SE438339B - Forfarande for framstellning av foreningar med analgetisk verkan - Google Patents

Description

7710755-5 användning av ett i huvudsak torrt surt avspjälkningsmedel, och even- tuellt överför föreningen till ett farmaceutiskt accepterbart, ogif- tigt syraadditionssalt.

Farmaceutiskt accepterbara, ogiftiga syraadditionssalter inom ramen för föreningarna med formeln (I) är de organiska och oorganiska syraadditionssalterna, t.eX. sådana framställda av syror som klorväte- syra, svavelsyra, sulfonsyra, vinsyra, fumarsyra, bromvätesyra, gly- kolsyra, citronsyra, maleinsyra, fosforsyra, bärnstenssyra, ättiksyra, salpetersyra, bensoesyra, askorbinsyra, p-toluensulfonsyra, bensen- sulfonsyra, naftalensulfonsyra och propionsyra.' Speciellt föredragna syraadditionssalter är de som framställes av klorvätesyra, ättiksyra eller bärnstenssyra. Vilket som helst av ovannämnda salter framstäl- les enligt konventionella förfaranden.

Såsom framgår av definitionen av de olika substituenterna, som uppträder i formeln (I), är de föreningar som definieras genom denna' formel osubstituerade eller N-substituerade amider av pentapeptider.

Stereokonfigurationen hos föreningarna med formeln (I) är ett väsent- ligt kännetecknen för föreningarna. Av lämplighetsskäl uppräknas ami- nosyraresterna i pentapeptiderna med formeln (I) i följd efter varand- ra med början med den rest, som har den ändstående aminogruppen. Chi- raliteten (dvs. höger- eller vänsterkonfiguration) hos aminosyrarester- na, läst från position l till position 5, är sålunda L, D, L, L och L.

Vïdare bär observeras, att resten i position 5 är definierad att inne- fatta en glycingrupp. I dessa fall existerar naturliptvis ingen chi- ralitet beträffande denna rest. Det är endast väsentligt att inse, att då position 5 definierar en aminosyrarest som har chiralitet, så måste denna chiralitet vara L. I Gruppen RB är definierad att innefatta gruppen "Cl-05 alkyl“.

Med uttrycket "Cl-G3 alkyl" avses metyl, etyl, n-propyl och isopropyl.

Grupperna R6 och R7 är definierade att innefatta gruppen "C1-C3 primär alkyl“. Med uttrycket PC]-C3 primär alkyl" avses metyl, etyl och n-propyl. - Grupperna R4 och R5 är definierade-att innefatta gruppen "C1-C4 'primär eller sekundär alkyl“. Med uttrycket "C1-C4 primär eller sekun- där alkyl" avses metyl, etyl, n-propyl, isopropyl, n-butyl, isobutyl och sek.butvl. _ Gruppen R9 är definierad att innefatta gruppen "C1-C4 alkyl“.

Med uttrycket “C1-C4 alkyl" avses metyl, etyl, n-propyl, isopropyl, n-butyl, isobutyl, sek.butyl och tert.butyl. Lämpligen är R9, då denna _ grupp är C1-CÃ alkyl, etyl. ' , _ - 7710755~5 Vad beträffar den speciella positionen hos resterna i penta- peptiderna med formeln (I) så gäller följande:_ (A). Position 1.

Denna position representerar amino-änddelen av peptiden. Resten är vad som resulterar från L-tyrosin.

(B). Position 2. A Aminosyraresten i den andra positionen i peptiden med formeln (I) måste vara D-stereoisomeren och är vilken som helst av ett fler- tal aminosyrarester; Dessa omfattar rester härstammande från D-alanin (Ala) (R4 är metyl), D-d- aminosmörsyra (Abu) (R4 är etyl), b-norvalin (Nva) (R4 är n-propyl), D-valin (Val) (R4 är isopropyl), D-norleucin (Nle) (R4 är n-butyl), D-leucin (Leu) (R4 är isobutyl), och D-isoleu- cin (Ile) (R4 är sek. butyl). Lämpligen härstammar resten från D-ala- nin.

(C). Position 3. I Aminosyraresten i denna position är den som härstammar från glycin (Gly) eller från någon av en grupp av L-aminosyror. Dessa amino- 7 syror omfattar följande: L-alanin, L-KK-amino)smörsyra, L-norvalin, L-valin, L-norleucin, L-leucin och L-isoleucin. Företrädesvis är res- ten i denna position_av peptiden den som härstammar från glycin.

(D). Position 4. I Aminosyraresten i denna position är den som härstammar från L- fenylalanin (Phe). Denna rest kan antingen vara osubstituerad eller substituerad vid aminokvävet (R6). För det fall att resten är N-sub- stituerad, är substituenten N-metyl, N-etyl eller N-n-propyl. Företrä- desvis är resten N-osubstituerad (R6 är väte).

(E). Position 5.

Aminosyraresten i position 5 i pentapeptiden är resten av en qamid av L-metionin (Met) (W är -CHZSCH3) eller L-(S-alkyl cystein [Cys(Alk)] (W är SR9). Lämpligen är aminosyraresten i position 5 res- ten av en amid av L-metionin. I de fall där resten i position 5 är S- substituerad cystein föredrager man att substituenten R9 är etyl.

'Eftersom aminosyran i position 5 i pentapeptiden representerar den ändstående karboxylaminosyran, måste den dessutom föreligga i form av en amid. Lämpligen är amiden N-osubstituerad, dvs R8 är väte.

Amidgruppen kan emellertid vara N-monosubstituerad, varvid substituen- ten är en C1-C3 alkylgrupp. I dessa fall är den ändståonde amidgrup- pen N-metyl, N-etyl, N-n-propyl eller N-isopropyl. ' 7710755-s _4 Föreningarna med formeln (I) framställes enligt rutinförfaran- den för peptidsyntes. Det är möjligt, att under syntesen av vissa av föreningarna med formeln (I) partiell racemisering kan förekomma.

Om racemísering skulle förekomma är emellertid graden därav icke till- räcklig för att allvarligt förändra den analgetiska aktiviteten hos fïreningarna med formeln (I).

Förfarandena för framställning av föreningarna med formeln (I) innebär koppling av aminosyror eller peptidfragment genom omsättning av karboxylgruppen i en med aminogruppen i en annan till bildning av en amidbindning. För att man skall åstadkomma en effektiv koppling är det önskvärt, att i första hand alla reaktiva grupper som icke del- tar direkt i reaktionen, inaktiveras genom användning av lämpliga blockerade grupper, och att i andra hand den karboxylgrupp, som skall kopplas, aktiveras på lämpligt sätt så att kopplingen kan försiggà.

Allt detta innebär ett omsorgsfullt val av både reaktionssekvens och o reaktionsbetingelser liksom även användning av specifika blockerande grupper, så att den önskade peptidprodukten erhålles. Var och en av de aminosyror, som användes för framställning av föreningarna med for- meln (I) och som har de särskilt valda skyddande grupperna och/eller aktiverande grupper, framställes genom användning av metoder, som är välkända inom peptidtekniken.

Valda kombinationer av blockerande grupper användes vid varje punkt av den totala syntesen av föreningarna med formeln (I). Dessa speciella kombinationer har befunnits fungera mycket väl. Andra kom- binationer fungerar visserligen tillfredsställande vid syntesen av föreningarna med formeln (I), ehuru kanske med en mindre grad av fram- gång. Sålunda kan exempelvis bensyloxikarbonyl (CBZ), tert.butyloxi- karbonyl (BOC), tert.amyloxikarbonyl (AOC), p-metoxibensyloxikarbonyl MOC), adamantyloxikarbonyl (AdOC) och isobornyloxikarbonyl användas såsom aminoblockerande grupper vid syntesen av föreningarna med for- meln (I). Vidare användes allmänt bensyl (Bzl) såsom den hydroxi- skyddande gruppen för tyrosylresten, även om andra, såsom p-nitrobensyl (PNB) och p-metoxibensyl (PNB) väl kan användas.

De karboxylblockerande grupper, som användes vid framställning av föreningarna med formeln (I) kan vara någon typisk esterbildande grupp, t.ex. metyl, etyl, bensyl, p-nitrobensyl, p-metoxibensyl och 2, ae-m-ikioretyi _ " till dess aktiva esterderivat. 7710755-5 Kopplingen av det på lämpligt sätt skyddade N-blockerade amino- syra- eller peptidfragmentet med ett på lämpligt sätt skyddat karboxi- blockerat aminosyra- eller peptidfragment vid framställning av före- ningarna med formeln (I) består i att göra den fria karboxylgruppen i aminosyra- eller peptidfragmentet aktiv för kopplingsreaktionen. Det- ta kan ske genom användning av någon av ett flertal välkända metoder.

En sådan aktiveringsmetod består i omvandling av karboxylgruppen till en blandad anhydrid. Den fria karboxylgruppen aktiveras genom reak- tion med någon annan syra, typiskt ett derivat av kolsyra, såsom en syraxloria därav. av blandade anhydrider är etylklorformiat, fenylklorformiat, sek.buty1- klorformiat, isobutylklorformiat och pivaloylklorid. Lämpligen använ- des isobutylklorformiat.

Ett annat förfarande för aktivering av karboxylgruppen i och för genomförande av kopplingsreaktionen är genom omvandling av densamma Exempel på dylika aktiva estrar är Exempel på syraklorider som användes för bildning en 2,4,5-triklorfenylester, en pentaklorfenylester och en p-nitrofenyl- ester. En annan kopplingsmetod som kan användas är den välkända azid- kopplingsmetoden. I Den föredragna kopplingsmetoden vid framställning av föreningar- na med formeln (I) utgör användning av N,N'-dicyklohexylkarbodiimid (DCC) för aktivering av den fria karboxylgruppen, varigenom kopplingen kan ske.* Denna aktiverings- och kopplingsmetod genomföres under an- vändning av en ekvimolekylär mängd DCC i förhållande till aminosyra- eller peptidfragmentet, och genomföres i närvaro av en ekvimolekylär mängd l-hydroxibensotriazol (HBT). Närvaronzv HBT undertrycker icke önskvärda sidoreaktioner, däribland möjligheten till raeemisering.

Avspjälkning av valda blockerande grupper är nödvändig vid spe- ciella pnnkter i syntessekvensen, som användes vid framställningen av föreningarna med formeln (I); En kemist med ordinära kunskaper be- träffande peptidsyntes kan lätt välja bland representativa skyddande grupper de grupper. som är förlikbara i den meningen¿ att selektiv spjälkning av produkten kan ske, som möjliggör avlägsnande av en eller flera men mindre än alla de skyddande grupperna, som är närvarande 1 aminosyra- eller peptidfragmentet. Dessa metoder är välkända inom peptidtekniken. En mera fullständig diskussion av metoder för selektiv. avspjälkning àterfinnes i litteraturen i Schröder och Lübke, The Peptides, volnm 1, Academic Press, New York (l965), och särskilt i tabellen pa sid. 72-75. 7710755-s t 6 Avspjälkning av karboxylskyddande grupper kan ske genom alkalisk förtvålning. Relativt kraftiga alkaliska betingelser, typiskt genom användning av en alkalimetallhydroxid, såsom natriumhydroxid, kalium- hydroxid och litiumhydroxid,-användes i allmänhet för avförestring av den skyddade karboxylgruppen. De reaktionsbetingelser, under vilka förtvâlning sker är välkända inom tekniken. De karboxylblockerande grupperna kan även avlägsnas genom katalytisk hydrogenolys, innefat- tande exempelvis nydr genolys i närvaro av en katalysator, såsom pal- ladium på kol. I de fall att den karboxylblockerande gruppen är p- nitrobensyl eller 2,2,2-trikloretyl, kan avblockering ske genom reduk- tion i närvaro av zink och klorvätesyra. ' D De aminoblockerande grupperna avspjälkas genom behandling av den skyddade aminosyran eller peptiden med.en syra, såsom 98%~ig myr- syra; trifluorättiksyra (TFA); en arylsulfonsyra, såsom p-toluensul- fonsyra (TSA), bensensulfonsyra (BSA), naftalensulfonsyra; trifluor- metansulfonsyra (ren); flytande HF och bortribromid i metylenklorid, till bildning av respektive syraadditionssalt. Avspjälkning av den aminoblockerande gruppen kan även ske genom behandling av den blocke- rade aminosyran eller peptiden med en blandning av HBr eller HCl och isättika till bildning av motsvarande hydrobromid- eller hydroklorid- additionssalt. Alla dessa avblockerande medel utgör därför ett 1 huvudsak torrt surt medium. Den speciella metod eller de speciella reagens som användes beror på de kemiska eller fysikaliska egenskaperna hos de material, som ingår i den specifika avblockeringsreaktionen.

Det har upptäckts, att i de fall, där_gruppen H7 är någon annan än väte och en peptid innehållande minst tre aminosyrarester skall avblockeras, det är synnerligen lämpligt att peptiden avblockeras med trifluorättik- syra eller myrsyra till bildning av motsvarande syraadditionssalt.

Saltet kan omvandlas till en mera farmaceutiskt accepterbar form genom behandling med något lämpligt jonbytarharts, såsom DEAE Sephadex A25 och Amberlyst A27. I andra fall, då aminoblockerande grupper avspjäl- kas, omsättes en förening med den allmänna formeln II n 0 o RC f 0 å? (u) || n \\ *q ll NH-CH-C-NH-CH-C-NH-CH-C- -CH-C-Nf-CH-Z' I I _ I k p èH . I - C B10 ?H2 Ru 5 _ 2 |H2 kx \ w, IÜ Å ' Ig/d .

F\?' _, ' _ 7710755-5 i vilken R10 är bensyloxikarbonyl, tert.butyloxikarbonyl, tert.amyl- oxikarbonyl, p-metoxibensyloxikarbonyl, adamantyloxikarbonyl eller isobornyloxikarbonyl, 2' är 2 eller polymerblockerat 2, och alla andra symboler har ovan angiven betydelse, med ett i huvudsak torrt, surt medium.

