DE2741393C2 - - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft Pentapeptide und diese Verbindungen enthaltende pharmazeutische Zubereitungen gemäß den voranstehenden Ansprüchen.

Aus dem Gehirn oder cerebraler Rückenmarksflüssigkeit von Säugetieren sind bereits endogene Substanzen mit morphinartigen Eigenschaften extrahiert worden. Diese als Enkephaline bezeichneten Substanzen sind von Hughes et al., Nature, Bd.258, S. 577 (1975) als Pentapeptide mit dem folgenden Aufbau

H-Tyr-Gly-Gly-Phe-Met-OH
H-Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-OH

identifiziert worden. Diese Verbindungen werden als Methioninenkephalin bzw. Leucin-enkephalin bezeichnet.

Es wurde zwar nachgewiesen, daß diese Verbindungen bei Mäusen nach intracerebroventrikularer Verabreichung analgetische Wirksamkeit zeigen [Buscher et al., Nature, Bd. 261, S. 423 (1976)], doch ermangeln sie einer nutzbaren analgetischen Wirksamkeit, wenn sie parenteral verabreicht werden.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen zeichnen sich durch eine signifikante und nachweisbare analgetische Wirkung aus, wenn sie dem Körpersystem parenteral verabreicht werden.

Eine bevorzugte Klasse von Verbindungen sind solche, in deren Formel I W die Gruppe -CH₂-S-CH₃ bedeutet.

Zu den pharmazeutisch annehmbaren nichttoxischen Säureadditionssalzen der Verbindungen der Formel I gehören sowohl organische als auch anorganische Säureadditionssalze, z. B. die mit Salzsäure, Schwefelsäure, Sulfonsäure, Weinsäure, Fumarsäure, Bromwasserstoffsäure, Glykolsäure, Citronensäure, Maleinsäure, Phosphorsäure, Bernsteinsäure, Essigsäure, Salpetersäure, Benzoesäure, Ascorbinsäure, p-Toluolsulfonsäure, Benzolsulfonsäure, Naphthalinsulfonsäure oder Propionsäure hergestellten. Die bevorzugten Säureadditionssalze sind die mit Salzsäure, Essigsäure oder Bernsteinsäure hergestellten. Alle diese Salze können nach üblichen bekannten Methoden hergestellt werden.

Wie sich aus der Definition der verschiedenen in Formel I angegebenen Substituenten ergibt, handelt es sich bei den Verbindungen der Formel I um N-substituierte Amide von Pentapeptiden. Die Stereokonfiguration der Verbindungen der Formel I ist ein wesentliches Merkmal dieser Verbindungen. Aus Zweckmäßigkeitsgründen werden die Aminosäurereste der Pentapeptide der Formel I, beginnend mit dem Rest mit der die Kette abschließenden Aminofunktion numeriert. Die Chiralität der Aminosäurereste in der Reihenfolge von Stellung 1 bis Stellung 5 ist demnach L, D, L, L und L. Ferner sei darauf hingewiesen, daß der Rest in Stellung 3 u. a. ein Glycinrest sein kann. In solchen Fällen ist hinsichtlich dieses Restes Chiralität natürlich nicht möglich. Wenn jedoch in Stellung 3 ein chiraler Aminosäurerest steht, dann muß die Chiralität dieses Restes L sein.

Die primären oder sekundären Alkylgruppen mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, die die Gruppen R₄ und R₅ bedeuten können, sind Methyl, Ethyl, n-Propyl, Isopropyl, n-Butyl, Isobutyl und sek.-Butyl.

Hinsichtlich der Reste in den einzelnen Stellungen der Pentapeptide der Formel I ist folgendes auszuführen:

(A) Stellung 1

Diese Stellung stellt das Aminoendteil des Peptids dar. Der Rest ist der sich aus L-Tyrosin ergebende.

(B) Stellung 2

Der in der zweiten Stellung des Peptids der Formel I befindliche Aminosäurerest muß das D-Stereoisomere eines Aminosäurerests sein. In Betracht kommen hierbei die Reste von D-Alanin (Ala) (R₁=Methyl), D-alpha-Aminobuttersäure (Abu) (R₁=Ethyl), D-Norvalin (Nva) (R₁=n-Propyl), D-Valin (Val) (R₁= Isopropyl), D-Norleucin (Nle) (R₁=n-Butyl), D-Leucin (Leu) (R₁=Isobutyl) und D-Isoleucin (Ile) (R₁=sek.-Butyl). Vorzugsweise ist der Rest der von D-Alanin.

(C) Stellung 3

Der in dieser Stellung vorliegende Aminosäurerest ist der des Glycins (Gly) oder einiger anderer Aminosäuren, wie L-Alanin, L-(alpha-Amino)-buttersäure, L-Norvalin, L-Valin, L-Norleucin, L-Leucin und L-Isoleucin. Vorzugsweise leitet sich der Rest in dieser Stellung des Peptids von Glycin ab.

(D) Stellung 4

Der Aminosäurerest in dieser Stellung ist der des L-Phenylalanins (Phe).

(E) Stellung 5

Der Aminosäurerest in Stellung 5 des Pentapeptids ist der Rest eines Amids von L-Methionin (Met) (W=CH₂SCH₃), L-Leucin (Leu) [W=-CH(CH₃)₂], oder L-(S-Alkyl- oder -Aralkyl)-cystein [Cys(Alk) oder Cys(Aralk)]. Vorzugsweise ist der Aminosäurerest in Stellung 5 der Rest des Amids von L-Methionin. In den Fällen, in denen der Rest in Stellung 5 S-substituiertes Cystein ist, ist der Alkylsubstituent die Ethylgruppe und der Aralkylsubstituent die p-Methoxybenzylgruppe.

Es wurden und werden folgende allgemeine übliche Abkürzungen verwendet:

Abu- alpha-Aminobuttersäure Ala- Alanin Cys- Cystein Gly- Glycin Hse- Homoserin Ile- Isoleucin Leu- Leucin Met- Methionin Nle- Norleucin Nva- Norvalin Phe- Phenylalanin Ser- Serin Tyr- Tyrosin Val- Valin Ac- Acetyl Me- Methyl Et- Ethyl Ip- Isopropyl Pr- n-Propyl Bu- n-Butyl i-Bu- Isobutyl t-Bu- tert.-Butyl s-Bu- sek.-Butyl BOC- tert.-Butyloxycarbonyl Bzl- Benzyl DCC- N,N′-Dicyclohexylcarbodiimid HBT- 1-Hydroxybenztriazol DMF- N,N-Dimethylformamid TFA- Trifluoressigsäure THF- Tetrahydrofuran DEAE- Diethylaminoethyl

Beispielhafte Verbindungen der Formel I sind folgende:

H-L-Tyr-D-Ala-Gly-L-Phe-L-(N-Me)Met-NH₂;
H-L-Tyr-D-Abu-Gly-L-Phe-L-(N-Me)Met-NH₂;
H-L-Tyr-D-Nva-Gly-L-Phe-L-(N-Me)Met-NH₂;
H-L-Tyr-D-Val-Gly-L-Phe-L-(N-Me)Met-NH₂;
H-L-Tyr-D-Ala-L-Ala-L-Phe-L-(N-Me)Met-NH₂;
H-L-Tyr-D-Ala-L-Nva-L-Phe-L-(N-Me)Met-NH₂;
H-L-Tyr-D-Ala-L-Leu-L-Phe-L-(N-Me)Met-NH₂;
H-L-Tyr-D-Val-L-Ala-L-Phe-L-(N-Me)Met-NH₂;
H-L-Tyr-D-Leu-L-Ala-L-Phe-L-(N-Me)Met-NH₂;
H-L-Tyr-D-Leu-L-Leu-L-Phe-L-(N-Me)Met-NH₂;
H-L-Tyr-D-Abu-L-Abu-L-Phe-L-(N-Me)Met-NH₂;
H-L-Tyr-D-Ala-Gly-L-Phe-L-(N-Me)Leu-NH₂;
H-L-Tyr-D-Abu-Gly-L-Phe-L-(N-Me)Leu-NH₂;
H-L-Tyr-D-Nva-Gly-L-Phe-L-(N-Me)Leu-NH₂;
H-L-Tyr-D-Val-Gly-L-Phe-L-(N-Me)Leu-NH₂;
H-L-Tyr-D-Ala-L-Ala-L-Phe-L-(N-Me)Leu-NH₂;
H-L-Tyr-D-Ala-L-Nva-L-Phe-L-(N-Me)Leu-NH₂;
H-L-Tyr-D-Ala-L-Leu-L-Phe-L-(N-Me)Leu-NH₂;
H-L-Tyr-D-Val-L-Ala-L-Phe-L-(N-Me)Leu-NH₂;
H-L-Tyr-D-Leu-L-Ala-L-Phe-L-(N-Me)Leu-NH₂;
H-L-Tyr-D-Leu-L-Leu-L-Phe-L-(N-Me)Leu-NH₂;
H-L-Tyr-D-Ala-Gly-L-Phe-L-(N-Me)Cys(Et)-NH₂;
H-L-Tyr-D-Abu-L-Abu-L-Phe-L-(N-Me)Leu-NH₂.

Die Verbindungen der Formel I werden durch für Peptidsynthesen übliche Verfahren hergestellt. Während der Synthese einiger der Verbindungen der Formel I kann eine teilweise Racemisierung erfolgen. Das Ausmaß einer solchen Racemisierung, wenn sie überhaupt eintritt, ist jedoch so gering, daß die analgetische Wirksamkeit der Verbindungen der Formel I nicht wesentlich beeinträchtigt wird.

Die Verfahren zur Herstellung der Verbindungen der Formel I beruhen auf dem Verknüpfen von Aminosäuren oder Peptidfragmenten durch Umsetzung der Carboxylfunktion der einen mit der Aminofunktion einer anderen Säure unter Bildung einer Amidbindung. Zur wirksamen Erzielung der Verknüpfung ist es zweckmäßig, daß erstens alle reaktionsfähigen Gruppen, die nicht direkt an der Reaktion teilnehmen, durch die Verwendung entsprechender blockierender Gruppen inaktiviert werden und daß zweitens die Carboxylfunktion, an der die Verknüpfung stattfinden soll, so aktiviert ist, daß die Verknüpfung erfolgen kann. Hierfür ist eine sorgfältige Wahl der Reaktionsfolge und der Reaktionsbedingungen sowie die Verwendung bestimmter Blockierungsgruppen erforderlich, damit das gewünschte Peptidprodukt auch tatsächlich erhalten wird. Jede der Aminosäuren, die für die Herstellung der Verbindungen der Formel I verwendet wird und die jeweils gewählten Schutzgruppen und/oder aktivierenden Funktionalitäten enthält, wird nach auf dem Pentidgebiet allgemein bekannten Arbeitsweisen hergestellt.

In jeder Stufe der Gesamtsynthese der Verbindungen der Formel I werden ausgewählte Kombinationen von blockierenden Gruppen angewandt. Diese besonderen Kombinationen haben sich hinsichtlich ihrer Wirkungsweise als sehr günstig erwiesen. Andere Kombinationen haben bei der Synthese der Verbindungen der Formel I eine befriedigende Wirkung, aber unter Umständen sind sie etwas weniger erfolgreich. So können beispielsweise folgende Gruppen als Aminoschutzgruppen bei der Synthese der Verbindungen der Formel I verwendet werden:

Benzyloxycarbonyl (Z),
tert.-Butyloxycarbonyl (BOC),
tert.-Amyloxycarbonyl (AOC),
p-Methoxybenzyloxycarbonyl (MeOz),
Adamantyloxycaronyl (AdOC) und
Isobornyloxycarbonyl.

Außerdem wird im allgemeinen die Benzylgruppe (Bzl) als die Hydroxyschutzgruppe für den Tyrosylrest verwendet, obwohl auch andere Gruppen, z. B. p-Nitrobenzyl (PNB) und p-Methoxybenzyl (PMB), eingesetzt werden können.

Die bei der Herstellung der Verbindungen der Formel I verwendeten Carboxylschutzgruppen können beliebige esterbildende Gruppen sein, z. B. Methyl, Ethyl, Benzyl, p-Nitrobenzyl, p-Methoxybenzyl und 2,2,2-Trichlorethyl.

Das Verknüpfen der in geeigneter Weise geschützten N-blockierten Aminosäure oder des entsprechend geschützten Peptidfragments mit einer in geeigneter Weise geschützten carboxyblockierten Aminosäure oder einem entsprechend geschützten Peptidfragment bei der Herstellung der Verbindungen der Formel I besteht darin, daß die freie Carboxylfunktion der Aminosäure oder des Peptidfragments für die Verknüpfungsreaktion aktiviert wird. Dies kann nach den verschiedenen allgemein bekanntnen Arbeitsweisen erfolgen. Bei einer derartigen Arbeitsweise wird die Carboxylfunktion in ein gemischtes Anhydrid übergeführt. Die freie Carboxylfunktion wird durch Umsetzung mit einer anderen Säure, z. B. einem Kohlensäurederivat, wie einem Säurechlorid, aktiviert. Beispiele für zur Herstellung gemischter Anhydride verwendete Säurechloride sind Ethylchlorformiat, Phenylchlorformiat, sek-Butylchlorformiat, Isobutylchlorformiat und Pivaloylchlorid. Vorzugsweise wird Isobutylchlorformiat verwendet.

