DE1518300C

DE1518300C - Ein neues Hendekapeptid, seine pharmazeutisch verwendbaren Salze und ein Verfahren zu seiner Herstellung

Info

Publication number: DE1518300C
Authority: DE
Inventors: Luigi; Bosisio Germano; Castiglione Roberto de; Goffredo Onofrio; Mailand Bernardi (Italien)
Original assignee: Farmaceutici Italia SpA
Current assignee: Pfizer Italia SRL
Publication date: 1972-10-05

Description

mit einer Schutzgruppe blockiert sind, wie z. B. mit der Carbobenzoxygruppe, wird mit Glycin-äthylestefhydrochlorid kondensiert. Die besagte Kondensation wird in Gegenwart eines Kondensationsmittels, wie Dicyclohexylcarbodiimid, ausgeführt, wobei das geschützte Dipeptid Di-carbobenzoxy-L-tyrosyl-glycinäthylester (I) erhalten wird, dessen Carbobenzoxygruppen dann durch Behandlung mit wasserfreiem Bromwasserstoff in Eisessig abgespaltet werden. Das so erhaltene Dipeptid L-Tyrosyl-glycin-äthyl-ester wird mit einem geschützten Derivat des Phenylalanine, wie z. B. Carbo-t-butoxy-L-phenylalanin, kondensiert, wobei ein geschütztes Derivat des L-Phenylalanyl-L-tyrosylglycin, wie z. B. Carbo-t.butoxy-L-phenylalanyl-L-tyrosyl-glycin-äthyl-ester (II), erhalten wird, dessen Estergruppe dann selektiv mit einem Alkali, wie verdünntem Natrium- oder Kaliumhydroxyd, zur freien Carboxyl- , gruppe verseift wird.

Das so erhaltene Produkt, d. h. das Carbo-t-butoxy-L-phenylalanyl-L-tyrosyl-glycin (III), wird mit dem Di- ao peptid L-Leucyl-L-methioninamid kondensiert, wobei ein geschütztes Derivat des L-Phenylalanyl-L-tyrosylglycyl-L-leucyl-L-methioninamids, wie z. B. das Carbot.butoxy - L - phenylalanyl - l - tyrosyl - glycyl - l - leucyl-L-methioninamid (IV), erhalten wird, aus dem durch as Abspaltung der Schutzgruppe durch wasserfreie Halogenwasserstoffsäuren in Eisessig, das erste Zwischenprodukt des erfindungsgemäßen Verfahrens, d. h. das Pentapeptid L-Phenylalanyl-L-tyrosyl-glycyl-L-leucyl-L-methioninamid (V) erhalten wird.

Das neue Hexapeptid L-Pyroglutamyl-L-alanyl-L-aspartyl-L-prolyl-L-asparaginyl-L-lysin kann auf folgende Weise hergestellt werden:

Ein geschütztes Derivat der Asparaginsäure, z. B. die N-Carbobenzoxy-L-asparaginsäure-a-p-nitrophenylj9-t.butyl-ester (VI), wird mit L-Prolin kondensiert, wobei das geschützte Derivat N-Carbobenzoxy-03-t.butyl)-L-aspartyl-L-prolin (VII) erhalten wird, das mit dem geschützten Derivat des Dipeptids L-Asparaginyl-(N⁸-carbo-t.butoxy)-L-lysin-methylester kondensiert wird. Somit wird das geschützte Tetrapeptid N-Carbobenzoxy- (/9-t.butyl) -L-aspartyl-L-prolyl-L-aspara - ginyl (N^s-carbo-t.butoxy)-L-Iysin-methylester (VIII) erhalten, aus dem durch Wasserstoff in Gegenwart eines Palladiumkatalysators,der (/J-t.Butyl)-L-asparty 1-L-prolyl-L-asparaginyl-(N'-carbo-tbutoxy) - L - lysin - methylester gewonnen wird. Dieser wird mit einem geschützten Derivat des Alanins, z. B. Carbobenzoxy-L-alanin-p-nitrophenylester umgesetzt, wobei das geschützte Derivat des L-Alanyl-L-aspartyl-L-prolyl-L-asparaginyl-L-lysins, z. B. der Carbobenzoxy-L-alanyl - (ß - t.butyl) -L- aspartyl - l -prolyl -L- asparaginyl (N³-carbo-t.butoxy)-L-lysin-methylester (IX), erhalten wird. Die Methylestergruppe des Pentapeptids IX wird dann selektiv zur freien Carboxylgruppe mit einem Alkali, wie verdünntem Natrium- oder Kaliumhydroxyd, verseift. Die Carbobenzoxygruppe des Pentapeptids wird dann durch Wasserstoff in Gegenwart eines Palladiumkatalysators abgespaltet, wobei das saure Pentapeptid L-Alanyl-(/3-t.butyl)-L-aspartyl-L-prolyl-L-asparaginyKN'-carbo-t.butoxyJ-L-lysin entsteht, das mit einem geschützten Derivat der Pyroglutaminsäure, z. B. Carbo-t.butoxy-L-pyroglutaminsäure-p-nitro-phenylester, umgesetzt wird, wodurch das geschützte Hexapeptid Carbo-t.butoxy- L-pyroglutamyl- L-alanyl-(/9-t.butyl)-L-aspartyl-L-prolyl-L-asparaginyl-(N^e-carbo-t.butoxy)-L-lysin (X) erhalten wird.

