DE1543882A1 - Octadecapeptid - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines neuen Octadecapeptids, das den ersten 18 Aminosäurebausteinen von Adrenocorticotropin entspricht. Die Erfindung betrifft insbesondere ein neues und verbessertes Verfahren zur Herstellung von I-Seryl-L-tyrosyl-I-seryl-L-iriethionyl-L-glutamyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-I-arginyl-L-tryptophyl-glycyl-L-lysyl-L-prolyl-IJ-valyl-glycyl-L-lysyl-I-lysyl-I-arginyl-L-arginin und seines therapeutisch aktiven Amidderivats.

Dieses Polypeptid kann nach Methoden erhalten werden, wie sie allgemein für die Synthese solcher Verbindungen bekannt sind,wobei die Aminosäuren eine nach der anderen oder nachuora sie zuerst zu kleineren Peptideinheiten vereinigt worden .jind, in der Sequenz der oben angegebenen Formel miteinander verknüpft werden.

JteUfi Unterlagen im.ϊ-sι^₃ >»π^, _a^s. 909886/1693

BAD ORIGINAL

Nach einer bevorzugten Aus.führungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird das die ersten drei Aminosäuren enthaltende Tripeptid, d.h. Seryl-tyrosylserin oder das Tetrapeptide _t das außerdem die vierte Aminosäure enthält, mit dem aus den folgenden Aminosäuren bis zur Aminosäure 10 gebildete! Heptapeptid oder Hexapeptid kondensiert, vorzugsweise nach dem Azidverfahren, worauf das erhaltene Decapeptid mit der gesamten übrigen Peptidsequenz kondensiert wird. Als Kupplungsmethode für die vorstehend erwähnte Kondensation wird vorzugsweise die Hydroxysuccinimidmethode oder die Dicyclohexylcarbodiimidmethode angewandt.

Das bisher nicht bekannte Octadecapeptid der Formel L-Seryl-L-tyrosyl-L-seryl-L-methionyl-L-glutamyl-I-histidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophyl-glycyl-L-lysyl-L-prDlyl-L-valyl-glycyl-L-ly.syl-L-lysyl-L-arginyl-L-arginin kann erfindungsgemäß beispielsweise durch Kondensieren von tert.-Butyloxycarbonyl-L-seryl-L-tyrosyl-L-seryl-L-methioninazid mit tert.-Butyl-L-glutamyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophyl-glycin, Kondensieren des erhaltenen tert.-Butyloxycarbonyl-L-seryl-L-tyrosyl-L-seryl-L-methionyl-γ-tert.-butyl-L-glutamyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophyl-glycin-N-hydroxysuccinimidesteismit aus jf£_tert.-Butyloxycarbonyl-L-lysyl-L-arginyl-L-arginin und. N^a-Carbobenzoxy-N^-tert.-butyloxycarbonyl-L-lysyl-L-prolyl-L-valyl-glycyl-N^-tert.-butyloxycarbonyl-L-lysinazid hergestellten N^-tert.-Butyloxycarbonyl-L-lysyl-L-prolyl-L-valyl-glycyl-Mr-tert.-butyloxycarbonyl-L-lysyl-ii^-tert.-butyloxycarbonyl-lysyl-L-arginyl-L-arginin und anschliei3ende Entfernung sämtlicher Schutzgruppen in einer oder mehreren Stufen in einem sauren Medium aus dem so erhaltenen neuen geschützten Octadecapeptid tert.-Butyloxycarbonyl-L-seryl-· L-tyrosyl-L-seryl-L-methionyl-t-butyl-L-glutamyl-L-histidyl-X-phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophyl-glycyl-N^-tert.-butyloxycarbonyl-L-lysyl-L-prolyl-L-valyl-glycyl-N -tert.-butyloxycarbonyl-L-lysyl-N^-tert,-buty]oxycarbonyl-L-lysyl-L-arginyl-L-arginin hergestelli, werden.

Die Erfindung umfaßt ferner die Herstellung des Octadecapeptidaraids, für die als Ausgangsmaterial ein neues nitro-' geschütztes Arginylargininamid verwendet wird. Die übrigen Stufen sind die gleichen wie bei dem Herstellungsverfahren für das Octadeeapeptid bzw. das Verfahren wird in allen Stufen in der gleichen Weise weitergeführt wie bei der Herstellung des Octadecapeptids. Das als Ausgangsmaterial für die Herstellung des Octadecapeptidamids verwendete Carbobenzoxynitro-L-arginylnitro-L-argininamid wird nach einem in der Peptidchemie üblichen Verfahren, nämlich durch Verknüpfung von Nitro-Ii-argininamid und Carbobenzoxy-nitro-1-arginin nach der Gemischt-Anhydridmethode erhalten.

Pur die Kondensation in der erforderlichen Sequenz des Octadecapeptids wird Carbobenzoxy-nitro-L-arginyl-L-argininamid nach Entfernung der Schutzgruppe mit N^-tert.-butyloxycarbonyl-L-lysin verknüpft, vorzugsweise nach der gemischten Anhydrid-Methode oder nach der aktivierten Estermethode. ".-'-'■

Das erfindungsgemäß erhältliche Octadecapeptid und sein Amid haben ähnliche biologische und therapeutische Eigenschaften wie natürliches Corticotropin und können beispielsweise zur Behandlung von akutem und chronischem Gelenkrheumatismus, allergischen Erkrankungen verschiedener Organe, durch verschiedene Ursachen bedingten Intoxikationen und Tumoren angewandt werden.

Der Hauptvorteil des synthetisch hergestellten Octadecapeptids gegenüber aus tierischem Material extrahierten natürlichen Hormonen besteht darin, daß ersteres keine Antigen-Wirkungen aufweist. Bei den oben genannten Erkrankungen bestehen daher gegen seine Verwendung selbst

909886/1693

dann keine Bedenken, wenn sich der Patient während einer früheren Behandlung als allergisch gegen natürliches Corticotropin erwiesen hat.

Während die Reinigung von natürlichem Corticotropin mühsame und aufwendige Verfahren erfordert und das gereinigte Produkt stets noch hochmolekulare proteinartige Verunreinigungen enthält, die gefährliche anaphylactische Reaktionen verursachen können, läßt sich die synthetische Verbindung erfindungsgemäß direkt in hoher Reinheit erhalten und zeichnet sich durch ein völliges Fehlen von Verunreinigungen durch Substanzen mit Proteincharakter aus. Darüber hinaus ist die Herstellung der neuen synthetischen Verbindung von Hypophysen unabhängig, die in letzter Zeit seltenund schwer erhältlich sind.

Das erfindungsgemäß erhältliche Octadecapeptid und sein Amid können ferner zur Herstellung anderer Peptide mit langer Kette verwendet werden. .

Das neue Octadecapeptid wird nach den für die Herstellung von Peptiden bekannten Metho'den, vorzugsweise der Carbodiimid-Methode, der aktivierten Estermethode, der Azidmethode oder der gemischten Anhydrid-Methode und durch Verknüpfen der Aminosäuren in der angegebenen Sequenz hergestellt, wobei man entweder die Aminosäuren selbst miteinander verknüpft oder nachdem man zuerst kleine Peptideinheiten hergestellt hat. Beispielsweise kann man eine der Aminosäuren oder eines der Peptidmoleküle in Form eines Esters mit einer weiteren Aminosäure oder einem weiteren Peptidmolekül, die eine geschützte Aminogruppe enthalten, in Gegenwart eines Kondensationsmittels verknüpfen oder den eine freie Aminogruppe enthaltenden Aminosäure- oder Peptideeter mit einer Aminosäure oder einem Peptid mit aktiver Carboxylgruppe oder aktivierter Estergruppe um-

909886/1693*

-.setzen. Umgekehrt kann man eine Aminosäure oder ein Peptid mit. freier Carboxylgruppe mit einer Aminosäure oder einem Peptid, die eine aktivierte Aminogruppe enthalten, umsetzen. ·

Freie funktionelle Gruppen, die nicht an der Umsetzung teilnehmen, werden zweckmäßigerweise geschützt, vorzugsweise mit Hilfe von Resten, die leicht durch Hydrolyse oder Reduktion eliminiert werden können. Dabei wird die Carboxylgruppe vorzugsweise durch Veresterung, zum Beispiel mit Methanol, tert.-Butanol oder Benzylalkohol ■ oder durch Amidbildung oder die Aminogruppe beispielsweise durch Einführung der Tosyl-, Trityl-, Pormyl- oder Carbobenzoxygruppe oder insbesondere des tert.-Butyloxycarbonylrests geschützt.

Die Aminogruppe des Serinrests kann durch eine Triphenylmethyl- oder Carbo-tert.-butoxygruppe geschützt werden, jedoch sind andere geeignete Schutzgruppen, zum Beispiel Carbobenzoxy- oder Formylgruppen ebenfalls anwendbar. Zum Schutz, der £.-Aminogruppe des lysinrests haben sich Carbo-tert.-butoxy- und Oarbo-tert.-amyloxygruppen als wirksam erwiesen, man kann aber auch mit Erfolg andere geeignete Schutzgruppen, zum Beispiel Carbobenzoxy- und Pormylgruppen anwenden. Die γ-Carboxylgruppe des Glutaminsäurerests kann zweckmäßig als tert.-Butylester geschützt werden, jedoch sind auch andere geeignete Schutzgruppen, zum Beispiel der Methyl-, Benzyl-, Amylester oder die Amidgruppe wirksam. Zum Schutz, der <Imidazolgruppe des Histidinrests hat sich die Triphenylmethylgruppe als zweckmäßig erwiesen, jedoch können auch hier andere Schutzgruppen, zum Beispiel Carbobenzoxy- oder Benzylgruppen angewandt werden. Die Guanidylgruppe des Arginins kann aurch die Nitrogruppe geschützt werden, es ist aber nicht

9 0 9 8 86 / 16 9 3 bad original

unbedingt erforderlich} daß die Guanidylgruppe von Arginin während der Umsetzung geschützt wird.

Im folgenden werden die nachstehend angegebenen Abkürzungen verwendet:

Cbz Carbobenzoxy

BOC tert.-Butyloxycarbonyl

O-But tert.-Butylester

DCCI N.N'-Dicyclohexylcarbodiimid

NHS N-Hydroxysucciniimid

DCHA Dicyclohexylamin

Synthese a¹~⁴-ACTH

	BOC-	Ser	-OH.HgO	-OMe	-NHNHg
	> ■ ■ .	Diazomethan	NH2NH2.HgO	2
	BOC-	Ser	Ser
		HNO
	BOC-	Ser
988606	BOC-

BOC-

Ser

H-I Try

iOMe

BOC-	Ser ■	.H2O	Try
	NHgNH2
BOC-	Ser		Try
	HNO2		■
BOC-	Ser	Try

-OMe

-NHNH,

-N.

BOC-	Ser	-OH	DCHA	-OH. DOHA H-	Met	-OH.HgH hJ	Met	DCCI	-OMe.HCl	•	-OMe.HCl
		Ser ■	H+(Dowex 50WX8) K CO5	Ser · . Met
BOC-	Ser	HCl/AeOSt	-OMe	-OKe
	Ser Met
BOC-	K2CO3	-OMe	-OKe
	Ser Met
BOC-
	Ser Met
H-
H-

Synthese von a^" -ACTH

OBut Cbz-blu

Cbz-

OBut _JL

GIu

OBut J

CbZ-

GIu

OBüt

Cbz-

GIu

OBut

-G

Cbz- GIu

Cbz-

Try GIyj-OMe

Cbz
ι

Cbz-plis -OMe

₀ ι 2

BOC-

ArgJ-OH H-| Try .GIy]-OMe

Cbz HBr/AcoH ι

NO,

DCCI

H-

His 1-OMe

BOC-

Arg

Cbz DCCI

_J

His l-OMe

NO,

BOC- Phe

-OH

H-

Arg

DCCI

NO,

His -NHNH₂ BOC-

Phe

Arg

HNO

NO

His

-N

Phe ·

Arg

His

Bhe

Arg

Try GIy

-OMe

CP₃COOH

Try GIy

Try GIy

Try GIy -OMe

	OBut	Cbz-	G-Iu	His	Phe	HO2	Try GIy
CJbz-	GIu				Arg	OH"
OBut	His	Phe	NO2	Try GIy
	Arg

-OMe

kOH

H₂/Pd

J-

BOG Ί

Cbz-

lys

BOO ι

Obz-

Cbz-

— Q —

Synthese von α ¹.¹ "¹⁵ACTH

BOC

Gbz-

Ly s

-OH

BOG DCHA

Cbz-

Ly s

•OH. DOHA

Cbz-

BOC Dowex-

50.CH₂H

-OMe

Cbz-

-OH

BOC
I

H-fLys

Cbz-

Cbz.