Den hydroxi-skyddande gruppen, som är närvarande 1 tyrosylresten, kan bibéhållas pà peptiden under sekvensen för dess framställning, och avlägsnas under det slutliga syntessteget 1 samband med avspjälk- ningen av den aminoblockerande gruppen. Beroende på de använda beting- elserna för avlägsnande av den karboxylblockerande gruppen kan den emel- lertid avlägsnas tidigare i den preparativa sekvensen. Då karboxyl- gruppen avspjälkas genom alkalisk förtválning, bibehålles den hydroxi- skyddande gruppen. Om emellertid katalytisk hydrogenolys användes för avlägsnande av den karboxylskyddande gruppen, avspjälkas även den hydroxi-skyddande gruppen. Den senare situationen utgör icke något allvarligt problem, eftersom framställning av föreningar med formeln (I) kan ske i närvaro av en tyrosylrest innehållande en fri hydroxyl- 8PUDD-- .

En föredragen specifik metod för framställning av föreningarna med formeln (I) är koppling av en separat framställd N-avslutad tri- peptid med en separat framställd C-avslutad dipeptidamid följt av lämplig avblookering av eventuella kvarstående blockerade grupper. Den- na allmänna sekvens, som illustrerar framställning av en pentapeptid med formeln (I), kan avbildas på nedanstående sätt. I sekvensen rep- resenterar symbolen AA amlnosyraresten; och den bifogade siffran rep- resenterar positionen för aminosyran i den slutliga peptidproduktsek- VGIISEIJ. . 7710755-5 s ßoc-L-Tyr-OH + H-n- (AA) z-oxm A ßoc-L-Phu-ou + :AL-(AAL-NHQ I i _ _ i i o Om' ncc A occ HBT HBT \ / - \ / ßoc- L~Tyr-D- (AA) z-oßzn .

| OBzI ' ' ' _ OH- ßoc-L-æne-L-(AAë-Nnz \ / í _ - > Hem-iom Boc-L~Tyr-o~(AA)2-ou í \ / A | oazl H-L-(Amö-oßzl _ _. ucc C: H -L-PAe-L-(AAL-NH ußT 2 , ° 2 \ .f - oH" ßoc-L-Tyr-o- (AA) n-L- (AA) _-oBz| | " °( \ / OBzl _ H 2 * Pd/z: '\ / sOc-L-Tyr-ß- (AA) 2- L- (AA) 3-61) H-L-Phe-L- (AA) s-NHO > I _ ._ ou I l Dec HBT \ / _ Boc-L-Tyr-D- (AA) 0-1.- (AA) qA-L-Phe-Lí-(AA) r-wun _' _ | I 11 u ~J f., U" 1) TFA _ u) DEAE sephauex A-zs Acefaf-for-m \ f AcoH -H-L-Ty r-n- (AA) ,- L-(AA) â-LfFne- L- (AA) r-NHÜ I t- v .J »., OH 7710755-5 Det ovanstående representerar endast en sekvens för framställ- ning av föreningar med formel (I). Även andra sekvenser är möjliga.

Ett annat förfarande, som kan användas, innebär stegvis addition efter 9 vartannat av enstaka aminosyror i konstruktionen av peptidkedjan med början med den karboxamidavslutade aminosyran. Ytterligare ett annat förfarande som kan användas utgör peptídsyntes i fast fas. Den C-av- slutade resten förbindes med en lämplig, polymer bärare, och peptiden utsträckes en rest i taget tills den önskade peptiden, som fortfarande är bunden vid polymeren, har syntetiserats. Eeptiden avlägsnas från polymeren genom något lämpligt avblockeringsmedel. Exempelvis kan den C-avslutade'Nemetylamürsyran, skyddad vid Na-kvävet med tert.butylox1- karbonyl, kopplas till en benshydrylaminpolymer genom dicyklohexylkar- bodiimidaktivering. N-tert.butyloxikarbonylgruppenfavlägnas genom reaktion av den polymerbundna resten med trifluorättiksyra i metylen~ klorid. Neutralisation av det polymera saltet med en lämplig tertiär bas och tillsättning av en andra rest sker på samma sätt. Den blocke- rade peptiden avlägsnas från polymeren zenom behandling med flytande HF vid OOC och renas genom kromatografi. .De specifika betingelserna för denna syntes är kända för en fackman kunnig i peptidsyntes 1 fast fas. En reaktionsteknik såsom den ovan beskrivna skulle använ- das i denna såväl som i varje annan avseddgneparativ sekvens.

J vissa av Föreningarna med formeln (I) är endera eller bägge grupperna R6 och R7 C1-C3 primär alkyl. I dessa fall användes den lämpliga N-substituerade aminosyran i den preparativa sekvensen. Vil- ken som helst av de N-monosubstituerade aminosyrorna kan framställas genom samma sekvens, som avbildas på nedanstående sätt, under använd- ning av en N-skyddad aminosyra som utgångsmaterial: 'I- - H K , |e+ } \ '_ soc-N~(AA)-coou t ------§ soc-N -(AA)-ooo"K* 1B~kron-G eter' THF ' DMF allyleller Cl-C primär ankyx Jodia (Ra: }<_ d . I ßoc-N-(AA)-coon Såsom antydes av ovanstående sekvens behandlas aminosyran först ' _ _ __ .. ., -- V j , d'- med kal iurnliydrid i narvaro av en lamplig; kroneter for aåstílnzâlíV l a > >d l" li* fl KY - 9 ef anjonen. Mellanplodukten behandlas sedan mt amp s i7v1o7ss-s 10 allyljodid för erhållande av den önskade N-substituerade_aminosyran.

Det är uppenbart för en fackman kunnig i peptidsyntes, att ra- cemisering vid d-kolatomen kan ske under kraftigt alkaliska betingel- ser, såsom sådana som användes vid ovanstående alkylering. Graden av racemisering kan variera beroende på den speciella aminosyra som ingår.

Racemisering kan minskas till ett minimum genom användning av överskott av alkyleringsmedel och genom att man håller reaktionstiden så kort som möjligt. Icke desto mindre kan produkten, även för det fall att kraftig racemisering inträder, renas genom omkristallisation i form av saltet av en lämplig chiralamin, exempelvis såsom saltet av d(+)- a-fenyletylamín.

Den C-avslutade delen av pentapeptiderna med formeln (I) deri- vatiseras till sin amid. I pentapeptiderna med formeln (I) är amiden osubstituerad eller N-monosubstituerad. Derivatisering till amiden sker genom aktivering av karboxylgruppen i aminosyran med N,N'-dicyk- lohexylkarbodiimid (DCC) i närvaro av l-hydroxibensotriazol (HBT) till bildning av HBT-estern. Vid framställning av pentapeptider med formeln (I) omsättes estern sedan med vattenfri ammoniak eller med lämplig primär amin för bildning av den osubstituerade eller N-mono- substituerade amiden. Lämpliga primära aminer för framställning av pentapeptiderna med formeln (I) är metylamin, etylamin och n-propyl- amin. _ I I föreliggande beskrivning användes följande förkortningar, av vilka de flesta är välkända och ofta använda: Abu - a-aminosmörsyrê Ala - alanin Cys --cystein Gly - glycin 1 Hse ~ homoserin Ile - isoleucin Leu'-Zleucin Met - metionini Nle - norleucin Nva - norvalin I phe - fenylalanin Ser - serin Tyr - tyrosin 7710755-5 11 Val - valín Ac - acetyl Me - metyl Et ~ etyl Ip - isopropyl Pr - g-prbpyl Bu - Q-butyl i-Bfi - ísobutyl t~Bu - tert.butyl s-Bu - sek.butyl BOC - tert.butyloxíkarbonyl Bzl - bensyl _ ' DCC - N,N'-dicyklóhexylkarbodiimid HBT - 1-hydtoxibensotriazol DMF - N,N-dimetylformamid TFA - trifluorättiksyra' THF - tetrahydrofuran DEAE - diqtylaminoçtyl 77407554» 12 Föreningarna med formeln(I) är värdefulla läkemedel. De uppvi- sar analgetisk aktivitet och de är särskilt användbara efter parente- ral tillförsel till däggdjur, däribland människor.

Föreningarna med formeln (I) kan tillförassom sådana eller de kan blandas och beredas till farmaoeutiska kompositioner i form av en- hetsdoser för parenteral tillförsel. Vïd blandningen eller beredning- en kan man använda organiska eller.oorganiska fasta ämnen och/eller vätskor, som är farmaceutiskt accepterbara bärare. Lämpliga dylika bärare är välkända för faokmannen. Kompositionerna kan beredas till form av tabletter, pulver, granuler, kapslar, suspensioner, lösningar och andra lämpliga former; Föreningarna med formeln (I) framkallar, då de tillföres i en effektiv mängd, en.analgetisk verkan. Den använda dosen kan variera i allmänhet från ca 0,1 mg till ca 100 mg per kg kroppsvikt hos mot- tagaren. Den föredragna dosen ligger i allmänhet från ca l,0 mg till ca 20 mg per kg kroppsvikt hos mottagaren.

Följande exempel avser att illustrera framställningen och ak- tiviteten hos föreníngarna med formeln (I) utan att därför uppfinning- en på något sätt begränsas. _" 0 Exempel l. - f K. _' Framställning av L-tyrosyl-D-alanyl-glycyl-L-fenylalanyl-Na-metyl-L- metionylamidhydroklorid. ' 7 0 A. Bensyl-D-alinat-p-toluensulfonat_ 7 Till en blandning av lOO ml bensylalkohol och 200 ml bensen innehållande 55,l.g (O,29 mol) p-toluensulfonsyramonohydrat sattes 25 g (0,28l mol) D-alanin. Blandningen upphettades till återflöde och vatten avlägsnades azeotropiskt i en Dean-Stark-fälla. Blandningen upphettades under lä timmar och kyldes sedan till rumstemperatur samt utspäddes_med eter. Den erhållna fällningen tillvaratogs och omkris- talliserades ur metanol-eter, varvid erhölls 55,5 g (56%) av den i rubriken angivna föreningen med en smältpunkt av ll2-ll5°C.

Anaiys, beräxnaçrör cl7H2lNo5s (351,42)= " C 58,10 H 6,02 N 3,99% 'Funnetfc 58,19 H 6,06 N 3,82% _ B. Bensvl-Na-tert.butyloxikarbonyl-0-bensyl-L-tyrosyl-D-alinat.

'Till 200 ml torr N,N-dimetylformamid (DM) sattes 55,1 g (0,1 mol) av produkten från avsnittet A. Den-erhållna blandningen omrördes och kyldes till OOC och ll,2 g (0,1 mol) diazabicyklooktan (DABCO) tillsattes. Blandningen omrördes under lO min vid O°C, och 37,1 g (O,l mol) Na-tert.butyloxikarbonyl-0-bensyl-L-tyrosin tillsattes följt av 13,5 g (0,1 moi) i-nydroxiberasocriazoi (HBT) och 20,6 g (0,1 moi) 77107595 13 N,N'-dicyklohexylkarbodiimid (DCC). Den så erhållna blandningen omrör- des vid 000 under tre timmar och sedan vid rumstemperatur under 24 tim- mar. Blandningen kyldes sedan till O°C, varpå den erhållna suspensio- nen filtrerades och ïiltratet koncentrerade: i vakuum. Den erhållna resten upplöstes på nytt i ctylacetat och tvättadcs successivt med N NaHCO3, vatten, 0,75 N kall citronsyra samt vatten. Det organiska skiktet torkades sedan över magnesiumsulfat, filtrerades och koncentre- rades i vakuum. Den uppkommande resten löstes sedan i varm etanol.

Kristallisation inträdde efter avkylning.' Efter en omkristallisation ur etanol erhölls 41,5 g (80%) av den färening som anges i rubriken i rent tillstånd och med en smältpunkt av l2l-12500.

Analys, beräknat för C30H36N206 (520,63): c 69,21 H 6,97 N 5,58% runner: c 68,99 H 6,75 N 5,17%, C. Na-tert.butyloxikarbonyl-O-bensyl-L-tyrosyl-D-alanin.

Till en blandning av 200 ml tetrahydrofuran (THF) och 20 ml vatten sattes 31,2 g (0,06 mol) av produkten från avsnittet B. Den uppkommande lösningen kyldes till OOC och l},2 ml (1,1 ekvivalenter) 5N natriumnydroxid tillsattes långsamt. _Den erhållna blandningen om- rördes och fick långsamt uppvärmas till rumstemperatur. Efter fem timmar fördelades blandningen mellan vatten och eter. Vattenskiktet avskildes och kyldes, pH inreglerades till 2 genom tillsättning av citransyra och blandningen extraherades med_etylacetat. Etylacetat- extraktet tvättades med vatten, torkades över magnesiumsulfat, filtre- rades och utspäddes med eter. Den erhållna fällningen tillvaratogs, varvid man erhöll 17,7 g (ó7ß) av den i rubriken angivna föreningen med en smäitpurikt- av i6o-i62°c., ' Analys, beräknat för C2¿H3ON206 (442,5l)i c 69,1» H 6,85 N 6,63% Funnct: C ó&,Yj H 6,70 N 6,20% D. Bensyl-Na-tert.butyloxikarbonyl-O-bensyl-L-tyrosyl-D- alanyl-glycinat.

Till 70 ml torr DNF sattes 6,74 g (0,02 mol) av p-toluensulfon- syrasaltet av bensylglycinat. Den uppkommande blandningen kyldes till OOC och 2,24 g (C,02O mol) DABCO tillsattes." Blandningen omrördes.un- der ett par minuter och 8,54 g (0,020 mol) av produkten från avsnittet C tillsattes, följt av 2,7 g (0,020 mol) HBT och 4,l2 5 (0,02O mol) DQC. Heaktionsblandningcn omrördcs under två timmar vid 000 och där- på under EH timmar vid rumstemperatur. Den uppkommande suspensionen kyldes till OOC, filtrerades och filtratet koncentrerades i vakuum.