Die Endkondensation zwischen dem Pentapeptid (V) und dem geschützten Hexapeptid (X) führt zu dem geschützten Hendekapeptid Carbo-tbutoxy-L-pyroglutamyl-L-alanyl-(^-t.butyl)-L-aspartyl-L-prolyl-L-asparaginyl-(N"-carbo-t.butoxy)-L-lysyl-L-phenylalanyl-L-tyrosyl-glycyl-L-Ieucyl-L-methioninamid(XI), aus dem dann durch Abspaltung der Schutzgruppen das Hendekapeptid L-Pyroglutamyl-L-alanyl-L-aspartyl-L-prolyl-L-asparaginyl-L-lysyl-L-phenyl-alanyl-L-tyrosylglycyl-L-leucyl-L-methioninamid (XII) in Form des Salzes entsprechend der zur Abspaltung der Schutzgruppen verwendeten Halogenwasserstoffsäure erhalten wird.

Wenn man an Stelle 3er obenerwähnten Schutzgruppen andere vorher angeführte verwendet, erzielt man die gleichen Resultate.

Die verfahrensgemäß hergestellten Verbindungen können in der Therapie von hypertensiven Anfällen oder jedenfalls zur schnellen Behandlung von schweren Anfällen infolge Hypertension, bei krampfartigen Gefäßsyndromen besonders im Oberflächenmuskelbereich (Bürgersche Krankheit, Raynaudsche Krankheit, Ulcera torpida usw.), der Netzhautgefäße (spastische Blindheit durch zentrale Spasmen der Netzhaut), der Hirnhautgefäße (spastische Kopfschmerzen und Migräne) und der Coronargefäße (Anginapectoris-Anfälle) angewendet werden. ,

Das neue Hendekapeptid kann subkutan, intramuskulär, intravenös (Injektion oder Infusion) oder intraarteriell verabreicht werden.

Die geeignetsten Lösungsmittel sind Wasser oder physiologische, nicht alkalische Salzlösungen. Bei subkutaner oder intramuskulärer Verabreichung können den Lösungen absorptionsverzögernde Substanzen beigemischt werden. . .

Der Prozentgehalt an aktiven Bestandteilen kann sich nach den besonderen pharmazeutischen Formen und nach der gewünschten hypotensiven Wirkung ändern, doch ist er gewöhnlich sehr niedrig.

Akute oder chronische Toxizität sind bei der Verabreichung von den besagten Verbindungen nicht bemerkt worden.

Das folgende Beispiel soll die Erfindung erläutern.

In der folgenden Tabelle sind einige Ergebnisse der Vergleichsversuche zwischen dem beanspruchten Hendekapeptid und Bradykinin aufgefüllt, aus denen die überlegenen Eigenschaften des neuen Hendekapeptids ersichtlich sind. Die Versuche sind beim anästhetisierten Hund durchgeführt und die Intraarteriell verabreichten Dosen in g/kg Köpergewicht ausgedrückt worden.

Vergleichbare Wirkung von gefäßerweiternden Arzneimitteln auf die periphere Durchblutung

Kontrolle

beanspruchtes Hendekapeptid, g/kg 10-¹⁴ I 10-" I 10-¹« I 10-'¹

Bradykinin, g/kg 10-»' I 10-'¹ I 10-"·

Durchblutung (Muskelfluß),
ml/Min ,

50

Prozentuelle Veränderung

71

+ 42 92,5
+ 85

113
+ 126

135
+ 170

58
+ 16

73 + 46

Die chromatographischen Analysen, die in den Beispielen angeführt .werden, wurden mit aufsteigendem Verfahren auf Whatmanpapier Nr. 1 mit· dem Lösungsmittelsystemn-Butanol/Essigsäure/Wasser(4:1:1) ausgeführt. Die analytische Angabe wird als Rf-Wert ausgedrückt. In den Beispielen werden außerdem die elektrophoretischen Wanderungskoeffizienten, die mit den in der Literatur bekannten Symbolen ausgedrückt sind, aufgeführt. Zum Beispiel zeigt die Angabe E₁,₉ = 0,905 Leu, daß das geprüfte Polypeptid bei pH 1,9 mit einer Geschwindigkeit, die 0,905mal jener des gleich 1 festgesetzten Leucins ist, wandert.

