Verfahren zur herstellung von Peptid-Derivaten
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein neues Verfahren zur Herstellung der inneren Anhydride von N-Thionocarboxyaminocarbonsäuren.
Die gesteuerte stufenweise Synthese von Polypeptiden und insbesondere Heteropeptiden ist ein Problem, das die Fachleute seit langem beschäftigt. Solche Produkte sind als Zwischenprodukte bei der Synthese von Proteinen nützlich. Gewisse von ihnen sind therapeutisch wirksam. Sie sind auch beim Studium und bei der Analyse von Proteinen nützlich, insbesondere bei Untersuchungen, die dazu dienen, die Wirkungsweise von Enzymen, Hormonen und anderen Proteinen mit wichtigen Funktionen im Organismus zu ergründen.
Eine gesteuerte stufenweise Synthese von Heteropeptiden und Proteinen besteht in der Umsetzung einer Aminosäure oder eines Peptids, z. B. eines Tetrapeptids, in einem wässrigen Milieu unter gesteuerten Konzentrations-, Temperatur-, Zeit- und Wasserstoffionenkonzentrationsbedingungen mit einem N-Thiocarboxyaminosäureanhydrid zur Bildung einer Thiocarbamat Zwischenverbindung, die dann zur Bildung des gewünschten Produkts dethiocarboxyliert wird, gewöhnlich indem die MTasserstoffionenkonzentration auf pH 3 bis 5 herabgesetzt wird. Das Verfahren kann in aufeinander folgenden Umsetzungen ohne Isolierung der Zwischenverbindungen ausgeführt werden, wobei ein äusserst grosses Molekulargewicht aufweisende Heteropeptide erzeugt werden. Dieses Verfahren wird nachstehend als TCA-Verfahren bezeichnet.
Dieses Verfahren besteht allgemein in der Umsetzung des gewählten Aminosäurethioanhydrids, entweder mit der Aminogruppe einer zweiten Aminosäure oder mit einem Peptid unter solchen Bedingungen, dass die einzige Aminogruppe, die während der Umsetzung in beträchtlicher Konzentration vorliegt, die Aminogruppe ist, die an der Umsetzung teilnehmen soll. Die genauen Bedingungen, unter denen ein besonderes .Nminosäurethioanhydrid sich mit einer Aminosäure oder einem Peptid umsetzt, hängen von den chemischen und physikalischen Eigenschaften der Reaktionsteilnehmer ab. Der Hauptfaktor ist die relative Basizi; tät der Reaktionsteilnehmer und Zwischenverbindungen.
Die Umsetzung wird normalerweise durchgeführt, indem das Thioanhydrid bei einem pH von etwa 7 bis 10 und gewöhnlich 8 bis 10 und bei einer niedrigen Temperatur, z. B. 0 bis 250 C, einem die Aminosäure oder das Peptid enthaltenden wässrigen Milieu beigefügt und die Kupplungsreaktion zur Bildung einer Thiocarbamat-Zwischenverbindung zu Ende geführt wird, indem während einer Periode, die normalerweise 30 Minuten nicht übersteigt, aber 2 bis 3 Stunden betragen kann, rasch gerührt wird. Die Zwischenverbindung wird dann zur Erzeugung des gewünschten Produkts dethiocarboxyliert, indem der pH auf etwa 3 bis 5 herabgesetzt wird.
Die vorliegende Erfindung stellt ein neuartiges und zweckmässiges Verfahren zur Herstellung der synthetisch nützlichen N-Thiocarboxyaminosäureanhydn.de dar. Das erfindungsgemässe Verfahren zur Herstellung der inneren Anhydride von N-Thiocarboxyaminocarb- onsäure ist nun dadurch gekennzeichnet, dass ein ent sprediendes Aminocarbonsäureamid, welches an der Aminogruppe durch eine veresterte Thionocarboxygruppe substituiert ist, in Gegenwart einer starken Säure in einem inerten polaren Lösungsmittel cyclisiert wird.
Das Verfahren kann durch folgende Gleichung dargestellt werden:
EMI1.1
worin R Wasserstoff oder z. B. eine Niederalkyl-, Niederaralkyl-, Niederaminoaikyl-, Niedercarboxyalkyl-, Niederhydroxyalkyl-, Niedermercaptoalkyl-, Nieder-(niederalkylmercapto)-alkyl-, Niederguanadylalkvl-niederindolylalkyloder Niederimidazólylalkyl-Gruppe und R1 eine Niederalkyl oder Aralkyl darstellt. Der Ausdruck Niederalkyl umfasst bis zu 8 Kohlenstoffatome aufweisende Alkylgruppen.