Den så erhållna resten löstes i etylacetat och tvättade: successivt -- ~-- --» 7- 7- 7- --»- ~~-->---» --....-.._..._.__.........._. 7710755-5 14 med N natriumbikarbonat, vatten, kall 0,75 N citronsyra samt vatten.

Dadorganiska fasen torkades över magnesiumsulfat, filtrerades och kon- centrerades i vakuum. Den erhållna resten kristalliserades ur etanol, varvid erhölls 10,8 5 (92%) av den i rubriken angivna föreningen i ren form med en smältpunkt av 145-l47°C. I Iänalys, beräknat för C, H59N307 _ C 07,22 H 6,67 N 7,l3% Funnecz c 67,32 H 6,85 N 6,91% d. Na-tert.butyloxikarbonyl-L-tyrosyl-D-alanyl-glycin Till 60 ml DM sattes 10,5 g (0,0l8 mol) av produkten från av- snittet D följt av 2,5 g 5% Pd/C, tillsatt såsom en uppslamning i DM.

Den uppkommande blandningen spelades med kväve, och vätgas infördes via Efter 5,5 timmar avbröts vätgasflödet, och katalysatorn avlägsnades genom (589,69>= ett gasfördelningsrör vid atmosfärstryck och rumstemperatur. filtrering. Filtratet koncentrerades i vakuum. Rivning av resten med eter gav 5,4~g (755) av den i rubriken angivna föreningen såsom ett amorft fast ämne.

Analys, beräknat för C26H26N2O_ (446,65): C 69,94 H 5,87- N 6,â7h rummen; c 'ro,o8 n 5,82 N 6,16% - F. Na-tert.butyloxikarbonylÄNafmetyl-L-metionylamid 17,2 g (0,04 mol) av dicyklohexylaminsaltet av Na-tert.butyl- oxikarbonyl-L-metionin fördelades mellan etylacetat och kall 0,75 N citronsyra. Den uppkommande organiska fasen avskildes, tvättades med vatten, torkades över magnesiumsulfat, filtrerades och koncentrerades i vakuum till en oljeartad rest. Denna rest löstes i en blandning av 80 ml torr THF och lO ml DMF, och 0,5 g lö-kron-6-eter tillsattes.

En kalciumhydridsuspension (ekvivalent med_O,l2 mol) inrördes och tillsattes droppvis till den uppkommande kylda blandninóen under 50 min. 2,Ä9 ml metyljodid (0,04 mol) tillsattes och blandnin¿en omrör-I des under 24 timmar vid rumstemperatur. Reaktionsblandningen kyldes sedan och surgjordes till pH 5 med 0,75 N citronsyra och fördelades n ister-skinnet :väntades med vatten Vatten- ektrakten sammanslogs, surgjordes till pH-2 och extraherades med etyl- acetat. .Etylacetatextraktet torkades över magnesiumsulfat, filtrerades och indunstades i vakuum, varvid erhölls ö,4 g produkt med ett NM- spektrum i överensstämmelse med den önskade N-metvlerade produkten fo! 2,92, :v-CHE; <5* 2,11, s-cH ; d' 1,6, c(cH5)3_7. därefter mellan vatten och eter. flera gånger och extraherades sedan med N natriumbikarbonat. - 5 771G755~5 15 8,4 g av oljan (ca 0,054 mol) löstes sedan i 60 ml DMF. Lös- ningen kyldes till OOC och 4,69 g (0,055 mol) HBT och 7,0 g (0,054 mol) DCC tillsattes. Blandningen omrördes under två timmar vid OOC och vattenfri ammoniak inbubblades i blandningen via ett gasfördel- ningsrör under 45 min. Reaktionsblandningcn filtrerades sedan och filtratet koncentrerades i vakuum. Den uppkommande resten tillfördes en pelare 3 x 50 cm av kiseldioxidgel (partikelstorlek 0,25-0,074 mm) och eluerades med Kloroform följt av en blandning 9,75:0,25 av kloro- form och metanol.- Analys ¿enom tunnskiktskromatografi (TLC) av frak- tionerna från pelarcn och efterföljande sammanslagning på basis av TLC-proven gav efter koncentrering i vakuum en produkt, som omkristal- ,liserades två gånger ur en blandning av eter och petroleumeter, varvid erhölls 4,1 g (39%) av den i rubriken angivna föreningen med en smält- punkt av 75-7800. e _ Nim: 62,80, N-cn.,; d" 2,10, s-onj; 61,48, c(cn3)}. _¿§/§5 :q-e-LS (c o,5; cnclj). ' Analys, beräknat för cll1¶22N2so5 (262,37)=~ c 50,36' H 8,45 N lo,é68;$ Funnet: C 50,59 H 8,24 N l0,87% e . - G. Na-tert.butyloxikarbonyl-L-fenylalanyl~NQ-metyl-L-metionyl- amid. ' _ ' En blandning av 20 ml isättika, 2lml anisol, 2 ml trictylsilan och 5,8 g (0,0l¿ä mol) av produkten från avsnittet F framställdes.

Vattenfritt klorväte bubblades in i den erhållna blandningen under 30 min. 'Därefter utspäddes blandnin¿en med eter. Erhållen fällning avfiltrerades, torkades, (2,9 g) och upplöstes på nytt i Ä0 ml DMF.

Blandningen kyldes till OOC och 2,9 ml (0,0l46 mol) dicyklohexylamin tillsattes följt av 1,97 g (o,o146-m0l) Har, 3,87 g (o,ol1+6 fiol) N”- tert.butyloxikarbonyl-L-fenylalanin och_5,0 g (0,0l46 mol) DCC. Den så erhållna blandnin¿en omrördes under två timmar vid 0°C och därpå _under 24 timmar vid rumstemperatur. Blandningen kyldes till 090 och filtrerades. Det så erhållna filtratet koncentrerades sedan i vakuum.

Resten löstes på nytt i etylacetat, och lösningen tvättades successivt med N natriumbikarbonat, vatten, 0,75 N citronsyra samt vatten. Etyl- acetatlösningcn tarkades sedan över maåncslumsulfat och indunstades i vakuum, varvid erhölls en olja, som icke ville kristallisera ur petro- leumetcr. Resten tillfördes sedan en pelare š x 50 cm av kiseldioxíd- gel (partixelstorlek 0,25-0,07% mm) och eluerades med Kloroform följt av kloroform~metanol (9,8:O,2). TLC-analys av fraktioner från pelaren och efterföljande,sammanslagning på basis av erhållna TLC~analysresul- 7710755-5 i 16' tat gav efter indunstning av kromatograferingslösningsmedlet en rest, som kristalliserades ur eter-petroleumeter, varvid erhölls 5,1 g (52,5%) av den i rubriken angivna föreningen med en smältpunkt av 99- 1o5°c. ' Analys, beräknat för C2OH3lN504S (409,55): c 58,65 H 7,63 N io,26% Funnet= c 58,74 H 7,47 N io,45% H, Na-tert.butyloxikarbonyl-L-tyrosyl-D~alanylg]ycyl-L-fenyl- alanyl-Na-metyl-L-mctionylamid _ _ ' Till en blandning av 20 ml isättika etylsilan sattes 2,2 g (5;37 mmol) av produkten från avsnittet G.

Torrt klorväte bubblades in i blandningen under 30 min. Eter sattes , 5 ml anisol och 3 ml tri- till blandningen och en fällning utföll, som avfiltrerades och torka- des i vakuum. Fällningen (l,75 g; 5 mmol) löstes i 50-ml torr DMF, och blandningen kyides till o°c. sedan genom tillsättning av 0,99 ml (5 mmol) dicyklohexylamin.

Hydrokloridsaltet neutralierades Efter 5 min tillsattes 2,05 g (5 mmol) av produkten_frân avsnittet E, följt av 0,68 g (5 mmol) HBT och 1,03 g (5 mmol) DCC. sedan under PH timmar vid 400. Det så erhållna olösliga materia- Blandningen omrör- des let Den avlägsnades genom filtrering, och filtratet indunstades i vakuum. så erhållna resten löstes på nytt i etylacetat, och etylacetatet tvättades successivt med N natriumbikarbonatlösníng i vatten, kall 0,75 N citronsyra samt med vatten. nesiumsulfat och tillfördes en pelare 5 x 50 cm av kiseldioxidgel (partikelstorlek 0,25-0,074 mm) och eluerades med kloroform följt av kloroform-metanol (9:l). TLC-analys av fraktioner från pelaren och efterföljande sammanslagning på basis av resultaten från TLC-analysen Lösningen torkades sedan över mag- gav två satser oren produkt, som vägde 0,80 g respektive 1,2 g. Den första satsen renades ytterligare genom prfoarativ tunnskiktskromato- grafi på kiseldioxidgel (kloroform:metanol- 9:1), varvid erhölls 0,62 g av den i rubriken angivna föreningen såsom ett amorft fast ämne.

Analys, beräknat för c54H4BN6c8s (7oo,86)= C 55,27 H 6,90 N 11,995 C 53,48 H 6,óä N ll,97ß Aminosyraanalys, funnet: Tyr 0,99; Ala l,0O; Gly l,O0; Phe 1,00. _ Den andra satsen av material kromatograferades två gånger på Funnet: samma sätt som beskrives ovan, varvid erhölls 0,74 g av den önskade produkten med en korrekt elementär- och aminosyraanalys. l. L-tyrosyl-D-alanyl-glyoyl-L-fenylalanyl-Na-metyl-L-metio-0 nylamidhydroklorifi. 1710755-s _ _ 17 Till 5 m1 isactixa innenåiianae 0,2 mi anisøi sattes o,72 g (l,05 nmol) av den i rubriken angivna föreningen från avsnittet H.

Vattenfritt klorväte bubblades sedan in i blandningen under 20 min.

Blandningen lyofillserades, varvid erhölls 0,74 g av den 1 rubriken angivna föreningen. R? = 0,3.

Ett analytiskt prov av produkten torkades i vakuum vid 100 Analys, beräknat för C29H4lN6OÖSCl4 {637,20): c 5115161 1-16,11g1 N 13,19-,$ vunnet: c 5n,56 H 6,19 N 13,oo% Aminosyreinalys, funnet: Tyr 1,01; Ala 0,99; Gly 1,00; Phe 1.00.

Exemgel 2. _ of' UI . Framställning av L-tyrosyl-D-1eueyl-glycy11L-fenylalanyl-Nu-metyl-L- 'metionylamidseskvíhydrokloridmonoacetat A. Bensyl-D-leucinat-p-toluensulfonat.

Denna förening framställdes på ett sätt exakt motsvarande det som beskrivas i avsnitt A'i exempel 1 för framställning av D-a1inat- föreningen. Utbyte 73%. Smältpunkt 155-15éoC.

Analys, beräknat för C2OH27N05S _(59j,50): C 61,05 H 6,92 N j,56% vunnet; c 61,17 116,68 1118195 B. Bensyl-Na-tert.butyloxikarbonyl-0-bensyl-L-tyrosyl-De leucinat I ' Till 50 ml DMF sattes 7,86 g (0,020 mol) av produkten från av- snittet A.A Blandningen kyldes till OOC och 2,2# 5 (O,U2O mol) DABCO tillsattes. Blandningen omrärdes under 5 min och 7,42 ¿ (0,020 mol) Na-tert.butyloxikarbanyl-0-bensyl-L-tyrosin tillsattes, följt av 2,7 g (0,02O mol) HBT och 4,12 g (0,02 mol) DCC. Den erhållna blandningen omrördes under två timmar vid OOC och därpå under 24 timmar vid rumstem- peratur. Blandningen kyldes sedan till 090, och den erhållna suspen- sionen filtrerades. Filtratet koncentrerades 1 vakuum. Den så erhåll- na reston löstes sedan i etylacetat, och etyiaeetatlösningen tvätta- .des successivt med N natrlumbikarbonat, vatten, kall 0,79 N citronsyra samt vatten.- Den orëaniska fasen.torkades över magnesiumsulfat, filt- rerades och filtratet_koncentrerades i vakuum. Den så erhållna resten kristallíserades ur torr etylalkohol, varvid erhölls 9,0 g (78%) av den 1 rubriken angivna föreningen med en smältpunkt av 100-10500.

Anaiys, beräknat för c54H¿2N2o6 (5?4,72)¿ c 71,06 flyg? N4,87% Funnet: C 71,30 H 7,15 N 4,79% _.. _..p.._._..-.........._- 7710755-5 18 3. Na-tert.butyloxikarbonyl-0-bensyl-L-tyrosyl-D-leucin.

Till 80 ml THF saflæs 8,0 g (0,0l39 mol) av produkten från avsnit- tet B. Efter tillsättning av 20 ml vatten kyldes den så erhållna bland- ningen till 000, och 7,25 ml (0,0l45 mol) 2N natriumhydroxid tillsattes långsamt. Efter fullbordad tillsättning omrördes blandningen vid 0°C under 50 min och därpå vid rumstemperatur under fyra timmar. Reaktions- blandningen fördelades sedan mellan vatten och eter. Vattenfasen av- skildes och kyldes till 000, surgjordes till pH 2 med kall N H01 samt extraheradesimed_etylacetatI Etylacetatextraktet tvättades sedan med vatten, torkades över magnesiumsulfat, filtrerades och koncentrerades i vakuum, varvid erhölls en sirapsartad rest. Resten'kristallisera- des ur eter-petroleumeter, varvid erhölls 6,4 g (95%) av den i rubri- ken angivna föreningen med en smältpunkt av 90-9400.

