CH636847A5 - Verfahren zur herstellung von neuen verbindungen, die eine peptidstruktur besitzen. - Google Patents

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung neuer Verbindungen, welche eine Peptidstruktur besitzen. Diese neuen Verbindungen weisen eine schmerzstillende Wirkung auf.

Aus dem Gehirn oder cerebraler Rückenmarksflüssigkeit von Säugetieren sind bereits endogene Substanzen mit morphinartigen Eigenschaften extrahiert worden. Diese als Enkephaline bezeichneten Substanzen sind von Hughes et al., Nature, Bd. 258, S. 577 (1975) als Pentapeptide mit dem folgenden Aufbau

H-Tyr-Gly-Gly-Phe-Met-OH

H-Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-OH

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identifiziert worden. Diese Verbindungen werden als Me-thionin-enkephalin, bzw. Leucin-enkephalin bezeichnet.

Es wurde zwar nachgewiesen, dass diese Verbindungen bei Mäusen nach intracerebroventrikularer Verabreichung anal-2s getische Wirksamkeit zeigen [Buscher et al., Nature, BD. 261, S. 423 (1976)], doch ermangeln sie einer nutzbaren analgetischen Wirksamkeit, wenn sie parenteral verabreicht werden.

Ziel der vorliegenden Erfindung war es ein Verfahren zur Herstellung neuer Verbindungen zu enwickeln, welche eine 30 analgetische Wirksamkeit besitzen.

Die erfindungsgemäss herstellbaren Verbindungen weisen folgende Formel auf

(L) (D) (L) (L) (L) OR 0 OR OR

II la II I! I6 II I7

rCH-C-N—CH-C-NK-CH-C-N—CH-C-.N—CH—C-NKR,

OR 0 OR OR

II la II I! I6 IM7 ?

- v ru r.v.-ï

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I I I I 1

CH R R CH CH (I)

6 , E ,6

11

/S /S

l J l J

V V

w

OY

worin

L und D die Chiralität, wo eine solche möglich ist, bezeichnen, und

R: ein Wasserstoffatom, eine Methyl-, Äthyl-, n-Propyl- oder Allylgruppe bedeutet,

Rs ein Wasserstoffatom oder eine Alkylgruppe mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen bedeutet,

Rj ein Wasserstoffatom, eine Methyl-, Äthyl- oder n-Propyl-gruppe ist,

R i eine Alkylgruppe mit 1 - 4 Kohlenstoffatomen, jedoch unter Ausschluss der tert.-Butylgruppe, ist,

Rs ein Wasserstoffatom oder eine Alkylgruppe mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen ist, jedoch unter Ausschluss der tert.-Butylgruppe,

ss Rs ein Wasserstoffatom, eine Methyl-, Äthyl- oder n-Propyl-gruppe bedeutet,

R7 eine Methyl-, Äthyl- oder n-Propylgruppe ist,

Y ein Wasserstoffatom oder eine Acetylgruppe bedeutet,

W eine Isopropylgruppe oder eine Gruppe der Formel -VR9 60 oder -CH2-X-CH3 ist, in welcher

V ein Sauerstoffatom oder ein Schwefelatom darstellt,

R9 eine Alkylgruppe mit 1 - 4 Kohlenstoffatomen oder eine Aralkylgruppe bedeutet,

X ein Sauerstoffatom, ein Schwefelatom oder die Gruppie-6s rung der Formel -CH2- darstellt,

unter der Voraussetzung, dass dann wenn W für eine Gruppierung der Formel -VR9 steht, in welcher V ein Schwefelatom ist und R9 den Methylrest bedeutet, dann der Rest Rs die

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Bedeutung einer Alkylgruppe mit 1-3 Kohlenstoffatomen aufweisen muss.

Die neuen Verbindungen der Formel I können auch als Säureadditionssalze vorliegen.

Das erfindungsgemässe Verfahren zur Herstellung der neuen Verbindungen der Formel I ist dadurch gekennzeichnet, dass man die Aminoschutzgruppen in Verbindung der Formel

<L) 0 R (OI0

R , ■ II lÄ II

{L)0 R (L)0 R (L)0

h r H IM H i '^-CH-O-N-CH-C-NH-CH-C-N-CH-C-N-CH-.C-NHR,

1 o

CH i 2

/V

V

l

OY

I

CH I 2

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I

CH l S W

(II)

worin Rio Benzyloxycarbonyl, tert.-Butyloxycarbonyl, tert.-Amyloxycarbonyl, p-Methoxybenzyloxycarbonyl, Adaman-tyloxy-carbonyl oder Isobornyloxycarbonyl bedeutet in einem praktisch trockenen Säuremedium abspaltet und erhaltene Verbindungen gegebenenfalls in die entsprechenden Salze überführt.

Aus der deutschen Offenlegungsschrift 2,703,121, für die eine Priorität vom 8. April 1976 beansprucht wird, sind Verbindungen bekannt geworden, die der obigen allgemeinen Formel I entsprechen, wobei in diesen Verbindungen sämtliche Reste Ri, R2, R3, Rs, Rs, R7 und Y Wasserstoffatome sind, R4 für einen Methylrest steht, Z eine Gruppierung der Formel

O

-C-NH2

ist, und W eine Gruppierung der Formel -VR9 bedeutet, in welcher V ein Schwefelatom ist und R9 den Methylrest bedeutet.

Diese in der deutschen Offenlegungsschrift beschriebenen Verbindungen wurden durch die Definition der Substitu-enten aus dem Schutzbereich der beim erfindungsgemässen Verfahren herzustellenden Verbindungen der Formel I ausgeschlossen.

Bevorzugte nach dem erfindungsgemässen Verfahren hergestellte Verbindungen der Formel I sind diejenigen, in denen W die Gruppe -CH2-X-CH3 bedeutet, insbesondere solche mit einer derartigen Gruppe, worin X Schwefel bedeutet.

Zu den pharmazeutisch annehmbaren nichttoxischen Säureadditionssalzen der Verbindungen der Formel I gehören sowohl organische als auch anorganische Säureadditionssalze, zum Beispiel die mit Salzsäure, Schwefelsäure, Sulfon-säure, Weinsäure, Fumarsäure, Bromwasserstoffsäure, Gly-kolsäure, Citronensäure, Maleinsäure, Phosphorsäure, Bernsteinsäure, Essigsäure, Salpetersäure, Benzoesäure, Ascor-binsäure, p-Toluolsulfonsäure, Benzolsulfonsäure, Naphtha-linsulfonsäure oder Propionsäure hergestellten. Die bevorzugten Säureadditionssalze sind die mit Salzsäure, Essigsäure oder Bernsteinsäure hergestellten. Alle diese Salze können nach üblichen bekannten Methoden hergestellt werden.

Wie sich aus der Definition der verschiedenen in Formel I

25 angegebenen Substituenten ergibt, handelt es sich bei den Verbindungen der Formel I um unsubstituierte oder N-sub-stituierte Amide von Pentapeptiden. Die Stereokonfiguration der Verbindungen der Formel I ist ein wesentliches Merkmal dieser Verbindungen. Aus Zweckmässigkeitsgründen werden 30 die Aminosäurereste der Pentapeptide der Formel I, beginnend mit dem Rest mit der die Kette abschliessenden Amino-funktion numeriert. Die Chiralität (Händigkeit) der Aminosäurereste in der Reihenfolge von Stellung 1 bis Stellung 5 ist demnach L, D, L, Lund L. Ferner sei daraufhingewiesen, 35 dass der Rest in Stellung 3 u. a. ein Glycinrest sein kann. In solchen Fällen ist hinsichtlich dieses Restes Chiralität natürlich nicht möglich. Wenn jedoch in Stellung 3 ein chiraler Aminosäurerest steht, dann muss die Chiralität dieses Restes L sein.

40 Wenn die Gruppe Rs eine Alkylgruppe mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen bedeutet, dann handelt es sich dabei um die Methyl-, Ethyl-, n-Propyl- oder Isopropylgruppe.

Die primären Alkylgruppen mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen, die zu den Bedeutungen von R2, R3, Ró und R7

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gehören, sind Methyl-, Ethyl- und n-Propylgruppen.

Die primären oder sekundären Alkylgruppen mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, die die Gruppen R4 und Rs bedeuten können, sind Methyl, Ethyl, n-Propyl, Isopropyl, n-Butyl, Isobutyl und sek.-Butyl.

Die Alkylgruppen mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, die R9 bedeuten kann, sind Methyl, Ethyl, n-Propyl, Isopropyl, n-Butyl, Isobutyl, sec.-Butyl oder tert.-Butyl, vorzugsweise die Ethylgruppe. Die Aralkylgruppe, die R9 bedeuten kann, ist eine unsubstituierte oder substituierte Aralkylgruppe, vorzugsweise mit etwa 7 bis 10 Kohlenstoffatomen. Besonders bevorzugte Aralkylgruppen sind die Benzylgruppe oder substituierte Benzylgruppen. Zu in Betracht kommenden Substituenten gehören u. a. Halogen, wie Fluor, Chlor oder Brom, Ci-C3-Alkoxy, wie Methoxy, Ethoxy oder Propoxy, Trifluor-methyl, Ci-C3-Alkyl und Ci-C3-Alkylthio, wie Methylthio oder Ethylthio. Ein etwa vorhandener Substituent steht vorzugsweise in der para-Stellung. Ein in hohem Masse bevorzugter Substituent ist Methoxy, und eine in hohem Masse bevorzugte Aralkylgruppe ist die p-Methoxybenzylgruppe.

Hinsichtlich der Reste in den einzelnen Stellungen des Pen-tapeptids der Formel I ist folgendes auszuführen:

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(A) Stellung 1

Diese Stellung stellt das Aminoendteil des Peptids dar. Der Rest ist der sich aus L-Tyrosin oder L-(0-acetyl)-tyrosin ergebende. In beiden Fällen kann der Rest am Stickstoff unsubstituiert sein, d. h. R2 ist Wasserstoff. Er kann durch eine Allylgruppe substituiert sein, so dass dann R2 eine Allyl-gruppe bedeutet. Vorzugsweise ist der in Stellung 1 des Peptids der Formel I befindliche Tyrosyl- oder O-Acetyltyrosyl-Rest am Stickstoff nicht substituiert. Ferner ist bevorzugt, dass der Rest der Tyrosylrest ist.

(B) Stellung 2

Der in der zweiten Stellung des Peptids der Formel I befindliche Aminosäurerest muss das D-Stereoisomere eines Aminosäurerests sein. In Betracht kommen hierbei die Reste von D-Alanin (Ala) (R4 = Methyl), D-alpha-Aminobutter-säure (Abu) (R4 = Ethyl), D-Norvalin (Nva) (R4 = n-Propyl), D-Valin (Val) (R4 = Isopropyl), D-Norleucin (Nie) (R4 = n-Butyl), D-Leucin (Leu) (R.4 = Isobutyl) und D-Isoleucin (Ile) (R4 = sek.-Butyl). Vorzugsweise ist der Rest der von D-Alanin. Bei allen diesen Aminosäureresten bedeutet die Gruppe R3 an dem Stickstoffatom, das der Aminogruppe der ursprünglichen Aminosäure entspricht, entweder ein Wasserstoffatom oder einen primären Alkylrest mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen. Im letztgenannten Fall ist der Aminosäurerest N-substituiert. Solche N-Substituenten sind N-Methyl, N-Ethyl und N-n-Propyl. Vorzugsweise ist die Aminosäure in Stellung 2 N-unsubstituiert, d. h. R3 bedeutet ein Wasserstoffatom.

(C) Stellung 3

Der in dieser Stellung vorliegende Aminosäurerest ist der des Glycins (Gly) oder einiger anderer Aminosäuren, wie L-Alanin, L-(alpha-Amino)-buttersäure, L-Norvalin, L-Valin, L-Norleucin, L-Leucin und L-Isoleucin. Vorzugsweise leitet sich der Rest in dieser Stellung des Peptids von Glycin ab.

(D) Stellung 4

Der Aminosäurerest in dieser Stellung ist der des L-Phenyl-alanins (Phe). Er kann am Aminostickstoffatom unsubstituiert oder substituiert (Re) sein. Wenn der Rest N-substituiert ist, handelt es sich um N-Methyl, N-Ethyl oder N-n-Propyl. Vorzugsweise ist der Rest am Stickstoff unsubstituiert (Rt> = Wasserstoff).

(E) Stellung 5

Der Aminosäurerest in Stellung 5 des Pentapeptids ist der Rest eines Amids von L-Methionin (Met) (W = CH2SCH3), L-Norleucin (Nie) (W = -CH2CH2CH3), L-(O-Methyl)-homoserin [Hse (Me)] (W = -CH2OCH3), L-Leucin (Leu) [W = -CH(CH3)2], L-(0-Alkyl- oder -Aralkyl)-serin [Ser(AIk) oder Ser(Aralk)] (W = OR9), oder L-(S-Alkyl- oder -Aralkyl)-cystein [Cys(Alk) oder Cys(Aralk)] (W = SR9). Vorzugsweise ist der Aminosäurerest in Stellung 5 der Rest des Amids von L-Methionin oder L-Leucin. In den Fällen, in denen der Rest in Stellung 5 O-substituiertes Serin oder S-substituiertes Cystein ist, ist der bevorzugte Alkylsubstituent die Ethyl-gruppe und der bevorzugte Aralkylsubstituent die p-Meth-oxybenzylgruppe.

Wenn es sich bei dem Rest dieser endständigen Aminosäure um einen anderen als den des L-Leucins handelt, kann er an seinem Aminostickstoff unsubstituiert oder substituiert sein. Als Substituenten kommen primäre Alkylgruppen mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen in Betracht, nämlich N-Methyl, N-Ethyl und N-n-Propyl. Vorzugsweise ist der Aminostickstoff substituiert, d. h. R7 ist eine primäre Alkylgruppe mit 1

bis 3 Kohlenstoffatomen und insbesondere eine Methylgruppe.

Da die Aminosäure in Stellung 5 des Pentapeptids die das Carboxylende liefernde Aminosäure darstellt, liegt sie ausserdem als Amid vor. Vorzugsweise ist das Amid N-unsubsti-tuiert, d. h. Rs bedeutet Wasserstoff. Die Amidgruppe kann jedoch auch N-monosubstituiert sein, wobei der Substituent eine Alkylgruppe mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen ist, zum Beispiel N-Methyl, N-Ethyl, N-n-Propyl oder N-Isopropyl.

Die Verbindungen der Formel II können durch für Peptid-synthesen übliche Verfahren hergestellt werden. Während der Synthese einiger der Verbindungen der Formel II kann eine teilweise Racemisierung erfolgen. Das Ausmass einer solchen Racemisierung, wenn sie überhaupt eintritt, ist jedoch so gering, dass die analgetische Wirksamkeit der Verbindungen der Formel I nicht wesentlich beeinträchtigt wird.

Die Verfahren zur Herstellung der Verbindungen der Formel II beruhen gewöhnlich auf dem Verknüpfen von Aminosäuren oder Peptidfragmenten durch Umsetzung der Carboxylfunktion der einen mit der Aminofunktion einer anderen Säure unter Bildung einer Amidbindung. Zur wirksamen Erzielung der Verknüpfung ist es zweckmässig, dass erstens alle reaktionsfähigen Gruppen, die nicht direkt an der Reaktion teilnehmen, durch die Verwendung entsprechender blockierender Gruppen inaktiviert werden und dass zweitens die Carboxylfunktion, an der die Verknüpfung stattfinden soll, so aktiviert ist, dass die Verknüpfung erfolgen kann. Hierfür ist eine sorgfältige Wahl der Reaktionsfolge und der Reaktionsbedingungen sowie die Verwendung bestimmter Blockierungsgruppen erforderlich, damit das gewünschte Peptidprodukt auch tatsächlich erhalten wird. Jede der Aminosäuren, die bevorzugt für die Herstellung der Verbindungen der Formel II verwendet wird und die jeweils gewählten Schutzgruppen und/oder aktivierenden Funktionalitäten enthält, kann nach auf dem Peptidgebiet allgemein bekannten Arbeitsweisen hergestellt werden.

In jeder Stufe der Gesamtsynthese der Verbindungen der Formel II werden im allgemeinen ausgewählte Kombinationen von blockierenden Gruppen angewandt. Diese besonderen Kombinationen haben sich hinsichtlich ihrer Wirkungsweise als sehr günstig erwiesen. Andere Kombinationen haben bei der Synthese der Verbindungen der Formel II eine befriedigende Wirkung, aber unter Umständen sind sie etwas weniger erfolgreich. So werden folgende Gruppen als Aminoschutzgruppen bei der Synthese der Verbindungen der Formel II verwendet:

Benzyloxycarbonyl (CBz),

tert.-Butyloxycarbonyl (BOC),

tert.-Amyloxycarbonyl (AOC),

p-Methoxybenzyloxycarbonyl (MBOC), Adamantyloxycarbonyl (AdOC) und Isobornyloxycarbonyl.

Ausserdem wird im allgemeinen die Benzylgruppe (Bzl) als die Hydroxyschutzgruppe für den Tyrosylrest verwendet, obwohl auch andere Gruppen, zum Beispiel p-Nitrobenzyl (PNB) und p-Methoxybenzyl (PMB), eingesetzt werden können.

Die bei der Herstellung der Verbindungen der Formel II verwendeten Carboxylschutzgruppen können beliebige esterbildende Gruppen sein, zum Beispiel Methyl, Ethyl, Benzyl, p-Nitrobenzyl, p-Methoxybenzyl und 2,2,2-Trichlorethyl.

Das Verknüpfen der in geeigneter Weise geschützten N-blockierten Aminosäure oder des entsprechend geschützten Peptidfragments mit einer in geeigneter Weise geschützten carboxyblockierten Aminosäure oder einem entsprechend geschützten Peptidfragment bei der Herstellung

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der Verbindungen der Formel II besteht bevorzugt darin,

dass die freie Carboxylfunktion der Aminosäure oder des Peptidfragments für die Verknüpfungsreaktion aktiviert wird. Dies kann nach den verschiedenen allgemein bekannten Arbeitsweisen erfolgen. Bei einer derartigen Arbeitsweise wird z.B. die Carboxylfunktion in ein gemischtes Anhydrid übergeführt. Die freie Carboxylfunktion wird gewöhnlich durch Umsetzung mit einer anderen Säure, zum Beispiel einem Kohlensäurederivat, wie einem Säurechlorid, aktiviert. Beispiele für zur Herstellung gemischter Anhydride verwendete Säurechloride sind Ethylchlorformiat, Phenylchlorformiat, sek.-Butylchlor-formiat, Isobutylchlorformiat und Pivaloylchlorid. Vorzugsweise wird Isobutylchlorformiat verwendet.

Eine andere Art der bevorzugten Aktivierung der Carboxylfunktion für die Durchführung der Verknüpfungsreaktion ist die Überführung in ihre aktiven Esterderivate. Zu solchen aktiven Estern gehören u.a. der 2,4,5-Trichlorphenylester, Pentachlorphenylester und p-Nitrophenylester.

Eine weitere Methode für die Verknüpfung ist die allgemein bekannte Azidverknüpfungsmethode.

Bei der bevorzugten Verknüpfungsmethode zur Herstellung der Verbindungen der Formel II wird N,N'-Dicyclo-hexylcarbodiimid (DCC) zur Aktivierung der freien Carboxylfunktion für die Verknüpfung verwendet. Diese Arbeitsweise der Aktivierung und Verknüpfung kann unter Verwendung einer äquimolaren Menge DCC im Verhältnis zu der Aminosäure oder dem Peptidfragment und in Gegenwart einer äquimolaren Menge 1-Hydroxybenztriazol (HBT) durchgeführt werden. Durch die Gegenwart von HBT werden unerwünschte Nebenreaktionen und eine mögliche Racemisierung unterdrückt.

In bestimmten Stufen der bei der Herstellung der Verbindungen der Formel II angewandten Folge von Synthesestufen müssen die blockierenden Gruppen abgespalten werden. Für den Durchschnittsfachmann auf dem Peptidge-biet ist es ein leichtes, aus den möglichen Schutzgruppen diejenigen auszuwählen, die miteinander in dem Sinn verträglich sind, dass eine selektive Spaltung des Produkts erzielt werden kann, wobei eine oder mehrere aber nicht alle in der Aminosäure oder dem Peptidfragment vorliegenden Schutzgruppen entfernt werden können. Es handelt sich hierbei um auf dem Peptidgebiet allgemein bekannte Massnahmen. Eine ausführliche Erörterung dieser Massnahmen findet sich beispielsweise bei Schröder und Lübke, The Peptides, Bd. I, Academic Press, New York, (1965), insbesondere in der Tabelle auf den Seiten 72 bis 75.

Die Abspaltung von Carboxylschutzgruppen kann durch alkalische Verseifung erreicht werden. Im allgemeinen werden verhältnismässig stark alkalische Bedingungen, beispielsweise unter Verwendung eines Alkalihydroxids, wie Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid und Lithiumhydroxid, für die Esterspaltung der geschützten Carboxylgruppe angewandt. Die Reaktionsbedingungen, unter welchen Verseifung erfolgt, sind allgemein bekannt. Die Carboxylschutzgruppen können auch durch katalytische Hydrierung, beispielsweise durch Hydrogenolyse in Gegenwart von Palladium auf Kohle, entfernt werden. Wenn die Carboxylschutz-gruppe die p-Nitrobenzyl- oder 2,2,2-Trichlorethylgruppe ist, kann die Entfernung dieser Schutzgruppe auch durch Reduktion in Gegenwart von Zink und Salzsäure erfolgen.

