellt. Durch Abfiltrieren erhält man 2,38 g
einer kristallinen festen Substanz vom F. = i4o bis
l42°C. Einengen des Piltrats liefert 0,9Qg Substanz
mit etwas niedrigerem Schmelzpunkt. Durch Umkristallisieren dieser Substanz aus etwa 100 ml Äthanol-Wasser
(1:9) erhält man 0,77 g Substanz vom P. = I2Il bis
1420C. Die vereinigten Produkte v/erden aus 115 ml
Äthanol-Wasser (1 : 2) umkristallisiert und liefern 2,75 g (70 &-ige Ausbeute) reines Produkt vom P. =
142 bis 143°C, /7*_7q5 = + 32,9 ± 2,17° (c * 2,3; absoluter Alkohol).
Herstellung von Carbobenzoxy-L-isoglutaminyl-L-asparap;ln
0,75 g (0,005 liol) Asparaginmonohydrat v/erden unter Er-
BAO OBlGtHAk 909848/1313
-" 20 -
wärmen in 10 ml Wasser gelöst. Nach dem Abkühlen auf .
Zimmertemperatur werden 0,7 ml '(0,005 Mol) Triäthylamin
zugesetzt. Dann wird unter Rühren bei Zimmertemperatur eine Lösung von 1,89 g (0,005 Mol) des N-Hydroxysuccinimidesters
von Carbobenzoxy-L-isoglutämin in 20 ml
Tetrahydrofuran zugegeben. Nach 30 Minuten wird das Reaktionsgemisch
mit 20 ml Wasser verdünnt und mit Salzsäure
auf pH 2 angesäuert. Nach Stehenlassen über Nacht in der Kälte erhält man 0,87 g Substanz vom P. = 179 bis 185°C.
Durch Abkühlen des PiItrats v/erden weitere 0,5 g Sub-,
stanz vom F. = 171 bis 1730C erhalten. Die beiden Fraktionen
werden gesondert aus Dlmethylformamid-Acetonitril (l : 2) in S Tagen umkristallisiert. Wenn sich eine gelartige
Substanz bildet, wird sie durch gelindes Erwärmen wieder in Lösung gebracht, bis sich schließlich beim Abkühlen
Kristalle ausbilden. Die beiden Fraktionen ergeben 0,95 g Substanz vom F. = 187 bis 1900C und 0,3 g
Substanz vom F. = 184 bis 187°C (Gesamtausbeute 63 %).
Herstellung von Carbobenzoxyglycyl-L-phenylalanylKlycin
0,775- g (0,003 Mol) L-Phenylalanylglycin und 0,252 g
(0,003 Mol) Natriuinbicarbonat werden in 8 ml Wasser
gelöst. Eine Lösung von O,6l25 g (0,002 Mol) des N-Hydroxysuccinirriidesters
von Carbobenzoxyglycln in 8 ml Dimethoxyäthan wird unter Rühren bei Zimmertemperatur
zugesetzt. Nach 1IO Minuten werden weitere 10 ml Wasser
zugefügt und die Lösung wird mit Salzsäure auf pH 2 ·
•angesäuert. Es bilden sich sofort Kristalle. Nach Stehenlassen
über Nacht in der Kälte und Filtrieren erhält man
90984 8/1313
0,75 β (91 ») weißer Kristalle vom F, = 155 bis lo9°C.
Das Produkt wird au3 heißen Essigsäureäthylester um-
kristalli3iort und ergibt in 2 Fraktionen 0,7^ s
(92 Jf) 3ub3tanz vom F. = 157 bis 1580C.
ala-nylp;lycln
Unter Erwärmen wird eine Lösung von 2,79 g Glycyl-L-phenylalanylglycin und 1,63 g Natriumbicarbonat in
50 ml Wasser und 25 ml Äthanol zubereitet und dann auf Zimmertemperatur abgekühlt. Hierzu wird eine Lösung
von 3,1Jo g des N~Hydroxy3uceinimide3ters von Carbobenaoxy-L-prolin in 25 ml Xthanol gegeben, die gleichfalls
unter Erwärmen zubereitet und anschließend auf Zimmertemperatur abgekühlt worden 1st, wöbet außerdem 5 ml
Waschäthanol eingesetzt werden. Nach l8-3t(indigem Stehenlassen der Lösung wird ile mittels Salzsäure
auf einen pH-Wert von etwa 1,5 angesäuert. Ein Teil des XthAnalt wird durch TakuulMtitillaUon entfernt,
worauf au3 der hinterbleibenden Lösung ein öl ausfällt,
das 3ich beim Abkühlen verfestigt und abfiltriert wird.
Nach dem Trocknen erhält man 4,53 g (89 % der theoreti
schen Ausbeute von 5,11 g) Substanz vorn F* = 1^8 bis
152°C. Umkristallisieren aus 105 ml Wasser und 35 nil
Alkohol liefert das reine Tetrapeptidderivat (3,37 ß,
76 Ji-ige Ausbeute) vom P, = 15^ bis 1550C Durch Aufarbeiten
des Filtrats erhält man weitere 0,25 g Substanz, wodurch die Gesamtmenge auf 4,12 g und die Aus-
BAO 909848/1313
beute auf 80 ; steist; LOiJ^ = -27,6 - 2,5° (c = 2
Dioxan).