Eine andere Art der Aktivierung der Carboxylfunktion für die Durchführung der Verknüpfungsreaktion ist die Überführung in ihre aktiven Esterderivate. Zu solchen aktiven Estern gehören u. a. der 2,4,5-Trichlorphenylester, Pentachlorphenylester und p-Nitrophenylester.

Eine weitere Methode für die Verknüpfung ist die allgemein bekannte Azidverknüpfungsmethode.

Bei der bevorzugten Verknüpfungsmethode zur Herstellung der Verbindungen der Formel I wird N,N′-Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) zur Aktivierung der freien Carboxylfunktion für die Verknüpfung verwendet. Diese Arbeitsweise der Aktivierung und Verknüpfung wird unter Verwendung einer äquimolaren Menge DCC im Verhältnis zu der Aminosäure oder dem Peptidfragment und in Gegenwart einer äquimolaren Menge 1-Hydroxybenztriazol (HBT) durchgeführt. Durch die Gegenwart von HBT werden unerwünschte Nebenreaktionen und eine mögliche Racemisierung unterdrückt.

In bestimmten Stufen der bei der Herstellung der Verbindungen der Formel I angewandten Folge von Synthesestufen müssen die blockierenden Gruppen abgespalten werden. Für den Durchschnittsfachmann auf dem Peptidgebiet ist es ein leichtes, aus den möglichen Schutzgruppen diejenigen auszuwählen, die miteinander in dem Sinn verträglich sind, daß eine selektive Spaltung des Produkts erzielt werden kann, wobei eine oder mehrere aber nicht alle in der Aminosäure oder dem Peptidfragment vorliegenden Schutzgruppen entfernt werden können. Es handelt sich hierbei um auf dem Peptidgebiet allgemein bekannte Maßnahmen. Eine ausführliche Erörterung dieser Maßnahmen findet sich beispielsweise bei Schröder und Lübke, The Peptides, Bd. I, Academic Press, New York, (1965), insbesondere in der Tabelle auf den Seiten 72 bis 75.

Die Abspaltung von Carboxylschutzgruppen kann durch alkalische Verseifung erreicht werden. Im allgemeinen werden verhältnismäßig stark alkalische Bedingungen, beispielsweise unter Verwendung eines Alkalihydroxids, wie Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid und Lithiumhydroxid, für die Esterspaltung der geschützten Carboxylgruppe angewandt. Die Reaktionsbedingungen, unter welchen Verseifung erfolgt, sind allgemein bekannt. Die Carboxylschutzgruppen können auch durch katalytische Hydrierung, beispielsweise durch Hydrogenolyse in Gegenwart von Palladium auf Kohle, entfernt werden. Wenn die Carboxylschutzgruppe die p-Nitrobenzyl- oder 2,2,2-Trichlorethylgruppe ist, kann die Entfernung dieser Schutzgruppe auch durch Reduktion in Gegenwart von Zink und Salzsäure erfolgen.

Die Aminoschutzgruppen werden durch Behandlung der geschützten Aminosäure oder des geschützten Peptids mit einer Säure, z. B. 98prozentiger Ameisensäure, Trifluoressigsäure (TFA), einer Arylsulfonsäure, wie p-Toluolsulfonsäure (TSA), Benzolsulfonsäure (BSA), Naphthalinsulfonsäure, Trifluormethansulfonsäure (rein), flüssigem HF und Bortribromid, in Methylenchlorid abgespalten werden, wobei das entsprechende Säureadditionssalz gebildet wird. Die Abspaltung der Aminoschutzgruppe kann auch durch Behandlung der blockierten Aminosäure oder des Peptids mit einer Mischung aus HBr oder HCl und Eisessig erfolgen, wobei das entsprechende Hydrobromid oder Hydrochlorid gebildet wird. Alle diese Entblockierungsmittel stellen daher ein praktisch trockenes Säuremedium dar. Das jeweils angewandte Verfahren oder Reagens hängt von den chemischen oder physikalischen Eigenschaften der Stoffe ab, die an der bestimmten Entblockierungsreaktion beteiligt sind. In den Fällen in denen ein Peptid mit wenigstens drei Aminosäureresten zu entblockieren ist, hat es sich als außerordentlich günstig erwiesen, das Peptid mit Trifluoressigsäure oder Ameisensäure unter Bildung des entsprechenden Säureadditionssalzes zu entblockieren. Das Salz kann durch Behandlung mit einem Ionenaustauscherharz, z. B. DEAE Sephadex A25® und Amberlyst®A27, in eine für pharmazeutische Zwecke besser geeignete Form übergeführt werden.

Die am Tyrosylrest befindliche Hydroxyschutzgruppe kann während der gesamten Herstellung des Peptids beibehalten werden und wird in der letzten Synthesestufe zusammen mit der Aminoschutzgruppe entfernt. Je nach dem zur Entfernung der Carboxylschutzgruppe angewandten Bedingungen kann sie jedoch in einer früheren Stufe des Herstellungsverfahren entfernt werden. Wird die Carboxylschutzgruppe durch alkalische Verseifung abgespalten, bleibt die Hydroxyschutzgruppe erhalten; wird jedoch zur Entfernung der Carboxylschutzgruppe eine katalytische Hydrogenolyse angewandt, dann wird auch die Hydroxyschutzgruppe abgespalten. Dies bereitet jedoch keine ernsten Schwierigkeiten, da die Herstellung der Verbindungen der Formel I auch mit einem Tyrosylrest mit freier Hydroxylgruppe erfolgen kann.

Bei einem bevorzugten Verfahren zur Herstellung der Verbindungen der Formel I wird ein gesondert hergestelltes Tripeptid mit N-Ende mit einem gesondert hergestellten Dipeptidamid mit C-Ende (oder einem Aminosäureamid mit C-Ende verknüpft, worauf die noch vorhandenen blockierten Gruppen gespalten werden. In der folgenden formelmäßigen Darstellung dieses Verfahrens steht das Symbol AA für den Aminosäurerest und die in Verbindung damit angegebene Zahl für die Stellung der Aminosäure in dem fertigen Peptidprodukt.

Außer der oben dargestellten Folge von Stufen können für die Herstellung der Verbindungen der Formel I auch andere Stufenfolgen angewandt werden. Ein anderes anwendbares Verfahren besteht in der stufenweisen aufeinanderfolgenden Anfügung der einzelnen Aminosäuren beim Aufbau der Peptidkette, wobei mit der Aminosäure mit endständiger Carboxamidgruppe begonnen wird. Eine weitere anwendbare Methode ist eine Festphasenpeptidsynthese. Dabei wird der Rest mit dem C-Ende an einen polymeren Träger gebunden und das Peptid mit jeweils einem Rest verlängert, bis das gewünschte Peptid, das immer noch an das Polymere gebunden ist, erhalten wird. Dann wird das Peptid durch ein dafür geeignetes Spaltungsmittel von dem Polymeren abgelöst. Beispielsweise kann die am N^alpha-Stickstoff mit tert.-Butyloxycarbonyl geschützte N-Methylaminosäure mit C-Ende durch Aktivierung mit Dicyclohexylcarbodiimid mit einem Benzhydrylaminpolymeren verknüpft werden. Die N-tert.-Butoxycarbonylgruppe wird durch Umsetzung des an das Polymere gebundenen Rests mit Trifluoressigsäure in Methylenchlorid entfernt. Neutralisation des Polymersalzes mit einer tertiären Base und Anfügen eines zweiten Rests erfolgen auf die gleiche Weise. Das blockierte Peptid wird von dem Polymeren durch Behandlung mit flüssigem HF bei 0°C entfernt und durch Chromatographie gereinigt. Die genauen Bedingungen dieser Synthese sind dem Durchschnittsfachmann auf dem Gebiet der Festphasenpeptidsyxnthese bekannt und geläufig.

Die N-monosubstituierten Aminosäuren können, wie im folgenden dargestellt, unter Verwendung einer N-geschützten Aminosäure als Ausgangsmaterial hergestellt werden:

Wie vorstehend angegeben, wird die Aminosäure zuerst mit Kaliumhydrid in Gegenwart eines dafür geeigneten Ethers zur Ausbildung des Dianions behandelt, das dann mit Methyliodid in die gewünschte N-substituierte Aminosäure übergeführt wird.

Wie für den Durchschnittsfachmann auf dem Gebiet der Peptidchemie ohne weiteres ersichtlich, kann unter stark alkalischen Bedingungen, wie sie bei der obigen Alkylierung angewandt werden, Racemisierung am alpha-Kohlenstoffatom erfolgen. Das Ausmaß der Racemisierung kann in Abhängigkeit von der jeweils betroffenen Aminosäure schwanken. Die Racemisierung kann durch Verwendung von überschüssigem Alkylierungsmittel und dadurch, daß die Reaktionszeit so kurz wie möglich gehalten wird, auf ein Minimum gesenkt werden. Wenn aber tatsächlich eine stärkere Racemisierung erfolgt, dann kann das Produkt durch Umkristallisieren als Salz eines dafür geeigneten chiralen Amins, z. B. als das Salz von d(+)-alpha-Phenylethylamin, gereinigt werden.

Das C-Ende des Pentapeptids der Formel I wird in sein Amid übergeführt. Die Überführung in das Amid erfolgt durch Aktivieren der Carboxylgruppe der Aminosäure mit N,N′-Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) in Gegenwart von 1-Hydroxybenztriazol (HBT) unter Bildung des HBT-Esters. Zur Herstellung der Peptapeptide der Formel I wird der Ester mit wasserfreiem Ammoniak zu dem umsubstituierten Amid umgesetzt.

Die Verbindungen der Formel I können als solche verabreicht werden, oder sie können zu pharmazeutischen Zubereitungen in Form von Dosierungseinheiten für die parenterale Verabreichung verarbeitet werden. Für solche Zubereitungen können organische oder anorganische Feststoffe und/oder Flüssigkeiten, die pharmazeutisch annehmbare Träger darstellen, verwendet werden. Hierfür in Betracht kommende Träger sind allgemein bekannt. Die Zubereitungen können Tabletten, Pulvergranulate, Kapseln, Suspensionen oder Lösungen sein.

Wenn sie in einer wirksamen Menge verabreicht werden, rufen die Verbindungen der Formel I eine analgetische Wirkung hervor. Die Dosierungen liegen im Bereich von etwa 0,1 bis 100 mg/kg Körpergewicht des Empfängers. Der bevorzugte Dosierungsbereich liegt zwischen 1,0 und 20 mg/kg Körpergewicht des Empfängers.

Zur pharmazeutischen Wirksamkeit:
Die analgetische Wirksamkeit der Verbindungen der Formel I wird durch den Maus-Heizplattentest nachgewiesen. Bei diesem Test wird eine Maus in einen aufrechtstehenden Acrylzylinder eingebracht, dessen Boden eine an ihrer Oberfläche bei 52°C gehaltene Heizplatte bildet. Der Maus wird durch subkutane Injektion eine vorbestimmte Menge der Testverbindung, die in einem Träger gelöst oder suspendiert ist, verabreicht. Nach Verstreichenlassen einer vorbestimmten Zeit nach der Verabreichung der Testverbindung wird die Maus auf die Heizplattenoberfläche gebracht. Die Zeit in Sekunden bis zum jeweiligen Eintritt zweier gesonderter Phänomene wird aufgezeichnet. Erstens wird die Zeit, bis die Maus ihre Hinterpfote leckt, gemessen und zweitens wird die Zeit gemessen, bis die Maus von der Heizplattenoberfläche hochspringt. Ein Mittel mit analgetischer Wirksamkeit führt zu einer Erhöhung dieser Zeiten im Vergleich zu Kontrollmäusen, die lediglich Injektionen des Trägers erhalten. Dies muß in einem Dosisbereich erfolgen, der nicht zu einer motorischen Inkoordination oder Inkapazität führt. In den folgenden Tabellen sind die bei diesem Test erhaltenen Ergebnisse zusammengestellt, wobei mit einer Kontrolle mit natürlichem Enkephalin und mit dem Amid von natürlichem Enkephalin verglichen wird. In der Tabelle I sind die Zeiten bis zum Lecken der Hinterpfote, in Tabelle II die Zeiten bis zum Fluchtsprung und in Tabelle III die Prozentsätze der Tiere jeder Testgruppe angegeben, die eine analgetische Wirkung zeigen. Das Kriterium für einen positiven analgetischen Effekt ist folgendes: Die Zeit bis zum Lecken der Hinterpfote oder bis zum Fluchtsprung muß bei einem behandelten Tier gleich der oder größer als die mittlere Kontrollzeit plus zwei Standardabweichungen vom Mittel sein. Jedes Ergebnis in den folgenden Tabellen I und II stellt den Mittelwert plus oder minus Standardfehler dar, und Tabelle III zeigt die Prozentsätze, die mit wenigstens 9 Mäusen und bis zu 40 Mäusen erhalten werden.

Tabelle I

Analgetische Wirksamkeit

Tabelle II

Analgetische Wirksamkeit

Tabelle III

Analgetische Wirksamkeit

Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele weiter erläutert.