Die Aminoschutzgruppen werden bevorzugt durch Behandlung der geschützten Aminosäure oder des geschützten Peptids mit einer Säure, zum Beispiel 98prozen-tiger Ameisensäure, Trifluoressigsäure (TFA), einer Arylsul-fonsäure, wie p-Toluolsulfonsäure (TSA), Benzolsulfonsäure (BSA), Naphthalinsulfonsäure, Trifluormethansulfonsäure (rein), flüssigem HF und Bortribromid, in Methylenchlorid abgespalten werden, wobei gewöhnlich das entsprechende Säureadditionssalz gebildet wird. Die Abspaltung der Ami-noschutzgruppe kann auch durch Behandlung der blok-kierten Aminosäure oder des Peptids mit einer Mischung aus HBr oder HCl und Eisessig erfolgen, wobei das entsprechende Hydrobromid oder Hydrochlorid gebildet wird. Alle diese Entblockierungsmittel stellen daher ein praktisch trok-kenes Säuremedium dar. Das jeweils angewandte Verfahren oder Reagens hängt von den chemischen oder physikalischen Eigenschaften der Stoffe ab, die an der bestimmten Entblok-kierungsreaktion beteiligt sind. In den Fällen, in denen die Gruppe R? eine andere Bedeutung als Wasserstoff hat und ein Peptid mit wenigstens drei Aminosäureresten zu entblok-kieren ist, hat es sich als ausserordentlich günstig erwiesen, das Peptid mit Trifluoressigsäure oder Ameisensäure unter Bildung des entsprechenden Säureadditionssalzes zu entblok-kieren. Das Salz kann durch Behandlung mit einem Ionenaustauscherharz, zum Beispiel DEAE Sephadex A25 und Amberlyst A27, in eine für pharmazeutische Zwecke besser geeignete Form übergeführt werden.

Die am Tyrosylrest befindliche Hydroxyschutzgruppe kann während der gesamten Herstellung des Peptids beibehalten werden und wird bevorzugt in der letzten Synthesestufe zusammen mit der Aminoschutzgruppe entfernt. Je nachdem zur Entfernung der Carboxylschutzgruppe angewandten Bedingungen kann sie jedoch in einer früheren Stufe des Herstellungsverfahrens entfernt werden. Wird z.B. die Carboxylschutzgruppe durch alkalische Verseifung abgespalten, bleibt die Hydroxyschutzgruppe erhalten; wird jedoch zur Entfernung der Carboxylschutzgruppe bevorzugt eine katalytische Hydrogenolyse angewandt, dann wird auch die Hydroxyschutzgruppe abgespalten. Dies bereitet jedoch keine ernsten Schwierigkeiten, da die Herstellung der Verbindungen der Formel II auch mit einem Tyrosylrest mit freier Hydroxylgruppe erfolgen kann.

Bei einem bevorzugten Verfahren zur Herstellung der Verbindungen der Formel II wird ein gesondert hergestelltes Tri-peptid mit N-Ende mit einem gesondert hergestellten Di-peptidamid mit C-Ende verknüpft, worauf die noch vorhandenen blockierten Gruppen gespalten werden. In der folgenden formelmässigen Darstellung dieses Verfahrens steht das Symbol AA für den Aminosäurerest und die in Verbindung damit angegebene Zahl für die Stellung der Aminosäure in dem fertigen Peptidprodukt.

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BOC-L-Tyr-OH + H-D-(AA)2-OBzl

I

OBzl

DCC HBT

BOC-L-Phe-OH + H-L-(AA)s-NH2

DCC HBT

BOC-L-Tyr-D-(AA)2-OBzl

I

OBzl

OH~

BOC-L-T yr-D-( A A)2-0 H

I

OBzl

H-L-(AA)3-OBzl DCC HBT

BOC-L-Tyr-D-(AA)2-L-(AA)3-OBzl

I

OBzl

H2

Pd/C

BOC-L-Tyr-D-(AA)2-L-(AA)3-OH

I 1

OH

BOC-L-Phe-L-(AA)5-NH2

HCl/HOAc

Cl-H2+-L-Phe-L-(AA)5-NH2

OH-

H-L- Phe- L-( A A)5- NH2

DCC HBT

BOC-L-Tyr-D-(AA)2-L-(AA)3-L-Phe-L-(AA)5-NH2

I

OH

1)TFA

Y 2) DEAE Sephadex A-25, Acetatform

AcOH • H-L-Tyr-D-(AA)2-L-(AA)3-L-Phe-L-(AA)5-NH2

I

OH

Ausser der oben dargestellten Folge von Stufen können für ständiger Carboxamidgruppe begonnen wird. Eine weitere die Herstellung der Verbindungen der Formel II auch andere anwendbare Methode ist eine Festphasenpeptidsynthese.

Stufenfolgen angewandt werden. Ein anderes bevorzugt 65 Dabei wird vorzugsweise der Rest mit dem C-Ende an einen anwendbares Verfahren besteht in der stufen weisen aufein- polymeren Träger gebunden und das Peptid mit jeweils anderfolgenden Anfügung der einzelnen Aminosäuren beim einem Rest verlängert, bis das gewünschte Peptid, das immer

Aufbau der Peptidkette, wobei mit der Aminosäure mit end- noch an das Polymere gebunden ist, erhalten wird. Dann

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kann das Peptid durch ein dafür geeignetes Spaltungsmittel von dem Polymeren abgelöst werden. Beispielsweise kann die am Nalpha-Stickstoff mittert.-Butyloxycarbonyl geschützte N-Methylaminosäure mit C-Ende durch Aktivierung mit Dicyclohexylcarbodiimid mit einem Benzhydrylaminpoly-meren verknüpft werden. Die N.-tert.-Butoxycarbonyl-gruppe wird bevorzugt durch Umsetzung des an das Polymere gebundenen Rests mit Trifluoressigsäure in Methylenchlorid entfernt. Neutralisation des Polymersalzes mit einer tertiären Base und Anfügen eines zweiten Rests kann auf die gleiche Weise erfolgen. Das blockierte Peptid wird von dem Polymeren z.B. durch Behandlung mit flüssigem HF

bei 0°C entfernt und durch Chromatographie gereinigt. Die genauen Bedingungen dieser Synthese sind dem Durchschnittsfachmann auf dem Gebiet der Festphasenpeptidsyn-these bekannt und geläufig.

5 In der Formel I kann eine oder können mehrere Gruppen R2, R3, Ró und R? primäre Alkylreste mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen sein. In solchen Fällen wird in der Regel die entsprechende N-substituierte Aminosäure in der präparativen Stufenfolge verwendet. Die N-monosubstituierten Aminosäuren

10 können, wie im folgenden dargestellt, unter Verwendung einer N-geschützten Aminosäure als Ausgangsmaterial hergestellt werden:

H

I

BOC-N-(AA)-COOH

K

KH I

BOC-N--(AA)-COO-K+

ig-Kron-6-ether THF DMF

Allyl- oder Ci-C3-primäres Alkyliodid (RJ)

Ra

I

BOC-N-(AA)-COOH

Wie vorstehend angegeben, wird die Aminosäure gewöhnlich zuerst mit Kaliumhydrid in Gegenwart eines dafür geeig- 30 neten Ethers zur Ausbildung des Dianions behandelt, das dann mit dem entsprechenden Alkyl- oder Allyliodid in die gewünschte N-substituierte Aminosäure übergeführt wird.

Wie für den Durchschnittsfachmann auf dem Gebiet der Peptidchemie ohne weiteres ersichtlich, kann unter stark 35 alkalischen Bedingungen, wie sie bei der obigen Alkylierung angewandt werden, Racemisierung am alpha-Kohlenstoff-atom erfolgen. Das Ausmass der Racemisierung kann in Abhängigkeit von der jeweils betroffenen Aminosäure schwanken. Die Racemisierung kann durch Verwendung von 40 überschüssigem Alkylierungsmittel und dadurch, dass die Reaktionszeit so kurz wie möglich gehalten wird, auf ein Minimum gesenkt werden. Wenn aber tatsächlich eine stärkere Racemisierung erfolgt, dann kann das Produkt durch Umkristallisieren als Salz eines dafür geeigneten chiralen 4s Amins, zum Beispiel als das Salz von d(+)-alpha-Phenylethyl-amin, gereinigt werden.

Das C-Ende des Pentapeptids der Formel I wird gewöhnlich in sein Amid übergeführt. In den Pentapeptiden der Formel I kann das Amid unsubstituiert oder N-monosub- so stituiert sein. Die Überführung in das Amid erfolgt vorzugsweise durch Aktivieren der Carboxylgruppe der Aminosäure mit N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) in Gegenwart von 1-Hydroxybenztriazol (HBT) unter Bildung des HBT-Esters, worauf dieser mit wasserfreiem Ammoniak oder dem ss entsprechenden primären Amin zu dem unsubstituierten bzw. N-monosubstituierten Amid umgesetzt wird. Zu hierfür geeigneten primären Aminen gehören Methylamin, Ethyl-amin und n-Propylamin.

Die Verbindungen der Formel II, für die Y Acetyl 60

bedeutet, können aus dem entsprechenden Peptid, das als Rest Y Wasserstoff enthält, hergestellt werden, und die Aminogruppe am Ende der Kette wird geschützt. Die letztgenannte Verbindung wird z.B. mit Essigsäureanhydrid in Gegenwart von Pyridin behandelt, wodurch das entspre- «s chende N-blockierte O-Acetylpeptid erhalten wird. Nach Entblockierung mit einer Mischung aus Salzsäure und Essigsäure wird die gewünschte Verbindung erhalten.

Es wurden und werden folgende allgemein übliche Abkürzungen verwendet:

Abu - alpha-Aminobuttersäure

Ala - Alanin

Cys - Cystein

Gly - Glycin

Hse - Homoserin

Ile - Isoleucin

Leu - Leucin

Met - Methionin

Nie - Norleucin

Nva - Norvalin

Phe - Phenylalanin

Ser - Serin

Tyr - Tyrosin

Val - Valin

Ac - Acetyl

Me - Methyl

Et - Ethyl

Ip - Isopropyl

Pr - n-Propyl

Bu - n-Butyl i-Bu - Isobutyl t-Bu - tert.-Butyl s-Bu - sek.-Butyl

BOC - tert.-Butyloxycarbonyl

Bzl - Benzyl

DCC - N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid HBT - 1-Hydroxybenztriazol DMF - N,N-Dimethylformamid TFA - Trifluoressigsäure THF - Tetrahydrofuran DEAE - Diethylaminoethyl

Beispielhafte Verbindungen der Formel I sind folgende:

H-L-Tyr-D-Ala-Gly-L-Phe-L-Met-NHz;

H-L-Tyr-D-Ala-Gly-L-Phe-L-(N-Me)Met-NH2;

H-L-Tyr-D-Abu-Gly-L-Phe-L-Met-NHa;

H-L-Tyr-D-Abu-Gly-L-Phe-L-(N-Me)Met-NH2;

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H-L-Tyr-D-Nva-Gly-L-Phe-L-(N-Me)Met-NH2;

H-L-Tyr-D-Nva-Gly-L-Phe-L-Met-NHa;

H-L-Tyr-D-Val-Gly-L-Phe-L-(N-Me)Met-NH2;

H-L-Tyr-D-Val-Gly-L-Phe-L-Met-NFh;

H-L-Tyr-D-Nle-GIy-L-Phe-L-Met-NHz;

H-L-Tyr-D-Nle-Gly-L-Phe-L-(N-Et)Met-NH2;

H-L-Tyr-D-Leu-Gly-L-Phe-L-Met-NHh;

H-L-Tyr-D-Leu-Gly-L-Phe-L-(N-Pr)Met-NH2;

H-L-Tyr-D-Ile-Gly-L-Phe-L-Met-NH2;

H-L-Tyr-D-Ile-Gly-L-Phe-L-(N-Pr)Met-NH2;

H-L-Tyr-D-Ala-Gly-L-Phe-L-(N-Et)Met-NH2;

H-L-Tyr-D-Ala-Gly-L-Phe-L-(N-Pr)Met-NH2;

H-L-Tyr-D-Ala-D-Ala-L-Phe-L-(N-Pr)Met-NH2;

H-L-Tyr-D-Ala-L-Ala-L-Phe-L-Met-NH2;

H-L-Tyr-D-Ala-L-Ala-L-Phe-L-(N-Me)Met-NH2;

H-L-Tyr-D-Ala-L-Abu-L-Phe-L-Met-NH2;

H-L-Tyr-D-AIa-L-Nva-L-Phe-L-(N-Me)Met-NH2;

H-L-Tyr-D-Ala-L-Leu-L-Phe-L-(N-Me)Met-NH2;

H-L-Tyr-D-Ala-L-Ile-L-Phe-L-Met-NH2;

H-L-Tyr-D-Ala-L-Ile-L-Phe-L-(N-Et)Met-NH2;

H-L-Tyr-D-Val-L-Ala-L-Phe-L-(N-Me)Met-NH2;

H-L-Tyr-D-Leu-L-Ala-L-Phe-L-(N-Me)Met-NH2;

H-L-Tyr-D-Val-L-Val-L-Phe-L-(N-Et)Met-NH2;

H-L-Tyr-D-Leu-L-Leu-L-Phe-L-(N-Me)Met-NH2;

H-L-Tyr-D-Ala-Gly-L-Phe-L-Nle-NH2;

H-L-Tyr-D-Ala-GIy-L-Phe-L-Hse(Me)-NH2;

H-L-Tyr-D-Ala-Gly-L-Phe-L-(N-Me)Nle-NH2;

H-L-Tyr-D-Ala-Gly-L-Phe-L-(N-Me)Hse(Me)-NH2;

H-L-Tyr-D-(N-Me)Ala-Gly-L-Phe-L-Met-NH2;

H-L-Tyr-D-(N-Me)Ala-Gly-L-Phe-L-(N-Me)Met-NH2;

H-L-Tyr-D-(N-Me)Ala-L-Ala-L-Phe-L-Met-NH2;

H-L-Tyr-D-(N-Me)Ala-L-Ala-L-Phe-L-(N-Me)Met-NH2;

H-L-Tyr-D-(N-Et)Ala-Gly-L-Phe-L-(N-Me)Met-NH2;

H-L-Tyr-D-(N-Me)Val-Gly-L-Phe-L-(N-Me)Met-NH2;

H-L-Tyr-D-(N-Me)Leu-Gly-L-Phe-L-(N-Me)Nle-NH2;

H-L-Tyr-D-(N-Me)Ile-L-Ala-L-Phe-L-(N-Me)Hse(Me)-

NH2;

H-L-Tyr(Ac)-D-Ala-Gly-L-Phe-L-Met-NH2;

H-L-Tyr(Ac)-D-Ala-GIy-L-Phe-L-(N-Me)Met-NH2;

H-L-Tyr-D-Nle-L-Nva-L-Phe-L-Met-NH2;

H-L-Tyr-D-Abu-L-Abu-L-Phe-L-(N-Me)Met-NH2;

(N-Me)-L-Tyr-D-Ala-Gly-L-Phe-L-Met-NH2;

(N,N-Di-Me)-L-Tyr-D-Ala-L-Ala-L-Phe-L-(N-Me)Met-

NH2;

(N-Allyl)-L-Tyr-D-Ala-Gly-L-Phe-L-(N-Me)Met-NH2; (N-Et)-L-Tyr-D-Abu-L-Ala-L-Phe-L-(N-Et)Nle-NH2; (N,N-Di-Pr)-L-Tyr-D-Val-L-Ala-L-Phe-L-(N-Me)-Hse(Me)-NH2;

(N-Pr)-L-Tyr-D-Leu-Gly-L-Phe-L-(N-Me)Met-NH2; (N,N-Di-Et)-L-Tyr-D-(N-Pr)Abu-L-Ala-L-Phe-L-Met-NH2; (N-Me,N-Et)-L-Tyr(Ac)-D-(N-Pr)Nle-L-Ala-L-Phe-L-(N-Me)Met-NH2;

(N,N-Di-Me)-L-Tyr(Ac)-D-(N-Et)Ile-L-Val-L-Phe-L-(N-Pr)Met-NH2;

(N-Me)-L-Tyr(Ac)-D-(N-Me)Leu-Gly-L-Phe-L-(N-Et)-Nle-NH2;

(N-Me)-L-Tyr(Ac)-D-(N-Me)Nva-L-Nva-L-Phe-L-(N-Me)Hse(Me)-NH2;

H-L-Tyr-D-Ala-Gly-L-(N-Me)Phe-L-Met-NH2;

H-L-Tyr-D-Ala-Gly-L-(N-Me)Phe-L-(N-Me)Met-NH2;

H-L-Tyr-D-Ala-Gly-L-(N-Et)Phe-L-(N-Me)Nle-NH2;

H-L-Tyr-D-Ala-Gly-L-(N-Pr)Phe-L-(N-Me)Hse(Me)-NH2;

H-L-Tyr-D-Ala-Gly-L-(N-Pr)Phe-L-(N-Me)Met-NH2;

H-L-Tyr-D-Ala-L-Ala-L-(N-Me)Phe-L-Met-NH2;

H-L-Tyr-D-Ala-L-Ala-L-(N-Et)Phe-L-(N-Me)Met-NH2;

H-L-Tyr-D-Ala-Gly-L-Phe-L-Met-NH(Me);

H-L-Tyr-D-Ala-Gly-L-Phe-L-(N-Me)Met-NH(Me);

H-L-Tyr-D-Ala-Gly-L-Phe-L-(N-Et)Met-NH(Me);

H-L-Tyr-D-Ala-Gly-L-Phe-L-(N-Me)Met-NH(Et);

H-L-Tyr-D-Ala-Gly-L-Phe-L-(N-Et)Met-NH(Et);

H-L-Tyr-D-Ala-Gly-L-Phe-L-(N-Me)Nle-NH(Me);

H-L-Tyr-D-Ala-Gly-L-Phe-L-(N-Et)Met-NH(Pr);

H-L-Tyr-D-Ala-Gly-L-Phe-L-(N-Pr)Met-NH(Me);

H-L-Tyr-D-Ala-GIy-L-Phe-L-Met-NH(Pr);

(N,N-Di-Me)-L-Tyr-D-Ala-Gly-L-Phe-L-(N-Me)Met-

NH(Et);

(N,N-Di-Me)-L-Tyr-D-(N-Me)Ala-Gly-L-(N-Me)Phe-L-(N-Me)Met-NH2;

(N,N-Di-Et)-L-Tyr-D-(N-Me)Ala-Gly-L-(N-Et)Phe-L-(N-Et)Met-NH(Me);

(N-allyl)-L-Tyr-D-(N-Me)Ala-L-Ala-L-(N-Me)Phe-L-(N-Me)Nle-NH(Me);

(N-Me)-L-Tyr-D-Ala-L-Val-L-(N-Me)Phe-L-(N-Pr)-Hse(Me)-NH(Me);

(N,N-Di-Me)-L-Tyr-D-Val-L-Ala-L-(N-Me)Phe-L-(N-Me)Met-NH(Me);

(N,N-Di-Pr)-L-Tyr-D-Ala-Gly-L-(N-Pr)Phe-L-(N-Me)Met-NH(Me);

H-L-Tyr-D-Ala-Gly-L-(N-Me)Phe-L-Met-NH(Me);

(N,N-Di-Me)-L-Tyr(Ac)-D-(N-Pr)Ala-Gly-L-(N-Et)Phe-L-

(N-Me)Met-N(Di-Me);

(N,N-Di-Pr)-L-Tyr(Ac)-D-(N-Et)Val-L-Nva-L-(N-Me)Phe-L-(N-Me)Met-NH(Me);

(N-allyl)-L-Tyr(Ac)-D-(N-Pr)Ile-L-Nle-L-(N-Pr)Phe-L-(N-Pr)Nle-NH(Et);

(N-Me)-L-Tyr(Ac)-D-(N-Pr)Leu-L-Abu-L-(N-Me)Phe-L-(N-

Me)Hse(Me)-NH(Pr);

H-L-Tyr-D-Ala-Gly-L-Phe-L-Ser(Et)-NH2;

H-L-Tyr-D-AIa-Gly-L-Phe-L-(N-Me)Leu-NH2;

H-L-Tyr-D-Abu-Gly-L-Phe-L-Cys(p-methoxy-Bzl)-NH2;

H-L-Tyr-D-Abu-Gly-L-Phe-L-(N-Me)Leu-NH2;

H-L-Tyr-D-Nva-Gly-L-Phe-L-(N-Me)Leu-NH2;

H-L-Tyr-D-Nva-Gly-L-Phe-L-Ser(p-methoxy-Bzl)-NH2;

H-L-Tyr-D-Val-Gly-L-Phe-L-(N-Me)Leu-NH2;

H-L-Tyr-D-Val-GIy-L-Phe-L-Ser(Me)-NH2;

H-L-Tyr-D-Nle-Gly-L-Phe-L-Cys(Me)-NH2;

H-L-Tyr-D-Nle-Gly-L-Phe-L-(N-Et)Leu-NH2;