Herstellung van Carbobenzoxyglycyl-L-prolin
Eine Lö3ung von 1,77 β (0,005 Mol) des Ιϊ-HydroxyphthalimidoestGra von Carbobenzoxygiycin in 25 ml Dimethoxyäthan wird zu einer Lösung von 0,575 s (0,005
Mol) Prolin und 0,42 g (0,005 Mol) liatriunbicarbonat
in 3 ml Wasser bei Zimmertemperatur gegeben. Die Lösung wird klar, doch bildet sich sofort eine leuchtend
rote Parbe aus. Nach 10 Minuten werden, weitere 15 ml
Wasser zugesetzt. Die Lö3ung wird sehr langsam mit konzentrierter Sal33äure.angesäuert und bei verschiedenen pH-Wtrten werden folgende Fraktionen abgetrennt:
| pH | 5 | O | »25 | S | P. | • l60°C |
| PH | H | O | •05 | S | >« | • l60°C |
| Ρ« | 3 | O | S | P. | « liJ5-8°C |
Mit abnehmenden pH-Werten 1st eine Änderung der Farbe der
Lösung zu beobachten und bei pH 3 1st die Lösung farblos.
Die letzte Fraktion wird erneut in 10 ml 10 ji-lg«r Natriumbicarbonatilösung
gelöst, warau-f das langsame Ansäuern
wiederholt wird.. Bei pH. 4 bis A-_>;5. lsi? .die Lösung
gelb und durch Filtrieren, erhält liian eine kleine Fraktion
von 0,15 g Substanz vom F». = 22J isis 226 C. iiae-h
Ansäuern des Filtrats auf pH 2 und Filtrieren erhält man
^AD ORtO1HAL
.-,...,..;.../ 90984Ö/1313
0,65 fi Substanz: von F. = 151 bis 15^0C. Das erhaltene
Filtrat liefert bein Abkühlen weitere 0,05 g Substanz
vom F. - 1^5 bis 150°C. Die Gesamtausbeute an dem
noch unreinen Dipeptid beträgt 0,70 g (2IS %) >
Reines CarbobenZGxyglycyl-L-prolln hat einen Schmelzpunkt
von 157 bis 1530C.
Beispiel 20
Herstellung von Carbobenzoxy-L-prolylglycin
Herstellung von Carbobenzoxy-L-prolylglycin
Eine Lösung von 1,97 g (0,005 Hol) des H-Hydroxyphthalimidoesters
von Carbobenzoxy-L-prolin in 9 ml Dimethoxyäthan
wird unter Rühren zu einer Lösung von 0,375 g (0,005 Mol) Glycin und 0,42 g (0,005 Mol) Natriumbicarbonat
in 7-ml Wasser bei Zimmertemperatur gegeben. Zur Aufrechterhaltung einer klaren Lösung fügt man vieltere
2 ml Dimethoxyäthan zu. Nach 50 Minuten wird die Lösung im Vakuum unter Entfernung von Dimethoxyäthan
eingeengt. Das wäßrige Reaktionsgemisch wird mit konzentrierter Salzsäure auf pH 5 angesäuert und filtriert,
viodurch man 0,72 g Substanz vom F. = l88°C erhält»
Das Filtrat wird weiter auf pH 2 angesäuert und liefert nach Filtrieren 0,43 Substanz (28 % der theoretischen
Menge von 153 g des Peptids) vom F. = 1θ6 bis 103°Cv
Die Untersuchung durch DünnschichtChromatographie ergibt,
daß beide Fraktionen.Gemische aus Carbobenzoxy-L-prolylglycin
und N-Hydroxyphthalimid darstellen. Deshalb wird ein Versuche gemacht, die beiden Substanzen durch fraktionierte
Kristallisation aus Chloroform zu trennen. beide Fraktionen werden mit Chloroform versetzt, worauf
die unlöslichen Anteile abfiltriert werden. Die erste
909848/1313
1445480
Qskk g gubfife&HB'VGln Fi = $M bis
Und d-ife zwöifci* Ö3ÖI gUBSbäfti' VÖffl ί» = §§4 bis 2Ι
und eh^öraatög^äphiiBt4^« Öaö Ghifoiflafeogramin zfeigtä daß bei*
JGeiniööhe glnd« M-iiyäföxyphthalimid
s
glycin beidgii big I
i S2g bis 22§°ß UiId
i0iS4S/1313 : ^
Claims (1)
1. Verfahren zur Herstellung von Peptiden, dadurch ge- .
kennzeichnet, daß man praktisch äquimolare Mengen eines,
M-Iiydroxysuccinimidesters einer an *der Aminogruppe durch
einen Benzoxycarbonyl-, tert.-Butoxycarbonyl-, Triphenylmethyl-j
Trifluoracetyl- oder Phthaloylrest substituierten natürlich vorkommenden «^-Aminosäure und eines niederen
Alkylesters, eines Alkalisalzes oder eines tert.-Aminsalzes
einer natürlich vorkommenden oC-Aminosäure oder eines
Peptlds bei einer Temperatur von IO - Uo°C miteinander
umsetzt und das Reaktionsprodukt isoliert.
2, Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß"
man eine
an v/endet,
an v/endet,
man eine etwa 15 - 300C nicht übersteigende Temperatur
3· Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß
man einen N-Hydroxysuccihimidester einer natürlich vorkommenden cC~Aminosäure verwendet, deren Aminogruppe
durch einen Carbobenzoxy- oder tert.-Butoxycarbonylrest
substituiert ist.
90984871343 -; *
BAD
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