Beispiel

Carbo-t.butoxy-L-pyroglutamyl-L-alanyl- ¹S

(/3-t.butyl)-L-aspartyl-L-prolyl-L-asparaginyl-(N^£-carbo-t.butoxy)-L-lysyl-L-phenylalanyl-L-tyrosyl-glycyl-L-leucyl-L-methioninmaid (XI)

Herstellung des ersten Zwischenproduktes

L-Phenylalanyl-L-tyrosyl-glycyl-L-leucyl-L-me-

thioninamids (V)

Zu einer Lösung von 9 g Di-carbobenzoxy-L-tyrosin in 70 ml Methylenchlorid werden bei 0⁰C 2,8 g GlycinäthyUesterhydrochlorid, 2,02 g Triäthylamin und 4,12g as Dicyclohexylcarbodümid zugefügt. Das Gemisch wird bei Raumtemperatur über Nacht sich selbst überlassen, worauf es filtriert wird. Das Filtrat wird dann in einem Scheidetrichter mit einer 5°/_oigen Zitronensäurelösung und hierauf mit einer 5°/_oigen Natriumbikarbonatlösung gewaschen. Die Dichlormethanschnicht wird über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und zur Trockene eingedampft. Durch Umkristallisieren des Rückstandes aus Äthanol werden 8,5 g Di-carbobenzoxy-L-tyrosyl-glycin-äthyl-ester (I) erhalten, der bei 165 bis 166°C schmilzt; [a]*_D° = -24,5°C (c = 0,5 in Dimethylformamid).

8,7 g des Produktes I werden in 50 ml einer 32°/_oigen wasserfreien Bromwasserstofflösung in Eisessig gelöst. Das Reaktionsgemisch wird 2 Stunden bei Raumtemperatur sich selbst überlassen und hierauf in Vakuum zur Trockene _eingedampft. Der Rückstand wird mit wasserfreiem Äthyläther behandelt und dann in 70 ml Dimethylformamid (Lösung A) gelöst. Dann wird die folgende Lösung (Lösung B) hergestellt: 4,3 g Carbo-t.butoxy-L-phenylalanin werden in 40 ml wasserfreiem Tetrahydrofuran gelöst, worauf dann bei — 10⁰C 3,03 g Tributylamin und 1,78 g Chlorameisensäureäthylester zugetropft werden und die Lösung 30 min stehengelassen wird. Die beiden Lösungen werden auf —10° C abgekühlt, und die Lösung A wird zu der Lösung B zugefügt. Schließlich wird das Reaktionsgemisch mit 1,66 g Triäthylamin versetzt und zuerst 2 Stunden bei —10°C, dann 2 Stunden bei O⁰C und zuletzt über Nacht bei Raumtemperatur sich selbst überlassen. Das Reaktionsgemisch wird im Vakuum zur Trockene eingedampft, der Rückstand wird mit Wasser gewaschen und aus Methylenchlorid—Petroläther umkristallisiert, wobei 7,8 g Carbo-t.butoxy-L-phenylalanyl-L-tyrosyl-glycin-äthyl-ester (II) erhalten werden, der bei 190 bis 191°C schmilzt; [<x]%^! = -16° (c = 0,7 in Dimethylformamid).

Eine Lösung von 5 g geschütztem Tripeptid II in 25 ml Äthanol wird bei Raumtemperatur mit 25 ml in Natronlauge versetzt und 20 Minuten sich selbst überlassen. Hierauf wird sie mit 50 ml Wasser bis zu pH-Wert von 6 verdünnt, mit verdünnter Salzsäure angesäuert, und ein Teil des nicht reagierten Tripeptids II wird mit Äthyläther extrahiert. Die Lösung wird bis zu pH = 1 mit verdünnter Salzsäure angesäuert und mit Äthylazetat extrahiert. Die Äthylazetat-Auszüge ' werden im Vakuum zur Trockene eingedampft und der Rückstand aus Azeton—Petroläther umkristallisiert, wobei 3,9 g Carbo-t.butoxy-L-phenylalanyl-L-tyrosylglycin (III) erhalten werden, das bei 144 bis 146° C ., schmilzt; [Ot]I⁰ = —14,3° (c = 0,5 in Dimethylformamid).

Eine Lösung von 3,4 g Tripeptid III und 2,07 g L-Leucyl-L-methioninamid-hydrochlorid (in der belgischen Patentschrift 648 011 beschrieben) in 15 ml Dimethylformamid wird bei — 10⁰C mit 0,7 g Triäthylamin und 1,44 g Dicyclohexylcarbodümid versetzt. Das Reaktionsgemisch wird 2 Stunden bei —10⁰C, dann über Nacht bei 9⁰C und 2 Tage bei Raumtemperatur sich selbst überlassen und.hierauf filtriert. Das Filtrat wird im Vakuum zur Trockene konzentriert, der Rückstand in 250 ml Wasser aufgenommen, filtriert, mit Wasser gewaschen und getrocknet. Schließlich wird der Rückstand in 150 ml kochendem Aceton aufgeschlämmt und in der Wärme *- filtriert, wobei 4,0 g Carbo-t.butoxy-L-phenylalanyl- \ L-tyrosyl-glycyl-L-leucyl-L-methioninamid (VI) gewonnen werden, das bei 229 bis 230⁰C schmilzt; [«]!? = —22,3° (c = 0,5 in Dimethylformamid).

