CH501660A

CH501660A - Verfahren zur Herstellung von Peptid-Derivaten

Info

Publication number: CH501660A
Application number: CH928968A
Authority: CH
Inventors: Schell Dewey Ray
Original assignee: Merck & Co Inc
Priority date: 1967-06-30
Filing date: 1968-06-24
Publication date: 1971-01-15
Also published as: NL6808552A; DE1770720A1; FR1570326A; GB1197105A

Description

Verfahren zur herstellung von Peptid-Derivaten
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein neues Verfahren zur Herstellung der inneren Anhydride von N-Thionocarboxyaminocarbonsäuren.

Die gesteuerte stufenweise Synthese von Polypeptiden und insbesondere Heteropeptiden ist ein Problem, das die Fachleute seit langem beschäftigt. Solche Produkte sind als Zwischenprodukte bei der Synthese von Proteinen nützlich. Gewisse von ihnen sind therapeutisch wirksam. Sie sind auch beim Studium und bei der Analyse von Proteinen nützlich, insbesondere bei Untersuchungen, die dazu dienen, die Wirkungsweise von Enzymen, Hormonen und anderen Proteinen mit wichtigen Funktionen im Organismus zu ergründen.

Eine gesteuerte stufenweise Synthese von Heteropeptiden und Proteinen besteht in der Umsetzung einer Aminosäure oder eines Peptids, z. B. eines Tetrapeptids, in einem wässrigen Milieu unter gesteuerten Konzentrations-, Temperatur-, Zeit- und Wasserstoffionenkonzentrationsbedingungen mit einem N-Thiocarboxyaminosäureanhydrid zur Bildung einer Thiocarbamat Zwischenverbindung, die dann zur Bildung des gewünschten Produkts dethiocarboxyliert wird, gewöhnlich indem die MTasserstoffionenkonzentration auf pH 3 bis 5 herabgesetzt wird. Das Verfahren kann in aufeinander folgenden Umsetzungen ohne Isolierung der Zwischenverbindungen ausgeführt werden, wobei ein äusserst grosses Molekulargewicht aufweisende Heteropeptide erzeugt werden. Dieses Verfahren wird nachstehend als TCA-Verfahren bezeichnet.

Dieses Verfahren besteht allgemein in der Umsetzung des gewählten Aminosäurethioanhydrids, entweder mit der Aminogruppe einer zweiten Aminosäure oder mit einem Peptid unter solchen Bedingungen, dass die einzige Aminogruppe, die während der Umsetzung in beträchtlicher Konzentration vorliegt, die Aminogruppe ist, die an der Umsetzung teilnehmen soll. Die genauen Bedingungen, unter denen ein besonderes .Nminosäurethioanhydrid sich mit einer Aminosäure oder einem Peptid umsetzt, hängen von den chemischen und physikalischen Eigenschaften der Reaktionsteilnehmer ab. Der Hauptfaktor ist die relative Basizi; tät der Reaktionsteilnehmer und Zwischenverbindungen.

Die Umsetzung wird normalerweise durchgeführt, indem das Thioanhydrid bei einem pH von etwa 7 bis 10 und gewöhnlich 8 bis 10 und bei einer niedrigen Temperatur, z. B. 0 bis 250 C, einem die Aminosäure oder das Peptid enthaltenden wässrigen Milieu beigefügt und die Kupplungsreaktion zur Bildung einer Thiocarbamat-Zwischenverbindung zu Ende geführt wird, indem während einer Periode, die normalerweise 30 Minuten nicht übersteigt, aber 2 bis 3 Stunden betragen kann, rasch gerührt wird. Die Zwischenverbindung wird dann zur Erzeugung des gewünschten Produkts dethiocarboxyliert, indem der pH auf etwa 3 bis 5 herabgesetzt wird.