H-L-Tyr-D-Leu-Gly-L-Phe-L-Ser(Bzl)-NH2;

H-L-Tyr-D-Leu-Gly-L-Phe-L-(N-Pr)Leu-NH2;

H-L-Tyr-D-Ile-Gly-L-Phe-L-Cys(Bzl)-NH2;

H-L-Tyr-D-Ue-Gly-L-Phe-L-(N-Pr)Leu-NH2;

H-L-Tyr-D-Ala-Gly-L-Phe-L-(N-Et)Leu-NH2;

H-L-Tyr-D-Ala-Gly-L-Phe-L-(N-Pr)Leu-NH2;

H-L-Tyr-D-Ala-D-Ala-L-Phe-L-(N-Pr)Leu-NH2;

H-L-Tyr-D-Ala-L-Ala-L-Phe-L-Ser(Pr)-NH2;

H-L-Tyr-D-Ala-L-Ala-L-Phe-L-(N-Me)Leu-NH2;

H-L-Tyr-D-Ala-L-Abu-L-Phe-L-Ser(Ip)-NH2;

H-L-Tyr-D-Ala-L-Nva-L-Phe-L-(N-Me)Leu-NH2;

H-L-Tyr-D-Ala-L-Leu-L-Phe-L-(N-Me)Leu-NH2;

H-L-Tyr-D-Ala-L-Ile-L-Phe-L-Cis(i-Bu)-NH2;

H-L-Tyr-D-AIa-L-Ile-L-Phe-L-(N-Et)Leu-NH2;

H-L-Tyr-D-Val-L-Ala-L-Phe-L-(N-Me)Leu-NH2;

H-L-Tyr-D-Leu-L-Ala-L-Phe-L-(N-Me)Leu-NH2;

H-L-Tyr-D-Val-L-VaI-L-Phe-L-(N-Et)Leu-NH2;

H-L-Tyr-D-Leu-L-Leu-L-Phe-L-(N-Me)Leu-NH2;

H-L-Tyr-D-Ala-Gly-L-Phe-L-Ser(p-methoxy-Bzl)-NH2;

H-L-Tyr-D-AIa-Gly-L-Phe-L-Cys(Et)-NH2;

H-L-Tyr-D-Ala-Gly-L-Phe-L-(N-Me)Ser(Et)-NH2;

H-L-Tyr-D-Ala-Gly-L-Phe-L-(N-Me)Cys(Et)-NH2;

H-L-Tyr-D-(N-Me)Ala-Gly-L-Phe-L-Ser(Et)-NH2;

H-L-Tyr-D-(N-Me)Ala-Gly-L-Phe-L-(N-Me)Leu-NH2;

H-L-Tyr-D-(N-Me)Ala-L-Ala-L-Phe-L-Cys(Et)-NH2;

H-L-Tyr-D-(N-Me)Ala-L-Ala-L-Phe-L-(N-Me)Leu-NH2;

H-L-Tyr-D-(N-Et)Ala-Gly-L-Phe-L-(N-Me)Leu-NH2;

H-L-Tyr-D-(N-Me)Val-Gly-L-Phe-L-(N-Me)Leu-NH2;

H-L-Tyr-D-(N-Me)Leu-GIy-L-Phe-L-(N-Me)Leu-NH2;

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

636847

10

H-L-Tyr-D-(N-Me)Ile-L-Ala-L-Phe-L-(N-Me)Ser(p-chlor-Bzlj-NHz;

H-L-Tyr(Ac)-D-Ala-Gly-L-Phe-L-Ser(m-trifluormethyl-Bzl)-NH2;

H-L-Tyr(Ac)-D-Ala-Gly-L-Phe-L-(N-Me)Leu-NH2; s

H-L-Tyr-D-NIe-L-Nva-L-Phe-L-Cys(o-methyl-Bzl)-NH2;

H-L-Tyr-D-Abu-L-Abu-L-Phe-L-(N-Me)Leu-NH2;

(N-Me)-L-Tyr-D-Ala-Gly-L-Phe-L-Ser(p-methoxy-Bzl)-NH2;

(N,N-Di-Me)-L-Tyr-D-Ala-L-Ala-L-Phe-L-(N-Me)Leu-

NH2; Î0

(N-Allyl)-L-Tyr-D-Ala-Gly-L-Phe-L-(N-Me)Leu-NH2;

(N-Et)-L-Tyr-D-Abu-L-Ala-L-Phe-L-(N-Et)Leu-NH2;

(N,N-Di-Pr)-L-Tyr-D-Val-L-Ala-L-Phe-L-(N-Me)Leu-NH2;

(N-Pr)-L-Tyr-D-Leu-Gly-L-Phe-L-(N-Me)Leu-NH2;

(N,N-Di-Et)-L-Tyr-D-(N-Pr)Abu-L-Ala-L-Phe-L-Leu-NH2; is

(N-Me,N-Et)-L-Tyr(Ac)-D-(N-Pr)Nle-L-Ala-L-Phe-L-(N-

Me)Leu-NH2;

(N,N-Di-Me)-L-Tyr(Ac)-D-(N-Et)Ile-L-Val-L-Phe-L-(N-Pr)Leu-NH2;

(N-Me)-L-Tyr(Ac)-D-(N-Me)Leu-Gly-L-Phe-L-(N-Et)Leu- 20 NH2;

(N-Me)-L-Tyr(Ac)-D-(N-Me)Nva-L-Nva-L-Phe-L-(N-Me)Ser(t-Bu)-NH2;

H-L-Tyr-D-Ala-Gly-L-(N-Me)Phe-L-Ser(s-Bu)-NH2;

H-L-Tyr-D-Ala-Gly-L-(N-Me)Phe-L-(N-Me)Leu-NH2; 25

H-L-Tyr-D-Ala-Gly-L-(N-Et)Phe-L-(N-Me)Cys(Et)-NH2;

H-L-Tyr-D-Ala-Gly-L-(N-Pr)Phe-L-(N-Me)Leu-NH2;

H-L-Tyr-D-Ala-Gly-L-(N-Pr)Phe-L-(N-Me)Cys(p-methoxy-

Bzl)-NH2;

H-L-Tyr-D-Ala-L-Ala-L-(N-Me)Phe-L-Ser(Et)-NH2; 30

H-L-Tyr-D-Ala-L-Ala-L-(N-Et)Phe-L-(N-Me)Leu-NH2;

H-L-Tyr-D-Ala-Gly-L-Phe-L-Ser(Et)-NH(Me);

H-L-Tyr-D-Ala-Gly-L-Phe-L-(N-Me)Leu-NH(Me);

H-L-Tyr-D-Ala-Gly-L-Phe-L-(N-Et)Leu-NH(Me);

H-L-Tyr-D-Ala-Gly-L-Phe-L-(N-Me)Leu-NH(Et); 35

H-L-Tyr-D-Ala-Gly-L-Phe-L-(N-Et)Leu-NH(Et);

H-L-Tyr-D-Ala-Gly-L-Phe-L-(N-Me)Leu-NH(Me);

H-L-Tyr-D-Ala-Gly-L-Phe-L-(N-Et)Cys(p-brom-Bzl)-NH(Pr);

H-L-Tyr-D-Ala-Gly-L-Phe-L-(N-Pr)Leu-NH(Me);

H-L-Tyr-D-Ala-Gly-L-Phe-L-Cys(Ip)-NH(Pr); 40

(N,N-Di-Me)-L-Tyr-D-Ala-Gly-L-Phe-L-(N-Me)Leu-

NH(Et);

(N,N-Di-Me)-L-Tyr-D-(N-Me)Ala-Gly-L-(N-Me)Phe-L-(N-Me)Leu-NHz;

(N,N-Di-Et)-L-Tyr-D-(N-Me)Ala-Gly-L-(N-Et)Phe-L-(N- « Et)Leu-NH(Me);

(N-allyl)-L-Tyr-D-(N-Me)Ala-L-Ala-L-(N-Me)Phe-L-(N-Me)Leu-NH(Me);

(N-Me)-L-Tyr-D-Ala-L-Val-L-(N-Me)Phe-L-(N-Pr)Ser(Bzl)-NH(Me); so

(N,N-Di-Me)-L-Tyr-D-Val-L-Ala-L-(N-Me)Phe-L-(N-Me)Leu-NH(Me);

(N,N-Di-Pr)-L-Tyr-D-Ala-Gly-L-(N-Pr)Phe-L-(N-Me)Leu-NH(Me);

H-L-Tyr-D-Ala-Gly-L-(N-Me)Phe-L-Ser(Pr)-NH(Me); ss

(N,N-Di-Me)-L-Tyr(Ac)-D-(N-Pr)Ala-Gly-L-(N-Et)Phe-L-

(N-Me)Leu-N(Di-Me);

(N,N-Di-Pr)-L-Tyr(Ac)-D-(N-Et)Val-L-Nva-L-(N-Me)Phe-L-(N-Me)Leu-NH(Me);

(N-allyl)-L-Tyr(Ac)-D-(N-Pr)Ile-L-Nle-L-(N-Pr)Phe-L-(N- eo Pr)Leu-NH(Et); and

(N-Me)-L-Tyr(Ac)-D-(N-Pr)Leu-L-Abu-L-(N-Me)Phe-L-(N-Me)Leu-NH(Pr).

Die Verbindungen der Formel I können als solche verabreicht werden, oder sie können zu pharmazeutischen Zubereitungen in Form von Dosierungseinheiten für die parenterale Verabreichung verarbeitet werden. Für solche Zubereitungen können organische oder anorganische Feststoffe und/oder Flüssigkeiten, die pharmazeutisch annehmbare Träger darstellen, verwendet werden. Hierfür in Betracht kommende Träger sind allgemein bekannt. Die Zubereitungen können Tabletten, Pulvergranulate, Kapseln, Suspensionen, Lösungen oder dergleichen sein.

Wenn sie in einer wirksamen Menge verabreicht werden, rufen die Verbindungen der Formel I eine analgetische Wirkung hervor. Die Dosierungen liegen im Bereich von etwa 0,1 bis 100 mg/leg Körpergewicht des Empfängers. Der bevorzugte Dosierungsbereich liegt zwischen 1,0 und 20 mg/kg Körpergewicht des Empfängers. Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele weiter erläutert.

Beispiel 1

Herstellung von L-Tyrosyl-D-alanyl-glycyl-L-phenyl-alanyl-Nalpha-methyl-L-methionylamid-hydrochlorid A. Benzyl-D-Alinat-p-toluolsulfonat Zu einer Mischung aus 100 ml Benzylalkohol, 200 ml Benzol und 55,1 g (0,29 Mol) p-Toluolsulfonsäuremono-hydrat werden 25 g (0,281 Mol) D-Alanin gegeben. Die Mischung wird zum Sieden unter Rückfluss erwärmt, und das Wasser wird azeotrop in einer Dean-Stark-Falle entfernt. Nach 15stündigem Erwärmen wird die^Mischung auf Zimmertemperatur abgekühlt und mit Ether verdünnt. Der gebildete Niederschlag wird abgetrennt und aus Methanol/Ether umkristallisiert, wodurch 55,3 g (56%) der in der Überschrift genannten Verbindung vom F. = 112 bis 115°C erhalten werden.

Analyse, CnHaiNOsS (351,42):

Ber.: C 58,10; Gef.: C 58,19;

H 6,02; H 6,06;

N 3,99; N 3,82.

B. Benzyl-Na,I,ha-tert.-butyloxycarbonyl-0-benzyl-L-tyrosyl-D-alinat

35,1 g(0,l Mol) des nach Teil A erhaltenen Produkts werden zu 200 ml trockenem N,N-DimethyIformamid (DMF) gegeben. Die erhaltene Mischung wird gerührt und auf 0°C abgekühlt und mit 11,2 g (0,1 Mol) Diazabicy-clooctan (DABCO) versetzt. Die Mischung wird 10 Minuten bei 0°C gerührt, worauf zuerst 37,1 g (0,1 Mol) NalPha-tert.-Butyloxycarbonyl-O-benzyl-L-tyrosin und dann 13,5 g (0,1 Mol) 1-Hydroxybenztriazol (HBT) und 20,6 g (0,1 Mol) N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) zugegeben werden. Die erhaltene Mischung wird 3 Stunden bei 0°C und dann 24 Stunden bei Zimmertemperatur gerührt. Nach Abkühlen auf 0°C wird die entstandene Suspension filtriert und das Filtrat im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wird in Ethylacetat gelöst und nacheinander mit In NaHCCb, Wasser, kalter 0,75n Citronensäure und Wasser gewaschen. Die organische Schicht wird über Magnesiumsulfat getrocknet, abfiltriert und im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wird in warmem Ethanol gelöst, und nach dem Abkühlen der Lösung erfolgt Kristallisation. Nach einmaligem Umkristallisieren aus Ethanol werden 41,5 g (80%) der reinen in der Überschrift genannten Verbindung vom F. = 121 bis 123°C erhalten.

Die Verbindungen der Formel I sind wertvolle pharmazeutische Mittel. Sie zeigen analgetische Wirkung und sind insbesondere wirksam, wenn sie Säugetieren oder Menschen parenteral verabreicht werden.

6s Analyse, C30H36N2O6 (520,63):

Ber.: C Gef.: C

69,21; 68,99;

H 6,97; H 6,75;

N N

5,38; 5,17.

11

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C. Nalpha-tert.-Butyloxycarbonyl-0-benzyl-L-tyrosyl-D-alanin

Zu einer Mischung von 200 ml Tetrahydrofuran (THF) mit 20 ml Wasser werden 31,2 g (0,06 Mol) des nach Teil B erhaltenen Produkts gegeben. Die Lösung wird auf 0°C abgekühlt und langsam mit 13,2 ml (1,1 Äquiv.) 5 n Natriumhydroxid versetzt. Die Mischung wird unter Rühren langsam auf Zimmertemperatur kommen gelassen. Nach 5 Stunden wird sie zwischen Wasser und Ether verteilt, und die wässrige Schicht wird abgetrennt und abgekühlt. Der pH wird durch Zusatz von Citronensäure auf 2 eingestellt, worauf mit Ethylacetat extrahiert wird. Der Ethylacetatextrakt wird mit Wasser gewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet, abfiltriert und mit Ether verdünnt. Der gebildete Niederschlag wird gewonnen, und es werden 17,7 g (67%) der in der Überschrift genannten Verbindung vom F. = 160 bis 162°C erhalten.

Analyse, C24H30N2O6 (442,51):

Ber.: C 65,14; H 6,83; N 6,63;

Gef.: C 64,73; H 6,70; N 6,20.

D. Benzyl-Nalpha-tert.-butyloxycarbonyl-0-benzyl-L-tyrosyl-D-alanyl-glycinat

Zu 70 ml trockenem DMF werden 6,74 g (0,02 Mol) des Salzes des Glycinbenzylesters mit p-Toluolsulfonsäure gegeben. Die erhaltene Mischung wird auf 0°C abgekühlt und mit 2,24 g (0,02 Mol) DABCO versetzt. Die Mischung wird einige Minuten gerührt, und dann werden 8,84 g (0,020 Mol) des nach Teil C erhaltenen Produkts und anschliessend 2,7 g (0,020 Mol) H BT und 4,12 g (0,020 Mol) DCC zugegeben. Das Reaktionsgemisch wird 2 Stunden bei 0°C und dann 24 Stunden bei Zimmertemperatur gerührt. Die erhaltene Suspension wird auf 0°C abgekühlt und filtriert, und das Filtrat wird im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wird in Ethylacetat gelöst und nacheinander mit In Natriumbicarbonat, Wasser, kalter 0,75n Citronensäure und Wasser gewaschen. Die organische Phase wird über Magnesiumsulfat getrocknet, abfiltriert und im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wird aus Ethanol umkristallisiert und ergibt 10,8 g (92%) der reinen in der Überschrift genannten Verbindung vom F. = 145 bis 147°C.

Analyse, C33H39N3O7 (589,69):

Ber.: C 67,22; H 6,67; N 7,13;

Gef.: C 67,32; H 6,83; N 6,91.

E. NdlplM-tert.-Butyloxycarbonyl-L-tyrosyl-D-alanyl-glycin

Zu 60 ml DMF werden 10,5 g (0,018 Mol) des nach Teil D erhaltenen Produkts und dann 2,5 g 5% Pd/C als Aufschläm-mung in DMF gegeben. Die erhaltene Mischung wird mit Stickstoff gespült und dann wird Wasserstoff bei Atmosphärendruck und Zimmertemperatur durch ein Gasverteilungsrohr eingeleitet. Nach 3'A Stunden wird die Wasserstoffzufuhr abgebrochen, und der Katalysator wird abfiltriert. Das Filtrat wird im Vakuum eingeengt, und der Rückstand wird mit Ether verrieben. Dadurch werden 5,4 g (75%) der in der Überschrift genannten Verbindung als amorpher Feststoff erhalten.

Analyse, C26H26N2O5 (446,65):

Ber.: C 69,94; H 5,87; N 6,27; Gef.: C 70,08; H 5,82; N 6,16.

F. Nalpha-tert.-Butyloxycarbonyl-Nalpha-methyl-L-methio-nylamid

17,2 g (0,04 Mol) des Dicyclohexylaminsalzes von Naipha-■tert.-Butyloxycarbonyl-L-methionin werden mit Ethylacetat 5 und kalter 0,75n Citronensäure geschüttelt und die organische Phase wird abgetrennt, mit Wasser gewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet, abfiltriert und im Vakuum bis zu einem öligen Rückstand eingeengt. Dieser Rückstand wird in einer Mischung aus 80 ml trockenem THF und 10 ml DMF 10 gelöst und mit 0,5 g 18-Kron-6-Ether versetzt. Eine Kaliumhydridsuspension (äquivalent 0,12 Mol) wird unter Rühren tropfenweise in 30 Minuten zu der erhaltenen gekühlten Mischung gegeben. Nach Zugabe von 2,49 ml (0,04 Mol) Methyliodid wird die Mischung 24 Stunden bei Zimmertem-15 peratur gerührt. Dann wird sie abgekühlt und mit 0,75n Citronensäure bis zu pH 3 angesäuert und mit Wasser und Ether geschüttelt. Die Etherschicht wird mehrere Male mit Wasser gewaschen und dann mit In Natriumbicarbonat extrahiert. Die wässrigen Extrakte werden vereinigt, auf pH 2 20 angesäuert und mit Ethylacetat extrahiert. Der Ethylacetatextrakt wird über Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und im Vakuum eingedampft, wodurch 8,4 g Produkt mit einem nmr-Spektrum erhalten werden, das dem gewünschten N-methylierten Produkt entspricht, [delta 2,92, N-CH3; delta 25 2,11, S-CH3; delta 1,6, C(CH3)3].

8,4 g (etwa 0,034 Mol) dieses Öls werden in 60 ml DMF gelöst. Die Lösung wird auf 0°C abgekühlt und mit 4,69 g (0,035 Mol) HBT und 7,0 g (0,034 Mol) DCC versetzt. Die Mischung wird 2 Stunden bei 0°C gerührt, und durch ein 30 Gasverteilungsrohr wird 45 Minuten wasserfreies Ammoniak in die Mischung eingeleitet. Dann wird filtriert, und das Filtrat wird im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wird auf eine 3 x 50 cm grosse Säule aus Kieselgel (Korngrösse entsprechend Sieböffnungen von 250 bis 75 Mikron) aufgebracht 35 und mit Chloroform und dann mit einer Mischung von Chloroform mit Methanol im Verhältnis 9,75:0,25 eluiert. Die Dünnschichtchromatographie (TLC) der aus der Säule austretenden Fraktionen und die dann vorgenommene Vereinigung aufgrund der erhaltenen Chromatrogramme liefert 40 nach dem Einengen im Vakuum ein Produkt, das zweimal aus einer Mischung von Ether mit Petrolether umkristallisiert wird. Auf diese Weise werden 4,1 g (39%) der in der Überschrift genannten Verbindung vom F. = 75 bis 78°C erhalten.

G. Naipha-tert.-Butyloxycarbonyl-L-phenylalanyl-Nalpha-55 methyl-L-methionylamid

In einer Mischung aus 20 ml Eisessig, 2 ml Anisol, 2 ml Triethylsilan und 3,8 g (0,0144 Mol) des nach Teil F erhaltenen Produkts wird 30 Minuten lang wasserfreier Chlorwasserstoff eingeleitet. Dann wird die Mischung mit Ether ver-60 dünnt. Der gebildete Niederschlag wird abfiltriert, getrocknet (2,9 g) und wieder in 40 ml DMF gelöst. Die Mischung wird auf 0°C abgekühlt und zunächst mit 2,9 ml (0,0146 Mol) Dicyclohexylamin und dann mit 1,97 g (0,0146 Mol) HBT, 3,87 g (0,0146 Mol) Nalpha-tert.-Butyloxycarbonyl-L-phenyl-65 alanin und 3,0 g (0,0146 Mol) DCC versetzt. Die erhaltene Mischung wird 2 Stunden bei 0°C und dann 24 Stunden bei Zimmertemperatur gerührt. Nach Abkühlen auf 0°C wird filtriert, und das Filtrat wird im Vakuum eingeengt. Der Rück45 nmr: delta 2,80, N-CH3; delta 2,10, S-CH3; delta 1,48 C(CH3)3.

[alphaß5 -29,5° (C = 0,5, CHCh).

