DE2447805C2 - Verfahren zur Herstellung von Pyroglutamyl-histidyl-prolinamid (TRH) - Google Patents

Verfahren zur Herstellung von Pyroglutamyl-histidyl-prolinamid (TRH)

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Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Pyroglutamyl-histidy-prolinamid (TRH) aus Pyroglutamyl-N'^-benzylhistidyl-prolinamid.
Das Thyreotropin-Releasing-Hormon (TRH) ist der Hypothalamusfaktor, der die Freisetzung des schilddrüsenstimulierenden Hormons (Thyreotropin) aus dem Hypophysen-Vorderlappen stimuliert.
TRH hat die Struktur von L-Pyroglutyamyl-L-histidyl-L-prolinamid:
O=I J—CO —NH-CH-CO—N
(nachstehend als PGIu-His-Pro-NH2 bezeichnet).
Synthetisches TRH besitzt dieselben hormonalen Aktivitäten wie das Schweine-TRH. Sowohl Schweine-TRH als auch synthetisches TRH setzen Thyreotropin aus der Hypophyse des normalen Menschen frei.
Synthetisches TRH ist daher für Untersuchungen über die Rolle von TRH als Kontrollfaktor bei der normalen und abnormalen Sekretion von Thyreotropin und über den Einfluß von TRH auf die Sektretion der anderen Hypophysenhormone sehr wertvoll. Es sind mehrere Verfahren bekannt, um synthetisches TRH herzustellen. Die meisten erfordern jedoch die Verwendung von geschützten Ausgangsaminosäuren und/oder Zwischen-Dipeptiden und sie weisen langwierige und aufwendige Stufen der Entfernung der Schutzgruppen auf.
Wenn andererseits nicht-geschützte Aminosäuren miteinander und mit Dipeptiden gekuppelt werden, dann sind die Ausbeuten sehr niedrig.
In Anbetracht der Tatsache, daß mindesten zwei theoretische Kupplungsstufen erforderlich sind, um das gewünschte Tripeptid herzustellen, wird verständlich daß. bezogen auf die Ausgangsmaterialien, nur eine nichttragbare niedrige Endausbeute erhalten wird. Bei der Beurteilung der Gesamtwirtschaftlichkeit des Verfahrens muß auch in Betracht gezogen werden, daß scharfe Fällungs- und Reinigungsstufen erforderlich sind, um das gewünschte Zwischenprodukt und die Endprodukte aus den Reaktionsgemischen zu isolieren, die unvermeidbar erhebliche Mengen an Nebenprodukten
enthalten
Aus J. Med. Chem. 14, 1971. 484 bis 87 ist die Herstellung von Pyroglutamyl-histidyl-prolinamid (TRH) aus Pyroglutarnyl-N^-benzylhistidylprolinamid bekannt. Ausgehend von dem Tripeptid erfolgt bei diesem bekannten Verfahren die Abspaltung der Benzylgruppe durch Hydrierung an P/C. Aus E. Schröder, K. Lübke, The Peptides, Academic Press, New York, Band I, 1965, Seite 179 bis SO, ist weiterhin die Abspaltung der an N""-His gebundenen Benzylgruppe mit Na/fl. NH3 bei Peptiden bekannt
Durch die Erfindung wird nun ein neues, schnelles und wirtschaftliches Verfahren zur Synthese von hochreinem TRH in hohen Ausbeuten zur Verfügung gestellt, in dem die an sich bekannte Abspaltung der an N"" His gebundenen Benzylgruppe mit Na/fl. NH3 auf das Tripeptid pGlu-(Bzl)His-Pro-NH2 angewendet -vi-d, wobei aber spezielle Verfahrensbedingungen eingehalten werden müssen.