Pro

DCCI

	DCCI	GIy	BOC t
CbZ-	H2/Pd	Lys
	Giy	BOC I
-OH H-

	DCCI	VaI	GIy	BOC I
Cbz-		.H2ZPd	Lys
	VaI	GIy	BOC I
-OH H-		Lys

	Pro	.-OH. H	Pro	DCCI	VaI	GIy	BOC
Cbz-				H2ZPd	Lys
	VaI	GIy	BOC I
		Lys

BOC

- Lys	Pro	VaI	GIy	lys
BOC I			NH2H2'	BOG t
Lys	Pro	VaI	GIy	. Lys

-OMe

-OMe

-OMe

-OMe

-OMe

-OMe

-OMe

-OMe

-HHNH,

909866/1691

ORIGINAL WSPECTED

Synthese von α¹⁶"¹⁸ACTH

- "ΙΟ -

	BOC I	-
CbZ-
	Lys
Cbz-	BOC
	Lys
Cbz-	BOS I
Lys

NO

-H.DCHA

BOO-

-H

NHS

DCCI

-ONHS

Arg H- Arg !-OBz

	|2	DCCI	,2
BOC-I	^ Arg		Arg
	HO2	CP3COOH	NO2 1
H-	Arg

-OBz

-OBz

	BOC ' t	NO ι2	H2/Pd	NO2
Cbz-	Lys	Arg		Arg
	BOC
H-	Lys	* Arg	Arg

-OH

Synthese von α¹⁶~¹⁸ACTH-NH,

BOC f

■NQ_t

BOC D0wex-50WXS NO₂

Cbz-

Lys

rOH NHS

DCCI

Cbz-

Cbz-

Lys

-ONHS

BOC Lys

Ob z-

Arg NO,

Cbz- Arg

-OH

Cbz-J Lys -OH.DCHA cbz- Arg -OH Cb.z-

NO₂ HBr/AcOH

H-

Arg

NO₂

Arg NO₉

Arg

-NH,

Arg

-NHo ■

Arg

μΝΗο.ΗΒΓ

C.

NO,

Arg

-NH,

909886/1693 ORIGINAL INSPECTED

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BAD ORIGINAL

Beispiel 1

1) Herstellung yon tert.-Butyloxycarbonyl-L-serin-

moK.ohydrat (I).

Zu einer Lösung von 10,5"! g Serin und 22,0 g Natrium-^ bicarbonat in einer Mischung aus 200 ml Dioxan und 200 ml Wasser werden 17_}20 g tert.-Butylazidoformiat gegeben und die gebildete Mischung wird bei 40 - 45 ⁰C 20 Stunden lang gerührt. Nach Kühlen mit Eis wird die Reaktions-. mischung mit 4n-Salzsäure auf pH.4>6··bis/,4 >8-'eingestellt und zur Entfernung des Dioxans bei'40 - 45 ⁰C unter vermindertem Druck eingeengt. Die konzentrierte Lösung wird mit 200 ml Äthylacetat vermischt und unter Kühlen mit Eis mit 4n Salzsäure bis unterhalb pH 2 angesäuert. Die . wässrige Schicht wird mehrmals mit Äthylacetat ausgeschüttelt. Die Äthylacetatsehichten werden vereinigt und über Natriumsulfat getrocknet. Nach'Verdampfen des Lösungsmittels unter vermindertem Druck erhält man 13,83 g sirupöse Subs tanz.Der Sirup wird in 100 ml Äther aufgelöst und mit einer Lösung von 12,20 g Ν,ΪΡ-Dicyclohexylamin in 100 ml Äther versetzt. Durch Stehenlassen der erhaltenen Mischung in einem Kühlschrank über Nacht erhält man 23,56 g BOC-L-Serin-dicyclohexylaminsalz, das aus Äthylacetat zu Nadeln vom I*. 142 - 144 ⁰C umkristallisiert wird. Die Ausbeute beträgt 60 #.

/TaJ ²j>»⁵ + 13,3 ° ( c*3, Methanol)

Eine Lösung von 17,40 g dieses Produkts in 200* ml 50 #-igem Äthanol wird mit 45 ml Kationenaustauscherhara (Dowex-50 w χ 8, H⁺-Porm) geschüttelt, um das Salz,zu entfernen. Das Harz wird abfiltriert, und das Piltrat

00 9 086/ 1S83

-■.13-

-wird unter vermindertem Druck eingeengt, um das Lösungsmittel abzudestillieren. Durch Vermischen des Rückstands-mit Wasser erhält man 9,81 g BOO-L-Serinmonohydrat als schuppige Kristalle vom F. 45 - 47 ⁰C. Die Ausbeute beträgt 98$.

Z~ä_7 ^⁶ - 5,0 ⁰Cc = .2,3, Methanol).

Beim Trocknen unter vermindertem Druck zur Entfernung des Kristallisationswassers geht die Substanz in einen Sirup über. .

2) Herstellung von L-»Seryl-L-methionin~methylester (II)

Durch Behandlung von 5,99 g L-Methioninmethylesterhydrochlorid mit einer Mischung aus Kaliumcarbonat und Methylenehlorid (1 :1 ) in üblicher Weise wird L-Methioninmethy1-ester hergestellt. Eine Lösung von L-Methioninmethylester in Methylenehlorid wird mit einer Mischung aus 6,13 g BOC-L-Serinmonohydrat und 5,68 g NjN'-Dicyclohexylcarbodiimid versetzt, und die erhaltene Mischung'wird in einem Kühlschrank stehengelassen, wodurch BOG-L-Seryl-L-methioninmethylester in einer Ausbeute von 84 .$ als Kristalle vom P. 66 - 67,5 ⁰C erhalten wird.

/~a_7^⁵'⁵ - 29,5 ° Co * 2,2, Methanol).

1,402 g BOC-L-Seryl-L-methioninmethylester werden in 2 ml Äthylacetat gelöst und mit 2,5 ml einer Mischung aus etwa 20 $-iger Salzsäure und Äthylacetat versetzt. Die erhaltene Mischung wird 60 Minuten bei Zimmertemperatur stehengelassen, worauf das Lösungsmittel unter vermindertem Druck verdampft wird. Das erhaltene L-Sacy 1-L-me thioninme thy 1-esterhydrochlorid wird mit einer Mischung aus 50 #-igem

809886/16t3

" . ·..-./' ν MS 4 308 2 V

Kaliumcarbonat und Methylenchlorid behandelt. Durch Um- . kristallisieren der erhaltenen Substanz aus Äthylacetat werden 0,825 g L-Sryl-L-methioninmethylester als Kristalle vom P. 84 - 85 ⁰C erhalten.

J'⁵ -16,3 °(c = 1,8, Methanol). 3) Herstellung von BOC-L-Serinhydrazid (III)

Durch Behandlung einer Lösung von 5,58 g BOC-L-Serinmonohydrat in Dioxan mit Diazomethan wird öliger Ester erhalten, der als Lösung in wasserfreiem Äthanol mit 3»0isL Hydrazinhydrat vermischt wird. Die erhaltene Mischung wird 24 Stunden bei Zimmertemperatur reagieren gelassen, wodurch 4,82 g BOC-L-Sarinhydraz.id als Nadeln vom P. 109 - 110 ⁰C erhalten werden.

²|>⁵ -9,0 ± 0,5 ° (c = 4,127, Methanol).

4) Herstellung von BOO-L-Saryl-L-tyrosinhydrazid (IV)

Durch Behandlung einer Lösung von. 4,385 g BOC-L-Serinhydrazid in 1n Salzsäure mit Natriumnitrat in üblicher Weise wird BOC-L-Serinazid gebildet. Das Produkt wird mit Äthylacetat extrahiert. Man wäscht die Äthylacetatschicht mit wässrigem Natriumbicarbonat und verdampft das Lösungsmittel unter vermindertem Druck. Eine Lösung des Rückstands in Tetrahydrofuran wird zu 3,90 g L-Tyrosinmethylester gegeben, und die erhaltene Mischung wird bei 0 4 C 60 Stunden lang reagieren gelassen, wodurch man S*70 g BOC-L-Seryl-tyrosinmethylester als amorphen Peststoff erhält. Eine Lösung von BOC-L-Seryl-L-tyrosinmethylester in

009886/1693 bad original

. wasserfreiem Äthanol wird mit 2,5 ml Hydrazinhydrat versetzt, *" und die erhaltene Mischung wird bei Zimmertemperatur über Nacht stehengelassen, wodurch 3,25 g BOC-L-Seryl-L-tyrosinhydrazid als Kristalle erhalten werden, die sich bei
193 - 195 ⁰C zersetzen.

Z>j|⁴ -19,8 + 1 ° ( c = 2.035, 50 /,-ige Essig-

säure).

5) Herstellung von BOC-L-Seryl-L-tyroeyl-L-seryl-L-methionin-

methy!ester (V)

Eine Lösung von 1,20 g BOO-L-Seryl-L-tyrosinhydrazid in 1n Salzsäure wird in ähnlicher Weise wie in dem vorstehenden Abschnitt 4 mit Hatriumnitrit behandelt. Der gebildete Niederschlag wird mit Äthylacetat extrahiert, die Äthylacetatschicht wird mit wässrigem Natriumbicarbonat und gesättigter Salzlösung in dieser Reihenfolge gewaschen. Die Waschlösungen liefern rasch 0,65 g eines kristallinen Niederschlags. Die Äthylacetatschicht wird mit einer Lösung von 0,625 g i-Seryl-L-methioninmethyIester in Dimethylformamid versetzt, und die erhaltene Mischung wird bei 0 - 4 ⁰C 40 Stunden lang reagieren gelassen, wodurch man 0,538 g BOC-Seryl-L-tyrosyl-L-seryl-L-methioninmethy1-ester als Kristalle vom 1?. 130 - 135 ⁰C erhält. Die Ausbeute beträgt 92,1 #.

ZTaJ⁷²I - 29,3 + 1 ° ( O =2,053, Methanol).

6.V Herstellung von BOC-L-Seryl-L-tiArpsyl-Ii-seryl-L-

inethioninhydrazid (VI)

Eine Lösung von 0,78 g BOC-L-Seryl-L-tyrosyl-L-seryl-L-me thioninmethylester in Dimethylformamid wird mit 0,3 ml Hydrazinhydrat vermischt, und die erhaltene Mischung wird

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bei O'⁰G 40 Stunden lang reagieren gelassen. Durch Vermischen der Reaktionsmischung mit Äthylacetat wird gelatinöses BOC-L-Seryl-L-tyrosyl-L-seryl-L-methioninhydrazid erhalten. Durch Umkristallisieren dieser Substanz aus Wasser werden 0,756 g BOC-L-Seryl-L-tyrosyl-L-Seryl L-methioninhydrazidhydrat als Kristalle gewonnen, die sich bei 187 - 189 "⁰C zersetzen.

D -3518 ° (c= 1,966, 50 fo-iges Methanol).

t.

7. Herstellung von BOC-Nitro-L-arginin (VIl)

Eine Lösung von 32,9 g Nitro-L-arginin und Natriumcarbonat.' in einer Mischung aus 300 ml Wasser und .300.-ml Dioxan wird"·., mit 25,8 g tert.-Butylazidoformiat versetzt, und die erhaltene Mischung wird bei einer Badtemperatur von 45 C gerührt. Nach Kühlen mit Eis wird die Reaktionsmischung mit 4n Salzsäure neutralisiert, und der inerte feine Niederschlag wird abfiltriert. Das Filtrat wird unter vermindertem Druck bei 40-45 C auf etwa 200 ml eingeengt, Die konzentrierte Lösung wird bei 0 ⁰C mit 300 ml Äthylacetat vermischt und unter Kühlen mit Eis mit 4n Salzsäure unter pH 2 eingestellt. Die wässrige Schicht wird mehrmals mit Äthylacetat ausgeschüttelt. Die vereinigten Äthylacetatschichten werden über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet. Der nach Verdampfen des Lösungsmittels erhaltene Sirup wird aus 150 ml Äthylacetat umkristallisiert. Man filtriert die -"-ristalle ab, wäscht mit Äthylacetat und Äther und verdampft das Lösungsmittel, wodurch pan 30,20 g BOC-Nitro-L-arginin als Kristalle erhält, die bei 98 - 1.02⁰C schmelzen, bei 165 - 166 ⁰C'wieder fest werden und sich dann bei 237 - 238 ⁰C zersetzen. Durch Einengen einer Lösung dieser Substanz in Methanol und Umkristallisieren des Rückstands aus Äthylacetat erhält man Kristalle vom P. 98 -

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BAD ORIGINAL

100 ⁰C.

