Verfahren zur Herstellung von Octadecapeptid-amid
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Ver fahren zur Herstellung von Octadecapeptid-amid der
Formel Lderyl-L-tyrosyl-L-seryl-L-methionyl-
L-glutamyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl L-tryptophyl-glycyl-clysyl-L-prolyl-
L-valyl-glycyl-L-lysyl-L-lysyl-L-arginyl-
L-arginin-amid, weches den ersten 18 Aminosäureresten von Cortico tropin entspricht.
Erfindungsgemäss wird dieses Octadecapeptid-amid so hergestellt, dass man ein geschütztes Decapeptid der
Formel t-Butyloxycarbonyl-L-seryl-L-tyrosyl-L-seryl
L-methionyl-γ-t-butyl-L-glutamyl-L-histidyl-
L-phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophyl-glycin mit einem geschützten Octadecapepdidamid der Formel Nt-Butyloxycarbonyl-L-lvsyl-Uprolyl-L-valyl- glycyl-N#-t-butyloxycarbonyl-L-lysyl-NE-t- butyloxycarbonyl-L-lysyl-N-arginyl-L-arginin-amid kondensiert und die geschützten Gruppen aus dem so erhaltenen t-Butyloxycarbonyl-L-seryl-L-tyrosyl-L-seryl
L-methionyl-γ-t-butyl-L-glutamyl-L-histidyl-
L-phenyl-alanyl-L-arginyl-L-tryptophyl-glucyl-
N± -t-butyloxycarbonyi-Ulysyl-L-prolyl-L-valyl- glycyl-Ne-t-butyloxyvarbonyl-L-lysyl-Ne-t-butyl- oxycarbonyl-L-lysyl-L-arginyl-L-arginin-amid durch Behandlung mit Trifluoressigsäure entfernt.
Bei der Herstellung dieses Octadecapetid-amids kann als Kondensationsreaktion jegliche bekannte Methode zur Herstellung von Peptiden verwendet werden, insbesondere die Carbodiimidmethode, die aktivierte Estermethode, die Azidmethode oder die gemischte Anhydridmethode. Am vorteilhaftesten wird die Kondensation in Gegenwart von N-Hydroxysuccinimid und/oder Dicyclohexylcarbodiimid vorgenommen.
Das Ausgangs-Decapeptid der Formel ÜButyloxycarbonyl-L-seryl-L-tyrosyl-Useryl-
Umethionyl-y-t-butyl-L-giutamyl-L-histidyl-
L-phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophyl-glycin kann beispielsweise hergestellt werden durch Konden sation von t-Butyloxycarbonyl-L-seryl-L-tyrosyi-Lseryl-
L-methionin-azid mit y-t-Butyl-L-glutamyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-
L-arginyl-L-tryptophyl-glycin.
Das als Ausgangssubstanz verwendete Octapeptid-amid der Formel
Ne-t-Butyloxycarbonyl-L-lysyl-L-prolyl-L-valyl- glycyl-Ne-t-butyloxycarbonyl-L-lysyl-Nt-t-butyl- oxycarbonyl-L-lysyl-L-arginyl-L-arginin-amid kann beispielsweise erhalten werden durch Konden sation von N#-t-Butyloxycarbonyl-L-lysyl-L-prolyl-L-valyl- glycyl-N#-t-butyloxycarbonyl-L-lysin-azid mit N#-t-Butyloxycarbonyl-L-lysyl-L-arginyl-
L-arginin-amid.
Das erfindungsgemässe erzeugte Octadecapeptid amid weist dem natürlichen Corticotropin ähnliche biologische und therapeutische Eigenschaften auf, und es kann für die Behandlung von verschiedenen Leiden, wie akuten oder chronischen Gelenkrheumatismus, allergische Krankheiten verschiedener Organe, Vergiftungen verschiedenen Ursprungs oder gegen Tumor, verwendet werden.
Ein Hauptvorteil des erfindungsgemäss erzeugten, synthetischen Octadecapeptid-amids gegenüber aus tierischen Materialien extrahierten natürlichen Hormonen besteht darin, dass die ersteren keine antigenen Wirkungen haben. Aus diesem folgt, dass diese Präparate auch bei jenen Krankheiten verwendet werden können, wo natürliches Corticotropin gegenindiziert ist.
Obschon die Reinigung des natürlichen Corticotropins schwierige und teuere Techniken erfordert und das gereinigte Produkt immer noch hochmolekulare Protein-ähnliche Verunreinigungen enthält, die gefährliche anaphylaktische Reaktionen verursachen können, ist das Octadecapeptid-amid erfindungsgemäss direkt in einem hohen Reinheitsgrad erhältlich, worin jegliche Verunreinigungen durch Substanzen von Proteincharakter fehlen. Überdies ist die erfindungsgemässe Herstellung des genannten synthetischen Peptids unabhängig von der Erhältlichkeit der Hypophyse-Drüsen, welche sehr selten und teuer sind. Das erfindungsgemäss erzeugte Octadecapeptid-amid kann im weiteren als Zwischensubstanz bei der Herstellung anderer Peptide mit langer Kette verwendet werden.
Beispiel
Herstellung von L-Seryl-L-tyrosyl-L-seryl-L-methionyl-
L-glutamyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl L-tryptophyl-glycyl-L-lysyl-L-prolyl-L-valyl- vglycyl-L-lysyl-L-lysyl-L-arginyl-L-arginin- amid-hexaacetat.