Analyse, C11H22N2SO3 (262,37):

50

Ber.: C 50,36; H 8,45; N 10,68;

Gef.: C 50,59; H 8,24; N 10,87.

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stand wird in Ethylacetat gelöst, und die Lösung wird nacheinander mit In Natriumbicarbonat, Wasser, 0,75n Citronensäure und Wasser gewaschen. Nach dem Trocknen über Magnesiumsulfat und Eindampfen im Vakuum wird ein Öl erhalten, das sich in Petrolether nicht zum Kristallisieren bringen lässt. Deshalb wird es auf eine Säule von 3 x 50 cm Kieselgel (Korngrösse entsprechend Sieböffnungen von 250 bis 75 Mikron) aufgebracht und mit Chloroform und anschliessend mit Chloroformmethanol (9,8:0,2) eluiert. TLC-Analyse der aus der Säule austretenden Fraktionen und anschliessende Vereinigung aufgrund der Chromatogramme ergibt nach dem Verdampfen des Lösungsmittels einen Rückstand, der aus Ether/Petrolether umkristallisiert wird und 3,1 g (52,5%) der in der Überschrift genannten Verbindung vom F. = 99 bis 103°C ergibt.

Analyse, C20H31N3O4S (409,55):

Ber.: C 58,65; H 7,63; N 10,26;

Gef.: C 58,74; H 7,47; N 10,45.

H. Nalphll-tert.-Butyloxycarbonyl-L-tyrosyl-D-alanyl-glycyl-L-phenylalanyl-Na|Pha-methyl-L-methionylamid

Zu einer Mischung aus 20 ml Eisessig, 3 ml Anisol und 3 ml Triethylsilan werden 2,2 g (5,37 mMol) des nach Teil G erhaltenen Produkts gegeben. Trockener Chlorwasserstoff wird 30 Minuten lang in die Mischung eingeleitet. Nach Zugabe von Ether wird der ausgefallene Feststoff abfiltriert und im Vakuum getrocknet. Dieser Feststoff, 1,75 g (5 mMol) wird in 30 ml trockenem DMF gelöst und die Lösung wird auf 0°C abgekühlt. Das Hydrochlorid wird durch Zugabe von 0,99 ml (5 mMol) Dicyclohexylamin neutralisiert. Nach 5 Minuten werden 2,05 g (5 mMol) des nach Teil E erhaltenen Produkts und danach 0,68 g (5 mMol) HBT und 1,03 g (5 mMol) DCC zugegeben. Die Mischung wird 24 Stunden bei 4°C gerührt. Die unlöslichen Anteile werden durch Filtrieren entfernt, und das Filtrat wird im Vakuum eingedampft. Der so erhaltene Rückstand wird in Ethylacetat gelöst, und die Lösung wird nacheinander mit In wässrigem Natriumbicarbonat, kalter 0,75n Citronensäure und Wasser gewaschen und über Magnesiumsulfat getrocknet. Dann wird die Lösung auf eine 3 x 50 cm messende Säule aus Kieselgel (Korngrösse entsprechend Sieböffnungen von 250 bis 75 Mikron) aufgebracht und mit Chloroform und dann mit Chloroform/Methanol (9:1) eluiert. TLC-Analyse der aus der Säule austretenden Fraktionen und anschliessende Vereinigung aufgrund der erhaltenen Chromatogramme ergibt zwei Anteile Rohprodukt mit einem Gewicht von 0,80 g bzw. 1,2 g. Der erste Anteil wird durch präparative Dickschichtchromatographie an Kieselgel (Chloroform/Methanol, 9:1) weiter gereinigt und ergibt 0,62 g der in der Überschrift genannten Verbindung als amorphen Feststoff.

Analyse, C34H48N60sS (700,86):

Ber.: C 58,27; H 6,90; N 11,99;

Gef.: C 58,48; H 6,64; N 11,97.

Aminosäureanalyse, gefunden: Tyr0,99, Ala 1,00, Gly 1,00, Phe 1,00.

Der zweite Anteil an Substanz wird zweimal in der oben beschriebenen Weise chromatographiert und ergibt 0,74 g des gewünschten Produkts mit zutreffender Elementar- und Aminosäureanalyse.

I. L-Tyrosyl-D-alanyl-glycyl-L-phenylalanyl-Na,Pha-methyl-L-methionylamid-hydrochlorid

Zu 5 ml Eisessig und 0,2 ml Anisol werden 0,72 g (1,03 mMol) der in der Überschrift von Teil H genannten Verbindung gegeben. Dann wird 20 Minuten lang wasserfreier Chlorwasserstoff in die Mischung eingeleitet. Durch Lyophi-lisieren der Mischung werden 0,74 g der in der Überschrift genannten Verbindung erhalten. Rf, 0,3.

Eine Analysenprobe des Produkts wird im Vakuum bei 100°C getrocknet.

Analyse, CasH^NeOôSCl (637,20):

Ber.: C 54,66; H 6,49; N 13,19;

Gef.: C 54,36; H 6,19; N 13,00.

Aminosäureanalyse, gefunden: Tyr 1,01, Ala 0,99, Gly 1,00, Phe 1,00.

Beispiel 2

Herstellung von L-Tyrosyl-D-leucyl-glycyl-L-phenyl-alanyl-Na|Pha-methyl-L-methyionylamid-sesquihydrochlorid-monoacetat

A. Benzyl-D-leucinat-p-toluolsulfonat

Diese Verbindung wird genauso hergestellt wie dies in Teil A von Beispiel 1 für die Herstellung der D-Alinatverbindung beschrieben ist. Ausbeute 73%, F. = 155 bis 156°C.

Analyse, C20H27NO5S (393,50):

Ber.: C 61,05; H 6,92; N 3,56;

Gef.: C 61,17; H 6,68; N 3,81.

B. Benzyl-Na|Pha-tert.-Butyloxycarbonyl-0-benzyl-L-tyrosyl-D-leucinat

Zu 50 ml DMF werden 7,86 g (0,020 Mol) des nach Teil A erhaltenen Produkts gegeben. Die Mischung wird auf 0°C abgekühlt und mit 2,24 g (0,020 Mol) DABCO versetzt. Nach 5 Minuten langem Rühren werden zunächst 7,42 g (0,020 Mol) Na'Ph0-tert.-Butyloxycarbonyl-O-benzyl-L-tyrosin und dann 2,7 g (0,020 Mol) HBT und 4,12 g (0,02 Mol) DCC zugegeben. Die gebildete Mischung wird 2 Stunden bei 0°C und dann 24 Stunden bei Zimmertemperatur gerührt. Nach Abkühlen auf 0°C wird die gebildete Suspension filtriert, und das Filtrat wird im Vakuum eingedampft. Der Rückstand wird in Ethylacetat gelöst, und die Lösung wird nacheinander mit In Natriumbicarbonat, Wasser, kalter 0,75n Citronensäure und Wasser gewaschen. Die organische Phase wird über Magnesiumsulfat getrocknet, abfiltriert und im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wird aus warmem Ethanol umkristallisiert und liefert 9,0 g (78%) der in der Überschrift genannten Verbindung vom F. = 100 bis 103°C.

Analyse, C34H42N2O6 (574,72):

Ber.: C 71,06; H 7,37; N 4,87;

Gef.: C 71,30; H 7,15; N 4,79.

C. Nalpha-tert.-Butyloxycarbonyl-0-benzyl-L-tyrosyl-D-leucin

Zu 80 ml THF werden 8,0 g (0,0139 Mol) des nach Teil B erhaltenen Produkts gegeben. Nach Zugabe von 20 ml Wasser wird die Mischung auf 0°C abgekühlt und mit 7,25 ml (0,0145 Mol) 2n Natriumhydroxid langsam versetzt. Nach vollständiger Zugabe wird die Mischung 30 Minuten bei 0°C und dann 4 Stunden bei Zimmertemperatur gerührt. Anschliessend wird sie mit Wasser und Ether geschüttelt und die wässrige Phase wird abgetrennt, auf 0°C abgekühlt, mit 1 n HCl auf pH 2 angesäuert und mit Ethylacetat extrahiert.

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• Der Ethylacetatextrakt wird mit Wasser gewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet, abfiltriert und in Vakuum bis zu einem sirupösen Rückstand eingeengt. Dieser Rückstand wird aus Ether/Petrolether umkristallisiert und man erhält 6,4 g (95%) der in der Überschrift genannten Verbindung vom F. = 90 bis 94°C.

Analyse, C27H36N2O6 (484,59):

Ber.: C 66,92; H 7,49; N 5,78;

Gef.: C 67,14; H 7,38; N 5,76.

D. Benzyl-Na|Pha-tert.-Butyloxycarbonyl-0-benzyl-L-tyrosyl-D-leucyl-glycinat

Zu einer Mischung aus 3,37 g (0,010 Mol) des Salzes von Benzylglycinat mit p-T oluolsulfonsäure und 1,12 g (0,010 Mol) DABCO in 25 ml trockenem DMF werden 4,84 g (0,010 Mol) der nach Teil C erhaltenen Verbindung gegeben. Die Mischung wird auf 0°C gekühlt und dann mit 1,35 g (0,010 Mol) HBT und 2,06 g (0,010 Mol) DCC versetzt. Die so erhaltene Mischung wird 2 Stunden bei 0°C und dann 24 Stunden bei Zimmertemperatur gerührt, wieder auf 0°C abgekühlt und filtriert. Das Filtrat wird im Vakuum eingeengt, und der erhaltene Rückstand wird in Ethylacetat gelöst. Die Lösung wird nacheinander mit In Natriumbicarbonat, Wasser, kalter 0,75n Citronensäure und Wasser gewaschen. Dann wird sie über Magnesiumsulfat getrocknet, abfiltriert und im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wird aus Ethanol/Wasser umkristallisiert und ergibt 4,0 g (63%) der in der Überschrift genannten Verbindung vom F. = 114 bis 116°C.

Analyse, C30H45N3O7 (631,77):

Ber.: C 68,44; H 7,18; N 6,65;

Gef.: C 68,17; H 7,12; N 6,40.

E. Nalpl,a-tert.-Butyloxycarbonyl-L-tyrosyl-D-leucyl-glycin Eine Mischung aus 5 ml wasserfreiem DMF, 3,9 g (0,006

Mol) der nach Teil D erhaltenen Verbindung, 1,5 g 5% Pd/C und 40 ml Ethanol wird mit Stickstoff gespült, worauf 5 Stunden lang Wasserstoff eingeleitet wird, wobei die Mischung bei Atmosphärendruck und Zimmertemperatur gehalten wird. Nach Abfiltrieren des Katalysators wird das Filtrat im Vakuum eingedampft, und der Rückstand wird aus Ether/Ethylacetat umkristallisiert, wodurch 2,3 g (85%) der in der Überschrift genannten Verbindung vom F. = 189 bis 190°C erhalten werden.

Analyse, C22H33N3O7 (451,52):

Ber.: C 58,52; H 7,37; N 9,31;

Gef.: C 58,79; H 7,48; N 9,39.

F. Nalpha-tert.-Butyloxycarbonyl-L-tyrosyl-D-leucyl-glycyl-L-phenylalanyl-NaIph"-methyl-L-methionylamid

Zu 10 ml wasserfreiem DMF werden 0,692 g (0,002 Mol) des, wie in Teil H von Beispiel 1 beschrieben, hergestellten Hydrochlorids von L-Phenylalanyl-Na|Pha-methyl-L-methio-nylamid und 0,903 g (0,002 Mol) des nach Teil E dieses Beispiels erhaltenen Produkts gegeben. Nach Abkühlen auf 0°C werden 0,28 ml (0,002 Mol) Triethylamin und 10 Minuten später 0,27 g (0,002 Mol) HBT und 0,412 g (0,002 Mol) DCC gegeben. Die Mischung wird 2 Stunden bei 0°C und dann 24 Stunden bei 4°C gerührt. Der entstandene Niederschlag wird abfiltriert, und das Filtrat wird im Vakuum bis zu einem Rückstand eingeengt, der in Ethylacetat gelöst wird. Die Ethylacetatlösung wird nacheinander mit In Natriumbicarbonat, Wasser, kalter 0,75n Citronensäure und Wasser gewaschen. Die organische Phase wird über Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wird auf 2 präparative Dickschichtchromatographier-platten aufgebracht, und die Platten werden mit Chloroformmethanol (9,25:0,75) eluiert. Die grössere UV-positive Bande wird aus jeder Platte ausgeschnitten, und das Produkt wird mit Chloroformmethanol aus dem Kieselgel eluiert. Durch Entfernen des Lösungsmittels im Vakuum werden 1,2 g (81%) der in der Überschrift genannten Verbindung als amorpher Feststoff erhalten.

[alphaig -31,5° (C = 0,5 MeOH).

Analyse, C37H54N6O8S (742,93):

Ber.: C 59,82; H 7,33; N 11,31; Gef.: C 59,88; H 7,06; N 11,15.

Aminosäureanalyse, gefunden: Tyr 1,01, Leu 1,00, Gly 1,00, Phe 0,99.

G. L-Tyrosyl-D-leucyl-glycyl-L-phenylalanyl-Nalpha-methyl-L-methionylamid-sesquihydrochlorid-monoacetat

Zu 5 ml Eisessig, die 0,3 ml Anisol enthalten, werden 0,9 g (0,0012 Mol) der nach Teil F erhaltenen Verbindung gegeben. In diese Mischung wird 20 Minuten lang trockener Chlorwasserstoff eingeleitet. Durch Lyophilisieren aus wässriger Essigsäure wird das Lösungsmittel entfernt, wodurch die in der Überschrift genannte Verbindung als amorpher Feststoff erhalten wird.

[alpha]" -2,1° [C = 0,3, MeOH],

Analyse, Cu^NeOeS- 1,5HC1-C2H402 (757,04):

Ber.: C 53,93; H 6,79; N 11,10; Cl 7,02;

Gef.: C 54,30; H 6,64; N 11,32; Cl 6,96.

Aminosäureanalyse, gefunden: Tyr 0,99, Leu 1,03, Gly 0,99, Phe 0,99.

Beispiel 3

Herstellung von L-Tyrosyl-D-alanyl-glycyl-L-phenyl-alanyl-L-methionylamid-hydrochlorid

A. Methyl-Nalpha-tert.-butyloxycarbonyl-L-phenylalänyl-L-methionat

Zu 200 ml DMF werden 19,9g (0,1 Mol) des Hydrochlorids des L-Methioninmethylesters gegeben. Nach Abkühlen auf 0°C werden unter rühren zunächst 19,9 ml (0,1 Mol) Dicyclo-hexylamin und dann 26,5 g (0,1 Mol) Nalpha-tert.-Butyloxy-carbonyl-L-phenylalanin, 13,5 g (0,1 Mol) HBT und 20,6 g (0,1 Mol) DCC gegeben. Die so erhaltene Mischung wird 2 Stunden bei 0°C und dann 24 Stunden bei Zimmertemperatur gerührt. Nach erneutem Abkühlen auf 0°C wird von dem gebildeten Niederschlag abfiltriert, und das Filtrat wird im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wird in Ethylacetat gelöst, und die Lösung wird nacheinander mit kalter 0,75n Citronensäure, Wasser, In Natriumbicarbonat und Wasser gewaschen. Dann wird sie über Magnesiumsulfat getrocknet und im Vakuum eingedampft, wodurch ein kristalliner Rückstand erhalten wird. Die feste Substanz wird zweimal aus Ether/Petrolether umkristallisiert, wodurch 26,6 g (65%) der in der Überschrift genannten Verbindung vom F. = 89 bis 92°C erhalten werden.

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Analyse, C20H30N2O5S (410,53):

Ber.: C 58,51; H 7,37; N 6,82; Gef.: C 58,41; H 7,15; N 6,71.

B. Na,pha-tert.-Butyloxycarbonyl-L-phenylalanyl-L-me-thionylamid

Eine Suspension von 13,0 g (0,032 Mol) der nach Teil A erhaltenen Verbindung in 60 ml Methanol wird in einem mit einem Magnetrührer ausgerüsteten Druckgefäss auf -78°C gekühlt und mit 60 ml wasserfreiem flüssigem Ammoniak versetzt. Das Reaktionsgefäss wird verschlossen, worauf man es bis auf Zimmertemperatur erwärmen lässt. Die Mischung wird 24 Stunden bei Zimmertemperatur gerührt, worauf das Gefäss langsam erneut auf -78°C abgekühlt und anschliessend geöffnet wird. Der Rest Ammoniak wird durch Erwärmen der Mischung verdampft, und das nach Verdampfen des Methanols erhaltene Produkt wird aus Methanol umkristallisiert, wodurch 9,7 g (77%) der in der Überschrift genannten Verbindung vom F. = 192 bis 195°C erhalten werden.

Analyse, C19H29N3O4S (395,52):

Ber.: C 57,70; H 7,39; N 10,62; Gef.: C 57,41; H 7,17; N 10,37.

C. L-Phenylalanyl-L-methionylamid-hydrochlorid Zu einer Mischung aus 150 ml Eisessig, 10 ml Anisol und 10 ml Triethylsilan werden 9,6 g (0,024 Mol) des nach Teil B erhaltenen Produkts gegeben. Dann wird durch ein Gasverteilungsrohr trockener Chlorwasserstoff eingeleitet. Nach 30 Minuten wird das Reaktionsgemisch mit Ether verdünnt, und der gebildete Niederschlag wird gewonnen und aus Ethanol/ Ether umkristallisiert. Man erhält so 7,5 g (94%) der in der Überschrift angegebenen Verbindung vom F. = 214 bis 216°C.

Analyse, C14H22N3O2SCI (331,87):

Ber.: C 50,67; H 6,68; N 12,66; Gef.: C 50,75; H 6,84; N 12,54.

D. Na!pha-tert.-Butyloxycarbonyl-D-alanyl-glycyl-L-phe-nylalanyl-L-methionylamid

Zu 40 ml DMF werden 1,66 g (0,005 Mol) des nach Teil C erhaltenen Produkts gegeben. Nach Zugabe von 0,99 ml (0,005 Mol) Dicyclohexylamin wird die Lösung unter Rühren auf 0°C abgekühlt. Dann werden zunächst 0,88 g (0,005 Mol) ]sjaipha_tert.-Butyloxycarbonyl-glycin und anschliessend 0,68 g (0,005 Mol) HBT und 1,03 g (0,005 Mol) DCC zugegeben. Die so erhaltene Mischung wird 2 Stunden bei 0°C und dann 24 Stunden bei Zimmertemperatur gerührt. Nach erneutem Abkühlen der Mischung auf 0°C wird vom gebildeten Niederschlag abfiltriert, und das Filtrat wird im Vakuum eingedampft. Der Rückstand wird in Ethylacetat gelöst, und die Lösung wird nacheinander mit In Natriumbicarbonat, Wasser, kalter 0,75n Citronensäure und Wasser gewaschen. Die orgnische Phase wird über Magnesiumsulfat getrocknet, abfiltriert und im Vakuum eingedampft. Der erhaltene Rückstand wird in warmem Ethylacetat gelöst. Nach Abkühlen bildet sich ein Gel, das nicht zur Kristallisation gebracht werden kann. Es wird durch Filtrieren gewonnen und getrocknet, wodurch 1,7 g einer amorphen festen Substanz erhalten werden. Diese Substanz wird in 50 ml Acetonitril, das 5 ml Anisol und 5 ml Triethylsilan enthält, suspendiert. Nach Zugabe von p-Toluolsulfonsäuremonohydrat wird die Mischung 5 Stunden gerührt. Der gebildete Niederschlag wird abfiltriert und getrocknet, wodurch 1,6 g (0,003 Mol) des rohen p-Toluolsulfonatsalzes von Glycyl-L-phenyl-alanyl-L-methionylamid erhalten werden. Dieses noch unreine Produkt wird in 30 ml trockenem DMF gelöst, auf 0°C abgekühlt und mit 0,336 g (0,003 Mol) DABCO versetzt, worauf nach 10 Minuten 0,8 g (0,004 Mol) Nalpha-tert.-Butyl-oxycarbonyl-D-alanin, 0,540 g (0,004 Mol) HBT und 0,824 g (0,004 Mol) DCC zugegeben werden. Die erhaltene Mischung wird dann 2 Stunden bei 0°C und anschliessend 48 Stunden bei Zimmertemperatur gerührt. Die Mischung wird erneut auf 0°C gekühlt und filtriert. Das Filtrat wird im Vakuum eingedampft, und der Rückstand wird in n-Butanol gelöst. Die n-Butanollösung wird nacheinander mit In Natriumbicarbonat, Wasser, kalter 0,75n Citronensäure und Wasser gewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und im Vakuum eingeengt. Der so erhaltene Rückstand wird in warmem Ethanol gelöst und durch Zugabe von Ethylacetat gefällt, wodurch 1,1 g (42% Gesamtausbeute) der in der Überschrift angegebenen Verbindung erhalten werden.

Aminosäurenanalyse, gefunden: Ala 1,01, Gly 1,01, Phe 1,01, Met 0,98.