. £OlJ ²^*⁵ + 2,8 ± 1 ° (a = 2,29.6, Methanol) ^J j ²^'³ . - 3,0 i 1 ° (c = 1,614, Wasser)

D* - 0,7 ± 0,5 ° (c = 1,597, Essigsäure). 8) Herstellung von Gbz-L-Tryptopiiyl-glycinmethylester (VIII)

Eine Suspension von 4>06 g Cbz-I-Tryptophan in 40 ml Kethylenchlorid wird tropfenweise mit Q?ri-n-t)utylamin versetzt. Die erhaltene klare Lösung wird mit Eis gekühlt und unter Rühren mit einer lösung von 1 ,51 g Glycinrnethylesterhydrochlorid und 2,48 g ITjN'-Mcyclohexylear'bodiimid in Methylenchlorid versetzt. Man läßt die erhaltene Mischung bei O ⁰C über Nacht stehen und filtriert dann den ausgefallenen KFjli'-Dicyclohexy!harnstoff ab. Das Filtrat wird unter vermindertem Druck eingeengt> und der schaumige Rückstand wird in Äthylacetat gelöst. Die Ithylacetatschicht wird mit \n Salzsäure, Wasser, 5 %-igem wässrigem Uatriumbicarbonat und Wasser in dieser Reihenfolge gewaschen und über wasserfreiem -Natriumsulfat getrocknet. Durch Abdampfen des Lösungsmittels erhält man 4,69 g Cbz-L-Tryptophyl-glycinmethylester als Kristalle vom S¹. 153 - 157 ⁰C. Durch Umkristallisieren dieser Substanz aus einer Mischung von Äthylacetat und Äther erhält man Kristalle vom F. 156 - 158 ⁰O. ■ ' .' ·

Z>_7 % - 12,1 ± 0,7 ° (c = 3,P58.,»°Eises,sig). ■ \ ^Ί

9) Herstellung von BQC-Nitro-L-arainin-L-tryptophyl-■■-'■'■ gl.VQinmethylester (IX)

Ei-ne Lööung von 11,25 g Cbz-L-IDryptophyl-glycin.inethylester in 180 ml Methanol,- die 3 ml Essigsäure enthält, wird

909880/1883

154388?

2,5 Stunden über einem Palladium-Schwarz-Katalysator hydriert. Der Katalysator wird abfiltriert, und das S¹Iltrat wird bei 35 ⁰C unter vermindertem Druck eingeengt, wodurch man einen schaumigen. Rückstand erhält. Sine Lösung dieses Rückstands .in 50 ml Wasser wird mit Athylacetat gewaschen und mit 80 ml Methylenchlorid und 40 ml einer eisgekühlten wässrigen 50 $-igen Kaliumcarbonatlösung geschüttelt. Die wässrige Schicht wird mit Methylen-Chlorid ausgeschüttelt. Die vereinigten. Kethylenehloridschichten werden über wasserfreiem !Jatriuiasulfat getrocknet und bis auf 60 ml unter vermindertem Druck eingeengt. Der erhaltene L-Tryptophyl-glycinmethylester wird mit einer Lösung von 9>32g BOC-Ni tr o-L-arginin. in Dimethylformamid und einer Lösung von 5>68 g NjN'-DicycloIiexylearbodiimid in Methylench'lorid verset-zt. Die erhaltene Mischung v/ira in einem Kühlschrank 34 Stunden lang stehen gelassen, wodurch man einen gelatinösen Niederschlag erhält. Der Niederschlag wird abfiltriert und mit Methylenchlorid gewaschen. Die Waschlösungen werden mit dem Filtrat vereinigt. Man löst den Niederschlag in 150 ml heißem Äthylacetat und filtriert den unlöslichen Ν,Ν'-Dicyclohexylharnstoff ab. Das Piltrat und die Waschlösungen werden mit kalter In Salzsäure, Wasser, 5 $-igem wässrigem liatriuabicarbonat und Wasser in dieser Reihenfolge gewaschen. Der während des Waschens isolierte gelatinöse Niederschlag wird abfiltriert, mit Wasser gewaschen und in 100 ial heißem Äthylacetät gelöst. Die erhaltene Lösung wird über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und mit der oben erhaltenen -ithylaeetatlösung vereinigt. Nach Stehenlassen, der vereinigten Äthylacetatlösung in einem Kühlschrank über Sacht wird der abgeschiedene Niederschlag abfiltriert, mit kalter Essigsäure und Äther gewaschen und bei 60 ⁰C unter verminderten Druck mit Phusphorpentoxyd getrocknet, wodurch 13,21 g BOG-Nitro-L-arginin-L-tryptophyl-glycinmethylesterals Kristalle

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BAD ORIGINAL

vom I*. 111 - 114 ⁰C gewonnen werden. Die Dünnschichtchromatographie an Kieselsäuregel in einen Lösungsmittel» system aus Chloroform und Methanol (85 : 15) ergibt einen einzigen Fleck (Rf = 0,7). Die Substanz wird umkristallisiert und wieder in gleicher Weise getrocknet, aainit sie luftstabil ist. P. 112 - TH ⁰C.

+21,7 - 0,7 °'(c = 3,022, Methanol).

10) Herstellung von ITitro-L-argininyl-I-tryptophyl-filycin- - saethylestertrifluoracetat (X)

Sine Lösung von 7,22 g BOC-ITitro-L-arginyl-L-tryptophylglycinmethylester in 7 ml Eisessig wird mit 40 ml wasserfreier Trifluoressigsäure versetzt. I-ian läßt die He-aktionsmisehung 45 Minuten unter einen: Stickst off strom stehen und vermischt sie dann unter Kühlen mit Eis mit 500 ral Äther. Der in einer Kenge von 6,7 g erhaltene IiIe-. derschiag wird abfiltriert, gewaschen und getrocknet, wodurch rohes Mtro-L-argininyl-L-tryptophyl-glycinmethylestertrifluoracetat erhalten wird. Eine Lösung dieser Substanz in 80 ml V«^rasser wird dreimal mit 20 ml Äthylacetat gewaschen. Man erhält 4,93 g iiitro-L-argininyl-L-tryptophyl-glycinmethestertrifluoracetat als hellgelbes Pulver vom F. 122 - 126 ⁰C. Diese Substanz ergibt bei PapierChromatographie in einem Lösungsmittelsystem aus n-Sutanol-Essigsäure-Wasser (4 : 1 : 2) (Rf=O,74) mit Hinhydrin- und Bhrlich-Reagens einen einzigen ELeck.

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+16,1 ± 1 ° (c = 1,918, Methanol).

11) Herstellung von BQC-L-Phenylalanyl-nitro-L-arfiinyl-L-tryptophyl-glycinmethylester (Xl) ·

Eine lösung von 5»02 g Nitro-L-argininyl-L-tryptophylglycin-methylestertrifluoracetat in Wasser wird mit einer Mischung aus 8 ml n-Butanol und 40 ml Äthylacetat versetzt, und die erhaltene Mischung wird bei 0 ⁰C mit 20 ml 50 $-igem wässrigem Kaliumcarbonat geschüttelt. Man schüttelt die wässrige Schicht mit' einer Mischung aus n-Butanol und Äthylacetat (1:5) aus, vereinigt die organischen lösungsmittel, trocknet über wasserfreiem Natriumsulfat und verdampft das Lösungsmittel unter vermindertem ■ Druck. Durch Waschen des öligen Rückstands mit Äther erhält man einen weißen Peststoff, der im Vakuum über ITatiiumhydroxyd getrocknet wird. Eine Lösung des erhaltenen Nitro-L-argininyl-L-tryptophyl-glycinmethylesters und von 3,795 g BOG-L-Phenylalanin in Acetonitril wird bei 0 ⁰C mit einer Lösung von 1,75 g N,N•-Dicyclohexylcarbodiimid in Acetonitril versetzt. Man läßt die Reaktionsmischung über Kacht in einem Kühlschrank stehen und filtriert dann den ausgefallenen N,N'-Dicyclohexy!harnstoff ab. Das FiI-trat wird unter vermindertem Druck eingeengt, und der Rückstand wird in 60 ml Äthylacetat gelöst. Die Äthylacetatschicht wird mit kalter. 1 η Salzsäure, Wasser, *1m wässrigem Katriumbicarbonat und Wasser in dieser Reihenfplge gewaschen und über Nacht in einem Kühlschrank stehen gelassen. Die "ausgefallene gelatinöse Substanz wird abfiltriert, mit kaltem Äthylacetat und Äther gewaschen und unter vermindertem Druck getrocknet, wodurch 5,28 g BOC-L-Phenylalanyl-nitro-L-arginyl-L-tryptophylglyoinmethylester erhalten werden. Durch zweimaliges ümkristal-

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""■"'· ^BAD ORIGINAL

'· lisieren dieser 'SuIastanz aus Acetonitril erhält man das ge- * . wünschte Tetrapeptid als Kristalle vom P. 172 - 173 ⁰O.

²| -20,1 ■ ■+■ 1 ° (c = -2,054, Methanol). .

12) Herstellung von L-Phenylalanyl-nitro-L-arginyl-L-

tryptophyl-filycinmethylestertrifluoracetat (XII)

Man versetzt eine lösung von 1,810 g BOC-L-Phenylalanylnitro-L-arginyl-L-tryptophyl-glycininethylester in 2 ml Essigsäure mit 8 ml Irifluoressigsäure und läßt die erhaltene Mischung "bei Zimmertemperatur unter Stickstoffatmosphäre 45 Minu.ten lang stehen. Dann versetzt man die Mischung mit 100 ml Äther, filtriert die ausgefallene Sub stanz ab und wäscht ausreichend mit Ither, wodurch man 1,765 g L-Phenylalanyl-nitro-L-arginyl-L-tryptophylglycinmethylestertrifluoracetat als helleremfarbenes Pulver gev/innt. Durch zweimaliges Waschen einer Lösung dieser Substanz in Wasser mit Äthylacetat erhält man farbloses flockiges Pulver XII.

.ζ¹ - 1,5 * 1 ° (c= 1,384, Methanol).

13) Herstellung von

cbz-L-histidinmethylester (XIII)

Eine Lösung von 4,74 g N^a,N -Dicarbobenzoxy-L-histidiniriethylesterhydrochlorid in 10 ml Eisessig versetzt man mit 30 ml von 33 $> Bromv/asserstoff enthaltender Essigsäure und läßt die erhaltene Mischung bei Zimmertemperatur 15 Minuten lang unter gelegentlichem Schütteln reagieren. Dann ver-

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BAD OBiQlNAL

mischt man die Reaktionsinisehung mit 200 ml Äther, filtriert den gebildeten Niederschlag ab, wäscht mit Kethy- lenchlorid und Äther in dieser !Reihenfolge und trocknet im Vakuum, wodurch man 4,40 g Ii ^m-Carbobenzoxy-L-histidinmethylesterdihydrobromid erhält. Man versetzt eine Lösung dieses Produkts in 30 ml Wasser mit 60 ml Methylenchlorid und 4 ml eisgekühltem 28 $-igem- wässrigem Ammoniak und schüttelt die Mischung ~be± Ό^:0O'gründlich'durch. '' Die wässrige Schicht wird mit kaltem Methylenchlorid ausgeschüttelt. Die organischen Lösungsmittel werden vereinigt, bei 0 C über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und bei 25 0 unter verminderten Druck eingedampft. -San versetzt den erhaltenen sirupösen Rückstand mit einer Lösung von Cbz-Y-tert.-Butyl-L-glutaminsäure, die durch Behandlung von 4,15g des Dicyclohexylaminsalzes mit Dowex χ 50 hergestellt ist, und.mit einer 0,008 m Lösung von K,N¹-Dicyclohexylcarbodiimid in, Methylenchlorid und IaB^ die erhaltene Mischung bei 0 ⁰C reagieren und dann in einem Kühlschrank über ^acht stehen. Der ausgefallene 21,IC cyclohexylharnstoff wird abfiltriert und das Piltrat wird unter vermindertem Druck eingeengt. Man löst" den sirupösen Rückstand in Äthylacetat und wäscht die Äthylacetatlösung mit 1n Salzsäure, Wasser, eisgekühltem 5 $-igem wässrigem Natriumcarbonat und Wasser in dieser Reihenfolge. Die gewaschene Lösung wird über wasserfreiem natriumsulfat getrocknet und zu einem Sirup eingedampft;. Der Sirup kristallisiert aus einer Mischung von Äthylacetat und Petroläther beim Abkühlen aus. Durch. Umkristallisieren der rohen Kristalle aus einer Mischung von Äthylacetat und Petroläther werden 4,48 g Cbz-y-tert.-

Ttvf

Butyl-L-glutamyl-N -carbobenzoxy-L-histidin-methylester als Kristalle vom F. 101 - 102 ⁰C isoliert.