Analys, beräknat för c27H56N2o6 (484,59)= c 66,92 H 7,49 N 5,78% runner: c 67,14 H 7,38 N 5,76% D. Bensyl-Na-tert.butyloxikarbonyl-O-bensyl-L-tyrosyl-D-leu- cyl-glycinat. i . e En blandning av 3,37 g (0,0l0 mol) av p-toluensulfonatsaltet av bensylglycinat och l,l2 g (0,0lO mol) DABCO i 25 ml torr DMF fram- ställdes. Till blandningen sattes 4,ö4 g (0,0l0 mol) av föreningen från avsnittet C. Blandningen kyldes sedan till OOC, och 1,35 g (0,0lO mol) HBT och 2,06 g (0,0l0 mol) DDC_tillsattes. Den så erhåll- na blandningen omrördes under två timmar vid OOC och- därpå under 24 timmar vid rumstemperatur. Blandningen kyldes till 000, filtrerades och filtratet koncentrerades i vakuum. Den så erhållna resten löstes i etylacetat, och etylacetatlösningen tvättades successivt med N nat- riumbikarbonat, vatten, kall 0,75 N citronsyra samt vatten. Lösningen torkades sedan över magnesiumsulfat,_filtrorades och koncentrerades i vakuum. Den så erhållna resten kristalliserades ur etylalkohol-vatten, varvid erhölls 4,0 g (63%) av den i rubriken angivna föreningen med en smäinpunkfi av lin-1i6°c. ' ' Anaiys, beräknat-för c.6s45N5o7 (631,77)§ _ c _68,44 H 7,18 _N 6,65% Funnet: C 68,17 H 7,12 N 6,40% 's. Na-fiert.buty1oxixarbbny1-L-cyrosyign-leueyi-glyein. 0 Till 5_ml vattenfri DM sattes 3,9 g (0,006 mol) av föreningen från avsnittet D följt av 1,5 g 5% Pd/C. Till blandningen sattes sedan 40 ml etanol, varpå blandningen spolades men kväve och väte infördes under fem timmar, under det att blandningen hölls vid atmosfärstryck 7710755-'5 19 och rumstemperatur._ Katalysatorn avfiltrerades sedan från blandningen och filtratet indunstades i vakuum. Den så erhållna resten kristalli- serades ur eter-etylacetat, varvid erhölls 2,3 g (85%) av den i rubri- ken angivna föreningen med en smältpunkt av 189-l90°C.

Analys, beräknat för C22H55N3O7_ (H5l,j2): c 58,52 mryfi? N9,5l% nunnan: c 56,79 H 7,48 'N 9,39% F. Ng-tert.butyloxikarbonyl~L-tyrosyl-D-leucyl-glycyl-L- fenylalanyl-NG-motyl-L-metionylamid.0 ' åTill LO ml vattenfri DMF sattes 0.692 ß (0,002 moi) av hydro- kloridsaltet av L-fenylalanyl-Nu-metyl-L-metionylamid (framställt såsom i avsnittet H'i exempel l) och 0,903 5 (0,002 mol) av produkten från avsnittet E. Den så erhållna'blandnin¿en kyldes till OUC och 0,28 ml (0,002 mol) trietylamin tillsattes, följt efter l0 min av .O,2? g (0,002 mol) HBT samt 0,412 g (0,002 mol) DCC. Blandningen om- rördes sedan vid O°C under två timmar och därpå vid 400 under 24 tim- mar. Den så erhållna fällningen avlägsnades genom filtrering, och filtratet koncentrerades i vakuum till en rest, som sedan löstes i etylacetat. Etylacetatlösningen tvättades successivt med N natriumbi- karbonat, vatten, kall 0,75 N citronsyra samt vatten. Den organiska fasen torkades sedan över magnesiumsulfat, filtrerades, och filtratet koncentrerades i vakuum. -Resten anbringades pà_två preparativa tjock- skiktskromatografiplattor, och plattorna eiuerades med kloroform-meta- nol (9,25:0,75)Ä Detstörsta UV>positiva bandet utskars från varje platta och produkten eluerades från kiseldioxidgelet med kloroform- metanolf Lösningsmedlet avlägsnades i vakuum, varvid erhölls 1,2 g (81%) av den i rubriken angivna föreningen såsom ett amorft fast ämne. ¿§7â° ="-31,5 (c = 0,5, meon) Analys, beräknat för C37H54N608S (742,9}): U jQ,ß2 H 7,}} N ll,5l% Funnet: C >~.öö H 7,00 N ll,l5%“ _ Aminosyraanalys, funnet: Tyr l,Ol; Leu 1,00; Gly l,00; Phe 0,99.

G. L-tyrosyl-D~leucyl-glycyl-L-fenylalanyl-Na-metyl-L-metio- nylamidseskvihydrokloridmonoacetat. _ Till 5 ml isättika innehållande 0,5 ml anisol sattes 0,900 g (0,00l2 mol) av föreningen från avsnitt F. 'Torrt klorväte bubblades ~in i blandningen under 20 min. Lösningsmedlet avlägsnades sedan genom .lyofilisering från vattenhaltig ättiksyra, varvid den i rubriken an- . givna föreningen erhölls såsom ett amorft fast ämne. ¿§7š5 = -2,1 (G = 0,5, meon) V ...____......~___-._....._, , 7710755-5 20 Analys, beräknat för C32H¿7N606S~l,5HCl-CQHÄOE (757,0H); c 53,93 H 6,79 N 11,10 c1 7,02% e i Funnet: C 5H,30 H 6,6M N 11,32 Cl 6,96% Aminosyraanalys, funnet: Tyr 0,99; Leu 1,05; Gly 0,99; Phe 0,99.

Exempel 3.

Framställning av L-tyrosyl-D-alanyl-glycyl-L-fenylalanyl-Nd-metyl- -L-metionylamidacetat. g _ _ A. Trifluorättíksyrasalt av L-tyrosyl-D-alanyl-g1ycy1-L-fenyl- alanyl-Nä-metyl-L-metionyl-benshydrylaminharts.

Peptidhartset syntetisemmes genom automatiserad syntes i fast fas, varvid man begagnade sig av en Beckman-990 Peptide Synthesízer och an- vände 5,0 g benshydrylaminharts. Hartset neutraliserades.med H% diiso- propyletylamin (DIEA) i metylenklorid, varpå det fick undergå kopp- lingsreaktion med BOC-(N-Me)-Met-OH och DCC i metylenklorid. Härige- nom erhölls det BOC-(N-Me)-Met-substituerade hartset. Man påkopplade på detta peptidharts i tur och ordning BOC-Phe-OH, BOC-Gly-OH, BOC-Ala-OH och BOC-Tyr-QH genom initialkoppling i enlighet med nedan- stående program l och efterföljande förnyad koppling av samma amino- syra i enlighet med program 2. Detta sistnämnda program utfördes en gång för varje amínonyra undantagandes Q-Phe-OH, vid vilken man utför- de programmet tre gånger. Från det resulterande BOC-pentapeptídhartset avlägsnades skyddsgruppen enligt steg 1-8 i program l, varvid man erhöll 6,15 g-av titelföreningen. Tvättstegen i program 1 och 2 ut- fördes med 10 ml per g harts.

- Program 1 1. Tvättning 3 ggr med CHQCI2. 2. Behandling 5 minuter med en blandning av TFA:Et3SiH:PH2Cl2i volym- förhållandet 30:5:65.

. Samma behandling som i steg 2, i 50 minuter. _ Tvättning 2 ggr med CH2Cl2.

. Tvättning 2 ggr med metanol.

. Tvättning med metanol:CH2Cl2 (lzl). 3 4 '5. Tvättning med metanol:CH2Cl2(l:l). 6 7 8 Tvättning 2 ggr med ü% DIEA i CH2Cl2, 9. Behandling H ggr med Ä% DIEA i CH2Cl2, varje gang 2 minuter- 7710755-'5 _21 10. Upprepning av stegen Ä-8.. ' ll. 120 min. behandling med 2,5 ekvívalenter av det önskade amino- syraderivatet i CH2Cl2 och 1,25 ekvivalenter DCC i CH2Cl2. 12. Tvättning Ä ggr med CH2Cl2. . lå. Upprepning av stegen 5-7. lü. Tvättning 3 ggr med CH2Cl2.

Program 2 l. Éehandling U ggr med U% DIEA i CH?Cl2, varje gång 2 minuter. 2. Tvättning 2 ggr med 0H2Cl2. 3. Tvättning med metanol;CH2Cl2(l:l). 4. Tvättning 2 ggr med metanol. 5. Tvättning med metanol:CH2Cl2 (l:l). 6. Tvättning Q ggr med CH2Cl2. 7. Tvättning 5 ggr med DMF:CH2Cl2 (lzl). 8. 120 min. behandling med 2,5 ekvivalenter av det önskade amino- syraderivatet i DMF:CH?Cl? (lzl) och 1,26 ekvivalenter DCC i CH?Clq. 9.' rvaunning H ggr med DMF=cH2c12 (1 1). 10. Upprepning av stegen_M-6.

B.' Vätefluoridsaltet av L-tyrosyl-D-alany1~glycyl-L-fenylalanyl- -figmetyl-L-metionylamid.

Det enligt A erhållna peptidhartset omsattes i 60 min. vid OOC med flytande vattenfritt HF, med användning av anisol som upptagande ämne, varvid reaktionen genomfördes i vakuum. De flyktiga komponen- terna avlägsnades från reaktionsblandningen i vakuum, och peptidhart- set revs med eter och filtrerades för avlägsnande av återstående HF och anísol. Peptiden extraherades från hartset genom rivning med 10%- ig ättiksyra, varpå den filtrerades,'tvättades 5 ggr med 50 ml ~lO%-ig ättiksyra_samt lyofiliserades; på så sätt erhölls 9U0 mg oren titelförening, C. A Kromatografisk rening för erhållande av slutprodukten.

H70 mg av från B erhållen oren blandning av peptiddiastereomerer kromatograferades över en 3,8 X 58,5 cm kolonn av silikagel i rever- terad fas.(C18), varvid man arbetade under lågt tryck (7,l7 kp/cm2) med användning av 25% acetonitril i 0,lN ammoniumacetat. Man uppsamlade 7710755-5 22' l~minutsfraktíoner. Fraktionerna nr. 98-150 sammanslogs och lyofíli- serades, varvid 360 mg produkt erhölls. _ Resten av den orena blandningen från B kromatograferades på samma sätt som beskrivits i föregående stycke; 320 mg produkt erhölls.

De båda lyofilíserade produkterna enligt ovan sammanslogs och kromatograferades över en Sephade G-10 kolonn med dimensionerna 2,5 x 10,0 cm, i O,2N ättíksyra - detta för att avlägsna återstående ammo- niumacetat. Fraktíonerna lyofilíserades, varvid man erhöll 636,7 mg av titelföreningen. ¿1]š5 + 19,7° (C = 0,5, 1N Hcl). ¿u7š25 + 71,70 (0 = 0,5, 1N Hcl).

Analys, Beräknat för C5lHu3N608S: c, 56,55; H, 6,71; N, 12,72; S,'H,85.

Funnet:C, 56,60; H, 6,Ä3; N, 12,97; S, U,92.

Aminosyraanalysz ' _ Ala Tyr Gly , Phe NH3 .% peptid (1) 0,99 1,01 1,00 1,01 1,10 93,1 (P) 1,00 1,01 1,00 0,97 1,02 90,5 77107595 23 Exemgel 4.

Framställning av L-tyrosyl-D-alanyl-glycyl-Na-metyl-L-fenylalanyl- Na-metyl-L-metionylamidhydrokloridtrihydrat.

A._ N,N-dicyklohexylammonium-Na-tert.butyloxikarbonyl-Na-metyl~ L-fenylalinat. _ Till 80 ml torr THF sattes 5,3 g (0,02 mol) Na-tert.butyloxi- karbonyl-L-fenylalanin. Den så erhållna lösningen kyldes till ca 1000 och 10 ml torr DM och 0,5 g l8-kron-6-eter tillsattes. Till den er- hållna blandningen sattes sedan långsamt 10,15 g (innehållande 0,060 mol KH) av en oljcdispersion av kaliumhydrid. Efter fullbordad till- sättning kyldes blandningen till OOC, och_l,2H ml (0,02O mol) metyl- Jodie tillsattes. ' 24 timmar. Blandningen hälldes sedan på krnssad is och extranerades Vattenfasen surgjordes till pH 2 med citronsyra och extra~ Omrörningen fortsattes vid rumstemperatur under med eter. herades sedan med etylacetat. :Den organiska fasen tvättades sedan med vatten, torkades över magnesiumsulfat och koncentrerades i vakuum, varvid erhölls en sirap, som icke ville kristallisera. Sirapens NMR- spektrum stod i överensstämmelse med det förväntade derivatet.

NM ¿1f 2,72, N-cnš; d 1,35, c(cH¿)3_7. sirapen löstes l eter och #,0 ml dicyklohexylamin tillsattes. Vid kylning bildades kristaller.

Kristallerna tillvaratogs och omkristalliserades ur_metanol-eter, var-I vid erhölls 6,8 g (74%) av den i rubriken angivna föreningen med en smaltpunxt av 171-l74°c. få/ga = 22,00 (C = l, metanol).

Analys, beräknat för C27H44N2O¿ C 70,40 H 9,63 N 6,08% Funnet: c 70,60 H 9,49 'N 6,19% _ B. Na-tert.butyloxikarbonyl-Na-metyl-L-fenylalanyl-Nu-metyl- <46o,eej= L-metionylamid. _ Till en lösning av 50 ml torr DMF innehållande l,)8 g (0,0l0 mol) av hydrokloridsaltet av Nu4metyl~L-metionylamid sattes 4,16 g (0,0l0 mol) Nu-tert.butyloxikarbonyl-Na-metyl-L-fenylalanin. Den så erhållna blandningen omrördes under fem min och kyldes sedan till OOC. 1,35 g (o,olo mol) HBT och 2,06 g (o,olo mol) Dcc tillsattes. Den så erhållna blandningen omrördes två timmar vid OOC och därpå under 24 timmar vid rumstemneratur. mrhållen fällning avlägsnadcs genom filtre- ring och filtratet koncentrerades i vakuum till en sirap, som på nytt Etylacetatlösningen tvättades successivt med Den upplöstes i etylacetat.