E. Nalpha-tert.-Butyloxycarbonyl-L-tyrosyl-D-alanyl-glycyl-L-phenylalanyl-L-methionylamid

Zu einer Mischung aus 20 ml Eisessig, 2 ml Anisol und 2 ml Triethylsilan wird 1,0 g (0,0019 Mol) des nach Teil D erhaltenen Produkts gegeben. Durch ein Gasverteilungsrohr wird 30 Minuten lang wasserfreier Chlorwasserstoff eingeleitet. Nach Zugabe von Ether bildet sich ein Niederschlag, der abfiltriert und getrocknet wird. Dieser Feststoff (0,870 g) wird in einer Mischung aus 20 ml kaltem (0°C) DMF und 0,38 ml (0,0019 Mol) Dicyclohexylamin gelöst. Nach 10 Minuten werden 0,534 g (0,0019 Mol) Nalpha-tert.-Butyloxycarbonyl-L-tyrosin, 0,257 g (0,0019 Mol) HBT und 0,391 g (0,0019 Mol) DCC zugegeben. Das Rühren wird noch 2 Stunden bei 0°C und dann 24 Stunden bei Zimmertemperatur fortgesetzt. Nach erneutem Kühlen der Mischung auf 0°C wird der gebildete Niederschlag abfiltriert und das Filtrat im Vakuum eingeengt. Der so erhaltene Rückstand wird in n-Butanol gelöst, und die Lösung wird nacheinander mit In Natriumbicarbonat, Wasser, kalter 0,75n Citronensäure und Wasser gewaschen. Die organische Phase wird dann über Magnesiumsulfat getrocknet und filtriert, und das Filtrat wird im Vakuum eingeengt. Versuche, den Rückstand aus Ethylacetat oder Ethanol umzukristallisieren, führen zu Gelen. Deshalb wird der Rückstand in warmem Methanol gelöst, und die Lösung wird auf eine präparative Dickschichtchromatogra-phierplatte aufgebracht und mit Chloroformmethanol (9:1) eluiert. Die Produktbande wird aus der Platte ausgeschnitten und mit Chloroform/Methanol extrahiert. Das Lösungsmittel wird im Vakuum verdampft, und es werden 0,270 g (21%) der in der Überschrift angegebenen Verbindung erhalten. Rf = 0,17.

Aminosäureanalyse, gefunden: Tyr 1,00, Ala 1,02, Gly 0,99, Phe 1,02, Met 0,98.

F. L-Tyrosyl-D-alanyl-glycyl-L-phenylalanyl-L-methio-nylamid-hydrochlorid

Zu 5 ml Eisessig, die 0,25 ml Anisol enthalten, werden 0,270 g (0,0004 Mol) des nach Teil E erhaltenen Produkts gegeben. Durch ein Gasverteilungsrohr wird 30 Minuten lang

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trockener Chlorwasserstoff eingeleitet. Die so erhaltene Mischung wird eingefroren und lyophilisiert, wodurch 0,182 g (75%) der in der Überschrift angegebenen Verbindung erhalten werden. Rf = 0,5.

Aminosäureanalyse, gefunden: Tyr 0,99, Ala 1,00, Gly 0,99, Phe 1,01, Met 0,91*.

* Die Analyse zeigt die Gegenwart von Methioninsulfoxid an.

Beispiel 4 io

Herstellung von L-Tyrosyl-D-alanyl-glycyl-Nalpha-methyl-L-phenyIalanyl-Napha-methyl-L-methionylamid-hydrochlorid-trihydrat

A. N,N-Dicyclohexylammonium-Nalpha-tert.-butyloxycar- is bonyl-Nalpha-methyl-L-phenylalinat

Zu 80 ml trockenem THF werden 5,3 g (0,02 Mol) Nalpha-tert.-butyloxycarbonyl-L-phenylalanin gegeben. Die so erhaltene Lösung wird auf etwa 10°C abgekühlt und mit 10 ml trockenem DMF und 0,5 g 18-Kron-6-ether versetzt. 20 Dann werden langsam 10,15 g einer Dispersion von Kaliumhydrid in Öl mit einem Gehalt von 0,060 Mol KH zugegeben, und die erhaltene Mischung wird auf 0°C abgekühlt und mit 1,24 ml (0,020 Mol) Methyliodid versetzt. Das Rühren wird bei Zimmertemperatur 24 Stunden fortgesetzt. Die Mischung 25 wird dann auf gestossenes Eis gegossen und mit Ether extrahiert. Die wässrige Schicht wird mit Citronensäure auf pH 2 angesäuert und mit Ethylacetat extrahiert. Die organische Phase wird mit Wasser gewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet und im Vakuum eingeengt, wodurch ein Sirup 30 erhalten wird, der nicht zur Kristallisation gebracht werden kann. Das nmr-Spektrum des Sirups entspricht dem erwarteten Derivat, nmr delta 2,72, N-CH3; delta 1,35 C(CH3)3. Der Sirup wird in Ether gelöst, und nach Zugabe von 4,0 ml Dicyclohexylamin und Kühlen bilden sich Kristalle. Durch 35 Abfiltrieren und Umkristallisieren aus Methanol-Ether werden 6,8 g (74%) der in der Überschrift genannten Verbindung vom F. = 171 bis 174°C erhalten.

[alphajo -22,0° (C = 1, Methanol). Analyse, C27H44N2O4 (460,66):

Chromatogramme werden nach Einengen im Vakuum 1,4 g (33%) eines Sirups erhalten, dessen NMR-Spektrum der in der Überschrift genannten Verbindung entspricht.

NMR: delta 2,93, N-CH3phe; delta 2,73, N-CHaMel; delta 2,10, S-CHs, delta 1,37, C(CH3)3.

C. NaIpha-tert.-Butyloxycarbonyl-L-tyrosyl-D-alanyl-glycyl-Nalpha-methyl-L-phenylalanyl-Na|Pha-methyl-L-methio-nylamid

Zu einer Mischung aus 5 ml Eisessig, 1 ml Anisol und 1 ml Triäthylsilan werden 1,4 g (0,0033 Mol) des nach Teil B erhaltenen Produkts gegeben. Durch ein Gasverteilungsrohr wird 30 Minuten lang trockener Chlorwasserstoff eingeleitet, und dann wird das Reaktionsgemisch mit Ether verdünnt. Der gebildete Niederschlag wird gewonnen und getrocknet (1,1g) und dann in 40 ml DMF gelöst. Nach Abkühlen dieser Lösung auf 0°C werden 1,27 g (0,0031 Mol) des nach Teil E von Beispiel 1 erhaltenen Produkts, 0,420 g (0,0031 Mol) HBT und 0,640 g (0,0031 Mol) DCC zugegeben. Nach 10 Minuten langem Rühren werden 0,43 ml (0,0031 Mol) Tri-äthylamin zugesetzt und das Rühren wird 2 Stunden bei 0°C und dann 48 Stunden bei 4°C fortgesetzt. Der gebildete Niederschlag wird durch Filtrieren entfernt, und das Filtrat wird im Vakuum zu einem sirupartigen Rückstand eingeengt, der in Ethylacetat gelöst wird. Die Ethylacetatlösung wird nacheinander mit In Natriumbicarbonat, Wasser, kalter 0,75n Citronensäure und Wasser gewaschen und über Magnesiumsulfat getrocknet. Durch Abfiltrieren und Einengen im Vakuum werden 2,0 g Rohprodukt erhalten, das in Chloroform gelöst und auf eine 3 x 50 cm messende Säule aus Kieselgel aufgegeben wird. Die Elution erfolgt mit Chloroform und dann mit Chloroform/Methanol (9:1). Durch TLC-Analyse der aus der Säule austretenden Fraktionen und Vereinigung aufgrund des TLC-Profils werden nach Einengen im Vakuum 1,1g (47%) der in der Überschrift genannten Verbindung erhalten.

Analyse, CssHsoNeOsS (714,88):

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Ber.: C 58,80; Gef.: C 59,01;

H 7,05; N 11,76; H 6,78; N 11,58.

Ber.: C 70,40; H 9,63; N 6,08;

Gef.: C 70,60; H 9,49; N 6,19.

B. Na,pha-tert.-Butyloxycarbonyl-Nalpha-methyl-L-phenyl-alanyl-Nalplia-methyl-L-methionylamid

Zu einer Lösung von 1,98 g (0,010 Mol) des Hydrochlorids von Naiphil-Methyl-L-methionylamid in 30 ml trockenem DMF werden 4,16 g (0,010 Mol) Nalpha-tert.-Butyloxycar-bonyl-Nalpha-methyl-L-phenylalanin gegeben. Nach 5 Minuten langem Rühren und Abkühlen auf 0°C werden 1,35 g (0,010 Mol) HBT und 2,06 g (0,010 Mol) DCC zugesetzt. Die so erhaltene Mischung wird 2 Stunden bei 0°C und dann 24 Stunden bei Zimmertemperatur gerührt. Der gebildete Niederschlag wird abfiltriert, und das Filtrat wird im Vakuum bis zu einem Sirup eingeengt, der in Ethylacetat gelöst wird. Die Ethylacetatlösung wird nacheinander mit In Natriumbicarbonat, Wasser, kalter 0,75n Citronensäure und Wasser gewaschen. Die organische Phase wird über Magnesiumsulfat getrocknet und im Vakuum bis zu einem Sirup eingeengt. Dieser Sirup wird in Chloroform gelöst und auf eine 3x50 cm messende Kieselgelsäule (Teilchengrösse entsprechend Sieböffnungen von 250 bis 75 Mikron) aufgegeben und mit Chloroform und dann mit Chloroformmethanol (9,75:0,25) eluiert. Durch TLC-Analyse der aus der Säule austretenden Fraktionen und Vereinigung auf der Grundlage der

D. L-Tyrosyl-D-alanyl-glycyl-Nalpha-methyl-L-phenyl-45 alanyl-Nalpha-methyl-L-methionylamid-hydrochlorid-trihy-drat

Zu einer Mischung aus 10 ml Eisessig und 0,5 ml Anisol werden 0,70 g (0,001 Mol) des nach Teil C erhaltenen Produkts gegeben. Durch ein Gasverteilungsrohr wird 30 50 Minuten trockener Chlorwasserstoff eingeleitet. Durch Einfrieren und Lyophilisieren des Reaktionsgemisches werden 0,678 g der in der Überschrift genannten hygroskopischen Verbindung erhalten.

55 Analyse, C3oH43N6Ö6SCl-3H20 (705,23):

Ber.: C 51,08; H 7,00; N 11,91;

Gef.: C 51,13; H 6,97; N 11,72.

60 Aminosäureanalyse, gefunden: Tyr 1,03, Ala 1,01, Gly 0,96.

Beispiel 5

Herstellung von L-Tyrosyl-D-alanyl-L-analyl-L-phenyl-alanyl-Nalpha-methyl-L-methionylamid, 1,25 Hydrochlorid, 65 Monoacetat

A. Benzyl-Nalpha-tert.-butyloxycarbonyl-0-benzyl-L-tyrosyl-D-alanyl-L-alinat

636847

16

Zu einer Lösung von 3,19 g (0,010 Mol) des p-Toluolsulfo-nats von Benzylalinat in 30 ml trockenem DMF werden 4,43 g (0,010 Mol) des nach Teil B von Beispiel 1 erhaltenen Produkts gegeben. Nach Abkühlen auf 0°C wird die Mischung mit 1,12 g (0,010 Mol) DABCO und anschliessend nach 10 Minuten mit 1,13 5 g (0,010 Mol) H BT und 2,06 g (0,010 Mol) DCC versetzt. Die so erhaltene Mischung wird 2 Stunden bei 0°C und dann 48 Stunden bei Zimmertemperatur gerührt. Der gebildete Niederschlag wird abfiltriert, und das Filtrat wird im Vakuum bis zu einem Sirup eingeengt. Dieser Sirup wird in Ethylacetat gelöst, und die Lösung wird nacheinander mit In Natriumbicarbonat, Wasser, kalter 0,75n Salzsäure und Wasser gewaschen. Nach Trocknen über Magnesiumsulfat und Filtrieren wird das Filtrat im Vakuum eingeengt, wodurch ein Rückstand erhalten wird, der sich mit Ethanol oder Ether nicht zur Kristallisation bringen lässt. Durch Verdünnen der etherischen Lösung mit Petrolether wird ein Gel erhalten, das abfiltriert und im Vakuum getrocknet wird. Die unreine amorphe Substanz (4,0 g) wird auf eine 3x50 cm messende Säule aus Kieselgel aufgebracht und mit Chloroform und dann mit Chloroform/Methanol (9,75:9,25) eluiert. TLC-Analyse der aus der Säule austretenden Fraktionen und anschliessende Vereinigung der Fraktionen aufgrund des TLC-Profils sowie Verdampfen des Lösungsmittels im Vakuum führt zu einem sirupösen Rückstand. Durch Lösen dieses Rückstands in Ether und Fällen mit Petrolether werden 3,0 g (50%) der in der Überschrift genannten Verbindung als amorpher Feststoff vom F. = 100 bis 104°C erhalten.

Analyse, C34H41N3O7 (603,72):

Ber.: C 67,64; H 6,85; N 6,96;

Gef.: C 67,56; H 6,60; N 7,16.

B. Nalpl,''-tert.-ButyloxycarbonyI-L-tyrosyl-D-alanyl-L-alanin

Zu einer Mischung aus 5 ml trockenem DMF und 2,9 g (0,0048 Mol) des nach Teil A erhaltenen Produkts werden 1,0 g 5% Pd/C und dann 50 ml Ethanol gegeben. Durch ein Gasverteilungsrohr wird bei Atmosphärendruck und Zimmertemperatur 6 Stunden lang Wasserstoff eingeleitet. Dann wird das Reaktionsgefäss mit Stickstoff gespült, der Katalysator abfiltriert und das Filtrat im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wird in Ethylacetat gelöst, und die Lösung wird mit Ether verdünnt. Der gebildete Niederschlag wird abfiltriert und im Vakuum getrocknet, wodurch 1,5 g (74%) der in der Überschrift genannten Verbindung als amorpher Feststoff erhalten werden.

[alphaß5 25,9° (C = 5, Chloroform).

Analyse, C20H29N3O7 (423,47):

Ber.: C 56,73; H 6,90; N 9,92;

Gef.: C 56,80; H 6,95; N 9,81.

C. NJ,pha-tert.-Butyloxycarbonyl-L-tyrosyl-D-alanyl-L-alanyl-L-phenylalanyl-Nalpha-methyl-L-methionylamid

Eine Mischung aus 10 ml trockenem DMF und 0,692 g (0,002 Mol) des Hydrochlorids von L-Phenylalanyl-Nalpha-methyl-L-methionylamid (hergestellt nach Teil H von Beispiel 1) wird auf 0°C abgekühlt und mit 0,28 ml (0,002 Mol) Triethylamin versetzt. Das Reaktionsgemisch wird 10 Minuten gerührt, worauf 0,846 g (0,002 Mol) des nach Teil B erhaltenen Produkts und danach 0,270 g (0,002 Mol) HBT und 0,412 g (0,002 Mol) DCC zugegeben werden. Die so erhaltene Mischung wird 2 Stunden bei 0°C und dann 48

Stunden bei Zimmertemperatur gerührt. Nach erneutem Abkühlen auf 0°C wird die Mischung filtriert, und das Filtrat wird im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wird in Ethylacetat gelöst, und diese Lösung wird nacheinander mit In Natriumbicarbonat, Wasser, kalter 0,75n Citronensäure und Wasser gewaschen. Durch Trocknen über Magnesiumsulfat, Filtrieren und Einengen des Filtrats im Vakuum werden 1,6 g Rohprodukt erhalten. Dieses Produkt wird in Chloroform gelöst und auf zwei präparative Dickschichtchromatographieplatten aufgebracht. Die Platten werden mit Chloroform/Methanol (9:1) eluiert. Die Hauptbande wird aus jeder Platte ausgeschnitten, und das Produkt wird mit Chloroform/Methanol extrahiert. Das Extrudat (1,3 g) wird auf eine einzige Dickschichtchromatographieplatte aufgebracht und erneut eluiert, wodurch 1,0 g (70%) der in der Überschrift genannten Verbindung als amorpher Feststoff erhalten werden.

[alphaß5 -25,6° (C = 0,5, MeOH).

Analyse, CssHsoNsOsS (714,88):

Ber.: C 58,80; H 7,05; N 11,76;

Gef.: C 58,60; H 6,87; N 11,53.

D. L-TyrosyI-D-alanyl-L-alanyl-L-phenylalanyI-Nalpha-methyl-L-methionylamid-hydrochlorid-monoacetat

Zu einer Mischung aus 5 ml Eisessig und 0,5 ml Anisol werden 0,880 g (0,0011 Mol) des nach Teil C erhaltenen Produkts gegeben. Nach 20 Minuten langem Einleiten von trok-kenem Chlorwasserstoff wird das Reaktionsgemisch eingefroren und lyophylisiert, wodurch 0,704 g der in der Überschrift genannten Verbindung erhalten werden.

[alphaß5 -16,2° (C = 0,5, MeOH).

Analyse, C30H42N6O6S • 1,25HC1 • C2H4O2 (719,14):

Ber.: C 53,43; H 6,45; N 11,68; Cl 6,16;

Gef.: C 53,48; H 6,47; N 11,62; Cl 6,50.

Aminosäureanalyse, gefunden, Tyr 1,00, Ala 1,99, Phe 1,01.

Beispiel 6

Herstellung von L-Tyrosyl-D-alanyl-glycyl-L-phenyl-alanyl-L-Nalpha-methyl-S-ethyl-cysteinylamid-acetat

A. Nalpha-tert.-Butyloxycarbonyl-S-ethyl-L-cystein, Di-cyclohexylaminsalz

Zu einer Mischung aus 400 ml N,N-Dimethylformamid (DMF) und 50 g (0,336 Mol) L-(S-Ethyl)-cystein werden 44,8 ml (0,336 Mol) Tetramethylguanidin und 66,8 ml (0,336 Mol) Dicyclohexylamin gegeben. Dann werden tropfenweise 68 ml (0,50 Mol) tert.-Butylazidoformiat innerhalb einer Stunde zugegeben und die Mischung wird 48 Stunden bei Zimmertemperatur gerührt. Das ausgefallene Dicyclohexyl-ammoniumazid wird abfiltriert und das Filtrat wird im Vakuum eingedampft. Der Rückstand wird mit Ether und Wasser geschüttelt, und der pH-Wert der wässrigen Schicht wird auf 8,0 eingestellt. Die organische Schicht wird abgetrennt und verworfen. Die wässrige Schicht wird mit kalter verdünnter Salzsäure bis pH 2,0 angesäuert und mit kaltem Ethylacetat extrahiert. Die Ethylacetatlösung wird mit Wasser gewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet und im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wird in Ether gelöst, worauf 66,8 ml (0,336 Mol) Dicyclohexylamin zugegeben werden. Der so erhaltene Niederschlag wird abgetrennt und aus Ethylacetat umkristallisiert, wodurch 32,8 g (23% der

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10

15

20

25

30

35

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45

50

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65

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Theorie) der in der Überschrift genannten Verbindung vom F. = 156 bis 159°C erhalten werden.

[alphaß5 -1,1° (C = 1, MeOH); [alpha$5 -7,7° (C = 1, MeOH).

Analyse, C22H42N2O4S (430,6):

Ber.: C 61,36; H 9,83; N 6,51;

Gef.: C 61,37; H 9,98; N 6,26.

B. NJ,Pha-tert.-Butyloxycarbonyl-N-methyl-S-ethyl-L-cysteinylamid

Eine Mischung aus 50 ml trockenem Tetrahydrofuran (THF) und 18,58 g (74,3 mMol) Nalpha-tert.-Butyloxycar-bonyl-S-ethyl-L-cystein (hergestellt durch Neutralisation des nach Teil A erhaltenen Produkts und Extraktion mit Ethylacetat) wird tropfenweise in 30 Minuten unter Rühren zu einer Suspension von 42,45 g einer Kaliumhydridsuspension (22,1% KH in Mineralöl; 0,234 Mol KH) in 375 ml THF von 0°C und einem 18-Kron-6-ethergehalt von 0,35 g gegeben. 9,25 ml (0,149 Mol) Methyliodid in 20 ml THF werden in 15 bis 20 Minuten tropfenweise zugesetzt. Die Mischung wird 1,5 Stunden bei 0°C gerührt, worauf 7,5 ml Essigsäure in 7,5 ml THF tropfenweise und danach 5 ml Ethanol zugegeben werden. Das so erhaltene Reaktionsgemisch wird auf Eis gegossen, und der pH-Wert wird mit 2n Natriumhydroxid auf etwa 9 eingestellt. Die erhaltene wässrige Lösung wird mit Ether extrahiert, der pH-Wert der wässrigen Schicht wird durch Zugabe von fester Citronensäure auf 3 eingestellt, worauf dreimal mit je 300 ml Ether extrahiert wird. Die Etherextrakte werden vereinigt, mit Wasser extrahiert, über Magnesiumsulfat getrocknet und im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wird in 200 ml Ether gelöst und mit 9,56 ml (74,3 mMol) d(+)-alpha-Methylbenzylamin versetzt. Nach Abkühlen und Zugabe von 500 ml Petrolether erfolgt keine Kristallisation. Deshalb wird die Lösung im Vakuum eingeengt, und der Rückstand wird in Petrolether gelöst. Die Mischung wird auf -78°C abgekühlt, wodurch sich eine kleine Menge eines Niederschlags bildet, der durch Filtrieren gewonnen wird (2,74 g). Die Mutterlauge wird im Vakuum eingeengt, und der Rückstand wird in Ether gelöst, die Ether-lösung wird mit In Citronensäure und mit Wasser extrahiert, über Magnesiumsulfat getrocknet und im Vakuum eingeengt, wodurch 6,56 g (33% der Theorie) eines Sirups erhalten werden.