± 1 ° (e = 2,475, Methanol).

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14) Herstellung von Cbz-y-.tert. -Butyl-L-glutamyl-L-his tidin-·

hydrazid (XIY)

Man versetzt eine lösung von 12,45 g Cbz-y-tert.-Butyl-L-glutamyl-H -carbobenzoxy-L-liistidinineth.ylester in 60 ml wasserfreiem Äthanol mit 6 ml Hydrazinhydrat. TJm die erhalte-^ ne Mischung zu lösen wird bei 0 ⁰O einige Minuten intensiv gerührt. Man läßt die Lösung bei 0 ⁰C in einem Kühlschrank 68 Stunden lang stehen und versetzt sie dann mit 240 ml Wasser. Der gebildete Sirup wird rasch kristallin. Die Kristalle werden abfiltriert, mit kaltem Wasser gewaschen und getrocknet, wodurch 8,51 g rohes kristallines Produkt erhalten wird. Durch Einengen der Mutterlauge werden 0,735 g kristallines Produkt erhalten, so daß die Gesamtmenge 9»245 g beträgt. Durch Umkristallisieren der Kristalle aus einer HisGhung von Äthanol und Wasser (1:4) werden ■ . ■ 8,425 g Cbz-Y^tert.-Butyl-L-glutamyl-L-histidinhydrazid als Kristalle, die bei 105 - 115 ⁰C sintern und bei 144 — 146 „ C schmelzen » erhalten.

^ -41,0 I 1° (c=' 2,075, InHCl)

1^) Herstellung von Cbz-Y-tert.-Butyl-L-glutar^yl-L-histidyl-L-phenylalanyl-nitro-L-arginyl-L-tryptophyl-L-glycinmethyl-

ester (XV)

ine Lösung von 5;57 g Cbz-Y-tert.-Butyl-L-glutamyl-L-histidinhydrazid in 10 ml Dimethylformamid wird.unter Kühlen in einem Sis/Kochsalzbad mit 45 ml eisgekühlter In-SaIzsäure und 6,05 inl 2m Natriumnitrit versetzt. Die erhaltene Mischung wird 4 Hinuten lang gerührt und mit 45 ml eisgekühltem 1a Natriumcarbonat und 30 ml gesättigter Salzlösung versetzt. Die ausgefallene Azidverbindung \i\vd. mit kaltem Äthylacetat extrahiert. Die Äthylacetatschicht wird über

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- 24. - '"■'■■

wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und mit einer Lösung von L-Phenylalanyl-nitro-L-arginyl-L-tryptophylglycinmethylester (hergestellt aus 8,87 g des Tetrapeptidtrifluoraeetats, Verbindung XIl) in 95 ml Acetonitril vermischt. Man läßt die Reaktionsmischung bei 0-4 C 48 Stunden lang 'reagieren. Der gelatinöse Niederschlag wird abfiltriert, mit Äthylacetat und Äther gewaschen und getrocknet, wodurch man 9,42 g Rohprodukt erhält. Eine Suspension des ^xrodukts in 110 ml Acetonitril wird einige Minuten unter Erwärmen gerührt und dann in einem Kühlschrank über Nacht stehen gelassen. Der Niederschlag wird abfiltriert, mit Acetonitril und Äther in dieser Reihenfolge gewaschen und getrocknet, wodurch man 9>21 g Cbz-γ-tert.-Butyl-L-glutamyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-nitro-L-arginyl-L-tryptophyl-L-glycinmethylester als Kristalle, die bei 180 ⁰C sintern und bei 185 - 186 ⁰C schmelzen, gewinnt.

Z"ay^⁷*⁵ " ⁵³»° - ¹ ° (°-^β'¹»99, Dimethylformamid) i⁷'⁵ - 33,1 ί 4 ° (c =-0,592, Methanol)

16) Herstellung von Cbz-Y-tert.-Butyl-L-glutamyl-L-hiBtidyl-L-phenylalanyl-nitro-L-arfiinyl--I;-tryptophyl-gly,oin (XVI)

Kan versetzt eine Lösung von 3,85 g Cbz-Y-tert.-Butyl-L-glutamyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-hitro-L-arginyl-L-tryptophyl-glycin-methylester in 50 ml 75 ^-igem Dioxan mit 4 ml 1n wässrigem Katriumhydroxyd und' läßt 'die er-r haltene Mischung bei Zimmertemperatur 30 Minuten unter Schütteln reagieren. Durch Vermischen der Reaktionsmi- . ■ schung mit 300 ml kaltem Wasser und 4,15 ml 1n Salzsäure wird ein gelatinöser Niederschlag erhalten. Nach.Stehen- " ».

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lassen in der Kälte für einige Stunden wird der Niederschlag abfiltriert, mit Wasser gewaschen und aus 15 ml Dimethylformamid und 105 ml Methanol erneut abgeschieden, woüurch man 3,44 g des gewünschten Cbz-Y-tert.-Butyl-l-glutainyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-nitro-L-arginyl-1-tryptophylglycinsals Kristalle gewinnt, die sich bei 217 - 218 C 'zersetzen. Durch Umkristallisieren dieser Substanz aus 90 $-igem Methanol werden Nadeln vom F. 217 ⁰C erhalten.

/~a_7 ²^'⁵ -26,8 + 1 ° (-C = 2,141,Dimethylformamid)

17) Herstellung von γ-tert,-Butyl-l·-glutamyl-l·-histidyl--L-phenylalanyl-L-ar_lg;inyl-L-tryptophyl-glycin-mΌnoacetat ■ (XVII)

Eine lösung von 1,084 g Cbz-y-tert.-Butyl-L-glutamyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-nitro-L-arginyl-1-tryptophylglycin in 40 ml 90 $-iger Essigsäure wird mit Palladium-Schwarz-Katalysator vermischt und im Wasserstoffstrom 17 Stunden geschüttelt. Nach Abfiltrieren des Katalysators wird das Piltrat unter vermindertem Druck bei 40 - 45 ⁰C zu einem - öligen !Rückstand eingeengt. Man löst den Rückstand in einer kleinen Menge Methanol und vermischt die Methanollösung mit Äther.- Die ausgefallene Substanz wird abfiltriert, lyophilisiert und über Phosphorpentoxyd und Natriumhydroxydplättchen bei Zimmertemperatur unter vermindertem Druck getrocknet, wodurch 0,977 g des gewünschten γ-tert.-Butyl-L-glutamyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl-I-tryptophyl-glycinacetats erhalten werden. Diese -Substanz wird bei 60 °C/2 bis 3 mm Hg 8 Stunden über Phosphorpentoxyd getrocknet und über Nacht an der luft stehengelassen.

j\^l -10,3 * 4° (c = Ό, 6 24, Dimethylformamid)

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BAD

18) Herstellung von N^a-Cbz-K^-3QC--L-Ly3in-dicyclohexylamin-

salz (ΧΫΙΙΙ)

Eine Lösung von 8,62 g 2^--3OC-L-Ly sin und 6,0 g Hatriumdicarbonat in einer Mischung aus 70 dl In ITatriumhydroxyd und 30 ml Wasser wird "bei 0 G unter intensivem Hühren mit 20 ml Ither und dann isit 6,58 g Car bobenzc-xy chlor id vorsetzt. Die erhaltene Kisciiung wird 30 liinuten bei 0 C gerührt und dann 2 Stunden bei Zimmertemperatur stehengelassen. Man trennt die Athersehicht ab, wäscht die wässrige Schicht mit Äther und-stellt bei- 0 ^UC mit kalter 4η

d mit

Salzsäure auf pH 2 ein. Der abgeschiedene Sirup wir Äthylacetat extrahiert. San vereinigt die organischer. Lösungsmittel, wäscht zweimal mit ¥asser, trocknet über wasserfreiem iiatriumsulfat und verdampft das Lösungsmittel unter vermindertem- Brück. Sine Lösung des erhaltenen schaumigen Rückstands in Äther wird mit 7,0 eü. 27,17'-Dicyciohexylamin (DCHA) versetzt und über -^aeht in einem Kühlschrank, stehen gelassen.. Die in einer Kenge von '3,59 g (94,8 io Ausbeute) abgeschiedenen kristalle vom ?. 14S 149 ⁰C werden abfiltriert, mit Äther gewaschen, getrocknet und aus einer Mischung von Methanol und Äther umkrisxallisiert. Ss werden 14,95 g i^-Cbz-Ii^-BOG-X-Lysin-dicyclohexylaminsalz als farblose Siadein vom 3¹. 1-53 - 155 °C erhalten.

faJ^S + 5,5 ± 0,5 ° (c = 4,564, Sethanoi) · 19) Herstellung von &^g-Gbz-l^- 300-L-Lysin-methylester

(XIX)

Eine Suspension von 11,23 g Έ -Cbz-N^-BOG-L-Lysin-dicyelohexylaminsalz in 160 ml 60 jS-igeiE Äthanol wird mit 20 ml Kationenaustauscherharz (Dowex-50 W χ 8; E -Form) versetzt, und die erhaltene Mischung wird 30 Minuten bei Zimmertemperatur geschüttelt. Man filtriert das Harz ab una engt das Filtrat unter vermindertem Druck bei 40 ⁰C ein. Eine Lö-

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sung des erhaltenen, öligen Rückstands in Äther wird über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und dann bei 0 C mit einer Lösung von Diazomethan in Ä-ther versetzt, bis · die gelbe Farbe der Lösung bestehen bleibt. Man läßt die erhaltene Lösung to Minuten bei 0 ⁰C stehen und gibt dann einige tropfen Essigsäure zu, um überschüssiges Diazomethan zu zersetzen, Kan wäscht die erhaltene Lösung mit Wasser, 5 $-igein STatriumbiearbonat und Wasser in dieser Reihenfolge» trocknet über wasserfreiern Natriumsulfat und verdampft das Lösungsmittel unter vermindertem Druck. Durch Umkristallisieren des Rückstands. aus einer Ki-\-.·. -^: schung von Ithylaeetat und Petroläther werden 1,10 g ^-Cbz-X^-BOC-L-Lysiniaethylester als Kristalle vom F. 60 61,5 ⁰C erhalten. Sie Ausbeute beträgt 97,7 #. Durch Umkristallisieren dieser Substanz aus dem gleichen Lösungsmittel werden Kristalle vom ?. 62 - 63 C gewonnen. .

^⁶ -9,3.+ -1. ° Cc = 2,045, Aceton)

• .2.0) Herstellung von ff -300-L-Lysinmethylesteraeetat (XX)

Eine Lösur-g von 1,972 g l^-Cbz-K^-BGO-L-Lysin-methylester in einer Kischung aus 20 al Methanol und 0,5.ml Essigsäure wird isit ^alladius-Scmiarz-Satalysator versetzt, und die erhaltene-Mischung wird 2 Stunden im Wasserstoffstrom ge schüfsei t.Ivach Abfiitrieren des Katalysators v/ird das Pilxrat sur Entfernung des Lösungssitteis unter veraindertea Druck eingeengt. Durch Stehenlassen einer Lösung des erhaltenen sirupösen Rückstands in Äther in einem Kühlschrank über Kachu werden 1,465 g li^-BOC-L-Lysinmethylesteracetaν als Kristalle vom P. 78-79 ⁰O erhalten. Die Ausbeute beträgt 91»4 £· "

j^⁶ *n_f0+ 1 ° (C = 2/134, Methanol)

. ■ ■

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21) Herstellung von Cbz-Glycyl-I-I^c-.aOC-L-lysin-rnethyl-

ester (XXI)

3ine Lösung von 0,802 g N^-BOC-L-Lysinmethylesteracetat in 1 ml Wasser wird mit 15 ml Kethylenchlorid und kaltem 50 $~igem wässrigem Kaliumcarbonat verüetzt, und die erhaltene Mischung wird bei 0 G intensiv gerührt. Die wässrige Schicht wird mit kaltem Kethylenchlorid ausgeschüttelt. Die Xethylenchloridschich'ten v/erden vereinigt, über wasserfreiem ICatriumsulfat getrocknet und unter ver- minderten Druck bei 25 C eingedampft. Kaη versetzt eine Lösung des erhaltenen öligen Rückstands und von 0,523 g Carbobenzoxy-glycin in Kethylenchlorid bei 0 C mit einer Lösung von 0,517 g K^'-Dicyclohexylcarbodiimid (DCCI) in Kethylenchlorid und läßt die Reaktionsmischung über !»acht in einem Kühlschrank stehen. Kach Abfiltrieren. des ausgefalltenen IT,IT'-Dicyclohexylharnstoffs wird das Piltrat unter vermindertem Druck eingeengt. Eine Lösung des sirupösen Rückstands, in Athylacetat wird mit kaPfcer In Salzsäure, Wasser, 5 ^-igem wässrigem Xatriumbicarbo-nat und Wasser in dieser Reihenfolge gewaschen, über wasserfreiem I^atriurasuifat getrocknet und unter vermindertem Druck zu einem sirupösen Rückstand eingedampft. Durch Stehenlassen des. Rückstands in einem Kühlschrank werden 1,013 g Cbz-Glycyl-17ⁱ-30C-L-lysinmeth.ylester als Kristalle vom ?. 71 - 73 C erhalten. Die Ausbeute beträgt 90,0 %.