Beispiel 1 Herstellung von L-Tyrosyl-D-alanyl-glycyl-L-phenylalanyl-N^alpha-methyl-L-methionylamid- hydrochlorid A. D-Alanin-benzylester-p-toluolsulfonat

Zu einer Mischung aus 100 ml Benzylalkohol, 200 ml Benzol und 55,1 g (0,29 Mol) p-Toluolsulfonsäuremonohydrat werden 25 g (0,281 Mol) D-Alanin gegeben. Die Mischung wird zum Sieden unter Rückfluß erwärmt, und das Wasser wird azeotrop in einer Dean-Stark-Falle entfernt. Nach 15stündigem Erwärmen wird die Mischung auf Zimmertemperatur abgekühlt und mit Ether verdünnt. Der gebildete Niederschlag wird abgetrennt und aus Methanol/Ether umkristallisiert, wodurch 55,3 g (56%) der in der Überschrift genannten Verbindung vom F.=112 bis 115°C erhalten werden.

Analyse, C₁₇H₂₁NO₅S (351,42):

berechnet:C 58,10; H 6,02; N 3,99; gefunden:C 58,19; H 6,06; N 3,82.

B. N-tert.-Butyloxycarbonyl-O-benzyl-L-tyrosyl-D-alanin-benzylester

35,1 g (0,1 Mol) des nach Teil A erhaltenen Produkts werden zu 200 ml trockenem N,N-Dimethylformamid (DMF) gegeben. Die erhaltene Mischung wird gerührt und auf 0°C abgekühlt und mit 11,2 g (0,1 Mol) Diazabicyclooctan (DABCO) versetzt. Die Mischung wird 10 Minuten bei 0°C gerührt, worauf zuerst 37,1 g (0,1 Mol) N-tert.-Butyloxycarbonyl-O-benzyl-L-tyrosin und dann 13,5 g (0,1 Mol) 1-Hydroxybenztriazol (HBT) und 20,6 g (0,1 Mol) N,N′-Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) zugegeben werden. Die erhaltene Mischung wird 3 Stunden bei 0°C und dann 24 Stunden bei Zimmertemperatur gerührt. Nach Abkühlen auf 0°C wird die entstandene Suspension filtriert und das Filtrat im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wird in Ethylacetat gelöst und nacheinander mit 1n NaHCo₃, Wasser, kalter 0,75 n Citronensäure und Wasser gewaschen. Die organische Schicht wird über Magnesiumsulfat getrocknet, abfiltriert und im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wird in warmem Ethanol gelöst, und nach dem Abkühlen der Lösung erfolgt Kristallisation. Nach einmaligem Umkristallisieren aus Ethanol werden 41,5 g (80%) der reinen in der Überschrift genannten Verbindung vom F.=121 bis 123°C erhalten.

Analyse, C₃₀H₃₆N₂O₆ (520,63):

berechnet:C 69,21; H 6,97; N 5,38; gefunden:C 68,99; H 6,75; N 5,17.

C. N-tert.-Butyloxycarbonyl-O-benzyl-L-tyrosyl-D-alanin

Zu einer Mischung von 200 ml Tetrahydrofuran (THF) mit 20 ml Wasser werden 31,2 g (0,06 Mol) des nach Teil B erhaltenen Produkts gegeben. Die Lösung wird auf 0°C abgekühlt und langsam mit 13,2 ml (1,1 Äquiv.) 5 n Natriumhydroxid versetzt. Die Mischung wird unter Rühren langsam auf Zimmertemperatur kommen gelassen. Nach 5 Stunden wird sie zwischen Wasser und Ether verteilt, und die wäßrige Schicht wird abgetrennt und abgekühlt.

Der pH wird durch Zusatz von Citronensäure auf 2 eingestellt, worauf mit Ethylacetat extrahiert wird. Der Ethylacetatextrakt wird mit Wasser gewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet, abfiltriert und mit Ether verdünnt. Der gebildete Niederschlag wird gewonnen, und es werden 17,7 g (67%) der in der Überschrift genannten Verbindung vom F.=160 bis 162°C erhalten.

Analyse, C₂₄H₃₀N₂O₆ (442,51):

berechnet:C 65,14; H 6,83; N 6,63; gefunden:C 64,73; H 6,70; N 6,20.

D. N-tert.-Butyloxycarbonyl-O-benzyl-L-tyrosyl-D-alanyl-glycin-benzyles-ter

Zu 70 ml trockenem DMF werden 6,74 g (0,02 Mol) des Salzes des Glycinbenzylesters mit p-Toluolsulfonsäure gegeben. Die erhaltene Mischung wird auf 0°C abgekühlt und mit 2,24 g (0,020 Mol) DABCO versetzt. Die Mischung wird einige Minuten gerührt, und dann werden 8,84 g (0,020 Mol) des nach Teil C erhaltenen Produkts und anschließend 2,7 g (0,020 Mol) HBT und 4,12 g (0,020 Mol) DCC zugegeben. Das Reaktionsgemisch wird 2 Stunden bei 0°C und dann 24 Stunden bei Zimmertemperatur gerührt. Die erhaltene Suspension wird auf 0°C abgekühlt und filtriert, und das Filtrat wird im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wird in Ethylacetat gelöst und nacheinander mit 1n Natriumbicarbonat, Wasser, kalter 0,75n Citronensäure und Wasser gewaschen. Die organische Phase wird über Magnesiumsulfat getrocknet, abfiltriert und im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wird aus Ethanol umkristallisiert und ergibt 10,8 g (92%) der reinen in der Überschrift genannten Verbindung vom F.=145 bis 147°C.

Analyse, C₃₃H₃₉N₃O₇ (589,69):

berechnet:C 67,22; H 6,67; N 7,13; gefunden:C 67,32; H 6,83; N 6,91.

E. N-tert.-Butyloxycarbonyl-L-tyrosyl-D-alanyl-glycin

Zu 60 ml DMF werden 10,5 g (0,018 Mol) des nach Teil D erhaltenen Produkts und dann 2,5 g 5% Pd/C als Aufschlämmung in DMF gegeben. Die erhaltene Mischung wird mit Stickstoff gespült, und dann wird Wasserstoff bei Atmosphärendruck und Zimmertemperatur durch ein Gasverteilungsrohr eingeleitet. Nach 3½ Stunden wird die Wasserstoffzufuhr abgebrochen, und der Katalysator wird abfiltriert. Das Filtrat wird im Vakuum eingeengt, und der Rückstand wird mit Ether verrieben. Dadurch werden 5,4 g (75%) der in der Überschrift genannten Verbindung als amorpher Feststoff erhalten.

Analyse, C₂₆H₂₆N₂O₅ (446,65):

berechnet:C 69,94; H 5,87; N 6,27; gefunden:C 70,08; H 5,82; N 6,16.

F. N-tert.-Butyloxycarbonyl-N^alpha-methyl-L-methionylamid

17,2 g (0,04 Mol) des Dicyclohexylaminsalzes von N-tert.- Butyloxycarbonyl-L-methionin werden mit Ethylacetat und kalter 0,75n Citronensäure geschüttelt, und die organische Phase wird abgetrennt, mit Wasser gewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet, abfiltriert und im Vakuum bis zu einem öligen Rückstand eingeengt. Dieser Rückstand wird in einer Mischung aus 80 ml trockenem THF und 10 ml DMF gelöst und mit 0,5 g 18-Kron-6- Ether versetzt. Eine Kaliumhydridsuspension (äquivalent 0,12 Mol) wird unter Rühren tropfenweise in 30 Minuten zu der erhaltenen gekühlten Mischung gegeben. Nach Zugabe von 2,49 ml (0,04 Mol) Methyliodid wird die Mischung 24 Stunden bei Zimmertemperatur gerührt. Dann wird sie abgekühlt und mit 0,75n Citronensäure bis zu pH 3 angesäuert und mit Wasser und Ether geschüttelt. Die Etherschicht wird mehrere Male mit Wasser gewaschen und dann mit 1n Natriumbicarbonat extrahiert. Die wäßrigen Extrakte werden vereinigt, auf pH 2 angesäuert und mit Ethylacetat extrahiert. Der Ethylacetatextrakt wird über Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und im Vakuum eingedampft, wodurch 8,4 g Produkt mit einem NMR-Spektrum erhalten werden, das dem gewünschten N-methylierten Produkt entspricht. [δ 2,92, N-CH₃; δ 2,11, S-CH₃; δ 1,6, C(CH₃)₃].

8,4 g (etwa 0,034 Mol) dieses Öls werden in 60 ml DMF gelöst. Die Lösung wird auf 0°C abgekühlt und mit 4,69 g (0,035 Mol) HBT und 7,0 g (0,034 Mol) DCC versetzt. Die Mischung wird 2 Stunden bei 0°C gerührt, und durch ein Gasverteilungsrohr wird 45 Minuten wasserfreies Ammoniak in die Mischung eingeleitet. Dann wird filtriert, und das Filtrat wird im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wird auf eine 3×50 cm große Säule aus Kieselgel (Korngröße entsprechend Sieböffnungen von 250 bis 75 Mikron) aufgebracht und mit Chloroform und dann mit einer Mischung von Chloroform mit Methanol im Verhältnis 9,75 : 0,25 eluiert. Die Dünnschichtchromatographie (TLC) der aus der Säule austretenden Fraktionen und die dann vorgenommene Vereinigung aufgrund der erhaltenen Chromatogramme liefert nach dem Einengen im Vakuum ein Produkt, das zweimal aus einer Mischung von Ether mit Petrolether umkristallisiert wird. Auf diese Weise werden 4,1 g (39%) der in der Überschrift genannten Verbindung vom F.=75 bis 78°C erhalten.

NMR: δ 2,80, N-CH₃; 2,10, S-CH₃; 1,48, C(CH₃)₃.

Analyse, C₁₁H₂₂N₂SO₃ (262,37):

berechnet:C 50,36; H 8,45; N 10,68; gefunden:C 50,59; H 8,24; N 10,87.

G. N-tert.-Butyloxycarbonyl-L-phenylalanyl-N^alpha-methyl-L-methionylamid

In eine Mischung aus 20 ml Eisessig, 2 ml Anisol, 2 ml Triethylsilan und 3,8 g (0,0144 Mol) des nach Teil F erhaltenen Produkts wird 30 Minuten lang wasserfreier Chlorwasserstoff eingeleitet. Dann wird die Mischung mit Ether verdünnt. Der gebildete Niederschlag wird abfiltriert, getrocknet (2,9 g) und wieder in 40 ml DMF gelöst. Die Mischung wird auf 0°C abgekühlt und zunächst mit 2,9 ml (0,0146 Mol) Dicyclohexylamin und dann mit 1,97 g (0,0146 Mol) HBT, 3,87 g (0,0146 Mol) N-tert.-Butyloxycarbonyl-L-phenylalanin und 3,0 g (0,0146 Mol) DCC versetzt. Die erhaltene Mischung wird 2 Stunden bei 0°C und dann 24 Stunden bei Zimmertemperatur gerührt. Nach Abkühlen auf 0°C wird filtriert, und das Filtrat wird im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wird in Ethylacetat glöst, und die Lösung wird nacheinander mit 1n Natriumbicarbonat, Wasser, 0,75n Citronensäure und Wasser gewaschen. Nach dem Trocknen über Magnesiumsulfat und Eindampfen im Vakuum wird ein Öl erhalten, das sich in Petrolether nicht zum Kristallisieren bringen läßt. Deshalb wird es auf eine Säule von 3×50 cm Kieselgel (Korngröße entsprechend Sieböffnungen von 250 bis 75 Mikron) aufgebracht und mit Chloroform und anschließend mit Chloroformmethanol (9,8 : 0,2) eluiert. TLC-Analyse der aus der Säule austretenden Fraktionen und anschließende Vereinigung aufgrund der Chromatogramme ergibt nach dem Verdampfen des Lösungsmittels einen Rückstand, der aus Ether/Petrolether umkristallisiert wird und 3,1 g (52,5%) der in der Überschrift genannten Verbindung vom F.=99 bis 103°C ergibt.
Analyse, C₂₀H₃₁N₃O₄S (409,55):

berechnet:C 58,65; H 7,63; N 10,26; gefunden:C 58,74; H 7,47; N 10,45.