[alphaß5 -61,1°,(C= 1,EtOH);NMR(CDCb)delta2,90, N-CHj; delta 1,45, t-Bu; delta 4,9-4,5, CH.

6,5 g (0,025 Mol) des Produkts werden in 80 ml DMF gelöst und auf -15°C abgekühlt. Nach Zugabe von 3,6 ml (0,027 Mol) Isobutylchlorformiat werden 2,99 ml (0,027 Mol) N-Methylmorpholin zugegeben. Die Mischung wird 10 Minuten bei - 15°C gerührt, wonach 1 Stunde wasserfreies Ammoniak in die Reaktionsmischung eingeleitet wird. Die Mischung wird noch weitere 4 Stunden bei — 15°C gerührt und dann auf eine Mischung aus Eis und In Natriumbicarbonat gegossen. Die kalte wässrige Mischung wird mit Ether extrahiert und der Etherextrakt wird seinerseits mit kalter 0,75n Citronensäure und Wasser gewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet und im Vakuum eingeengt, wodurch ein Rückstand erhalten wird, der aus einer Mischung von Ether mit Petrolether umkristallisiert wird und 1,7 g (26%) der in der Überschrift genannten Verbindung vom F. = 56 bis 59°C ergibt.

N-CH3; delta 1,46, t-Bu; delta 4,9-4,5, alpha-CH.

Analyse, C11H21N2O3S (261,36):

5

Ber.: C 50,55; H 8,10; N 10,72;

Gef.: C 50,56; H 7,93; N 10,51.

C. Na|Pha-tert.-Butyloxycarbonyl-L-phenylalanyl-Na,Pha-10 methyl-S-ethyl-L-cysteinylamid

In eine Mischung aus 20 ml Eisessig, 1 ml Triethylsilan, 4 ml Anisol und 2,5 g (9,5 mMol) Nalplia-tert.-Butyloxycar-bonyl-NaIPha-methyl-S-ethyl-L-cysteinylamid wird 30 Minuten trockener Chlorwasserstoff eingeleitet, worauf 15 Ether zur Fällung des Hydrochlorids zugesetzt wird. Der Niederschlag (1,8 g) wird in 25 ml DMF gelöst, und nach Abkühlen auf 0°C mit 1,31 ml Triethylamin neutralisiert. 2,65 g (0,01 Mol) Na|Pha-tert.-Butyloxycarbonyl-L-phenyl-alanin und danach 1,35 g (0,01 Mol) HBT und 2,06 g (0,01 20 Mol) DCC werden zugegeben. Die erhaltene Mischung wird 2 Stunden bei 0°C und dann 24 Stunden bei Zimmertemperatur gerührt. Anschliessend wird sie auf 0°C abgekühlt und vom gebildeten Niederschlag abfiltriert. Das Filtrat wird im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wird in Ethylacetat 25 gelöst, und diese Lösung wird mit In Natriumbicarbonat, Wasser, 0,75n Citronensäure und Wasser extrahiert. Nach Trocknen über Magnesiumsulfat wird das Lösungsmittel im Vakuum entfernt. Der hinterbleibende Sirup wird in Chloroform gelöst, und die Lösung wird auf eine 3 x45 cm messende 30 Säule von Kieselgel (Grade 62 Grace and Davidson) aufgebracht. Die Elution erfolgt mit Chloroform und abgestuften Chloroformmethanolmischungen [CHCh^-CHCL/MeOH (9:1)] und die Lage des Produkts wird durch das TLC-Profil der Fraktionen festgestellt. Die entsprechenden Fraktionen 35 werden vereinigt und im Vakuum eingedampft, wodurch 3,0 g der in der Überschrift genannten Verbindung erhalten werden.

[alphaß5 -77° (C = 0,5, MeOH).

Analyse, C20H31N3O4S (409,5):

Ber.: C 58,65; H 7,63; N 10,26; 45 Gef.: C 58,87; H 7,41; N 9,81.

D. Na|Pha-tert.-Butyloxycarbonyl-L-tyrosyl-D-alanyl-glycin, Dicyclohexylaminsalz 50 Das Produkt der Hydrogenolyse (nach Teil E von Beispiel 1) von 46,80 g Benzyl-Na|Pha-tert.-butyloxycarbonyl-0-benzyl-L-tyrosyl-D-alanyl-glycinat wird in 150 ml Isopropyl-alkohol gelöst und mit 16 ml (0,081 Mol) Dicyclohexylamin versetzt. Ether wird bis zu einem Gesamtvolumen von etwa 55 1,51 zugesetzt. Die halbfeste Masse wird verrieben bis sie fest wird, und der erhaltene Niederschlag wird gewonnen und getrocknet, wodurch 46,04 g (98%) Substanz vom F. = 194,5 bis 197°C erhalten werden. Diese Substanz wird in 100 ml siedendem Methanol gelöst, worauf 500 ml Isopropylalkohol 60 zugegeben werden. Das Volumen der Lösung wird unter Stickstoff auf etwa 150 ml verringert. Nach dem Abkühlen setzt Kristallisation ein. Die Mischung wird über Nacht stehengelassen, und der Niederschlag wird gesammelt und getrocknet, wodurch 41,44 g (88%) der in der Überschrift 65 genannten Verbindung vom F. = 198 bis 200,5°C erhalten werden.

[alphaß5 -127,6° (C = 0,5, CHCb); NMR(CHCh) delta 2,80, [alphaß5 +17,9° (C = 1, MeOH).

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Analyse, C31H50N4O7 (590,8):

Ber.: C 63,03; H 8,53; N 9,48;

Gef.: C 62,95; H 8,77; N 9,20.

E. NJ|Phil-tert.-Butyloxycarbonyl-L-tyrosyl-D-alanyl-gIycyl-L-phenylalanyl-Na,pha-methyl-s-ethyl-L-cysteinylamid

Zu einer Mischung aus 20 ml Eisessig, 3 ml Anisol und 3 ml Triethylsilan werden 2,5 g (6,1 mMol) des nach Teil C erhaltenen Produkts gegeben. Trockener Chlorwasserstoff wird 25 Minuten in die Mischung eingeleitet. Nach Zugabe von Ether wird die Mischung gekühlt und filtriert, wodurch 1,9 g (5,5 Mol) des Hydrochlorids erhalten werden. Das Salz wird in 25 ml DMF gelöst, und nach Abkühlen mit 3,2 g (5,5 mMol) des Dicyclohexylaminsalzes von Nalpha-tert.-ButyIoxycarbonyi-L-tyrosyl-D-alanyl-glycin versetzt. Die so erhaltene Mischung wird 10 Minuten bei 0°C gerührt, worauf 0,74 g (5,5 mMol) HBT und 1,1g (5,5 mMol) DCC zugegeben werden. Das Reaktionsgemisch wird 2 Stunden bei 0°C und 48 Stunden bei 4°C gerührt. Der gebildete Niederschlag wird abfiltriert, und das Filtrat wird im Vakuum eingedampft. Der Rückstand wird in Ethylacetat gelöst, und die Lösung wird mit In Natriumbicarbonat, Wasser, 0,75n Citronensäure und Wasser extrahiert. Die organische Schicht wird über Magnesiumsulfat getrocknet und im Vakuum eingedampft,

wodurch 3,5 g der rohen, in der Überschrift genannten Verbindung erhalten werden. Das Produkt wird in Chloroform gelöst und auf eine 3x45 cm messende Säule aus Kieselgel (Grade 62 Grace and Davidson) aufgebracht, worauf mit Chloroform und abgestuften Chloroformmethanolmischungen [CHCb-CHCh/MeOH (9:1)] eluiert wird. Die Fraktionen werden entsprechend ihren Dünnschichtchroma-togrammen vereinigt und im Vakuum eingeengt, wodurch 2,4 g (62%) der reinen, in der Überschrift angegebenen Verbindung, erhalten werden.

[alphaß -30,7° (C = 0,5, MeOH).

Analyse, Cm^sNóOsS (700,86):

Ber.: C 58,27; H 6,90; N 11,99;

Gef.: C 58,14; H 6,98; N 11,94.

Aminosäureanalyse, gefunden: Tyr 1,01, Ala 1,00, Gly 1,00, Phe 0,98, NH31,09.

F. L-Tyrosyl-D-alanyl-glycyI-L-phenylalanyl-L-Naipha-methyl-S-ethyl-cysteinylamid-acetat

In einer Mischung aus 20 ml Eisessig, 2 ml Anisol, 2 ml Triethylsilan und 2,2 g (3 mMol) des nach Teil E erhaltenen Produkts wird 25 Minuten trockener Chlorwasserstoff eingeleitet. Nach Zugabe von Ether wird abgekühlt. Der gebildete Niederschlag wird abfiltriert und getrocknet (2,0 g). 1,2 g des Niederschlags werden durch Versetzen mit einer Pufferlösung (1% Pyridin und 0,05% Essigsäure in Wasser) bis zu einem Gesamtvolumen von 10 ml gelöst, und die Lösung wird auf eine 2,5x99 cm messende Säule aus DEAE-Sephadex A 25 (Acetat), das zuvor mit dem gleichen Puffer äquilibriert worden ist, aufgebracht. Das Eluat wird bei 280 nm überwacht, und die einander entsprechenden Fraktionen werden vereinigt und lyophilisiert. Erneutes Lyophilisieren aus 10% Essigsäure und dann aus Wasser/Acetonitril (75:25) ergibt 0,59 g der in der Überschrift genannten Verbindung.

[alphaß5 +9,9° (C = 0,5, In HCl).

Analyse, Cj.^NöOsS (660,79):

Ber.: C 56,35; H 6,71; N 12,72; S 4,85;

Gef.: C 56,63; H 6,72; N 12,63; S 4,69.

Aminosäureanalyse, gefunden: Tyr 1,00, Ala 1,01, Gly 1,00, Phe 0,98, NH31,09.

s Beispiel 7

Herstellung von L-Tyrosyl-D-alanyl-glycyl-L-phenyl-alanyl-Nalpha-methyl-L-leucylamid-acetat

A. Nalf,ha-tert.-Butyloxycarbonyl-Nalpha-methyl-L-leucin, 10 d(+)-alpha-Methylbenzylaminsalz

Eine Mischung aus 20 ml Ether und 12,5 g (0,05 Mol) Nalpha-tert.-ButyloxycarbonyI-L-leucin-hydrat wird über Magnesiumsulfat getrocknet und im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wird in 75 ml THF gelöst, und die Lösung wird 15 tropfenweise in 35 Minuten unter mechanischem Rühren zu einer auf 0°C abgekühlten Suspension von 27,9 g einer Kaliumhydridsuspension (22,1% in Mineralöl; 0,154 Mol KH) in 200 ml THF mit einem 18-Kron-6- Ethergehalt von 0,25 g gegeben. Dann werden innerhalb von 15 Minuten 6,4 ml 20 Methyliodid in 10 ml THF zugesetzt. Die Mischung wird 3 Stunden bei 0°C gehalten, worauf zunächst 5 ml Essigsäure in 5 ml THF tropfenweise und dann 5 ml Ethanol zugegeben werden. Die so erhaltene Mischung wird auf 500 ml Eis gegossen, und der pH der Mischung wird durch Zugabe von 25 In Natriumhydroxid auf etwa 9 eingestellt. Die wässrige Lösung wird mit Ether extrahiert, und dann durch Zugabe von fester Citronensäure bis zu einem pH-Wert von 3 angesäuert. Die angesäuerte wässrige Suspension wird mit Ether extrahiert. Die vereinigten Etherextrakte werden mit Wasser 30 gewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet und im Vakuum eingeengt, wodurch 13,2 g (107% der Theorie) Rohprodukt erhalten werden. Die Prüfung des Produkts durch TLC ergibt, dass noch etwas nichtumgesetztes Ausgangsmaterial vorhanden ist. Das Produkt wird in Ether gelöst und 35 mit 5,25 ml (0,05 Mol) tert.-Butylamin versetzt. Die etherische Lösung wird mit Petrolether verdünnt und über Nacht gekühlt. Es bildet sich ein Niederschlag (5,4 g), der entfernt wird. Das Filtrat wird mit In Citronensäure und dann mit Wasser extrahiert. Nach Trocknen über Magnesiumsulfat 40 und Einengen im Vakuum wird der Rückstand (6,45 g) in 100 ml Ether gelöst, worauf 3,39 g (0,026 Mol) d(+)alpha-Methylbenzylamin zugegeben werden. Die Lösung wird über Nacht gekühlt und filtriert, wodurch 9,09 g (49% der Theorie) der in der Überschrift genannten Verbindung vom F. = 120 45 bis 122°C erhalten werden.

[alphaß5 -14,1° (C = 1, MeOH).

Analyse, C20H34N2O4 (366,5):

50

Ber.: C 65,54; H 9,35; N 7,64;

Gef.: C 65,83; H 9,05; N 7,35.

B. Nalpha-tert.-Butyloxycarbonyl-Nalpha-methyl-L-leucyl-55 amid

Eine Mischung aus 80 ml DMF und 11,5g (0,047 Mol) NalPha-tert.-Butyl0XyCarb0nyl-Na'Pha-methyl-L-leucin (hergestellt durch Neutralisation des Produkts von Teil A mit Citronensäure und Extraktion mit Ether) wird auf — 15°C abge-60 kühlt. Nach Zugabe von 6,7 ml (0,052 Mol) Isobutylchlorformiat und 5,7 ml (0,052 Mol) N-Methylmorpholin wird die Mischung 10 Minuten bei -15°C gerührt, worauf wasserfreies Ammoniak 1 Stunde in das Reaktionsgemisch eingeleitet wird. Das Rühren wird noch 4 Stunden bei -15°C 65 fortgesetzt. Dann wird das Reaktionsgemisch auf eine Mischung aus In Natriumbicarbonat und Eis gegossen. Die kalte Mischung wird mit Ether extrahiert und der Etherex-trakt wird mit 0,75n Citronensäure und Wasser extrahiert,

19

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über Magnesiumsulfat getrocknet und im Vakuum einge- MeO H (9:1 )] eluiert wird. Die Fraktionen werden entspre-

dampft. Der Rückstand wird aus einer Mischung aus Ether chend dem TLC-Profil vereinigt. Durch Verdampfen des und Petrolether zur Kristallisation gebracht und ergibt 5,5 g Lösungsmittels werden 2,3 g (67%) der in der Überschrift (48%) der in der Überschrift genannten Verbindung vom F. = genannten Verbindung erhalten.

127 bis 128°C. s

[alphag -17,5° (C = 0,6, MeOH).

[alpha]b5 -42,2° (C = 1, MeOH).

Analyse, CasHsoNóOs (682,8):

Analyse, C12H24N2O3 (244,3):

10 Ber.: C 61,57; H 7,38; N 12,31;

Ber.: C 58,99; H 9,90; N 11,47; Gef.: C 61,33; H 7,47; N 12,08.

Gef.: C 59,17; H 9,66; N 11,21.

Aminosäureanalyse, gefunden: Tyr 1,00, Ala 1,01, Gly 0,99,

C. Naiphil-tert.-Butyloxycarbonyl-L-phenylalanyl-Nalpha- Phe 1,00, NH31,08.

methyl-L-leucylamid is

Zu einer Mischung aus 30 ml Eisessig, 3 ml Anisol und 3 ml E. L-Tyrosyl-D-alanyl-glycyl-L-phenylalanyl-Nalpha-Triethylsilan werden 5,0 g (0,02 Mol) des nach Teil B erhal- methyl-L-leucylamid-acetat tenen Produkts gegeben. Dann wird 25 Minuten trockener Zu 5 ml Ameisensäure, die 0,5 ml Anisol und 0,1 ml Tri-

Chlorwasserstoff eingeleitet, Äther zugegeben und die ethylsilan enthalten, werden 1,8 g (0,003 Mol) des nach Teil

Mischung gekühlt. Der Niederschlag wird gewonnen und 20 D erhaltenen Produkts gegeben. Die Mischung wird 3 getrocknet (3,6 g). Das so erhaltene Hydrochlorid wird in Stunden bei Zimmertemperatur gerührt. Dann wird sie mit

60 ml DMF gelöst, und die Lösung wird auf 0°C abgekühlt Ether verdünnt und 1 Stunde stehengelassen. Der Ether wird und mit 3,99 ml (0,02 Mol) Dicyclohexylamin versetzt. Die von dem gebildeten Öl abdekantiert, und das Öl wird in Mischung wird 10 Minuten bei 0°C gerührt, worauf zunächst Ethanol gelöst. Durch Zugabe von Ether bildet sich ein 5,3 g (0,02 Mol) Nalpl,;,-tert.-Butyloxycarbonyl-L-phenyl- 2s Niederschlag, der abfiltriert und getrocknet wird, wodurch alanin und dann 2,7 g (0,02 Mol) H BT und 4,12 g (0,02 Mol) 0,9 g der rohen in der Überschrift angegebenen Verbindung DCC zugegeben werden. Das Reaktionsgemisch wird 2 erhalten werden. Das Produkt wird durch Zugabe einer Puf-

Stunden bei 0°C und dann 24 Stunden bei Zimmertemperatur ferlösung (1% Pyridin und 0,05% Ameisensäure in Wasser) gerührt. Nach Abkühlen auf 0°C und Filtrieren wird das Fil- bis zu einem Gesamtvolumen von 5,0 ml gelöst. Die Lösung trat im Vakuum eingedampft. Der Rückstand wird in Ethyl- 30 wird auf eine 2,5 x 100 cm messende Säule aus DE AE-acetat gelöst und die Lösung wird mit 1 n Natriumbicarbonat, Sephadex A-25 (Formiat) aufgegeben und wird mit der Wasser, 0,75n Citronensäure und Wasser extrahiert. Nach gleichen Pufferlösung eluiert. Auf der Grundlage der UV-Trocknen über Magnesiumsulfat wird das Lösungsmittel im Überwachung (280 nm) zusammengehörende Fraktionen Vakuum verdampft. Der erhaltene Rückstand wird in Chlo- werden vereinigt und lyophilisiert. Durch erneutes Lyophili-roform gelöst und auf eine 3x45 cm messende Säule aus Kie- 35 sieren aus lOprozentiger Essigsäure und aus einer Mischung selgel (Grade 62 Grace and Davidson) aufgegeben. Die Elu- von Wasser und Acetonitril im Verhältnis 75:25 werden tion erfolgt mit Chloroform und abgestuften Chloroform- 0,852 g der in der Überschrift angegebenen Verbindung methanolgemischen [CHCb-»CHCb/MeOH (9:1)]. Die erhalten.

Fraktionen werden aufgrund ihres TLC-Profils vereinigt und nach Verdampfen des Lösungsmittels werden 5,7 g (73%) der 40 [alphalg +23,2° (C = 0,6, In HCl).

in der Überschrift genannten Verbindung erhalten.

Aminosäureanalyse, gefunden: Tyr 1,02, Ala 1,00, Gly 1,01, [alphaJn -49,5° (C = 0,5, MeOH); NMR (CDCb) delta 1,4, Phe 0,96, NHs 1,03.

t-Bu; delta 7,25, Phenyl; delta 0,95 bis 0,75, CH(CH3):; delta

2,7, N-CH3. 45 Beispiel 8

Herstellung von L-Tyrosyl-D-alanyl-glycyl-L-phenyl-

D. Nalpha-tert.-Butyloxycarbonyl-L-tyrosyl-D-alanyl- alanyl-S-p-methoxybenzyl-L-cysteinylamid-hydrochlorid glycyl-L-phenylalanyl-Naipha-methyl-L-leucylamid

Eine Mischung aus 20 ml 1 n HCl in Eisessig, 1 ml Anisol A. Nalpha-tert.-Butyloxycarbonyl-S-p-methoxybenzyl-L-

und 2,0 g des nach Teil C erhaltenen Produkts wird 30 50 cysteinylamid

Minuten bei Zimmertemperatur stehengelassen und dann mit Zu 80 ml auf -15°C gekühltes DMF werden 6,82 g (0,02 Ether versetzt. Die Mischung wird abgekühlt, und der gebil- Mol) Nalpha-tert.-Butyloxycarbonyl-S-p-methoxy-benzyl-L-dete Niederschlag wird abfiltriert und getrocknet ( 1,63 g). cystein gegeben. Die erhaltene gekühlte Mischung wird mit Das so erhaltene Hydrochlorid wird in 30 ml DMF gelöst, 2,88 ml (0,022 Mol) Isobutylchlorformiat und 2,42 ml (0,022 und 2,95 g (0,05 Mol) Nalpha-tert.-Butyloxycarbonyl-L- 55 Mol) N-Methylmorpholin versetzt. 10 Minuten später wird tyrosyl-D-alanyl-glycin, Dicyclohexylaminsalz werden zuge- 1,5 Stunden wasserfreies Ammoniak in das Reaktionsgegeben. Die Mischung wird 15 Minuten bei 0°C gerührt und misch geleitet. Das Rühren wird bei — 15°C noch weitere 2 dann mit 0,675 g (0,005 Mol) HBT und 1,3 g (0,005 Mol) Stunden fortgesetzt. Das Reaktionsgemisch wird in eine

DCC versetzt. Das Reaktionsgemisch wird 24 Stunden bei Mischung aus Eis und In Natriumbicarbonat gegossen, und 4°C gerührt. Der gebildete Niederschlag wird abfiltriert, und 60 die so erhaltene wässrige Suspension wird mit Ethylacetat das Filtrat wird im Vakuum eingeengt. Eine Lösung des extrahiert. Der Ethylacetatextrakt wird mit Wasser, 0,75n

Rückstands in Ethylacetat wird mit In Natriumbicarbonat, Citronensäure und Wasser gewaschen, über Magnesium-Wasser, 0,75n Citronensäure und Wasser extrahiert. Nach sulfat getrocknet und im Vakuum eingeengt. Durch Umkri-Trocknen über Magnesiumsulfat wird die Ethylacetatlösung stallisieren des Rückstands aus einer Mischung aus Ethanol im Vakuum eingeengt. Eine Lösung des erhaltenen Rück- 65 und Wasser werden 4,9 g (72%) der in der Überschrift angege-stands in Chloroform wird auf eine 3 x45 cm messende Säule benen Verbindung vom F. = 138 bis 140°C erhalten, aus Kieselgel (Woelm Grade III) aufgegeben, die mit Chloroform und abgestuften Methanolgemischen [CHCb—CHCb- [alpha]?,5 -12,8° (C = 5, MeOH).