Durch Umkristallisieren dieser Substanz aus einer Mischung von Xthylacetat und Petroläther werden glänzende . dünne «adeln vom ?. 74 - 75 ⁰C in 92,5 %> Ausbeute erhalten .

-6,04 I 0,5 ° (c = 3,136, Methanol)

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22) Herstellung _νοη cbz-L-yalyl-glycyl-N^-BOG-L-lysin-

methylester (XXII)

Eine Lösung von 3,05 g Cbz-Glycyl-^-BOC-L-lysinmethylester in einer Mischung aus 30 ml Methanol und T, 5 ml Essigsäure wird mit Palladium-Sehwarz-Katalysator versetzt und die erhaltene Mischung wird 2,25 Stunden im Wasserstoffstrom geschüttelt. Nach Abfiltrieren des Katalysators wird das Filtrat unter vermindertem Druck bei 30 G eingeengt. Sine lösung des öligen.Rückstands in 25 ml Wasser wird zweimal, mit Äthylacetat gewaschen und unter vermindertem. Druck auf etwa.10 ml eingeengt. Die konzentrierte Lösung wird mit 40 ml Methylenchlorid vermischt und unter Kühlen mit 20 ml kaltem 5O ^-igem Kaliumcarbonat geschüttelt. Die wässrige Schicht wird zweimal mit kaltem Methylenchlorid ausgeschüttelt. Die MethylenchlO-ridschichten werden vereinigt, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck eingedampft, wodurch man Glycyl-ÜT -SOC-L-lysinmethylester als Sirup in quantitativer Ausbeute erhält. Zu einer Lösung dieses Dipeptidesters und von 1,7O g Garbobenzoxy-L-valin in Methylenchlorid wird N,N'•-Dicyclohexylcarbodiimid gegeben, und die erhaltene Mischung wird in der gleichen Weise wie in dem vorstehenden Abschnitt 21 reagieren gelassen, lach Abfiltrieren des ausgefallenen KVN'-Dicyclohexylharnstoffs wird das Piltrat unter vermindertem Druck zu einem kristallinen Rückstand eingedampft. Man versetzt eine Lösung des Rückstands in 10 ml warmem Äthylacetat mit Äther-und läfdt die erhaltene Mischung in einem Kühlschrank über Stächt stehen. Die ausgefallenen Kristalle werden abfiltriert, mit Äther gewaschen und getrocknet, wodurch" 3,51 g ■ Gbz-L-Valyl-glycyl.-N^-300-L-lyslnmethylester als Kristalle vom FV 1^8,5 - 129 ⁰C gewonnen wrden. Die Ausbeute

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beträgt 94,5 ¥>> Durch Umkristallisieren dieser Substanz aus Acetonitril v/erden, farblose Nadeln, vom F. 130 -131 G erhalten.

*-J ^ ^ -12,2 i 1 ° (c =-2,433, Methanol)

23) Herstellung vx Cbg-I-Prolyl-L-valyl-^lycyl-:: ^BOO-L-Iysinnethylester (XXIII)

3ine lösung von 6,61 g Cbz-L-Valyl-glycyl-1.- -300-L-lysinmethyiester in 60 ml i'Isthanol v/ird mit -^ailadium-Schwarz-Ivatalysator versetzt, und aie erhaltene Xischung 2,5 Stunden iai Wasserstoffstroa geschüttelt» I-Tach Abfiltrieren des Katalysators und einengen des Piltrats bei 30 C unter vermindertem Druck erhält man 1-Valyl-giycy 1—IT ^c-30C-L-lysininethylesxer als farblose schaurige Subsxanz. Sine Lösung dieses ^ripeptiaesters und von 2,9S g Garbob'enzoxy-L-prclirx in Kexhylenchlorid versetzt rr.an r:.it 2,48 g Ii,li'-Dieylohexylcarbodiirnid und läßt die erhaltene Mischung in der gleichen Vieise v/ie im vorstehenden Abschnitt 21 reagieren. I-Ian filtriert den ausgefallenen X,Ii'-Dicyclohexy!harnstoff ab und engt das ?il"jrat unter verminderten Druck zu einem schaumigen Ilückstand ein. Durch Umkristallisieren des Rückstands aus einer liischung von Athylacetat und ^ther v/erden 7,31 g Cbz-L-Prolyl-L-valyl-glycyl-Ιΐ -BOG-L-lysin-nethylester als Kristalle vom P. .142 - 143 ⁰G erhalten. Die Ausbeute beträgt 94,1 ⁰Jo. Diese Substanz wird aus Äthylacetat zu Kristallen vom P. 143-144 C uinkristaliisiert.

J²^ -50,-6 1 1 ° (c = 2,558, Methanol)

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24) Herstellung von L-Prolyl-L-valyl-glycyl-N^-BOC-L-lysinmethylester (XXIV)

Eine lösung von 0,972 g Cbz-L-Prolyl-L-valyl-glycyl-N^f-BOC-L-lysinmethylester in einer Mischung aus 15 ml Methanol und 0,5 ml Essigsäure versetzt man mit Palladium-Schwarz-Katalysator und schüttelt die erhaltene Mischung 2 Stunden Id Wasserstoffstrom. Nach Abfiltrieren des Katalysators wird das Filtrat unter vermindertem Druck zu einem farblosen Öl eingeengt. Eine Lösung des Öls in 5 ml Wasser wird mit Athylacetat gewaschen und mit 10 ml Methylenchlorid vermischt. Die erhaltene Mischung wird bei 0 C mit 5 ml wässrigem 50 ίά-igem Kaliumcarbonat intensiv geschüttelt. Die organischen Lösungsmittelschichten werden vereinigt, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck zu einem kristallinen Peststoff eingedampft. Durch Waschen des Peststoffs mit Äther und Trocknen werden 0,700 g L-Prolyl-L-valyl-glycyl-N^-BOG-L-lysin-methylester als Kristalle vox P. 98 - 102 ⁰C gewonnen. Die Ausbeute beträgt 90,9 ^. Durch Umkristallisieren dieser Substanz aus einer Mi- · schung von Methanol und Äther erhält man den Tetrapeptides ter als Nadeln vom P. 104 - 106 ⁰C.

AJj⁴'⁵ -34,4 +. 1,5 ° (c =1,762,Methanol)

25) Herstellung von ^-Cbz-N^-BOC-L-Lysyl-L-propyl-L-valyl ßlycyl-N^£-B0C-L-ly3inmethylester (XXY)

Man versetzt eine Mischung von 0,483 g L-Prolyl-L-Talylglycyl-Ji^-BOC-L-lysinmethylester und H^a-Cbe-H^-BOC-L-lysin, das durch Behandlung von 0,528 g des Dicyolohexylaminsalzes mit Kationenaustauscherharz hergestellt 1st,

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BAD

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bei O ⁰C mit einer Lösung von 0,194 C N,N^f-Dicyclohexylcarbodiimid in Kethylenchlorid und läßt die erhaltene Mischung über Nacht in einem Kühlschrank stehen. Nach Abfiltrieren des ausgefallenen Ν,Ν'-Dieyclohexylharnstoffs wird das Piltrat mit kalter In-Salzsäure, Wasser, 5 tigern Natriumbicarbonat und Wasser in dieser Reih<- /ifolge gewaschen, über wasserfreiem Natriumsulfat getiocknet und unter vermindertem Druck eingedampft. Durch Vermischen der konzentrierten Lösung mit Äther erhält man 0,?28 g N^Cbz-N^-BOC-L-LysyHrprolyl-L-valyl-glycyl-N^-BOC-L-lysinniethylester als amorphen Feststoff vom P. 98 - 103 ⁰C. Diese Substanz wird aus Aceton zu Nadeln vom P. 105 - 107 ⁰C umkristallisiert.

Z~a_7 ²^ -55,2 ± 1° (ö » 2,126, Methanol)

26) Herstellung von N^g~Cbz-N^g-BOO-L-ly8yl-L-prolyl-L-valyl-

glycyl-N^£-BOC-L-lysinhydrazid (XXYI)

Man versetzt eine Lösung von N^a-Cbz-N^-BOC-L-Iysyl-1-prolyl-L-valyl-glycyl-N -BOC-L-lysinmethyleeter in Dimethylformamid mit Hydrazinhydrat und läßt die erhaltene Mischung bei Zimmertemperatur 45 Stunden lang stehen. Nach Vermischen der Reaktionsmischung mit Äthylacetat wird die erhaltene gelatinöse Substanz abfiltriert, mit Waeeer gewaschen, über ^acht bei 60 ⁰C unter vermindertem Druck getrocknet und an der Luft stabilisiert, woduroh man · ■} N^a-Cbz-N^£-BOC-L-lysyl-L-prolyl-L-valyl-flyoyl«-H^f-BOG-L-· lyainhydrazid erhält. · /

27) Herstellung von Nitro-arginlnbenyyl-eattr-p-tolttol-r

Bulfonat (XXYII) ' ;. ■' ^?;·

Eine Lösung von 10,96 g Nitro-L-arginin und U,25 g p-Toluolsulfoneäurehydrat in 100 ml Benzylalkohol wird .V-

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■"■""■ 154388?

.bei 100 ⁰O gerührt. Die 18sung wird in Abständen von etwa 40 Minuten mit 50 ml Portionen von Tetrachlorkohlenstoff vereetzt, und das Lösungsmittel wird abdestilliert. Man läßt die Reaktionsmisohung 5 Stunden stehen und vermischt sie dann mit 500 ml wasserfreiem Äther. ■Der nach Abdekantieren der oberen Schicht erhaltene sirupöse Rückstand wird ausreichend mit Äther gewaschen und unter vermindertem Druck getrocknet. Das in einer Menge von 5 g erhaltene rohe, p-Toluolsulfonat "wird in 20 ml n-Butanöl gelöst, und die Lösung wird mit Wasser gesättigt, dreimal mit Wasser gewaschen und unter vermindertem Druck bei 45 ⁰C zu einem öligen Rückstand eingeengt. Durch Vermischen dieses Rückstands mit Äther erhält man 4,36 g NitrO-L-arginin-benzylester-p-toluolsulfonat als reine Substanz. Diese Substanz ist ein stark hygroskopisches Pulver und ergibt bei PapierChromatographie in dem Lösungsmittelsystem n-Butanol, Essigsäure, Pyridin und Wasser (30 : 6 : 20 : 24) (Rf =0,83) mit Ninhydrinreagene einen einzelnen deutlichen ?leck. . *

28) Herstellung von BOC-Nitro-L-arginyl-nitro-L-arginin-

benzylester (XXVIII) .