Zu einer Lösung von 0,174 g t-Butyloxycarbonyl-L-seryl-L-tyrosyl-L-seryl L-methionyl-/w-t-butyl-L-glutamyl-L-histidyl-
L-phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophyl glycin . hydrochlorid und 0,069 g N-Hydroxysuccinimid in Dimethylformamid werden 0,099 g NN'-Dicyclohexylcarbodiimid zugesetzt, und das so erhaltene Gemisch wird zum aktiven t-Butyl oxycarbonyl-L-seryl-Utyrosyl-L - seryl - L - methionyl-r- t-butyl-L-giutamyl-L-hystidyl-L-phenylalanyl -L- arginyl L-tryptophyl - glycin-N-hydroxysuccinimid - ester. hydrochlorid reagieren gelassen.
Eine Lösung von 0,753 g genannten aktiven Esters und 0,370 g Ne-t-Butyloxycar- bonyl- L-lysyl-L-proly(t-L,valyl-glycyl - Ne-t-butyloxycar- bonyl - L - lysyl - L-prolyl-L-valyl-glycyl-N#-t-butyloxycar- bonyl - L - lysyl - NE-t-butyloxycarbonyl-L-lysyl-L-arginyl- L-arginin-amid . triacetat in 10 ml 90 %igem Pyridin wird vorbereitet, und das so erhaltene Gemisch wird bei 0-4t C während 40 Std. reagieren gelassen. Das Reaktionsgemisch wird in 250 ml kaltes Äthylacetat geschüttet. Das so erhaltene Gemisch wird abfiltriert und mit Athylacetat gewaschen.
Auf diese Weise wird t-Butyloxycarbonyl-L-seryl-L-tyrosyl-L-seryl-
L-methionyl- -t-butyl-L-glutamyl-L-histidyl-
L-phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophyl-glycyl
NE-t-butyloxycarbonyl-L-lysyl-L-prolyl-L-valyl- giycyl-N-butyloxycarbonyl-L-lysyl-Nt-butyl oxycarbonyl-L-lysyl-Larginyl-L-arginin- amid-triacetat erhalten. Zu einer Lösung von 1,119 g genannten Tri acetats in 25 ml 50 Oigem t-Butanol wird Amberlite CG-4B (Acetatform 8 ml) zugesetzt und das Gemisch bei Zimmertemperatur während 40 min gerührt. Das Harz wird abfiltriert und das Filtrat mit 1,25 ml M Mercaptoäthanol vermischt. Das Gemisch wird 20 Stunden bei 370 C stehengelassen und dann durch eine Carboxymethylcellulose-Säule geführt, wobei die in beiliegender Fig. 1 dargestellten Ergebnisse erhalten werden.
Die einzelnen Durchführungsbedingungen sind die folgenden:
Material: rohes geschütztes Octadecapeptid-amid (entsprechend 0,275 ml)
Säule: CMC ( Serva -0,44 m-acq/g) 2,7 X 18 cm
Puffer: A 50S t-Butanol B 50% t-Butanol/2 M Ammoniumacetat (pH 5,80) (99 :1) C 50% t-Butanol/2 M Ammoniumacetat (pH 5,80) (98 : 2).
Die Anteile der Fraktion II (Rohr Nr. 76-100) in Fig. 1 werden gesammelt, konzentriert und lyophilisiert.
Das erhaltene geschützte Octadecapeptid-amid (0,145 g) wird in einer Lösung von 0,2 ml Wasser und 1,8 ml Trifluoressigsäure gelöst, und die erhaltene Lösung wird 60 min bei Raumtemperatur stehengelassen. Das Reaktionsgemisch wird bei vermindertem Druck konzentriert und das Lösungsmittel entfernt. Und der Rückstand wird mit Amberlite CG-4B (Essigsäuretyp) behandelt. Die erhaltene Lösung wird durch eine Carboxymethylcellulose-Säule geführt, wobei die in Fig. 2 dargestellten Ergebnisse erhalten werden. Die einzelnen Durchführungsbedingungen sind die folgenden:
Material: Rohes Octadecapeptid-amid, abgeleitet von 0,145 g des geschützten Peptids
Säule: CMC ( Serva -0,44 m-acq/g) 1,7 X 11 cm
Puffer: A H20 B 0,075 M (pH 5,80) - 0,25 M (pH 7,00) Ammonium acetat C 0,25 M (pH 7,00) - 0,40 M (pH 6,60) Ammonium acetat D 0,40 M (pH 8,60) Ammoniumacetat.
Die Anteile der Hauptspitzen (Rohr Nr. 126-200) in Fig. 2 werden gesammelt und lyophilisiert, und man erhält 75 mg L-Seryl-L-tyrosyl-L-seryl-L-methionyl-L-glutamyl-
L-histidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophyl- glycyl-L-lysyl-L-prolyl-L-valyl-glycyl-L4ysyl-
L-lysyl-L-arginyl-L-arginin-amid hexaacetat.
UV: i Nm/ax1ONaOH = 281,5 mlr (e = 6870), 288,5 m,u 6660).
[24 55 8 + 40 (c = 0,493, 0,ln Essigsäure).