DE2022032C3

DE2022032C3 - Verfahren zur Herstellung von Pepliden

Info

Publication number: DE2022032C3
Application number: DE19702022032
Authority: DE
Inventors: M A Tilak
Original assignee: Eli Lilly and Co
Current assignee: Eli Lilly and Co
Priority date: 1969-05-05
Filing date: 1970-05-05
Publication date: 1975-08-14
Also published as: NL165454B; CH539614A; GB1268463A; NL7006567A; NL165454C; DE2022032B2; FR2047314A5; AT301771B; DE2022032A1; JPS5039641B1; SE374738B

Description

Anhydrids von 50 Molprozent wird außerdem eine praktisch vollständige Acrylierung des Peptids erzielt.

Geeignete Pufferlösungen enthalten beispielsweise Natriumacetat, Kaliumacetat, Dinatriumhydrogenohosphat, Borax, Natriumbenzoat, Kaliumformiat und lmidazolhydrochlorid sowie je nach dem üblichen loneneffekt zur Unterdrückung einer Ionisierung gemischte Salze, wie Kaliumphthalat oder Kaliumhydrogenphthalat.

Die ernndungsgemäße Umsetzung wird bei Temperaturen zwischen Raumtemperatur und bis zum Gefrierpunkt der Reaktionsmischung vorgenommen. Die Reaktionsmischung wird mit einem Oberschuß der Pufferlösung, z. B. einer gesättigten wäßrigen Lösung

vi.t.:..mkti<4rhnn!)} von (V'f vpi*QPt7t nnrl 7iir

IO Imidazolylmethylrest, Indolylmethylrest oder Phenylrest und m und η 0 oder 1 bedeuten.

Unter Niedcralkyl wird beispielsweise Methyl, Äthyl, n-Propyl, Isopropyl, η-Butyl, Isobutyl, sec-Butyl oder tert.-Butyl verstanden. Hydroxysubstituiertes Niederalkyl bedeutet beispielsweise Hydroxymethyl, Λ-Hydroxyäthyl, /?-Hydroxyäthyl, y-Hydroxypropyl, 2-Hydroxy-2-propyl, 2-Hydroxy-2-butyl, 3-Hydroxy-2-butyl oder Hydroxy-tert.-butyl. Zu »carboxysubstituiertem Niederalkyl« gehören Carboxymethyl, Carboxyäthyl, 2-Carboxy-2-propyl oder 2-Carboxymethyl-2-pΓopyl. Beispiele für niederalkylmercaptosubstiiuiertes Niederalkyl sind Methylmer-

Pufferlöst'ng, z. B. einer gesättigten wätSngeu Lösung captoäthyl, Isopropylmercapinmethyl, n-Propylvon Natriumbicarbonat von OC, versetzt und zur 15 mercapioäthyl, Methylmercaptobutyl, 2-Methylrner-7ersetzung des Säureanhydrids etwa 15 Minuten lang capto-2-propyl, 3-Methylmercapto-2-butyl oder 2-Merfer mehr gut damit vermischt. Die Abtrennung des thyliTjercaptomethyl-2-propyl. Unter einem guanidinoprhaltenen festen Produkts erfolgt in üblicher Weise. substituierten Niederalkyl versteht man beispielsweise Beispiele für Säurechloride, die sich zur Herstellung Guanidinomethyl, Guanidinoäthyl, 2-Guanidinofur die erfindungsgemäßen Zwecke geeigneten 20 2-propyl oder \,%-Oimethylguanidinoäthyl. Zu einem Anhvdriden verwenden lassen, sind Äthylchlorcarbo- guanidinooxysubstituiertem Niederalkyl gehören guaniat Phenylchlorcarbonat, 2,2,2-Trichloräthylchlor- dinosubstituierte Niederalkylsubstituenten der oben rnrhonat see -Butylchlorcarbonat, Isobutylchlor- angegebenen Art, in denen die heterocyclische Ouaniefrbonat oder Pivaloylchlorid. dingruppe über ein weiteres Sauerstoffatom an die