Die Ringschlussumsetzung wird in Gegenwart einer starken Säure und vorzugsweise einer anorganischen Mineralsäure wie z. B. Salzsäure, durchgeführt. Sie wird auch in einem inerten polaren organischen Lösungsmittel ausgeführt, wobei inert heisst, dass das Lösungsmittel mit dem Thiourethan-Derivat, dem Thionocarboxyanhydrid und der starken Säure nicht reagiert. Geeignete polare Lösungsmittel sind die Nitroniederalkane, insbesondere Nitromethan, doch können auch andere Lösungsmittel, besonders Ester, Äther oder halogenierte Kohlenwasserstoffe, die z. B. bis zu 8 Kohlenstoffatome aufweisen, verwendet werden.
Bei der Ausführung der Umsetzung wird das Thionourethan-Derivat im polaren Lösungsmittel gelöst oder dispergiert und die starke Säure z. B. durch Einleiten von Chlorwasserstoffgas in die Lösung eingeführt. Geeignet sind mässige Reaktionstemperaturen von etwa 0 bis etwa 40 C, doch können auch etwas höhere oder niedrigere Temperaturen verwendet werden. Im allgemeinen ist es am zweckmässigsten, die Umsetzung bei etwa Raumtemperatur auszuführen. Es kann atmosphärischer Druck oder ein höherer Druck verwendet werden, Die Bildung des Thiocarboxyanhydrid-Produkts wird durch das Auftreten eines Niederschlags des Ammoniumsalzes der verwendeten Säure angezeigt, und die Umsetzung wird fortgesetzt, bis sich kein weiterer Niederschlag bildet oder bis aus den Infrarotspektren hervorgeht, dass die Umsetzung vollständig ist, im typischen Fall etwa 0,5 bis 10 Stunden.
Das Thiocarboxyanhydrid wird zweckmässig durch Extraktion mit einem inerten organischen Lösungsmittel, wie z. B. Methylenchlorid oder Äthylacetat, Waschen mit Wasser, Trocknen der organischen Phase und Entfernen des Lösungsmittels rückgewonnen. Der Reinheitsgrad des Produkts wird durch Umkristallisation aus einem geeigneten Lösungsmittel, wie z. B.
N-Hexan-Äthylacetat erhöht. Gegebenenfalls kann das Anhydrid nach dem Fachmann bekannten Methoden in dessen optische Isomere aufgespalten werden.
Das Thionourethan-Derivat kann z veckmässig entweder aus dem verwandten Aminosäureamid durch Umsetzung mit einem Xanthogenatdiester oder aus der verwandten Aminosäure selbst durch Umsetzung mit einem Xanthogenatdiester und dann Umsetzung mit Ammoniak und einem milden Entwässerungsmittel hergestellt werden.
Die Synthese des Thionourethans aus dem Aminosäureamid wird durch folgende Umsetzung veranschaulicht:
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worin R und R1 wie oben beschrieben und die zwei Gruppen Rt gleich oder ungleich sind. Die Umsetzung lässt sich ohne weiteres bei einer massigen Temperatur von etwa 30 bis 500 C ausführen, obwohl auch etwas höhere oder niedrigere Temperaturen verwendet werden können. Gegebenenfalls können Lösungsmittel verwendet werden, um die Homogenität und Flüssigkeit des Reaktionsgemisches zu erhöhen. Es ist wünschenswert, das Mercaptan-Nebenprodukt bei dessen Bildung zu entfernen, weshalb die kurzzeitigen Xanthogenatester, wie z. B. Methylxanthogenat, vorgezogen werden.
Die Umsetzung lässt sich zweckmässig ausführen, indem ein Stickstoffträgerstrom durch das Reaktionsgemisch und von dort durch eine wässrige Bleiacetatlösung geleitet wird. Das Vorhandensein des Mercaptan-Nebenprodukts im Gasstrom wird durch die kontinuierliche Fällung eines gelb bis orange farbenen Bleimercaptids angezeigt, dessen Bildung aufhört, wenn die Hauptumsetzung zu Ende ist. Das Thionourethan kann durch herkömmliche Verfahren, wie z. B. dessen Lösung in einem inerten organischen Lösungsmittel, Waschen mit wässrigem Natriumchlorid, Abtrennen der organischen Schicht und Entfernen des Lösungsmittels, für die nachfolgende Umsetzung genügend gereinigt werden.