1 g Pentapeptid IV wird in 20 ml einer 4,4%igen wasserfreien Chlorwasserstofflösung in Eisessig gelöst, 1 Stunde bei Raumtemperatur sich selbst überlassen und hierauf im Vakuum zur Trockene eingedampft. Der Rückstand wird danach in einer kleinen Menge Dimethylformamid gelöst und mit Äther verdünnt. 0,88 g L-Phenylalanyl-L-tyrosyl-glycyl-L-leucyl-L-methioninamid-hydrochlorid (V) werden erhalten, das bei 120 bis 122°C (Zersetzung) schmilzt; [oc]^! _D° = -11,2° (c = 0,5 in CH₃COOH).

Herstellung des zweiten Zwischenproduktes

Carbo-t.butoxy-L-pyroglutamyl-L-alanyl-(/3-t.butyl)-L-aspartyl-L-prolyl-L-asparaginyl-iN'-carbo-t.bu-

toxy)-L-lysin (X)

Zu einer auf 0⁰C abgekühlten Lösung von 18,2 g Carbobenzoxy -L- asparaginsäure -ß - t.butyl - ester (von ν R. Schwyzer, HeIv. Chim. Acta, 44,1961, S. 2003, beschrieben) in 300 ml Äthylazetat werden 9,26 g p-Nitrophenol und 1,14 g Dicyclohexylcarbodümid zugefügt. Die Lösung wird 1 Stunde bei O⁰C und über Nacht bei Raumtemperatur sich selbst überlassen und hierauf filtriert. Das Filtrat wird mit weiterem Äthylazetat verdünnt, mehrmals mit 5°/_oigem Natriumkarbonat gewaschen und im Vakuum zur Trockene eingedampft. Der Rückstand wird aus Äthyläther umkristallisiert, wobei 17 g Carbobenzoxy-asparaginsäure-«-p-nitrophenyl-/3-t.butylester (VI) erhalten werden, der bei 84 bis 86⁰C schmilzt; [α]!,⁰ = 4-3,5° (c = 3 in CHCl₃).

Zu einer Suspension von 2.19 g L-Prolin in 300 ml Chloroform und 1,9 g Triäthylamin werden 8,5 g der geschützten Aminosäure VI zugefügt. Die Lösung wird unter Rühren 2 Tage bei 35° C gehalten, dann im Vakuum zur Trockene eingedampft, der Rückstand mit 200 ml wässerigem Natriumbicarbonat aufgenommen und die wässerige alkalische Lösung mit Äthyläther gewaschen. Die wässerige alkalische Lösung wird auf —10⁰C abgekühlt, mit Salzsäure bis zu pH = 1 angesäuert und mit Methylenchlorid extrahiert... Die Auszüge werden im Vakuum zur Trockene eingedampft,

der aus rohem Carbobenzoxy-(/?-t.butyl)-L-aspartyl-L-prolin bestehende Rückstand wird in 30 ml Äthyläther gelöst, mit 3,3 g Dicyclohexylamin versetzt und eine Nacht bei Raumtemperatur sich selbst überlassen. Es werden so 9,6 g Carbobenzoxy-(/J-t.butyl)-L-aspartyl-L-prolin-dicyclohexyl-ammoniumsalz erhalten, das bei 132 bis 133°C schmilzt; [α]? = -30° (c = 0,5 in Dimethylformamid).

Das Produkt wird. in 250 ml Wasser und Eis angeschlämmt und mit 1,31 g phosphoriger Säure versetzt. Dann wird es mit Dichlormethan extrahiert und im Vakuum zur Trockene eingedampft, wobei man 7,2 g Carbobenzoxy-(/3-t.butyl)-L-aspartyl-L-prolin (VII) als ölige Substanz erhält.

2,54 g Carbobenzoxy-L-asparaginyl-CN'-carbo-t.butoxy)-L-lysin-methyl-ester (von S a η d r i n, HeIv. Chim. Acta, 46, 1963, S. 1637, beschrieben) werden in 150 ml Äthanol und 150 ml Tetrahydrofuran gelöst und in Gegenwart von 1,5 g 10°/₀igem Palladium auf Kohle hydriert.

Wenn die Entwicklung des Kohlendioxyds beendet ist, wird das Reaktionsgemisch bei niedriger Temperatur im Vakuum zur Trockene eingedampft und der Rückstand in 20 ml Tetrahydrofuran gelöst. Zu dieser auf —10°C abgekühlten Lösung wird eine Lösung zugefügt, die wie folgt erhalten wurde:

2,1 g geschütztes Dipeptid VIl werden in 25 ml Tetrahydrofuran und 0,7 ml Triäthylamin gelöst. Der auf —10⁰C abgekühlten Lösung werden 0,5 ml Chlorameisensäureäthylester zugefügt, und die Mischung wird 30 Minuten bei —10⁰C sich selbst überlassen. Nach Vereinigung der zwei Lösungen wird die Temperatur 2 Stunden bei — 10⁰C gehalten, worauf die Lösung über Nacht bei Raumtemperatur stehengelassen wird. Dann wird sie im Vakuum zur Trockene eingedampft, mit Äthylacetat aufgenommen und in einem Scheidetrichter mit einer Natriumchlorid- und verdünnten Salzsäurelösung bei —5° C und schließlich mit einer 5°/_oigen Bicarbonatlösung und Wasser gewaschen und dann im Vakuum zur Trockene eingedampft. Der Rückstand wird aus Äthylacetat—Petroläther umkristallisiert, wobei man 2,5 g Carbobenzoxy-(/J-t.butyl)-L-aspartyl-L-prolyl-L-asparaginyl-(N"-carbo-t.butoxy) L-lysin-methyl-ester (VIII) erhält, der bei 105 bis 107⁰C schmilzt; [«]?? = -40° (c = 0,3 in Dimethylformamid).