Die vorliegende Erfindung stellt ein neuartiges und zweckmässiges Verfahren zur Herstellung der synthetisch nützlichen N-Thiocarboxyaminosäureanhydn.de dar. Das erfindungsgemässe Verfahren zur Herstellung der inneren Anhydride von N-Thiocarboxyaminocarb- onsäure ist nun dadurch gekennzeichnet, dass ein ent sprediendes Aminocarbonsäureamid, welches an der Aminogruppe durch eine veresterte Thionocarboxygruppe substituiert ist, in Gegenwart einer starken Säure in einem inerten polaren Lösungsmittel cyclisiert wird.

Das Verfahren kann durch folgende Gleichung dargestellt werden:
EMI1.1
worin R Wasserstoff oder z. B. eine Niederalkyl-, Niederaralkyl-, Niederaminoaikyl-, Niedercarboxyalkyl-, Niederhydroxyalkyl-, Niedermercaptoalkyl-, Nieder-(niederalkylmercapto)-alkyl-, Niederguanadylalkvl-niederindolylalkyloder Niederimidazólylalkyl-Gruppe und R1 eine Niederalkyl oder Aralkyl darstellt. Der Ausdruck Niederalkyl umfasst bis zu 8 Kohlenstoffatome aufweisende Alkylgruppen.

Die Ringschlussumsetzung wird in Gegenwart einer starken Säure und vorzugsweise einer anorganischen Mineralsäure wie z. B. Salzsäure, durchgeführt. Sie wird auch in einem inerten polaren organischen Lösungsmittel ausgeführt, wobei inert heisst, dass das Lösungsmittel mit dem Thiourethan-Derivat, dem Thionocarboxyanhydrid und der starken Säure nicht reagiert. Geeignete polare Lösungsmittel sind die Nitroniederalkane, insbesondere Nitromethan, doch können auch andere Lösungsmittel, besonders Ester, Äther oder halogenierte Kohlenwasserstoffe, die z. B. bis zu 8 Kohlenstoffatome aufweisen, verwendet werden.

Bei der Ausführung der Umsetzung wird das Thionourethan-Derivat im polaren Lösungsmittel gelöst oder dispergiert und die starke Säure z. B. durch Einleiten von Chlorwasserstoffgas in die Lösung eingeführt. Geeignet sind mässige Reaktionstemperaturen von etwa 0 bis etwa 40 C, doch können auch etwas höhere oder niedrigere Temperaturen verwendet werden. Im allgemeinen ist es am zweckmässigsten, die Umsetzung bei etwa Raumtemperatur auszuführen. Es kann atmosphärischer Druck oder ein höherer Druck verwendet werden, Die Bildung des Thiocarboxyanhydrid-Produkts wird durch das Auftreten eines Niederschlags des Ammoniumsalzes der verwendeten Säure angezeigt, und die Umsetzung wird fortgesetzt, bis sich kein weiterer Niederschlag bildet oder bis aus den Infrarotspektren hervorgeht, dass die Umsetzung vollständig ist, im typischen Fall etwa 0,5 bis 10 Stunden.

Das Thiocarboxyanhydrid wird zweckmässig durch Extraktion mit einem inerten organischen Lösungsmittel, wie z. B. Methylenchlorid oder Äthylacetat, Waschen mit Wasser, Trocknen der organischen Phase und Entfernen des Lösungsmittels rückgewonnen. Der Reinheitsgrad des Produkts wird durch Umkristallisation aus einem geeigneten Lösungsmittel, wie z. B.

N-Hexan-Äthylacetat erhöht. Gegebenenfalls kann das Anhydrid nach dem Fachmann bekannten Methoden in dessen optische Isomere aufgespalten werden.

Das Thionourethan-Derivat kann z veckmässig entweder aus dem verwandten Aminosäureamid durch Umsetzung mit einem Xanthogenatdiester oder aus der verwandten Aminosäure selbst durch Umsetzung mit einem Xanthogenatdiester und dann Umsetzung mit Ammoniak und einem milden Entwässerungsmittel hergestellt werden.