Die Erzeugung des Thionourethans aus der verwandten Aminosäure wird durch folgende Umsetzung dargestellt und kann wie folgt durchgeführt werden:
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worin R und Rl wie oben beschrieben und die zwei Gruppen R1 gleich oder ungleich sind. In der ersten Stufe dieser Synthese ist es wünschenswert, eine starke Base, wie z. B. ein Alkalimetallhydroxyd in Wasser, Alkohol oder einer Wasser-Alkohol-Lösung, zu verwenden. Sonst sind die Umsetzungsbedingungen gleich wie die oben für die Umsetzung des Aminosäureamids mit dem Xanthogenatester angegebenen.
Das Aminosäurethiononrethan wird isoliert, indem das Produkt in eine wässrige alkalische Lösung aufgenommen und in einem inerten organischen Lösungsmittel, wie z. B. Äther, gewaschen wird, worauf die wässrige Schicht angesäuert und mit einem inerten organischen Lösungsmittel, wie z. B. Äthylacetat, wieder extrahiert wird. Die organische Schicht wird gesammelt und mit wässrigem Natriumchlorid gewaschen, worauf sie abgetrennt und zur Trockne verdampft wird.
Die Umwandlung des Aminosäurethionourethans in das entsprechende Amid wird ausgeführt, indem es nacheinander mit Ammoniak und einem milden Entwässerungsmittel behandelt wird. Das Ammoniak wandelt die Säure in das Ammoniumsalz um und das Entwässerungsmittel entzieht ein Mol Wasser zur Bildung des Amids. Im typischen Fall wird das Aminosäurethionourethan in einem inerten organischen Lösungsmittel, wie z. B. Äther, gelöst, und trockenes Ammoniakgas wird zur Fällung des Ammoniumsalzes eingeleitet. Dann wird überschüssiges Ammoniak entfernt und die theoretische Menge Entwässerungsmittel beigefügt. Die bevorzugten Entwässerungsmittel sind die Dialkylcarbodiimide, wie z. B. Dicyclohexalcarbodiimid. Das Reaktionsgemisch wird gerührt, bis die Umsetzung zu Ende ist, im typischen Fall etwa 5 bis 20 Stunden.
Mit den bevorzugten Entwässerungsmitteln geht die Umsetzung bei Raumtemperatur glatt vor sich, so dass keine höhere Temperatur notwendig ist. Die Aufarbeitung des Aminosäureamidthionourethan-Produkts zur Verwendung bei der Herstellung eines Thiocarboxyanhydrids wurde bereits beschrieben.
Beispiele von zur Verwendung beim erfindungsgemässen Verfahren geeigneten Ausgangsmaterialien sind die nachstehenden Aminosäuren, und zwar entweder die rechts als auch die linksdrehenden Formen oder razemische Gemische sowie deren Amide oder Thionourethane: Alanin Leucin Cystein Phenylalanin Histidin Glutaminsäure als das a-Amid, Isoglutamin Aspastinsäure als das a-Amid, Isoaspurugin Cystin Arginin Glycin Prolin Serin Isoleucin Valin Thyrosin Threonin und dergleichen, sowie substituierte Derivate davon, wie diejenigen, die mit Niederalkyl-, Aryl-, Aralkyl=, Alkaryl- und Halogen-Gruppen substituiert sind.
Wenn die Aminosäure eine einfache Aminosäure ist, wie z. B. Leucin oder Alanin, geht die Synthese wie oben angegeben in gerader Weise vor sich. Wenn die Aminosäure andere reaktionsfähige Gruppen enthält, werden diese vorzugsweise während der Synthese und allfälligen nachfolgenden Peptid-Synthesen geschützt.
Die Hemmgruppe sollte einer Aufspaltung durch die bei der Ringschliessung verwendete starke Säure wiederstehen. Z. B. werden Amingruppen leicht mit Benzylgruppen blockiert. Thiocarbonsäureanhydride von Dicarbonsäureaminosäuren werden am besten über die a-Amide hergestellt. Ähnliche Verfahren zur Behandlung anderer reaktionsfähiger Gruppen sind dem Fach- mann bekannt.
Wie bereits erwähnt, können die verwendeten Xanthogenate irgend eines der folgenden Xanthogenate oder ähnliche Verbindungen sein: Dimethylxanthogen, Diäthylxanthogen, Di-n-propylxanthogen, Di-n-butylxanthogen, Di-n-hexylxanthogen, Dibenzylxanthogen, Di-ss-phenyläthylxanthogenat usw. Gegebenenfalls können auch asymmetrische Xanthogenate verwendet werden.