1,42 g geschütztes Tetrapeptid VIII werden in 100ml Äthanol gelöst und in Gegenwart von 2 g 10°/₀igem Palladium auf Kohle hydriert. Wenn die Hydrierung beendet ist, wird nitriert und das Filtrat im Vakuum zur Trockene eingedampft. Der Rückstand wird mit 10 ml Dimethylformamid aufgenommen, worauf 0,46g Carbobenzoxy-L-alanin-p-nitrophenylester hinzugefügt werden. Die Reaktionsmischung wird 2 Tage bei Raumtemperatur sich selbst überlassen, dann im Vakuum zur Trockene eingedampft, der Rückstand wird in Äthylacetat gelöst und bei —10° C mit verdünnten Lösungen von Salzsäure und Natriumchlorid und schließlich mit Natriumbicarbonatlösung gewaschen. Die Lösung wird dann im Vakuum zur Trockene eingedampft und der Rückstand 3mal mit warmem Äthyläther gewaschen. Der Rückstand wird in Äthylacetat gelöst: durch Zusatz von Äthyläther fällt eine gelatineartige Substanz aus. Man erhält 0,9 g Carbobenzoxy-L-alanyl-(/3-t.butyl) - L-aspartyl-L-prolyl-L-asparaginyl - (N^e- carbo - t.butoyx)-i.-lysin-methyl-ester (IX), der bei 103 bis 106⁰C schmilzt; [\]%⁰ = -59° (c = 1 in Äthanol).

Eine Lösung von 2.12 g geschütztes Pentapeptid IX 50 ml Äthanol, wird mit 25 ml Natronlauge und mit 10 ml Wasser versetzt. Das Reaktionsgemisch wird 1 Stunde bei Raumtemperatur sich selbst überlassen, worauf dann 2 ml 5°/_oige Natriumbicarbonatlösung zugefügt werden. Die Mischung wird dann mit 180 ml Wasser verdünnt und 2mal mit Äthylacetat ausgeschüttelt. Danach wird sie auf —10° C abgekühlt, mit ln-Salzsäure bis zum Kongorot-Farbumschlag angesäuert und mit Äthylacetat extrahiert. Durch Verdampfen des Äthylacetats werden 1,6 g Carbobenzoxy-L-alanyl-(/J-t.butyl)-L-aspartyl-L-prolyI-L-asparaginyl-(N^£-carbo-t.butoxy)-L-lysin als amorphes Produkt erhalten: E₅,₈ = 0,27 GIu.
Dieser Schaum wird in 120 ml Äthanol und 120 ml Tetrahydrofuran gelöst und in Gegenwart von 1 g 10°/_oigem Palladium auf Kohle hydriert. Wenn die Entwicklung von CO₂ beendet ist, wird die Lösung filtriert und im Vakuum zur Trockene konzentriert: der Rückstand wird in 12 ml Dimethylformamid gelöst, worauf 0,7 g p-Nitrophenyl-carbo-tbutoxy-L-pyroglutamate (wie im nachstehenden hergestellt) und 0,25 g Triäthylamin zugefügt werden. Das Reaktionsgemisch wird bei 35⁰C sich selbst überlassen und im Vakuum zur Trockene eingedampft. Der Rückstand wird mit wässerig verdünntem Natriumbicarbonat aufgenommen und mit Äthylacetat 2mal ausgeschüttelt. Der pH-Wert der alkalischen Lösung wird bei — 10⁰C mit ln-Salzsäure auf 5,5 eingestellt. Die Lösung wird nun mit Äthyläther ausgeschüttelt, hierauf bis zu

pH = 1 angesäuert und mit Äthylacetat erschöpfend extrahiert, wobei das Carbo-tbutoxy-L-pyroglutamyl-L-alanyl-(j3-t.butyl)-L-aspartyl-L-prolyl-L-asparaginyl-(N⁸-carbo-t.butoxy)-L-lysin (X) erhalten wird, das bei 143 bis 148° (Zersetzung) schmilzt; [<x]%° = —67°

(c = 0,5 in Äthanol); E₅,₈ = 0,20 GIu.

Das Carbo-t.butoxy-pyroglutaminsäure-p-nitrophenyl-ester wird folgendermaßen hergestellt: zu einer Suspension von 14 g Glutaminsäure in 200 ml Dimethylformamid werden 23,9 g Terbutyl-p-nitrophenylcarbonat und 40 ml Triäthylamin zugefügt. Die Lösung wird 3 Tage bei 37° C unter Rühren gehalten, dann im Vakuum zur Trockene eingedampft, und der Rückstand wird mit 5°/_oigem Natriumbicarbonat wiederaufgenommen.