H. N-tert.-Butyloxycarbonyl-L-tyrosyl-D-alanyl-glycyl-L-phenylalanyl-N^alpha-methyl-L- methionylamid

Zu einer Mischung aus 20 ml Eisessig, 3 ml Anisol und 3 ml Triethylsilan werden 2,2 g (5,37 mMol) des nach Teil G erhaltenen Produkts gegeben. Trockener Chlorwasserstoff wird 30 Minuten lang in die Mischung eingeleitet. Nach Zugabe von Ether wird der ausgefallene Feststoff abfiltriert und im Vakuum getrocknet. Dieser Feststoff, 1,75 g (5 mMol) wird in 30 ml trockenem DMF gelöst und die Lösung wird auf 0°C abgekühlt. Das Hydrochlorid wird durch Zugabe von 0,99 ml (5 mMol) Dicyclohexylamin neutralisiert. Nach 5 Minuten werden 2,05 g (5 mMol) des nach Teil E erhaltenen Produkts und danach 0,68 g (5 mMol) HBT und 1,03 g (5 mMol) DCC zugegeben. Die Mischung wird 24 Stunden bei 4°C gerührt. Die unlöslichen Anteile werden durch Filtrieren entfernt, und das Filtrat wird im Vakuum eingedampft. Der so erhaltene Rückstand wird in Ethylacetat gelöst, und die Lösung wird nacheinander mit 1n wäßrigem Natriumbicarbonat, kalter 0,75n Citronensäure und Wasser gewaschen und über Magnesiumsulfat getrocknet. Dann wird die Lösung auf eine 3×50 cm messende Säule aus Kieselgel (Korngröße entsprechend Sieböffnungen von 250 bis 75 Mikron) aufgebracht und mit Chloroform und dann mit Chloroform/Methanol (9 : 1) eluiert. TLC-Analyse der aus der Säule austretenden Fraktionen und anschließende Vereinigung aufgrund der erhaltenen Chromatogramme ergibt zwei Anteile Rohprodukt mit einem Gewicht von 0,80 g bzw. 1,2 g. Der erste Anteil wird durch präparative Dickschichtchromatographie an Kieselgel (Chloroform/Methanol, 9 : 1) weiter gereinigt und ergibt 0,62 g der in der Überschrift genannten Verbindung als amorphen Feststoff.

Analyse, C₃₄H₄₈N₆O₈S (700,86):

berechnet:C 58,27; H 6,90; N 11,99; gefunden:C 58,48; H 6,64; N 11,97.

Aminosäureanalyse, gefunden: Tyr 0,99, Ala 1,00, Gly 1,00, Phe 1,00.

Der zweite Anteil an Substanz wird zweimal in der oben beschriebenen Weise chromatographiert und ergibt 0,74 g des gewünschten Produkts mit zutreffender Elementar- und Aminosäureanalyse.

I. L-Tyrosyl-D-alanyl-glycyl-L-phenylalanyl-N^alpha-methyl-L-methionylamid-hydrochlorid

Zu 5 ml Eisessig und 0,2 ml Anisol werden 0,72 g (1,03 mMol) der in der Überschrift von Teil H genannten Verbindung gegeben. Dann wird 20 Minuten lang wasserfreier Chlorwasserstoff in die Mischung eingeleitet. Durch Lyophilisieren der Mischung werden 0,74 g der in der Überschrift genannten Verbindung erhalten. R_f ^A, 0,3.

Eine Analysenprobe des Produkts wird im Vakuum bei 100°C getrocknet.

Analyse, C₂₉H₄₁N₆O₆SCl (637.20):

berechnet:C 54,66; H 6,49; N 13,19; gefunden:C 54,36; H 6,19; N 13,00.

Aminosäureanalyse, gefunden: Tyr 1,01, Ala 0,99, Gly 1,00, Phe 1,00.

Beispiel 2 Herstellung von L-Tyrosyl-D-leucyl-glycyl-L-phenylalanyl-N^alpha-methyl-L-methionylamid- sesquihydrochlorid-monoacetat A. D-leucin-benzylester-p-toluolsulfonat

Diese Verbindung wird genauso hergestellt wie dies in Teil A von Beispiel 1 für die Herstellung der D-Alinatverbindung beschrieben ist. Ausbeute 73%, F.=155 bis 156°C.

Analyse, C₂₀H₂₇NO₅S (393,50):

berechnet:C 61,05; H 6,92; N 3,56; gefunden:C 61,17; H 6,68; N 3,81.

B. N-tert.-Butyloxycarbonyl-O-benzyl-L-tyrosyl-D-leucin-benzylester

Zu 50 ml DMF werden 7,86 g (0,020 Mol) des nach Teil A erhaltenen Produkts gegeben. Die Mischung wird auf 0°C abgekühlt und mit 2,24 g (0,020 Mol) DABCO versetzt. Nach 5 Minuten langem Rühren werden zunächst 7,42 g (0,020 Mol) N-tert.-Butyloxycarbonyl- O-benzyl-L-tyrosin und dann 2,7 g (0,020 Mol) HBT und 4,12 g (0,02 Mol) DCC zugegeben. Die gebildete Mischung wird 2 Stunden bei 0°C und dann 24 Stunden bei Zimmertemperatur gerührt. Nach Abkühlen auf 0°C wird die gebildete Suspension filtriert, und das Filtrat wird im Vakuum eingedampft. Der Rückstand wird in Ethylacetat gelöst, und die Lösung wird nacheinander mit 1n Natriumbicarbonat, Wasser, kalter 0,75 n Citronensäure und Wasser gewaschen. Die organische Phase wird über Magnesiumsulfat getrocknet, abfiltriert und im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wird aus warmem Ethanol umkristallisiert und liefert 9,0 g (78%) der in der Überschrift genannten Verbindung vom F.=100 bis 103°C.

Analyse, C₃₄H₄₂N₂O₆ (574,72):

berechnet:C 71,06; H 7,37; N 4,87; gefunden:C 71,30; H 7,15; N 4,79.

C. N-tert.-Butyloxycarbonyl-O-benzyl-L-tyrosyl-D-leucin

Zu 80 ml THF werden 8,0 g (0,0139 Mol) des nach Teil B erhaltenen Produkts gegeben. Nach Zugabe von 20 ml Wasser wird die Mischung auf 0°C abgekühlt und mit 7,25 ml (0,0145 Mol) 2n Natriumhydroxid langsam versetzt. Nach vollständiger Zugabe wird die Mischung 30 Minuten bei 0°C und dann 4 Stunden bei Zimmertemperatur gerührt. Anschließend wird sie mit Wasser und Ether geschüttelt, und die wäßrige Phase wird abgetrennt, auf 0°C abgekühlt, mit 1n HCl auf pH 2 angesäuert und mit Ethylacetat extrahiert. Die Ethylacetatextrakt wird mit Wasser gewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet, abfiltriert und in Vakuum bis zu einem sirupösen Rückstand eingeengt. Dieser Rückstand wird aus Ether/Petrolether umkristallisiert und man erhält 6,4 g (95%) der in der Überschrift genannten Verbindung vom F.=90 bis 94°C.

Analyse, C₂₇H₃₆N₂O₆ (484,59):

berechnet:C 66,92; H 7,49; N 5,78; gefunden:C 67,14; H 7,38; N 5,76.

D. N-tert.-Butyloxycarbonyl-O-benzyl-L-tyrosyl-D-leucyl-glycin-benzyles-ter

Zu einer Mischung aus 3,37 g (0,010 Mol) des Salzes von Benzylglycinat mit p-Toluolsulfonsäure und 1,12 g (0,010 Mol) DABCO in 25 ml trockenem DMF werden 4,84 g (0,010 Mol) der nach Teil C erhaltenen Verbindung gegeben. Die Mischung wird auf 0°C gekühlt und dann mit 1,35 g (0,010 Mol) HBT und 2,06 g (0,010 Mol) DCC versetzt. Die so erhaltene Mischung wird 2 Stunden bei 0°C und dann 24 Stunden bei Zimmertemperatur gerührt, wieder auf 0°C abgekühlt und filtriert. Das Filtrat wird im Vakuum eingeengt, und der erhaltene Rückstand wird in Ethylacetat gelöst. Die Lösung wird nacheinander mit 1n Natriumbicarbonat, Wasser, kalter 0,75n Citronensäure und Wasser gewaschen. Dann wird sie über Magneisumsulfat getrocknet, abfiltriert und im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wird aus Ethanol/Wasser umkristallisiert und ergibt 4,0 g (63%) der in der Überschrift genannten Verbindung von F.=114 bis 116°C.

Analyse, C₃₆H₄₅N₃O₇ (631,77):

berechnet:C 68,44; H 7,18; N 6,65; gefunden:C 68,17; H 7,12; N 6,40.

E. N-tert.-Butyloxycarbonyl-L-tyrosyl-D-leucyl-glycin

Eine Mischung aus 5 ml wasserfreiem DMF, 3,9 g (0,006 Mol) der nach Teil D erhaltenen Verbindung, 1,5 g 5% Pd/C und 40 ml Ethanol wird mit Stickstoff gespült, worauf 5 Stunden lang Wasserstoff eingeleitet wird, wobei die Mischung bei Atmosphärendruck und Zimmertemperatur gehalten wird. Nach Abfiltrieren des Katalysators wird das Filtrat im Vakuum eingedampft, und der Rückstand wird aus Ether/Ethylacetat umkristallisiert, wodurch 2,3 g (85%) der in der Überschrift genannten Verbindung vom F.=189 bis 190°C erhalten werden.

Analyse, C₂₂H₃₃N₃O₇ (451,52):

berechnet:C 58,52; H 7,37; N 9,31; gefunden:C 58,79; H 7,48; N 9,39.

F. N-tert.-Butyloxycarbonyl-L-tyrosyl-D-leucyl-glycyl-L-phenylalanyl-N^alpha-methyl-L- methionylamid

Zu 10 ml wasserfreiem DMF werden 0,692 g (0,002 Mol) des wie in Teil H von Beispiel 1 beschrieben hergestellten Hydrochlorids von L-Phenylalanyl-N^alpha-methyl-L-methionylamid und 0,903 g (0,002 Mol) des nach Teil E dieses Beispiels erhaltenen Produkts gegeben. Nach Abkühlen auf 0°C werden 0,28 ml (0,002 Mol) Triethylamin und 10 Minuten später 0,27 g (0,002 Mol) HBT und 0,412 g (0,002 Mol) DCC gegeben. Die Mischung wird 2 Stunden bei 0°C und dann 24 Stunden bei 4°C gerührt. Der entstandene Niederschlag wird abfiltriert, und das Filtrat wird im Vakuum bis zu einem Rückstand eingeengt, der in Ethylacetat gelöst wird. Die Ethylacetatlösung wird nacheinander mit 1n Natriumbicarbonat, Wasser, kalter 0,75n Citronensäure und Wasser gewaschen. Die organische Phase wird über Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wird auf 2 präparative Dickschichtchromatographierplatten aufgebracht, und die Platten werden mit Chloroformmethanol (9,25 : 0,75) eluiert. Die größere UV-positive Bande wird aus jeder Platte ausgeschnitten, und das Produkt wird mit Chloroformmethanol aus dem Kieselgel eluiert. Durch Entfernen des Lösungsmittels im Vakuum werden 1,2 g (81%) der in der Überschrift genannten Verbindung als amorpher Feststoff erhalten.

Analyse, C₃₇H₅₄N₆O₈S (742,93):

berechnet:C 59,82; H 7,33; N 11,31; gefunden:C 59,88; H 7,06; N 11,15.

Aminosäureanalyse, gefunden: Tyr 1,01, Leu 1,00, Gly 1,00, Phe 0,99.

G. L-Tyrosyl-D-leucyl-glycyl-L-phenylalanyl-N^alpha-methyl-L-methionylamid-sesquihydrochlorid-monoacetat

Zu 5 ml Eisessig, die 0,3 ml Anisol enthalten, werden 0,9 g (0,0012 Mol) der nach Teil F erhaltenen Verbindung gegeben. In diese Mischung wird 20 Minuten lang trockener Chlorwasserstoff eingeleitet. Durch Lyophilisieren aus wäßriger Essigsäure wird das Lösungsmittel entfernt, wodurch die in der Überschrift genannte Verbindung als amorpher Feststoff erhalten wird.

Analyse, C₃₂H₄₇N₆O₈S · 1,5 HCl · C₂H₄O₂ (757,04):

berechnet:C 53,93; H 6,79; N 11,10; Cl 7,02; gefunden:C 54,30; H 6,64; N 11,32; Cl 6,96.

Aminosäureanalyse, gefunden: Tyr 0,99, Leu 1,03, Gly 0,99, Phe 0,99.

Beispiel 3 Herstellung von L-Tyrosyl-D-alanyl-L-alanyl-L-phenylalanyl-N^alpha-methyl-L-methionylamid, 1,25 Hydro­ chlorid, Monoacetat A. N-tert.-Butyloxycarbonyl-O-benzyl-L-tyrosyl-D-alanyl-L-alanin-benzyl-ester

Zu einer Lösung von 3,19 g (0,010 Mol) des p-Toluolsulfonats von Alanin-benzylester in 30 ml trockenem DMF werden 4,43 g (0,010 Mol) des nach Teil B von Beispiel 1 erhaltenen Produkts gegeben. Nach Abkühlen auf 0°C wird die Mischung mit 1,12 g (0,010 Mol) DABCO und anschließend nach 10 Minuten mit 1,135 g (0,010 Mol) HBT und 2,06 g (0,010 Mol) DCC versetzt. Die so erhaltene Mischung wird 2 Stunden bei 0°C und dann 48 Stunden bei Zimmertemperatur gerührt. Der gebildete Niederschlag wird abfiltriert, und das Filtrat wird im Vakuum bis zu einem Sirup eingeengt. Dieser Sirup wird in Ethylacetat gelöst, und die Lösung wird nacheinander mit 1n Natriumbicarbonat, Wasser, kalter 0,75n Salzsäure und Wasser gewaschen, Nach Trocknen über Magnesiumsulfat und Filtrieren wird das Filtrat im Vakuum eingeengt, wodurch ein Rückstand erhalten wird, der sich mit Ethanol oder Ether nicht zur Kristallisation bringen läßt. Durch Verdünnen der etherischen Lösung mit Petrolether wird ein Gel erhalten, das abfiltriert und im Vakuum getrocknet wird. Die unreine amorphe Substanz (4,0 g) wird auf eine 3×50 cm messende Säule aus Kieselgel aufgebracht und mit Chloroform und dann mit Chloroform/Methanol (9,75 : 9,25) eluiert. TLC- Analyse der aus der Säule austretenden Fraktionen und anschließende Vereinigung der Fraktionen aufgrund des TLC- Profils sowie Verdampfen des Lösungsmittels im Vakuum führt zu einem sirupösen Rückstand. Durch Lösen dieses Rückstands in Ether und Fällen mit Petrolether werden 3,0 g (50%) der in der Überschrift genannten Verbindung als amorpher Feststoff vom F.=100 bis 104°C erhalten.