Gegenstand der Erfindung ist daher ein Verfahren der eingangs erwähnten An, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man
A) PyrogIutamyl-N'OT-benzylhistidylprolinamid in flüssigem Ammoniak löst, portionsweise Natrium zugibt, bis die Lösung einer dauernde blaue Färbung annimmt, die Reaktion mit Eisessig 30 bis 60 see nach dem Bestehenbleiben der blauen Färbung abbricht und
B) aus dem gemäß Verfahrensstufe A) erhaltenen rohen Tripeptid durch Gelfiltration reines TRH gewinnt.
Im einzelnen geht man bei dem erfindungsgemäßen Verfahren so vor, daß man zunächst das geschützte Tripeptid-PyroglutamyI-N""-benzylhistidyl-prolinamid der Formel:
O=I J—CO—NH-CH-CO—N
(nachstehend als pGlu-(Bzl)-His-Pro-NH2 bezeichnet) herstellt, dieses mittels Natrium in flüssigem Ammoniak reduktiv in die ungeschützte Form überführt und daß man das resultierende rohre ungeschützte Tripeptid durch eine Gelfil'rationseinrichtung leitet.
Das geschützte Tripeptid wird vorzugsweise dadurch hergestellt, daß man N-t-Butyloxycarbonyl-N"»-benzylhistidin mit Prolinamid in Gegenwart von N.N'-Di-cyclohexylcarbodiimid kuppelt, wodurch mit hoher Ausbeute das geschützte Dipeptid N-t-Butyloxycarbonyl-N""-benzylhistidyI-prolinamid erhalten wird.
Die Entfernung der t-Butyloxycarbonylgruppe durch mit HBr gesättigtem Eisessig liefert das N""-Benzylhistidyl-prolinamid-dihydrobromid, das durch Umkristallisation gereinigt und mit einem aktiven Ester der Pyroglutaminsäure zu dem geschützten Tripeptid pGlu-(BzlJHis-Pro-NH? umgesetzt wird. Alternativ kann man auch, was weniger bevorzugt wird, N-Carbobenzoxypyroglutaminsäure und den Benzylester von N""-Benzylhistidin nach dem Mischanhydridverfahren kuppeln und den resultierenden Dipeptidester durch selektive Hy-
drogenolyse in PyrogIutamyl-N'm-benzylhistidin überführen. Das geschützte Dipeptid wird sodann mit Prolinamid in Gegenwart von N.N'-Dicyclohexyl-carbodiitnid zu pGlu-(Bzl)His-Pro-NH2 umgesetzt
Die reduktive Entfernung der Schutzgruppe des geschützten Tripeptids gemäß der vorliegenden Erfindung wird durchgeführt, indem das Tripeptid in flüssigem Ammoniak aufgelöst wird, worauf allmählich Natrium zu der Lösung gegeben wird. Die Reaktionszeit wird ausgehend von dem Moment an gezählt, wenn die Lösung eine dauernde blaue Farbe annimmt. Nach einer extrem kurzen Zeitperiode von etwa 30 bis 60 see wird die Reaktion abgebrochen, indem sorgfältig Eisessig zugesetzt wird.
Die Reaktionszeit ist etwas kritisch. Zeitspannen von weniger als 30 see können nicht ausreichend sein, um eine im wesentlichen vollständige Überführung des Tripeptids in die ungeschützte Form zu erreichen. Andererseits können Zeiträume von mehr als 60 see zu einer Zersetzung des Produkts führen.
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flüssigen Ammoniak eines etwas drastische Methode darstellt Diese Umsetzung ist als solche noch niemals als geeigneter Weg beschrieben oder vorgeschlagen worden, um geschütztes synthetisches TRH in die ungeschützte Form zu überführen. Überraschenderweise wurde nun gefunden, daß das geschützte Tripeptid pGlu-(Bzl)His-Pro-NH2 die reduktive Entschützungsstufe ohne wesentliche Zersetzung des Tripeptidmoleküls durchläuft
Ein weiteres überraschendes Merkmal der Erfindung liegt in der großen Leichtigkeit, mit der das in die ungeschützte Form überführte Tripeptid chromatographisch gereinigt werden kann. Bereits <·ϊη einziger Durchlauf des in die ungeschützte Form überfürirten. Reaktionsprodukts durch eine chromatographische Säule, die mit einer geeigneten Gelfiltrationseinrichtung bepackt ist, liefert direkt extrem reines synthetisches TRH mit hoher Ausbeute.