Die Lösung wird auf einem pH-Wert von 5,3 eingestellt und 2mal mit Äthyläther extrahiert, worauf sie bei — 10⁰C bis zu pH = 1 mit konzentrierter Salzsäure angesäuert und dann mit Äthyläther extrahiert wird. Der Ätherauszug wird im Vakuum zur Trockene eingedampft und der Rückstand in 170 ml Tetrahydrofuran gelöst; die resultierende Lösung wird bei O⁰C mit 15,1 g Dicyclohexylcarbodümid versetzt. Das Reaktionsgemisch wird über Nacht bei Raumtemperatur sich selbst überlassen, dann filtriert und im Vakuum zur Trockene eingedampft. Der Rückstand wird in 130 ml Äthyläther aufgelöst und die Lösung mit 13,6 g Dicyclohexylamin versetzt. Ein reichlicher Niederschlag von Carbo-t.butoxy-L-pyroglutamin-säure-dicyclohexylammoniumsalz fällt aus: Ausbeute 21,3 g; Fp. = 180 bis 181°C; [«]? = -7° (c = 0,5 in Chloroform).

Zu einer Suspension von 5,3 g Carbo-t.butoxy-L-pyroglutamsäure-dicyclohexyl -ammoniumsalz in 150 ml Eiswasser werden 1,4 g phosphorige Säure zugefügt und lange mit 250 ml Äthyläther geschüttelt. Der Ätherauszug wird im Vakuum zur Trockene eingedampft und der Rückstand in 50 ml Äthylacetat aufgelöst.

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Die resultierende Lösung wird bei O⁰C mit 2,1 g p-Nitrophenol und 2,55 g Dicyclohexylcarbodiimid versetzt. Sie wird über Nacht bei Raumtemperatur sich selbst überlassen, filtriert und das Filtrat im Vakuum zur Trockene eingedampft.

Durch Umkristallisieren des Rückstandes aus Äther erhält man 2,5g p-Nitro-phenyl-carbo-t.butoxy-L-pyroglutamat, das bei 143 bis 145° C schmilzt; [«]% = —26° (c = 0,5 in Äthanol).

IO

Endkondensation

Carbo-Lbutoxy-L-pyroglutamyl-L-alanyl-(/3-t.butyl)-L-aspartyl-L-prolyl-L-asparaginyl-

(N^f-carbo-tbutoxy)-i.-Lysyl-L-phenylalanyl-L-tyroysl-glycyl-L-leucyl-L-methioninamid (XI)

Eine Lösung von 0,7 g des geschützten Hexapeptids X in und 0,83 g L-Phenylalanyl-L-tyrosyl-glycyl-L-leucyl-L-methioninamid-hydrochlorid 10 ml wasser- a° freiem Pyridin (V) wird mit 0,21 g Dicyclohexylcarbodiimid versetzt. Das Reaktionsgemisch wird 2 Tage bei Raumtemperatur sich selbst überlassen, dann im Vakuum zur Trockene eingedampft, und der Rückstand wird in 150 ml der unteren Schicht der separat herge- «5 stellten Mischung CH₃OH/H₂O/CC1₄/CHC1₃ (8:3:3:7) gelöst und mit 300 ml in Wasser verdünnt. Der ausgefallene, gelatinartige Niederschlag wird abgetrennt und in einer weiteren Menge der unteren Schicht obenerwähnter Mischung gelöst und bei —10° C mit einer gleichen Menge der oberen, mit 1 ml konzentrierter Salzsäure versetzten Schicht geschüttelt; die resultierende obere Schicht wird nun verworfen, und die untere Schicht wird mit einer gleichen Menge der oberen Schicht der besagten Mischung geschüttelt, zu der etwas Natriumbikarbonat zugesetzt wurde. Die Mischung wird im Vakuum zur Trockene eingedampft und durch Umkristallisieren aus Methanol/Tetrachlorkohlenstoff/Äther gereinigt.

Nach zwei Umkristallisierungen werden 0,4 g Carbo-t.butoxy-L-pyroglutamyl-L - alanyl-(/3 - t.butyl)-L-aspartyl-L-prolyl-L-asparaginyl-(N'-carbo-t.butoxy)-L-lysyl-L-phenylalanyl-L-tyrosyl-glycyl-L-leucyl-L-me- thioninamid erhalten, das bei 155 bis 158° C (Zersetzung) schmilzt; [α]?,⁰ = —59° (c = 0,3 in Äthanol). Wenn man das durch andere Schutzgruppen geschützte Hexapeptid verwendet und unter denselben experimentellen Bedingungen in bekannter Weise vorgeht, werden die entsprechenden geschützten Derivate des Hendekapeptids L-Pyroglutamyl-L-alanyl-L-aspartyl - L - prolyl -L- asparaginyl - L - lysyl - L - pheny lalanyl L-tyrosyl-glycyl-L-leucyl-L-methioninamid erhalten.