636847

20

Analyse, C16H24N2O4S (340,4):

Ber.: C 56,45; H 7,11; N 8,23;

Gef.: C 56,58; H 6,97; N 8,07.

B. Nalpha-tert.-Butyloxycarbonyl-L-phenyIalanyl-S-p-me-thoxy-benzyl-L-cysteinylamid

In einer Lösung von 4,1 g (0,012 Mol) des nach Teil A erhaltenen Produkts in 45 ml Eisessig, 5 ml Anisol und 5 ml Triethylsilan wird wasserfreier Chlorwasserstoff eingeleitet. Nach 20 Minuten wird Ether zugegeben, und der gebildete Niederschlag wird abfiltriert und getrocknet. Das Hydrochlorid (3,3 g) wird in 50 ml DMF gelöst, worauf 2,92 g (0,012 Mol) Dicyclohexylamin, 3,19 g (0,012 Mol) Nalpha-tert.-Butyl-oxycarbonyl-L-phenylalanin und 1,62 g (0,012 Mol) HBT zugegeben werden. Die Mischung wird 10 Minuten bei 0°C gerührt und dann mit 2,47 g (0,012 Mol) DCC versetzt. Nach 2 Stunden bei 0°C wird das Reaktionsgemisch 24 Stunden bei Zimmertemperatur gerührt und wiederum auf 0°C abgekühlt. Der gebildete Niederschlag wird abfiltriert, und das Filtrat wird im Vakuum eingeengt, wonach der erhaltene Rückstand in n-Butylalkohol gelöst wird. Die Lösung wird mit In Natriumbicarbonat und Wasser extrahiert, über Magnesiumsulfat getrocknet und im Vakuum eingedampft. Der Rückstand wird aus Ethanol umkristallisiert und ergibt 4,95 g (85%) der in der Überschrift angegebenen Verbindung vom F. = 175 bis 178°C.

[alpha® -35,1° (C = 0,5, DMF).

Analyse, C25H33N3O5S (487,6):

Ber.: C 61,58; H 6,82; N 8,62;

Gef.: C 61,78; H 6,78; N 8,28.

C. Nalpha-tert.-Butyloxycarbonyl-L-tyrosyl-D-alanyl-glycyl-L-phenylalanyl-S-p-methoxybenzyl-L-cysteinylamid

In eine Lösung von 1,3 g (0,027 Mol) des nach Teil B erhaltenen Produkts in 40 ml Eisessig, 4 ml Anisol und 4 ml Triethylsilan wird wasserfreier Chlorwasserstoff eingeleitet. Nach 20 Minuten wird Ether zugegeben, und der gebildete Niederschlag wird abfiltriert und getrocknet. Das so erhaltene Hydrochlorid (1,1g) wird in 10 ml DMF gelöst, und die Mischung wird auf 0°C abgekühlt. 0,34 ml (0,0026 Mol) Triethylamin werden zugegeben. 10 Minuten später werden 1,06 g (0,0026 Mol) Nalpha-tert.-Butyloxycarbonyl-L-tyrosyl-D-alanyl-glycin und danach 0,35 g (0,0026 Mol) HBT und 0,536 g (0,0026 Mol) DCC zugegeben. Das so erhaltene Reaktionsgemisch wird 2 Stunden bei 0°C und dann 72 Stunden bei 4°C gerührt. Der gebildete Niederschlag wird abfiltriert und das Filtrat wird im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wird in Ethylacetat gelöst, und diese Lösung wird mit In Natriumbicarbonat, Wasser, 0,75n Citronensäure und Wasser extrahiert. Nach Trocknen über Magensiumsulfat wird der Extrakt im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wird in Methylacetat gelöst und durch Chromatographieren an einer Säule aus Kieselgel (Grace and Davidson Grade 62) gereinigt. Fraktionen werden auf der Grundlage des TLC-Profils vereinigt und eingedampft, wodurch nach Kristallisation aus einem kleinen Volumen Ethylacetat 1,1g (52%) der in der Überschrift genannten Verbindung erhalten werden.

[alpha]?,5 -4,3° (C = 0,5, DMSO).

Analyse, CssHsoNeOS (778,9):

Ber.: C 60,14; H 6,47; N 10,79;

Gef.: C 59,95; H 6,24; N 10,53.

Aminosäureanalyse, gefunden: Tyr 0,98, Ala 1,03, Gly 1,01, Phe 0,98, NH3 0,99.

D. L-Tyrosyl-D-alanyl-glycyl-L-phenylalanyl-S-p-metho-xybenzyl-L-cysteinylamid-hydrochlorid

Zu 20 ml Eisessig, die 0,5 ml Anisol enthalten, werden 0,90 g (0,0012 Mol) des nach Teil C erhaltenen Produkts gegeben. Dann wird 30 Minuten lang trockener Chlorwasserstoff eingeleitet. Durch Lyophilisieren der Mischung werden 0,862 g (100%) der in der Überschrift angegebenen Verbindung erhalten.

[alphajg +2,6° (C = 0,5, In HCl).

Analyse, C34H43N6O7S (715,2):

Ber.: C 57,09; H 6,06; N 11,75; Cl 4,96;

Gef.: C 56,85; H 6,06; N 11,48; Cl 5,21.

Aminosäureanalyse, gefunden: Tyr 0,99, Ala 1,01, Gly 1,01, Phe 0,98, NH3 0,99.

Beispiel 9

Herstellung von L-Tyrosyl-D-alanyl-glycyl-L-phenyl-alanyl-Nalpha-methyl-L-methionylamid-acetat

A. Nalpha-tert.-Butyloxycarbonyl-Nalpha-methyl-L-me-thionin, d(+)alpha-Methylbenzy laminsalz

86,13 g (0,02 Mol) des Dicyclohexylaminsalzes von Nalpha-tert.-Butyloxycarbonyl-L-methionin werden in 600 ml kaltem Ether suspendiert. Die Suspension wird viermal mit 100 ml kalter l,5n Citronensäure und Wasser extrahiert. Die organische Schicht wird abgetrennt, über Magnesiumsulfat getrocknet und im Vakuum eingeengt. Eine Lösung des Rückstands in 150 ml THF wird tropfenweise in 30 Minuten unter mechanischem Rühren zu einer Suspension von 0,6 Mol Kaliumhydrid in 1000 ml trockenem THF (0°C) mit einem 18-Kron-6-Ethergehalt von 1,0 g gegeben. 25 ml (0,4 Mol) Methyliodid werden tropfenweise in 15 Minuten zugesetzt. Zwei Stunden später wird tropfenweise eine Mischung aus 20 ml Essigsäure und 20 ml THF und danach 40 ml Ethanol zugegeben. Die Mischung wird 30 Minuten gerührt und dann auf 21 Eis gegossen. Der pH-Wert der wässrigen Mischung wird mit 2n Kaliumhydroxid auf 7 eingestellt. Dann wird dreimal mit 400 ml Ether extrahiert und mit fester Säure bis zu einem pH-Wert von 3 angesäuert. Diese Mischung wird dreimal mit 500 ml Ether extrahiert. Die Etherextrakte werden vereinigt, extrahiert, über Magnesiumsulfat getrocknet und im Vakuum bis zu einem Sirup eingedampft. Der Sirup (44,76 g, 84% der Theorie) wird in 450 ml Ethylacetat gelöst und mit 25,78 ml (0,2 Mol) d(+)alpha-Methylbenzylamin versetzt. Nach Abkühlen und Kratzen setzt Kristallisation ein. Die in der Überschrift genannte Verbindung wird durch Filtrieren gewonnen, und man erhält 51,05 g (66%) Substanz vom F. = 131 bis 134°C.

[alpha]" -18,9° (C = 1, EtOH).

Analyse, C19H32N2O4S (384,54):

Ber.: C 59,35; H 8,39; N 7,29;

Gef.: C 59,15; H 8,12; N 7,21.

B. Nalpha-tert.-Butyloxycarbonyl-Nalpha-methyl-L-me-thionylamid

33,3 g (0,127 Mol) Nalpha-tert.-Butyloxycarbonyl-Nalpha-

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

21

636847

methyl-L-methionin (hergestellt durch Ansäuern des nach Teil A erhaltenen d(+)alpha-Methylbenzylaminsalzes und Extraktion mit Ether) werden in 160 ml DMF gelöst. Die Lösung wird auf -15°C abgekühlt und mit 18,3 ml (0,14 Mol) Isobutylchlorformiat und 15,4 ml (0,14 Mol) N-Methylmor- 5 pholin versetzt. Die Mischung wird 10 Minuten bei —15°C gerührt, worauf 1 Stunde wasserfreies Ammoniak durch ein Gasverteilungsrohr eingeleitet wird. Das Reaktionsgemisch wird 4 Stunden bei -15°C gerührt und dann in 300 ml kalte In NaHCCh-Lösung gegossen. Die wässrige Suspension wird io mit Ether extrahiert, und der Etherextrakt wird mit Wasser, kalter 0,75n Citronensäure und Wasser gewaschen, über MgSC>4 getrocknet und im Vakuum zu einem Sirup eingedampft. Dieser Sirup wird aus Ether-Petrolether umkristallisiert, wodurch 16 g (48%) der in der Überschrift angegebenen is Verbindung vom F. = 75 bis 77°C erhalten werden.

[alphag -117,3° (C = 0,5, CHCb).

gedampft. Eine Lösung des Rückstands in Ethylacetat wird nacheinander mit In wässrigem Natriumbicarbonat, Wasser, kalter 0,75n Citronensäure und Wasser gewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet und im Vakuum eingedampft. Der Rückstand wird an Kieselgel (Grace and Davidson G-62) chromatographiert und ergibt 4,1 g (69%) der in der Überschrift angegebenen Verbindung.

[alpha]" -13,1° (C = 0,5, MeOH).

Analyse, C34H48N0O8S (700,86):

Ber.: C Gef.: C

58,27; 58,05;

H 6,90; N H 6,62; N

11,99; 11,73.

Analyse, C1.H22N2SO3 (262,37):

Ber.: C 50,36; H 8,45; N 10,68;

Gef.: C 50,63; H 8,57; N 10,45.

C. Nalpha-tert.-ButyIoxycarbonyl-L-phenylalanyl-Nalpha-methyl-L-methionylamid

In ein Gemisch aus 70 ml Eisessig, 5 ml Anisol, 7 ml Triethylsilan und 13,5 g (0,05 Mol) des nach Teil B erhaltenen Produkts wird 25 Minuten wasserfreier Chlorwasserstoff eingeleitet. Danach wird die Mischung in Ether gegossen, und der gebildete Niederschlag wird abfiltriert und getrocknet. Das so erhaltene Hydrochlorid (9,9 g) wird in 200 ml DMF gelöst, auf 0°C abgekühlt und mit 9,9 ml (0,05 Mol) Dicyclohexylamin versetzt. Nach 10 Minuten langem Rühren werden 6,8 g 0,05 Mol HBT, 13,3 g (0,05 Mol) Nalpha-tert.-Butyloxy-carbonyl-L-phenylalanin und 10,3 g (0,05 Mol) DCC zugegeben. Die erhaltene Mischung wird 2 Stunden bei 0°C und dann 48 Stunden bei Zimmertemperatur gerührt. Nach Abkühlen auf 0°C und Filtrieren wird das Filtrat im Vakuum bis zu einem Öl eingeengt. Eine Lösung dieses Öls in Ethylacetat wird nacheinander mit In Natriumbicarbonat,

Wasser, 0,75n Citronensäure und Wasser gewaschen. Durch Trocknen über Magnesiumsulfat und Eindampfen im Vakuum wird ein Rückstand erhalten, der aus Ether kristallisiert und 16,4 g (80%) der in der Überschrift angegebenen Verbindung vom F. = 114 bis 115°C ergibt.

[alpha]b5 -43,4° (C = 0,5, MeOH).

Aminosäureanalyse, gefunden: Tyr 1,00, Ala 1,01, Gly 0,99, Phe 1,00, NH31,01.

E. L-Tyrosyl-D-alanyl-glycyl-L-phenylalanyl-Nalpl,a-20 methyl-L-methionylamid-acetat

8,3 g (0,012 Mol) des nach Teil D erhaltenen Produkts werden zu 15 ml Thioanisol gegeben und auf 0°C gekühlt. Nach Zugabe von 50 ml kaltem TFA wird die Mischung 30 Minuten bei 0°C gerührt und dann mit mehreren Volumina 25 Ether verdünnt. Durch Abfiltrieren und Trocknen des gebildeten Niederschlags werden 8 g des rohen Trifluoracetats erhalten. Dieses Salz wird durch Zugabe einer wässrigen Pufferlösung, die 1% Pyridin und 0,05% Essigsäure enthält, bis zu einem Volumen von 60 ml gelöst, und diese Lösung wird 30 auf eine 5 x 138 cm messende Säule aus Kieselgel (DEAE Sephadex A-25, Acetatform) aufgegeben, das vorher mit der gleichen Pufferlösung äquilibiert worden war. Die UV-Absorption bei 280 nm wird überwacht, und das Elutionspro-dukt zwischen 1270 und 1950 ml wird aufgefangen. Der nach 35 Lyophilisieren erhaltene Rückstand wird in etwa 200 ml In Essigsäure gelöst und diese Lösung wird lyophilisiert. Eine letzte Lyophilisierung aus Wasser/Acetonitril (3:1) ergibt 6,64 g (83%) der in der Überschrift angegebenen Verbindung.

40 [alpha]" +21,7° (C = 1, In HCl).

Analyse, C31H44N6O8S (660,79):

Ber.: C 56,35; H 6,71; N 12,72; O 19,37;

45 Gef.: C 56,50; H 6,46; N 12,62; O 19,25.

Aminosäureanalyse, gefunden: Tyr 1,00, Ala 1,01, Gly 1,00, Phe 0,99, NH31,03.

Analyse, C20H31N3O4S (409,55):

Ber.: C 58,65; H 7,63; N 10,26;

Gef.: C 58,76; H 7,42; N 10,30.

D. NJlphll-tert.-Butyloxycarbonyl-L-tyrosyl-D-alanyl-glycyl-L-phenylalanyl-Nalpha-methyl-L-methionylamid

In eine Mischung aus 20 ml Eisessig, 2 ml Anisol, 2 ml Triethylsilan und 3,5 g (8,56 mMol) des nach Teil C erhaltenen Produkts wird 25 Minuten trockener Chlorwasserstoff eingeleitet. Das Hydrochlorid wird mit Ether gefällt und abfiltriert und im Vakuum getrocknet. Eine Lösung von 5,0 g (8,47 mMol) Nalpha-tert.-Butyloxycarbonyl-L-tyrosyl-D-alanyl-glycin, Dicyclohexylaminsalz in 40 ml DMF wird auf 0°C abgekühlt und mit dem vorerwähnten Hydrochlorid versetzt. Nach einigen Minuten Rühren bei 0°C werden 1,1g (8,47 mMol) HBT und 1,7 g (8,47 mMol) DCC zugegeben. Die Mischung wird 24 Stunden bei 4°C gerührt, zur Entfernung des unlöslichen Materials filtriert und im Vakuum ein-

50 Beispiel 10

Herstellung von L-Tyrosyl-D-alanyl-glycyl-L-phenyl-alanyl-Nri-methyl-L-methionylamid-acetat.

Das gemäss diesem Beispiel hergestellte Peptid ist identisch mit dem gemäss Beispiel 9 hergestellten Peptid. In diesem 55 Falle erfolgte jedoch die Herstellung so, dass nach der Fest-phasenpeptidsynthese vorgegangen wurde, indem man das C-Ende der Peptidstruktur, also das an seiner Aminogruppe geschützte Na-Methyl-L-methionin, an ein Benzhydryl-aminharz kuppelte, die andere Aminosäuren ankuppelte und 60 in der letzten Stufe des Verfahrens das als Aminoschutz-gruppe wirkende Harz durch Behandlung mit einer trok-kenen Säure abspaltete, wobei das entsprechende Peptid mit seiner Na-methyl-L-methionylamid-endgruppierung freigesetzt wurde.

65

A) Herstellung des Trifluoressigsäuresalzes des L-Tyrosyl-D-alanyl-glycyl-L-phenylalanyl-N-methyl-L-methionyl-benzhydrylamin-harzes.

636847

22

Das im Titel genannte Peptid-harz wurde nach der automatischen Festphasensynthese in der Vorrichtung zur Peptid-synthese «Beckman 990» hergestellt, indem man 5,0 g an dem Benzhydrylaminharz einsetzte.

Das verwendete Benzhydrylaminharz wurde unter Verwendung einer 4%igen Lösung von Diisopropyläthylamin, abgekürzt als DIEA, in Methylenchlorid neutralisiert, und dann kuppelte man das an seiner freien Aminogruppe mit der tert.-Butyloxycarbonylgruppe geschützte Na-Methyl-L-me-thionin, also die Verbindung der Formel BOC-(N-Me)-Met-OH, unter Verwendung von N,N-Dicyclohexylcarbo-diimid, abgekürzt als DCC, in Methylenchlorid an das Harz an. Man erhielt dabei ein mit der Gruppierung BOC-(N-Me)-Met-NH substituiertes Harz. Dann wurden die nachfolgenden Aminosäuren nämlich L-Phenylalanin, bzw. Glycin, bzw. D-Alanin, bzw. L-Tyrosin, nacheinander in ihrer an der Aminogruppe mit der tert.-Butyloxycarbonylgruppe geschützten Form, also als BOC-Phe-OH, bzw. BOC-Gly-OH, bzw. BOC-Ala-OH, bzw. BOC-Tyr-OH angekuppelt, wobei jeweils vor der Ankupplung der nächsten Aminosäure die Aminoschutzgruppe der vorhergegangenen bereits angekuppelten Aminosäure entfernt wurde.

Die Aminosäuren BOC-Phe-OH, BOC-Gly-OH, BOC-Ala-OH und BOC-Tyr-OH wurden nacheinander angekuppelt, indem man sie zuerst nach dem weiter unten kommenden Programm Nr. 1 ankuppelte und anschliessend die gleiche Aminosäure nach dem unten erläuterten Programm Nr. 2 ankuppelte. Das Programm Nr. 2 wurde für jede der genannten Aminosäuren einmal durchgeführt, mit Ausnahme der Ankuppelung der Aminosäure L-Phenylalanin, für welche das Kupplungsprogramm Nr. 2 dreimal durchgeführt wurde. Nach der Ankuppelung der letzten Aminosäure erhielt man das an das Harz gekuppelte Pentapeptid, bei dem die Aminogruppe des L-Tyrosins noch mit der tert.-Butyloxycarbonylgruppe geschützt war. Von diesem BOC-Penta-peptid-Harz wurde die Aminoschutzgruppe nach den Verfahrensschritten 1 bis 8 des Programms Nr. 1 abgespaltet, also unter Verwendung von Trifluoressigsäure als praktisch trok-kenes Säuremedium zur Abspaltung der Aminoschutzgruppe, und man erhielt so 6,13 g der im Titel genannten Verbindung.

In den Programmen Nr. 1 und Nr. 2 wurden die Waschvorgänge durchgeführt, indem man 10 ml der jeweiligen Waschflüssigkeit pro Gramm des Harzes einsetzte.