Die Synthese des Thionourethans aus dem Aminosäureamid wird durch folgende Umsetzung veranschaulicht:
EMI2.1
worin R und R1 wie oben beschrieben und die zwei Gruppen Rt gleich oder ungleich sind. Die Umsetzung lässt sich ohne weiteres bei einer massigen Temperatur von etwa 30 bis 500 C ausführen, obwohl auch etwas höhere oder niedrigere Temperaturen verwendet werden können. Gegebenenfalls können Lösungsmittel verwendet werden, um die Homogenität und Flüssigkeit des Reaktionsgemisches zu erhöhen. Es ist wünschenswert, das Mercaptan-Nebenprodukt bei dessen Bildung zu entfernen, weshalb die kurzzeitigen Xanthogenatester, wie z. B. Methylxanthogenat, vorgezogen werden.

Die Umsetzung lässt sich zweckmässig ausführen, indem ein Stickstoffträgerstrom durch das Reaktionsgemisch und von dort durch eine wässrige Bleiacetatlösung geleitet wird. Das Vorhandensein des Mercaptan-Nebenprodukts im Gasstrom wird durch die kontinuierliche Fällung eines gelb bis orange farbenen Bleimercaptids angezeigt, dessen Bildung aufhört, wenn die Hauptumsetzung zu Ende ist. Das Thionourethan kann durch herkömmliche Verfahren, wie z. B. dessen Lösung in einem inerten organischen Lösungsmittel, Waschen mit wässrigem Natriumchlorid, Abtrennen der organischen Schicht und Entfernen des Lösungsmittels, für die nachfolgende Umsetzung genügend gereinigt werden.

Die Erzeugung des Thionourethans aus der verwandten Aminosäure wird durch folgende Umsetzung dargestellt und kann wie folgt durchgeführt werden:
EMI3.1
worin R und Rl wie oben beschrieben und die zwei Gruppen R1 gleich oder ungleich sind. In der ersten Stufe dieser Synthese ist es wünschenswert, eine starke Base, wie z. B. ein Alkalimetallhydroxyd in Wasser, Alkohol oder einer Wasser-Alkohol-Lösung, zu verwenden. Sonst sind die Umsetzungsbedingungen gleich wie die oben für die Umsetzung des Aminosäureamids mit dem Xanthogenatester angegebenen.

Das Aminosäurethiononrethan wird isoliert, indem das Produkt in eine wässrige alkalische Lösung aufgenommen und in einem inerten organischen Lösungsmittel, wie z. B. Äther, gewaschen wird, worauf die wässrige Schicht angesäuert und mit einem inerten organischen Lösungsmittel, wie z. B. Äthylacetat, wieder extrahiert wird. Die organische Schicht wird gesammelt und mit wässrigem Natriumchlorid gewaschen, worauf sie abgetrennt und zur Trockne verdampft wird.

Die Umwandlung des Aminosäurethionourethans in das entsprechende Amid wird ausgeführt, indem es nacheinander mit Ammoniak und einem milden Entwässerungsmittel behandelt wird. Das Ammoniak wandelt die Säure in das Ammoniumsalz um und das Entwässerungsmittel entzieht ein Mol Wasser zur Bildung des Amids. Im typischen Fall wird das Aminosäurethionourethan in einem inerten organischen Lösungsmittel, wie z. B. Äther, gelöst, und trockenes Ammoniakgas wird zur Fällung des Ammoniumsalzes eingeleitet. Dann wird überschüssiges Ammoniak entfernt und die theoretische Menge Entwässerungsmittel beigefügt. Die bevorzugten Entwässerungsmittel sind die Dialkylcarbodiimide, wie z. B. Dicyclohexalcarbodiimid. Das Reaktionsgemisch wird gerührt, bis die Umsetzung zu Ende ist, im typischen Fall etwa 5 bis 20 Stunden.