N natriumbikarbonat, vatten, kall 0,75 N citronsyra samt vatten. organiska fasen torkades sedan över magnesiumsulfat och konoentrerades 7710755-5 24 i vakuum till en sirap. Den så erhållna sirapen löstes på nytt i kloroform och tillfördes en pelare 5 x 50 om av kiseldioxidgel (par- tikelstorlek 0,25-0,075 mm) och eluerades med kloroform följt av klo- roform-mctanol (9,75:O,25). TLC-analys av fraktioner från pelaren och efterföljande sammanslagning på basis av resultaten från TLC-analysen gav efter koncentrering i vakuum l,4 g (35%) av en sirap, som uppvisa- de ett NM-spektrum i överensstämmelse med det för den i rubriken an- givna föreningen. Phe Met 7 NM: @”2,95, N-CH3 ; tf 2,75, N-CH; ; of 2,10, S-CH5; er 1,57, 'zxâfljjï i . i Ci N -tert.butyloxikarbonyl-L-tyrosyl-D-alanylglycyl-Na-metyl- L-fenylalanyl-Na-metyl-L-metionylamid. rriii en tiananing av 5 m1 isättika., 1 m1 anisoi och 1 m1 tri- etylsilan sattes 1,4 g (0,005} mol) av produkten från avsnittet B.

Torrt klorväte infördes via ett gasfördelningsrör under 50 min, och reaktionsblandningen utspäddes sedan med eter. Erhållen fällning till- varatogs och torkades (l,l g) och löstes på nytt i 40 ml DM. Reak- tionsblandningen kyldes sedan till OOC, och 1,27 E (0,005l mol) av produkten från avsnittet E i exempel l, 0,420 3 (0,00}l moi) HBT och O,6HO 5 (0,00jl moi) DCC tillsattes. -Efter tio min tillsattes 0,45 ml (0,00}l mol) trietylamin och omrörningen fortsattes vid OOC under två timmar och därpå vid 400 under 48 timmar. Erhållen fällning av- lägsnados genom filtrering och filtratet koncentrerades i vakuum till en sirapsartad rest, som sedan löstes på nytt i etylacetat. fitylace- tatlösníngen tvättades successivt med N natriumbikarbonat, vatten, kall 0,75 N citronsyra samt vatten, och torkades sedan över magnesium- sulfat, filtrerades och koncentrerades i vakuum, varvid erhölls 2,0 g oren produkt. Produkten löstes i kloroform och tillfördes en pelare 3 x 50 om av kiseldíoxidgel (partikelstorlek 0,25-0,074 mm) ocn elue- rades med kloroform följt av kloroform-metanol (9:l)." TLC-analys av fraktionerna från pelaren och efterföljande sammanslagning på basis av TLC-analysen gav efter koncentrering i vakuum 1,1 g (473) av den i rub- riken angivna föreningen i icke kristalliserad form. 7 ,Analys, beräknat för C35H5ON6O8S (7l4,ö8): C 58,80 pH 7,05 N_ll,76% runner: c 59,01 H 6,78 N_11,58/¿- D. L-tyrosyl-D-alanyl-glycyl-Na-mety -L-fenylalanyl-Na-metyl- L-mecionyianli-qnyoi-okior iatrihydrazt . y Till en blandning av 10 ml isättika och 0,5 ml anisol sattes 0,70 3 (0,00l moi) av produkten från avsnittet C. Torrt klorväte in- fördes via ett ga:fördelningsrör'under 20 min. Reaktionsblandningen - ----------»-» ~ -- - Z _-~___.__.:,.._..___._._ 7710755-5 , 25 frystes sedan och lyofiliserades, varvid erhölls 0,678 g av den i rub- riken angivna föreningen, som var hygroskopisk. analys, beräknat för C3OH43N6O6SCl-}H20 (705,25): C 51,08 H 7,0 N ll,9l% Funnet: C 51,15 H 6,97 N ll,72% Aminosyraanalys, funnet: Tyr 1,05; Ala 1,01; Gly 0,96.

Exempel 5. . n Framställning av L-tyrosyl-D-alanyl-L-alanyl-L-feny1alanyl-Na-metyl- L-metionylamid.1,25-hydrokloridmonoacetat.

A." Bensyl-Na-tert}butyloxikarbonyl-0-bensyl-L-tyrosy1-D- alanyl-L-alinat.

Till en lösning av 3,19 g (0,010 mol) av p-toluensulfonatsaltet av bensylalinat i 30 ml torr DMF sattes 4,ü5 g (0,0l0 mol) av produkten från avsnittet B i exempel l. 'Den så erhållna blandningen kyldes till 000 och 1,12 g (0,0l0 mol) DABCO följt inom tio min av 1,135 g (0,0l0 mol) HT och 2,06 g (0,0l0 mol) DCC. .Den erhållna blandningen omrör- des vid O°C under två timmar och därpå vid rumstemperatur under 48 timmar. Erhállen fällning avlägsnades genom filtrering och filtratet indunstades i vakuum till en sirap. Sirapen löstes på nytt i etyl- acetat, och etylacetatlösningen tvättades successivt med N natriumbi- karbonat, vatten, kall 0,75 N klorvätesyra samt vatten. Den organiska fasen torkades sedan över magnesiumsulfat och filtrerades, och filtra- tet koncentrerades i vakuum, varvid erhölls en rest, som icke ville kristallisera ur etanol eller eter. Utspädning av eterlösningen med petroleumeter gav ett gel, som tillvaratogs genom filtrering och torka- des i vakuum. Det därvid erhållna orena, amorfa fasta ämnet (4,0 g) tillfördes en pelare 3 x 50 om av kiseldioxidgel (partikelstorlek 0,25- 0,074 mm) och eluerades med kloroform följt av kloroform-metanol (9,75: 0,25). TLC-analys av fraktionerna från pelaren, efterföljande samman- slagning av fraktionerna på basis av TLC-analysen och Jndunstnlng av lösningsmedlet i vakuum gav en sirapsartad rest. Detta material lös- tes i eter och fälldes med petroleumeter, varvid 5,0 g (50%) av den i rubriken angivna föreningen_erhö1ls såsom ett amorft fast ämne med. en smäitpunkt av ioo-iolPc. ' Analys, beräknat för C ÄHÅINBO7 {603,72): C 67,64 H 6,85 N 6,96% nunnan 067,56 H 6,60 N 7,16% B. Na-tert.butyloxikarbony1-L-tyrosy1-D-alanyl-L-alanin.

Till 5 ml torr DMF sattes 2,9 g.(0,0048 mol) av produkten från avsnittet A. Till blandningen sattes sedan 1,0 g 5% Pd/C följt av 50 ml etanol. Väte infördes vid atmosfärstryck och rumstemperatur via ett ._ .-.___ ......_.......__....-~._........ 7710755-S 26 gasfördelningsrör under sex timmar. Reaktionskärlet spolades sedan med kväve, katalysatorn tillvaratogs genom filtrering, och filtratet kon- , centrerades i vakuum. Resten löstes i etylacetat, och lösningen ut- späddes med eter. Erhâllen fällning tillvaratogs genom filtrering och torkades i vakuum, varvid erhölls 1,5 g (74%) av den i rubriken angiv- na föreningen såsom ett amorft fast ämne. gë7š5 = 25,9° (c = 0,5, Kloroform). _ Analys, beräknat för C2OH29N507 (425,47): G 56.75 H 6,90 N 9,92% Funnet: C 56,80 H 6,95 N 9,81% C. Na-tert.butyloxikarbonyl-L-tyrosyl-D-alanyl-L-alanyl-L- fenylalanyl-Na-metyl-L-metionylamid.

Till 10 ml torr DM sattes 0,692 g (0,002 mol) av hydroklorid- saltet av L-fenylalanyl-Na-metyl-L-metionylamid (framställd såsom i avsnitt É i exempel l). Blandningen kyldes till OOC och 0,28 ml (0,002 mol) trietylamin tillsattes." Éeaktionsblandningen omrördes un- der tio min och 0,846 g (0,002 mol) av produkten från avsnitt B till- sattes följt av 0,270 g (0,002_mol) HB¶ och 0,412 g (0,002 mol) DCC.

Den så erhållna blandningen omrördes vid 090 under två timmar och där- på vid rumstemperatur under 48 timmar.; Efter förnyad kylning av bland- ningen till OOC Filtrerades den och filtratet koncentrerades i vakuum.

Resten löstes på nytt i etylacetat, och etylacetatlösningen tvättades successivt med N natriumbikarbonat, vatten,-0,75 N citronsyra samt vatten. Den organiska fasen torkades sedan över magnesiumsulfat och filtrerades, och filtratet koncentrerades i vakuum, varvid erhölls l,6 g oren produkt. Produkten löstes i kloroform och tillfördes tva preparativa tjockskiktskromatografiplattor. Plattorna eluerades med kloroform-metanol (9:l). Det största bandet skars ut från varje plat- ta och produkten utvanns från kiseldioxidgelet genom extraktion med kloroform-metanol; Eluatet (1,5 g) löstes och påfördes på nytt på en enda tjockskiktskromatografiplatta och kromatograferades på nytt, var- vid erhölls 1,0 g (70%) av den i rubriken angivna föreningen såsom ett amorfc fas: ämne. 437? = -25,6° (c = 0,5, xvïeon).

Analys, beräknat för C 5H5oN608S _(7l4,88): C 58,80 H 7,05 N ll,76%' Funnet: C 58,60 H 6,87 N ll,53% D. L-tyrosyl-D-alanyl-L-alanyl-L-fenylalanyl-Na-metyl-L- metionylamidhydrokloridmonoacetat. 0 Till 5 ml isättika innehållande 0,5 ml anisol sattes 0,880 g (0,00ll mol) av produkten från-avsnitt C. Torrt klorväte infördes via ett gasfördelningsrör under_20 min. Reaktionsblandningen frystes se- _____ _ __.-. _ . _... . _-._.__.._.._..___._...__._._ 7710755-5 27 dan och lyofiliserades, varvid erhölls 0,704 g av den i rubriken angiv- na föreningen. ¿§7§5 = -16,2° (c = 0,5, meon). _ Analys, neraknat för c50H42N6o6s-1,25Hc1~c2nho2 (719,14): c 55,43 H 6,45 N 11,68 ci 6,16% Funnet: C 55,48 H 6,4? N ll,62 Cl 6,50% Aminosyraanalys, funnet: Tyr 1,00; Ala 1,99; Phe l,0l.

Exemgel 6. 1 Framställning-av L-tyrosyl-D-alanyl-glycyl-L-fenylalanyl-L-Na-metyl- ' S-etyl-cysteinylamidacetat.

A. Na-tert.butyloxikarbonyl-S-etyl-L-cysteindicyklohexylamin- salt.

Till 400 ml N,N-dimetylformamid (DMF) sattes 50 g (0,556 mol) L-(S-etyl)cystein. 44,8 ml (O,556 mol) tetrametylguanidin och 66,8 ml (0,536 mol) dicyklohexylamin sattes till reaktionsblandningen. 68 ml (O,5O mol) tert.butylazidoformiat tillsattes sedan droppvis till reak- tionsblandningen under en tidsrymd av en timme, och blandningen omrör- des under 48 timmar vid rumstemperatur. Utfälld dicyklohexylammonium- azid avlägsnades genom filtrering och filtratet indunstades i vakuum.

Resten fördelades mellan eter och vatten. Vattenskiktets pH inregle- rades till 8,0. Det organiska skiktet avskildes och bortkastades.

Vattenskiktet surgjordes sedan till pH 2,0 med kall utspädd klorväte- syra och cxtraherades med kallt'etylacetat. Etylacetatfasen tvätta- des sedan med vatten, torkaden över magneslumsulfat och koncentrera- des i vakuum. Den så erhållna resten löstes i eter, och 66,8 ml (0,556 mol) dicyklohexylamin tillsattes. Erhállen fällning tillvara- togs och omkristalliserades ur etylacetat, varvid erhölls 52,8 g (25% av det teoretiska utbytet) av den i rubriken_angivna föreningen med en emältpunkt av 156-159°c. ¿§7š5 = -1,10 (c'e 1, MeoH); _ë7§6¿ = -7,v° (c = 1, meon)- ' Analys, beräknat för c22H42N2o¿s (43o,6§= c 61,36 n 9,85 N 6,51% Funnet= c 61,37 H 9,98 N 6,26% B. Na-butyloxikarbonyl-N-metyl-S-etyl-L-oysteinylamid.

Till 50 ml torr tetrahydrofuran (THF) sattes 18,58 g (74,5 mmol) Na-butyloxikarbonyl-S-etyl-L-cystein (framställt genom neutrali- sering av produkten från avsnitt A och extrahering med etylacetat). _ Den så erhållna blandningen sattes droppvis under 50 min till en me- kaniskt omrörd suspension av 42,45 g kaliumhydrid {22,l% KH i mineral- oija; 0,234 moi KH) 1 375 mi THF vid o°c och inxenailanae o,35 g 18- kron-6-eter._ 9,25 ml (0,l49 mol) metyljodid i 20 ml THF tillsattes 771Û755*5 28 droppvis under l5-20 min. Blandningen omrördes vid OOC under 1,5 tim- mar, och 7,5 ml ättiksyra i 7,5 ml THF tillsattes dreppvis följt av 5 ml etanol. Den därvid erhållna reaktionsblandningen hälldes på is, och blandningens pH inreglerades till ca 9 genom tillsättning av 2N natriumhydroxid. Den erhållna vattenlösningen extraherades med eter.

Vattenskiktets pH inreglerades sedan till 3 genom tillsättning av fast citronsyra, och extraherades sedan på nytt med 5 x 500 ml eter. Eter- extrakten sammanslogs, tillbakaextraherades med vatten, torkades över magnesiumsulfat och koneentrerades i vakuum. Härvid erhållen rest löstes L 200 ml eter och 9,56 ml (74,5 mmol) d(+)a-metylbensylamin tillsattes. Blandningen kyldes och 500 ml petroleumeter tillsattes.