Für eine vollständige Zersetzung des überschüssigen 25 niedere Alkylgruppe gebunden ist. Aminosubstituiene Anhvdrids nach beendeter Kupplungsreaktion soll die Niederalkyle sind beispielsweise Aminoathyl, Am.nopüfferlosung in solcher Menge zugesetzt werden, so methyl, 2-Amino-2-propyl, 3-Am.npropyl oder daß die Endbasizität der wäßrigen Phase der Reaktions- 1-Aminopropyl.

lö'unp/wischen etwa pH 7,5 und etwa pH 9,5 liegt. Beispiele für a-Am.nosauren, ehe nach dercι Jn-

Na?h einer bevorzugten Ausführungsform der Erfin- 30 dungsgemäßen Verfahren unter Bildung von ^pept.den ng wird Natriumcarbonatlösung bei etwa 0 C bis umgesetzt werden können »nd die in Jr folgenden M einem pH-Wert von etwa 8 zugesetzt, worauf man Tabelle genannten Verbindungen, d.enach der Arides bei oder unterhalb Raumtemperatur bis zu 2 Stunden
lang intensiv rührt und dann die Phasen trennt.

Die Umsetzung wird zweckmäßigerweise in Gegenwart einer nicht reaktionsfähigen Base als Säureakzeptor durchgeführt. Hierzu gehören beispielsweise sterisch stark gehinderte sekundäre Amine, wie Ditert -butylamin, Dicyclohexylainin oder Diisopropylamin oder tertiäre Amine, wie Triäthylamin, Dimethyläthylamin, Äthyldimethylamin, Äthyldiisopropylamin, N-Methylpyrrolidon, Dimethylanilin oder Tribenzylamin.

Als inerte Lösungsmittel lassen sich fur die ernndungsgemäße Umsetzung beispielsweise mit Wasser mischbare Lösungsmittel verwenden wie N,N-Dimethylformamid, N-Methylpyrrolidon, Hexamethylphosphoramid oder Ν,Ν-Dimethylacetamid.

Die erfindungsgemäße Anhydridtechnik läßt sich auf jede Aminosäure anwenden, die an ein vorhandenes Fragment einer C-geschütz-ten Peptidkette gekuppelt

. ■ τ-»: \/»·.κ:ΐΛ*4ιιηηοη laccpn Qirn nlircn

Substituenten klassifiziert sind, der in der oben angegebenen Formel mit R² bezeichnet ist.

Üblicher Name

Alkyl hydroxy-substituiertes
Niederalkyl

carboxy-substituiertes

Niederalkyl
niederalkyl-mercapto-sub-

stituiertes Niederalkyl

werden kann. Diese Verbindungen lassen sich durch folgende Formel kennzeichnen:

R¹

C - (CH₂),„ - COOH

NHR³

worin R¹ und R³ Wasserstoff atome oder Niederalkylreste, R² ein Wasserstoffatom oder einen Niederalkylrest, hydroxysubstituierten Niederalkylrest, carboxy- piperidin substituierten Niederalkylrest, niederalkylmercaptosubstituierten Niederalkylresl, guanidinosubstituierten Niederalkylrest, guanidinooxysubstituierten Niederalkylrest, aminosubstituierten Niederalkylrest, guanidino-substituiertes

Niederalkyl

guanidinooxy-substituiertes Niederalkyl
amino-substituiertes
Niederalkyl

, Imidazolylmethyl
00

Indolylmethyl
Phenyl

Glycin, Sarcosin

Alanin

Valin

Λ-Amino-n-buttersäure

Isoleucin

tert.-Leucin

Serin

Threonin

Hydroxyvalin

Asparaginsäure

Glutaminsäure

Methionin

Äthionin

S-Äthylcystein

S-Methylhomocystein

Arginin

Canavanin

Ornithin

Lysin

Histidin

1-Methylhistidin

Tryptophan

Phenylglycin

Phenylalanin

Pipecolinsäure

Prolin

Die Aminosäuren, die sich ergeben, wenn m in der oben angegebenen Formel 1 bedeutet, und die ge-

wohnlich alsjS-Aminosäuren bezeichnet werden, setzen sich ebenfalls analog zu den ^-Aminosäuren um und können durch Aminierung der entsprechenden /5-Halogensäuren oder durch Addition von Ammoniak an α,/9-ungesättigten Säuren hergestellt werden.