4,10 g Nitro-L-argininbenzyleeter-p-toluoleulfonat werden zu einer'Mischung aus Wasser, n-Butanol und Äthylacetat (1 : 1 : 4) gegeben, und die erhaltene Mischung wird mit Eis gekühlt und mit 5 ml.kaltem 50 £-.igem Kaliumcarbonat vermischt. Die erhaltene Mischung wird intensiv geschüttelt, und die wässrige Schicht wird sweimal mit einer Mischung aus n-Butanol und Äthylaoetat (1 : 4) ausgeschüttelt. Die organischen Lösungsmittel werden vereinigt, mit Wasser gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck eingedampft. Beim. Vermischen des

9O9SS6/1093

. BAD

Rückstands mit Äther fallen 1,88 g Nitro-L-argininbenzylester aus. Eine Lösung von 1,88 g dieses Esters und 1,815 g BO.C-Nitro-L-arginln in 10 ml Dimethylformamid wird mit einer Lösung von 1,03 g NtN'-DicyclQhexylcarbodiimicf (DDCI) in 15 ml Methylenchlorid versetzt. Man läßt die erhaltene Mischung in einem Kühlschrank über Nacht stehen, filtriert den ausgefallenen Ν,Ν'-Dlcylohexylharnstoff ab und engt das Filtrat bei 40 - 45 ⁰C unter vermindertem Druck zu einem sirupösen Huckstand . ■ein. Eine Lösung des Rückstands in einer Mischung aus n-Butanol und Äthylacetat (1 i 2) wird mit Wasser, kalter 1n Salzsäure, 1m wässrigem Natriumbicarbonat und Wasser in dieser Reihenfolge gewaschen, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck eingedampft. Durch Umkristallisieren des Rückstande aus n-Butanol werden 2,42 g BOC-Nitro-L-arginyl-nitro-L-argininbenzyle'ster als amorpher Niederschlag gewonnen. Diese Substanz ergibt beim Chromatographieren an einer Dünnschicht aus Kieselsäuregel G in dem Lösungsmitteleyatem Methanol und Äthylacetat (15 : 85) (Rf » 0*40) einen einzigen und deutlichen

Z~<*7 ²I -18,1 ± 1 ° ( c * 2,487, Methanol)

29) Herstellung von Nitro-L-arginyl-nitro-L-arginyl-_ nitro-L-argininbeagylestertrifluoracetat (XXIX)

Eine Lösung von 0,916 g BOC-Nitro-lA-arginyl-nitro-L-argininbenzylester in Trifluoressigeäure wird 60 Minuten bei Zimmertemperatur stehen gelassen. Durch Vermischen der erhaltenen Mischung mit wasserfreiem Äther erhält man einen Niederschlag aus 0,892 g Nitro-L-nrginyl-nitro-L-argininbenzylestertrifluoracetat.

909886/169G

BAD ORIGINAL

30) Herstellung von N^a-Cbz-N^f-30C-L-Lysin-N-hydroxysuccininiid-

ester (XXX) ·

Eine Lösung von N^a-Gbz-X^-BOC-L-Lysin (hergestellt aus 5,62 g des Dicyclohexylaninsalzes) und von 1,15 g N-Hydroxysucciniraid in Acetonitril, versetzt man mit 2,06 g NiN'-Dicyclohexylcarbodiimid und läßt die erhaltene Mischung in einem Kühlschrank über Nacht stehen. Nach Abfiltrieren des ausgefallenen Ν,Ν'-Dicyclohexylharnstoffs wird das Piltrat unter vermindertem Druck zu einem sirupäsen Rückstand eingeengt. Eine Lösung des Rückstands in Äthylacetat wird mit kalter In Salzsäure, V/asser, 1m wässrigem Natriunbiearbonat und Wasser in dieser Reihenfolge gewaschen, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck zu einem Sirup eingedampft. Durch Umkristallisieren des Rückstands aus einer Kischung von Äthylacetat und Isopropylather erhält man '4,58 g N^a-Cbz-N^-BOC-L-Lysin-N-hydroxysuccinimidester als Kristalle vom P. 91 - 94 ⁰C. Diese Substanz wird aus den gleichen Lösungsmitteln zu 4,00g an Kristallen vom P-. 94,5 - 95,5 ⁰C umkrietallisiert.

jTqlJ²¹^ -14,8 ~ 1 ° (c » 1,770, Dioxan)

?1) Herstellung von U^a-Cbz-N -BOC-L-Lysyl-nitro-L-ar/aiinylnitro-L-argininbenzylester (XXXI)

Eine-Lösung von 0,843 g Xitro-L-arginyl-nitro-L-argininbenzylestertrifluoracGtat in 10 ml 90 ?6-igem Tetrahydrofuran wird mit 0,38 g Triäthylamin versetzt. Die erhaltene Mischung wird mit Eis gekühlt, mit 0,645 g N^a-Cbz-N£-B0C-L-Ly8in-N-hydroxysuccinimidester vermischt, in einem Kühlschrank über '^"acht, stehen gelassen und unter vermindertem Druck

909886/1693 .

BAD ORIGINAL

eingedampft. Eine lösung des Rückstands in einer Mischung aus n-Butanol, Äthylacetat und Wasser ( 3 '· 2 : 1) wird mit kalter 1 η Salzsäure, Wasser, 5 #-igem wässrigem Natriumbicarbonat und Wasser in dieser Reihenfolge gewaschen, mit Natriumchlorid gesättigt, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet undunter vermindertem Druck zu einer gelatinösen Substanz eingedampft. Durch .Umkristallisieren der gelatinösen Substanz aus Acetonitril werden 0,88 g N^a-Cbz-N ^-30C-L-Lysyl-nitro-L-arginal-nitro-L-argininbenzylester als amorpher Feststoff erhalten.

£aj ^⁴ · -20,3 ΐ 1° (c = 2,112, Methanol)

32) Herstellung von N^-BOC-L-Lysyl-L-arginyl-L-arginin-

diacetat (XXXII) · '

Eine Lösung von 0,740 g N^a-Cbz-N^f-BOC-L-l.yeyl-nitro- ^r L-arginyl-nitro-L-argininbenzylester in 90 jfc-iger Essigsäure wird mit Palladium-Schwarz-Katalysatör versetzt, und die erhaltene Mischung wird im Wasserstoff-;_ strom 6,5 Stunden geschüttelt. Man filtriert den Katalysator ab und engt das Piltrat unter vermindertem Druck zu einem sirupösen Rückstand ein. Durch Lyophilisieren des Rückstands werden 0,57 g N^-BOC-L-Lyayl-arginyi-L-arginindiacetat als farbloses Pulver gewonnen.

Cv-J^ +5,3 I 1 ° (c » 2.132, 50 #-ige Essigsäure) .

909186/ Ϊ·9-3

33) Herstellung von

-N ^-BOC-L-lysyl-L-arginyl-L-arginin-

acetat (XXXIII)

Eine Lösung von 0,876 g N^Cbz-H^-BOC-L-Lysyl-L-prolyl-L-valyl-glycyl-IiI⁸-BOC-L-lysinhydrazld in 10 ml 90 #-igem Tetrahydrofuran wird mit einer Mischung aus Eis und Kochsalz gekühlt und mit 2,5 ml kalter 1n Salzsäure und kaltem 2m Hatriumbisulfit vermischt. Nach 5 Minuten wird die Reaktioßsmischung mit 0,35 ml Triethylamin'neutr,al,isiert^v, ' .-··' wodurch man N^a-Cbz-N%OG-L-Lysyl-L-^roi'^-L-vÄlyi-gly^yl·-'"' ■">■■-N^-BÖC-L-lysinazid erhält. Diese Substanz wird mit einer Lösung von 0,527 g N^-BOC-L-Lysyl-L-arginyl-L-arginindiacetat in einer Mischung aus 0,21 ml Triethylamin, 1,5 ml Wasser und 6,0 ml Tetrahydrofuran versetzt, und die erhaltene Mischung wird bei 0-4 ⁰C 5& Stunden gerührt. Die Reaktionsmischung wird zur Entfernung des Lösungsmittels unter vermindertem Druck eingeengt, und eine Lösung des Rückstands in In-Essigsäure wird viermal mit A' thy Iac e tat ausgeschüttelt. Die Äthylacetatextrakte werden vereinigt und auf etwa 20 ml eingeengt. Die erhaltene konzentrierte Lösung wird viermal mit 1n Essigsäure extrahiert. Die vereinigten Έβsigsäureextrakte werden bei 40 - 45 ⁰G unter vermindertem Druck auf etwa TO ml eingeengt."Die erhaltene wässrige Lösung wird viermal mit wässrigem n-Butanol ausgeschüttelt. Die Butanolextrakte werden vereinigt, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und bei 40-45 ⁰C unter vermindertem Druck zu einem schaumigen Rückstand eingedampft. Durch Lyophilisltren dee Rücketanda erhält man 0,587 g N^α-Obz-N^ί-BOO-Iι-L·yβyl-I-prolyl-L- ^ valyl-glycyl-N^-BOC-L-lyeyl-L-arginyl-I-ftgininAceiat al· farbloses Pulver. , . . , ü

²lⁱ⁵ -46,1 t 2 ° (o - 1,044, 50 *-ige; Essigsäure)

909886/1693

34) Herstellung; von H^-BOC-L-Lysyl-L-prolyl-L-valyl-glycylfrl^-BQC-L-lysyl-N^-BOC-L-'-lysyl-L-arginyl-L-argininacetat

(XXXIV)

Eine Lösung von 0,300 g N^Cbz-N^-BOC-L-Lysyl-L-prolyl-L-valyl-glycyl-N^-BOC-L-lysyl-N^-BOC-L-lysyl-L-arginyl-L-argininacetat in 90 #-iger Essigsäure wird mit -falladium-Schwarz-Katalysator versetzt und in üblicher V/eise im Wasserstoffstrom geschüttelt. Nach Abfiltrieren des Kataly-■ sators und Einengen des Filtrats bei 40-45 C unter vermindertem Druck wird der Rückstand viermal mit wässrigem Butanol extrahiert. Die Butanollösungen werden vereinigt, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und bei 40 45 ⁰C unter vermindertem Druck eingedampft. Durch Lyophilisieren des Rückstands erhält man 0,275 g N^-BOC-L-Lysyl-L-prolyl-L-valyl-glycyl-N^-BOC-L-lysyl-N^-BOC-L-lysyl-L-arginyl-L-argininacetat".

Cu-J ²I'⁵ - 41,6 t 2 °(c» 1,007,50^-ige Essigsäure)

35) Herstellung von BOO-L-Seryl-L-tyroByl-L-seryl-L-methionyl- γ-tert.-butyl-L-glutamyl-L-hi8tidyl-LτP'henyl·-alanyl·-ίί-argl-^■*- ■ ' ·nyl-L-tryptophyl-glycindihV'drat--:'<XXXV)- '^:-'^''ii»i'; '■ '■-*■'"^:

Eine Lösung von 0,685 g BOC-L-Seryl-L-tyrosyl-it-e^ryl-L-methioninhydryzid in J,5 ml warmem Dimethylformemld- wird
nach Abkühlen mit 1,8 ml kalter 1n Salzeänre^iind 0^66 ίλΧ " S , 1m Natriumnitrit versetzt. 4 Minuten apater.Wird die.er- *" * haltene Mischung mit 20 ml einer geeät.±I*gten .Salzlöiung yea>·. " mischt. Man extrahiert den Niederschlag mit Xthylacetat,
trocknet die Äthylacetatschicht über wasaerfreiem .Natriumsulfat und dampft bei einer Bad temperatur von 5 - 10--°cf das Lösungsmittel ab, wodurch man BOC-L-Seryl^L-tyrosyl— Irseryl-L-methioninazid erhält. Zu einer Lösung dieses

909886/te4.3

in einer Mischung aus Äthylacetat und Dimethylformamid gibt man 0,750 g γ-tert.-Butyl-L-glutamyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophyl-glycin-und läßt die erhaltene Mischung bei 0 - 4 ?C 44 Stunden reagieren.. Die Reaktionsmischung wird mit 0,75 ml Essigsäure versetzt und in kaltes Äthylacetat gegossen. Die in einer Menge von 1,041 g ausgefallene Substanz wird abfiltriert und aus einer Mischung von Dimethylformamid und Methanol zu 0,9.10 g reiner Kristalle von BOC-L-Seryl-L-tyrosyl-L-seryl-L-methionyl-γ-tert.-butyl-L-glutamyl-L-hiatidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophyl-glycindihydrat umkristallisiert, die sich bei 202 ⁰C zersetzen.