Mit den bevorzugten Entwässerungsmitteln geht die Umsetzung bei Raumtemperatur glatt vor sich, so dass keine höhere Temperatur notwendig ist. Die Aufarbeitung des Aminosäureamidthionourethan-Produkts zur Verwendung bei der Herstellung eines Thiocarboxyanhydrids wurde bereits beschrieben.

Beispiele von zur Verwendung beim erfindungsgemässen Verfahren geeigneten Ausgangsmaterialien sind die nachstehenden Aminosäuren, und zwar entweder die rechts als auch die linksdrehenden Formen oder razemische Gemische sowie deren Amide oder Thionourethane: Alanin Leucin Cystein Phenylalanin Histidin Glutaminsäure als das a-Amid, Isoglutamin Aspastinsäure als das a-Amid, Isoaspurugin Cystin Arginin Glycin Prolin Serin Isoleucin Valin Thyrosin Threonin und dergleichen, sowie substituierte Derivate davon, wie diejenigen, die mit Niederalkyl-, Aryl-, Aralkyl=, Alkaryl- und Halogen-Gruppen substituiert sind.

Wenn die Aminosäure eine einfache Aminosäure ist, wie z. B. Leucin oder Alanin, geht die Synthese wie oben angegeben in gerader Weise vor sich. Wenn die Aminosäure andere reaktionsfähige Gruppen enthält, werden diese vorzugsweise während der Synthese und allfälligen nachfolgenden Peptid-Synthesen geschützt.

Die Hemmgruppe sollte einer Aufspaltung durch die bei der Ringschliessung verwendete starke Säure wiederstehen. Z. B. werden Amingruppen leicht mit Benzylgruppen blockiert. Thiocarbonsäureanhydride von Dicarbonsäureaminosäuren werden am besten über die a-Amide hergestellt. Ähnliche Verfahren zur Behandlung anderer reaktionsfähiger Gruppen sind dem Fach- mann bekannt.

Wie bereits erwähnt, können die verwendeten Xanthogenate irgend eines der folgenden Xanthogenate oder ähnliche Verbindungen sein: Dimethylxanthogen, Diäthylxanthogen, Di-n-propylxanthogen, Di-n-butylxanthogen, Di-n-hexylxanthogen, Dibenzylxanthogen, Di-ss-phenyläthylxanthogenat usw. Gegebenenfalls können auch asymmetrische Xanthogenate verwendet werden.

Folgende Beispiele dienen dazu, die vorliegende Erfindung zu veranschaulichen.

Beispiel 1
A) Leucinamidmethylthionourethan
Ein mit einem mechanischen Rührwerk, einem Einlassventil für Stickstoff, einem Thermometer und einer Rückflusskühler-Schrubbvorrichtung versehener 50 ml Dreihalskolben wird mit einer Lösung von 2,6 g (20 Millimol) L-Leucinamid in 5 mol Methanol beschickt. Insgesamt 2,17 ml (21 Millimol) Dimethylxanthat werden in das Gemisch pipetiert. Ein Strom von trockenem Stickstoffgas wird durch das Gemisch geleitet und das ausströmende Gas in wässriges Bleiacetat eingeblasen. Es bildet sich sofort ein gelb bis orange farbener Bleimercaptid-Niederschlag.

Das Gemisch wird 3 1/2 Stunden bei Raumtemperatur gerührt und dann 30 Minuten auf 500 C erhitzt.

In diesem Zeitpunkt verläuft der Bleiacetat-Test praktisch negativ. Das erzielte zähflüssige Öl wird in 10 ml Äthylacetat aufgenommen, zweimal mit 7 mol einer wässrigen 10 0/obigen Natriumchloridlösung gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und zur Trockne verdampft. Das erzielte Produkt wird in 18 ml Äthanol gelöst, worauf man es langsam verdunsten lässt. Man erhält 3,5 g L-Leucinamidmethylthionourethan, das langsam kristallisiert.