Beispiele für solche /Ϊ-Aminosäuren sind:

«-Phenyi-^-aminopropionsäure,

/?-Pher>,yl-/i?-ami nopropi on säure,

/3-Aminopropionsäure, /3-Aminobuttersäure,

/S-Aminocapronsäure,

a)-Hydroxy-/J-aminovaleriansäure,

e-Hydroxy-/?-aminocapronsäure,

/3-Aminoisovaleriansäure, /J-Amino-y-quanidinovaleriansäure,

/J-Aminoglutarsäure,

yS-Amino-y-methylmercaptobuttersaure,

/ϊ-Amino-y-äthylmercaptobuttersäure,

y-4-Imidazolyl-/?-aminobuttercäure usw.

Die an der Umsetzung nicht beteiligten f unktionellen Gruppen der reagierenden Aminosäuren oder der reagierenden Peptidkette müssen inaktiviert werden. Für eine solche inaktivierung sind in der Chemie verschiedene Methoden bekannt. Für diese Inaktivierung sind zwei Arten von Schutzgruppen erforderlich: die C-endständigen Schutzgruppen, die den Säureteil der Aminosäure inaktivieren, z. B. Esterschutzgiuppen aus Alkoholderivaten n dgl., und N-endständige Schutzgruppen, die die Reaktionsfähigkeit des Aminteils aufheben, z. B. Benzyloxycarbonylsubstituiertes Benzyloxycarbonyl, tert.-Butoxycarbonyl, Allyloxycarbonyl, Trifluoracetyl, Phthaloyl, o-Nitrophenylsulfenyl u. dgl. Die Verwendung der üblichen Schutzgruppen wird infolge der milden Natur der wäßrigen Natriumbicarbonatwaschlösung in keiner Weise eingeschränkt.

Beispiel

unterscheidet. Ausbeute 89 °_o, Schmelzpunkt 204 (Zersetzung), 207 bis 208 (Schmelze).

Analyse:

Berechnet ... C 66,04, H 5,73, N 7,70, O 20,53; gefunden ... C 66,27, H 5,80, N 7,80, O 20,40.

Das Dipeptid wird nach der oben zur Entfernung der N-Benzyloxycarbonylgruppe beschriebenen Arbeitsweise hydrogenolysiert und dann mit Dimethylformamid gelöst. Diese Lösung wird auf —15 C gekühlt und mit N-Benzyloxycarbonylnitroarginin-isobutylcarbonat versetzt, das aus 3,53 g (10 mMol) N-Benzyloxycarbonylnitroarginin, 1,40 ml (10 mMol) Triäthylamin und 1,30 ml (10 mMol) Isobutylchlorformiat hergestellt wurde. Die Reaktionsmischung wird über Nacht bei —15^CC gehalten, auf 0^aC erwärmt und mit 12 ml einer gesättigten wäßrigen Lösung von Natriumbicarbonat von Q^CC bis pH 8 versetzt. Die erhaltene Mischung wird langsam zu 800 ml kaltem Wasser gegeben, 2 Stunden gerührt, um das Tripeptidprodukt N-Benzyloxycarbonylnitroarginyl-alanyl-N⁵-xanthylglutamin-methylester zu kristallisieren, das abfiltriert, mit Warser gewaschen und im Vakuum über P₂O₅ getrocknet wird. Ausbeute 100"

40

2,37 g (5 Mol) N²-Benzyloxycarbonyl-N⁶-xanthyl-11Iutaminmethylester werden in einer Mischung aus Dimethylformamid und Methanol, die ? ml Essigsäure enthält, gelöst. Die Lösung wird bei Atmosphärendruck in Gegenwart von 0,5 g eines 5 % Palladium-auf-Kohle-Katalysators mit Wasserstoffgas gesättigt, bis die Entwicklung von Kohlendioxid aufhört. Der Katalysator wird abfiltriert, und das Filtrat wird im Vakuum destilliert, wodurch als Rückstand N ⁶-Xanthylglutaminmethylester erhalten wird.