Ingen kristallisation inträdde; Lösningen koncentrerades i vakuum och löstes på nytt i petroleumeter. Blandningen kyldes till -7800 och en mindre mängd fällning bildades, som tillvaratogs genom filtrering (2,74 g). Moderluten koncentrerades i vakuum och resten löstes på nytt i eter. Eterlösningen extraherades med N citronsyra. Det organiska skixtet tillbakaextraherades med vatten._torkades över magnesiumsulfat och koncentrerades i vakuum, varvid erhölls 6,56 g (}5% av det teore- tiska utbytet) ev en sirap. ¿§7š5 = -61,1°, (c e 1, EtoH); NMR (cncij) U 2,90, N-CH,; d'l,Ä5, tert.Bu; Of 4,9-4,5, CH.

Produkten (6,5 g; 0,025 mol) löstes i 80 ml DMF och blandningen 'kyldes till -1500. 5,6 ml (0,027 mol) isobutylklorformiat tillsattes följt av 2,99 ml (0,02?_mQl) N-metylmorfolin. Den därvid erhållna blandningen omrördcs under tio min vid -LSOC, varpå vattenfri ammoniak inbubblades i reaktionsblandningen under en timme. Blandningen omrör- des ytterligare fyra timmar vid -l5°C och hälldes sedan över en bland- ning av is och N natriumbikarbonat. ,Det kalla vattenskiktet extrahe- rades med eter. Eterextraktet extraherades_sedan med kall 0,75 N cit- ronsyra samt vatten, torkades over magnesiumsulfat och koncentrerades i vakuum, varvid erhölls en rest som kristalliserade ur en blandning av eter och petroleumeter och gav l,7 g (26%) av den i rubriken angivna föreningen med en emäitpunkt ev 56-59°c. ¿§7â5 = -127,6° (c= 0,5, CHCl3); NMR (CfiCl3) CfV2,8O, N-CH3; @^ i,46, tert.Bu;cf 4,9-4,5,_ d-CH. ' Aneiye, beräknat för cllnalvaošs (261,56)= c 50,55 iH 8,10 N 1o,72% Funnet= C 50,56 H 7,93 N 1o,51% 'C. Na-tert;butyloxikarbonyl-L-fenylalanyl-Na-metyl-S-etyl-L- -eysteinylamid.

' Till 20 ml isättika innehållande l ml trietylsilan och 4 ml anisol sattes 2,5 g (9,5 mmol) Na-tert.butyloxikarbonyl-Na-metyl-S- 7710755~5 29 etyl-L-cysteinylamid. Torrt klorväte bubblades genom blandningen under 50 min, och eter tillsattes sedan för utfällning av hydrokloridsaltet (1,8 g). Fällningen löstes i 25 ml DMF. Blandningen kyldes till OOC och neutraiieradee med 1,31 m1 trietylamin. '2,65 g (o,o1 moi) N”- tert.butyloxikarbonyl-L-fenylalanin tillsattes följt av 1,35 g (0,0l .mo1) HBT och 2,06 g (0,0l mol) DCC. -Den så erhållna blandningen omrör- des vid OOC under två timmar och därpå vid rumstemperatur under 24 1 timmar. Hßlandningen kyldes till 0°C, varpå erhàllen fällning avlägsna- des genom filtrering. Filtratet koncentrerades i vakuum till en rest.

.Resten löstes i etvlacetat, och etylacetatlösningen extraherades med N natriumbikarbonat, vatten, 0,75 N citronsyra samt vatten. ßlandnlng-' en torkades sedan över magnesiumsulfat, och lösningsmedlet avlägsnades i vakuum, varvid erhölls en sirap. Sirapen löstes i kloroform och lös- ningen tillfördes en pelare 5 x 45 cm innehållande kiseldioxidgel Grace and Davidson kvalitet 62. 'Eluering med en kloroform-metanol stegvis gradient [ÖHCl3 -á CHCl5/Me0H (9:1)_7 och lokalisering av produkten genom TLC-analys av fraktionerna gav efter sammanslagning av rätta fraktioner och indunstning-i vakuum av lösningsmedlet 5,0 g av den i rubriken angivna föreningen.e ÅQYÉ5 = ~77° (C = 0,5, MeOH).

Analys, beräknat för C20H3lN3O4S (409,5): C 58,65 H 7,63 N 10,26% Funnet: C 58,87 H 7,41 N 9,81% D. Na-tert.buty1oxikarbony1-L-tvrosyl-D-alanylglycindicyklo- hexylaminsalt. _ 1 l Produkten från hydrogenolys (enligt förfarandet i avsnittet E i exempel 1) av 46,80 g bensyl~Na-tert.butyloxikarbonyl-O-bensy1-L- tyrosyl-D-alanyl-glycinat löstes i 150 ml isopropylalkohol, och 16 ml (0,081 mol) dicyklohexylamin tillsattes. Eter tillsattes till en voå lym av ca 1,5 1. Den halvfasta massan revs tills den blev fast, och erhàllen fällning tillvaratogs och torkades, varvid erhölls 46,04 g' .(98%) av ett fast ämne med en smältpunkt av 194,5-19700. Det fasta ämnet löstes i 100 ml kokande metanol och 500 ml isopropylalkohol tillsattes; Lösningens volym minskades under en kvävgasström till ca 150 ml.. Vid avkylning inträdde kristallisering. Blandnlngen fick stà_ över natten och fällningen tillvaratogs och torkades, varvid erhölls 41,44 g (88%) av den i rubriken angivna föreningen med en smältpunkt av 198-2oo,5°c. ¿§7š5 +17,9° (c = 1, meon).

Analys, beräknat för C5lH5ON407 (590,8): c 63,03 H 8,53 N 9,48% Funnet= C 62,95 H 8,77 N 9,20% 7710755-5 _30' E. Na-tert.butyloxikarbonyl-L-tyrosyl-D-alanyl-glycyl-L- fenylalanyl-Na-metyl-S-etyl-L-cysteinylamid. I Till 20 ml isättika innehållande 5 ml anisol och 5 ml trietyl- silan sattes 2,5 g (6,1 mmol) av produkten från avsnittet C. Torr klorvätegas bubblades genom reaktionsblandningen under 25 min. Eter tillsattes sedan, och blandningen kyldes och filtrerades, varvid er- hölls l,9 g (5,5 mmol) av hydrokloridsaltet. Saltet löstes i 25 ml DM. Blandningen kyldes och 5,2 g (5,5 mmol) Na-tert.butyloxikarbonyl- L-tyrosy1-D-alanyl-glycindicyklohexylaminsalt tillsattes. Den så er- hållna blandningen omrördes vid OOC under tio min. 0,74 g (5,5 mmol) HBT och l,l g (5,5 mmol) DCC tillsattes_och reaktionsblandningen om- rördes vid OOC under två timmar och vid ÄOC under Ä8 timmar. Erhållen _ fällning avlägsnades genom filtrering, och filtratet indunstades i va- kuum. Resten löstes i etylacetat, och etylacetatlösningen extrahera- des med N natriumbikarbonat, vatten, Q,75 N citronsyra samt vatten.

Den organiska fasen torkades över magnesiumsulfat och indunstades i vakuum, varvid erhölls 5,5 g av den i rubriken angivna föreningen i orent tillstånd. Produkten löstes i kloroform och tillfördes en pela- re 5 x 45 cm av kiseldioxidgel Grace and Davidson kvalitet 62 och elu- erades med en stegvis gradient av kloroform-metanol ¿ÖHCl5 -à CHCl3/ McOH (9:l)¿/. indunstades i vakuum, varvid erhölls 2,4 g (62%) ren förening av i rubriken angivet slag. [§7š5 = -50,70 (C å 0,5, MeOH).

Analys, beräknat för C34H48N6O8S (700,86): . c 58,27 H 6,90 _ N 11,99% 5 i runner: c. 58,14 ._ H 6,98 N 11,94% Aminosyraanalys, funnet: Tyr l,Ol; Ala 1,00; Gly 1,00; Phe 0,98; N55 1,09. _ - F. L-tyrosyl-D-alanyl-glycyl-L-fenylalanyl-L-Nu-metyl-S-etyl- Fraktionerna sammanslogs på basis av TLC-analys och cysteinylamidacetat.

Till 2Q ml isättika innehållande 2 ml anisol och 2 ml trietyl- silan sattes 2,2 5 (5 mmol) av produkten från avsnittet E. Torrt klor- väte bubblades genom-reaktionsblandningen under 25 min, Eter sattes sedan till blandningen och blandningen kyldes. Erhållen fällning filt- ' rerades och torkades (2,0 g). En del av fällningen (1,2 g) löstes i tillräcklig mängd buffert (l% pyridin och 0,15% ättiksyra i vatten) för åstadkommande av en total volym av lO ml. 'Lösningen páfördes en pelare 2,5 X 99 cm av DEAE-Sephadex A 25 (acetat) som tidigare bringats till jämvikt med samma buffert. Eluatet övervakades och följdes vid 280 pm, och lämpliga fraktioner sammanslogs och lyofiliserades. För- nyad lyofilisering ur 10%-ig ättiksyra följt av lyofilisering ur en 7710755~5 31 blandning 75:25 av~vatten¿och acetonitrll gav 0,59 g av den i rubriken angivna föreningen. ¿§7š5 = +9,9° (c =-0,5, N Hcl). ' Analys, beräknat för C3lHu4N60¿S (ö60,79): _ c 55,55 H 6,71 N 12,72 s 4,85% runnet: c 56,63 H 6,72 N 12,65 s 4,69% Aminosyraanalys, funnet: Tyr l,0O; Ala 1,01; Gly l,00; Phe o,98;'Nn¿ l,o9. ' ' Exemgel 7.

Framstäilning av L-tyrosyl~D-alanyl-glyoyl-L-Fcnylalanyl-Nu-mutyl-L- leucylamidacetat. - A. Na-tert.batyloxlkarbonyl-N”-metyl-L-leucln-a(+)u-metylben- sylaminsalt. _ 0 Till 20nü.eter sattes 12,5 g (0,05 mol) Na-tert.butyloxikarbonyl- L-leucinhydrat. Blandningen torkades över magnesiumsulfat och koncent- rerades i vakuum. Resten löstes i 75 ml THF, och den erhållna lösning- en sattes droppvis nnder 55 min till en mekaniskt omrörd, kyld (OOC) suspension av 27,9 g av en kaliumhydridsuspension (22,lß suspension 1 mlneralolja; o,l54 KH) 1 zoo ml THF, innehållande 0,25 g ls-kron-6- eter. 6,4 ml metyljodid i 10 ml THF tillsattes sedan droppvis under 15 min. Blandningen hölls vid 0°C under tre timmar, och-5 ml attiksyra i 5 ml THF tillsattes därpå droppvis följt av-5 ml etanol. Den er- hållna blandningen hälldes över 500 ml is, och blandningcns pH inreg- lerades till ca 9 genom tillsättning av N natriumhydroxid. Vattenlös- ningen extraherades med eter och surgjordes sedan till pH 5 genom till- sättning av.fast citronsyra. Den surgjorda vattenhaltiga suspensionen extraherades sedan-med eter. De sammanslagna eterextrakten tvättades med vatten, torkades över magnesiumsulfat och koncentrerades i vakuum, varvid erhölls l5,2 g (lO7% av det teoretiska utbytet) av oren produkt.

Undersökning av produkten genom TLC antydde närvaro av något icke om- satt utgàngsmaterial. Produkten löstes i eter och 5,25 ml (0,05 mol) tert.bntylamin tillsattes. Eterlösningen utspäddes med petroleumeter ochlqfldes över natten. 5,4 3 fällning bildades och avlägsnades. Filt- ratet extraherades med N citronsyra och sedan med vatten. Den organis- ka fasen torkades över magnesiumsulfat och koncentrerades i vakuum till en rest. Resten (6,45 g) löstes i 100 ml eter och 5,59 g (0,026 moi) d(+)a-metylbensylamin tillsattes. Lösningen kyldes över natten och filtrerades sedan, varvid erhölls 9,09 g (49% totalt utbyte) av den i rubriken angivna föreningen med en smältpunkt av 120-l22°C. ¿§7š> = -l4,l° (c = l, neon).

Analys, beräknat för caoujnnzon (366,5)= l C 65-54 H 9,55 N 7,64% Funnet: C 55-33 H 9,05 N 7:55% 7710755-5 32 .