Programm Nr. 1

1.) Dreimalige Waschung mit Methylenchlorid,

2.) 5 Minuten Behandlung mit einer Mischung aus 30 Volumen-Teilen Trifluoressigsäure + 5 Volumen-Teilen AetsSiH und 65 Volumen-Teilen Methylenchlorid,

3.) Behandlung wie in Schritt 2.), jedoch während 30 Minuten,

4.) Zweimaliges Waschen mit Methylenchlorid,

5.) Waschen mit einem 1:1 Gemisch aus Methanol plus Methylenchlorid,

6.) Zweimaliges Waschen mit Methanol,

7.) Waschen mit einer Mischung aus Methanol + Methylenchlorid im Mischungsverhältnis 1:1

8.) Zweimaliges Waschen mit Methylenchlorid,

9.) Viermaliges Behandeln während jeweils 2 Minuten mit einer Mischung aus 4% Diisopropyläthylamin in Methylenchlorid,

10.) Wiederholung der Verfahrensschritte 4.) bis einschliesslich 8.),

11.) Behandlung mit 2,5 Äquivalenten des erwünschten Aminosäurederivates in Methylenchlorid und 1,25 Äquivalenten an N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid in Methylenchlorid während 120 Minuten,

12.) Viermaliges Waschen mit Methylenchlorid,

13.) Wiederholung der Verfahrensschritte 5.) bis einschliesslich 7.),

14.) Dreimaliges Waschen mit Methylenchlorid.

s

Programm Nr. 2

1.) Viermaliges Behandeln während jeweils 2 Minuten mit 4% Diisopropyläthylamin in Methylenchlorid,

2.) Zweimaliges Waschen mit Methylenchlorid,

io 3.) Waschen mit einer Mischung aus Methanol+Methylenchlorid im Mischungsverhältnis 1:1,

4.) Zweimaliges Waschen mit Methanol,

5.) Waschen mit einer Mischung aus Methanol und Methylenchlorid im Mischungsverhältnis 1:1,

is 6.) Zweimaliges Waschen mit Methylenchlorid,

7.) Dreimaliges Waschen mit einer Mischung aus N,N-Dimethylformamid plus Methylenchlorid im Mischungsverhältnis 1:1,

8.) Behandlung mit 2,5 Äquivalenten des erwünschten

20 Aminosäurederivates in einer Mischung aus Dimethylform-amid plus Methylenchlorid im Mischungsverhältnis 1:1, und 1,25 Äquivalenten an N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid in Methylenchlorid während 120 Minuten,

9.) Viermaliges Waschen mit einer Mischung aus Di-25 methylformamid plus Methylenchlorid im Mischungsverhältnis 1:1,

10.) Wiederholung der Verfahrensschritte 4.) bis einschliesslich 6.).

30 B) Herstellung des Fluorwasserstoffsalzes des L-Tyrosyl-D-alanyl-glycyl-L-phenylalanyl-N-methyl-L-methionyl-amides.

Das aus dem Verfahrensschritt A) erhaltene Peptidharz wurde mit flüssigem wasserfreiem Fluorwasserstoff im 35 Vakuum während 60 Minuten bei 0°C unter Verwendung von Anisol als Spülmittel behandelt. Die flüchtigen Komponenten wurden aus dem Reaktionsmedium unter Vakuum entfernt, und das Peptidharz wurde mit Äther trituriert, und man filtrierte, um restliche Mengen an der Fluorwasserstoff-40 säure und dem Anisol zu entfernen. Das Peptid wurde von dem Harz entfernt, indem man mit 10%iger Essigsäure tritu-rierte, filtrierte, dreimal mit 50 ml 10%iger Essigsäure wusch und lyophilisierte, wobei man 940 mg der rohen, im Titel genannten Verbindung erhielt.

45

C) Chromatographische Reinigung zur Herstellung des Endproduktes.

470 mg des rohen Peptid-diastereomeren, das aus dem Verfahrensschritt B) erhalten wurde, wurden auf einer Säule der so Grösse 3,8cmx58,5 cm auf einem Reversephasen-(Cis)-sili-cagel bei einem Niederdruck (7,17 kg/cm2) mit 25% Essigsäu-renitril in 0,1 normalem Ammoniumacetat chromatogra-phiert. Das austretende Material wurde in 1 Minuten Fraktionen aufgesammelt, die Fraktionen der Nr. 98 bis 150 ss wurden miteinander vereinigt, und man lyophilisierte, wobei man 360 mg des Produktes erhielt.

Der Rest des rohen Peptides aus dem Verfahrensschritt B) wurde chromatographiert, wie dies im obigen Abschnitt erläutert wird, und man erhielt dabei 320 mg des Produktes. 60 Die nach den beiden obigen Abschnitten erhaltenen lyophilisierten Produkte wurden miteinander vereinigt, und man chromatographierte erneut über einer mit Sephadex G-10 gefüllten Säule einer Grösse von 2,5 cm x 10,0 cm,

wobei 0,2 normale Essigsäure als Laufmittel verwendet 65 wurde, um das Ammoniumacetat zu entfernen.

Die Fraktionen wurden lyophilisiert und man erhielt 636,7 mg des im Titel genannten Pentapeptides.

Die optische Drehung des Produktes war wie folgt:

23

636847

(a)" +19,7° (c = 0,5, in In HCl).

(cOä +71,70 (c = 0,5, in 1 n HCl).

Bei der Elementaranalyse ergab das Produkt der Summenformel C31H43N6O8S die folgenden Werte:

Ber.: C 56,35; H 6,71; N 12,72; S 4,85;

Gef.: C 56,60; H 6,43; N 12,97; S 4,92.

Die Aminosäureanalyse ergab die folgenden Werte:

Ala

Tyr

Gly

Phe

NHb

% Peptid

(1)

0,99

1,01,

1,00

1,01

1,10

93,1

(2)

1,00

1,01

1,00

0,97

1,02

90,5

Die nach dem erfindungsgemässen Verfahren hergestellten 20 neuen Peptid-derivate der Formel I und ihre pharmazeutisch annehmbaren nicht-toxischen Säureadditionssalze besitzen eine analgetische Wirksamkeit.

In der Folge werden nunmehr Tests beschrieben, mit denen die analgetische Wirksamkeit dieser Verbindungen überprüft 25 wurde.

Die analgetische Wirksamkeit der Verbindungen der Formel I wird durch den Maus-Heizplattentest nachgewiesen. Bei diesem Test wird eine Maus in einen aufrechtstehenden Acrylzylinder eingebracht, dessen Boden eine an ihrer Oberfläche bei 52°C gehaltene Heizplatte bildet. Der

Maus wird durch subkutane Injektion eine vorbestimmte Menge der Testverbindung, die in einem Träger gelöst oder suspendiert ist, verabreicht. Nach Verstreichenlassen einer vorbestimmten Zeit nach der Verabreichung der Testverbindung wird die Maus auf die Heizplattenoberfläche gebracht.

Die Zeit in Sekunden bis zum jeweiligen Eintritt zweier gesonderter Phänomene wird aufgezeichnet. Erstens wird die Zeit, bis die Maus ihre Hinterpfote leckt, gemessen und zweitens wird die Zeit gemessen, bis die Maus von der Heizplattenoberfläche hochspringt. Ein Mittel mit analgetischer Wirksamkeit führt zu einer Erhöhung dieser Zeiten im Vergleich zu Kontrollmäusen, die lediglich Injektionen des Trägers erhalten. Dies muss in einem Dosisbereich erfolgen, der nicht zu einer motorischen Inkoordination oder Inkapazität führt. In den folgenden Tabellen sind die bei diesem Test erhaltenen Ergebnisse zusammengestellt, wobei mit einer Kontrolle mit natürlichem Enkephalin und mit dem Amid von natürlichem Enkephalin verglichen wird. In der Tabelle I sind die Zeiten bis zum Lecken der Hinterpfote, in Tabelle II die Zeiten bis zum Fluchtsprung und in Tabelle III die Prozentsätze der Tiere jeder Testgruppe angegeben, die eine analgetische Wirkung zeigen. Das Kriterium für einen positiven analgetischen Effekt ist folgendes: Die Zeit bis zum Lecken der Hinterpfote oder bis zum Fluchtsprung muss bei einem behandelten Tier gleich der oder grösser als die mittlere Kontrollzeit plus zwei Standardabweichungen vom Mittel sein. Jedes Ergebnis in den folgenden Tabellen I und II stellt den Mittelwert plus oder minus Standardfehler dar, und Tabelle III zeigt die Prozentsätze, die mit wenigstens 9 Mäusen und bis zu 40 Mäusen erhalten werden.

Tabelle I

Analgetische Wirksamkeit

Zeit bis zum Lecken der Hinterpfote in Sekunden

Verbindung1-'

verstrichene Zeit,

Dosis, mg/kgil

Min.

Kontrolle

1

3

10

30

100

200

Met5-Enkephalinb

5

29,5 ±2,6

_

_

33,3 ±2,2

10

33,9 ±4,5

-

-

-

-

-

-

-

30,1 ±2,6

Met5- Enkephalinamid

5

33,1 ±1,1

_

_

—

33,6 ±2,2

43,1±2,91

15

33,3 ±0,8

~

35,0± 1,8

34,5 ±2,2

28,6 ±2,2

39,1 ±3,7*

A

5

33,1 ±1,1

_

43,2 ±3,2'

48,9 ±6,9'

56,8 ± 9,V

-

-

15

33,3 ±0,8

30,3 ±1,5

38,6 ±2,2'

40,6 ± 1,7'

67,7 ±9,3'

-

-

30

32,9 ±1,8

34,5 ±1,6

43,8 ±2,3'

48,7 ±3,5'

-

-

B

5

33,1 ±1,1

-

-

37,4 ± 2,52

35,8 ± 3,5

46,3 ± 3,01

15

33,3 ±0,8

-

38,8 ±2,3'

35,1 ±2,1

-

30

32,9 ±1,8

-

-

29,3 ±2,1

-

-

C

15

33,3 ±0,8

35,3 ±2,7

32,8 ±1,0

38,4± 1,9'

40,6 ±2,1'

-

-

D

5

33,1 ±1,1

-

-

37,6 ±2,7

-

-

15

33,3 ±0,8

34,2 ±2,2

39,9 ±2,0'

35,4±2,8

37,4 ± 2,82

-

_

30

32,9 ±1,8

-

-

-

30,7 ±2,8

-

_

E

5

33,1 ±1,1

_

-

-

35,3 ±2,9

-

_

15

33,3 ±0,8

31,0±3,5

31,9 ±2,5

36,8 ±2,5

44,5 ± 3, l1

-

-

30

32,9 ±1,8

_

-

-

30,2 ±2,4

-

-

F

15

32,8 ±2,9

_

43,7 ±3,2'

-

-

«

_

15

35,7 ±3,9

_

-

50,2 ±5,3'

-

-

-

G

15

30,0 ±2,4

34,0 ± 2,4e

-

-

-

-

-

15

27,2 ±2,2

-

34,7 ±2,1'

34,4 ± 1,4'

-

-

-

Tabelle II

Analgetische Wirksamkeit

Zeit bis zum Fluchtsprung, Sekunden

Verbindung1-

verstrichene Zeit, Min.

Dosis, mg/kga

Kontrolle

1

3

10

30

100

200

Met5-Enkephalinb

5 10

79,5 ±9,6 64,2 ± 10,4

-

-

-

-

82,2 ±5,2

92,8 ± 8,92

Met5- Enkephalinamid

5

70,8 ±4,7

-

-

-

-

95,6 ±10,6'

96,8 ±7,7'

15

73,0 ±2,4

-

-

77,3 ±6,8

82,8 ±9,1

103,6 ±10,4'

105,8 ±10,4'

A

5

70,8 ± 4,7

-

140,4 ±14,5'

165,3 ±20,2'

194,8 ±22,1'

-

-

15

73,0 ±2,4

96,7 ±8,0'

131,3±7,91

157,6 ±7,0'

214,3 + 7,5'

-

-

30

92,4 ±7,0

-

83,6 ±6,5

109,4±7,1

143,0 ±8,8'

-

-

B

5

70,8 ±4,7

-

-

118,5 ±11,2'

125,0 ±14,0'

163,9 ±12,0'

-

15

73,0 ±2,4

-

-

92,4 ±8,2'

113,3 ± 6,1'

-

-

30

92,4 ±7,0

-

-

-

84,8 ±11,6

-

-

C

15

73,0 ±2,4

89,2 ±20,0

113,7 ±7,2'

121,2± 13,1'

162,3 ±19,1'

-

-

D

5

70,8 ±4,7

-

-

-

80,2 ±14,3

-

15

73,0 ±2,4

88,7 ±6,8

102,8 ±9,5'

107,0 ±12,3'

115,6± 13,9'

-

-

30

92,4 ±7,0

-

-

-

70,8 ± 4,42

-

-

E

5

70,8 ±4,7

-

-

-

97,7 ± 14,32

-

-

15

73,0 ±2,4

79,9 ±12,1

103,1 ±12,4'

116,4 ±9,6'

158,1 ±13,7'

-

-

30

92,4 ±7,0

-

-

-

63,2 ± 8,92

-

-

F

15

75,6 ±9,9

-

182,4 ±21,3'

-

-

-

-

15

57,3 ±6,0

-

-

215,8 ±12,8'

-

-

-

G

15

72,3 ±8,5

130,5 ± 12,5le

-

-

-

-

-

•

15

53,8 ±6,7

-

128,2 ±20,4'

159,9 ±22,7'

-

-

-

636847

26

Tabelle III

Analgetische Wirksamkeit

Tiere, die analgetische Wirkung zeigen, Prozent

Verbindung0 verstrichene Dosis, mg/kgaid

Zeit, Min.

I

3

10

30

100

200

HPL

EJ

HPL

EJ

HPL

EJ

HPL

EJ

HPL

EJ

HPL

EJ

Met5-Enkephalinb

5

_

_

_

_

_

_

0

0

10

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

11

22

Mets-Enkephalinamid

5

-

-

-

-

-

-

-

-

12

24

38

19

15

-

_

-

-

14

0

28

13

13

24

31

25

A

5 ■

-

-

40

60

50

80

60

80

-

-

_

-

15

5

21

28

55

40

82

85

100

-

-

-

-

30

-

-

10

10

53

50

57

67

-

-

-

-

B

5

-

-

-

-

25

50

19

50

50

81

-

-

15

-

-

-

35

21

20

40

-

-

-

-

30

-

-

-

-

-

-

0

20

_

_

_

_

C

15

11

11

0

50

25

38

33

89

-

-

-

-

D

5

-

-

-

-

-

-

13

22

_

-

-

-

15

11

0

31

25

22

22

25

33

-

-

30

-

-

-

-

-

-

11

0

-

-

-

E

5

-

-

-

-

-

-

22

33

_

-

-

-

15

11

11

6

31

31

56

44

78

-

-

_

-

30

-

-

-

-

-

-

11

0

-

-

-

-

F

15

_

-

30

70

40

100

-

-

-

-

-

-

G

15

10

30e

44

60

10

70

-

—

—

~~

—

—

a. Wenn nichts anderes angegeben ist, sind die Tests unter Verwendung von Salzlösung als Kontrolle durchgeführt worden. Die hochgestellten Ziffern « 1 » und «2» zeigen an, dass das Ergebnis bis P< 0,01 bzw. P< 0,05 signifikant ist.

b. Test und Kontrolle mit Acacia, worin die Verbindung als Suspension vorliegt.

c. Die Bezeichnungen beziehen sich auf folgende Verbindungen:

A. L-Tyrosyl-D-alanyl-glycyl-L-phenylaIanyl-Nalpha-methyl-L-methionylamid-hydrochIorid(Beispiel 1),

B. L-Tyrosyl-D-alanyl-glycyl-L-phenylalanyl-L-methionylamid-hydrochlorid (Beispiel 3),

C. L-Tyrosyl-D-a]anyl-L-alanyl-L-phenylalanyl-Na'pha-methyl-L-methionylamid-l,25-hydrochlorid-monoacetat(Beispiel5),

D. L-Tyrosyl-D-leucyl-glycyl-L-phenylalanyl-Nalpha-methyl-L-methionylamid-sesquihydrochIorid-monoacetat (Beispiel 2),

E. L-Tyrosyl-D-alanyl-glycyl-Na'pha-methyl-L-phenylaianyl-Na!p,M-methy!-L-methiony!amid-hydrochlorid-trihydrat (Beispiel 4),

F. L-Tyrosyl-D-alanyl-glycyl-L-phenylalanyl-Nalpha-methyl-L-leucylamid-acetat (Beispiel 7),

G. L-Tyrosyl-D-alanyl-glycyl-L-phenylalanyl-L-Nalpha-methyl-S-ethyl-cysteinylamid-acetat (Beispiel 6).

d. H PL = Lecken der Hinterpfote EJ = Fluchtsprung e. Bei der Prüfung bei 0,3 mg/kg beträgt die Zeit bis zum Lecken der Hinterpfote 33,9 ±2,3 Sekunden, die Zeit bis zum Fluchtsprung 129,0 ± 11,5 Sekunden und die analgetische Wirkung 10% für HPL und 60 % für EJ.

B

Claims (11)

636847

1

/\ \./

CH I 1 W

(I)

OY

worin

L und D die Chiralität, wo eine solche möglich ist, bezeichnen, und

Ra ein Wasserstoffatom, eine Methyl-, Äthyl-, n-Propyl- oder Allylgruppe bedeutet,

Rs ein Wasserstoffatom oder eine Alkylgruppe mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen bedeutet,

Rs ein Wasserstoffatom, eine Methyl-, Äthyl- oder n-Propyl-gruppe ist,

R4 eine Alkylgruppe mit 1 -4 Kohlenstoffatomen, jedoch unter Ausschluss der tert.-Butylgruppe, ist,

Rs ein Wasserstoffatom oder eine Alkylgruppe mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen ist, jedoch unter Ausschluss der tert.-Butylgruppe,

Re ein Wasserstoffatom, eine Methyl-, Äthyl odern-Propyl-gruppe bedeutet,

Rt eine Methyl-, Äthyl- oder n-Propylgruppe ist,

Y ein Wasserstoffatom oder eine Acetylgruppe bedeutet,

25 W eine Isopropylgruppe oder eine Gruppe der Formel -VR9 oder -CH2-X-CH3 ist, in welcher

V ein Sauerstoffatom oder ein Schwefelatom darstellt,

R9 eine Alkylgruppe mit 1-4 Kohlenstoffatomen oder eine Aralkylgruppe bedeutet,

30 X ein Sauerstoffatom, ein Schwefeiatom oder die Gruppierung der Formel -CH2- darstellt,

unter der Voraussetzung, dass dann wenn W für eine Gruppierung der Formel -VR9 steht, in welcher V ein Schwefelatom ist und R9 den Methylrest bedeutet, dann der Rest Rs die 35 Bedeutung einer Alkylgruppe mit 1-3 Kohlenstoffatomen aufweisen muss, sowie von Säureadditionssalzen der Verbindungen der Formel I, dadurch gekennzeichnet, dass man die Aminoschutzgruppe in Verbindungen der Formel

(L) (D)

OR '0

R v II la II

2J^-CH-C-W-CH-C-NH-CH-C-N-CH-C-N^-CH- C-NHR, ' 1 I

(L)0 R (L)0 R (L)0 III® II ,7

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man als praktisch trockenes Säuremedium zur Abspaltung der Aminoschutzgruppen Trifluoressigsäure, eine Aryl-sulfonsäure, vorzugsweise t-Toluolsulfonsäure, Benzolsul-

fonsäure oder Naphthalinsulfonsäure, reine Trifluormethan-60 sulfonsäure, flüssigen Fluorwasserstoff oder Bortribromid verwendet.

2

PATENTANSPRÜCHE 1. Verfahren zur Herstellung neuer Verbindungen der Formel

(L) (D) OR 0 II |a II

(L) (L) (L) O.R OR

II I

il I

;-CH-C-N—CH-C-NH-CH-C-N—CH-C-N—CH—C-NHRg

/\

u

I

CH

3 636847

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man als praktisch trockenes Säuremedium zur Abspal-

6S tung der Aminoschutzgruppen Eisessig mit gasförmigem Chlorwasserstoff verwendet.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man als praktisch trockenes Säuremedium zur Abspal

tung der Aminoschutzgruppen 98%ige Ameisensäure verwendet.

5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man L-Tyrosyl-D-leucyl-glycyl-L-phenylalanyl-N"-methyl-L-methionylamid oder sein Sesquihydrochloridmo-noacetat herstellt.

6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man L-Tyrosyl-D-alanyl-glycyl-Na-methyl-L-phe-nylalanyl-Na-methyl-L-methionylamid oder sein Hydro-chlorid-trihydrat herstellt.

7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man L-Tyrosyl-D-alanyl-L-alanyl-L-phenylalanyl-Na-methyl-L-methionylamid oder sein 1,25-Hydrochloridmono-acetatsalz herstellt.

8. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man L-Tyrosyl-D-alanyI-glycyl-L-phenylalanyI-N°-methyl-S-ethyl-cysteinylamid oder sein Acetat herstellt.

9. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, s dass man L-Tyrosyl-D-alanyl-glycyl-L-phenylalanyl-Na-

methyl-L-leucylamid oder sein Acetat herstellt.

10. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man L-Tyrosyl-D-alanyl-glycyl-L-phenylalanyl-S-p-methoxybenzyl-L-cysteinylamid oder sein Hydrochlorid her-

io stellt.

10

CH

I

R

/%] \/

CH l 8

/\

V/

I

CH I : W

(II)

OY

worin Rio Benzyloxycarbonyl, tert.-Butyloxycarbonyl, tert.-Amyloxycarbonyl, p-Methoxybenzyloxycarbonyl, Adaman-tyloxycarbonyl oder Isobornyloxycarbonyl bedeutet in einem praktisch trockenen Säuremedium abspaltet und erhaltene Verbindungen gegebenenfalls in die entsprechenden Salze überführt.

11. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man L-Tyrosyl-D-alanyl-glycyl-L-phenylalanyl-Na-methyl-L-methionylamid oder sein Hydrochlorid oder Acetat herstellt.