2,23 g (10 mMol) N-Benzyloxycarbonyl-i.-alanin werden in Dimethylformamid gelöst. Die Lösung wird auf -15°C abgekühlt und mit 1,39 ml (10 mMol) Tnäthylamin und 1,30 ml (10 mMol) Isobutylchlorformiat versetzt. Die erhaltene Mischung wird 10 Minuten bei —15°C gerührt und dann zu einer Lösung des obengenannten N⁵-Xanthylglutamin-methyIesters, ebenfalls in Dimethylformamid gelöst und auf — 15°C gekühlt, gegeben. Die Reaktionsmischung wird 16 Stunden bei —15°C gehalten, dann auf O⁰C erwärmt und bis zu pH 8 mit gesättigter wäßriger Natriumbicarbonatlösung von 0°C versetzt. Das gewünschte Dipeptid kristallisiert sofort und wird abfiltriert und mit Wasser gewaschen. Die Identifizierung durch Dünnschichtchromatographie an Kieselsäuregel ergibt bei vertikaler Entwicklung in einem Tetrahydrofuran-Cyclohexan-Wasser-System einen einzigen Fleck des Materials, das sich von den Ausgangsverbindungen

Analyse:	. C	57,90,	H	5,67,	N	15,01,	O	21,43;
Berechnet ..	. C	57,73.	H	5,64,	N	14,92,	O	21,43.
gefunden ..

Ein wie oben entwickeltes Dünnschichtchromatogramm zeigt einen einzigen Fleck eines Materials, das sich von dem Ausgangspeptid unterscheidet.

Nach der oben beschriebenen Arbeitsweise werden ferner folgende Peptidsequenzen hergestellt:

N-Benzyloxycarbonylleucyl-^-tert.-butyl^-äthyl-

aspartat,
N-Benzyloxycarbonyl-O-tert.-butyltyrosyl-

leucyl-/?-tert.-butyl-A-äthylaspartat, N'-Benzyloxycarbonyl-N-tert.-butyloxycarbonyllysyl-O-tert.-butyltyrosyl-leucyl-^-tert.-butyl-

Λ-äthylaspartat,
N-Benzyloxycarbonyl-O-tert.-butylseryl-N-tert.-butyloxycarbonyllysyl-O-tert.-butyltyrosyl-

leucyl-/?-tert.-butyl-\-äthylaspartat, N-Phenylalanyl-phenylalaninmethylester, N-Benzyloxycarbonylglutaminyl-'x^-ditert.-

butylaspartat,
N-Benzyloxycarbonylglutaminyl-zS-tert.-butyl-

α-äthylaspartat,
N-Benzyloxycarbonylalanyl-glulaminyl-x^-di-

tert.-butylaspartat,
N-Benzyloxycarbonylalanyl-glutaminyl-^-tert.-

butyl-i-äthylaspartat,
N-Benzyloxycarbonylnitroarginyl-alanyl-glut-

aminyl--v,/?-ditert.-butylaspartat, N-Benzyloxycarbonylnitroarginyl-alanyl-glut-

aminyl-ß-tert.-butyl-«-äthy!aspartat, Tribenzyloxycarbonylarginyl-alanyl-glutaminyl-

a,/?-ditert.-butylaspartat,
Tribenzyloxycarbonylarginyl-acetarginyl-alanyl-

glutaminyl-«,/?-ditert.-butylaspartat, N-Benzyloxycarbonyl-O-tert.-butylseryl-acetylarginyl-acetylarginyl-alanyl-glutaminyl-Ä^-di-

tert.-butylaspartat,
N-Benzyloxycarbonylglutaminyl-glycin-äthylester,

N-Benzyloxycarbonyl-O-tert.-butylseryl-glut-

am i nylglycin-äthylester,
N-Benzyloxycarbonyltryptophyl-leucin-methyl-

ester.
N-Benzyloxycarbonylglutaminyl-lyrptophyl-

leucinmethylester,
N-Benzyloxycarbonylvalyl-glutaminyl-trypto-

phyl-leucinmethylester,
N-Benzyloxycarbonylphenylalanyl-valyl-glut-

aminyl-tryptophyl-leucin-methylester, N-tert.-Butyloxycarbonylphenylalanyl-valyl-