L-Pyroglutamyl-L-alanyl-L-aspartyl-L-prolyl-

L-asparaginyl-L-lysyl-L-phenylalanyl-L-tyrosyl-

glycyl-L-leucyl-L-methioninamid (XII)

0,1g Hendekapeptid (XI) werden in 40 ml wasserfreier 4°/₀ Chlorwasserstoff enthaltender Trifluoressigsäure gelöst. Das Reaktionsgemisch wird 3 Stunden bei Raumtemperatur sich selbst überlassen, dann filtriert, im Vakuum zur Trockene eingedampft, und der Rückstand wird 3mal mit Äthyläther und dann lmal mit 15 ml Aceton zerrieben. Die abfiltrierte feste Substanz wird in 5 ml absolutem Äthanol gelöst. Die Lösung wird von einer kleinen Menge an pechartigem Rückstand abfiltriert und im Vakuum zur Trockene eingedampft.

Der Rückstand wird mit wenig Äther zerrieben und filtriert, wobei man 0,065 g L-Pyroglutamyl-L-alanyl-L - aspartyl - L - prolyl - L - asparaginyl - L - Iy sy 1 - L - phenylalanyl-L-tyrosyl-glycyl-L-leucyl-L-methioninamid-trifluoracetat (XII) erhält ,das bei 180⁰C (Zersetzung) schmilzt; [x]%^s = —57° (c = 0,3 in Äthanol); E₁,,, = 0,43 Leu.

Bei Umsetzung obigen Produktes mit einer geeigneten Base in bekannter Weise wird das freie Hendekapeptid erhalten, das mit organischen oder anorganischen pharmazeutisch verträglichen Säuren in andere Salze übergeführt werden kann.

Falls die Aminogruppen des Pyroglutamyl- und Lysylrestes und die Carboxylgruppe des Aspartylrestes des Hendekapeptids mit anderen Schutzgruppen blockiert sind, können diese mit anderen aus der PoIypeptidchemie bekannten Abspaltungsmitteln, wie Wasserstoff, in Gegenwart von Palladium oder metallisches Natrium in flüssigem Ammoniak, abgespaltet werden.

Claims

1 2 Patentansprüche· Moleküls und der Carboxylgruppe eines anderen Moleküls, um die Peptidbindung zu erzielen, kann nach den

1. Das Hendekapeptid L-Pyroglutamyl-L-alanyl- üblichen in der Polypeptidchemie bekannten Methoden L-aspartyl-L-prolyl-L-asparaginyl-L-lysyl-L-phenyl- ■ ausgeführt werden, z. B. über ein aktiviertes Acylderialanyl-L-tyrosylglycyl-L-leucyl-L-methioninamid 5 vat wie das Azid und den p-Nitrophenylester oder vor- und seine Salze mit einer organischen oder anorga- zugsweise durch direkte Kondensation der freien nischen pharmazeutisch verträglichen Säure. Amino- und der freien Carboxylgruppe in Gegenwart

2. Verfahren zur Herstellung des neuen Hende- geeigneter Kondensationsmittel aus der Gruppe der kapeptids L-Pyroglutamyl-L-alanyl-L-aspartyl- Carbodiimidderivate, wie Dicyclohexylcarbodiimid, L-prolyl-L-asparaginyl-L-lysyl-L-phenylalanyl- io l-cyclohexyl-S-morpholinyl-carbodnmid und anderer L-tyrosyl-glycyl-L-leucyl-L-methionin-amid, da- aus der Literatur bekannter Kondensationsmittel. Die durch gekennzeichnet, daß man in an sich bekann- Kondensation kann in einem geeigneten Lösungsmittel ter Weise das Pentapeptid L-Phenylalanyl-L-tyrosyl- wie Ν,Ν-Dialkylformamid, niederen aliphatischen glycyl-L-leucyl-L-methioninamid mit dem sauren Nitrilen und Pyridin, vorzugsweise Dimethylformamid, Hexapeptid L-Pyroglutamyl-L-alanyl-L-aspartyl- 15 Acetonitril und Pyridin ausgeführt werden; die Reak-L-prolyl-L-asparaginyl-L-lysin kondensiert, wobei tion beginnt zwischen —10⁰C und Raumtemperatur die Iminogruppe des Pyroglutamylrestes, die und wird bei Raumtemperatur innerhalb von etwa 10 ε-Aminogruppe des Lysylrestes und die /J-Car- bis 70 Stunden vervollständigt.

boxylgruppe des Aspartylrestes durch eine Schutz- Aus dem geschützten Hendekapeptid wird durch

gruppe blockiert sind, und die Kondensation in ao Abspaltung der Schutzgruppen in an sich bekannter Gegenwart eines Carbodiimids bei einer Tempera- Weise das entsprechende freie oder mit organischen tür zwischen —10 und +20°C innerhalb 10 bis 70 oder anorganischen Säuren kombinierte Hendekapep-Stunden unter Bildung des neuen, entsprechend ge- tid entsprechend dem zur Abspaltung der Schutzgrupschützten Hendekapeptids durchgeführt wird und pen angewendeten Abspaltungsmittel erhalten. Die daß man die Schutzgruppe der Iminogruppe des »5 Wahl des besagten Abspaltungsmittels hängt von der Pyroglutamylrestes, der ε-Aminogruppe des Lysyl- Natur der Schutzgruppen ab; hierfür können z.B. restes und der /3-Carboxylgruppe des Aspartyl- Natriummetall in flüssigem Ammoniak, Wasserstoff restes durch Acidolyse oder Hydrogenolyse ab- in Gegenwart eines Palladiumkatalysators, wasserspaltet, und das Hendekapeptid in freier Form oder freie Halogenwasserstoffsäuren in Eisessig und Triin Form eines Salzes mit einer organischen oder 30 fluoressigsäure in an sich bekannter Weise verwendet anorganischen pharmazeutisch verträglichen Säure werden,
isoliert. Aus den entsprechenden Salzen kann das freie