Die entsprechenden Eluatfraktionen, die das gewünschte Produkt enthalten, werden aufgrund der scharfen und symmetrischen Gestalt des Peaks leicht gewonnen.
Demgegenüber sind die Endreinigungsstufen bei den Verfahren nach dem Stand der Technik langwierig und aufwendig, wenn man mit der erfindungsgemäß erfolgenden einzigen Gelfiltrationsstufe vergleicht.
Die Erfindung liefert daher ein einfaches Verfahren, das die Hauptnachteile des Standes der Technik überwindet, d. h. das Problem der Herstellung von nichtzersetztem, im wesentlichen vollständig in die ungeschützte Form überführten TRH sowie die bislang erforderliche aufwendige Endreinigung des Produkts.
Beispiele für geeignete Gelfiltrationsmedium sind Polyacrylamid, Dextran und Agarosegel. Es hat sich gezeigt, daß solche Dextrangele, wie die Produkte Sephadex® (eine Reihe von perlenförmigen Dextrangelen), sehr gut dazu geeignet sind, die Endreinigungsstufe des Peptids bei dem Verfahren der Erfindung durchzuführen.
Synthetisches TRH wird gewöhnlich aus den L-Formen der Ausgangsaminosäuren hergestellt, um eine Anpassung an die Struktur von natürlichem TRH vorzunehmen. In den Beispielen und in den Ansprüchen beziehen sich daher die Bezeichnungen »Pyroglutaminsäure«, »Histidin« und »Prolin« sowie diejenigen ihrer Derivate oder Abkürzungen auf die L-Formen der entsprechenden Aminosäuren oder ihrer Derivate.
Es liegt aber im Rahmen der Erfindung, entweder die L- oder die D- oder beide Formen zu verwenden. Die Erfindung wird in den Beispielen erläutert.
Herstellung von pGlu-(Bzl)His-Pro-NH2
Eine Suspension von 13,2 g N'^-Benzylhistidyl-prolinamid-dihydiobromid, hergestellt gemäß
J. Med. Chem. 14, 1971, Seile 481 bis 483, in 150 ml N1N-Dimethylformamid, das 53 g Triethylamin enthielt, wurde mit einer Lösung von 9,9 g Pentachlorphenylpyroglutamal in 130 ml Ν,Ν-Dimethylformamid vermischt. Nach einstündigem heftigen Rühren bei 0 bis 5° C und anschließendem 24stündigem Rühren bei Raumtemperatur wurde das Reaktionsgemisch im Vakuum zur Trockene eingedampft.
Der Rückstand wurde in 100 ml destilliertem Wasser aufgelöst. Die Lösung wurde abfiltriert und das wüßrige Filtrat wurde erneut im Hochvakuum zur Trockene eingedampft, wodurch ein öliger Rückstand erhalten wur-
L-UtJMCIl-CLCIl
10 ml Methanol wieder aufgelost wurde.
Nach Abfiltrieren desTriethylaminhydrobromid-Niederschlags. Eindampfen des Filtrats zur Trockene im Vakuum, Waschen des öligen Rückstands mit 100 ml wasserfreiem Ether, Filtrieren und Trocknen wurden 8,24 g (69.5%) kristallin pGlu-(Bzl)His-Pro-NH2 gewonnen.
Das Produkt gab bei der Dünnschichtanalyse auf SiIikagel G unter Verwendung einer 60 :45 :20-Mischung aus Chloroform, Methanol und 30%iger Essigsäure als Eluierungsmittel einen einzigen Flecken Rf = 0,76).