glutaminyl-tryptophyl-leucin-methylester, N-Benzyloxycarbonyl-O-tert.-butylseryl-ß-tert.-

butyl-*-äthylaspartat,
N-Benzyloxycarbonyl-O-tert.-butylthreonyl-

O-tert.-butylseryl-/9-tert.-butyl-\-äthylaspartat, N-Benzyloxycarbonylphenylalanyl-O-tert.-butylthreonyl-O-tert.-butylseryi-^-lert.-butyl-

Λ-äthylaspartat,
N-Benzyloxycarbonyl-O-tert.-butylthreonylphenylalanyl-O-tert.-butylthreonyl-O-tert.- butylseryl-ß-tert.-butyl-K-äthylaspartat.

Vergleichsversuche Versuch I

A. Gemische Säureanhydridmethode nach dem Stand der Technik

1,08 g (5 mMol) des Hydrochlorids von Phenylalaninmethylester werden in 30 ml Dimethylformamid gelöst und nach Abkühlen auf etwa —15'C mit 0,55 ml (5 mMol) N-Methylmorpholin versetzt, um das Amin freizusetzen.

In einem gesonderten Kolben v. erde η 2.60 g(8 mMol) N-Benzyloxycarbonyiphenylaianin in 30 ml Dimethylformamid gelöst und nach Abkühlen auf etwa — 15⁰C mit 0,88 ml (0,8 mMol) N-Methylmorpholin und 0,97 ml (7,6 mMol) Chlorameisensäureisobutylester versetzt. Die Mischung wird etwa 10 Minuten gerührt, um die Bildung des gemischten Anhydrids zu gewährleisten, und anschließend zu der Lösung des Phenylalaninmethylesters gegeben. Das so erhaltene Reaktionsgemisch wird etwa 3 Stunden bei etwa —15°C gerührt und dann unter Verwendung eines Rotationsverdampfers im Vakuum eingeengt. Hierdurch wird eine beträchtliche Menge des als Lösungsmittel verwendeten Dimethylformamids entfernt. Der Rückstand wird dann mit 200 ml gesättigter wäßriger Kaliumcarbonatlösung verrieben. Das Verreiben wird so lange fortgesetzt, bis die Mischung filtrierbar ist. Die durch Abfiltrieren der Mischung erhaltene feste Substanz wird mit weiteren Mengen wäßriger Kaliumbicarbonatlösung gewaschen, bis das Filtrat einen pH-Wert von etwa 8 zeigt. Die feste Substanz wird dann 8mal mit Wasser gewaschen und im Vakuum getrocknet. Das Produkt, N-Benzyloxycarbonylphenyla'.anylphenylalanin-methylester, hat einen Schmelzpunkt von 134 bis 136°C und ein Gewicht von 2,39 g, was einer Ausbeute von etwa 127°_n entspricht. Die Dünnschichtchromatographie (TlC) des Produkts zeigt, daß es in beträchtlichem Ausmaß verunreinigt ist.

B. Gemischte Anhydridmethode gemäß der Erfindung

Es werden die unter 1 A angegebenen Reaklionsteilnehmer, Mengenverhältnisse und Bedingungen angewandt. Das schließlich erhaltene Reaklionsgemisch wird über Nacht bei 15 C stehengelassen. Danach wird die Mischung mit gesättigter wäßriger Kaliumbicarbonatlösung von 0°C in einer Menge versetzt, die ausreicht, um den pH-Wert des Reaktionsgemische auf etwa 8 zu erhöhen. Insgesamt werden etwa 50 ml der Kaliumbicarbonatlösung zugesetzt. Das Gemisch wird dann etwa 0,5 Stunden gerührt, wonach der pH-Wert immer noch bei etwa 8 liegt. Während dieser Zeit fällt ein Teil des Produkts aus der Mischung aus, und weitere Produktmengen werden durch Zugabe von etwa 200 ml einer 30 %igen wäßrigen Natriumchloridlösung ausgefällt. Nach Abkühlen wird das erhaltene Gemisch filtriert und das gewonnene feste Produkt mit Wasser gewaschen und im Vakuum getrocknet. Man erhält 2,36g (Ausbeute 102%) des unter I A angegebenen Dipe.ptids mit einem Schmelzpunkt von 138 bis 140⁰C in durch TLC-Analyse nachgewiesenem hochreinem Zustand.