Hendekapeptid durch Versetzen mit einer geeigneten

• Base oder durch Chromatographie an Ionenaustausch-

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf das 35 harzen, beispielsweise der neuen Art von verzögerten neue hypotensiv wirksame Hendekapeptid L-Pyro- Ionenaustauschharzen, die von den Bio-Bad Laboraglutamyl-L-alanyl-L-aspartyl-L-prolyl-L-asparaginyltories Richmond, California, USA., unter dem Kenn-L-lysyl-L-phenylalanyl-L-tyrosyl-glycyl-L-leucyl-L-mezeichen AG 11 AB im Handel sind, gewonnen werden, thioninamid, seine pharmazeutisch verwendbaren Salze Auch die Reinigung des Hendekapeptids kann nach

und ein Verfahren zu seiner Herstellung. 40 den in der Polypeptidchemie bekannten Verfahren, wie

Das erfindungsgemäß herstellbare Hendekapeptid durch Gegenstromverteilung, Chromatographie an und seine pharmazeutisch verwendbaren Salze besitzen basischer Tonerde, Zellulose oder an Ionenaustauscheine stark peripher gefäßerweiternde Wirkung und harzen, z. B. »Amberlite IRC 50«, ausgeführt werden, können besonders zur Therapie von schwerer Hyperten- Typische Beispiele von pharmazeutisch verwend-

sion verwendet werden. 45 baren Salzen sind: Chlorhydrat, Sulfat, Azetat, Tri-

Es bestehen zahlreiche Möglichkeiten zur Herstel- fluorazetat, Glukonat, Tartrat, Malat, Maleinat, Cilung des erfindungsgemäßen Hendekapeptids, die trat, Methansulfonat, Pamoat und andere nicht hauptsächlich auf der geeigneten aufeinanderfolgenden toxische, pharmazeutisch verträgliche Salze.
Kondensation von geschützten Aminosäuren und Poly- Wie schon oben erwähnt, bestehen zahlreiche Mög-

pepdden beruhen, die auf solche Weise ausgeführt wird, 50 lichkeiten zur Herstellung des erfindungsgemäßen daß das resultierende Hendekapeptid jene gewünschte Hendekapeptids.
Reihenfolge von den bezüglichen elf Aminosäuren hat. Als Beispiel wird das folgende Verfahren zur Her-

Bei den Aminosäuren und Polypeptiden, die mitein- stellung angeführt.

ander kondensiert werden, sind die an der Knüpfung Das erfindungsgemäße Verfahren, dessen Einzel-

der Peptidbindung nicht teilnehmenden Amino- und 55 heiten im Nachstehenden erläutert werden, beruht Carboxylgruppen mit geeigneten Schutzgruppen blök- hauptsächlich auf der Kondensation des neuen Penkiert, die leicht durch Acidolyse und Hydrogenolyse tapeptids L-Phenylalanyl-L-tyrosyl-glycyl-L-leucylin bekannter Weise abgespaltet werden können. L-methioninamid (V) mit dem neuen sauren Hexapep-Zum Schutz der Aminogruppe können z. B. folgende tid l-Pyroglutamyl-L-alanyl-L-aspartyl-L-prolyl-Gruppen verwendet werden: Tosyl (p-Toluolsulfonyl), 60 L-asparaginyl-L-lysin (X), worin die Carboxylgruppe Carbobenzoxy (Carbobenzyloxy), Carbo-t.butoxy, Tri- des Aspartylrestes sowie die Aminogruppe des Lysintyl (Triphenylmethyl), Formyl, Trifluoracetyl und an- und Pyroglutamylrestes mit geeigneten Schutzgruppen dere in der Polypeptidchemie übliche Schutzgruppen. blockiert sind, die leicht durch Acidolyse oder Hydro-

Beispiele für die zum Schütze der Carboxylgruppen genolyse abgespaltet werden können,
eingeführten Gruppen sind: Methyl-, Äthyl-, t.Butyl-, 65 Das neue Pentapeptid L-Phenylalanyl-L-tyrosyl-Benzyl-, p-Nitrophenylgruppen und andere für diesen glycyl-L-leucy I-L-methioninamid kann vorzugsweise Zweck übliche Schutzgruppen. auf folgende Weise hergestellt werden.

Die Kondensation zwischen der Aminogruppe eines Das L-Tyrosin, dessen Phenol- und Aminogruppen