Analyse, C₃₄H₄₁N₃O₇ (603,72):

berechnet:C 67,64; H 6,85; N 6,96; gefunden:C 67,56; H 6,60; N 7,16.

B. N-tert.-Butyloxycarbonyl-L-tyrosyl-D-alanyl-L-alanin

Zu einer Mischung aus 5 ml trockenem DMF und 21,9 g (0,0048 Mol) des nach Teil A erhaltenen Produkts werden 1,0 g 5% Pd/C und dann 50 ml Ethanol gegeben. Durch ein Gasverteilungsrohr wird bei Atmosphärendruck und Zimmertemperatur 6 Stunden lang Wasserstoff eingeleitet. Dann wird das Reaktionsgefäß mit Stickstoff gespült, der Katalysator abfiltriert und das Filtrat im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wird in Ethylacetat gelöst, und die Lösung wird mit Ether verdünnt. Der gebildete Niederschlag wird abfiltriert und im Vakuum getrocknet, wodurch 1,5 g (74%) der in der Überschrift genannten Verbindung als amorpher Feststoff erhalten werden.

Analyse, C₂₀H₂₉N₃O₇ (423,47):

berechnet:C 56,73; H 6,90; N 9,92; gefunden:C 56,80; H 6,95; N 9,81.

C. N-tert.-Butyloxycarbonyl-L-tyrosyl-D-alanyl-L-alanyl-L-phenylalanyl-N^alpha-methyl-L- methionylamid

Eine Mischung aus 10 ml trockenem DMF und 0,692 g (0,002 Mol) des Hydrochlorids von L-Phenylalanyl-N^alpha-methyl-L-methionylamid (hergestellt nach Teil H von Beispiel 1) wird auf 0°C abgekühlt und mit 0,28 ml (0,002 Mol) Triethylamin versetzt. Das Reaktionsgemisch wird 10 Minuten gerührt, worauf 0,846 g (0,002 Mol) des nach Teil B erhaltenen Produkts und danach 0,270 g (0,002 Mol) HBT und 0,412 g (0,002 Mol) DCC zugegeben werden. Die so erhaltene Mischung wird 2 Stunden bei 0°C und dann 48 Stunden bei Zimmertemperatur gerührt. Nach erneutem Abkühlen auf 0°C wird die Mischung filtriert, und das Filtrat wird im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wird in Ethylacetat gelöst, und diese Lösung wird nacheinander mit 1n Natriumbicarbonat, Wasser, kalter 0,75n Citronensäure und Wasser gewaschen. Durch Trocknen über Magnesiumsulfat, Filtrieren und Einengen des Filtrats im Vakuum werden 1,6 g Rohprodukt erhalten. Dieses Produkt wird in Chloroform gelöst und auf zwei präparative Dickschichtchromatographieplatten aufgebracht. Die Platten werden mit Chloroform/Methanol (9 : 1) eluiert. Die Hauptbande wird aus jeder Platte ausgeschnitten, und das Produkt wird mit Chloroform/Methanol extrahiert. Das Extrudat (1,3 g) wird auf eine einzige Dickschichtchromatographieplatte aufgebracht und erneut eluiert, wodurch 1,0 g (70%) der in der Überschrift genannten Verbindung als amorpher Feststoff erhalten werden;

Analyse, C₃₅H₅₀N₆O₈S (714,88):

berechnet:C 58,80; H 7,05; N 11,76; gefunden:C 58,60; H 6,87; N 11,53.

D. L-Tyrosyl-D-alanyl-L-alanyl-L-phenylalanyl-N^alpha-methyl-L-methionylamid-hydrochlorid-monoacetat

Zu einer Mischung aus 5 ml Eisessig und 0,5 ml Anisol werden 0,880 g (0,0011 Mol) des nach Teil C erhaltenen Produkts gegeben. Nach 20 Minuten langem Einleiten von trockenem Chlorwasserstoff wird das Reaktionsgemisch eingefroren und lyophylisiert, wodurch 0,704 g der in der Überschrift genannten Verbindung erhalten werden;

Analyse, C₃₀H₄₂N₆O₆S · 1,25 HCl · C₂H₄O₂ (719,14):

berechnet:C 53,43; H 6,45; N 11,68; Cl 6,16; gefunden:C 53,48; H 6,47; N 11,62; Cl 6,50.

Aminosäureanalyse, gefunden, Tyr 1,00, Ala 1,99, Phe 1,01.

Beispiel 4 Herstellung von L-Tyrosyl-D-alanyl-glycyl-L-phenylalanyl-L-N^alpha- methyl-S-ehtyl-cysteinylamid-acetat A. N-tert.-Butyloxycarbonyl-S-ethyl-L-cystein, Dicyclohexylaminsalz

Zu einer Mischung aus 400 ml N,N-Dimethylformamid (DMF) und 50 g (0,336 Mol) L-(S-Ethyl)-cystein werden 44,8 ml (0,336 Mol) Tetramethylguanidin und 66,8 ml (0,336 Mol) Dicyclohexylamin gegeben. Dann werden tropfenweise 68 ml (0,50 Mol) tert.-Butylazidoformiat innerhalb einer Stunde zugegeben, und die Mischung wird 48 Stunden bei Zimmertemperatur gerührt. Das ausgefallene Dicyclohexylammoniumazid wird abfiltriert, und das Filtrat wird im Vakuum eingedampft. Der Rückstand wird mit Ether und Wasser geschüttelt, und der pH-Wert der wäßrigen Schicht wird auf 8,0 eingestellt. Die organische Schicht wird abgetrennt und verworfen. Die wäßrige Schicht wird mit kalter verdünnter Salzsäure bis pH 2,0 angesäuert und mit kaltem Ethylacetat extrahiert. Die Ethylacetatlösung wird mit Wasser gewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet und im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wird in Ether gelöst, worauf 66,8 ml (0,336 Mol) Dicyclohexylamin zugegeben werden. Der so erhaltene Niederschlag wird abgetrennt und aus Ethylacetat umkristallisiert, wodurch 32,8 g (23% der Theorie) der in der Überschrift genannten Verbindung vom F.=156 bis 159°C erhalten werden.

Analyse, C₂₂H₄₂N₂O₄S (430,6):

berechnet:C 61,36; H 9,83; N 6,51; gefunden:C 61,37; H 9,98; N 6,26.

B. N-tert.-Butyloxycarbonyl-N-methyl-S-ethyl-L-cysteinylamid

Eine Mischung aus 50 ml trockenem Tetrahydrofuran (THF) und 18,58 g (74,3 mMol) N-tert.-Butyloxycarbonyl-S-ethyl-L-cystein (hergestellt durch Neutralisation des nach Teil A erhaltenen Produkts und Extraktion mit Ethylacetat) wird tropfenweise in 30 Minuten unter Rühren zu einer Suspension von 42,45 g einer Kaliumhydridsuspension (22,1% KH in Mineralöl; 0,234 Mol KH) in 375 ml THF von 0°C und einem 18-Kron-6-ethergehalt von 0,35 g gegeben. 9,25 ml (0,149 Mol) Methyliodid in 20 ml THF werden in 15 bis 20 Minuten tropfenweise zugesetzt. Die Mischung wird 1,5 Stunden bei 0°C gerührt, worauf 7,5 ml Essigsäure in 7,5 ml THF tropfenweise und danach 5 ml Ethanol zugegeben werden. Das so erhaltene Reaktionsgemisch wird auf Eis gegossen, und der pH-Wert wird mit 2n Natriumhydroxid auf etwa 9 eingestellt. Die erhaltene wäßrige Lösung wird mit Ether extrahiert, der pH-Wert der wäßrigen Schicht wird durch Zugabe von fester Citronensäure auf 3 eingestellt, worauf dreimal mit je 300 ml Ether extrahiert wird. Die Etherextrakte werden vereinigt, mit Wasser extrahiert, über Magnesiumsulfat getrocknet und im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wird in 200 ml Ether gelöst und mit 9,56 ml (74,3 mMol) d(+)-alpha-Methylbenzylamin versetzt. Nach Abkühlen und Zugabe von 500 ml Petrolether erfolgt keine Kristallisation. Deshalb wird die Lösung im Vakuum eingeengt, und der Rückstand wird in Petrolether gelöst. Die Mischung wird auf -78°C abgekühlt, wodurch sich eine kleine Menge eines Niederschlags bildet, der durch Filtrieren gewonnen wird (2,74 g). Die Mutterlauge wird im Vakuum eingeengt, und der Rückstand wird in Ether gelöst, die Etherlösung wird mit 1n Citronensäure und mit Wasser extrahiert, über Magnesiumsulfat getrocknet und im Vakuum eingeengt, wodurch 6,56 g (33% der Theorie) eines Sirups erhalten werden.

NMR (CDCl₃) δ: 2,90, N-CH₃; 1,45, t-Bu; 4,9-4,5, CH.

6,5 g (0,025 Mol) des Produkts werden in 80 ml DMF gelöst und auf -15°C abgekühlt. Nach Zugabe von 3,6 ml (0,027 Mol) Isobutylchlorformiat werden 2,99 ml (0,027 Mol) N-Methylmorpholin zugegeben. Die Mischung wird 10 Minuten bei -15°C gerührt, wonach 1 Stunde wasserfreies Ammoniak in die Reaktionsmischung eingeleitet wird. Die Mischung wird noch weitere 4 Stunden bei -15°C gerührt und dann auf eine Mischung aus Eis und 1n Natriumbicarbonat gegossen. Die kalte wäßrige Mischung wird mit Ether extrahiert und der Etherextrakt wird seinerseits mit kalter 0,75n Citronensäure und Wasser gewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet und im Vakuum eingeengt, wodurch ein Rückstand erhalten wird, der aus einer Mischung von Ether mit Petrolether umkristallisiert wird und 1,7 g (26%) der in der Überschrift genannten Verbindung vom F.=56 bis 59°C ergibt.

NMR (CHCl₃) w: 2,80, N-CH₃; 1,46, t-Bu; 4,9-4,5, alpha-CH.

Analyse, C₁₁H₂₁N₂O₃S (261,36):

berechnet:C 50,55; H 8,10; N 10,72; gefunden:C 50,56; H 7,93; N 10,51.

C. N-tert.-Butyloxycarbonyl-L-phenylalanyl-N^alpha-methyl-S-ethyl-L-cysteinylamid

In eine Mischung aus 20 ml Eisessig, 1 ml Triethylsilan, 4 ml Anisol und 2,5 g (9,5 mMol) N-tert.-Butyloxycarbonyl- N^alpha-methyl-S-ethyl-L-cysteinylamid wird 30 Minuten trockener Chlorwasserstoff eingeleitet, worauf Ether zur Fällung des Hydrochlorids zugesetzt wird. Der Niederschlag (1,8 g) wird in 25 ml DMF gelöst, und nach Abkühlen auf 0°C mit 1,31 ml Triethylamin neutralisiert. 2,65 g (0,01 Mol) N-tert.- Butyloxycarbonyl-L-phenylalanin und danach 1,35 g (0,01 Mol) HBT und 2,06 g (0,01 Mol) DCC werden zugegeben. Die erhaltene Mischung wird 2 Stunden bei 0°C und dann 24 Stunden bei Zimmertemperatur gerührt. Anschließend wird sie auf 0°C abgekühlt und vom gebildeten Niederschlag abfiltriert. Das Filtrat wird im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wird in Ethylacetat, gelöst, und diese Lösung wird mit 1n Natriumbicarbonat, Wasser, 0,75n Citronensäure und Wasser extrahiert. Nach Trocknen über Magnesiumsulfat wird das Lösungsmittel im Vakuum entfernt. Der hinterbleibende Sirup wird in Chloroform gelöst, und die Lösung wird auf eine 3×45 cm messende Säule von Kieselgel aufgebracht. Die Elution erfolgt mit Chloroform und abgestuften Chloroformmethanolmischungen [CHCl₃→CHCl₃/MeOH (9 : 1)], und die Lage des Produkts wird durch das TLC-Profil der Fraktionen festgestellt. Die entsprechenden Fraktionen werden vereinigt und im Vakuum eingedampft, wodurch 3,0 g der in der Überschrift genannten Verbindung erhalten werden.

Analyse, C₂₀H₃₁N₃O₄S (409,5):

berechnet:C 58,65; H 7,63; N 10,26; gefunden:C 58,87; H 7,41; N 9,81.