B. N”-nere.busyioxixarbonyi-NG-metyi-L-1eucyiamid.

Till 80 ml DNF sattes ll,5 g (0,047 mol) Na-tert.butyloxikarbo- nyl-Na-metyl-L-leucin (framställt genom neutralisering av produkten 5 från avsnitt A med citronsyra och extraktion i eter). Blandningen kyl- - des till -1500. 6,7 ml (0,052 mol) isobutylklorformiat och 5,7 ml (0,052 mol) N-metylmorfolin_tillsattes. Blandningen omrördes under lO min vid -l5°C och vattenfri ammoniak bubblades genom reaktions- blandningen under en timme. Omrörningen fortsattes sedan under fyra timmar vid -1500. Reaktionsblandningen hälldes över en blandning av lN natriumbikarbonat och is.r Den kalla blandningen extraherades med Heter. Eterskiktet extraherades sedan med 0,75 N citronsyra och vatten, torkades över magnesiumsulfat och indunstades i vakuum. Resten kris- talliserades ur en blandning av eter och petroleum, varvid erhölls 5,5 g (48%) av den i rubriken angivna föreningen med en smältpunkt av 127-128°c. ¿§7š5 = -42,2° (c = i, MeoH). iinaiys, beräknat för cl2H24N2o5 (244,5)= C 58,99 H 9,90 N 11,47% Funnet: C 59,17 H 9,66 N ll,2l% _ C. Na-tert.butyloxikarbonyl-L-fenylalanyl-Na-metyl-L-leucyl- ænid. ' 5 5 Till*5O ml isättika innehållande 5 ml anisol och 5 ml trietyl- silan sattes 5,0 g (0,02 mol) av produkten från avsnittet B. Torrt klorväte bubblades genom reaktionsblandningen under 25 min. Därpå tillsattes eter och blandningen kyldes. Erhållen fällning tillvara- togs och torkades (5,6 g). Det tillvaratagna hydrokloridsaltet lös- tes 1 60 mi DMF. Den så erhållna iösningen kyides till o°c, och '5,99 ml (0,02 mol) dicyklohexylamin tillsattes. Blandningen omrördes vid o°c under tio min, och 5,3-g (o,o2 moi) Na-ter:.buny1ox1karbony1- L-fenylalanin tillsattes följt av 2,7 g (0,02 mol) HBT och 4,12 g (0,02 mol) DCC. Reaktionsblandningen omrördes under två timmar vid O°C och därpå vid rumstemperatur under 24 timmar. Blandningen kyldes till OÜC och filtrerades, och filtratet indunstades i vakuum. Resten löstes i etylacetat, och etylacetatlösningen ektraherades med N nat- riumbikarbonat, vatten, 0,75 N citronsyra samt vatten.- Lösningen tor- .kades sedan over magnesiumsulfat och lösningsmedlet avdunstades iva- I kuum. Den erhållna resten löstes i kloroform och tillfördes en pela- re 5 x 45 cm av kiseldioxidgel Grace and Davidson kvalitet 62. Elu- ering företogs med en stegvis gradient kloroform-metanol ÄÖHCI5 ~+ _CHCl3/MeOH (9:l)_?. Fraktloner sammanslogs på basis av TLC-analys, varvid efter avdunstning av lösningsmedlet erhölls 5,7 g (75%) av den i rubriken angivna föreningen. Äë/äs = -49,59 (C = 0,5, MG0H); NMR 7710155-s 33 (CDCl}) ë'l,4, tert.Bu; d 7,25, fenyl; d 0,95-0,75, CH(CH3)2; Cf 2,7, N-CH . 5 .

D. Na-tert.butyloxikarbonyl-L-tyrosyl-D-alanyl-glycyl-L-fenyl~ alanvl-Na-metyl-L-leucylamid.

Till en blandning av 20 ml_N H01 i isättika innehållande l ml anisol sattes 2,0 glav produkten från avsnittet C.. Blandningen hölls vid rumstemperatur under 50 min, varpå eter tillsattes. Blandningen xyides och ernàiien faiining ciiivaratogs om torxades (ißj g). Det tillvaratagna hydrokloridsaltet löstes i 50 ml DM och 2,95 g (0,05 mol) Na-tert.butyloxikarbonyl-L-tyrosyl-D-alanyl-glycindicyklohexyl- amínsalt tillsattes. Blandningen omrördes under 15 min vid O°C, och 0,675 g (0,005 mol) HBT och 1,5 g (0,005 mol) DCC tillsattes. Reak- tlonsblandningen omrördes sedan under 24 timmar vid 400. Den så er- hållna fällningen tillvaratogs och filtratet koncentrerades i vakuum.

Resten löstes i etylacetat, och etylacetatlösningen extraherades med N natriumbikarbonat, vatten, 0,75 N citronsyra samt vatten. Etylacetat- lösningen torkades sedan över_magnesiumsulfat och koncentrerades i va- kuum. Den så erhållna resten löstes i kloroform,_och kloroformlösning- en páfördes en pelare 5 x 45 om av kiseldioxid-Woelm Grade III. Pela- ren elucrades med_en stegvis kloroform-metanolgradient [ÖHCl}-*ål CHCl5-MeOH (9:l)_/, och fraktionerna sammanslogs på basis av TLC-ana- lys. Efter avdunstning av lösningsmcdlet erhölls 2,3 H (67Å) av den i rubriken angivna föreningen. [§7š5 = 4l7,5°'(C = 0,6, Me0H).

Analys, beräknat för C35H5oN6O8 (682,8)r c 61,57 H 7,58 N 12,31% Funnet: c 61,33 H 7,47 N 12,o8;z _ Aminosyraanalys, funnet: Tyr l,0Q;.Ala 1,01; Gly 0,99; Phe 1,00; nu; 1,08. _ ' E. L-tyrosyl-D-alanyl-glycyl-Lffenylalanyl-Na-metyl-L-leucyl- amidacetat. t I 9 Till 5 ml myrsyra innehållande 0,5 ml anisol och 0,l ml tri- etylsilan sattes 1,8 g (Q,O05 mol) av.produkten från avsnittet D.

Blandningen omrördes vid rumstemperatur under tre timmar. Reaktions- blandningen utspäddes sedan med eter och fick stå under en timme. 'Stern avdekanterades från erhàllen olja, och oljan löstes i etanol. Till- sättning av eter gav en fällning, som avfiltrerades och torkades, var- vid erhölls 0,9 g av den i rubriken angivna föreningen i oren form.

Produkten löstes i enillräcklig mängd buffert (lß pyridin och 0,05% myrsyra i vatten) till en total volym av 5,0 ml. Lösningen påfördes en pelare 2,5 x 100 cm av DEAE-Sephadex A-25 (formiat) och eluerades med samma buffert. Lämpliga fraktioner sammanslogs på basis av UV; _. . __._._...._-.-Q~.__.__.._._-_ _ 7710755 '-5 elueringsanalys (280 nm) och lyofiliserades. Förnyad lyofilisering ur 10%-ig ättiksyra och ur en 75:25 blandning av vatten och acetonitril gav 0,852 g av den i rubriken angivna föreningen. ¿§7š5 = +25,2° (C = 0,6, N HCl).

Aminosyraanalys, funnet: Tyr 1,02; Ala 1,00; Gly 1,01; Phe 0,96; NH, 1,05.

Ekemgelß. - Framställning av L-tyrosyl-D-alanyl-glycyl-L-fenylalanyl-Na-metyl-L- metionylamidacetat.

A. Na-tert.butyloxikarbonyl-Na-metyl-L-metionin-d(+)a-metyl- bensylaminsalt. V Dicyklohexylaminsaltet av Na-tert.butyloxikarbonyl-L-metionin (86,l5 É; 0,2 mol) suspenderades i 600 ml kall eter.' Suspensionen extraherades fyra gånger med lOO ml kall 1,5 N citronsyra och vatten.

Den-så erhållna organiska fasen avskildes, torkades_över magnesium- sulfat och koncentrerades i vakuumfl 'Resten löstes i 150 ml THF och lösningen sattes droppvis under 30 min till en mekaniskt omrörd sus- pension av 0,6 mol kaliumhydrid i 1000 ml torr TH (000), innehållan- de l,0 g 18-kron-6-eter. 25 ml (0,4 mol) metyljodid tillsattes dropp- vis under 15 min. Två timmar efter tillsättningen av metyljodiden tillsattes droppvis en blandning av 20 ml ättiksyra och 20 ml THF, följt av 40 ml etanol. Blandningen omrördes i 50 min och hälldes se- dan på 2 l is. Den vattenhaltiga blandningcns nH inreglerades till 7 med 2 N kaliumhydroxid. Den vattenhaltiga blandningen extraherades -_ tre gånger med 400 ml eter och surgjordes sedan till pH 5 med fast citronsyra. Blandningen extraherades tre gånger med 500 ml eter.

Eterextrakten sammanslogs, extraherades, torkades över magnesiumsul- fat och indunstades i vakuum till en sirap {44,76 g; 84% av det teo- retiska utbytet). Sirapen löstes i 450 ml etylacetat, och 25,78 ml (0,2 mol) d(+)a-metylbensylamin tillsattes. Efter kylning och skrap- ning inträdde kristallisation. Den i rnbriken angivna föreningen till- varatogs genom filtrering, varvid erhölls 51,05 g (66%) med en smält- punxt av 151-134°c. ¿§7š9 = -18,9° (c e 1. ston).- Analys, beräknat för Cl9H32N20¿S (384,54): . C.59,35 H 8,59 N 7,29% Funnec= c 59,15 H 8,12 N 7,21% _ 5 B. Nu-tert.butyloxikarbonyl-Na-mety1-L-metionylamid. 53,3 g (o,127 moi) Na-tera.butyioxixarbonyi-N“-mèty1-L-met1o- nin (framställt genom surgörning av d(+)a-metylbensylaminsaltet från avsnittet A och extraktion i eter) löstes i 160 ml DM. Lösningen kyldes till -1500, och 18,3 ml (O,I4 mol) isobntylklorformiat samt 0 15,4 ml (O,l4 mol) N-metylmorfolin tillsattes. Blandningen omrördes ?710755~5 . 35 under tio min vid -1500, och vattenfri ammoniak bubblades genom bland- ningen via ett gasfördelningsrör under en timme. Reaktíonsblandningen omrördes under fyra timmar vid -l5qC och hälldes sedan i 500 ml kall N natriumbikarbonatlösning. Den vattenhaltiga suspensionen extrahera- des med eter. Eterextraktet tvättades-med vatten, kall 0,75 N citron- syra samt vatten, torkades över MgSO4 och indunstades i vakuum till en sirap. Sirapen omkristalliserades ur eter-petroleumeter, varvid cr- hölls lo g (48%) av den 1 rubriken angivna föreningen med en :mältpunkt av 75-77°t. ¿ë7§> = -117.i° <0 = 0}5, øuc13).. _ Analys, beräknat för CllH22N2SO3 _(262,57): c 5o,56. H 8,n5 N 1o,68% Funnet= c 50,65 H 8,57 N 1o,45% c. Naftert.tutyitxixarbtnyi-L-fenyiaianyl-N”-mttyi-L-metitnyi- amid. l 7 En blandning av_7O ml isättika, 5 ml anisol, 7.ml trietylsilan och 15,5 g (0,05 mol) av produkten från avsnittet B framställdes.

Vattenfritt klorväte bubblades in'i den så erhållna blandningen under -25 min. Blandningen hälldes sedan i eter, och erhållen fällning till- varatogs och-torkades (9,9 g). Hydrokloriden löstes i 900 ml DM.

Blananingen-kyiaes till o°c och 9,9 mi (o,o5 moi) aitykitnexyiamin tillsattes. efter omrörning 1 tio min tillsattes 6,8 g (o,o5 moi) HBT, 15,3 g (0,0§ mol) Nu-tert,butyloxikarbonyl-L-fenylalanin och 10,3 g (0,05 mol) DCC. Den så erhållna blandningen omrördes under två timmar vid 000, och därpå under 48 timmar vid rumstemperatur.

Blandningen kyldes till OOC och filtrerades. Det sà.erhàllna filtra- tet koncentrerades sedan i vakuum till en olja.. Oljan löstes på nytt i etylacetat, lösningen tvättades successivt med N natriumbikarbonat, vatten, 0,75 N citronsyra samt vatten. Etylacetatlösningen torkades sedan över magnesiumsulfat och indunstades i vakuum, varvid erhölls en rest, som kristalliserades ur eter.. Man erhöll 16,4 g (805) av den i rubriken angivna föreningen med en smältpunkt av llä-11500. ¿§7š° = -45,4° (c = 0,5, neon). - . Analys, beräknat för càonjlnjons (4o9,55)= C 58,65 H 7,63 N lO,26% Funnet= c 58,76 H 7,42 N 1o,5o% D. Na~tert.butyloxikarbonyl-L-tyrosyl-D-alanyl-glycyl-L- fenylalanyl~Na-metyl-L-metionylamid.

Till en blandning av 20 ml isättika, 2 ml anisol och 2 ml tri- 'etylsilan sattes 3,5 g (8,56 mmol) av produkten från avsnittet C.

Torrt klorväte bubblades genom blandningen under 25 min. Etcr sattes till blandningen. och hydrokloriden utföll och filtreradessamt torka. ~».- 7- .. . _ -.-.___._.-__.__..._. 7710755~5 36 des i vakuum. En lösning av 5.0 g (8,47 mmol) Na-tert.butyloxikarbo- nyl-fi-tyrosyl-D-alanyl~glÜcindioyklohexylaminsalt i 40 ml DMF kyldes till 003; och ovannämnda hydrokloridsalt tillsattes. Efter omrörning vid OOC under några minuter tillsattes l,l g (8,4T mmol) HBT och l,7 5 (o,47 mmol} DCC; Blandningen omrördes sedan under 24 .'nmar vid ÄOC. Bet så erhållna olösliga materialet avlägsnades ¿enom filtrering, och filtratet indunstades à vakuum. Srhållen rest löstes på nytt i etylueetat, och etylacetatet tvättades successivt med H natriumbikar- bonatlösning i vatten, vatten, kall 0,75 N citronsyra samt vatten.

Lüsnin¿en torkades sedan över magnesiumsulfat och indunstades i va- kuum. Resten kromatograferades på kiseldioxidgel Grace and Davidson G-62¿ varvid erhålls 4,1 (69$)'av den i rubriken angivna föreningen. /§7š9 =-15,10 (c = 0,5, meon). ànalys, beräknat för C3¿H¿8N6Oüs (7G0,ö6): C 53,27 H 6,90 N ll,99% Funnet: C 55.05 H 5,62 N ll,Y§$' Aminosyrannalys, funnet: Tyr_l,ÖO; Ala 1,01; Gly O,9?; Phe 1,oo; nnj 1,oL. _ Q. L-tyrosyl-D-alanyl-glycyl-Lefenylalanyl-Nu-metyl-L-metio- nylamidacetat. ' ' - ' Till lä ml tioanisol sattes 8,5 g (0,0l2 mol) av produkten som hi avsnittet D. Blandningen kyldes till OOÜ Och 5Ü ml Käll TFA till- sattes. Blandnin¿en omrördes vid OOC under 30 min och ystades sedan med flera volymer eter. Erhållen fällning tillvaratogs och torkades, varvid erhälls 8 ¿ orent trifluoracetatsalt. Saltet löstes i en till~ räcklig volym av en vattenhaltig buffert innehållande lá pyridin och 0,005ß ättiksyra så att totalt 60 ml erhölls. Lösningen påfördes en pelare 5 x ljß cm av DEAE-Sephadex A-25 (acetatform), som tidigare bringats i jämvikt med samma buffert. UV-absorptionen vid 280 nm följdes; och den produkt som eluerades mellan l27O ml och l95O ml tillvaratogs. Bufferten lyofiliserades. Resten löstes i ca 200 ml N ättiksyra, och lösningen lyofiliserades. 3n.slutlig lyofilisering ur vatten-acetonitril (jzl) gav 6,64 g_(ö5ß) av den i rubriken angivna föreningen, ¿§7š3 = +21,?° (C = 1, N Hcl). ' ' ' i Analys, beräknat för C3lH¿4N60öS (660,?9): - C 56,35 H 6,71 N 12,72 0 l9,37% Funnesz C 56,50 H 6,46 N 12,62 o i9,25% Aminosyraanalys, funnet: Tyr l,OO; Ala 1,01; Gly l,OO; Phe 0,99; NH3 l,O5.