²J -13,2 ± 2° ( c = 1,045, Dimethylformamid)

36) Herstellung von L-Seryl-L^tyrosyl-L-aeryl-Lrinethionyl-lglutamyl-L-hietidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophyl-Αΐγο.ν_1-Ι-1γβγ1-Ιι-ρΓθ1χ1-Ιτ·νβΐ7ΐ-1-8ΐχογ1-Ι-ΐ3Γ·3Γΐ-1ι-1γβ7ΐ-Ι·- arginyl-L-arginin (^α1"⁸-ACTH-OH) (XXXVI)

Eine Lösung von 0,174 g BOO-L-Seryl-L-tyroeyl-L-eeryl-L-methionyl-Y-tert.-butyl-L-glutamyl-L-hietidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophyl-Glycinhydrochlorid und 0,069 g N-Hydroxysuccinimid irj Dimethylformamid wird mit 0,099 g NfN'-Dicyclohexylcarbodiimid versetzt. Die erhaltene Mischung läßt man zu dem aktiven BOC-Ir-Seryl-L-tyroßyl-L-seryl-ii-methionyl-Y-tert.-butyl-L-glutamyl-Ir-hietidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophyl-glycin-N-hydroxy-euccinimidesterhydrcchlorid reagieren. Eine Lösung von 0,325 g dieses aktiven Esters und von 0,288 g N^£-BOC-L-Lyayl-L-propyl-L-valyl-glycyl-N^-BOC-L-lysyl-N^-BOC-L-lyeyl-L-arginyl-L-argininacetat in 90 ?t-igem Pyridin läßt man" 40 Stunden bei 0 - 4 ⁰C reagieren. Man gießt die.^eaktione-

9098 86/169 3

* BAD

mischung in Äthylacetat, behandelt den erhaltenen Niederschlag mit Kationenaustauscherharz (Amberlite CG-4B; Essigsäuretyp) in 50 $-igem t-Butanol und versetzt die erhaltene Lösung mit 0,8 ml 1m Mercaptoäthanol. Man läßt ? die Mischung bei 7 ⁰C über Nacht stehen und leitet sie dann durch einen Carboxymethylcellulosekolonne, wobei die in < Fig. 1 dargestellten Ergebnisse, erhalten werden. Die Teiledes Maximums II (Reagensglas Nr. 126-185) werden geeammelt und lyophilisiert. Die lyophilisierte Substanz wird auf eine frische Carboxymethylcellulosekolonne aufgegeben und unter konstanten Bedingungen entwickelt, wobei die in Pig. 2 dargestellte Eluierkurve erhalten wird.. Die Anteile von. Reagensglas Nr. 91-140 in Fig. .2 werden geeammelt und lyophilisiert. Durch Behandeln der erhaltenen Substanz mit Trifluoressigsäure erhält man L-Seryl-L-tyroayl-L-eeryl-

L-methionyl-L-glutamyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophyl-glycyl-L-lyayl-L-prolyl-L-valyl-L-

1 1 ft

glycyl-L-lysyl-L-lysyl-L-arginyl-L-arginin (α.· " -ACTH-OH). Diese Substanz wird an Carboxymethylcelluloee chromatographiert und mit 0,25 m Ammoniumacetat (pH 6,70) bia 0,40 mm Ammoniumacetat (pH 8,00) eluiert. Wie aus Fig..> zu-er-' sehen ist, wird dabei ein einzigea Maximum erhalten.

Beispiel 2 ■

1) Herstellung von Carbobenzoxy-nitro-L-argininamid ,l·

(XXVIII«) ■ , ■ ■ " . {

17,67 g (0,05.Mol) CarbobenEoxy-nitro-L-arginin und £ 13,1 ml (0,055 Mol) Tri-n-butylamin werden in 130 Bl jS^: wasserfreiem Tetrahydrofuran gelöst. Diese Lösung wird H unter Kühlen mit einem EisAochealzbad tropfenweise mit.. 5,3 ml (0,055 Mol) Äthylchlorformiat veraetzt. Nach 5 10 Minuten werden 9|6 ml wässriges 28 #-igea Ammoniak zugegeben, und die Mischung wird 2 Stunden bei 0 ⁰C ge- >

90 98 86/16 93 ^;

BAD

rührt. Der gebildete Niederschlag wird abfiltriert, mit Tetrahydrofuran und Äther gewaschen und im Valckum getrocknet, wodurch 19,31 g Rohprodukt erhalten werden. Das Rohprodukt wird aus wässrigem Äthanol zu 14,26 g( 80,9 %) XXVIII* vom P. 217 - 219 ⁰C kristallisiert.'

/Γα J ²^ + 4,9 i · 1 °( C= 1,946, Dimethylformamid) 2) Herstellung von Nitro-L-argininamidhydrobromid ( XXIX*)

1,06 g XXVIII* werden mit 8 g von 40 Gewichts-^ Bromwasserstoff enthaltender Essigsäure versetzt. Die Mischung wird 30 Minuten bei Zimmertemperatur stehen gelassen und dann mit 30 ml wasserfreiem Äther versetzt.Der erhaltene Niederschlag wird abfiltriert, mit wasserfreiem Äther gewaschen und getrocknet, wodurch 1,18 g des Dihydrobromids als hygroskopisches Pulver erhalten werden, die· durch Umkristallisieren aus wässrigem Äthanol in 0,764 g (85,2 #) des Monohydrobromids vom F-.'. 237 - 239 ⁰C übergeführt >.| werden.

²% +13,7 +0,5° ( c = 2,550, Wasser)

Rf =0,38 - .0,39 (BAPW).

-3) Herstellung von Oarbobenzoxy-nitro-Ii-arginyl-nltro-L-

argininamid (XXX^f) ;

7,07 g (Ο,02 Mol) Garbobenzoxy-nitro-I-arginin werdüa in Tetrahydrofuranlösung nach.der gleiQhen Arbeitsweise, wie sie für die Herstellung von Verbindung XXVIII* angewandt wurde, in das gemischte Anhydrid übergeführt» Nach 20 Minuten wird eine eiskalte Lösung von'5,99 g (0,02 Mol) ■

909886/1991 j

BAD OFUGlNAL

XXIX* und 4,77 ml (0,02 Mol) Tri-n-Butylamin in 20 ml Y/asser und HO ml Dioxa^ zugegeben, und die Mischung wird 2 Stunden bei 0 ⁰C gerührt. Der ausgefallene Niederschlag wird .abfiltriert, mit Dioxan und Äther gewaschen und im Vakuum getrocknet, wodurch man 13,2 g (92,1 i») des rohen Dipeptidamids vom F. 116 - 119 ⁰C gewinnt. Durch Umkristallisieren aus heißem Dimethylformamid erhält man 9,49 g (66,1 JS) feine Nadeln vom P. 115 - 115,5 ⁰C, die offenbar mit 2 Molekülen Dimethylformamid kristallisieren.

jTclJ ²^ -6,2 + 1 ° (c =2,165, 50 #-ige Essigsäure)

gefunden: C 43,40; H 6,75ί Ν 25,42.

berechnet für G₂₀H₃₁N_{1 t}0q.2HC0N(CHj)₂H₂Oj C 43,51; H-6,60 ;

N 25,37 5*.

4) Herstellung von Nitroarginyl-nitroargininamid-hydrobromld

5,74 g (8,0 mMol) Verbindung XXX») werden mit 70 g von Gewichts-^ Bromwasserstoff enthaltender Essigsäure versetzt. Die Mischung wird bei Zimmertemperatur 40 Minulfen lang stehengelassen und dann mit 150 ml wasserfreiem . Äther versetzt. Der stark hygroskopische Niederschlag wird aus wässrigem Äthanol erneut abgeschieden. Man erhält „

4,21 g (96,4 i») Produkt.yom ?v;HT>-J56-'.^o0.j(*2ers,),.' *.', .'

^^%1* + H,1 i 1 ° (c » 2_t0ü6,Wa»ser). Rf * 0,33 (BAPW). ."-.;- .

-«- 1543682

5), Herstellung von N -Carbobenzoxy-N^-lSutyloxycarbonyl-l·- lysyl-nitro-L-arginyl-nltroargininamid (XXXII*) über den

N-HydroxyBucclnlmidester

Sine Lösung von 1,41 g (2,5 mMol) Verbindimg XXXI* und 1,16 ml (6,25 mMol) Tri-n-Bütylamin in einer Mischung aus 3,5 DJl Wasser und 9 ml Ie tr ahydro furan wird mit 1,19 g (2,5 mMol) dee N-Hydroxysuccinimid-Esters von N^a-Carbobenzoxy-N^-zOutyloxycarbonyl-L-lySin (XXX) versetzt. Man laßt die Mischung 4 Stunden bei Zimmertemperatur stehen, entfernt das lösungsmittel durch Verdampfen im Vakuum und löst den Rückstand in einer Mischung aus Wasser, n-Butanol und Äthylacetat (2 : 1 ι 2), Die organische Phase wird nacheinander mit eiskalter Vn Salzsäure, Wasser und 1m Natriumbicarbonat gewaschen und über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet. Nach Verdampfen dee Lösungsmittels wird der sirupöse Rückstand in heißem n-Butanol gelöst. Daa geschützte Tripeptid, das eich beim Abkühlen abscheidet, wird abfiltriert, mit kaltem n-Butanol und Äther gewaschen und getrocknet. Man erhält 1,75 g (87,4 fi) Produkt, das nach Umkristallisieren aus heißem n-Butanol 1 ,44 g (71 »8 J^) reines Material vom P. 111 - 114 ⁰C liefert. . ^v-

/ά_7 ²^»⁵ -15,4 ± 1 ° (c - 2,092, Methanol) ;i

Rf « 0,45 Kieeeleäuregel Ö, Methanol-XthylAcetrt (25:75).·

Nach dem gemischten Anhydridverfahren; · · -

Eine Lösung von N^a-Carbobenzoxy-H*-JButyloxyoarbonyl-L-iyein (hergestellt aus 1,12 g des Dicyolohexylaiainealaee) und 0,48 ml Tri-n-butylamin. in 10 ml wasserfreiem Tetrahydrofuran wird bei Eis/Kochsalzbadtemperatur (etwa -10 ⁰C)

909t86/16Ö3

BAD ORIGINAL

mit 0,19 ml Xthylclilorformiat versetzt. Die Mischung wird 15 Minuten lang gerührt und dann mit einer Lösung . von Nitroarginyl-nitroargininamidhydrobromid und 0,57 ml Tri-n-butylamin in 2 ml Wasser und 14 ml Tetrahydrofuran versetzt." Die Reaktionsmöchung wird eine Stunde bei O⁰O gerührt und dann 3 Stunden bei Zimmertemperatur stehen gelassen. Der nach Verdampfen des Lösungsmittel im Vakkum erhaltene sirupöse Rückstand wird mit 5 ml n-Butanol, "= 10 ml Äthylacetat und 5 ml Wasser versetzt. Die wässrige Phase wird zweimal mit n-Butanol/Äthylacetat (1:2 )extrahiert. Die organischen Extrakte werden vereinigt, nacheinander mit eiskalter 1n Salzsäure, 1m Natriumbicar-' Ί bonat und Wasser gewaschen, rasch über wasserfreien Na-, triumsulfat getrocknet und bei 40- 50 ⁰C im Vakuum eingedampft. Umkristallisieren des Rückstands aus heißem '■' n-Butanol liefert 1,05 g (65,6 #) des gewünschten Tri- t peptits vom P. 110 - 120 ⁰C' . . * · _rtJ;.

C*J ²J'⁵ - ¹5.5 ii°(c - 2,046,;üetÄanol) 'fr'

Das Produkt erweist sich bei der DUnnechichtchromatographle als homogen. _; 'l·

6) Herstellung von N^-fffutyloxycarbonyl-L-lyByl-L-arginyl-l·- argininamid-triacetat (XXXIII«)

1,00 g Verbindung XXXII* in 90 £-iger Besigeäure werden in Gegenwart eines Palladiumkatalyeatore bei Zimmer- \ temperatur und Atmosphärendruck 5 Stunden lang hydriert. Nach Abfiltrieren des Katalyeatore wird daβ Piltrat ttttt#T vermindertem Druck eingeengt. Durch Lyophilieieren de· Rücketands erhält man 0,913 g einee farblosen Pulver·.

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1543862

Bei Papierchromatographie tritt mit Ninhydrin- und Sakaguchireagens bei R'f ~ 0,51 (BAPW) ein einziger Fleck auf.

+ 2,7 + 2. ° (c = 1,318, 50 #-ige Essigsäure)

· 7) Herstellung von N^g-Obz-N^g-tert.-

L-valyl-glycyl-N^g-tert.-B0C-L-lyflyl-N^£-tert..-B00-L-lv8yl-^ arginyl-L-argininamidtriacetat (XXXIV») i ■

Eine lösung von 1,313 g K^a-Cbz-N^£-tert.-BOC-L-Lysyl-L-prolyl-L'-valyl-glycyl-N -tert.-BOG-L-lysinhydrazid in 1O ml 90 $-igem Tetrahydrofuran wird mit einer Mischung von Eis und Natriumchlorid gekühlt und mit kalter- Tn Salzsäure und kalten2m Natriumbiaulfit. vermiecht·. Nach 5 Minuten wird die Reaktionsmiechung mit Triäthylamin neutralisiert, wodurch man N^a-Cbz-N^-tert.-BOC-L-Lysyl-Ir-prolyl*" L-valyl-glycyl-N^s-tert.-BOC-L-lyeina«id «rhält. Diese Substanz wird mit einer Lösung von 0,756 g lf^-tept.-BOC-L-Lysyl-L-arginyl-L-argininamidtriacetat in einer Miechung au· 0,21 ml Triethylamin, Wasser und Tatrahydrofuran vereetat. und die erhaltene Mischung wird 40 Stunden bei 0 bie A ⁰O gerührt. Man engt die Reaktionemi»chung zur Entfernung dee Lösungsmittels unter vermindertem Druck ein und schüttelt., eine Lösung des Rückstände, in 1n Essigsäure viermal mit Äthylacetat aus. Die erhaltene konzentrierte Lösung wird' viermal mit 1n Essigsäure extrahiert. Die Essigsäure ex-,* trakte werden vereinigt· und bei 40 bis 45 ⁰C unter ver-·?]. mindertem Druck eingeengt» Die erhalten* wässrig» Lösung wird viermal mit wässrigem n-Butfc&ol ausgeschüttelt. Die Butanolschichten werden vereinigt, über.wasserfreien Ha*.. triumsulfat getrocknet und bei 40 bis 45 ⁰C unter ver- 'k' mi ridertem Druck zu einem schaumigen Rückstand.eingedampft.

909886/1693 {''

BAD ORIGINAL

Durch. Lyophilisieren des Rückstands wer.den 1,292 g l^-Cbz-ii^-tert.-BOC-L-Lysyl-L-prolyl-L-valyl-glycyl-Νί-tert.-BOC-L-lysyl-L-arginyl-L-argininamid als 7,5-Hy;· drat erhalten. /?

/"^a_7 ²S'⁵ - 43,7 - 1 ° (ο ■ 1,745, 50 #-ige Eaeigsäure)

8) Herstellung von N'-tert.-BOC-L-Lysyl-L-prolyl-L-valylglycyl-N^ε-tert.-BOC-L-lysyl-N ^£-tert.-BOC-L-lysyl-L-arginyl-

L-arginin-amidtriacetat (XXXIV»)

Eine Lösung von 0,300 g N^a-Cbz-N^-tert.-BOC-L-lysylprolyl~L-valyl-glycyl-N^£-tert.-BOC-L-lysyl-N^&-tert.-BOC-L-lysyl-L-arginyl-L-agininamid in 90 #-iger Essigsäure wird mit Palladiumschwarzkatalysator versetzt und die erhaltene Mischung wird in Üblicher Weise im tfasserstoffatrom geschüttelt. Nach Abfiltrieren dee Katalysators wird das Piltrat unter vermindertem Druck bei 40 bis 45 ⁰C eingeengt. Der Rückstand wird viermal mit wässrigem Butanol ex- V träniert. Die Butanolösungen werden vereinigt, über wasser freiem Natriumsulfat getrocknet und bei 40 bis 45 ⁰C unter. vermindertem Druck eingedampft. Nach Lyophilisieren des Rückstands werden 0,275 g N^-tert.-BOC-L-Lysyl-Ir-prolyi-L-valyl-glycyl-N^-tert.-BOC-L-lyeyl-N ^-tert.-BOC-l-lysyl-L-arginyl-L-argininamidtriao«\at erhalten. _; .'.-■■<

Co-J ²J -41,0 J 2 ° (o « 1,210^, 50 ji-ige Essigsäure)

9) Herstellung von L-Seryl-L-tyrosyl-I-eeryl-i-netliionyl-L-glutamyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophylglycyl-L-lysyl-L-prolyl-L-valyl-L-glyoyl-L-lysyl-l-lyeyl-L-arginyl-L-argininamidhexaaoetat (ajuiVI») *3

Eine Lösung von 0,174 g tert.-BOO-L-Seryl-L-tryrosyl-L·-! · seryl-E-methionyl-Y-tert.-butyl-L-glutamyl-L-histidyl-·

909886/1693 .,. ■;:

BAD

L-phenylalanyl-Ir-arginyl-L-tryptophyl-glycinhydrochlorid · und 0,069 g N-Hydroxysuccinimid in Dimethylformamid wird mit 0,099 g NjlJ'-Dicyclohexylcarbodiimid versetzt μηά die erhaltene Mischung wird reagieren gelassen, wodurch das aktive tert.-BOC-L-Seryl-L-tyrosyl-L-seryl-L-methionyl-γ-tert.-Butyl-L-glutamyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophyl-glycin-N-hydroxysuccinimidesterhydrochlorid erhalten wird. Eine Lösung von 0,753 g dieses aktiven Esters und von 0,370 g N^-tert.-BQC-L-Lysyl-L-prolyl-L- · valyl-glycyl-Ii^-tert.-BOC-L-lysyl-N^-tert.-BOC-L-lysyl-L-arginyi-L-argininamidtriacetat in 10 ml 90 #-igem Pyridin wird bei 0 bis 4 ⁰C 40 Stunden lang reagieren gelassen. Die Reaktionsmischung wird in 250 ml kaltes Äthylacetat gegossen, der erhaltene Niederschlag filtriert und mit Äthylacetat gewaschen. Auf diese Weise erhält man BOC-L-Seryl-L-tyrosyl-Ir-seryl-Ir-methionyiAtert.-butyl-L-glutaniyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophylglycyl-lÄBOC-L-lysyl-L-prolyl-L-Talyl-glycyl-li-JpC-L-lyeylh-BOC-L-lysyl-L-arginyl-L-argininainidtriacetat..

Sine Lösung von 1,119 g dieses Triacetats in 25 ml 50 ji-igem tert.-Butanol wird mit 8 ml Kationenaustauscherharz (Ambelite CG-4B; Essigsäuretyp) versetzt, und die erhaltene Mischung wiyd bei Zimmertemperatur 40 Minuten lang gerührt. Nach Abfiltrieren des Harzes vermischt man da* JiI-trat mit 1,25 ml 1m Mercaptoäthanol. i)ie erhaltene Mischung läßt man 2Ö Stunden bei 37 ⁰C stehen und leitet sie dann durch eine Carboxymethylcellulosekolonne, wobei die in Fig. 4 dargestellten Ergebnisse erhalten werden. Die Anteile der Praktion'II (Reagensglae Nr».?6-10O^ in Pig. werden gesammelt, eingeengt und Iyophilleierb>-Pfte in "einer Menge von 0,145 g erhaltene geschützte Ootadecapöptidamid wird in einer Lösung aus 0,2 ml Wasser und 1,8 ml Trifluoressigsäure aufgelöst und 6G Minuten^bei Zimmertemperatur

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BAD ORJGiNAt

stehen gelassen. Man engt-die ^eaktionsmiBchung zur Entfernung dea Lösungsmittels unter vermindertem Druck ein und behandelt den Rückstand mit Kationenaustauecherharz; (Amberlite CG--4B; Essigsäuretyp). Die erhaltene'Lösung leitet man durch eine Carboxymethylcellulosekolonne, wobei die in Pig. 5 dargestellten Ergebnisse erhalten werden. Die. Anteile der Hauptmaxima j(JReagensglas Nr. 126 - 200) in '.;■ Pig. 5 werden gesammelt und lyophilisiert, wodurch man 75 mg L-Seryl-L-tyrosyl-L-seryl-L-methionyl-L-glutamyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl-L-itryptophyl-glycyl-L-lysyl-L-prolyl-L-valyl-glycyl-L-lysyl-L-lyeyl-Ir-ar^inyl-L-argininaaidhexaace tat ,erhält.

χ n/1 ONaOH » 281,5'iga (€■ 6870) ^/vmax 288,5 ifa (ε- 6660)

fa J ²J -55,8 + 4° (c = 0,493, 0,1 η Essigsäure)

ÖQ9ISS/1893

Claims (5)

1. * P at en ta ns ρ r Ü ο h e

   . 1. Verfahren zur Herstellung eines Polypeptide, dadurch • gekennzeichnet, daß man ein Octadecapeptid der Formel 1-Seryl-L-tyrosyl-L-seryl-L-methionyl-L-glutamyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl-I-tryptOphyl-glycyl-L-lysyl-L-prolyl-L-valyl-glycyl-L-lysyl-L-lysyl-L-arginyl-L-arginin herstellt. ·
2. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man aus der Verbindung tert.-Butyloxycarbonyl-L-seryl-L-tyrosyl-L-seryl-L-methionyl-tert.-butyl-I-glutamyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl-Ii-tryptophyl-glycyl-N^-tert.-butyloxycarbonyl-L-lysyl-L-prolyl-L-valylglycyl-N£-tert.-butyloxycarbonyl-L-lysyl-N^-tert.-butyloxycarbonyl-L-lysyl-L-arginyl-L-arginin sämtliche Schutzgruppen in einer oder mehreren Stufen entfernt.
3. 3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet_fc daß man tert.-Butyloxycarbonyl-Ir-8eryl-Li_<1iyroβyJL->L·^sβryl·^·. L-met'hioninazid. mit Y-tert^^Butyi-I^l4iiamyl*Jtehid^~^ dyl-L-phenylalanyl-I-arginyl-L-tryptophyl-giycin kondensiert, das erhaltene Produkt in den tert.-Butyloxycarbonyl-L-seryl-L-tyrosyl-L-methionyl-γ-tert.-buty1-L-glutamyl-I-histidyl-L-phenylalanyl-Ii-arginyl-I»-tryptophyl-glycin-N-hydroxysuccinimideeter Überführt und mit , N^-tert.-Butyloxycarbonyl-L-lyByl-Ir-prolyl-L-valyl-gly- · cyl-üi ^-tert.-bu tyloxycarbonyl-lH.lyeyl-N^£-tert.-butyloxycarbonyl-L-lysyl-Ir-arginyl-L-arginin, dae aus N^- tert.-Butyloxycarbonyl-L-lysyl-L-Ärginyl-I-arginin und N^a-Carbobenzoxy-N^-tert.-butyloxycarbonyl-L-lyeyl-L- prolyl-L-valyl-glycyl-N^-tert.-butylorycarbonyl-L-lyeina« zid hergestellt let, kondensiert und in »inem sauren ■. Medium aus dem erhaltenen geschützten Ootadecapeptld

   SQ9il5/1693

   _0R1G,_NAL

   tert.-Butyloxycarbonyl-L-aeryl-L-rtyroeyl-Lfseryl-L^ *' ionyltertbutyli^glütamylLh^s''^^

   alanyl-L-arginyl-L-tryptophyl-glycyl-N -tert.-butyloxy carbonyl-L-ly syl-Ir-prolyl-L-valyl-glycyl-N^Ä-tert. butylox-ycarboriyl-L-lysyl-N^-tert.-butyloxycarbonyl-Ir-lysyl-L-arginyl-L-ärginin sämtliche Schutzgruppen in einer oder mehreren Stufen entfernt.
4. 4. Abänderung des Verfahrens nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man tert.-Butyloxycarbonyl-L-seryl-L-tyrosyl-L-seryl-L-methioninazid., mit tert.-Butyl-L-glutamyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophyl-glycin kondensiert, das erhaltene Produkt in den tert. -Butyloxycarbonyl-Ir-seryl-L-tyrosyl-L-seryl-L-methionyl-Y-tert.-butyl-L-glutämyl-L-hietidyl-L-' phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophyl-glycin-N-hydroxysuccinimidester überführt und mit N^-tert.-Butyi.oxycarbonyl-L-lysy1-L-prolyl-L-valyl-glycyl-N ^-tert.-butyloxycarbonyl-L-lysyl-N ^-tert.-butyloxycarbonyl-L-lysyl-L-arginyl-Ir-argininamid kondensiert! wobei man das Fragment N^-tert.-Butyloxycarbonyl-L-lysyl-L-arginyl-L-argininamid durch stufenweise Umsetzung von Nitro-L-argininamid zuerst mit Carbobenzoxy-nitro-L-arginin und dann mit N^Carbobenzoxy-N^-tert.-butyloxycarbonyl-L-lysin herstellt, und in einem sauren Medium aus dem erhaltenen geschützten Octädecapeptidamid tert.-Butyloxy-carbonyl-L-seryl-L-tyrosyl-L-Tfleryl-L-methionyltert.-butyl-L-glutamyl-L-histidyl-L-phenyl-alanyl-L-arginyl-L-tryp tophyl-glycyl-N^-tert .-liu-tyloay-carbonyl-L-lysyl-L-prolyl-L-valyl-glycyl-NCteriT-butyloxycarbonyl-L-lysyl-N^-tert.-butyloxycarbonyl-L-lyeyl-l-arginyl-L-argininamid sämtliche- Schutzgruppen in einer oder V' ■ mehreren Stufen entfernt. * t

   909886/1693 ^BAD

   1543182
5. 5. L-Seryl-L-tyrosyl-Ir-seryl-L-methioriyl-L-glutainyl-

   L-hi stidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl-Ir-tryptophyl-glycyl-L-lysyl-I-prolyl-L-valyl-glycyl-L-lysyl-L-lysyl-I-arginyl-Ii-arginin und seine Säureadditionssalze.

   Ή •■a·

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   BAD ORlG»NAt

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