Beispiel 1
Ein stickstoffgeschützter Reaktor, der mit einem Magnetrührer versehen war, wurde mit etwa 500 ml flüssigem Ammoniak und I g reinem pG!'j-(BzI)His-Pro-NH2 beschickt. Es wurde allmählich Natrib.r. zugesetzt, bis die Lösung eine dauernde blaue Färbung angenommen hatte. Nach 30 see wurde die Reaktion durch sorgfältige Zugabe von etwa 1 ml Eisessig abgebrochen. Das Gemisch wurde zur Trockene eingedampft und der Rückstand wurde in 0,2 η Essigsäure wieder aufgelöst.
Die resultierende Lösung wurde abfiltriert und durch eine Chromatographiesäule mit den Abmessungen 2,2 · 110cm geleitet, welche mit Sephadex® G-15 bepackt war, das mit 0,2 η Essigsäure ins Gleichgewicht gebracht worden war. Die Durchführung der Gelfiltration mit 25 ml/std bei Verwendung der gleichen 0,2 η Essigsäure als Eluierungsmittel lieferte einen symmetrische:: Peak des Eluats. Die Eluatfraktionen, die der Peakfläche entsprachen, wurden gesammelt und lyophilisiert, wodurch 0,58 g (72,5%) hochreines pGlu-His-Pro-NH2 (TRH) erhalten wurden. Eine Dünnschichtanalyse, die auf Platten mit Silikagel G, welche eine Stunde bei 1200C aktiviert worden waren (250 μ), unter Verwendung entweder des Systems Chloroform: Methanol : konzentriertes Ammoniak (60 :45 : 20) oder des Systems Chloroform : Methanol : 30%ige Essigsäure (60 :45 :20) durchgeführt wurde, zeigte in beiden Fällen einen einzigen Flecken mit Rr-Werten von 0,6 bzw. 0,36. Das Produkt schien von Ammonium-(Nessler's Reagenstest) und Halogenidionen vollständig frei zu sein.
Die Aminosäureanalyse bestätigte die erwartete Struktur.
[λ] ;? -ΛΓ (c = 1 in Methanol).
Beispiel 2
Das Beispiel I wurde wiederholt, mit der Ausnahme, daß 8,24 g reines pGlu-(Bzl)His-Pro-NH2 mit Natrium in 2500 ml flüssigem Ammoniak in die ungeschützte Form 5 umgewandelt wurden und daß etwa 6 ml Eisessig dazu verwendet wurden, um die Reaktion abzubrechen.
Das rohe Reaktionsprodukt wurde durch eine Säule mit Abmessungen von 5,5 · 135 cm von Sephadex® G-15 mit 160 ml/std geleitet, wobei das gleiche Eluierungs- io mittel wie im Beispiels verwendet wurde. Es wurden 4,65 ε(70,5%) hochreines pGlu-His-Pro-NH2 erhalten.
Die Analysenergebnisse zeigten, daß dieses Produkt extrem rein war und daß es mit dem des Beispiels 1 identisch war. 15
20
25
30
35
40
45
50
55
b0

Claims (1)

  1. Patentanspruch:
    Verfahren zur Herstellung von Pyroglutamyl-histidyl-prolinamid (TRH) aus PyrogIutamyl-N'm-benzylhistidyl-prolinamid, dadurch gekennzeichnet, daß man
    A) dieses in flüssigem Ammoniak !öst, portionsweise Natrium zugibt, bis die Lösung eine dauernde blaue Färbung annimmt, die Reaktion mit Eisessig 30 bis 60 see nach dem Bestehenbieiben der blauen Färbung abbricht und
    B) aus dem gemäß Verfahrensstufe A) erhaltenen rohen Tripeptid durch Gelfiltration reines TRH gewinnt.
DE2447805A 1973-10-19 1974-10-08 Verfahren zur Herstellung von Pyroglutamyl-histidyl-prolinamid (TRH) Expired DE2447805C2 (de)

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