Befolgt man das gleiche Verfahren mit Alaninamid oder Phenylalaninamid, so werden die entsprechenden Methylthionourethane erzeugt. Ersetzt man das Dimethylxanthogenat durch Diäthylxanthogenat, Di-n-butylxanthogenat oder Dibenzylxanthogenat, so erhält man die entsprechenden Äthyl-, n-Butyl- und Benzylthionourethane.

B) Leucin-N-thiocarboxyanhydrid
Insgesamt 0,45 g (2,2 Millimol) des nach A) erzielten Proddukts werden in 5 ml Nitromethan dispergiert, und trockenes Chlorwasserstoffgas wird eine Stunde bei Raumtemperatur eingeleitet. Das Reaktionsgemisch wird sofort trübe. Nach 1 Stunde wird eine 0,2 ml Probe entnommen und im Vakuum zur Trockene verdampft. Die Feststoffe werden in etwa 0,4 ml Methylenchlorid aufgenommen, durch Glaswolle filtriert und einer Infrarotanalyse unterzogen, die die Gegenwart von Leucin-N-thiocarboxyanhydrid anzeigt.

Der Rest des Reaktionsgemisches wird 1 weitere Stunde mit Chlorwasserstoff behandelt und dann in 5 ml Äthylacetat und 5 ml Wasser aufgenommen. Die wässrige Schicht wird weggeworfen und die organische Schicht mit weiteren 5 ml Wasser gewaschen. Die organische Schicht wird wieder abgetrennt und über Natriumsulfat getrocknet. Sie wird dann zur Trockne verdampft und der Rückstand aus 2 ml Cyclohexan umkristallisiert, wobei 0,17 g LeucineN-thiocarboxyan- hydrid erzielt werden.

Die weiteren oben beschriebenen Thionourethane können unter gleichen Bedingungen verwendet werden, wobei man die entsprechenden Thiocarboxyanhydride erhält.

Beispiel 2
Leucinmethylthionourethan
Insgesamt 52,5 g Leucin werden in 34,2 ml 45 0/obiges äthanolisches Kaliumhydroxyd aufgenommen, worauf 10 ml Wasser beigefügt werden. In die Lösung werden 48,9 g Dimethylxanthogenat in 40 ml Methanol gegeben. Das Zweiphasensystem wird zur Bildung eines Einphasensystems unter Entwicklung von Methylmercaptan auf etwa 500 C erhitzt. Die Lösung wird etwa 90 Minuten bei 500 C gehalten und konzentriert, um das meiste Äthanol zu entfernen. Der Rückstand wird mit 100 ml Wasser verdünnt und zweimal mit je 100 ml Äthylacetat gewaschen, um nicht umgesetztes Xanthogenat zu entfernen.

Die wässrige Schicht wird in 200ml 34 mol konzentrierte Salzsäure enthaltendes Äthylacetat gegeben, und weitere 50 mi Wasser werden beigefügt. Durch diese Behandlung wird das Kaliumsalz von N-Thiocarbalkoxyleucin in die gewünschte Säure umgewandelt und in eine organische Schicht extrahiert. Die wässrige Schicht wird mit zusätzlichem Äthylacetat gewaschen, und die kombinierten organischen Schichten werden zweimal mit je 40 ml gesättigter Natriumchloridlösung gewaschen, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und filtriert. Das Filtrat wird bei vermindertem Druck zu einem zähflüssigen Öl konzentriert, das beim Stehen zur Bildung von Leucinmethylthionourethan kristallisiert.

In ähnlicher Weise werden Alanin und Phenylalanin mit Dimethylxanthogenat zur Bildung des entsprechenden Methyltbiononrethans und Leucin, Alanin und Phenylalanin mit Diäthylxanthogenat bzw. Di-n-butylxanthogenat und Dibenzylxanthogenat zur Bildung der Sithyl- bzw. n-Butyl- und Benzylthionourethane umgesetzt.