Folgende Beispiele dienen dazu, die vorliegende Erfindung zu veranschaulichen.
Beispiel 1
A) Leucinamidmethylthionourethan
Ein mit einem mechanischen Rührwerk, einem Einlassventil für Stickstoff, einem Thermometer und einer Rückflusskühler-Schrubbvorrichtung versehener 50 ml Dreihalskolben wird mit einer Lösung von 2,6 g (20 Millimol) L-Leucinamid in 5 mol Methanol beschickt. Insgesamt 2,17 ml (21 Millimol) Dimethylxanthat werden in das Gemisch pipetiert. Ein Strom von trockenem Stickstoffgas wird durch das Gemisch geleitet und das ausströmende Gas in wässriges Bleiacetat eingeblasen. Es bildet sich sofort ein gelb bis orange farbener Bleimercaptid-Niederschlag.
Das Gemisch wird 3 1/2 Stunden bei Raumtemperatur gerührt und dann 30 Minuten auf 500 C erhitzt.
In diesem Zeitpunkt verläuft der Bleiacetat-Test praktisch negativ. Das erzielte zähflüssige Öl wird in 10 ml Äthylacetat aufgenommen, zweimal mit 7 mol einer wässrigen 10 0/obigen Natriumchloridlösung gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und zur Trockne verdampft. Das erzielte Produkt wird in 18 ml Äthanol gelöst, worauf man es langsam verdunsten lässt. Man erhält 3,5 g L-Leucinamidmethylthionourethan, das langsam kristallisiert.
Befolgt man das gleiche Verfahren mit Alaninamid oder Phenylalaninamid, so werden die entsprechenden Methylthionourethane erzeugt. Ersetzt man das Dimethylxanthogenat durch Diäthylxanthogenat, Di-n-butylxanthogenat oder Dibenzylxanthogenat, so erhält man die entsprechenden Äthyl-, n-Butyl- und Benzylthionourethane.
B) Leucin-N-thiocarboxyanhydrid
Insgesamt 0,45 g (2,2 Millimol) des nach A) erzielten Proddukts werden in 5 ml Nitromethan dispergiert, und trockenes Chlorwasserstoffgas wird eine Stunde bei Raumtemperatur eingeleitet. Das Reaktionsgemisch wird sofort trübe. Nach 1 Stunde wird eine 0,2 ml Probe entnommen und im Vakuum zur Trockene verdampft. Die Feststoffe werden in etwa 0,4 ml Methylenchlorid aufgenommen, durch Glaswolle filtriert und einer Infrarotanalyse unterzogen, die die Gegenwart von Leucin-N-thiocarboxyanhydrid anzeigt.
Der Rest des Reaktionsgemisches wird 1 weitere Stunde mit Chlorwasserstoff behandelt und dann in 5 ml Äthylacetat und 5 ml Wasser aufgenommen. Die wässrige Schicht wird weggeworfen und die organische Schicht mit weiteren 5 ml Wasser gewaschen. Die organische Schicht wird wieder abgetrennt und über Natriumsulfat getrocknet. Sie wird dann zur Trockne verdampft und der Rückstand aus 2 ml Cyclohexan umkristallisiert, wobei 0,17 g LeucineN-thiocarboxyan- hydrid erzielt werden.
Die weiteren oben beschriebenen Thionourethane können unter gleichen Bedingungen verwendet werden, wobei man die entsprechenden Thiocarboxyanhydride erhält.
Beispiel 2
Leucinmethylthionourethan
Insgesamt 52,5 g Leucin werden in 34,2 ml 45 0/obiges äthanolisches Kaliumhydroxyd aufgenommen, worauf 10 ml Wasser beigefügt werden. In die Lösung werden 48,9 g Dimethylxanthogenat in 40 ml Methanol gegeben. Das Zweiphasensystem wird zur Bildung eines Einphasensystems unter Entwicklung von Methylmercaptan auf etwa 500 C erhitzt. Die Lösung wird etwa 90 Minuten bei 500 C gehalten und konzentriert, um das meiste Äthanol zu entfernen. Der Rückstand wird mit 100 ml Wasser verdünnt und zweimal mit je 100 ml Äthylacetat gewaschen, um nicht umgesetztes Xanthogenat zu entfernen.
Die wässrige Schicht wird in 200ml 34 mol konzentrierte Salzsäure enthaltendes Äthylacetat gegeben, und weitere 50 mi Wasser werden beigefügt. Durch diese Behandlung wird das Kaliumsalz von N-Thiocarbalkoxyleucin in die gewünschte Säure umgewandelt und in eine organische Schicht extrahiert. Die wässrige Schicht wird mit zusätzlichem Äthylacetat gewaschen, und die kombinierten organischen Schichten werden zweimal mit je 40 ml gesättigter Natriumchloridlösung gewaschen, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und filtriert. Das Filtrat wird bei vermindertem Druck zu einem zähflüssigen Öl konzentriert, das beim Stehen zur Bildung von Leucinmethylthionourethan kristallisiert.
In ähnlicher Weise werden Alanin und Phenylalanin mit Dimethylxanthogenat zur Bildung des entsprechenden Methyltbiononrethans und Leucin, Alanin und Phenylalanin mit Diäthylxanthogenat bzw. Di-n-butylxanthogenat und Dibenzylxanthogenat zur Bildung der Sithyl- bzw. n-Butyl- und Benzylthionourethane umgesetzt.
Leucinamidmethylthionourethan
2,05 g (10,0 Millimol) des erzielten Produkts werden in einem 50 ml Einhalskolben in 15 ml trockenem Äther gelöst; trockenes Ammoniakgas wird etwa 5 Minuten eingeleitet. Es bildet sich ein Öl, das sich von der Lösung abscheidet. Das Gemisch wird im Vakuum konzentriert, um Äther und überschüssiges Ammoniak zu entfernen, und 10 ml Acetonitril und 2,06 g (10 Millimol) Dicyclohexylcarbodiimid werden beigefügt.
Das Gemisch wird über Nacht bei Raumtemperatur gerührt, konzentriert und mit Äther extrahiert. Der Xaither- extrakt wird über Natriumsulfat getrocknet, filtriert und eingedampft, wobei Leucinamidmethylthionourethan erzielt wird. Das Produkt wird zur Bildung von Leucin-N-thiocarboxyanhydrid unter den Bedingungen von Beispiel 1 B cyclisiert.
In ähnlicher Weise werden die anderen genannten Thionourethane in das Amidthionourethan umgewandelt, und zu den entsprechenden Thiocarboxyanhydriden cyclisiert.
Herstellung von Analylleucylphenylalanin
Dieses Beispiel veranschaulicht die Verwendung der Thiocarboxyanhydride zur Herstellung von Polypeptiden. In ein Gemisch von 3 Millimol Phenylalanin und 30 ml wässrigem Kaliumboratpuffer bei pH 10 werden 3,2 Millimol festes N-Thiocarboxylleucinanhydrid unter raschem Rühren gegeben, während die Temperatur zwischen 0 und 400 C gehalten wird. Der pH mit konzentrierter Schwefelsäure auf 3 eingestellt, während ein Stickstoffstrom durch das Gemisch geleitet wird. Das Leucylphenylalanin-Produkt wird nicht isoliert.
Der pH des Gemisches wird durch die Beigabe von konzentriertem Kaliumhydroxyd auf 10,0 eingestellt, und 3,4 Millimol Alanin-N-thiocarboxyanhydrid werden unter raschem Rühren beigefügt, während die Temperatur bei etwa 250 C gehalten wird. Die Umsetzung wird 20 Minuten fortgesetzt und die Dethiocarboxylierung durch Einstellung des pH-Wertes auf 3 mit Schwefel säure bewirkt. Das gewünschte Produkt wird chromatographisch auf einer Silicagel-Kolonne isoliert. In ähnlicher Weise werden andere oben beschriebene Thiocarboxylanhydride zur gesteuerten stufenweisen Synthese von Polypeptiden verwendet.
Process for the preparation of peptide derivatives
The present invention relates to a new process for the preparation of the internal anhydrides of N-thionocarboxyaminocarboxylic acids.
The controlled, staged synthesis of polypeptides, and particularly heteropeptides, has long been a problem of concern to those skilled in the art. Such products are useful as intermediates in the synthesis of proteins. Certain of them are therapeutically effective. They are also useful in the study and analysis of proteins, especially in studies that are used to understand the mode of action of enzymes, hormones and other proteins with important functions in the organism.
A controlled step-wise synthesis of heteropeptides and proteins consists in the conversion of an amino acid or a peptide, e.g. B. a tetrapeptide, in an aqueous medium under controlled concentration, temperature, time and hydrogen ion concentration conditions with an N-thiocarboxyamino acid anhydride to form a thiocarbamate intermediate which is then dethiocarboxylated to form the desired product, usually by adjusting the Mhydrogen ion concentration to pH 3 to 5 is reduced. The process can be carried out in successive reactions without isolation of the intermediate compounds, with extremely high molecular weight heteropeptides being produced. This procedure is hereinafter referred to as the TCA procedure.
This method generally consists in reacting the chosen amino acid thioanhydride, either with the amino group of a second amino acid or with a peptide under such conditions that the only amino group which is present in significant concentration during the reaction is the amino group which is to take part in the reaction . The exact conditions under which a particular .Nminosaurethioanhydride reacts with an amino acid or a peptide depend on the chemical and physical properties of the reactants. The main factor is the relative base rate; ity of the reaction participants and intermediate connections.
The reaction is usually carried out by bubbling the thioanhydride at a pH of about 7-10 and usually 8-10 and at a low temperature, e.g. B. 0 to 250 C, added to an aqueous medium containing the amino acid or the peptide and the coupling reaction to form a thiocarbamate intermediate compound is brought to completion by during a period which normally does not exceed 30 minutes, but can be 2 to 3 hours , is stirred rapidly. The intermediate is then dethiocarboxylated to produce the desired product by lowering the pH to about 3-5.
The present invention represents a novel and expedient process for the preparation of the synthetically useful N-thiocarboxyaminosäureanhydn.de. The process according to the invention for the preparation of the internal anhydrides of N-thiocarboxyaminocarbonic acid is now characterized in that a corresponding aminocarboxamide which is attached to the amino group is substituted by an esterified thionocarboxy group, is cyclized in the presence of a strong acid in an inert polar solvent.
The procedure can be represented by the following equation:
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wherein R is hydrogen or e.g. A lower alkyl, lower aralkyl, lower amino alkyl, lower carboxyalkyl, lower hydroxyalkyl, lower mercaptoalkyl, lower (lower alkylmercapto) alkyl, lower guanadyl alkyl, lower indolylalkyl or lower imidazoylalkyl group and R1 is lower alkyl or aralkyl. The term lower alkyl includes alkyl groups containing up to 8 carbon atoms.
The ring closure reaction is carried out in the presence of a strong acid and preferably an inorganic mineral acid such as. B. hydrochloric acid performed. It is also carried out in an inert polar organic solvent, inert means that the solvent does not react with the thiourethane derivative, the thionocarboxy anhydride and the strong acid. Suitable polar solvents are the nitro lower alkanes, in particular nitromethane, but other solvents, especially esters, ethers or halogenated hydrocarbons, e.g. B. have up to 8 carbon atoms can be used.
When carrying out the reaction, the thionourethane derivative is dissolved or dispersed in the polar solvent and the strong acid z. B. introduced into the solution by bubbling hydrogen chloride gas. Moderate reaction temperatures of about 0 to about 40 ° C. are suitable, but slightly higher or lower temperatures can also be used. In general, it is most convenient to carry out the reaction at about room temperature. Atmospheric pressure or a higher pressure can be used. The formation of the thiocarboxy anhydride product is indicated by the appearance of a precipitate of the ammonium salt of the acid used and the reaction continues until no further precipitate forms or until the infrared spectra indicate that the reaction is complete, typically about 0.5 to 10 hours.
The thiocarboxy anhydride is conveniently extracted by extraction with an inert organic solvent, such as. B. methylene chloride or ethyl acetate, washing with water, drying the organic phase and removing the solvent recovered. The purity of the product is determined by recrystallization from a suitable solvent, such as e.g. B.
N-hexane-ethyl acetate increased. If necessary, the anhydride can be split into its optical isomers by methods known to the person skilled in the art.
The thionourethane derivative can be prepared either from the related amino acid amide by reaction with a xanthate diester or from the related amino acid itself by reaction with a xanthate diester and then reaction with ammonia and a mild dehydrating agent.
The synthesis of thionourethane from the amino acid amide is illustrated by the following implementation:
EMI2.1
wherein R and R1 are as described above and the two groups Rt are the same or different. The reaction can easily be carried out at a moderate temperature of about 30 to 500 ° C., although slightly higher or lower temperatures can also be used. Solvents can optionally be used to increase the homogeneity and fluidity of the reaction mixture. It is desirable to remove the mercaptan by-product as it is formed, which is why the short-term xanthate esters, such as. B. methyl xanthate, are preferred.
The reaction can be conveniently carried out by passing a nitrogen carrier stream through the reaction mixture and from there through an aqueous lead acetate solution. The presence of the mercaptan by-product in the gas stream is indicated by the continuous precipitation of a yellow to orange colored lead mercaptid, the formation of which stops when the main reaction is over. The thionourethane can be prepared by conventional methods such. B. its solution in an inert organic solvent, washing with aqueous sodium chloride, separating the organic layer and removing the solvent, are sufficiently purified for the subsequent reaction.
The generation of thionourethane from the related amino acid is represented by the following reaction and can be carried out as follows:
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wherein R and Rl are as described above and the two groups R1 are the same or different. In the first stage of this synthesis it is desirable to use a strong base, such as. B. to use an alkali metal hydroxide in water, alcohol or a water-alcohol solution. Otherwise the reaction conditions are the same as those given above for the reaction of the amino acid amide with the xanthate ester.
The amino acid urethionone methane is isolated by taking up the product in an aqueous alkaline solution and in an inert organic solvent, such as. B. ether, is washed, whereupon the aqueous layer acidified and with an inert organic solvent, such as. B. ethyl acetate, is extracted again. The organic layer is collected and washed with aqueous sodium chloride, whereupon it is separated and evaporated to dryness.
The conversion of the amino acid urethionourethane to the corresponding amide is carried out by treating it sequentially with ammonia and a mild dehydrating agent. The ammonia converts the acid to the ammonium salt and the dehydrating agent removes one mole of water to form the amide. Typically the amino acid urethionourethane is dissolved in an inert organic solvent such as. B. ether, dissolved, and dry ammonia gas is introduced to precipitate the ammonium salt. Then excess ammonia is removed and the theoretical amount of dehydrating agent is added. The preferred dehydrating agents are the dialkylcarbodiimides, e.g. B. dicyclohexalcarbodiimide. The reaction mixture is stirred until the reaction is complete, typically about 5 to 20 hours.
With the preferred dehydrating agents, the reaction proceeds smoothly at room temperature, so that no higher temperature is necessary. The work-up of the amino acid amide thionourethane product for use in the manufacture of a thiocarboxy anhydride has already been described.
Examples of starting materials suitable for use in the process according to the invention are the following amino acids, namely either the right-handed or the levorotatory forms or racemic mixtures and their amides or thionourethanes: alanine leucine cysteine phenylalanine histidine glutamic acid as the a-amide, isoglutamine aspastic acid as the a -Amide, isoaspurugine, cystine, arginine, glycine, proline, serine, isoleucine, valine, tyrosine, threonine, and the like, as well as substituted derivatives thereof, such as those substituted with lower alkyl, aryl, aralkyl =, alkaryl, and halogen groups.
If the amino acid is a simple amino acid such as e.g. B. leucine or alanine, the synthesis proceeds in a straight line as indicated above. If the amino acid contains other reactive groups, these are preferably protected during the synthesis and any subsequent peptide syntheses.
The inhibitor group should resist splitting by the strong acid used in ring closure. For example, amine groups are easily blocked with benzyl groups. Thiocarboxylic anhydrides of dicarboxylic acid amino acids are best prepared via the α-amides. Similar methods for treating other reactive groups are known to those skilled in the art.
As already mentioned, the xanthates used can be any of the following xanthates or similar compounds: dimethylxanthogen, diethylxanthogen, di-n-propylxanthogen, di-n-butylxanthogen, di-n-hexylxanthogen, dibenzylxanthogen, di-ss-phenylethylxanthogenate, etc. Where appropriate Asymmetric xanthates can also be used.
The following examples serve to illustrate the present invention.
example 1
A) Leucinamide methylthionourethane
A 50 ml three-necked flask fitted with a mechanical stirrer, nitrogen inlet valve, thermometer, and reflux condenser scrubber is charged with a solution of 2.6 g (20 millimoles) of L-leucine amide in 5 moles of methanol. A total of 2.17 ml (21 millimoles) of dimethylxanthate are pipetted into the mixture. A stream of dry nitrogen gas is passed through the mixture and the effluent gas is sparged into aqueous lead acetate. A yellow to orange colored lead captide precipitate forms immediately.
The mixture is stirred for 3 1/2 hours at room temperature and then heated to 500 ° C. for 30 minutes.
At this point in time the lead acetate test is practically negative. The viscous oil obtained is taken up in 10 ml of ethyl acetate, washed twice with 7 mol of an aqueous 10 0 / above sodium chloride solution, dried over sodium sulfate and evaporated to dryness. The product obtained is dissolved in 18 ml of ethanol, whereupon it is allowed to slowly evaporate. 3.5 g of L-leucine amide methylthionourethane are obtained, which slowly crystallizes.
If the same procedure is followed with alanine amide or phenylalanine amide, the corresponding methylthionourethanes are produced. If the dimethyl xanthate is replaced by diethyl xanthate, di-n-butyl xanthate or dibenzyl xanthate, the corresponding ethyl, n-butyl and benzylthionourethanes are obtained.
B) Leucine-N-thiocarboxy anhydride
A total of 0.45 g (2.2 millimoles) of the product obtained according to A) are dispersed in 5 ml of nitromethane, and dry hydrogen chloride gas is passed in for one hour at room temperature. The reaction mixture immediately becomes cloudy. After 1 hour, a 0.2 ml sample is taken and evaporated to dryness in vacuo. The solids are taken up in about 0.4 ml of methylene chloride, filtered through glass wool and subjected to infrared analysis which indicates the presence of leucine-N-thiocarboxy anhydride.
The remainder of the reaction mixture is treated with hydrogen chloride for a further hour and then taken up in 5 ml of ethyl acetate and 5 ml of water. The aqueous layer is discarded and the organic layer is washed with an additional 5 ml of water. The organic layer is separated again and dried over sodium sulfate. It is then evaporated to dryness and the residue is recrystallized from 2 ml of cyclohexane, 0.17 g of LeucineN-thiocarboxyanhydride being obtained.
The other thionourethanes described above can be used under the same conditions, the corresponding thiocarboxy anhydrides being obtained.
Example 2
Leucine methylthionourethane
A total of 52.5 g of leucine are taken up in 34.2 ml of 45% of the above ethanolic potassium hydroxide, whereupon 10 ml of water are added. 48.9 g of dimethyl xanthate in 40 ml of methanol are added to the solution. The two-phase system is heated to about 500 ° C. to form a single-phase system with evolution of methyl mercaptan. The solution is held at 500 ° C. for about 90 minutes and concentrated to remove most of the ethanol. The residue is diluted with 100 ml of water and washed twice with 100 ml of ethyl acetate each time in order to remove unreacted xanthate.
The aqueous layer is poured into 200 ml ethyl acetate containing 34 mol of concentrated hydrochloric acid, and a further 50 ml of water are added. By this treatment, the potassium salt of N-thiocarbalkoxyleucine is converted into the desired acid and extracted into an organic layer. The aqueous layer is washed with additional ethyl acetate and the combined organic layers are washed twice with 40 ml of saturated sodium chloride solution each time, dried over anhydrous sodium sulfate and filtered. The filtrate is concentrated under reduced pressure to a viscous oil which crystallizes on standing to form leucine methylthionourethane.
In a similar way, alanine and phenylalanine are reacted with dimethylxanthogenate to form the corresponding methyltbiononethane and leucine, alanine and phenylalanine with diethylxanthogenate or di-n-butylxanthogenate and dibenzylxanthogenate to form the sithyl- or n-butyl- and benzylthionourethanes.
Leucine amide methylthionourethane
2.05 g (10.0 millimoles) of the product obtained are dissolved in 15 ml of dry ether in a 50 ml single-necked flask; dry ammonia gas is introduced for about 5 minutes. An oil forms which separates from the solution. The mixture is concentrated in vacuo to remove ether and excess ammonia and 10 ml of acetonitrile and 2.06 g (10 millimoles) of dicyclohexylcarbodiimide are added.
The mixture is stirred at room temperature overnight, concentrated and extracted with ether. The Xaither extract is dried over sodium sulfate, filtered and evaporated to give leucine amide methylthionourethane. The product is cyclized under the conditions of Example 1B to form leucine-N-thiocarboxyanhydride.
In a similar way, the other thionourethanes mentioned are converted into the amidothionourethane and cyclized to the corresponding thiocarboxy anhydrides.
Manufacture of analylleucylphenylalanine
This example illustrates the use of the thiocarboxy anhydrides to make polypeptides. 3.2 millimoles of solid N-thiocarboxylic leucine anhydride are added to a mixture of 3 millimoles of phenylalanine and 30 ml of aqueous potassium borate buffer at pH 10 with rapid stirring while the temperature is kept between 0 and 400.degree. The pH is adjusted to 3 with concentrated sulfuric acid while a stream of nitrogen is passed through the mixture. The leucylphenylalanine product is not isolated.
The pH of the mixture is adjusted to 10.0 by the addition of concentrated potassium hydroxide and 3.4 millimoles of alanine-N-thiocarboxy anhydride are added with rapid stirring while maintaining the temperature at about 250.degree. The reaction is continued for 20 minutes and the dethiocarboxylation is effected by adjusting the pH to 3 with sulfuric acid. The desired product is isolated by chromatography on a silica gel column. Similarly, other thiocarboxylic anhydrides described above are used in the controlled, stepwise synthesis of polypeptides.