D. N-tert.-Butyloxycarbonyl-L-tyrosyl-D-alanylglycin, Dicyclohexylaminsalz

Das Produkt der Hydrogenolyse (nach Teil E von Beispiel 1) von 46,80 g N-tert.-Butyloxycarbonyl-O-benzyl-L- tyrosyl-D-alanyl-glycin-benzylester wird in 150 ml Isopropylalkohol gelöst und mit 16 ml (0,081 Mol) Dicyclohexylamin versetzt. Ether wird bis zu einem Gesamtvolumen von etwa 1,5 l zugesetzt. Die halbfeste Masse wird verrieben bis sie fest wird, und der erhaltene Niederschlag wird gewonnen und getrocknet, wodurch 46,04 g (98%) Substanz vom F.=194,5 bis 197°C erhalten werden. Diese Substanz wird in 100 ml siedendem Methanol gelöst, worauf 500 ml Isopropylalkohol zugegeben werden. Das Volumen der Lösung wird unter Stickstoff auf etwa 150 ml verringert. Nach dem Abkühlen setzt Kristallisation ein. Die Mischung wird über Nacht stehengelassen, und der Niederschlag wird gesammelt und getrocknet, wodurch 41,44 g (88%) der in der Überschrift genannten Verbindung vom F.=198 bis 200,5°C erhalten werden.

Analyse, C₃₁H₅₀N₄O₇ (590,8):

berechnet:C 63,03; H 8,53; N 9,48; gefunden:C 62,95; H 8,77; N 9,20.

E. N-tert.-Butyloxycarbonyl-L-tyrosyl-D-alanyl-glycyl-L-phenylalanyl-N^alpha-methyl-S-ethyl-L-cysteinyl­ amid

Zu einer Mischung aus 20 ml Eisessig, 3 ml Anisol und 3 ml Triethylsilan werden 2,5 g (6,1 mMol) des nach Teil C erhaltenen Produkts gegeben. Trockener Chlorwasserstoff wird 25 Minuten in die Mischung eingeleitet. Nach Zugabe von Ether wird die Mischung gekühlt und filtriert, wodurch 1,9 g (5,5 Mol) des Hydrochlorids erhalten werden. Das Salz wird in 25 ml DMF gelöst, und nach Abkühlen mit 3,2 g (5,5 mMol) des Dicyclohexylaminsalzes von N-tert.-Butyloxycarbonyl-L-tyrosyl- D-alanyl-glycin versetzt. Die so erhaltene Mischung wird 10 Minuten bei 0°C gerührt, worauf 0,74 g (5,5 mMol) HBT und 1,1 g (5,5 mMol) DCC zugegeben werden. Das Reaktionsgemisch wird 2 Stunden bei 0°C und 48 Stunden bei 4°C gerührt. Der gebildete Niederschlag wird abfiltriert, und das Filtrat wird im Vakuum eingedampft. Der Rückstand wird in Ethylacetat gelöst, und die Lösung wird mit 1n Natriumbicarbonat, Wasser, 0,75n Citronensäure und Wasser extrahiert. Die organische Schicht wird über Magnesiumsulfat getrocknet und im Vakuum eingedampft, wodurch 3,5 g der rohen, in der Überschrift genannten Verbindung erhalten werden. Das Produkt wird in Chloroform gelöst und auf eine 3×45 cm messende Säule aus Kieselgel aufgebracht, worauf mit Chloroform und abgestuften Chloroformmethanolmischungen [CHCl₃→CHCl₃/MeOH (9 : 1)] eluiert wird. Die Fraktionen werden entsprechend ihren Dünnschichtchromatogrammen vereinigt und im Vakuum eingeengt, wodurch 2,4 g (62%) der reinen, in der Überschrift angegebenen Verbindung, erhalten werden.

Analyse, C₃₄H₄₈N₆O₈S (700,86):

berechnet:C 58,27; H 6,90; N 11,99; gefunden:C 58,14; H 6,98; N 11,94.

Aminosäureanalyse, gefunden: Tyr 1,01, Ala 1,00, Gly 1,00, Phe 0,98, NH₃ 1,09.

F. L-Tyrosyl-D-alanyl-glycyl-L-phenylalanyl-L-N^alpha-methyl-S-ethyl-cysteinylamid-acetat

In einer Mischung aus 20 ml Eisessig, 2 ml Anisol, 2 ml Triethylsilan und 2,2 g (3 mMol) des nach Teil E erhaltenen Produkts wird 25 Minuten trockener Chlorwasserstoff eingeleitet. Nach Zugabe von Ether wird abgekühlt. Der gebildete Niederschlag wird abfiltriert und getrocknet (2,0 g). 1,2 g des Niederschlags werden durch Versetzen mit einer Pufferlösung (1% Pyridin und 0,05% Essigsäure in Wasser) bis zu einem Gesamtvolumen von 10 ml gelöst, und die Lösung wird auf eine 2,5×99 cm messende Säule aus DEAE-Sephadex®A25 (Acetat, das zuvor mit dem gleichen Puffer äquilibriert worden ist, aufgebracht. Das Eluat wird bei 280 nm überwacht, und die einander entsprechenden Fraktionen werden vereinigt und lyophilisiert. Erneutes Lyophilisieren aus 10% Essigsäure und dann aus Wasser/Acetonitril (75 : 25) ergibt 0,59 g der in der Überschrift genannten Verbindung.

Analyse, C₃₁H₄₄N₆O₈S (660,79):

berechnet:C 56,35; H 6,71; N 12,72; S 4,85; gefunden:C 56,63; H 6,72; N 12,63; S 4,69. Aminosäureanalyse, gefunden: Tyr 1,00, Ala 1,01, Gly 1,00, Phe 0,98, NH₃ 1,09.

Beispiel 5 Herstellung von L-Tyrosyl-D-alanyl-glycyl-L-phenylalanyl-N^alpha-methyl-L-leucylamid-ace­ tat A. N-tert.-Butyloxycarbonyl-N-methyl-L-leucin, d(+)-alpha-Methylbenzylaminsalz

Eine Mischung aus 20 ml Ether und 12,5 g (0,05 Mol) N-tert.- Butyloxycarbonyl-L-leucin-hydrat wird über Magnesiumsulfat getrocknet und im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wird in 75 ml THF gelöst, und die Lösung wird tropfenweise in 35 Minuten unter mechanischem Rühren zu einer auf 0°C abgekühlten Suspension von 27,9 g einer Kaliumhydridsuspension (22,1% in Mineralöl; 0,154 Mol KH) in 200 ml THF mit einem 18-Kron-6-Ethergehalt von 0,25 g gegeben. Dann werden innerhalb von 15 Minuten 6,4 ml Methyliodid in 10 ml THF zugesetzt. Die Mischung wird 3 Stunden bei 0°C gehalten, worauf zunächst 5 ml Essigsäure in 5 ml THF tropfenweise und dann 5 ml Ethanol zugegeben werden. Die so erhaltene Mischung wird auf 500 ml Eis gegossen, und der pH der Mischung wird durch Zugabe von 1n Natriumhydroxid auf etwa 9 eingestellt. Die wäßrige Lösung wird mit Ether extrahiert und dann durch Zugabe von fester Citronensäure bis zu einem pH-Wert von 3 angesäuert. Die angesäuerte wäßrige Suspension wird mit Ether extrahiert. Die vereinigten Etherextrakte werden mit Wasser gewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet und im Vakuum eingeengt, wodurch 13,2 g (107% der Theorie) Rohprodukt erhalten werden. Die Prüfung des Produkts durch TLC ergibt, daß noch etwas nichtumgesetztes Ausgangsmaterial vorhanden ist. Das Produkt wird in Ether gelöst und mit 5,25 ml (0,05 Mol) tert.-Butylamin versetzt. Die etherische Lösung wird mit Petrolether verdünnt und über Nacht gekühlt. Es bildet sich ein Niederschlag (5,4 g), der entfernt wird. Das Filtrat wird mit 1n Citronensäure und dann mit Wasser extrahiert. Nach Trocknen über Magnesiumsulfat und Einengen im Vakuum wird der Rückstand (6,45 g) in 100 ml Ether gelöst, worauf 3,39 g (0,026 Mol) d(+)-alpha-Methylbenzylamin zugegeben werden. Die Lösung wird über Nacht gekühlt und filtriert, wodurch 9,09 g (49% der Theorie) der in der Überschrift genannten Verbindung vom F.=120 bis 122°C erhalten werden;

Analyse, C₂₀H₃₄N₂O₄ (366,5):

berechnet:C 65,54; H 9,35; N 7,64; gefunden:C 65,83; H 9,05; N 7,35.

B. N-tert.-Butyloxycarbonyl-N-methyl-L-leucylamid

Eine Mischung aus 80 ml DMF und 11,5 (g 0,047 Mol) N-tert.- Butyloxycarbonyl-N-methyl-L-leucin (hergestellt durch Neutralisation des Produkts von Teil A mit Citronensäure und Extraktion mit Ether) wird auf -15°C abgekühlt. Nach Zugabe von 6,7 ml (0,052 Mol) Isobutylchlorformiat und 5,7 ml (0,052 Mol) N-Methylmorpholin wird die Mischung 10 Minuten bei -15°C gerührt, worauf wasserfreies Ammoniak 1 Stunde in das Reaktionsgemisch eingeleitet wird. Das Rühren wird noch 4 Stunden bei -15°C fortgesetzt. Dann wird das Reaktionsgemisch auf eine Mischung aus 1n Natriumbicarbonat und Eis gegossen. Die kalte Mischung wird mit Ether extrahiert, und der Etherextrakt wird mit 0,75 n Citronensäure und Wasser extrahiert, über Magensiumsulfat getrocknet und im Vakuum eingedampft. Der Rückstand wird aus einer Mischung aus Ether und Petrolether zur Kristallisation gebracht und ergibt 5,5 g (48%) der in der Überschrift genannten Verbindung vom F.=127 bis 128°C.

Analyse, C₁₂H₂₄N₂O₃ (244,3):

berechnet:C 58,99; H 9,90; N 11,47; gefunden:C 59,17; H 9,66; N 11,21.

C. N-tert.-Butyloxycarbonyl-L-phenylalanyl-N^alpha-methyl-L-leucylamid

Zu einer Mischung aus 30 ml Eisessig, 3 ml Anisol und 3 ml Triethylsilan werden 5,0 g (0,02 Mol) des nach Teil B erhaltenen Produkts gegeben. Dann wird 25 Minuten trockener Chlorwasserstoff eingeleitet, Äther zugegeben und die Mischung gekühlt. Der Niederschlag wird gewonnen und getrocknet (3,6 g). Das so erhaltene Hydrochlorid wird in 60 ml DMF gelöst, und die Lösung wird auf 0°C abgekühlt und mit 3,99 ml (0,02 Mol) Dicyclohexylamin versetzt. Die Mischung wird 10 Minuten bei 0°C gerührt, worauf zunächst 5,3 g (0,02 Mol) N-tert.- Butyloxycarbonyl-L-phenylalanin und dann 2,7 g (0,02 Mol) HBT und 4,12 g (0,02 Mol) DCC zugegeben werden. Das Reaktionsgemisch wird 2 Stunden bei 0°C und dann 24 Stunden bei Zimmertemperatur gerührt. Nach Abkühlen auf 0°C und Filtrieren wird das Filtrat im Vakuum eingedampft. Der Rückstand wird in Ethylacetat gelöst, und die Lösung wird mit 1n Natriumbicarbonat, Wasser, 0,75n Citronensäure und Wasser extrahiert. Nach Trocknen über Magnesiumsulfat wird das Lösungsmittel im Vakuum verdampft. Der erhaltene Rückstand wird in Chloroform gelöst und auf eine 3×45 cm messende Säule aus Kieselgel aufgegeben. Die Elution erfolgt mit Chloroform und abgestuften Chloroformmethanolgemischen [CHCl₃→CHCl₃/MeOH (9 : 1)]. Die Fraktionen werden aufgrund ihres TLC-Profils vereinigt und nach Verdampfen des Lösungsmittels werden 5,7 g (73%) der in der Überschrift genannten Verbindung erhalten.

NMR (CDCl₃) δ: 1,4, t-Bu; 7,25, Phenyl; 0,95 bis 0,75, CH(CH₃)₂; 2,7, N-CH₃.

D. N-tert.-Butyloxycarbonyl-L-tyrosyl-D-alanyl-glycyl-L-phenylalanyl-N^alpha-methyl-L- leucylamid

Eine Mischung aus 20 ml 1n HCl in Eisessig, 1 ml Anisol und 2,0 g des nach Teil C erhaltenen Produkts wird 30 Minuten bei Zimmertemperatur stehengelassen und dann mit Ether versetzt. Die Mischung wird abgekühlt, und der gebildete Niederschlag wird abfiltriert und getrocknet (1,63 g). Das so erhaltene Hydrochlorid wird in 30 ml DMF gelöst, und 2,95 g (0,05 Mol) N-tert.-Butyloxycarbonyl-L-tyrosyl-D-alanyl-glycin, Dicyclohexylaminsalz werden zugegeben. Die Mischung wird 15 Minuten bei 0°C gerührt und dann mit 0,675 g (0,005 Mol) HBT und 1,3 g (0,005 Mol) DCC versetzt. Das Reaktionsgemisch wird 24 Stunden bei 4°C gerührt. Der gebildete Niederschalg wird abfiltriert, und das Filtrat wird im Vakuum eingeengt. Eine Lösung des Rückstands in Ethylacetat wird mit 1n Natriumbicarbonat, Wasser, 0,75n Citronensäure und Wasser extrahiert. Nach Trocknen über Magnesiumsulfat wird die Ethylacetatlösung im Vakuum eingeengt. Eine Lösung des erhaltenen Rückstands in Chloroform wird auf eine 3×45 cm messende Säule aus Kieselgel aufgegeben, die mit Chloroform und abgestuften Methanolgemischen [CHCl₃→CHCl₃-MeOH (9 : 1)] eluiert wird. Die Fraktionen werden entsprechend dem TLC-Profil vereinigt. Durch Verdampfen des Lösungsmittels werden 2,3 g (67%) der in der Überschrift genannten Verbindung erhalten.