Föreningarna med formeln I är värdefulla analgetika. Den anal- getiska aktiviteten hos föreningarna med formeln I demonstreras genom i o f QUALITY '7710755--5 37 provet med möss på varm platta. Vid detta prov placeras en mus pá in- sidan av en upprättstâende cylinder av akrylplast innefattande vid sin botten. en varm platta, som hàlles vid 52°C. Vid provet ges musen genom subkutan injektion en förutbestämd mängd av provföreningen löst eller suspenderad i en lämplig bärare. En bestämd tidsrymd efter till- förseln av provföreningen får förflyta, varefter musen placeras på den varma plattan. Tiden i sekunder tills vart och ett av två skilda fe- nomen uppträder antecknas. För det första mätes tiden tills musen börjar slicka sin baktass, och för det andra mätes tiden tills musen hoppar från den varma plattan. Ett medel som uppvisar analgetisk aktivitet framkallar en ökning i dessa tidsrymder i förhållande till de tider som erhålles med kontrollmöss, som endast erhåller injektio- ner av bäraren. Detta måste ske inom ett dosïntorvall, som Loke fram- kallar någon motorisk inkoordination eller inkapacitet. I efterföl- jande tabeller anges resultaten erhållna från_detta prov och från ett jämförande kontrollprov under användning av naturligt enkefalin och naturligt enkefalín omvandlat till dess amid. Tabell 1 ger tiden in- till baktassen slickas, tabell II ger tiden till flykthopp och tabell III ger ett mått på prooenttalet djur i varje grupp, som uppvisade analgetisk verkan; 'Kriteriet på en bekräftad analgetisk verkan är följande: tiden tills baktassen slickas ellerflykthopp hos ett behand- lat djur måste vara lika med eller större än den genomsnittliga kont- rolltiden plus två standarddeviationer från medeltalet. Varje resul- tat som anges i efterföljande tabell I och II utgör medeltalet plus eller minus standardfel och tabell II anger det procenttal som erhölls _ vid minst nio möss upp till så mycket som 40 möss. ___....__..._,......... _ ,... _ , , __... __ _ ___-___..- ...._...- 7710755-5 38 1 1 H Hm.~Hm.m« @.HHm.wm 1 m.H+@.~m om 1 1 1m.mH~.ß Hß.Hu@.@« _H~.~H@.mm m.flnm om w.@nm.mm mfl 1 1 Hß.@Hm.wm Hm.@Hm.m« H~.mH~.m« 1 fl.HH~.mm m 4 «ß.~uH.mm ~.~H@.m~ ~.~nm.«m æWflHo.mm 1 1 w.@Hm.m~ ma 1 1 1 wflsmaflfl Am.N+fl.mv m.N+w.mm 1 1 1 1 H.H+A.mm m 1Mwwxnm1numZ wdwfom 1 1 1 1 1 máfimám 3 1 1. Qnfifl 1 Náiflmm 1 1 1 1 mïmiáw m .àmmxumïnuwrq Qom OCH om OH m H flflnnucom nwwïwe Thom flws owuflnmnmm _ ~øflH . 1 wmpH>fl»xm xmflpwuflmafl .H Hfiwßßæ mMNUHíwm Qwwwßwvwmfi, WHHMU .hmflflfi-Xmw H 7710755-5 39 1 iiïwám HÜNHÉà 1 NAHNKN _ S 1 1 1 1 1 wfwuéfï wdwoám 2 o 1 .1 1 ïfiimwåáä 1 1 máwlfimm Û 1 1 1 1 fimáuïfl 1 .máwmám 3 m 1 1 ïmnïom 1 1 1 Wáwmám om 1 1 fláurnïï máfiwám máumám .WTIBÃE wánmán Û 1 1 mdnfmm 1 1 1 Háuïmm m. 11. 1 1 wáwåfom 1 1 1 wáumám 3. 1 1 Nmïwwïßm wáwïmm. ïñwflmám. flánmém mónmám 3, 1 1 ÜNHWÉM 1 1 1 Háwïmm m o 1 1 HÜNHY? flmáwlïwm øáuwám Émflïmfl æ¿1+.m..mm mfl u SN E: om 3 m H .Éoppnom mMx\wE14wOQ _ GHE. ,ouCwCwhmh .Jäs mflxofifiw Gwmmdvxdß mfiflflu hwflüflxwm fi Ufiä. uwufl>fluxd xwflum HflG< H HAGQMB 1v1n7ss~s l |\. .1 '.{ QQOflUKLwdm. H v wu.

.HQUGÜ-sflmm ..| .Om .H vG@w>w¿AM xuw+whH id HH flamndß -_ | mñmë m3 mimwßïmm l Ošuïmm om - 1 mifflpfïw Hoénwëfl flménmàmfi iïmnïå .fwflïmß 2 1 | ïmwnwlåfi kámfifimï, HmJMnT 3 | ßïquwgï, m m . _. .Éfinm m3 fïfistmáoq. fmfifiáw wßiåéß | I ïwnoáß .lå .. l I . _ ufifimufl Hïïm å. 4w.o.ïm.mm | | 1 1 ßtïwáß m LfiwÉmJhÜfl...

.Nïmuw Hm l | | | f .ïqšwwáw .3 I I _ Qüflfl 1 ÜTÜÉ I f | 1 992.12 m àhmflflcmäfifi.. 03 03 O ¶ 3 m H .Søsäfóum .mmx\w& .mon Qflfi owafl_nmhmm då 7710755-5 41 Hß.~N+m.mmH «.o~H~.

H wmfi 1 ~1@Hm@mm mfi 1 1 1 1 1 wHm.~H+m.omH m.wHm.- ma o 1 1 1 fiw.~fiHw.m- 1 1 @.@Hm.>m md 1 1 1 1 -.H~H«.~mH 1 m.@Hw.m> ma m 1 1 ~m.wHN.m@ 1 1 1 o.>H«d~m Om. 1 1 ~ß.mHHH.wmH ~@.@n@.@HH fi«.~HHH.mo~ H.~HHm.m> «.~Ho.~> mfl. 1 1 N~.«HH>.>m 1 1 1 ß.«Hw.o> ím m 1 w ~«.wHw.@> 1 1 _ 1 o.>H«.~m om 1 1 Hm.m~H@.mHd Hm.-Ho.>ofl HW.mMm.~oH æ.@H>.wæ «.NHo.mw mä 1 1 m.«fiH~.ow 1 . 1 1 >.@Hw.o> m 1 Q 1 1 HH.wfiHm.~@H AH.mHH~.HNfl Hfl.»H>.mHH o.o~H~.mm «.~H°.m> mfl , u Qom OCH OM1 @~_ M H Hflofipnom w mmvïws* .won o Qflcmhmß Qmofluxhaw aafl» hmñdßxmm w UHB nwuH>wu&N xmfiuw adfld ^.m»»owv HH fiawnma .....-__._.._.........._....._.... _... _., _ __,____ _._._...._... Éë maøßflu 1 11 .1 ßw ..1m om .um GH 0A l | om I 1. .1 oofl mm mm o.r mm mm MN m, m4. 1 1 1 1 ä., 3 3 om om. o., 1 1 m m mm Hm wm mfl WH mm o wa 1 1 1 1 md 2 v25 4 nå mm ä. 2 1 1 1 1 _ 1 . 1 1. .. .m _ Lfiflmwmxnmfluwr.

NN AH | I l | | I I I 1 1 ofi 1 1 c Q 1 1 1 1 1 1 1 1 m nuflflmmmnmflüflwumflà 191% .mn ma. mmm :m lmvm mmm mam- oc.. 004 om A _ m fl W f . .mwuïufi .mon _ ondflcmnâ.. ß WW mfloømmh xmfluwuammm mflflmmflbmnß nnmoono M nflqm .1/1 33 Så xfivmfiäå 7.. .

HHH Hfimndfi 7710755-5 43 OHH Om 1 1 1 1 1 oß HH mom OH HH. 1 1 1 1 1 QGH .OH 1 GN om _1. 1 mH 1 1 1 Q HH 1 1 1 1 1 1 om 1 1 1 wß HH wm Hm _ 1 Hm w HH1 HH 1 HH 1 1 1 mm NN 1 1 1 1 1 1 m 1 1 1 O HH 1 1 1 1 1 1 Hon 1 1 1 HH m~ NN NN m~. Hm O HH .mH 1 1 1, NN HH 1 1 1 1 1 1 m 11 1 1 mm mm mm WN om O HH HH mH mm. nam, mm nam. mm. mam mm. mam mm. mam1. mm 11uHmm oo . COH om OH H H d.mwx\wE .mom .cflë mcflümhwm . _ .UHH 0 mflomwmn xwwummflßcm wøummH>ømn pcmoomm H mflwa _ r llllllllllllllfifllill wvfi>4uÅm &w4> 4 Q n. Jul rflfid. .mppowv HHH HHmnmH _.. ._ ____....-___.__

Claims (3)

1. 7710755-5 44 a. Såvida.icke annat anges utföres proven under användning av kontroll av salthaltena Siffrorna "l" och “2" som användes såsom övre 'index, indikerar att resultatet är signifikant till en sannolikhet P<Û,Gl respektive till P<0,0§. b. :Prov- och kontrollförsök i akacia med föreningen närvarande såsom suspension. c. Beteckningarna avser följande föreningar: A. L-tyrosyl-D-alanyl-glycyl-L-fenylalanyl-N*-metyl-L-metionyl- amidhydroklorid. (Exempel l.) Ci L-tyrosylfD-alanyl-L-alanyl-L-fenylalanyl-N¿-metyl-L-me- tionylamid.-1,25-hydrokloridmonoacetat. (Exempel 5.) >D. L-tyrosyl-D-leucyl-glycyl-L-fenylalanyl-N¿ïmetyl-L-metionyl- amidseskvihydrokloridmonoacetat. (Exempel 2.) E._ L-tyrosyl-D-alanyl-glycy1-N*-metyl-L-fenylalanyl-NL-metyl- -L-metionylamidhydrokloridtrihydrat. (Exempel Ä.) F. L-tyrosyl-D-alanyl-glycyl-L-fenylalanyl-N¿>metyl-L-leucyl- amidacetat. (Exempel 7.) . _ 'G. -L-tyrosyl-D-alanyl-glycyl-L-fenylalanyl-L-N*-metyl-S-ety1- cysteinylamídacetat. (Exempel 6.) U _ d. BTS = baktasslickning. FH = fiyktnopp. E e. Vid prov med en dos av 0,3 mg/kg blev tiden intill slickning av baktassen 55,9 É 2,3 sekunder, tiden till flykthopp 129,0 I ll,5 sekunder och den analgetiska responsen var 10% för BTS och 60% för FH. Patentkrav l. Förfarande för framställning av en förening med den allmänna formeln ' ' (L) 0 ~(D)_ 0 (L) 0 R6 (L) R (L) (I) || u 1: | Q 17 p NH? - FH - C - NH - CH.~ C f NH - CH - C - N - CH - C - N - CH - Z CH2 R R E en än H _ 5 - - ° l s i :i :J KÄ EE! - ön E - Z I och farmaceutiskt accepterbara,ogiftiga syraadditionssalter därav, i vilken formel ' i L och D i förekommande fall definierar chiraliteten; Ru är Cl-Cu primär eller sekundär alkyl; POÛR positions QUALITY p 7710755-5 45 R5 är väte eller C1~Cu primär eller sekundär alkyl; R6 är väte eller Cl-G3 primär alkyl; R är C1-G5 primär alkyl; 7 0 . Z är -3-NHR8, där R8 är väte eller C]-05 alkyl; ~och W är ísopropyl, -CH2-S-CH3 eller -S¥R9, där R9 är Cl-Cu alkyl; k ä n n e t e c K n a t a v att man avspjälkar blockerande grupper från en motsvarande skyddad förening I,företrädesvíe med an- vändning av ett i huvudsak torrt surt avspjälkninqsmedel, och even- tnellt (3v<.rt'!'¿'>-r I“¿'>1'ur.1in_»-'_<.-1| Liflfl, ett far-xnucxrutízskt zmuteptc:vbzlvi., git?- tigt syraadditionssaltf
2. 2. Förfarande enligt krav 1, k ä n n e t e c k n a t' a V att den skyddade föreningen här formeln 0 0 O dö 0 l§( (TI) NH - CH - E - NH - CH - 8 - NH - CH -“Ö - - CH - 8 - N - CH - Z' Il å ' à B10 CH2 Vu CH2 CH le 5 VI, .\ V _ Iz' k; - i vilken B10 är bensyloxikarbonyl, tert.butyl0xikarbonyl, tert. amyloxí- karbonyl, p-metoxíhensyhxdkaflxmylj adamantyloxíkarbonyl eller isobor- nyloxikarbonyl, Z' är Z eller polymerblockerat Z, och.alla andra symbo- ler har den í krav-1 angivna betydelsen.
3. 3. ' Förfarande enligt krav 1 eller 2, k äln n e t e c k n a t a v att R 7 år metyl.