Leucinamidmethylthionourethan
2,05 g (10,0 Millimol) des erzielten Produkts werden in einem 50 ml Einhalskolben in 15 ml trockenem Äther gelöst; trockenes Ammoniakgas wird etwa 5 Minuten eingeleitet. Es bildet sich ein Öl, das sich von der Lösung abscheidet. Das Gemisch wird im Vakuum konzentriert, um Äther und überschüssiges Ammoniak zu entfernen, und 10 ml Acetonitril und 2,06 g (10 Millimol) Dicyclohexylcarbodiimid werden beigefügt.

Das Gemisch wird über Nacht bei Raumtemperatur gerührt, konzentriert und mit Äther extrahiert. Der Xaither- extrakt wird über Natriumsulfat getrocknet, filtriert und eingedampft, wobei Leucinamidmethylthionourethan erzielt wird. Das Produkt wird zur Bildung von Leucin-N-thiocarboxyanhydrid unter den Bedingungen von Beispiel 1 B cyclisiert.

In ähnlicher Weise werden die anderen genannten Thionourethane in das Amidthionourethan umgewandelt, und zu den entsprechenden Thiocarboxyanhydriden cyclisiert.

Herstellung von Analylleucylphenylalanin
Dieses Beispiel veranschaulicht die Verwendung der Thiocarboxyanhydride zur Herstellung von Polypeptiden. In ein Gemisch von 3 Millimol Phenylalanin und 30 ml wässrigem Kaliumboratpuffer bei pH 10 werden 3,2 Millimol festes N-Thiocarboxylleucinanhydrid unter raschem Rühren gegeben, während die Temperatur zwischen 0 und 400 C gehalten wird. Der pH mit konzentrierter Schwefelsäure auf 3 eingestellt, während ein Stickstoffstrom durch das Gemisch geleitet wird. Das Leucylphenylalanin-Produkt wird nicht isoliert.

Der pH des Gemisches wird durch die Beigabe von konzentriertem Kaliumhydroxyd auf 10,0 eingestellt, und 3,4 Millimol Alanin-N-thiocarboxyanhydrid werden unter raschem Rühren beigefügt, während die Temperatur bei etwa 250 C gehalten wird. Die Umsetzung wird 20 Minuten fortgesetzt und die Dethiocarboxylierung durch Einstellung des pH-Wertes auf 3 mit Schwefel säure bewirkt. Das gewünschte Produkt wird chromatographisch auf einer Silicagel-Kolonne isoliert. In ähnlicher Weise werden andere oben beschriebene Thiocarboxylanhydride zur gesteuerten stufenweisen Synthese von Polypeptiden verwendet.

Claims

PATENTANSPRUCH

Verfahren zur Herstellung der inneren Anhydride von N-Thionocarboxyaminocarbonsäuren, dadurch gekennzeichnet, dass ein entsprechendes Aminocarbonsäureamid, welches an der Aminogruppe durch eine veresterte Thionocarboxygruppe substituiert ist, in Gegenwart einer starken Säure in einem inerten polaren organischen Lösungsmittel cyclisiert wird.

UNTERANSPRÜCHE 1. Verfahren nach Patentanspruch zur Herstellung eines Aminosäure-N-thiocarboxyanhydrids der Formel EMI5.1 worin R Wasserstoff oder einen Substituenten bedeutet, dadurch gekennzeichnet, dass ein Aminosäureamidthionourethan der Formel EMI5.2 worin R1 ein Niederalkyl oder Aralkyl mit bis zu 8 Kohlenstoffatomen ist, in Gegenwart einer starken Säure und eines inerten polaren organischen Lösungsmittel cyclisiert wird.

2. Verfahren nach Unteranspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Säure eine Mineralsäure ist.

3. Verfahren nach Unteranspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Mineralsäure Salzsäure ist.

4. Verfahren nach Unteranspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Säure Salzsäure, das Lösungsmittel Nitromethan und R' Methyl ist.