Analyse, C₃₅H₅₀N₆O₈ (682,8):

berechnet:C 61,57; H 7,38; N 12,31; gefunden:C 61,33; H 7,47; N 12,08.

Aminosäureanalyse, gefunden: Tyr 1,00, Ala 1,01, Gly 0,99, Phe 1,00, NH₃ 1,08.
a

E. L-Tyrosyl-D-alanyl-glycyl-L-phenylalanyl-N^alpha-methyl-L-leucylamid-acetat

Zu 5 ml Ameisensäure, die 0,5 ml Anisol und 0,1 ml Triethylsilan enthalten, werden 1,8 g (0,003 Mol) des nach Teil D erhaltenen Produkts gegeben. Die Mischung wird 3 Stunden bei Zimmertemperatur gerührt. Dann wird sie mit Ether verdünnt und 1 Stunde stehengelassen. Der Ether wird von dem gebildeten Öl abdekantiert, und das Öl wird in Ethanol gelöst. Durch Zugabe von Ether bildet sich ein Niederschlag, der abfiltriert und getrocknet wird, wodurch 0,9 g der rohen in der Überschrift angegebenen Verbindung erhalten werden. Das Produkt wird durch Zugabe einer Pufferlösung (1% Pyridin und 0,05% Ameisensäure in Wasser) bis zu einem Gesamtvolumen von 5,0 ml gelöst. Die Lösung wird auf eine 2,5×100 cm messende Säule aus DEAE-Sephadex®A-25 (Formiat) aufgegeben und wird mit der gleichen Pufferlösung eluiert. Auf der Grundlage der UV-Überwachung (280 nm) zusammengehörende Fraktionen werden vereinigt und lyophilisiert. Durch erneutes Lyophilisieren aus 10prozentiger Essigsäure und aus einer Mischung von Wasser und Acetonitril im Verhältnis 75 : 25 werden 0,852 g der in der Überschrift angegebenen Verbindung erhalten.

Aminosäureanalyse, gefunden: Tyr 1,02, Ala 1,00, Gly 1,01, Phe 0,96, NH₃ 1,03.

Beispiel 6 Herstellung von L-Tyrosol-D-alanyl-glycyl-L-phenylalanyl-S-p-methoxybenzyl-L-cystein-ylamid-hydro­ chlorid A. N-tert.-Butyloxycarbonyl-S-p-methoxybenzyl-L-cysteinylamid

Zu 80 ml auf -15°C gekühltes DMF werden 6,82 g (0,02 Mol) N-tert.-Butyloxycarbonyl-S-p-methoxy-benzyl-L-cystein gegeben. Die erhaltene gekühlte Mischung wird mit 2,88 ml (0,022 Mol) Isobutylchlorformiat und 2,42 ml (0,022 Mol) N-Methylmorpholin versetzt. 10 Minuten später wird 1,5 Stunden wasserfreies Ammoniak in das Reaktionsgemisch geleitet. Das Rühren wird bei -15°C noch weitere 2 Stunden fortgesetzt. Das Reaktionsgemisch wird in eine Mischung aus Eis und 1n Natriumbicarbonat gegossen, und die so erhaltene wäßrige Suspension wird mit Ethylacetat extrahiert. Der Ethylacetatextrakt wird mit Wasser, 0,75n Citronensäure und Wasser gewaschen, über Magensiumsulfat getrocknet und im Vakuum eingeengt. Durch Umkristallisieren des Rückstands aus einer Mischung aus Ethanol und Wasser werden 4,9 g (72%) der in der Überschrift angegebenen Verbindung vom F.=138 bis 140°C erhalten.

Analyse, C₁₆H₂₄N₂O₄S (340,4):

berechnet:C 56,45; H 7,11; N 8,23; gefunden:C 56,58; H 6,97; N 8,07.

B. N-tert.-Butyloxycarbonyl-L-phenylalanyl-S-p-methoxybenzyl-L-cysteiny-lamid

In eine Lösung von 4,1 g (0,012 Mol) des nach Teil A erhaltenen Produkts in 45 ml Eisessig, 5 ml Anisol und 5 ml Triethylsilan wird wasserfreier Chlorwasserstoff eingeleitet. Nach 20 Minuten wird Ether zugegeben, und der gebildete Niederschlag wird abfiltriert und getrocknet. Das Hydrochlorid (3,3 g) wird in 50 ml DMF gelöst, worauf 2,92 g (0,012 Mol) Dicyclohexylamin, 3,19 g (0,012 Mol) N-tert.-Butyloxycarbonyl- L-phenylalanin und 1,62 g (0,012 Mol) HBT zugegeben werden. Die Mischung wird 10 Minuten bei 0°C gerührt und dann mit 2,47 g (0,012 Mol) DCC versetzt. Nach 2 Stunden bei 0°C wird das Reaktionsgemisch 24 Stunden bei Zimmertemperatur gerührt und wiederum auf 0°C abgekühlt. Der gebildete Niederschlag wird abfiltriert, und das Filtrat wird im Vakuum eingeengt, wonach der erhaltene Rückstand in n-Butylalkohol gelöst wird. Die Lösung wird mit 1n Natriumbicarbonat und Wasser extrahiert, über Magnesiumsulfat getrocknet und im Vakuum eingedampft. Der Rückstand wird aus Ethanol umkristallisiert und ergibt 4,95 g (85%) der in der Überschrift angegebenen Verbindung vom F.=175 bis 178°C.

Analyse, C₂₅H₃₃N₃O₅S (487,6):

berechnet:C 61,58; H 6,82; N 8,62; gefunden:C 61,78; H 6,78; N 8,28.

C. N-tert.-Butyloxycarbonyl-L-tyrosyl-D-alanyl-glycyl-L-phenylalanyl-S--p-methoxybenzyl-L-cysteinyl­ amid

In eine Lösung von 1,3 g (0,027 Mol) des nach Teil B erhaltenen Produkts in 40 ml Eisessig, 4 Mol Anisol und 4 ml Triethylsilan wird wasserfreier Chlorwasserstoff eingeleitet. Nach 20 Minuten wird Ether zugegeben, und der gebildete Niederschlag wird abfiltriert und getrocknet. Das so erhaltene Hydrochlorid (1,1 g) wird in 10 ml DMF gelöst, und die Mischung wird auf 0°C abgekühlt. 0,34 ml (0,0026 Mol) Triethylamin werden zugegeben. 10 Minuten später werden 1,06 g (0,0026 Mol) N-tert.- Butyloxycarbonyl-L-tyrosyl-D-alanyl-glycin und danach 0,35 g (0,0026 Mol) HBT und 0,536 g (0,0026 Mol) DCC zugegeben. Das so erhaltene Reaktionsgemisch wird 2 Stunden bei 0°C und dann 72 Stunden bei 4°C gerührt. Der gebildete Niederschlag wird abfiltriert, und das Filtrat wird im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wird in Ethylacetat gelöst, und diese Lösung wird mit 1n Natriumbicarbonat, Wasser, 0,75n Citronensäure und Wasser extrahiert. Nach Trocknen über Magnesiumsulfat wird der Extrakt im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wird in Methylacetat gelöst und durch Chromatographieren an einer Säule aus Kieselgel gereinigt. Fraktionen werden auf der Grundlage des TLC-Profils vereinigt und eingedampft, wodurch nach Kristallisation aus einem kleinen Volumen Ethylacetat 1,1 g (52%) der in der Überschrift genannten Verbindung erhalten werden.

Analyse, C₃₉H₅₀N₆O₉S (778,9):

berechnet:C 60,14; H 6,47; N 10,79; gefunden:C 59,95; H 6,24; N 10,53.

Aminosäureanalyse, gefunden: Tyr 0,98, Ala 1,03, Gly 1,01, Phe 0,98, NH₃ 0,99.

D. L-Tyrosyl-D-alanyl-glycyl-L-phenylalanyl-S-p-methoxybenzyl- L-cysteinylamid-hydrochlorid

Zu 20 ml Eisessig, die 0,5 ml Anisol enthalten, werden 0,90 g (0,0012 Mol) des nach Teil C erhaltenen Produkts gegeben. Dann wird 30 Minuten lang trockener Chlorwasserstoff eingeleitet. Durch Lyophilisieren der Mischung werden 0,862 g (100%) der in der Überschrift angegebenen Verbindung erhalten.

Analyse, C₃₄H₄₃N₆O₇S (715,2):

berechnet:C 57,09; H 6,06; N 11,75; Cl 4,96; gefunden:C 56,85; H 6,06; N 11,48; Cl 5,21.

Aminosäureanalyse, gefunden: Tyr 0,99, Ala 1,01, Gly 1,01, Phe 0,98, NH₃ 0,99.

Beispiel 7 Herstellung von L-Tyrosyl-D-alanyl-glycyl-L-phenylalanyl-N^alpha- methyl-L-methionylamid-acetat A. N-tert.-Butyloxycarbonyl-N^alpha-methyl-L-methionin, d(+)alpha-Methylbenzylaminsalz

86,13 g (0,02 Mol) des Dicyclohexylaminsalzes von N- tert.-Butyloxycarbonyl-L-methionin werden in 600 ml kaltem Ether suspendiert. Die Suspension wird viermal mit 100 ml kalter 1,5n Citronensäure und Wasser extrahiert. Die organische Schicht wird abgetrennt, über Magnesiumsulfat getrocknet und im Vakuum eingeengt. Eine Lösung des Rückstands in 150 ml THF wird tropfenweise in 30 Minuten unter mechanischem Rühren zu einer Suspension von 0,6 Mol Kaliumhydrid in 1000 ml trockenem THF (0°C) mit einem 18-Kron-6-Ethergehalt von 1,0 g gegeben. 25 ml (0,4 Mol) Methyliodid werden tropfenweise in 15 Minuten zugesetzt. Zwei Stunden später wird tropfenweise eine Mischung aus 20 ml Essigsäure und 20 ml THF und danach 40 ml Ethanol zugegeben. Die Mischung wird 30 Minuten gerührt und dann auf 2 l Eis gegossen. Der pH-Wert der wäßrigen Mischung wird mit 2n Kaliumhydroxid auf 7 eingestellt. Dann wird dreimal mit 400 ml Ether extrahiert und mit fester Säure bis zu einem pH-Wert von 3 angesäuert. Diese Mischung wird dreimal mit 500 ml Ether extrahiert. Die Etherextrakte werden vereinigt, extrahiert, über Magnesiumsulfat getrocknet und im Vakuum bis zu einem Sirup eingedampft. Der Sirup (44,76 g, 84% der Theorie) wird in 450 ml Ethylacetat gelöst und mit 25,78 ml (0,2 Mol) d(+)alpha- Methylbenzylamin versetzt. Nach Abkühlen und Kratzen setzt Kristallisation ein. Die in der Überschrift genannte Verbindung wird durch Filtrieren gewonnen, und man erhält 51,05 g (66%) Substanz vom F.=131 bis 134°C.

Analyse, C₁₉H₃₂N₂O₄S (384,54):

berechnet:C 59,35; H 8,39; N 7,29; gefunden:C 59,15; H 8,12; N 7,21.

B. N-tert.-Butyloxycarbonyl-N-methyl-L-methionylamid

33,3 g (0,127 Mol) N-tert.-Butyloxycarbonyl-N-methyl- L-methionin (hergestellt durch Ansäuern des nach Teil A erhaltenen d(+)alpha-Methylbenzylaminsalzes und Extraktion mit Ether) werden in 160 ml DMF gelöst. Die Lösung wird auf -15°C abgekühlt und mit 18,3 ml (0,14 Mol) Isobutylchlorformiat und 15,4 ml (0,14 Mol) N-Methylmorpholin versetzt. Die Mischung wird 10 Minuten bei -15°C gerührt, worauf 1 Stunde wasserfreies Ammoniak durch ein Gasverteilungsrohr eingeleitet wird. Das Reaktionsgemisch wird 4 Stunden bei -15°C gerührt und dann in 300 ml kalte 1n NaHCO₃-Lösung gegossen. Die wäßrige Suspension wird mit Ether extrahiert, und der Etherextrakt wird mit Wasser, kalter 0,75n Citronensäure und Wasser gewaschen, über MgSO₄ getrocknet und im Vakuum zu einem Sirup eingedampft. Dieser Sirup wird aus Ether-Petrolether umkristallisiert, wodurch 16 g (48%) der in der Überschrift angegebenen Verbindung vom F.=75 bis 77°C erhalten werden.