Analyse für C₂₇H₂₈N₂O₅:

Berechnet ... C 70,42, H 6,13, N 6,08, O 17,37; gefunden ... C 70,37, H 6,06, N 6.83, 0 16,85.

Versuch II

A. Gemische Anhydridmethode
nach dem Stand der Technik

Eine Mischung aus etwa 30 ml Dimethylformamid und 1,08 g (SmMoI) des Hydrochlorids des Phenylalaninmeihylesters wird auf etwa —15° C gekühlt und

zur Überführung des Aminsalzes in das freie Amin mit 0,55 ml (5 mMol) N-Methylmorpholin versetzt.

In einem gesonderten Kolben werden 1,79 g(8 mMol) N-Benzyloxycarbonylalanin in 30 ml Dimethylformamid gelöst und nach Abkühlen auf etwa -15^CC mit 0,88 ml (8 mMol) N-Methylmorpholin und 0,97 ml (7,6 mMol) Chlorameisensäureisobutylester versetzt. Nach etwa 10 Minuten langem Rühren zur Ausbildung des gemischten Anhydrids wird die Mischung zu der Lösung des Phenylalaninmethylesters gegeben. Das so erhaltene Reaktionsgemisch wird dann etwa 3 Stunden bei —15 C gerührt und anschließend zur Entfernung eines möglichst großen Anteils des Dimethylformamids unter Verwendung eines Rotationsverdampfers im Vakuum eingeengt. Die zurückbleibende Reaktionsmischung wird dann mit 200 ml gesättigter wäßriger Natriumbicarbonatlösung verrieben. Das Verreiben wird fortgesetzt, bis die Mischung filtrierbar ist. Nach dem Abfiltrieren der Mischung wird der Filterrückstand mit wäßrigem Natriumbicarbonat gewaschen bis das Filtrat einen pH-Wert von etwa 8 zeigt. Anschließend wird der Filterrückstand 6mal mit Wassei gewaschen und im Vakuum getrocknet. Mar erhält 2.35 g N-Benzyloxycarbonylalanylphenylalanin methylester. Das Produkt hat einen Schmelzpunkt voi 89 bis 93^CC und wird in einer Menge gewonnen, dl einer Ausbeute von etwa 122% entspricht. Die Dünn Schichtchromatographie des Produkts zeigt, daß es ii beträchtlichem Ausmaß verunreinigt ist. Die Amine säureanalyse ergibt folgende Werte für das Verhältni der Aminosäurereste:

Alanin 1,39

Phen>lalanin 1,00

B. Gemischte Säureanhydridmethode
nach der Erfindung

Die unter Il A beschriebene Umsetzung wird m den gleichen Reaktionsteilnchmern, Mcngenverhäl

509 633/

nissen und Bedingungen wiederholt. Das erhaltene Reaktionsgemisch wird über Nacht bei einer Temperatur von etwa — 15° C stehengelassen und anschließend bei einer Temperatur von etwa 0° C mit einer gesättigten wäßrigen Natriumbicarbonatlösung in solcher Menge versetzt, daß der pH-Wert der Mischung auf etwa 8 erhöht wird. Insgesamt werden etwa 75 ml der gesättigten wäßrigen Natriumbicarbonatlösung zugesetzt. Das Gemisch wird etwa 0,5 Stunden gerührt, wonach die pH-Bestimmung wiederum einen Wert von etwa 8 ergibt. Das Produkt wird durch Zugabe von etwa 300 ml einer 30%igen wäßrigen Natriumchloridlösung von etwa O⁰C ausgefällt. Nach dem Abfiltrieren wird der Filterrückstand 6mal mit Wasser gewaschen und im Vakuum getrocknet. Man erhält 1,89 g (98,6% Ausbeute) des unter II A angegebenen Dipeptids mit einem Schmelzpunkt von 98 bis 99°C. Die TLC-Analyse ergibt, daß das Produkt praktisch rein ist, und die Aminosäureanalyse liefert folgendes Verhältnis der Aminosäurereste:

Alanin 1,09

Phenylalanin 1,0

Analyse für C₂₁H₂₄N₂O₅:

Berechnet ... C 65,61, H 6,29, N 7,29, O 20,81;
gefunden ... C 65,36, H 6,26, N 7,20, O 21,02.

Die höhere Reinheit der nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten Peptide wurde durch DC-Aufnahmen bestätigt.

Claims

würde sich besonders vorteilhaft bei der Herstellung

Patentanspruch von Polypeptiden auswirken, da hier die Unterschiede

in den chemischen und physikalischen Eigenschaften

Verfahren zur Herstellung von Peptiden aus zwischen dem eingesetzten Peptid und dem erzeugten

einem gemischten Anhydrid einer N-geschützten 5 Polypeptid außerordentlich gering werden. Eine

Aminosäure und einem reaktiven C-geschützten Trennung wird daher kompliziert und infolge von

Ausgangspeptid oder einer solchen Aminosäure Produktverlusten wäh *nd der Reinigung auch kost-

durch Umsetzung eines Überschusses des ge- spielig.

mischten Anhydrids des einzuführenden geschützten Bei Verfahren, für die gemischte Anhydride zur Aminosäurederivats mit dem reaktiven Ausgangs- 10 Ausbildung der Peptidbindung eingesetzt werden, peptid oder der reaktiven Ausgangsaminosäure in kann die Beseitigung von überschussigem Anhydrid einem nicht wäßrigen, mit Wasser mischbaren durch hydrolytische Spaltungsmethoden eine kon-Lösungsmittel bei einer Temperatur im Bereich von kurrierende willkürliche Spaltung einiger Amidbin-Raumtemperatur bis zum Gefrierpunkt der Re- düngen verursachen. Das Auftreten solcher uneraktionsmischung, Einengen des Reaktionsge- i_ä wünschter Spaltungsreaktionen hat die Verwendung misches, anschließendes Hydrolysieren des über- von Anhydrid im Überschuß und die durch Verwenschüssigen Säureanhydrids durch Verreiben mit dung von überschüssigem Anhydrid zur Erhöhung der einer wäßrigen Pufferlösung und Gewinnung des Umsätze erzielbaren Vorteile verhindert. Diese will-Peptids aus der erhaltenen Mischung, dadurch kürliche Spaltung führt zu einer Verunreinigung des gekennzeichnet, daß man wenigstens 20 Produkts mit sehr ähnlichen kleineren Peptiden ver-1,5 Moläquivalente des gemischten Anhydrids pro schiedener Struktur. In vielen Fällen läßt sich die Moläquivalent Peptid oder Aminosäure verwendet Uneinheitlichkeit des Produkts nicht einmal mikro- und das überschüssige Säureanhydrid durch Zu- analytisch feststellen, und die Gegenwart einer Vielgabe einer wäßrigen Pufferlösung mit einem zahl ähnlicher, aber nicht identischer Fragmente kann pH-Wert von etwa 7,5 bis etwa 9,5 zu der Reak- 25 nur durch ausgeklügelte Trennmethoden nachgewiesen tionsmischung hydrolysiert. werden.

Aus Annalen der Chemie, 691, 1965, S. 235, ist eine derartige Peptidsynthese bekannt, wobei ein Über-

schuß des Säureanhydrids eingesetzt, das erhaltene

30 Reaktionsgemisch nach einigen Stunden eingeengt und danach mit einer wäßrigen Pufferlösung verrieben

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur wird, um das überschüssige Anhydrid zu hydroly-Herstellung von Peptiden aus einem gemischten An- sieren. Diese Arbeitsweise führt gleichfalls zn Prohydrid einer N-geschützten Aminosäure und einem dukten mit ungenügender Reinheit, reaktiven C-geschützten Ausgangspeptid oder einer 35 Es besteht daher nach wie vor die Aufgabe, ein versolchen Aminosäure durch Umsetzung eines über- bessertes Verfahren zu finden, das in quantitativer Schusses des, gemischten Anhydrids des einzuführenden Ausbeute direkt zu reinen Peptiden führt und damit üie geschützten Aminosäurederivats mit dem reaktiven übliche Reinigung durch chromatographische oder Ausgangspeptid oder der reaktiven Ausgangsamino- elektrophoretische Trennung der Reaktionsprodukte säure in einem nicht wäßrigen, mit Wasser mischbaren 40 überflüssig macht.

Lösungsmittel bei einer Temperatur im Bereich von Das Verfahren der eingangs genannten Art ist nun

Raumtemperatur bis zum Gefrierpunkt der Reaktions- dadurch gekennzeichnet, daß man wenigstens 1,5 MoI-

mischung, Einengen des Reaktionsgemisches, anschlie- äquivalente des gemischten Anhydrids pro Moläqui-

ßendes Hydrolysieren des überschüssigen Säurean- valent Peptid oder Aminosäure verwendet und das

hydrids durch Verreiben mit einer wäßrigen Puffer- 45 überschüssige Säureanhydrid durch Zugabe einer

lösung und Gewinnung des Peptids aus der erhaltenen wäßrigen Pufferlösung mit einem pH-Wert von etwa

Mischung. 7,5 bis etwa 9,5 zu der Reaktionsmischung hydroly-

Peptide sind wichtige biologische Substanzen. Ihre siert.

Isolierung aus biologischen Systemen in reinem Zu- Die erfindungsgemäße Arbeitsweise ist gegenüber stand ist jedoch ziemlich schwierig, so daß sich größere 50 der oben beschriebenen bekannten Arbeitsweise schon Mengen solcher Stoffe nur durch chemische Synthesen allein deshalb vorteilhaft, weil dabei die wäßrige Pufferherstellen lassen. Eine fundamentale Stufe solcher lösung direkt zu dem erhaltenen Reaklionsgemisch Synthesen ist die Kupplung von zwei oder mehr Amino- ohne irgendwelche Zwischenbehandlung desselben zusäuren unter Ausbildung einer Amido- oder Peptid- gegeben wird und damit die zusätzliche Maßnahme bindung. Diese Kupplung erfolgt, indem man beispiels- 55 der bekannten Arbeitsweise, das Einengen, entfällt weise ein Amin mit einem Ester, einem Säurehalogenid, Es war nicht vorherzusehen, daß durch die erfindungs einem Säuireanhydrid oder einem Carboxyanhydrid gemäße Vereinfachung des Verfahrens Produkte mi umsetzt. Das amidbildende Amin muß dabei wenig- beträchtlich höherer Reinheit erhalten werden würdet stens über ein reaktionsfähiges Wasserstoffatom ver- als nach dem bekannten Verfahren. Die höhere Rein fügen. Dieses Kriterium erfüllen alle natürlich vor- 60 heit der nach dem erfindungsgemäßen Verfahren er kommenden Λ-Aminosäuren und ihre optischen Anti- haltenen Produkte zeigt sich an ihren höheren Schmelz poden sowie Isomeren. punkten und bei ihrer Prüfung durch Dünnschicht Im Interesse einer höheren Ausbeute und insbe- Chromatographie. Das erfindungsgemäße Verfahre sondere einer leichteren Reinigung der dabei erhalte- ermöglicht somit eine wirksame und sichere Beseiligun nen gewünschten Peptide wäre es zweckmäßig, wenn 65 des bei der Peptidsynthese verwendeten Überschusse man die Umsetzung eines wertvolleren Ausgangspro- an Anhydrid unter Vermeidung einer merkliche duktes auf Kosten anderer Ausgangsprodukte zum Spaltung von Peptidbindungen. Durch die Verw< idun eewünschtcn Produkt hin verschieben könnte. Dies eines Überschusses des Anhydrids oder gemischte