Analyse, C₁₁H₂₂N₂SO₃ (262,37):

berechnet:C 50,36; H 8,45; N 10,68; gefunden:C 50,63; H 8,57; N 10,45.

C. N-tert.-Butyloxycarbonyl-L-phenylalanyl-N^alpha-methyl-L-methionylamid

In ein Gemisch aus 70 ml Eisessig, 5 ml Anisol, 7 ml Triethylsilan und 13,5 g (0,05 Mol) des nach Teil B erhaltenen Produkts wird 25 Minuten wasserfreier Chlorwasserstoff eingeleitet. Danach wird die Mischung in Ether gegossen, und der gebildete Niederschlag wird abfiltriert und getrocknet. Das so erhaltene Hydrochlorid (9,9 g) wird in 200 ml DMF gelöst, auf 0°C abgekühlt und mit 9,9 ml (0,05 Mol) Dicyclohexylamin versetzt. Nach 10 Minuten langem Rühren werden 6,8 g 0,05 Mol HBT, 13,3 g (0,05 Mol) N-tert.-Butyloxycarbonyl- L-phenylalanin und 10,3 g (0,05 Mol) DCC zugegeben. Die erhaltene Mischung wird 2 Stunden bei 0°C und dann 48 Stunden bei Zimmertemperatur gerührt. Nach Abkühlen auf 0°C und Filtrieren wird das Filtrat im Vakuum bis zu einem Öl eingeengt.

Eine Lösung dieses Öls in Ethylacetat wird nacheinander mit 1n Natriumbicarbonat, Wasser, 0,75n Citronensäure und Wasser gewaschen. Durch Trocknen über Magnesiumsulfat und Eindampfen im Vakuum wird ein Rückstand erhalten, der aus Ether kristallisiert und 16,4 g (80%) der in der Überschrift angegebenen Verbindung vom F.=114 bis 115°C ergibt.

Analyse, C₂₀H₃₁N₃O₄S (409,55):

berechnet:C 58,65; H 7,63; N 10,26; gefunden:C 58,76; H 7,42; N 10,30.

D. N-tert.-Butyloxycarbonyl-L-tyrosyl-D-alanyl-glycyl- L-phenylalanyl-N^alpha-methyl-L-methionylamid

In eine Mischung aus 20 ml Eisessig, 2 ml Anisol, 2 ml Triethylsilan und 3,5 g (8,56 mMol) des nach Teil C erhaltenen Produkts wird 25 Minuten trockener Chlorwasserstoff eingeleitet. Das Hydrochlorid wird mit Ether gefällt und abfiltriert und im Vakuum getrocknet. Eine Lösung von 5,0 g (8,47 mMol) N-tert.-Butyloxycarbonyl-L-tyrosyl-D-alanyl-glycin, Dicyclohexylaminsalz in 40 ml DMF wird auf 0°C abgekühlt und mit dem vorerwähnten Hydrochlorid versetzt. Nach einigen Minuten Rühren bei 0°C werden 1,1 g (8,47 mMol) HBT und 1,7 g (8,47 mMol) DCC zugegeben. Die Mischung wird 24 Stunden bei 4°C gerührt, zur Entfernung des unlöslichen Materials filtriert und im Vakuum eingedampft. Eine Lösung des Rückstands in Ethylacetat wird nacheinander mit 1n wäßrigem Natirumbicarbonat, Wasser, kalter 0,75n Citronensäure und Wasser gewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet und im Vakuum eingedampft. Der Rückstand wird an Kieselgel chromatographiert und ergibt 4,1 g (69%) der in der Überschrift angegebenen Verbindung.

Analyse, C₃₄H₄₈N₆O₈S (700,86):

berechnet:C 58,27; H 6,90; N 11,99; gefunden:C 58,05; H 6,62; N 11,73.

Aminosäureanalyse, gefunden: Tyr 1,00, Ala 1,01, Gly 0,99, Phe 1,00, NH₃ 1,01.

E. L-Tyrosyl-D-alanyl-glycyl-L-phenylalanyl-N^alpha-methyl-L-methionylamid-acetat

8,3 g (0,012 Mol) des nach Teil D erhaltenen Produkts werden zu 15 ml Thioanisol gegeben und auf 0°C gekühlt. Nach Zugabe von 50 ml kaltem TFA wird die Mischung 30 Minuten bei 0°C gerührt und dann mit mehreren Volumina Ether verdünnt. Durch Abfiltrieren und Trocknen des gebildeten Niederschlags werden 8 g des rohen Trifluoracetats erhalten. Dieses Salz wird durch Zugabe einer wäßrigen Pufferlösung, die 1% Pyridin und 0,05% Essigsäure enthält, bis zu einem Volumen von 60 ml gelöst, und diese Lösung wird auf eine 5×138 cm messende Säule aus Kieselgel (DEAE Sephadex®A-25, Acetatform) aufgegeben, das vorher mit der gleichen Pufferlösung äquilibriert worden war. Die UV-Absorption bei 280 nm wird überwacht, und das Elutionsprodukt zwischen 1270 und 1950 ml wird aufgefangen. Der nach Lyophilisieren erhaltene Rückstand wird in etwa 200 ml 1n Essigsäure gelöst und diese Lösung wird lyophilisiert. Eine letzte Lyophilisierung aus Wasser/Acetonitril (3 : 1) ergibt 6,64 g (83%) der in der Überschrift angegebenen Verbindung.

Analyse, C₃₁H₄₄N₆O₈S (660,79):

berechnet:C 56,35; H 6,71; N 12,72; O 19,37; gefunden:C 56,50; H 6,46; N 12,62; O 19,25.

Aminosäureanalyse, gefunden: Tyr 1,00, Ala 1,01, Gly 1,00, Phe 0,99, NH₃ 1,03.

Beispiel 8 Herstellung von L-Tyrosyl-D-alanyl-glycyl-L-phenylalanyl- N^alpha-methyl-L-methionylamidacetat A. Trifluoressigsäuresalz von L-Tyrosyl-D-alanyl-glycyl-L-phenylalanyl-N^alpha-methyl-L-methionyl- Benzhydrylaminharz

Das Peptidharz wird durch automatische Festphasensynthese in einem Peptidsynthesegerät (Beckman 990) unter Verwendung vom 5,0 g Benzhydrylaminharz hergestellt. Das Harz wird mit 4% Diisopropylethylamin (DIEA) in Methylenchlorid neutralisiert, worauf man es mit Boc-(N-Me)-Met-OH und DCC in Methylenchlorid kuppeln läßt und so zu Boc-(N-Me)-Met-substituiertem Harz gelangt. Sodann führt man in das Peptidharz der Reihe nach Boc-Phe-OH, Boc-Gly-OH, Boc-Ala-OH und Boc-Tyr-OH ein, indem man die Kupplung zuerst nach dem Programm Nr. 1 durchführt und anschließend eine Rekupplung der gleichen Aminosäure nach dem Programm Nr. 2 bewerkstelligt. Das Programm Nr. 2 wird für jede der Aminosäuren einmal durchgeführt, mit Ausnahme der Aminosäure L-Phe-OH, mit welcher das Programm Nr. 2 dreimal durchgeführt wird. Das erhaltene Boc-Pentapeptid-Harz wird dann nach den Stufen 1 bis 8 des Programms Nr. 1 von Schutzgruppen befreit, wodurch man zu 6,13 g der Titelverbindung gelangt. Die Waschvorgänge gemäß der Programme Nr. 1 und 2 werden unter Verwendung von 10 ml Waschflüssigkeit pro Gramm Harz durchgeführt.

Programm Nr. 1:

• 1. Dreimaliges Waschen mit CH₂Cl₂
• 2. 5 Minuten lange Behandlung mit einem 30 : 5 : 65 Volumengemisch aus TFA : Et₃SiH : CH₂Cl₂
• 3. Behandlung wie bei Stufe 2, jedoch über eine Zeitdauer von 30 Minuten
• 4. Zweimaliges Waschen mit CH₂Cl₂
• 5. Waschen mit Methanol : CH₂Cl₂ (1 : 1)
• 6. Zweimaliges Waschen mit Methanol
• 7. Waschen mit Methanol : CH₂Cl₂ (1 : 1)
• 8. Zweimaliges Waschen mit CH₂Cl₂
• 9. Viermalige Behandlung über eine Zeitdauer von jeweils 2 Minuten mit jeweils 4% DIEA in CH₂Cl₂
• 10. Wiederholung der Stufen 4 bis 8
• 11. Behandlung mit 2,5 Äquivalent des gewünschten Aminosäurederivats in CH₂Cl₂ und mit 1,25 Äquivalent DCC in CH₂Cl₂ über eine Zeitdauer von 120 Minuten
• 12. Viermaliges Waschen mit CH₂Cl₂
• 13. Wiederholung der Stufen 5 bis 7
• 14. Dreimaliges Waschen mit CH₂Cl₂

Programm Nr. 2:

• 1. Viermaliges Behandeln über eine Zeitdauer von jeweils 2 Minuten mit jeweils 4% DIEA in CH₂Cl₂
• 2. Zweimaliges Waschen mit CH₂Cl₂
• 3. Waschen mit Methanol : CH₂Cl₂ (1 : 1)
• 4. Zweimaliges Waschen mit Methanol
• 5. Waschen mit Methanol : CH₂Cl₂ (1 : 1)
• 6. Zweimaliges Waschen mit CH₂Cl₂
• 7. Dreimaliges Waschen mit DMF : CH₂Cl₂ (1 : 1)
• 8. Behandlung mit 2,5 Äquivalent des gewünschten Aminosäurederivats in DMF : CH₂Cl₂ (1 : 1) und mit 1,25 Äquivalent DCC in CH₂Cl₂ über eine Zeitdauer von 120 Minuten
• 9. Viermaliges Waschen mit DMF : CH₂Cl₂ (1 : 1)
• 10. Wiederholung der Stufen 4 bis 6

B. Hydrogenfluoridsalz von L-Tyrosyl-D-alanyl-glycyl-L-phenylalanyl-N^alpha-methyl-L- methionylamid

Das nach obigem Teil A erhaltene Peptidharz wird bei 0°C über eine Zeitdauer von 60 Minuten unter Vakuum mit flüssigem wasserfreiem HF in Gegenwart von Anisol als Säureakzeptor umgesetzt. Die flüchtigen Bestandteile werden von der Reaktion unter Vakuum abgezogen, und das erhaltene Peptidharz wird zur Entfernung von restlichem HF und Anisol mit Ether behandelt und filtriert. Das Peptid wird hierauf vom Harz durch Behandlung mit 10%iger Essigsäure extrahiert, worauf man das Ganze filtriert, dreimal mit jeweils 50 ml 10%iger Essigsäure wäscht und lyophilisiert. Auf diese Weise gelangt man zu 940 mg der rohen Titelverbindung.

C. Chromatographische Reinigung zur Bildung des Endprodukts

Das rohe Gemisch der Peptiddiastereomeren, nämlich 470 mg des nach obigem Teil B erhaltenen Produkts, chromatographiert man über eine mit Umkehrphasensilicagel C₁₈ gefüllte und 3,8×58,5 cm messende Säule bei niedrigem Druck (7,17 kg/cm²) mit 25%igem Acetonitril in 0,1n Ammoniumacetat. Über eine Zeitdauer von 1 Minute werden jeweils entsprechende Fraktionen gesammelt. Die Fraktionen 98 bis 150 werden vereinigt und lyophilisiert, wodurch man zu 360 mg Produkt gelangt.

Der Rest des nach Teil B erhaltenen rohen Gemisches wird wie im ersten Absatz beschrieben chromatographiert, wodurch man zu 320 mg Produkt gelangt.

Die aus den beiden obigen Absätzen erhaltenen lyophilisierten Produkte werden vereinigt und zur Entfernung von restlichem Ammoniumacetat über eine mit Sephadex®G-10 gefüllte Säule mit den Abmessungen 2,5×10,0 cm in 0,2n Essigsäure chromatographiert. Durch Lyophilisierung der dabei erhaltenen Fraktionen gelangt man zu 636,7 mg der Titelverbindung mit folgenden physikalischen Eigenschaften:

Analyse, C₃₁H₄₃N₆O₈S:

berechnet:C 56,35; H 6,71; N 12,72; S 4,85. gefunden:C 56,60; H 6,43; N 12,97; S 4,92.

Aminosäureanalyse:

Claims (3)

1. Pentapeptide der allgemeinen Formel worinL und Ddie Chiralität und R₁eine primäre oder sekundäre Alkylgruppe mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, R₂Wasserstoff oder eine primäre oder sekundäre Alkylgruppe mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen und Weine Isopropylgruppe oder eine Gruppe der Formeln bedeuten,sowie ihre pharmazeutisch annehmbaren Säureadditionssalze.

2. L-Tyrosyl-D-alanylglycyl- L-phenylalanyl-N^alpha-methyl-L-methionylamid oder sein Hydrochlorid oder Acetat.

3. Pharmazeutische Zubereitungen, enthaltend eine Verbindung der allgemeinen Formel (I) gemäß Anspruch 1 und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger.