CS204011B2 - Process for preparing substituted pentapeptides - Google Patents

Description

ČESKOSLOVENSKÁ SOCIALISTICKÁ KIPUBLIKA (19) POPIS VYNALEZU K PATENTU 204011 (11) (B2) s (22) Přihlášeno 16 09 77(21) (PV 6044-77) (51) Int. Cl.3 C 07 C 103/52 (32) (31) (33) Právo přednosti od 27 09 76(726724) a od 20 06 77 (807849) Spojené státy americké OEAO mo VYNÁLEZY A OBJEVY (40) Zveřejněno 30 06 80(45) Vydáno 15 12 83 (72]

Autor vynálezu SMITHWICK EDWARD LEE dr., ml., FREDERICKSON ROBERT CURTISARTHUR dr., INDIANAPOLIS a SHUMAN ROBERT THEODORE,GREENWOOD (Sp. st. a.) Í73)

Majitel patentu ELI LILLY AND COMPANY, INDIANAPOLIS (Sp. st. a.) [ 54 ] Způsob přípravy substituovaných pentapeptidů

Vynález se týká způsobu přípravy novéskupiny sloučenin, které vykazují při paren-terálním podávání analgetickou účinnost. V poslední době byly izolovány endogen-ní látky s vlastnostmi podobajícími se vlast-nostem morfinu, z mozku nebo z cerebrál-ních spinálních tekutin savců. Tyto látky,označované jako enkefaliny, byly identifi-kovány jako pentapeptidy a dále uvedenýmisekvencemi, viz Hughes a spol., Nátuře 258,577 [1975]: H-Tyr-Gly-Gly-Phe-Met-OH, H-Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-OH.

Tyto látky se označují jako methionin-en-kefalin a leucin-enkefaíin. Ačkoliv bylo zjištěno, že se tyto látky vy-značují analgetickou účinností u myší přiiníracerebroventrikulárním podávání, vizBuscher a spol., Nátuře 261, 423 [1976], ne-mají žádnou použitelnou analgetickou účin-nost při parenterálním podávání.

Nyní byla nalezena nová skupina slouče-nin, vyznačujících se velmi výraznou a doka-zatelnou analgetickou účinností při syste-mickém podávání. Vynález se týká způsobupřípravy těchto sloučenin. Předmětem vynálezu je způsob přípravysubstituovaných pentapeptidů obecného vzor-ce I, (L) (D) (L)

(LI (L) O O O Rs O R7

H^N-CH-C-NH-CH-C-NH~CH-C-N-CH-C-N-CH-Z <· i I I li CHZ fy R5 CHz CHz

OH 204011 (I) 204011 kde L a D, přicházejí-li v úvahu, definuji chi-ralitu, přičemž R4 je C1-C4 primární nebo sekundární al-kyl,

Rs je vodík nebo C1.-C3 primární alkyl, R6 je vodík nebo C1-C3 primární alkyl, R7 je vodík nebo C1-C3 primární alkyl, Z je skupina

O —C—NH2 a W je isopropyl, skupina —CH2SCH3,—S—CH2CH3 nebo

~ 5 ~c,iž~^y~0CH3 J s podmínkou, že je-li W isopropyl, pak R7je C1-C3 primární alkyl, a jejich farmaceu-ticky přijatelných adičních solí s netoxický-mi kyselinami, jehož podstata spočívá v tom,že z odpovídající chráněné sloučeniny obec-ného vzorce II,

o Ré o R?

11 1 ·* 11 I

NH-CH-C-N-CH- C-N-CH -Z 0 ’ 1 RS C L CH,

I

W

(II) kde R10 je benzyloxykarbonyl, terc.butyloxykar-bonyl, terc.amyloxykarbonyl, p-methoxybenz-yloxykarbonyl, adamantyloxykarbonyl neboisobornyloxykarbonyl a ostatní symboly majívýše uvedený význam, se odštěpí chránícískupiny v prostředí suché kyseliny.

Jako farmaceuticky vhodné a netoxickó a-diční soli sloučenin podle tohoto vynálezus kyselinami je možno uvést například adič-ní soli připravené za použití organických ne-bo anorganických kyselin, jako jsou kyseli-na chlorovodíková, sírová, sulfonové kyseli-ny, kyselina vinná, fumarová, bromovodíko-vá, gíykolová, citrónová, maleová, fosforeč-ná, jantarová, octová, dusičná, benzoová, as-korbová, p-toluensulfonová, benzensulfono-vá, naftalensulfonová a propionová. Za vý-hodné soli je třeba pokládat ty, které bylypřipraveny z kyseliny chlorovodíkové, octo-vé nebo jantarové. Kterákoli z výše uvede-ných solí se může připravovat běžnými po-stupy.

Lze vyčíst z povahy různých substituentůsloučenin obecného vzorce I, že sloučeninydefinované obecným vzorcem I jsou amidypentapeptidů. Stereochemické uspořádánísloučenin obecného vzorce I je zásadní o-tázkou. Pro zjednodušení jsou zbytky ami-nokyselin v pentapeptidech obecného vzorceI číslovány jako sekvence začínající zbyt-kem s koncovou aminoskupinou. Chiralitazbytků aminokyseliny při sledu od aminoky-seliny 1 až po aminokyselinu 5 je tedy L, D,L, L a L. Dále pak je třeba situaci rozuměttak, že zbytek v poloze 3 je definován tak, že zahrnuje zbytek glycinu. V takových pří-padech pochopitelně neexistuje chiralita po-dobného zbytku. Pouze je důležité konstato-vat, že pokud poloha 3 odpovídá chirální-mu zbytku aminokyseliny musí jít o chirali-tu L.

Skupiny Rs, Rs a R7 znamenají alkylovouskupinu s 1 až 3 atomy uhlíku, a to primár-ní; tím jsou míněny skupiny methylová, e-thylová a n-propylová.

Skupina Ri je definována jako primárnínebo sekundární alkylová skupina s 1 až 4atomy uhlíku a jsou tím míněny skupinamethylová, ethylová, n-propylová, isopropy-lová, n-butylová, isobutylová a sek.butylová.

Se zřetelem na polohu zbytků v peptapep-tidech obecného vzorce I převažují tyto si-tuace: (A) Poloha 1

Tato poloha je totožná s N-koncovou a-minokyselinou peptidu. Zbytek odpovídá L--tyrosinu. (B) Poloha 2

Zbytek aminokyseliny v poloze 2 peptiduobecného vzorce I musí být stereoisomerkonfigurace D, a může to být kterýkoli zby-tek z několika aminokyselin. Patří sem zbyt-ky D-alaninu (R4 znamená methylovou sku-pinu), kyseliny D-w-aminomáselné (R4 zna-mená ethylovou skupinu), D-norvalinu (R4znamená n-propylovou skupinu), D-valinu(R4 znamená isopropylovou skupinu), D-nor-leucinu (R4 znamená n-butylovou skupinu), 204011 D-leucinu (Rt znamená isobutylovou skupi-nu) a D-ísoleucinu (R4 znamená sek.butylo-ýou skupinu). S výhodou je tento zbytek od-vozen od D-alaninu. (C) Poloha 3

Zbytek aminokyseliny v této poloze je od-vozen od glycinu nebo od kterékoli amino-kyseliny a konfigurací L. Mezi vhodné ami-nokyseliny patří: L-alanin, kyselina L-(a-a-mirío) máselná, L-norvalin, L-valin, L-norleu-tíin, L-leúcin a L-isoleucin. S výhodou se od-vozuje zbytek v této poloze peptidu od gly-cinu. (D) Poloha 4

Zbytek aminokyseliny v této poloze se od-vozuje od L-fenylalaninu. Zbytek může býtpopřípadě substituován na dusíkovém atomuaminoskupiny (R6). V tomto případě obsa-huje zbytek N-substituent a to může být sku-pina N-methylová, N-ethylová nebo N-n-pro-pylová. S výhodou je však tento zbytek bezsubstituentu na dusíkovém atomu, tedy Reznamená vodík. (E) Poloha 5 V příloze 5 pentapeptidu je zbytek amiduaminokyseliny, popřípadě substituované naaminoskupině. Tato aminokyselina je odvoze-na od L-methioninu (W znamená methylthio-méthylovou skupinu). L-leucinu (W zname-ná isopropylovou skupinu), L-(S-ethyl)cystei-nu (W znamená ethylthioskupinu) nebo L--(S-p-methoxybenzyl) cysteinu (W znamenáp-methoxybenzylthioskupinu). Výhodně je vpoloze 5 pentapeptidu zbytek amidu L-me-thioninu nebo amidu L-leucinu.

Zbytek této koncové aminokyseliny, pokudje to jiná látka než L-leucin, je popřípaděsubstituován na dusíkovém atomu aminosku-piny. Pokud je koncovou aminokyselinouzbytek L-leucinu, je tento zbytek substituo-ván na dusíkovém atomu aminoskupiny. Ja-ko přítomný substituent přichází v úvahuprimární alkylová skupina s 1 až 3 atomyUhlíku a jako příkladné substituující skupi-ny lze uvést skupiny N-methylovou, N-ethy-lovou a N-n-propylovou. Pokud je dusíkovýatom aminoskupiny substituován, jde s vý-hodou například o primární alkylovou sku-pinu s 1 až 3 atomy uhlíku. A ještě je vý-hodnější, znamená-li primární alkylová sku-pina s 1 až 3 atomy uhlíku skupinu methy-lovou. Dále třeba zdůraznit, že aminokyselina vpoloze 5 pentapeptidu, znamenající konco-vou karboxylovou aminokyselinu, je v sek-venci přítomná ve funkci amidu.

Sloučeniny obecného vzorce I se připra-vují za použití postupů, které jsou v chemiipeptidů zcela rutinní. Je možné, že běhemsynthesy některých sloučenin obecného vzor-ce I dojde k částečné racemisaci, avšak roz-sah takové racemisace, pokud k ní dojde, není v žádném případě dostačující k tomu,aby vážněji změnil analgetickou účinnostsloučenin obecného vzorce I.

Způsoby příprav sloučenin obecného vzor-ce I záleží ve spojování aminokyselin nebopeptidových fragmentů reakcí karboxylovéskupiny jedné části s aminoskupinou druhéčásti za vzniku amidické vazby. S přihléd-nutím k účinnému spojení takových dvoučástí je žádoucí v prvé řadě, aby všechnyreaktivní funkční skupiny, které se přímoneúčastňují reakce, byly desaktivovány po-užitím vhodných, chránících skupin, a za dru-hé, aby karboxylová skupina, jež se má spo-jit s aminoskupinou, byla vhodným způsobemaktivována, aby bylo možno spojení provést.To vše vyžaduje velmi pečlivou volbu jak re-akční sekvence, tak i reakčních podmínek,jakož i použití speciálních chránících sku-pin tak, že se dosáhne vzniku žádaného pep-tidu jako produktu. Každá z aminokyselinpoužitých k přípravě sloučenin obecnéhovzorce I, jež má zvláště zvolené chránícískupiny a/nebo aktivující funkční skupiny,se připravuje za použití postupů, které jsouobecně známy na úseku peptidů. V každém místě celkové synthesy slouče-nin obecného vzorce I se použijí zvolenékombinace chránících skupin; a bylo zjiště-no, že tyto zvláště zvolené kombinace způ-sobují, že reakce probíhají zcela hladce. Pří-padné jiné kombinace by sice také působilyuspokojivě při synthese sloučenin obecnéhovzorce I, ačkoli — popřípadě — s menšímúspěchem. Takže například je možno použítbenzyloxykarbonylovou skupinu, terc.buty-loxykarbonylovou skupinu, terc.amyloxykar-bonylovou skupinu, p-methoxybenzyloxykar-bonylovou skupinu, adamantyloxykarbonylo-vou skupinu a isobornyloxykarbonylovouskupinu jako chránící funkci aminoskupinypři synthese sloučenin obecného vzorce I.Dále pak je možno obvykle použít benzylovéskupiny jako chránící skupinu hydroxylovéfunkce tyrosylového zbytku, i když se dajípoužít dobře i další skupiny, jako je p-nitro-benzylová a p-methoxybenzylová skupina.

Jako skupina chránící karboxylovou funk-ci při přípravě sloučenin obecného vzorceI se může použít kterákoli z typických sku-pin tvořících estery, jako je například sku-pina methylová, ethylová, benzylová, p-nitro-benzylová, p-methoxybenzylová a 2,2,2-tri-chlorethylová.

Spojování vhodně chráněné aminokyselinys chráněnou aminoskupinou nebo podobnéhopeptidového fragmentu s aminokyselinou svhodně chráněnou karboxylovou skupinounebo s podobným peptidovým fragmentempři přípravě sloučenin obecného vzorce I zá-leží v tom, že se volná karboxylová skupinaaminokyseliny nebo peptidového fragmentuaktivuje pro kondensační reakci. To lze pro-vést za použití kteréhokoli z několika dobřeznámých postupů. Jedním z nich je převede-ní karboxylové funkce do formy smíšenéhoanhydridu. Volná karboxylová funkce se ak- 204011 tivuje reakcí s další kyselinou, což je typic-ky derivát uhličité kyseliny, jako je odpoví-dající chlorid. Jako příklad vhodných chlo-ridů, použitelných při přípravě smíšenýchanhydridů, je možno jmenovat ethylester ky-seliny chlormravenčí, fenylester kyselinychlormravenčí, sek.butylester kyseliny chlor-mravenčí, isobutylester kyseliny chlormra-venčí a chlorid kyseliny pivalové. S výhodouse používá isobutylester kyseliny chlormra-venčí.

Jiným způsobem aktivování karboxylovéfunkce pro účely provádění takových kon-densačních reakcí je převedení karboxylovéfunkce do formy aktivovaného esteru. Mezityto estery patří například 2,4,5-trichlorfe-nylester, pentachlorfenylester a p-nitrofenyl-ester. A dalším způsobem kondensace je dob-ře známá azidová kondensační reakce. Výhodným kondensačním postupem připřípravě sloučenin obecného vzorce I je po-užití Ν,Ν’-dicyklohexylkarbodiimidu k akti-vování volné karboxylové skupiny, což umož-ňuje průběh kondensace. Tento postup akti-vování a kondensování se provádí za použi-tí ekvimolárního množství Ν,Ν’-dicyklohe-xylkarbodiimidu. přepočteno na aminokyse-linu nebo peptidový fragment, a provádí seza přítomnosti ekvimolárního množství 1--hydroxybenzotriazolu. Přítomnost této lát-ky potlačuje nežádoucí vedlejší reakce, po-čítaje v to i možnost průběhu racemisování.

Odštěpení některých, chránících skupin jenutné v určitých místech syntetického sledureakcí, použitých při přípravě sloučenin o-becného vzorce I. Chemik obvyklé erudi-ce na úseku synthesy peptidů může snadnozvolit z příkladových krycích skupin ty, kte-ré jsou kompatibilní v tom smyslu, že se dáprovést selektivní štěpení produktu tak, žese odstraní jedna nebo více z chránících sku-pin, ale nikoli všechny chránící skupiny,které jsou přítomné v aminokyselině nebopeptidovém fragmentu. Podobné postupy jsouna úseku peptidové chemie dobře známy.Podrobnější rozbor postupů, které se hodípro selektivní štěpení, popsal v literatuřeSchrbder a Ltibke, The Peptides, sv. L., A-cad. Press, New York (1965), přičemž sezvláště odkazuje na tabulku, jež je na str.72 až 75 uvedené monografie.

Odštěpení chránící skupiny na karboxylovéfunkci se dá provést zmýdelněním v alkalic-kém prostředí. Obvykle se používá energic-kých podmínek štěpení v alkalickém prostře-dí s úmyslem deesterifikovat chráněnou kar- boxylovou skupinu, obvykle za použití hyd- roxidu alkalického kovu, jako je hydroxid sodný, hydroxid draselný a hydroxid lithný.

Reakční podmínky, za kterých probíhá zmý- delnění, jsou na tomto úseku dobře známy.

Skupiny chránící karboxylovou skupinu lzerovněž odstranit katalytickou hydrogenoly-sou, například hydrogenolysou za přítom-nosti katalyzátoru, jako je palladium na uhlí. Dále pak v těch případech, kdy je skupinouchránící karboxylovou skupinu p-nitrobenz-ylová nebo 2,2,2-trichlorethylová skupina, semůže odstranění takových chránících sku-pin provést redukcí za přítomnosti zinku a , chlorovodíkové kyseliny.

Chránící skupiny na aminoskupinách seodštěpují působením některých kyselin naaminokyselinu nebo peptid s chráněnou a- , minoskupinou; lze uvést jako příklady ky-selin například 98% mravenčí kyselinu, tri-fluoroctovou kyselinu nebo některou z aren-sulfonových kyselin, jako je kyselina p-tolu-ensulfonová, benzensulfonová, naftalensulfo-nová, dále trifluormethansulfonová kyseli-na, kapalný fluorovodík a roztok bromiduboritého v metHylenchloridu. Vzniká tím jakoprodukt odpovídající adiční sůl kyseliny. Od-štěpení chránící skupiny z aminoskupiny lzerovněž provést působením směsi bromovodí-ku nebo chlorovodíku a ledové kyseliny oc-tové na aminokyselinu nebo peptid s chrá-něnou aminoskupinou, čímž vzniká jako pro-dukt odpovídající adiční sůl s kyselinou bro-movodíkovou nebo chlorovodíkovou. Všech-na tato činidla, Určená k odštěpování, je mož-no pokládat za v podstatě bezvodé kyseléprostředí. Zvláštní způsob nebo to či onopoužité činidlo bude vždy záviset na che-mických nebo fyzikálních vlastnostech ma-teriálů, počítaje v to i specifitu štěpné re-akce. Bylo nalezeno, že v těch případech,kdy R7 znamená jinou skupinu než vodíka má se zbavit chránících skupin peptid ob- « sáhující nejméně 3 zbytky aminokyselin, jevysoce výhodné provést odštěpení chránícíchskupin kyselinou trifluoroctovou nebo mra-venčí za vzniku odpovídající adiční soli s ky- <> selinou. Sůl lze potom převést do jiné, far-maceuticky vhodnější formy, například pů-sobením vhodné iontoměničové pryskyřice,jako je diethylaminoethylsefadex A25 neboAmberlyst 2 27. V jiném případě, kdy se majíodštěpit chránící skupiny z aminoskupin, sepůsobí v podstatě bezvodým kyselým pro-středím na sloučeninu obecného vzorce II, 0

II R-HN-CH-C-NH-CH-C-NH- 70 J í CH> fy

° R'6 V

CH-C-N-CH-C-N-CH-Z

Rs CHZ

OH (li) 204011 g 10 kde Rio znamená skupinu benzyloxykarbo-nylovou, terc.butyloxykarbonylovou, terc.a-myloxykarbonylovou, p-methoxybenzyloxy-karbonylovou, adamantyloxykarbonylovounebo isobornyloxykarbonylovou, přičemžvšechny další symboly mají významy, jakzde byly již uvedeny.

Chrániči skupina na hydroxylové funkcityrosylového zbytku může zůstat v peptiduběhem celé sekvence přípravy a odstraní sev konečném syntetickém stupni spolu s od-štěpovanými chránícími skupinami z amino-skupin. Avšak v závislosti na podmínkáchpři odstraňování chránících skupin z karbo-xylových skupin se může výše uvedená chrá-nící skupina odstranit dříve ve sledu prepa-rativních r> Ací. Uvolňuje-li se karboxylováskupina zrn ýdelněním v alkalickém prostře-dí, nezmění se chráněná hydroxylová sku-pina a zůstane takto zachována; avšak po-užije-li se katalysovaná hydrogenolysa k od-BOC-L-Tyr-OH + H-D-(AAj2-OBzl OBzl i N,N’-dicyklohexyl- J. karbodiimid v 1-hydroxybenzotriazol BOC-L-Tyr-D-(AA)2-OBzl OBzl v OH"

BOC-L-Tyr-D-(AA)2-OH OBzl 1H-L-(AA)3-OBzl N,N’-dicyklohexyl- karbodiimid 1-hydroxybenzotriazol BOC-L-Tyr-D- (AA) 2-L- (AA) 3-OBzl OBzl stranění Chrániči skupiny z karboxylová sku-piny, štěpí se rovněž chránící skupina z hyd-roxylové skupiny. Posléze uvedená situacenepředstavuje vážný problém, protože slou-čeniny obecného vzorce I je možno připra-vovat za přítomnosti tyrosylového zbytku svolnou hydroxylovou skupinou. Výhodný specifický způsob přípravy slou-čenin obecného vzorce I záleží v kondensa-ci odděleně připraveného N-koncového tri-peptidu s odděleně připraveným amidem C-koncového dipeptidu s tím, že se v dalšímreakčním stupni vhodným způsobem odstraníjakékoli zbývající chránící skupiny. Tentoobecný postup, jímž je doložena přípravapentapeptidu obecného vzorce I, se dá blí-že popsat takto: v následující sekvenci zna-mená symbol AA zbytek aminokyseliny a při-pojené číslo označuje polohu aminokyselinyv konečné sekvenci peptidu jako produktu. BOC-L-Phe-QH + H-L-(AA)5-NH2 N,N’-dicyklohexyl- karbodiimid 1-hydroxybenzo- * triazol BOC-L-Phe-L-(AA]5-NH2 HCl/HOAc

Cl-H2+-L-Phe-L-(AA)5-NH2 OH-

BOC-L-Tyr-D-(AA)2-L-(AA)3-OHOH I H-L-Phe-L-(AA)5-NH2 Γ N,N’-dicyklohexylkarbodiimid* 1-hydroxybenzotriazol BOC-L-Tyr-D- (AA) 2-L- (AA) 3-L-Phe-L- (AA) s-N H2

OH . 1] kyselina trifluoroctová 1 2) diethylaminoethylsefadex A-25 » v acetátové formě

AcOH.H-L-Tyr-D-(AA)2-L-(AA)3-L-Phe-L-(AA )s-NH2

OH 204 11 Výše uvedené schéma představuje pouzejednu sekvenci pro přípravu sloučenin o-becného vzorce I. Jsou možné další sekven-ce. Jiný způsob, kterého je možno použít, zá-leží v postupném, sekvenciálním přidáváníaminokyselin, odpovídajících konstrukci pep-tidového řetězce, začínajícího koncovou kar-boxamidovou aminokyselinou. A ještě dalšípoužitelný způsob se týká syntézy peptidův pevné fázi. C-koncový zbytek se připoutána vhodný polymerní podklad a peptidse protahuje o jeden zbytek tak dlouho, ažse syntetisuje žádaný peptid, stále ještě vevazbě na polymer. Potom se oddělí peptid zpolymeru vhodným činidlem. Tak napříkladje možno kondensovat C-koncovou N-methyl-aminokyselinu, chráněnou na Na-dusíkovématomu terc.butyloxykarbonylovou skupinouza vzniku benzhydrylaminového polymeru zapoužití aktivování dicyklohexylkarbodiimi-dem. Potom se odstraní N-terc.butyloxykar-bonylová skupina reakcí polymeru s váza-ným zbytkem s roztokem kyseliny trifluor-

KH

BOC-NH-(AA)-COOH 18-korunový ether tetrahydrofuran dimethylformamid

Jak je to patrné z výše uvedené sekvence,působí se na aminokyselinu nejprve hydri-dem draslíku za přítomnosti vhodného ko-runového etheru, čímž vznikne dianion. Nameziprodukt se potom působí vhodným al-kyljodidem nebo allyljodidem za vzniku o-čekávané N-substituované aminokyseliny.

Odborníkům na tomto úseku bude zcelajasné, že za podmínek silně alkalickéhoprostředí může dojít k racemisaci na a-uhlí-kovém atomu, přičemž uvedenými podmínka-mi jsou míněny ty, kterých se používá přivýše uvedeném alkylačním postupu. Stupeňracemisace může kolísat v závislosti na ténebo oné použité aminokyselině. Racemisa-ci lze udržet na minimu použitím nadbytkualkylačního činidla s tím, že se použije re-akční doba tak krátká, jak je to jen možné.Nicméně i v takovém případě, kdy by došlok nadměrné racemisaci, se může produktčistit překrystalováním ve formě soli vhod-ného chirálního aminu, jako je napříkladsůl d (-j—) -a-fenylethylaminu. C-koncová část pentadekapeptidu obecné-ho vzorce I je ve formě funkčního derivátu,totiž amidu, přičemž v pentapentidech obec-ného vzorce I může být amid popřípadě N--monosubstituován. Při přípravě takovéhoderivátu se aktivuje karboxylová skupina a-minokyseliny působením N,N’-dicyklohexyl- 11 12 octové v methylenchloridu. Neutralisovánípolymerní soli vhodnou terciární bází a na-vázání druhého zbytku se provede stejnýmzpůsobem. Peptid s chráněnými skupinamise oddělí od polymeru působením kapalnéhofluorovodíku za chlazení na 0 °C a čistí sechromatografováním. Specifické podmínkytéto syntézy jsou známé každému obvykleinformovanému jedinci se znalostmi na úse-ku syntézy peptidů v pevné fázi. Reakčiíípostupy a způsoby, jaké byly popsány zdevýše, byly použity při tomto postupu, jakoži při jakékoli případné další sekvenci. V některých látkách ze sloučenin obecné-ho vzorce I znamená jedna nebo více ze sku-pin R6 a R7 primární alkylovou skupinu s 1až 3 atomy uhlíku. V těch případech se po-užije vhodným způsobem N-substituovaná a-minokyselina při preparativní sekvenci. Kte-rákoli z N-monosubstituovaných aminokyse-lin se dá připravit stejnou sekvencí, jak jezde uvedena výše, a to za použití N-chráně-né aminokyseliny jako výchozí sloučeniny: K+ i BOC-N--JAAJ-COO-K+ allyljodid neboprimární alkyljodid V s 1 až 3 atomy uhlíku (Ral)

Ra

I

Í-N-(AA)-COOH karbodiinidu za přítomnosti 1-hydroxybenzo-triazolu za vzniku esteru posléze uvedenélátky. Při přípravě pentapeptidů obecnéhovzorce I se na ester N-hydroxybenzotriazolupůsobí bezvodým amoniakem nebo vhodnýmprimárním aminem za vzniku nesubstituova-ného nebo N-monosubstituovaného amidu.Jako vhodné primární aminy pro tuto reakcije možno uvést methylamin, ethylamin a n--propylamin. V popisované části jsou nadále používánytyto zkratky, z nichž většina je velmi dobřeznáma a běžně se používá v tomto oboru:

Abu kyselina a-aminomáselná

Ala aíanin

Cys cystein

Gly glycin

Hse homoserin

Ile isoleucin

Leu leucin

Met methionin

Nle norleucin

Nva norvalín

Phe fenylalanin

Ser serin

Tyr tyrosin

Val valin

Ac acetylová skupina

Me methylová skupina ff 204011 13

Et ethylová skupina IP isopropylová skupina Pr n-propylová skupina Bu n-butylová skupina i-Bu isobutylová skupina t-Bu terc.butylová skupina s-Bu sek.butylová skupina BOC terc.butyloxykarbonylová skupina Bzl benzylová skupina

Jako příklady typických sloučenin obecné-ho vzorce I lze uvést zkratkami tyto látky:H-L-Tyr-D-Ala-Gly-L-Phe-L-Met-NH2,H-L-Tyr-D-Ala-Gly-L-Phe-L- (N-Me) Met-NH2,H-L-Tyr-D-Abu-Gly-L-Ohe-L-Met-NHž,H-L-Tyr-D-Abu-Gly-L-Phe-L-(N-Me)Met-NH2,H-L-Tyr-D-Nva-Gly-L-Phe-L- (N-Me) Met-NH2,H-L-Tyr-D-Nva-Gly-L-Phe-L-Met-NH2,H-L-Tyr-D-Val-Gly-L-Phe-L- (N-Me) Met-NH2,H-L-Tyr-D-Val-GIy-L-Phe-L-Met-NH2,H-L-Tyr-D-Nle-Gly-L-Phe-L-Met-NHz,H-L-Tyr-D-Nle-Gly-L-Phe-L-(N-Et)Met-NH2,H-L-Tyr-D-Leu-Gly-L-Phe-L-Met-NH2,H-L-Tyr-D-Leu-Gly-L-Phe-L- (N-Pr) Met-NH2,H-L-Tyr-D-Ile-Gly-L-Phe-L-Met-NH2,H-L-Tyr-D-Ile-Gly-L-Phe-L- (N-Pr J Met-NH2,H-L-Tyr-D-Ala-Gly-L-Phe-L-(N-Et)Met-NH2,H-L-Tyr-D-Ala-Gly-L-Phe-L- (N-Pr) Met-NH2,H-L-Tyr-D-Ala-D-Ala-L-Phe-L- (N-Pr) Met-NH2,H-L-Tyr-D-Ala-L-Ala-L-Phe-L-Met-NH2,H-L-Tyr-D-Ala-L-Ala-L-Phe-L- (N-Me) Met-NH2,H-L-Tyr-D-Ala-L-Abu-L-Phe-L-Met-NH2,H-L-Tyr-D-Ala-L-Nva-L-Phe-L- (N-Me J Met-NH2,H-L-Tyr-D-Ala-L-Leu-L-Phe-L- (N-Me) Met-NH2,H-L-Tyr-D-Ala-L-Ile-L-Phe-L-Met-NH2,H-L-Tyr-D-Ala-L-Ile-L-Phe-L- [ N-Et) Met-NH2,H-L-Tyr-D-Val-L-Ala-L-Phe-L- (N-Me) Met-NH2,H-L-Tyr-D-Leu-L-Ala-L-Phe-L- (N-Me J Met-NH2,H-L-Tyr-D-Val-L-Val-L-Phe-L- [ N-Et) Met-NH2, 14 H-L-Tyr-D-Leu-L-Leu-L-Phe-L- (N-Me) Met-NH2, H-L-Tyr-D-Ala-Gly-L-Phe-L-Nle-NH2, H-L-Tyr-D-Ala-Gly-L-Phe-L-Hse (Me) -NH2, H-L-Tyr-D-Ala-Gly-L-Phe-L- (N-Me) Nle-NH2, H-L-Tyr-Ď-Ala-Gly-L-Phe-L- (N-Me) NSe (Me )--NH2, H-L-Tyr-D- (N-Me) Ala-Gly-L-Phe-L-Met-NH2, H-L-Tyr-D- (N-Me) Ala-Gly-L-Phe-L- (N-Me) -Met-NH2, H-L-Tyr-D- (N-Me) Ala-L-Ala-L-Phe-L-Met-NH2) H-L-Tyr-D- (N-Me) Ala-L-Ala-L-Phe-L- (N-Me )-Met-NHz, H-L-Tyr-D-(N.Et)Ala-Gly-L-Phe-L-(N-Me)-

Met-NHz, H-L-Tyr-D- (N-Me) Val-Gly-L-Phe-L- (N-Me) -Met-NHz, H-L-Tyr-D- (N-Me J Leu-Gly-L-Phe-L- (N-Me) -Nle-NHz, H-L-Tyr-D- (N-Me) Ile-L-Ala-L-Phe-L- (N-Me) -Hse(Me)-NH2, H-L-Tyr (Ac J -D-Ala-GIy-L-Phe-L-Met-NH2, H-L-Tyr (Ac J -D-Ala-Gly-L-Phe-L- (N-Me ] Met-NH2, H-L-Tyr-D-Nle-L-Nva-L-Phe-L-Met-NH2, H-L-Tyr-D-Abu-L-Abu-L-Phe-L- (N-Me J Met--NH2, H-L-Tyr-D-Ala-Gly-L- (N-Me) Phe-L-Met-NH2, H-L-Tyr-D-Ala-Gly-L- ( N-Me J Phe-L- (N-Me) -Met-NHz, H-L-Tyr-D-Ala-Gly-L- (N-Et} Phe-L- (N-Me) Nle--NH2, H-L-Tyr-D-Ala-Gly-L- (N-Pr) Phe-L- (N-Me) Hse-(Me)-NH2, H-L-Tyr-D-Ala-Gly-L- (N-Pr) Phe-L- {N-Me J Met-NH2, H-L-Tyr-D-Ala-L-Ala-L- (N-Me J Phe-L-Met--NH2, H-L-Tyr-D-Ala-L-Ala-L- (N-Et) Phe-L- (N-Me) -Met-NH2, (N,N-di-Me) -L-Tyr-D- (N-Me) Ala-Gly-L- (N- -Me) Phe-L- (N-Me ) Met-NH2, 204011 15 (Ν,Ν-di-Etú-L-Tyr-D- (N-Me) Ala-Gly-L- (N--Et ) Phe-L- (N-Et) Met-NH (Me), (N-allyl)-L-Tyr-D- (N-Me) Ala-L-Ala-L- (N--Me) Phe-L- (N-Me) Nle-NH (Me), (N-Me) -L-Tyr-D-Ala-L-Val-L- (N-Me) Phe-L--(N-Pr )-Hse(Me)NH(Me), (N,N-di-Me) -L-Tyr-D-Val-L-Ala-L- (N-Me JPhe--L-(N-Me)MetNH(Me), H-L-Tyr-D-Ala-Gly-L-Phe-L- (N-Me) Leu-NH2, H-L-Tyr-D-Abu-Gly-L-Phe-L-Cys (p-methoxy-Bzl)-NH2, H-L-Tyr-D-Abu-Gly-L-Phe-L- (N-Me) Leu-NH2,H-L-Tyr-D-N Va-Gly-L-Phe-L- (N-Me) Leu-NHz, H-L-Tyr-D-Nva-Gly-L-Phe-L-Ser (p-methoxy- -Bzl)-NHz, H-L-Tyr-D-Val-Gly-L-Phe-L- (N-Me) Leu-NH2,H-L-Tyr-D-Val-Gly-L-Phe-L-Ser (Me) -NH2,H-L-Tyr-D-Nle-Gly-L-Phe-L-Cys (Me) -NH2,H-L-Tyr-D-Nle-Gly-L-Phe-L- (N-Et) Leu-NH2,H-L-Tyr-D-Leu-Gly-L-Phe-L-Ser (Bzl) -NH2,H-L-Tyr-D-Leu-Gly-L-Phe-L- (N-Pr) Leu-NH2,H-L-Tyr-D-Ile-Gly-L-Phe-L-Cys (Bzl )-NH2,H-L-Tyr-D-Ile-Gly-L-Phe-L-(N-Pr)Leu-NH2,H-L-Tyr-D-Ala-Gly-L-Phe-L- (N-Et) Leu-NH2,H-L-Tyr-D-Ala-Gly-L-Phe-L- (N-Pr) Leu-NHz,H-L-Tyr-D-Ala-D-Ala-L-Phe-L- (N-Pr) Leu-NH2,H-L-Tyr-D-Ala-L-Ala-L-Phe-L-Ser (Pr )-NH2,H-L-Tyr-D-Ala-L-Ala-L-Phe-L- (N-Me) Leu-NHž,H-L-Tyr-D-Ala-L-Sbu-L-Phe-L-Ser(Ip)-NH2,H-L-Tyr-D-Ala-L-Nva-L-Phe-L- (N-Me) Leu-NH2,H-L-Tyr-D-Ala-L-Leu-L-Phe-L- (N-Me) Leu-NH2,H-L-Tyr-D-Ala-L-Ile-L-Phe-L-Cys (i-Bu)-NH2,H-L-Tyr-D-Ala-L-Ile-L-Phe-L-(N-Et)Leu-NH2,H-L-Tyr-D-Val-L-Ala-L-Phe-L- (N-Me) Leu-NH2,H-L-Tyr-D-Leu-L-Ala-L-Phe-L-(N-Me)Leu-NH2,H-L-Tyr-D-Val-L-Val-L-Phe-L- (N-Et) Leu-NH2,

1B H-L-Tyr-D-Leu-L-Leu-L-Phe-L-( N-Me) Leu-NH2; H-L-Tyr-D-D Ala-Gly-L-Phe-L-Ser (p-methoxy--Bzl)NH2, H-L-Tyr-D-Ala-Gly-L-Phe-L-Cys (Et) -NHz, H-L-Tyr-D-Ala-Gly-L-Phe-L- (N-Me) Cys (Et) - -nh2, H-L-Tyr-D- (N-Me) Ala-Gly-L-Phe-L- (N-Me) -Leu-NH2, H-L-Tyr-D- (N-Me) Ala-L-Ala-L-Phe-L-Cys (Et) --NH2) H-L-Tyr-D- (N-Me) Ala-L-Ala-L-Phe-L- (N-Me) -Leu-NHz, H-L-Tyr-D- (N-Et) Ala-Gly-L-Phe-L- (N-Me) -Leu-NHz, H-L-Tyr-D- (N-Me) Val-Gly-L-Phe-L- (N-Me ) -Leu-NH2, H-L-Tyr-D- (N-Me) Leu-Gly-L-Phe-L- (N-Me) -Leu-NHz, H-L-Tyr-D-Nle-L-Nva-L-Phe-L-Cys (O-methyl--BzlJ-NHz, H-L-Tyr-D-Abu-L-Abu-L-Phe-L-(N-Me)Leu- -nh2, (N,N-di-Me) -L-Tyr (Ac) -D- (N-Et) Ele-L-Val--L-Phe-L-(N-Pr)Leu-NH2, (N-Me) -L-Tyr (Ac) -D- (N-Me) Leu-Gly-L-Phe--L-(N-Et)-Leu-NH2, (N-Me)-L-Tyr (Ac) -D- (Nva-L-Nva-L-Phe-L-- (N-Me)Ser (t-Bu)-NH2, H-L-Tyr-D-Ala-Gly-L- (N-Me) Phe-L-Ser (s--Bu)-NH2, H-L-Tyr-D-Ala-Gly-L- (N-Me) Phe-L- (N-Me) -Leu-NH2, H-L-Tyr-D-Ala-Gly-L- (N-Et) Phe-L- (N-Me) -Cys(Et)-NH2, H-L-Tyr-D-Ala-Gly-L- (N-Pr) Phe-L- (N-Me) -Leu-NH2, H-L-Tyr-D-Ala-Gly-L- (N-Pr) Phe-L- (N-Me) -Cys (p-methoxy-Bzl) -NH2, H-L-Tyr-D-Ala-L-Ala-L- (N-Me) Phe-L-Ser-(Et)-NH2, H-L-Tyr-D-Ala-L-Ala-L- (N-Et) Phe-L- (N-Me) -Leu-NH2, H-L-Tyr-D- Ala-Gly-L-Phe-L-Ser (Et )-NH (Me), 204011 17 Η-L-Tyr-D-Ala-Gly-L-Phe-L- (N-Me) Leu--NH(Me), H-L-Tyr-D-Ala-Gly-L-Phe-L- (N-Et) Leu-NH-(Me), H-L-Tyr-D-Ala-Gly-L-Phe-L- (N-Me ) Leu- -NH(Et), H-L-Tyr-D-Ala-Gly-L-Phe-L- (N-Et} Leu-NH- (Et), H-L-Tyr-D-Ala-Gly-L-Phe-L- (N-Me) Leu--NH(Me), H-L-Tyr-D-Ala-Gly-L-Phe-L- (N-Et) Cys (p--brom-Bzl)-NH(Pr), H-L-Tyr-D-Ala-Gly-L-Phe-L- (N-Pr) Leu-NH- (Me), H-L-Tyr-D-Ala-Gly-L-Phe-L-Cys (Ip) -Nh (Pr), (N,N-di-Me) -L-Tyr-D-Ala-Gly-L-Phe-L- (N-Me) Leu-NH (Et), (N,N-di-Me) -L-Tyr-D- (N-Me) Ala-Gly-L- (N--Me) Phe-L- (N-Me) Leu-NHž, (N,N-di-Et) L-Tyr-D- (N-Me) Ala-Gly-L- (N-Et) -Phe-L- (N-Et} Leu-NH (Me).

Sloučeniny obecného vzorce I jsou cenný-mi farmaceutickými látkami. Vyznačují seanalgetickou účinností a jsou zvláště vhod-né pro parenterální podávání savcům, počí-taje v to lidi.

Sloučeniny obecného vzorce I je možno po-dávat jako takové nebo se mohou upravo-vat ve směsích do formy farmaceutickýchpřípravků v jednotkových dávkách pro pa-renterální podávání. Při přípravě farmaceu-tických preparátů se používají organické ne-bo anorganické pevné látky a/nebo kapaliny,které jsou vhodnými farmaceutickými vehi-kuly. Jako vhodná vehikula lze používatvšechna, jež jsou na tomto úseku běžně zná-má. A přípravky mohou být ve formě tablet,prášků, granulí, kapslí, suspenzí, roztokůa dalších vhodných forem.

Sloučeniny obecného vzorce I, podávají-lise v účinném množství, se vyznačují analge-tickou účinností. Dávkování může kolísat asiod 0,1 mg asi do 100 mg na 1 kg hmotnostitěla příjemce. Výhodné dávkování je v roz-mezí asi od 1,0 mg asi do 20 mg na 1 kghmotnosti těla příjemce.

Další příklady jsou připojeny pro bližšíobjasnění popisu a účinností sloučenin obec-ného vzorce I; neznamenají však v žádnémpřípadě jakékoli omezování rozsahu vyná-lezu. Příklad 1 Příprava hydrochloridu L-tyrosyl-D-alanyl- 18 -glycyl-L-fenylalanyl-Na-methyl-L-methionyl- amidu A. Sůl benzylesteru D-alaninu s kyselinoup-toluensulfonovou

Do směsi 100 ml benzylalkoholu a 200 mlbenzenu, obsahující 55,1 g (0,29 mol) mono-hydrátu kyseliny p-toluensulfonové, se při-dá 25 g (0,281 mol) D-alaninu, směs se u-vede do varu pod zpětným chladičem za od-destilování vody azeotropicky v zařízení pod-le Deana a Starka. Reakční směs se zahřívá15 hodin, načež se ochladí na teplotu míst-nosti a zředí se etherem. Vzniklá sraženinase odsaje a krystalizací ze směsi methanolua etheru se získá 55,3 g (56 %) sloučeninyuvedené v nadpise, b. t. 112 až 115 °C.Analysa: pro C17H21NO5S (351,4) vypočteno: 58,10 % C, 6,02 % H, 3,99 % N;nalezeno: 58,19 % C, 6,06 % H, 3,82 % N. B. Benzylester N“-terc.butyloxykarbonyl-O- -benzyl-L-tyrosyl-D-alaninu

Do 200 ml suchého N,N-dimethylformami-du se vnese 35,1 g (0,1 mol) produktu zpředchozí části A postupu a vzniklá reakčnísměs se za míchání ochladí na 0 °C, načežse přidá 11,2 g (0,1 mol) diazabicyklooktanu.Dále se reakční směs míchá 10 minut zachlazení na 0°C, přidá se 37,1 g (0,1 mol)NK-terc.butyloxykarbonyl-O-benzyl-L-tyrosi-nu, dále pak 13,5 g (0,1 mol) 1-hydroxy-benzotriazolu a 20,6 g (0,1 mol) N,N’-dicyk-lohexylkarbodiimidu. Takto připravená re-akční směs se míchá 3 hodiny za chlazenína 0 °C, potom 24 hodin za teploty místnosti,načež se reakční směs ochladí na 0 °C, sus-penze se filtruje a filtrát se zahustí ve va-kuu.

Takto získaný zbytek se opět Roz-pustí v ethylesteru kyseliny octové a roztokse postupně promývá 1 N roztokem hydro-genuhličitanu sodného, vodou, vychlazeným0,75 N roztokem kyseliny citrónové a vodou.Potom se organická vrstva vysuší bezvodýmsíranem hořečnatým, filtruje se a zahustí vevakuu. Získaný zbytek se rozpustí v horkémethanolu; chlazením látka vykrystaluje a pojedné krystalizací z ethanolu se získá 41,5 g(80 %) čisté sloučeniny, jejíž složení je u-vedeno v nadpise, b. t. 121 až 123 °C.

Analysa: pro C3oH36Nž06(520,63) vypočteno: 69,21 0/0 C, 6,97 % H, 5,38 % N; nalezeno: 68,99 % C, 6,75 % H, 5,17 % N. 204011 19 C. N“-terc.hutyloxykarbonyl-0-benzyl-L-ty-rosyl-D-alanin

Ke směsi 200 ml tetrahydrofuranu a 20 mlvody se přidá 31,2 g (0,06 mol) produktuz části B a vzniklý roztok se ochladí na 0 °C;pomalu se přidává 13,2 ml (1,1 ekv.) 5 Nroztoku hydroxidu sodného a vzniklá reakčnísměs se míchá, přičemž se nechá její teplo-ta pomalu vystoupit na 20 °C. Po pěti hodi-nách se směs rozděluje mezi vodu a ether.Vodná vrstva se po oddělení ochladí, jejípH se upraví na hodnotu 2 přidáním citró-nové kyseliny a směs se extrahuje do ethyl-esteru kyseliny octové, roztok v tomto roz-pouštědle se promyje vodou, vysuší se bez-vodým síranem hořečnatým a po filtraci sefiltrát zředí etherem. Vzniklá sraženina seodifltruje a isoluje se tím 17,7 g (67 %]sloučeniny uvedené v nadpise, b. t. 160 až162 °C.

Analysa: pro C21H30N2O6 (442,51) vypočteno: 65,14 % C, 6,83 % H, 6,63 % N;nalezeno: 64,73 % C, 6,70 % H, 6,20 % N. D. Benzylester N“-terc.butyloxykarbonyl-O- -benzyl-L-tyrosyl-D-alanylglycinu

Do 70 ml suchého dimethylformamidu sepřidá 6,74 g (0,02 mol) soli benzylesteruglycinu s kyselinou p-toluensulfonovou, re-akční směs se ochladí na 0 °C a přidá se2,24 g (0,020 mol) DABCO.

Potom se reakční směs míchá několik mi-nut, přidá se 8,84 g (0,020 mol) produktu zčásti C postupu a 2,7 g (0,020 mol) 1-hydro-xybenzotriazolu a 4,12 g (0,020 mol) dicyk-lohexylkarbodiimidu. Směs se míchá za chla-zení na 0 °C po 2 hodiny, dále 24 hodin zateploty místnosti, vzniklá suspense se ochla-dí na 0 °C, filtruje se a filtrát se zahustí vevakuu. Získaný zbytek se rozpustí v ethyl-esteru kyseliny octové a roztok se promývápostupně 1 N roztokem hydrogenuhličitanusodného, vodou, vychlazeným 0,75 N rozto-kem citrónové kyseliny a vodou. Organickýpodíl se potom vysuší bezvodým síranem ho-řečnatým a po filtraci se filtrát zahustí vevakuu. Krystalizací zbytku z ethanolu se zís-ká 10,8 g (92 %) čisté sloučeniny, jejíž slo-žení je uvedeno v nadpise, b. t. 145 až 147stupňů Celsia.

Analysa: pro C33H39N3O7 (589,69) vypočteno: 67,22 % c, 6,67 % H, 7,13 % N; nalezeno: 67,32 % C, 6,83 % H, 6,91 % N. 20 E. N“-terc.butyloxykarbonyl-L-tyrosyl-D-ala-nylglycin

Do 60 ml dimethylformamidu se vnese10,5 g (0,018 mol) produktu z části D a sus-penduje se 2,5 g 5%ního palladia na uhlí.Vzduch se vypudí dusíkem, načež se zavádě-cí trubičkou s dispersním nástavcem zave-de za atmosférického tlaku a teploty míst-nosti vodík. Po 3,5 hod. se spotřeba vodíkuzastaví, katalyzátor se odfiltruje, filtrát sezahustí ve vakuu, a triturováním zbytku setherem se získá 5,4 g (75 %) sloučeniny,jejíž složení je uvedeno v nadpise. Látka sezíská ve formě amorfní pevné hmoty.Analysa: pro C26H26N2O5 (446,65) vypočteno: 69,94 % C, 5,87 % H, 6,27 % N;nalezeno: 70,08 % C, 5,82 % H, 6,16 % N. F. N“-terc.butyloxykarbonyl-N“-methyl-L- -methlonylamid

Mezi ethylester kyseliny octové a vychlaze-ný 0,75 N roztok kyseliny citrónové se roz-děluje 17,2 g (0,04 mol) dicyklohexylamino-vé soli NK-terc.butyloxykarbonyl-L-methioni-nu. Organická fáze se oddělí, promyje se vo-dou, vysuší se bezvodým síranem hořečnatýma po filtraci se filtrát zahustí ve vakuu. Ole-jovitý zbytek se rozpustí ve směsi 80 ml su-chého tetrahydrofuranu a 10 ml dimethyl-formamidu a přidá se 0,5 g 18-korunového--6-etheru. Rozmíchá se suspense hydridudraslíku (ekvivalentní 0,12 mol) a suspensese přikapává během 30 minut do takto při-pravené vychlazené směsi. Přidá se 2,49 ml(0,04 mol) methyljodidu a reakční směs semíchá 24 hodin za teploty místnosti. Potomse reakční směs ochladí a okyselí se na hod-notu pH 3 přidáním 0,75 N roztoku citróno-vé kyseliny, načež se vše rozděluje mezi vo-du a ether. Roztok v etheru se promyje ně-kolika podíly vody, potom se extrahuje do1 N roztoku hydrogenuhličitanu sodného,vodné extrakty se spojí, okyselí se na pH 2a kyselý podíl se extrahuje do ethylesterukyseliny octové. Extrakt v ethylesteru ky-seliny octové se vysuší bezvodým síranemhořečnatým, po filtraci se filtrát zahustí vevakuu a získá se tím 8,4 g produktu, jehožNMR-spektrum je v naprostém souhlasu sočekávaným N-methylovaným produktem (í2,92, N-CH3 5 2,11, S-CH3, S 1,6, C(CH3)3.

Olej, který se získá ve výtěžku 8,4 g (při-bližně 0,034 mol), se potom rozpustí v 60 mldimethylformamidu, roztok se ochladí na 0stupňů Celsia a přidá se 4,59 g (0,035 mol)1-hydroxybenzotriazolu a 7,0 g (0,034 mol)dicyklohexylkarbodiimidu. Reakční směs semíchá 2 hodiny za chlazení na 0°C, načež 204011 21 22 se zavádí dó reakční směsi po 45 minut plyn-ný bezvodý amoniak pomocí trubičky prodispersi plynů. Reakční směs se filtruje, filt-rát se zahustí ve vakuu, získaný zbytek senanese na kolonu 3 X 50 cm silikagelu (60až 200 mesh) a eluuje se chloroformem snásledujícím eluováním směsí 9,75 : 0,25chloroformu a methanolu. Po analyse chro-matografováním na tenké vrstvě za použitífrakcí z kolony s následujícím spojením napodkladě profilu výsledků chromatografiena tenké vrstvě se získá po koncentrováníve vakuu produkt, který byl dvakrát pře-krystalován ze směsi etheru a petroletherus tím, že se takto získá 4,1 g (39 %) slou-čeniny, jejíž složení je uvedeno v nadpise,b. t. 75 až 78 °C. NMR-spektrum: δ 2,80, N-CH3, 5 2,10, S-CH3,δ 1,48, C(CH3)3.

[ajo25 -29,5 (c = 0,5, chloroform).

Analysa: pro C11H22N2SO3 (262,37) vypočteno: 50,36 % C, 8,45 % H, 10,68 % N;nalezeno: 50,59 % C, 8,24 % H, 10,87 % N. G. N“-terc.butyloxykarbonyl-L-fenylalanyl- -N“-methyl-L-methionylamid Připraví se reakční směs z 20 ml ledovékyseliny octové, 2 ml anisolu, 2 ml triethyl-aminu a 1,8 g (0,0144 mol) produktu z částiF a do takto připravené směsi se zavádípo 30 minut bezvodý plynný chlorovodík.Reakční směs se zředí etherem, vyloučenásraženina se odfiltruje a vysuší (2,9 g), na-čež se znovu rozpustí v 40 ml dimethylfor-mamidu. Roztok se ochladí na 0 °C, přidá se 2,9 ml (0,0146 mol) dicyklohexylkarbodiimi-du a potom 1,97 g (0,0146 mol) 1-hydroxy-benzotriazolu, 3,87 g (0,0146 mol) NMerc.-butyloxykarbonyl-L-fenylalaninu a 3,0 gramů(0,0146 mol) dicyklohexylkarbodiimídu. Tak-to připravená reakční směs se míchá za chla-zení na 0 °C po 2 hodiny, dále pak 24 hodinza teploty místnosti. Po ochlazení na 0 °C sereakční směs filtruje, filtrát se zahustí vevakuu a zbytek se znovu rozpustí v ethyles-teru octové kyseliny, roztok se promývá po-stupně za použití 1 N roztoku hydrogenuhli-čitanu sodného, 0,75 N roztoku citrónové ky-seliny a vodou. Roztok v ethylesteru kyse-liny octové se potom vysuší bezvodým síra-nem hořečnatým a zahuštěním filtrátu vevakuu se isoluje olej, který nekrystalujepřidáním petroletheru. Zbytek se nanese nakolonu 3 X 50 cm se silikagelem (60 až 200mesh) a kolona se eluuje chloroformem snásledujícím eluováním směsí chloroformua methanolu (9,8 : 0,2). Se zřetelem na ana-lysu frakcí pomocí chromatografie na ten-ké vrstvě s následujícím spojením frakcí na podkladě získaných profilů se získá po od-destilování rozpouštědla, použitého při chro-matografii, zbytek, který krystaluje ze smě-si etheru a petroletheru, a získá se tím 3,1gramů (52,5 %) sloučeniny, jejíž složení jeuvedeno v nadpise. Látka má b. t. 99 až103 °C.

Analysa: pro C20H31N3O4S (409,55) vypočteno: 58,65 % C, 6,73 % H, 10,26 % N;nalezeno: 57,84 % C, 7,47 % H, 10,45 0/0 N. H. N“-terc.butyloxykarbonyl-L-tyrosyl-D- -alanylglycyl-L-fenylalanyl-N“-methyl- -L-methionylamid

Do směsi 20 ml ledové kyseliny octové, 3ml anisolu, a 3 ml triethylsilanu se vnese2,2 g (5,37 mmol) produktu z části G a 30minut se zavádí do reakční směsi suchý plyn-ný chlorovodík. Po přidání etheru k reakčnísměsi se vyloučí pevný podíl, který se od-filtruje a vysuší se ve vakuu. Z tohoto pev-ného podílu se 1,75 g (5 mmol) rozpustí v30 ml suchého dimethylformamidu a reakčnísměs se ochladí na 0°C. Sůl chlorovodíkovékyseliny se neutralisuje přidáním 0,99 ml(5 mmol) dicyklohexylaminu a po 5 minu-tách se přidá 2,05 g (5 mmol) produktu zčásti E s následujícím přidáním 0,68 g (5mmol) 1-hydroxybenzotriazolu a 1,03 g (5mmol) dicyklohexylkarbodiimídu. Reakčnísměs se dále míchá 24 hodiny při 4°C, ne-rozpustný podíl se odfiltruje, filtrát se za-hustí ve vakuu a získaný zbytek se znovurozpustí v ethylesteru kyseliny octové a roz-tok v ethylesteru kyseliny octové se promývápostupně 1 N roztokem hydrogenuhličitanusodného, vychlazeným 0,75 N roztokem citró-nové kyseliny a vodou. Dále se organickýroztok vysuší bezvodým síranem hořečnatýma nanese se 11a kolonu 3 X 50 cm silikage-lu (60 až 200 mesh), která se eluuje chloro-formem a následujícím eluováním směsíchloroformu a methanolu (9 : 1). Analysoufrakcí chromatografováním na tenké vrstvěs následujícím spojením frakcí po podkladěprofilu z chromatografie na tenké vrstvě sezískají 2 podíly surového produktu o váze0,80 g a 1,2 g v tom kterém případě. Prvýpodíl se dále čistí preparativní chromatogra-fií na silné vrstvě silikagelu za použití sou-stavy chloroform a methanol (9 : 1). Získáse tím 0,62 g sloučeniny uvedené v nadpise,a to ve formě amorfní pevné látky.

Analysa: pro C34H48N6O8S (700,86) vypočteno: 58,27 % C, 6,90 % H, 11,99 % N; nalezeno: 58,48 % C, 6,64 % H, 11,97 % N. 204011 23 24

Analysa aminokyselin, nalezeno: tyrosin0,99, alanin 1,00, glycin 1,00, fenylalanin 1,00.

Druhá dávka materiálu byla chromatogra-fována dvakrát stejným způsobem, jak to by-lo zde výše popsáno, a získalo se tak 0,74 gočekávaného produktu s přesnou elemen-tární analysou, jakož i s přesným výsledkemanalysy aminokyselin. 1. L-Tyrosyl-D-alanyl-glycyl-L-fenylalanyl- -N“-methyl-L-methionylamid ve forměhydrochloridu

Do 5 ml ledové kyseliny octové, obsahují-cí 0,2 ml anisolu, se přidá 0,72 g (1,03 mmoljsloučeniny uvedené v nadpise části H. 20minut se potom zavádí do reakční směsichlorovodík a lyofilisováním reakční směsise získá 0,74 g sloučeniny, jejíž složení jeuvedeno v nadpise. RfA = 0,3.

Vzorek této látky pro analysu byl sušenve vakuu při 100 °C. -hydroxybenzotriazolu a 4,2 g (0,02 mol]dicyklohexylkarbodiimidu. Takto připravenáreakční směs se míchá 2 hodiny při 0 °C,dále pak 24 hodin za teploty místnosti, o-chladí se na 0 °C a suspenze se filtruje. Filt-rát se zahustí ve vakuu, získaný zbytek serozpustí v ethylesteru octové kyseliny a roz-tok v tomto rozpouštědle se promývá po-stupně vodným 1 N roztokem hydrogenuhli-čitanu sodného, vodou, vychlazeným 0,75 Nroztokem citrónové kyseliny a opět vodou.Organická fáze se vysuší bezvodým síranemhorečnatým, filtruje se a filtrát se zahustíve vakuu. Krystalisací takto připravenéhozbytku z horkého ethanolu se získá 9,0 g(78 %) sloučeniny uvedené v nadpise, b. t.100 až 103 °C.

Analysa: pro C34H42N2O6 (574,72) vypočteno: 71,06 % C, 7,37 % H, 4,87 % N;

Analysa: nalezeno: 71,30 °/o C, 7,15 % H, 4,79 % N. pro CfflHátNeOeSCl (637,20) vypočteno: 54,66 % C, 6,49 % H, 13,19 % N; nalezeno: 54,36 % C, 6,19 % H, 13,00 % N.

Analysa aminokyselin: nalezeno tyrosin 1,01,alanin 0,99, glycin 1,00, fenylalanin 1,00. Příklad 2 Příprava monoacetátu seskvihydrochlori-du L-tyrosyl-D-leucyl-glycyl-L-fenylalanyl--N“-methyl-L-methionylamidu A. Sůl bsnzylesteru D-leucln s kyselinou p- -toluensulfonovou

Tato sloučenina se připraví postupem, kte-rý odpovídá části A z příkladu 1 pro přípra-vu odpovídajícího esteru D-alaninu. Látka sezíská ve výtěžku 73 °/o, b. t. 155 až 156 °C.Analysa: pro C20H2ZNO5S (393,50) vypočteno: 61,05 % C, 6,92 % H, 3,56 % N;nalezeno: 61,17 % C, 6,68 % H, 3,81 % N. B. Benzylester N“-terc.butyloxykarbonyl-O- -benzyl-L-tyrosyl-D-lsucinu

Do 50 ml dimethylformamidu se přidá7,86 h (0,020 mol) produktu z předchozíčásti A a reakční směs se ochladí na 0 °C.Po přidání 2,24 g (0,020 mol) DABCO se mí-chá reakční směs 5 minut, vnese se 7,42 g(0,020 mol) N“-terc.butyloxykarbonyl-O-ben-zyl-L-tyrosinu a potom 2,7 g (0,020 mol) Ι- Ο. N“-terc.Butyloxykarbonyl-0-benzyl-L-ty-rosyl-D-leucin

Do 80 ml tetrahydrofuranu se vnese 8,0 g(0,0139 mol) produktu z části B a po přidá-ní 20 ml vody se reakční směs ochladí na0°C, načež se pomalu přidává 7,25 ml (0,0145mol) 2 N roztoku hydroxidu sodného. Poskončení tohoto postupu se reakční směsmíchá 30 minut za chlazení na 0 °C, potom4 hodiny za teploty místnosti, načež se roz-děluje mezi vodu a ether. Vodný podíl se od-dělí, ochladí na 0 °C, okyselí se přidánímvychlazeného 1 N roztoku kyseliny chlorovo-díkové na pH 2, načež se okyselený roztokextrahuje do ethylesteru octové kyseliny,roztok v tomto rozpouštědle se po promytí ♦ vodou vysuší síranem hořečnatým, filtrujese a filtrát se zahustí ve vakuu. Sirupovitýzbytek se překrystaluje ze směsi etheru apetroletheru a získá se tak 6,4 g (95 %)sloučeniny uvedené v nadpise, b. t. 90 až94 °C.

Analysa: pro C27H36N2O6 (484,59) vypočteno: 66,92 % C, 7,49 % H, 5,78 θ/ο N;nalezeno: 67,14 % C, 7,38 % H, 5,76 % N. D. Benzylester N“-terc.butyloxykarbonyl-0- -benzyl-L-tyrosyl-D-leucylglycinu

Směs 3,37 g (0,010 mol) soli benzylesteruglycinu s kyselinou p-toluensulfonovou a1,12 g (0,010 mol) DABCO se rozpustí v su-chém dimethylformamidu a do reakční smě-si se přidá 4,84 g (0,010 mol) sloučeniny zčásti C. Po ochlazení reakční směsi na 0°C 204011 25 26 se přidá 1,35 g (0,010 mol) 1-h.ydroxybenzo-triazolu a 2,06 g (0,010 mol) dlcyklohexyl-karbodiimidu, získaná reakční směs se mí-chá 2 hodiny za chlazení na 0 °C a potom24 hodin za teploty místnosti. Po dalším o-chlazení na 0 °C se reakční směs filtruje afiltrát se zahustí ve vakuu. Zbytek se roz-pustí v ethylesteru kyseliny octové a roztokv tomto rozpouštědle se postupně promyjevodným 1 N roztokem hydrogenuhličitanusodného, vodou, vychlazeným 0,75 N rozto-kem citrónové kyseliny a vodou. Potom seroztok vysuší síranem horečnatým, filtrujese a zahustí ve vakuu. Krystalisací zbytkuze směsi ethanolu a etheru se získá 4,0 g(83 %) sloučeniny uvedené v nadpise, b. t.114 až 116 °C.

Analysa: pro C36H45N3O7 (631,77) vypočteno: 68,44 % C, 7,18 % H, 6,65 % N;nalezeno: 68,17 % C, 7,12 % H, 6,40 % N. E. N“-terc.butyloxykarbonyl-L-tyrosyl-D-leu-cylglycin

Do 5 ml bezvodého dimethylformamidu sevnese 1,9 g (0,006 mol) sloučeniny z částiD a potom 1,5 g 5% palladia na uhlí. Popřidání 40 ml ethanolu se vzduch vypudídusíkem a 5 hodin se zavádí vodík za udržo-vání reakční směsi na teplotě místnosti a naatmosférickém tlaku. Po odfiltrování kata-lyzátoru z reakční směsi se filtrát zahustíve vakuu a krystalisací ze směsi etheru aethylesteru octové kyseliny se připraví 2,3gramů (85 %) sloučeniny uvedené v nadpi-se, b. t. 189 až 190 °C.

Analysa: pro C22H33N3O7 (451,52) vypočteno: 58,52 % C, 7,37 % H, 9,31 % N;nalezeno: 58,79 % C, 7,48 % H, 9,39 % N. F. N“-terc.butyloxykarbonyl-L-tyrosyl-D- -leucylglycyl-L-fenylalanyl-N“-methyl-L- -methionylamid

Do 10 ml bezvodého dimethylamidu se při-dá 0,692 g (0,002 mol) soli L-fenylalanyl-N“--methyl-L-methionylamidu s kyselinou chlo-rovodíkovou, jak byla připravena v části Hpříkladu 1 a 0,903 g (0,002 mol) produktuz části E tohoto příkladu. Reakční směs seochladí na 0°C, přidá se 0,28 ml (0,002 mol)triethylaminu a za 10 minut 0,27 g (0,002mol) 1-hydroxybenzotriazolu a 0,412 g (0,002mol) dicyklohexylkarbodiimidu. Reakčnísměs se míchá 2 hodiny za chlazení na 0 °Ca 24 hodin za teploty 4°C, vzniklá sraženi-na se odfiltruje, filtrát se zahustí ve vakuu na zbytek, který se rozpustí v ethylesteruoctové kyseliny, a tento roztok se promývápostupně vodným 1 N roztokem hydrogen-uhličitanu sodného, vodou, vychlazeným 0,75N roztokem citrónové kyseliny a vodou. Or-ganická fáze se vysuší síranem horečnatým,filtruje se a filtrát se zahustí ve vakuu. Zby-tek se nanese na 2 preparativní desky prochromatografování na tlusté vrstvě a deskyse eluují směsí chloroformu a methanolu(9,25 : 0,75). Hlavní pás, positivní pod ultra-fialovým světlem, se vyřízne z každé z de-sek a produkt se eluuje ze silikagelu směsíchloroformu a methanolu. Po oddestilovánírozpouštědel ve vakuu se získá 1,2 g (81 %)sloučeniny uvedené v nadpise, a to ve forměamorfní pevné látky, [ajo25 = —31,5° (c —= 0,5, methanol).

Analysa: pro C37H54N6O8S (742,93) vypočteno: 59,82 % C, 7,33 % H, 11,31 % N; nalezeno: 59,88 % C, 7,06 % H, 11,15 % N.

Analysa aminokyselin, nalezeno: tyrosin 1,01,leucin 1,00, glycin 1,00, fenylalanin 0,99. G. Seskvihydrochlorid monoacetátu L-tyro-syl-D-leucyl-glycyl-L-fenylalanyl-N“-me-thyl-L-methionylamidu

Do 5 ml ledové kyseliny octové s obsahem 0,3 anisolu se vnese 0,900 g (0,0012 mol)sloučeniny ž části F, načež se do reakčnísměsi zavádí 20 minut proud suchého chlo-rovodíku. Rozpouštědlo se potom odstranílyofilisováním z vodného roztoku octové ky-seliny a získá se sloučenina uvedená v nad-pise, a to ve formě amorfní bílé látky.[a]D25 = —2,1 (c = 0,3, methanol).

Analysa: pro C32H47N6O6S . 1,5 HC1 . C2H4O2 (757,04) vypočteno: 53,93 % C, 6,79 % H, 11,10 % N,7,02 % Cl; nalezeno: 54,30 % C, 6,64 % H, 11,32 % N,6,96 % Cl.

Analysa aminokyselin: nalezeno: tyrosin 0,99, leucin 1,03, glycin0,99, fenylalanin 0,99. Příklad 3 Příprava trihydrátu hydrochloridu L-tyrosyl- -D-alanyl-glycyl-Na-methyl-L-fenylalanyl- -N“-methyl-L-methionylamidu A. Sůl N“-terc.butyloxykarbonyl-N“-methyl- -L-fenylalaninu s N,N-dicyklohexylaminem 204011 27

Do 80 ml suchého tetrahydrofuranu se vne-se 5,3 g (0,02 mol) N“-terc.butyloxykarbo-nyl-L-fenylalaninu, získaný roztok se ochla-dí asi na 10 °C a přidá se 10 ml suchého di-methylformamidu a 0,5 g 18-korunového-6etheru. Do reakční směsi se potom přidávápomalu 10,15 g disperse hydridu draslíku voleji, obsahující 0,060 mol hydridu draslíku,a po skončeném přidávání se reakční směsochladí na 0°C, přidá se 1,24 ml (0,020 mol)methyljodidu a reakční směs se míchá zateploty místnosti po 24 hodin. Dále se re-akční směs vlije na drcený led, extrahuje seetherem, vodný podíl se okyselí přidánímcitrónové kyseliny na pH 2 a okyselený po-díl se extrahuje do ethylesteru octové kyse-liny. Roztok v tomto rozpouštědle se promy-je vodou, vysuší se síranem hořečnatým azahustí se ve vakuu. Isolovaný sirup nekrys-taluje; jeho NMR-spektrum je v souladu sočekávanou strukturou připraveného derivá-tu. NMR-spektrum [í 2,72, N-CH3; δ 1,35,C(CH3)3). Sirup se rozpustí v etheru a při-dáním 4,0 ml dicyklohexylaminu se po ochla-zení získají krystaly. Tento podíl se odfiltru-je a krystalisací ze směsi methanolu a ethe-ru se získá 6,8 g (74 %) sloučeniny, jejížsložení je uvedeno v nadpise, b. t. 171 až 174stupňů Celsia. [«]D25 —22,0° (c = 1, metha-nol).

Analysa: pro C27H44N2O4 (460,66) vypočteno: 70,40 % C, 9,63 % H, 6,08 % N;nalezeno: 70,60 % C, 9,49 % H, 6,19 % N. B. N“-terc.butyloxykarbonyl-NK-methyl-L- -fenylalanyl-Na-methyl-L-methionylamid K roztoku 30 ml suchého dimethylforma-midu s obsahem 1,98 g (0,010 mol) soli Na--methyl-L-methionylamidu s kyselinou chlo-rovodíkovou se přidá 4,16 g (0,010 mol) N“--terc.butyloxykarbonyl-N“-methyl-L-fenyl-alaninu a získaná reakční směs se míchá 5minut, načež se po ochlazení na 0 °C přidá1,35 g (0,010 mol) 1-hydroxybenzotriazolua 2,06 g (0,010 mol) dicyklohexylkarbodiimi-du. Reakční směs se míchá 2 hodiny za tep-loty 0 °C, 24 hodin za teploty místnosti, na-čež se vzniklá sraženina odfiltruje a zahuš-těním filtrátu za sníženého tlaku se isolujesirup, který se znovu rozpustí v ethylesteruoctové kyseliny. Získaný roztok v uvedenémrozpouštědle se promývá postupně 1 N vod-ným roztokem hydrogenuhličitanu sodného,vodou, vychlazeným 0,75 N roztokem citró-nové kyseliny a vodou. Organická fáze sepotom vysuší síranem hořečnatým a po filt-raci se zahuštěním ve vakuu získá sirup, kte-rý se znovu rozpustí v chloroformu, a roztokse nanáší na kolonu 3 X 50 cm silikagelu(60 až 200 mesh) s eluováním chloroformema potom směsí chloroformu a methanolu 28 (9,75 : 0,25). Podle výsledků chromatografiena tenké vrstvě se spojí frakce z kolony sestejným profilem při vyhodnocování a za-huštěním těchto spojených frakcí za sníže-ného tlaku se isoluje 1,4 g (33 %) sirupu,jehož NMR-spektrum je v souladu s poža-davky pro sloučeninu, uvedenou v nadpise. NMR-spektrum: δ 2,93, N-CH3plie; δ 2,73, N-CH3Met; í 2,10, S-CH3; δ 1,37, C(CH3)3. C. N“-terc.butyloxykarbonyl-L-tyrosyl-D-ala-nylglycyl-N“-methyl-L-fenylalanyl-N“--methyl-L-methionylamid

Do směsi 5 ml ledové kyseliny octové, 1ml anisolu a 1 ml triethylsilanu se přidá 1,4gramů (0,0033 mol) produktu z části B a doreakční směsi se zavádí 30 minut dispersnítrubičkou pro zavádění plynů suchý chloro-vodík. Reakční směs se zředí etherem, vznik-lá sraženina se odfiltruje a vysuší, načež seprodukt o hmotnosti 1,1 g znovu rozpustí v40 ml dimethylformamidu. Reakční směs seochladí na 0°C, přidá se 1,27 g (0,0031 mol)produktu z části E příkladu 1, 0,420 g (0,0031mol) 1-hydroxybenzotriazolu a 0,640 gramů(0,0031 mol) dicyklohexylkarbodiimidu. Po10 minutách se vnese do reakční směsi 0,43ml (0,0031 mol) triethylaminu a reakčnísměs se míchá při 0°C po 2 hodiny a potom24 hodin při 4 °C. Vyloučená sraženina seodfiltruje a zahuštěním filtrátu za snížené-ho tlaku se získá sirupový zbytek, který seznovu rozpustí v ethylesteru octové kyseliny.Roztok v tomto rozpouštědle se postupněpromývá 1 N vodným roztokem hydrogen-uhličitanu sodného, vodou vychlazeným 0,75N roztokem citrónové kyseliny a vodou, vy-suší se síranem hořečnatým a po filtraci sezahuštěním filtrátu za sníženého tlaku zís-ká 2,0 g surového produktu. Ten se rozpustív chloroformu a nanese na kolonu 3 X 50cm silikagelu (60 až 200 mesh), jež se eluujechloroformem a potom směsí chloroformus methanolem (9 : 1). Frakce eluované zkolony se testují chromatografií na tenkévrstvě a frakce se stejným profilem při vy-hodnocování se spojí. Zahuštěním za sníže-ného tlaku se isoluje 1,1 g (47 %) nekrys-talující sloučeniny uvedené v nadpise.Analysa: pro C35H50N6O8S (714,88) vypočteno: 58,80 % C, 7,05 % H, 11,76 % N; nalezeno: 59,01 % C, 6,78 % H, 11,58 % N. D. Trihydrát hydrochloridu L-tyrosyl-D-ala-nyl-glycyl-Na-methyl-L-fenylalanyl-N“--methyl-L-methionylamidu

Do směsi 10 ml ledové octové kyseliny a 0,5 ml anisolu se přidá 0,70 g (0,001 mol) 204011 29 30 produktu z části C a do reakční směsi se za-vádí 20 minut trubičkou pro dispergováníplynů suchý chlorovodík. Po zmrazení sereakční směs lyofilisuje a získá se tím 0,678gramů hygroskopické sloučeniny, jejíž slo-žení je uvedeno v nadpise.

Analysa: pro C30H43N6O6SCI . 3H O (705,23) vypočteno: 51,08 % C, 7,0 % H, 11,91 % N; nalezeno: 51,13 % C, 6,97 % H, 11,72 % N.

Analysa aminokyselin: nalezeno tyrosin 1,03,alanin 1,01, glycin 0,96. Příklad 4 Příprava monohydrochloridu monoacetátu L-tyrosyl-D-alanyl-L-alanyl-L-fenylalanyl- -N“-methyl-L-methionylamidu A. Benzylester NK-terc.butyloxykarbonyl-O-benzyl-L-tyrosyl-D-alanyl-L-alaninu K roztoku 3,19 g (0,010 mol) soli benzyl-esteru alaninu s kyselinou p-toluensulfono-vou v 30 ml suchého dimethylformamidu sepřidá 4,43 g (0,010 mol) produktu ze stupněB příkladu 1. Takto připravená reakční směsse ochladí na 0°C, vnese se do ní 1,12 g(0,010 mol) DABCO a potom za 10 minut1,135 g (0,010 mol) 1-hydroxybenzotriazolu a2,06 g (0,010 mol) dicyklohexylkarbodiimi-du. Dále se reakční směs míchá za chlazenína 0 °C 2 hodiny, potom 48 hodin za teplotymístnosti, vyloučená sraženina se odfiltrujea zahuštěním filtrátu za sníženého tlaku sezíská sirup. Ten se znovu rozpustí v ethyl-esteru octové kyseliny a roztok se postupněpromývá vodným 1 N roztokem hydrogen-uhličitanu sodného, vodou, vychlazeným roz-tokem 0,75 N chlorovodíkové kyseliny a vo-dou. Organická fáze se vysuší síranem ho-řečnatým a po filtraci se filtrát zahustí zasníženého tlaku; takto isolovaný zbytek ne-krystaluje ani z ethanolu ani z etheru. Zře-děním roztoku v etheru přidáním petrolethe-ru se vyloučí gel, který je možno odfiltro-vat, a sušením ve vakuu se získá nečistá a-morfní pevná látka ve výtěžku 4,0 g. Ta senanese na silikagelovou kolonu 3 X 50 cm(60 až 200 mesh) a kolona se eluuje nejprvechloroformem, potom směsí chloroformu amethanolu (9,75 : 0,25). Analysováním frak-cí z kolony, chromatografováním na tenkévrstvě s následujícím spojením frakcí popodkladě profilu při sledování chromatogra-fií na tenké vrstvě se získá podíl a zahuště-ním rozpouštědla z tohoto podílu za snížené-ho tlaku se isoluje sirupovitý zbytek. Ten serozpustí v etheru a vysrážením petrolethe-ru se získá 3,0 g (50 %) sloučeniny uvede-né v nadpise, a to ve formě amorfní pevnélátky o b. t. 100 až 104 °C.

Analysa: pro C34H41N3O7 (603,72] vypočteno: 67,64 % C, 6,85 % H, 6,96 % N; nalezeno: 67,56 % C, 6,60 % H, 7,16 % N. B. N“-terc.butyloxykarbonyl-L-tyrosyl-D-ala-nyl-L-alanin

Do 5 ml suchého dimethylformamidu sevnese 2,9 g (0,0048 mol] produktu z částiA a k reakční směsi se přidá 1,0 g 5% pa-lladia na uhlí a potom 50 ml ethanolu. Zanormálního tlaku a teploty místnosti se za-vádí po 6 hodin trubičkou pro dispergováníplynů vodík, načež se reakční nádobka pro-pláchne dusíkem, katalyzátor se odfiltrujea filtrát se zahustí za sníženého tlaku. Zby-tek se rozpustí v ethylesteru octové kyselinya roztok se zředí přidáním etheru. Získanásraženina se odfiltruje a sušením ve vakuuse získá 1,5 g (74 °/o) sloučeniny uvedenév nadpise, a to jako amorfní bezbarvá lát-ka, [a]D25 + 25,9° (c = 5, chloroform).

Analysa: pro C20H29N3O7 (423,47) vypočteno: 56,73 % C, 6,90 % H, 9,92 % N; nalezeno: 56,80 % C, 6,95 % H, 9,81 % N. C. N“-terc.butyloxykarbonyl-L-tyrosyl-D-a-lanyl-L-alanyl-L-fenylalanyl-N“-methyl--L-methionylamid

Do 10 ml suchého dimethylformamidu sepřidá 0,692 g (0,002 mol) soli L-fenylalanyl--N“-methyl-L-methionylamidu s kyselinouchlorovodíkovou (viz příprava v části H pří-kladu 1). Reakční směs se ochladí na 0°C,přidá se 0,28 ml (0,002 mol) triethylaminua reakční směs se míchá po 10 minut, načežse přidá 0,846 g (0,002 mol) produktu z čás-ti B a potom 0,270 g (0,002 mol) 1-hydroxy-benzotriazolu a 0,412 g (0,002 mol) dicyklo-hexylkarbodiimidu. Získaná reakční směs semíchá 2 hodiny za chlazení na 0°C, potom48 hodin za teploty místnosti; po novémochlazení reakční směsi na 0 °C se tato směsfiltruje a filtrát se zahustí ve vakuu. Zby-tek se znovu rozpustí v ethylesteru octovékyseliny, roztok v tomto rozpouštědle se pro-myje postupně vodným 1 N roztokem hydro-genuhličitanu sodného, potom vodou, vychla-zeným 0,75 N roztokem citrónové kyselinya znovu vodou. Po vysušení síranem hořeč-natým se organická fáze filtruje a filtrát sezahustí ve vakuu. Ve výtěžku 1,6 g se iso-luje surový produkt, který se rozpustí vchloroformu, a roztok se nanese na 2 prepa-rativní desky pro chromatografování na tlus-té vrstvě. Desky se eluují směsí chloroforma methanolu (9 : 1), hlavní pás se vyřízne 204011 31 z každé desky a produkt se isoluje ze si-likagelu extrakcí směsí chloroform a metha-nol. Eluát o váze 1,3 g se znovu rozpustí ananese na jednu desku pro chromatografo-vání na tlusté vrstvě a opakováním chroma-tografie se isoluje 1,0 g (70 %) sloučeninyuvedené v nadpise jako amorfní pevná lát-ka, [«]D25 —25,6° (c = 0,5, methanol).Analysa: pro C35H50N6O3S (714,88) vypočteno: 58,80 % C, 7,05 % H, 11,76 % N; nalezeno: 58,60 % C, 6,87 % H, 11,53 % N. D. Hydrochlorid monoacetát L-tyrosyl-D-ala-nyl-L-alanyl-L-fenylalanyl-N“-methyl-L--methionylamidu

Do 5 ml ledové octové kyseliny s obsahem 0,5 ml anisolu se vnese 0,880 g (0,0011 mol)produktu z části C a trubičkou pro disper-gování plynů se zavádí po dobu 20 minutproud suchého chlorovodíku do reakční smě-si, která se potom zmrazí, a lyofilisovánímsé získá 0,704 g sloučeniny, uvedené v nad-pise, [ef]D25 —16,2° (c = 0,5, methanol).Analysa: pro C30H42N6O6S . 1,25 HC1 . C2H4O2 (719,14) vypočteno: 53,43 % C, 6,45 % H, 11,68 % N,6,16 % Cl; nalezeno: 53,48 % C, 6,47 % H, 11,62 % N,6,50 % Cl.

Analysa aminokyselin: nalezeno tyrosin 1,00,alanin 1,99, fenylalanin 1,01. Příklad 5 Příprava soli L-tyrosyl-D-alanyl-glycyl-L-fe-nylalanyl-L-hP-methyl-S-ethylcysteinylami-du s kyselinou octovou A. Sůl N“-terc.butyloxykarbonyl-S-ethyl-L--cysteinu s dicyklohexylaminem

Do 400 ml Ν,Ν-dimethylformamidu se při-dá 50 g (0,336 mol) L-(S-ethyl)cysteinu a doreakční směsi se dále vnese 44,8 ml (0,336mol) tetramethylguanidinu a 66,8 ml (0,336mol] dicyklohexylaminu. Během hodiny sepřikapává dále do reakční směsi 68 ml (0,50mol) terc.butylesteru kyseliny azidomraven-čí a reakční směs se míchá 48 hodin za tep-loty místnosti. Vysrážený dicyklohexylamo-niumazid se odfiltruje a filtrát se zahustíza sníženého tlaku. Zbytek se rozděluje meziether a vodu, hodnota pH vodné vrstvy seupraví na 8,0, načež se organický podíl od-dělí s tím, že není dále k potřebě. Vodný po-díl se okyselí na pH 2 přidáním vychlazené- 32 ho zředěného roztoku chlorovodíkové kyse-liny a okyselený roztok se extrahuje vychla-zeným roztokem ethylesteru octové kyseliny.Získaný organický roztok se promyje vo-dou, vysuší se síranem hořečnatým a zahustíve vakuu. Získaný zbytek se opět rozpustív etheru a přidá se 66,8 ml (0,336 mol) dí-cyklohexylaminu. Vyloučená sraženina se od-filtruje a překrystalováním z ethylesteru octové kyseliny se isoluje 32,8 g (23 % teorie)sloučeniny uvedené v nadpise, b. t. 156 až159°C, [«]o25 = —1,1° (c = 1, methanol), 25 [a] 3gg = —7,7° (c = 1, methanol).Analysa: pro C22H42N2O4S (430,6) vypočteno: 61,36 % C, 9,83 % H, 6,51 0/0 N; nalezeno: 61,37 % C, 9,98 % H, 6,26 % N. B. hP-Butyloxykarbonyl-N-methyl-S-ethyl--L-cysteinylamid

Do 50 ml suchého tetrahydrofuranu se vne-se 18,58 g (74,3 mmol) N“-butyloxykarbo-nyl-S-ethyl-L-cysteinu, připraveného neutra-lisováním produktu ze stupně A a extraho-váním do ethylesteru octové kyseliny. Tak-to připravená reakční směs se přikapáváběhem 30 minut do mechanicky míchanésuspense 42,45 g hydridu draslíku (obsahu-jící 22,1 % hydridu draslíku, tedy 0,234 molhydridu draslíku, v minerálním oleji)v 375ml tetrahydrofuranu za chlazení na 0 °C aobsahující 0,35 g 18-korunového-6-etheru.Během 15 až 20 minut se přikapává 9,25 ml(0,149 mol) methyljodidu v 20 ml tetrahyd-rofuranu a reakční směs se míchá 1,5 hod.za chlazení na 0 °C. Potom se přikapává 7,5ml octové kyseliny v 7,5 ml tetrahydrofura-nu, dále 5 ml ethanolu, reakční směs se vli-je na led a pH reakční směsi se upraví nahodnotu asi 9 přidáním 2 N roztoku hydro-xidu sodného. Vzniklý vodný roztok se ex-trahuje etherem, pH vodného podílu se u-praví na hodnotu 3 přidáním pevné citróno-vé kyseliny a potom se provede nová extrak-ce do 3 dávek po 300 ml etheru. Spojené roz-toky v etheru se extrahují zpět do vody apo vysušení síranem hořečnatým se filtrátzahustí za sníženého tlaku. Získaný zbytekse rozpustí v 200 ml etheru a k roztoku sepřidá 9,56 ml (74,3 mmol) D(-j-)-a-methyl-benzylaminu. Po ochlazení se k reakční smě-si přidá 500 ml petroletheru; ke krystalisa-ci tím nedojde, roztok se proto zahustí zasníženého tlaku a zbytek se znovu rozpustív petroletheru. Reakční směs se ochladí na—78 °C, malý podíl sraženiny, který se vy-loučí, se odfiltruje (2,74 g). Matečný louhse zahustí za sníženého tlaku a zbytek serozpustí v etheru. Roztok v etheru se extra-huje do 1 N roztoku citrónové kyseliny, na-čež se organická vrstva extrahuje vodou, 204011 33 34 vysuší se bezvodým síranem horečnatým azahuštěním za sníženého tlaku se získá 6,56gramů (33 % teorie) sirupovité látky o[a]D25 = —61,1° (c = 1, ethanol). NMR--spektrum (CDCb) δ 2,90, N-Ctb; δ 1,45,terc.butylová skupina; 5 4,9 — 4,5, CH.

Produkt o hmotnosti 6,5 g (0,025 mol) serozpustí v 80 ml dimethylformamidu a tep-lota reakční směsi se sníží na —15 °C. Popřidání 3,6 ml (0,027 mol) isobutylesteru ky-seliny chlormravenčí se přidá 2,99 ml (0,027mol) N-meíhylmorfolinu, reakční směs semíchá 10 minut za chlazení na —15 °C a ho-dinu se do reakční směsi zavádí plynný bez-vodý amoniak. Reakční směs se míchá dal-ší 4 hodiny za chlazení na —15 °C, načež sevlije na směs ledu a 1 N roztoku hydrogen-uhličitanu sodného, studená vodná vrstvase extrahuje etherem, roztok v etheru seextrahuje studeným 0,75 N roztokem citró-nové kyseliny a vodou, načež se vysuší sí-ranem hořečnatým. Zahuštěním za sníženéhotlaku se isoluje zbytek, který krystaluje zesměsi etheru a petroletheru a získá se tím1,7 g (26 %) sloučeniny uvedené v nadpise,b. t. 56 až 59 °C, [a]„25 = —127,6° (c = 0,5,chloroform). NMR-spektrum (CDCb) δ 2,80, N-CHj; δ 1,46,terc.butylová skupina; δ 4,9 — 4,5, α-CH.Analysa: pro C11H21N2O3S (261,36) vypočteno: 50,55 % C, 8,10 % H, 10,72 % N;nalezeno: 50,56 % C, 7,93 % H, 10,51 % N. C. N“-terc.Butyloxykarbonyl-L-fenylalanyl- -N“-methyl-S-ethyl-L-cysteinylamid

Do 20 ml ledové kyseliny octové s obsahem1 ml triethylaminu a 4 ml anisolu se přidá2,5 g (9,5 mmol) N“-terc.butyloxykarbonyl--N“-methyl-S-ethyl-L-cysteinylamidu a do re-akční směsi se zavádí 30 minut proud su-chého plynného chlorovodíku. Přidáním et-heru se vysráží sůl chlorovodíkové kyselinyve výtěžku 1,8 g; sraženina se rozpustí v 25ml dimethylformamidu, reakční směs se 0-chladí na 0 °C a neutralisuje se přidáním 1,31me triethylaminu. Dále se přidá 2,65 g (0,01mol) N“-terc.butyloxykarbonyl-L-fenylalani-nu, 1,35 g (0,01 mol) 1-hydroxybenzotriazolua 2,06 g (0,01 mol) dicyklohexylkarbodiimi-du. Reakční směs se míchá 2 hodiny za tep-loty 0 °C, potom 24 hodin za teploty míst-nosti, znovu se ochladí na 0 °C a vyloučenásraženina se odfiltruje. Zahuštěním filtrátuza sníženého tlaku se získá zbytek, který serozpustí v ethylesteru octové kyseliny, a roz-tok v uvedeném rozpouštědle se extrahujedo 1 N roztoku hydrogenuhličitanu sodného,dále pak vodou, 0,75 N roztokem citrónovékyseliny a vodou. Po vysušení síranem ho-řečnatým se oddestiluje z filtrátu za snížené- ho tlaku rozpouštědlo, získá se tím sirupovi-tý zbytek, který se rozpustí v chloroformu,a roztok se nanese na kolonu 3 X 45 cmsilikagelu (Grace a Davidson, Grade 62).Eluování se provádí chloroformem s gra-dientem methanolu, tj. za použití čistéhochloroformu až směsi s methanolem v pomě-ru 9 : 1, kvalita frakcí se vyhodnotí chroma-tografováním na tenké vrstvě, vhodné frak-ce se spojí a oddestilováním rozpouštědlave vakuu se isoluje 3,0 g sloučeniny uvede-né v nadpise, [a]D25 — —77° (c = 5, me-thanol).

Analysa: pro C20H31N3O4S (409,5) vypočteno: 58,65 % C, 7,63 % H, 10,26 % N;nalezeno: 58,87 % C, 7,41 % H, 9,81 % N. D. Sůl N“-terc.butyloxykarbonyl-L-tyrosyl-D- -alanylglycinu s dicyklohexylaminem.

Produkt hydrogenolysy (za použití postu-ru NK-terc.butyloxykarbonyl-O-benzyl-L-tyro-pu z části E příkladu 1) 46,80 g benzyleste-syl-D-alanyl-glycinu se rozpustí v 150 ml i-sopropylalkoholu, k roztoku se přidá 16 ml(0,081 mol) dicyklohexylaminu. Objem roz-toku se přidáním etheru upraví celkem na1,5 litru a polopevná hmota, jež se tím vy-loučí, se rozmíchává tak dlouho, až ztuhne,načež se vzniklá sraženina odsaje. Vysuše-ním se isoluje 46,04 g (98 %) látky o b. t.194,5ažl97 °C. Tento pevný podíl se rozpustív 100 ml vroucího methanolu, přidá se 500ml isopropylalkoholu, objem roztoku sezmenší zahuštěním pod dusíkem asi na 150ml, načež se chlazením vynutí krystalizace.Reakční směs se nechá stát přes noc, vylou-čená sraženina se odfiltruje, a sušením sezíská 41,44 g (88 %) sloučeniny, uvedenév nadpise, b. t. 198 až 200,5 °C, [a]D25 == -j— 17,9° (c = 1, methanol).

Analysa: pro C31H30N4O7 (590,8) vypočteno: 63,03 % C, 8,53 % H, 9,48 % N;nalezeno: 62,94 % C, 8,77 «/o H, 9,20 % N. E. N“-terc.Butyloxykarbonyl-L-tyrosyl-D-ala-nylglycyl-L-fenylalanyl-N“-methyl-S--ethyl-L-cysteinylamid

Do 20 ml ledové kyseliny octové obsahu-jící 3 ml anisolu a 3 ml triethylsilanu se vne-se 2,5 g (6,1 mmol) produktu z části C, na-čež se do reakční směsi zavádí 25 minut su-chý plynný chlorovodík. Po přidání etheruse reakční směs ochladí a filtrací se isoluje 1,9 g (5,5 mmol) odpovídající soli chlorovo-díkové kyseliny. Ta se rozpustí v 25 ml di- 204011 33 methylformamidu, směs se ochladí a přidáse 3,2 g (5,5 mmol) soli N“-terc.butyloxy-karbonyl-L-tyrosyl-D-alanylglycinu s dicyklo-hexylaminem. Reakční směs se míchá 10 mi-nut za teploty 0°C, přidá se dále 0,74 g (5,5mmol) 1-hydroxybenzotrlazolu a 1,1 g (5,5mmol) dicyklohexylkarbodiimidu, načež sereakční směs míchá 2 hodiny při 0 °C a 48hodin za teploty 4°C. Vyloučená sraženinase odfiltruje a filtrát se zahustí za snížené-ho tlaku. Zbytek se rozpustí v ethylesteruoctové kyseliny a roztok v tomto rozpouš-tědle se extrahuje vodným 1 N roztokemhydrogenuhličitanu sodného, vodou, 0,75 Nroztokem citrónové kyseliny a opět vodou.Potom se organická fáze vysuší síranem ho-řečnatým a zahuštěním filtrátu ve vakuu seisoluje 3,5 g surové sloučeniny, jejíž slože-ní je uvedeno v nadpise. Produkt se roz-pustí v chloroformu a nanese se na kolonu3 X 45 cm silikagelu (Grace a Davidson,Grade 62) s tím, že se kolona eluuje chlo-roformem s gradientem methanolu, tedychloroformem až směsí s methanolem (9:1).Frakce se spojují na podkladě výsledků chro-matografie na tenké vrstvě a zahuštěnímza sníženého tlaku se získá 2,4 g (62 %)čisté sloučeniny uvedené v nadpise, [«]D25 == —30,7° (c = 0,5, methanol).

Analysa: pro C34H48N&amp;O8S (700,86) nalezeno: 58,27 % C, 6,90 % H, 11,99 % N;nalezeno: 58,14 % C, 6,98 % H, 11,94 % N.Analysa aminokyselin: nalezeno: Tyrosin 1,01, alanin 1,00, glycin1,00, fenylalanin 0,98, amoniak 1,09. F. Sůl L-tyrosyl-D-alanyl-glycyl-L-fenylala-nyl-L-N“-methyl-S-ethylcysteinylamidus kyselinou octovou

Do 20 ml ledové octové kyseliny s obsa-hem 2 ml anisolu a 2 ml triethylsilanu sevnese 2,2 g (3 mmol) produktu z části E ado reakční směsi se zavádí 25 minut suchýplynný chlorovodík. Reakční směs se ochla-dí, vyloučená sraženina se odsaje a vysuší. Zcelkového výtěžku 2,0 g se oddělí 1,2 g atento podíl se rozpustí v dostačujícím množ-ství pufru (1 % pyridinu a 0,05 % octovékyseliny ve vodě) tak, že celkový objemroztoku činí 10 ml. Roztok se nanese na ko-lonu 2,5 X 99 cm s diethylaminoethyl-sefa-dexem A 25 (acetátová forma), který bylpředtím uveden do rovnovážného stavu zapoužití stejného pufru. Eluát se sleduje v ul-trafialové oblasti za vlnové délky 280 nm,sobě odpovídající frakce se spojí a lyofilisu-jí. Novou lyofilisací z 10% octové kyselinys následující lyofilisací ze směsi vody a ace-tonitrilu (75 : 25) se získá 0,59 g sloučeni- 36 ny, jejíž složení je uvedeno v nadpise,[a]D25 = + 9>9° (c = 0,5, 1 N roztok chlo-rovodíku).

Analysa: pro C31H44NSO8S (660,79) vypočteno: 56,35 % C, 6,71 % H, 12,72 % N, 4,85 % S; nalezeno: 56,63 % C, 6,72 % H, 12,63 % N, 4,69 % S.

Analysa aminokyselin: nalezeno: tyrosin 1,00, alanin 1,01, glycin1,00, fenylalanin 0,98, amoniak 1,09. Příklad 6 Příprava soli L-tyrosyl-D-alanyl-glycyl-L-fe-nylalanyl-N“-methyl-L-ceucylamidu s kyseli-nou octovou A. Sůl N“-terc.butyloxykarbonyl-N“-methyl- -L-leucinu s d( + )-a-methylbenzylaminem.

Do 20 ml etheru se přidá 12,5 g (0,05 mol)hydrátu N“-terc.butyloxykarbonyl-L-leucinu,reakční směs se vysuší síranem hořečnatýma zahustí se za sníženého tlaku. Zbytek serozpustí v 75 ml tetrahydrofuranu a roztokse přikapává během 35 minut do míchanéa chlazené (0°C) suspense 27,9 g hydridudraslíku (22,1% suspense v minerálním 0-leji, 0,154 mol hydridu draslíku) v 200 mltetrahydrofuranu, obsahujícího 0,25 g 18--korunového-6-etheru. Během 15 minut sedále přikapává roztok 6,4 ml methyljodiduv 10 ml tetrahydrofuranu a reakční směsse udržuje 3 hodiny na teplotě 0 °C. Potomse přidá 5 ml octové kyseliny v 5 ml tetra-hydrofuranu, a to po kapkách, dále ještě5 ml ethanolu. Získaná reakční směs se vli-je na 500 ml ledu a pH reakční směsi se u-praví asi na hodnotu 9 přidáním 1 N rozto-ku hydroxidu sodného. Vodný roztok se ex-trahuje etherem, načež se okyselí na pH 3přidáním pevné citrónové kyseliny a okyse-lená vodná suspense se extrahuje etherem.Spojené extrakty v etheru se promyjí vodou,vysuší se síranem hořečnatým a zahuštěnímza sníženého tlaku po filtraci se isoluje 13,2gramů (107 % teorie) surového produktu.Testováním produktu chromatografovánímna tenké vrstvě se zjistí přítomnost určité-ho množství nezreagované výchozí slouče-niny. Produkt se rozpustí v etheru a k roz-toku se přidá 5,25 ml (0,05 mol) terc.butyl-aminu. Roztok v etheru se zředí petrolethe-rem a po chlazení přes noc se odfiltruje 5,4 g sraženiny. Filtrát se extrahuje 1 N roz-tokem citrónové kyseliny, potom vodou, or-ganická fáze se vysuší síranem hořečnatýma filtrát se zahustí za sníženého tlaku do su-cha. Zbytek o váze 6,45 g se rozpustí v 100 204011 37 ml etheru, načež se k roztoku přidá 3,39 g(0,026 mol) D(-)-]-a-methylbenzy laminu.Roztok se chladí přes noc a filtrací se iso-luje 9,09 g (49% výtěžek celkově) slouče-niny, jejíž složení je uvedeno v nadpise. Lát-ka má b. t. 120 až 122 °C, [«]d25 = -14,1°(c = 1, methanol).

Analysa: pro C20H34N2O4 (366,5) vypočteno: 65,54 % C, 9,35 % H, 7,64 % N;nalezeno: 65,83 % C, 9,05 % H, 7,35 % N. B. N“-terc.Butyloxykarbonyl-NK-methyl-L- -leucylamid

Do 80 ml dimethylformamidu se přidá 11,5gramů (0,047 mol) NK-terc.butyloxykarbo-nyl-NK-methyl-L-leucinu, připraveného neu-tralisováním produktu z části A citrónovoukyselinou a extrakcí do etheru. Reakční směsse ochladí na —15 °C a přidá se 6,7 ml iso-butylesteru chlormravenčí kyseliny (0,052mol) a 5,7 ml (0,052 mol) N-methylmorfo-linu. Reakční směs se míchá 10 minut zachlazení na —15 °C, načež se hodinu zavádído reakční směsi bezvodý amoniak. Reakčnísměs se dále míchá 4 hodiny při —15 °C,vlije se na směs 1 N roztoku hydrogenuhli-čitanu sodného a ledu, studená směs se ex-trahuje etherem. Roztok v etheru se extra-huje 0,75 N roztokem citrónové kyseliny svodou, načež se vysuší bezvodým síranemhořečnatým a filtrát se zahustí za sníženéhotlaku. Krystalisací zbytku ze směsi etherua petroletheru se isoluje 5,5 g (48 %) slou-čeniny, jejíž složení je uvedeno v nadpise,b. t. 127 až 128 °C, |>]D25 = —42,2° (c = 1,methanol).

Analysa: pro C12H24N2O3 (244,3) vypočteno: 58,99 % C, 9,90 % H, 11,47 % N;nalezeno: 59,17 % C, 9,66 % H, 11,21 % N. C. NH-terc.butyloxykarbonyl-L-fenylalanyl- -N“-methyl-L-leucylamid

Do 30 ml ledové octové kyseliny, obsahu-jící 3 ml anisolu a 3 ml triethylsilanu, se při-dá 5,0 g (0,02 mol) produktu z části B a doreakční směsi se zavádí po dobu 25 minutsuchý plynný chlorovodík. Vyloučená sra-ženina se odsaje, sušením se získá 3,6 gramůproduktu, načež se tato sůl chlorovodíkovékyseliny rozpustí v 60 ml dimethylformami-du. Vzniklý roztok se ochladí na 0 °C, přidáse 3,99 ml (0,02 mol) dicyklohexylaminu, areakční směs se míchá při 0 °C 10 minut, na-čež se přidá 5,3 g (0,02 mol) NK-terc.butyl-oxykarbonyl-L-fenylalaninu a 2,7 g (0,02 38 mol) 1-hydroxybenzotriazolu, posléze ještě4,12 g (0,02 mol) dicyklohexylkarbodiimidu.Reakční směs se míchá 2 hodiny při 0 °C,potom 24 hodin za teploty místnosti, ochla-dí se na 0 °C a filtruje, načež se filtrát za-hustí za sníženého tlaku. Zbytek se rozpustív ethylesteru octové kyseliny, roztok se ex-trahuje za použití 1 N roztoku hydrogenuhli-čitanu sodného, vody, 0,75 N roztoku citró-nové kyseliny a vody, načež se organickýroztok vysuší síranem hořečnatým a roz-pouštědlo se oddestiluje za sníženého tla-ku. Zbytek se rozpustí v chloroformu a roz-tok se nanese na kolonu 3 X 45 cm silika-gelu (Grace a Davidson, Grade 62) s tím,že se eluování provádí chloroformem sestoupajícím gradientem methanolu, až tedysměsí chloroformu s methanolem (9 : 1).Na podkladě výsledků ze sledování chroma-tografií na tenké vrstvě se spojí vhodnéfrakce, a oddestilováním rozpouštědla sezíská 5,7 g (73 %) sloučeniny uvedené vnadpise, [a)D25 = —49,5° (c = 0,5, metha-nol). NMR-spektrum (CDCb): 5 1,4, terc.butylováskupina; δ 7,25, fenylová skupina; δ 0,95 —— 0,75, CH(CH3)2,; <5 2,7, N-CH3. D. N“-terc.butyloxykarbonyl-L-tyrosyl-D-ala-nylglycyl-L-fenylalanyl-N“-methyí-L-leu-cylamid

Ke směsi 20 ml 1 N roztoku chlorovodí-kové kyseliny s obsahem 1 ml anisolu se při-dá 2,0 g produktu ze stupně C a reakčnísměs se udržuje na teplotě místnosti po 30minut. Dále se zředí reakční směs etherem,roztok se ochladí a vzniklá sraženina seodifltruje a vysuší. Ve výtěžku 1,63 g se zís-ká sůl chlorovodíkové kyseliny, jež se roz-pustí v 30 ml dimethylformamidu, a k roz-toku se přidá 2,95 g (0,05 mol) soli N“-terc.-butyloxykarbonyl-L-tyrosyl-D-alanylglycinus dicyklohexylaminem. Reakční směs se mí-chá 15 minut při 0°C, načež se přidá 0,675gramů (0,005 mol) 1-hydroxybenzotriazolu a 1,3 g (0,005 mol) dicyklohexylkarbodiimidu.Dále se reakční směs míchá 24 hodin při4 °C, vyloučená sraženina se odfiltruje a filt-rát se zahustí za sníženého tlaku. Zbytekse rozpustí v ethylesteru octové kyseliny azískaný roztok se extrahuje 1 N roztokemhydrogenuhličitanu sodného, dále vodou,0,75 N roztokem citrónové kyseliny a vodou.Roztok v ethylesteru octové kyseliny se vy-suší síranem hořečnatým a zahustí se ve va-kuu. Zbytek se rozpustí v chloroformu a roz-tok se nanese na kolonu 3 X 45 cm se si-likagelem (Woelm, Grade III). Kolona seeluuje chloroformem se stoupajícím gradien-tem methanolu až do použití soustavy chlo-roform-methanol (9 : 1) a vhodné frakce sespojují podle výsledků chromatografie natenké vrstvě. Po oddestilování rozpouštěd-la se isoluje 2,3 g (67 %) sloučeniny, jejíž 204011 39 složení je uvedeno v nadpise, [a]D25 == —17,5° (c = 0,6, methanol).

Analysa: pro C35H5oNe08 (682,8) vypočteno: 61,57 % C, 7,38 % H, 12,31 % N;nalezeno: 61,33 % C, 7,47 % H, 12,08 % N.Analysa aminokyselin: nalezeno: tyrosin 1,00, alanin 1,01, glycin0,99, fenylalanin 1,00, amoniak 1,08. E. Sůl L-tyrosyl-D-alanyl-glycyl-L-fenylala-nyl-N“-methyl-L-leucylamidu s kyselinouoctovou

Do 5 ml mravenčí kyseliny, obsahující 0,5ml anisolu a 0,1 ml triethylsilanu, se vnese1,8 g (0,003 mol) produktu z části D a re-akční směs se míchá 3 hodiny za teplotymístností. Potom se reakční směs zředí ethe-rem a roztok se ponechá stát hodinu. Etherse odlišuje od vyloučeného oleje, olej se roz-pustí v ethanolu a přidáním etheru se vy-loučí pevná sraženina, jež se odfiltruje avysuší. Získá se tím 0,9 g surové sloučeninyuvedené v nadpise. Produkt se rozpustí vpufru (1 % pyridinu a 0,05 % mravenčí ky-seliny ve vodě) a množství dostačujícím nacelkový objem 5,0 ml a roztok se nanesena kolonu 2,5 X 100 cm diethylaminoethyl-sefadexu A-25 (v mravenčanovém cyklu) aeluování se provádí stejným pufrem. Vhod-né frakce se spojí podle vyhodnocení v ul-trafialovém světle za vlnové délky 280 nma globál se lyofilisuje. Opakováním lyofili-sování z 10% octové kyseliny a směsi vodya acetonitrilu (75 : 25) se získá 0,852 gsloučeniny, jejíž složení je uvedeno v nad-pise, [o(]d25 — + 23,2° (c = 0,6, 1 N roztokchlorovodíkové kyseliny).

Analysa aminokyselin: nalezeno: tyrosin 1,02, alanin 1,00, glycin1,01, fenylalanin 0,96, amoniak 1,03. Příklad 7 Příprava hydrochloridu L-tyrosyl-D-alanyl- -glycyl-L-fenylalanyl-S-p-methoxybenzyl-L- -cysteinylamidu A. N“-terc.Butyloxykarbonyl-S-p-methoxy-benzyl-L-cysteinylamid

Do 80 ml dimethylformamidu se po chla-zení na —15 °C vnese 6,82 g (0,02 mol) NK--terc.butyloxykarbonyl-S-p-methoxybenzyl--L-cysteinu a do vzniklé vychlazené reakčnísměsi se přidá 2,88 ml (0,022 mol) isobutyl-esteru kyseliny chlormravenčí a 2,42 ml(0,022 mol) N-methylmorf olinu. Za 10 minut 40 se zavádí do reakční směsi bezvodý plynný amoniak, a to po dobu 1,5 hodin, a reakční

směs se potom míchá za chlazení na —15 °C ještě další 2 hodiny. Po vlití reakční směsi na směs ledu a 1 N roztoku hydrogenuhliči- tanu sodného se extrahuje vzniklá vodná suspense do ethylesteru octové kyseliny extrakt v ethylesteru octové kyseliny se pro- myje vodou, 0,75 N roztokem citrónově ky- seliny a opět vodou. Organická vrstva se vysuší síranem hořečnatým a zahustí se ve vakuu. Zbytek se krystaluje ze směsi etha- nolu a vody a získá se tím 4,9 g (72 %) sloučeniny, jejíž složení je uvedeno v nad- · pise. Látka má b. t. 138 až 140 °C a [a]D25 — = —12,8° (c = 5, methanol).

Analysa: « pro C16H24N2O4S (340,4)vypočteno: 56,45 % C, 7,11 % H, 8,23 % N;nalezeno: 56,58 % C, 6,97 % H, 8,07 % N. B. N“-terc.Butyloxykarbonyl-L-fenylalanyl- -S-p-methoxybenzyl-L-cysteinylamid

Bezvodý chlorovodík se zavádí do rozto-ku 4,1 g (0,012 mol) produktu z části A vesměsi 45 ml ledové kyseliny octové, 5 ml a-nisolu a 5 ml triethylsilanu. Po 20 minutáchse přidá ether a filtrací i vysušením vzniklésraženiny se získají 3,3 g produktu. Tato sůlchlorovodíkové kyseliny se rozpustí v 50 mldimethylformamidu a přidá se 2,92 g (0,012mol) dicyklohexylaminu, 3,19 g (0,012 mol)N“-terc.butyloxykarbonyl-L-fenylalaninu a1,62 g (0,012 mol) 1-hydroxybenzotriazolu.

Reakční směs se míchá za chlazení na 0°Cpo 10 minut, přidá se 2,47 g (0,012mol) di-cyklohexylkarbodiimidu a za 2 hodiny ucho-vávání při 0 °C se reakční směs míchá zateploty místnosti po 24 hodin, načež se zno-vu ochladí na 0°C. Vyloučená sraženina seodfiltruje, filtrát se zahustí za sníženéhotlaku a získaný zbytek se rozpustí v n-bu-tylalkoholu. Roztok se extrahuje 1 N rozto-kem hydrogenuhličitanu sodného a vodou,načež se vysuší síranem hořečnatým a pofiltraci se filtrát zahustí za sníženého tlaku.

Zbytek se překrystaluje z ethanolu a isolujese takto 4,95 g (85 %) sloučeniny, jejíž slo-žení je uvedeno v nadpise, b. t. 175 až 178stupňů Celsia, [«)D25 = —35,1° (c = 0,5,dimethylf ormamid).

Analysa: pro C25H33N3O5S (487,6) vypočteno: 61,58 % C, 6,82 % H, 8,32 % N; nalezeno: 61,78 % C, 6,78 % H, 8,28 % N. C. N“-terc.Butyloxykarbonyl-L-tyrosyl-D-ala- 204011 41 nylglycyl-L-fenylalanyl-S-p-methoxybenz- yl-L-cysteinylamid

Bezvodý chlorovodík se zavádí do rozto-ku 1,3 g (0,027 mol) produktu z části B vesměsi 40 ml ledové octové kyseliny, 4 ml a-nisolu a 4 ml triethylsilanu. Za 20 minut sevysráží pevný podíl etherem; filtrací a su-šením se získá 1,1 g látky. Tato sůl chloro-vodíkové kyseliny se rozpustí v 10 ml di-methylformamidu a směs se ochladí na 0 °C.Přidá se 0,34 ml (0,0026 mol) triethylaminu,za 10 minut 1,06 g (0,0026 mol) Na-terc.bu-tyloxykarbonyl-L-tyrosyl-D-alanylglycinu aještě 0,35 g (0,0026 mol) 1-hydroxybenzotria-zolu a 0,536 g (0,0026 mol) dicyklohexylkar-bodiimidu. Získaná reakční směs se mícháza chlazení na 0°C 2 hodiny, potom 72 ho-din za teploty 4 °C, vyloučená sraženina seodfiltruje a filtrát se zahustí za sníženéhotlaku. Zbytek se rozpustí v ethylesteru oc-tové kyseliny a tento roztok se extrahujedo 1 N roztoku hydrogenuhličitanu sodné-ho, dále vodou, 0,75 N roztokem citrónovékyseliny a znovu vodou. Extrakt se vysušíbezvodým síranem horečnatým, načež se filt-rát zahustí za sníženého tlaku, isolovanýzbytek se rozpustí v ethylesteru octové ky-seliny a roztok se čistí sloupcovou chroma-tografií na silikagelu (Grace a Davidson,Grade 62). Frakce se spojují na základě vý-sledků chromatografie na tenké vrstvě a za-huštěním se získá 1,1 g 52 °/o) sloučeniny,jejíž složení je uvedeno v nadpise, a to krys-talisací z malého objemu ethylesteru octovékyseliny, [ ee]D25 = —4,3° (c = 0,5, dimethyl-sulfoxid).

Analysa: pro C39H50N6O9S (778,9) vypočteno: 60,14 % C, 6,47 % H, 10,79 % N; nalezeno: 59,95 % C, 6,24 % H, 10,53 % N.

Analysa aminokyselin, nalezeno: tyrosin 0,98,alanin 1,03, glycin 1,01, fenylalanin 0,98, a-moniak 0,99. D. Hydrochlorid L-tyrosyl-D-alnyl-glycyl-L- -fenylalanyl-S-p-methoxybenzyl-L-cystein- ylamidu

Do 20 ml ledové octové kyseliny s obsa-hem 0,5 ml anisolu se vnese 0,90 g (0,0012mol) produktu z části C a 30 minut se za-vádí do reakční směsi suchý chlorovodík.Lyofilisováním reakční směsi se získá 0,862gramů (100 %) sloučeniny uvedené v nad-pise, [ai]D25 = +2,6° (c = 0,5, 1 N roztokchlorovodíkové kyseliny).

Analysa: pro C34H43N6O7S (715,2) 42 vypočteno: 57,09 % C, 6,06 % H, 11,75 °/o N,4,96 % Cl; nalezeno: 56,85 0/0 C, 6,06 % H, 11,48 % N,5,21 % Cl.

Analysa aminokyselin, nalezeno: tyrosin 0,99,alanin 1,01, glycin 1,01, fenylalanin 0,98,amoniak 0,99. Příklad 8 Příprava soli L-tyrosyl-D-alanyl-glycyl-L-fe-nylalanyl-N'*'-methyl-L-methionylamidu s ky-selinou octovou. A. Sůl N“-terc.butyloxykarbonyl-N“-methyl--L-methioninu s d( + )-«-methylbenzylami-nem V 600 ml studeného etheru se suspenduje 86,13 g (0,2 mol) soli N“-terc.butyloxykar-bonyl-L-methioninu s dicyklohexylaminem asuspense se extrahuje čtyřikrát za použití100 ml studeného 1,5 N roztoku citrónovékyseliny a vody. Organická fáze se oddělí,vysuší se síranem hořečnatým a zahuštěnímfiltrátu za sníženého tlaku se získá zbytek,který se rozpustí v 150 ml tetrahydrofuranu,a roztok se přikapává během 30 minut domechanicky míchané suspense 0,6 mol hyd-ridu draslíku v 1000 ml suchého tetrahydro-furanu za chlazení na 0 °C, obsahující 1,0 g18-korunového-6 etheru. Během 15 minut sepřikapává 25 ml (0,4 mol) methyljodidu aza 2 hodiny po přidání methyljodidu se při-kapává směs 20 ml octové kyseliny a 20 mltetrahydrofuranu, potom ještě 40 ml ethano-lu. Reakční směs se míchá 30 minut, vlijese na 2 litry ledu, pH vodné směsi se upra-ví na hodnotu 7 přidáním 2 N roztoku hyd-roxidu draselného, vodná směs se extrahujetřikrát do 400 ml etheru a potom se okyselína pH 3 přidáním pevné citrónové kyseliny.Reakční směs se extrahuje třemi podíly po500 ml etheru, roztoky v etheru se spojí,extrahují se vodou a po vysušení síranemhořečnatým a zahuštění za sníženého tlakuse isoluje 44,76 g sirupu (84 % teorie). Zís-kaný sirup se rozpustí v 450 ml ethylesteruoctové kyseliny a k roztoku se přidá 25,78ml (0,2 mol) d(-j-)-a-methylbenzylaminu.Chlazením a škrabáním o stěny se vynutíkrystalisace. Sloučenina uvedená v nadpisese odfiltruje s výtěžkem 51,05 g (66 %),b. t. 131 až Ϊ14 °C, [«]D25 = -18,9° (c = 1,ethanol).

Analysa: pro C19H32N2O4S (384,54) vypočteno: 59,35 % C, 8,39 % H, 7,29 «/o N;nalezeno: 59,15 % C, 8,12 % H, 7,21 % N. B. NK-terc.Butyloxykarbonyl-N“-methyl-L--methionylamid 204011 43 44 V 160 ml dimethylformamidu se rozpustí 33.3 g (0,127 mol) N“-terc.butyloxykarbo-nyI-Na-methyl-L-methioninu, připravenéhookyselením d( + )-a-methylbenzylaminové so-li z části A a extrakcí do etheru. Roztok seochladí na —15 °C, přidá se 18,3 ml (0,14mol) isobutylesteru kyseliny chlormravenčía 15,4 ml (0,14 mol) N-methylmorf olinu.Reakční směs se míchá 10 minut za chlazenína —15 °C a trubičkou pro dispergování ply-nů se zavádí do reakční směsi hodinu plyn-ný bezvodý amoniak. Reakční směs se mí-chá 4 hodiny při —15 °C, načež se vlije do300 ml vychlazeného 1 N roztoku hydrogen-uhličitanu sodného. Vodná suspense se ex-trahuje etherem, roztok v etheru se promyjevodou, vychlazeným 0,75 N roztokem citró-nové kyseliny, znovu vodou, a po vysušenísíranem hořečnatým se filtrát zahustí zasníženého tlaku na sirup. Týž vykrystalujeze směsi etheru a petroletheru, čímž se zís-ká 16 g (48 %) sloučeniny, uvedené v nad-pise, b. t. 75 až 77°C, [«b25 = —117,3°(c = 0,5, CHCb).

Analysa: pro C11H22N2SO3 (282,77) vypočteno: 50,36 % C, 8,45 °/o H, 10,68 % N;nalezeno: 50,63 % C, 8,57 % H, 10,45 0/0 N. C. N“-terc.butyloxykarbonyl-L-fenylalanyl- -N“-methyl-L-methionylamid Připraví se směs z 70 ml ledové kyselinyoctové, 5 ml anisolu, 7 ml triethylsllanu a13,15 g (0,05 mol) produktu podle části B,a 25 minut se zavádí do této reakční směsibezvodý chorovodík. Potom se vlije reakčnísměs do etheru, vyloučená sraženina se od-filtruje a sušením se získá 9,9 g soli chloro-vodíkové kyseliny; ta se rozpustí v 200 mldimethylformamidu, reakční směs se ochla-dí na 0°C, přidá se 9,9 ml (0,05 mol) dicyk-lohexylaminu, a po desetiminutovém míchá-ní 6,8 g (0,05 mol) 1-hydroxybenzotriazolu, 13.3 g (0,05 mol) NK-terc.butyloxykarbonyl--L-fenylalaninu a 10,3 g (0,05 mol) dicyklo-hexylkarbodiimidu. Reakční směs se dálemíchá 2 hodiny při 0 °C, 48 hodin za teplo-ty místnosti, ochladí se znovu na 0 °C, a pev-né podíly se odfiltrují. Zahuštěním filtrátuza sníženého tlaku se získá olejovitý podíl,který se rozpustí v ethylesteru octové kyse-liny, a získaný roztok se postupně promývá1 N roztokem hydrogenuhličitanu sodného,vodou, 0,75 N roztokem citrónové kyselinya znovu vodou. Dále se roztok v ethylesteruoctové kyseliny vysuší síranem hořečnatýma po filtraci se filtrát zahustí za sníženéhotlaku; zbytek se dá překrystalovat z etherua získá se tím 16,4 g (80 %) sloučeniny, je-jíž složení je uvedeno v nadpise, b. t. 114 až115 °C, [ac]D25 = —43,4° (c = 0,5, methanol).

Analysa: pro C20H31N3O4S (409,55) vypočteno: 58,65 % C, 7,63 % H, 10,26 % N; nalezeno: 58,76 % C, 7,42 % H, 10,30 % N. D. N“-terc.butyloxykarbonyl-L-tyrosyl-D- -alanyIglycyI-L-fenylalanyI-Na-methyl-L- -methionylamid

Do směsi 20 ml ledové octové kyseliny, 2ml anisolu a 21 triethylaminu se přidá 3,5gramu (8,56 mmol) produktu ze stupně C,načež se do reakční směsi zavádí 25 minutsuchý chlorovodík. Přidáním etheru se z re-akční směsi vysráží hydrochlorid, který sepo odsátí vysuší ve vakuu. Odděleně se 0-chladí roztok 5,0 g (8,47 mmol) soli N“--terc.butyloxykarbonyl-L-tyrosyl-D-alanyl-glycinu s dicyklohexylaminem v 40 ml dime-thylformamidu na 0"C a do roztoku se při-dá výše uvedená sůl chlorovodíkové kyseli-ny. Reakční směs se míchá několik minutza chlazení na 0 °C, načež se přidá 1,1(8,47 mmol) 1-hydroxybenzotriazolu a 1,7gramů (8,47 mmol) dicyklohexylkarbodiimi-du. Po míchání 24 hodin za teploty 4°C seodfiltrují nerozpustné podíly a filtrát se za-hustí za sníženého tlaku. Zbytek se znovurozpustí v ethylesteru octové kyseliny a zís-kaný roztok se postupně promývá 1 N vod-ným roztokem hydrogenuhličitanu sodného,vodou, vychlazeným roztokem 0,75 N citró-nové kyseliny a vodou. Dále se roztok vy-suší síranem hořečnatým a filtrát se zahustído sucha. Zbytek se chromatografuje na si-likagelu (Grace a Davidson G-62) a získá setím 4,1 g (69 %) sloučeniny uvedené v nad-pise, (ab25 = —13,1° (c = 0,5, methanol).Analysa: pro C34H48N6O8S (700,86) vypočteno: 58,27 % C, 6,90 % H, 11,99 % N; nalezeno: 58,05 % C, 6,62 % H, 11,73 % N.

Analysa aminokyselin, nalezeno: tyrosín 1,00,alanin 1,01, glycin 0,99, fenylalanin 1,00, a-moniak 1,01 E. Sůl L-tyrosyl-D-alanyl-glycyl-L-fenylala-nyl-N“-methyl-L-methionylamidu kyselinyoctové

Do 15 ml thioanisolu se vnese 8,3 g (0,012mol) produktu z části D, reakční směs seochladí na 0 °C a přidá se 50 ml vychlazenétrifluoroctové kyseliny. Reakční směs se mí-chá za chlazení na 0 °C 30 minut, načež sezředí několika objemy etheru, vzniklá sra-ženina se odfiltruje a sušením se získá 8 gsurové soli kyseliny trifluoroctové. Ta se 204011 45 rozpustí v dostatečném objemu vodného puf-ru, obsahujícího 1 % pyridinu a 0,05 % oc-tové kyseliny, tak, aby objem činil 60 ml.Roztok se nanese na kolonu 5 X 138 cm di-ethylaminoethylsefadexu A-25 (v acetátovéformě], jež byla předtím uvedena do rov-novážného stavu použitím téhož pufru. Sle-duje se absorbance v ultrafialovém světle při280 nm a jímá se produkt, který se eluujemezi 1270 ml a 1950 ml. Pufr se lyofilisuje,zbytek se rozpustí v asi 200 ml 1 N roztokuoctové kyseliny a roztok se znovu lyofilisuje.Konečné lyofilisování se provede ze směsivody a acetonitrilu (3 : 1], získá se tím 6,64 ' gramů (83 %) sloučeniny uvedené v nadpise, [α;]η25 + 21,7° (c = 1, 1 N roztok chlorovo-díku ). • Analysa: pro C3iHt4N6O8S (660,79) vypočteno: 56,35 % C, 6,71 % H, 12,72 % N,19,37 % O; nalezeno: 56,50 % C, 6,46 % H, 12,62 % N,19,25 % O.

Analysa aminokyselin, nalezeno: tyrosin 1,00,alanin 1,01, glycin 1,00, fenylalanin 0,99, a-moniak 1,03.

Sloučeniny obecného vzorce I jsou cennáa použitelná analgetika, přičemž analgetic-kou účinnost sloučenin obecného vzorce Ilze dokázat na myších testech na horké des-ce. Při tomto testu se myš umístí ve svislémakrylovém válci, obsahujícím u základnydesku s horkým povrchem, který je udržovánna teplotě 52 °C. Při tomto testu se myším 48 podá subkutánní injekcí předem stanovenémnožství testované sloučeniny, jež je roz-puštěna nebo suspendována ve vhodném msiči. Dovolí se potom uplynout po podání tes-tované sloučeniny předem stanovená doba,načež se myš umístí na horkém povrchu.Zaznamená se latence v sekundách, až seobjeví náznak dvou různých jevů. Nejprvese zjistí latence, až myš začne olizovat zad-ní tlapku, a za druhé se změří latence, ažmyš začne vyskakovat nad horkou desku.Činidlo, vyznačující se analgetickou účin-ností, způsobuje zvýšení latence ve srovnánís kontrolními myškami, kterým se podáváinjekčně pouze nosič. To vše se musí podá-vat v dávkovacím rozsahu, kdy nedochází knekoordinaci pohybových ústrojí nebo kznehybnění. V dalších tabulkách jsou vý-sledky dosažené při tomto testu, a to vesrovnání s kontrolní látkou, tedy přírodnímenkefalinem a přírodním enkefalinem převe-deným na odpovídající amid. V tabulce Ijsou latence týkající se lízání zadních tla-pek, v tabulce II jsou latence se zřetelemna vyskakování zvířátek. A v tabulce III jsoupercentové údaje o zvířatech z každé tes-tované skupiny, kde se jevil analgetický ú-činek. Kritériem pro vyhodnocení analgetic-kého účinku bylo toto stanovisko. Latencepro lízání zadní tlapky nebo nadskakováníošetřovaného zvířete se musí rovnat nebo býtvětší ve srovnání se střední hodnotou kont-rolní latence + 2 standardní odchylky odprůměru. Každý výsledek, jak je uveden vnásledujících tabulkách I a II, znamenástřední hodnotu plus nebo minus standardníchybu a a v tabulce III jsou percentuálníúdaje, získané za použití nejméně 9 myší aždo počtu i 40 myší. *· 204011

Analgetická účinnost

Latence lízání zadních tlapek, v sekundách oučeninac Doba Kontrolní Dávka, mg/kga po podání skupina 1 3 10 30 100 200 co~ □> CM* CM* CO* l+l +1+1 1 1 1 1 r-1 rH rH O* CO* CD* co . -Φ CO Ή CM^ CM^CM ΙΟ CM* CM* CM* CO* +11 +1+1 | i i +i co CD CD co* CO* 00* CD* co CO CM *Φ

τ-i i—) i—I T-1 ř'] ÍM _ i-H cm" σΓ o" co* co* cm" cm* cm* cm* cm" cm cm* co* cm"

+1 +I+I+I+I+I+I+I+I+I+I+I+I+I cd udcm" *φ"

LÍD OOC^t^OOrHCOCOCD ’Φ t>. CO" LíD" CMe "Φ* CO bs 00 LÍD UD OD o 't<o" UD* ·φ" CO CO LÍD CO CO CO CM Tji CO co co CO *Φ CO °0 r”i i—1 i—l CM i—( i—( i-i tH co^in co CD" OO" líd CO ut rH CD* rH* CM* CM* CM* rH CM* cm" líd" rH +1 +I+I+I+I+II +11 +11 1+1! 1 +1 1 l+l cd CO^ OO' OO' Mi -Φ CO" CM" *φ" UD* 00* o* co* t>" 00* oo" líd" CD* O* *φ CO ••Φ τφ CO CO co co CO LÍD co i—4 i—4 i—l 1-4 i-4 CM CM CO O" O" ID" CM" rH CO* CM* rH rH CM* CM* CO* CM* 1 +1+1+11 | [ +11 +11 1+11 +1 1 l+l cm co in CO" CD" CD" C>." tX" CO 00 CM* CD rH co* co co CO CO CO <φ CO in t> CM ID υ Mí rH CM* CM* CO* CM* 1 I +11 1 1 1 +H +H l+l 1 | 1 +H CO" CO" CM O" O" o" ud" ”Φ* rH ’φ* co co CO CO co oo rHOOCOrHOOOOOOrH oo OO" rH CO 00 CD 05 if CM 'o* rH O* rH* rH* O* rH* O* rH* O* rH* rH O rH CM CO CM CM

+1+1 +1+1 +I+I+I+I+I+I+I+I+I+I+I+I+I+I+I+I+I

UD CD ofco*CM co r^ coco* co*co co ud o ud ud cd

r^ co ογ rH CO CD^ 00^ rH CO r^ CO^ CD 00 <O CMCO* CO* CM* CO* CO* CM* CO* CO* CO* CM* CO* CO* CM* CM* ΙΩ* O* 1S*COCOCOCOCOCOCOCOCOCOCOCOCOCOCOCOCM ududoududoudududOududoudududud

rH CO rH CO rH rH CO rl CO rH rl Η H co

<M Φ 4tí cd φ Φ 4tí ti Φ

CQ fa o

CO 204011 o o

CM &amp;0 Ίϊ) a co r* > 'Cti O , o co

<=* θ'CO h H I +1 +1+1

CO cm" co" to"cd cd o +1 cm" co +i+i co o +1 co

CD Ό.' ►k ' _;’4i CO ‘ 5· °°~3“ + 33"«3"co

+1 +I+I+I+I+I+I+I+I+I+I4-1+I+I m <-λ CO O <—«, CO __ m «,·. rr\ rr\ λι

tio CO 1 . ~ ~ r-H ,-·'_i ΓΤι *>w m

CD

Cm"

CO 00 ς í H, O ~ CO CO CM CO 00 r\co u-r co ~ ~rH <Φ

^CM

, ^r, -. S2 cm" o in o" I< co co"I^CMjLjcQCOcOTHt^^lDCO CM 7+ CMh°°- ο°-Ί^

CO CM

h> r—I CO CO^ cm"

' CD

(O cd" co cm"

CM

CM +1 +I+I+I+I+I I +1 I +1 I | +1 | 5 +1 | +1

Analgetická účinnostLatence úniku výskokem, sekund fi o

R

4-J a o « <ΰ a cd .s ‘2 φ >o 3 co^ !>." !>.

cd o- t> -srctT 1-1 c\T +1+1 +1+1 iocm~ co cocd" φ" o" co"o. co i> tx

LD O LO ÍO cd

«W Φ 4sd a φ OD 2. CD ΙΟ ’Φin" 2 co" cm"CO 2

tH rH Φ

rM 01 Φ

1 O ΙΛ w4-> MΦ JO}

2 «J w q-t s (0

CM Φ co"

rH to"

rH

CM °1 cd" io Ή

w„o) 10 rH CM^ r-l UD Φ~ CO' 7, ]>." cd" cm" tH t—1 CM ď CM +1+1+1 i 1+1 i + i i+i l+l 1 l+l co rH Φ CM~ §3“ co" rH Ή cm" o rH co" O ί 1 1 cm" co _J co" CM v—J ω t—1 co co" o o" CM ©θ' co" rH cm" tH UO' cm" rH +11 1 1 1 +1 l+l 1 1 +1 1 1 l+l CM~ CD^ to co" CD co" σ" o" CD 00 00 co t> Φ_ O Φ~ C\ xr θ' t> Φ_ CO CD^ CD IO ~

φ" cm" t>" φ" cm" t>" cm" φ" cm" »" φ" cm" [>" cd" co" oo" 00+I+I+I+I+I+I+I+I+I+I+I+I+I+I+I+I+ICO CD 'Φ 00 CD 'Φ CD CO' CD *Φ CO CD Φ co CO^ COo" co" cm" o" co" cm" co" θ' co" cm" o" co" cm" to" Cx" cm" £2t> E>- CD I> CD í> í> CD Cx t> CD LO tx LO to

looioiooioininoiorH CO H CO Η H CO

O 1O to IO toCO rH rH rH rH 204011

I CM 05 ID

I CM rH CM o o

CM

CO co

rH co m< μ»

CM CM

CO E-h

P

CM CO

Analgetická účinnost

Percentuální vyhodnocení zvířat s analgetickou odezvouSlouče- Doba po Dávka, mg/kg a-d o co co E-h

P fi

'cd B ό b

O B

ID ΙΌ co

CO

CM

O S c-s o o O 0500 H CO ΙΓ5 Mi CM CO

CM CO O CO CO OCM CO CO S

O ΙΌ S 02 O OCO 00 ΙΩ rH CM

co co inCO rH CM

CM Mi rHCM M< rH O O CM O O rH I CO00 CO ΙΌ ΙΌ CM l co

Ml O O CO ΙΌ ÍO f ÍT5rH m mí ío cm co l cm

I O ΙΓ5 OI CO ΙΓ5 rH

o coMi CM

CM in

IÍ5U5 OIT5LDrH CO rH

B

CM

CM

CM

CM o ir>

in iCM I

O I rH l co

CD in Y—ico o

Mi o t> o

rH rH i o Oco I t>s co CO I O MlI CO Mi

O ÍO ΙΠ ΙΌCO rH rH

o lo in o in mCO rH CO rH rH

Claims (12)

1. 204011 47 Vysvětlivky k tabulkám: a) Pokud není uvedeno jinak, byly testyprovedeny za použití fysiologického roztokuchloridu sodného při kontrolních pokusech.Indexy „1” nebo „2” značí, že výsledek od-povídá P <0,01 a P <0,05 v tom kterém pří-padě. b) Test i kontrolní pokus byly provedenyv roztoku akaciové gumy s látkou v suspensi. c) Označení se vztahuje k těmto látkám: A. Hydrochlorid L-tyrosyl-D-alanyl-glycyl-L- -fenylalanyl-NK-methyl-L-methionylamidu (příklad 1). B. Hydrochlorid L-tyrosyl-D-alanyl-glyeyl-L- -fenylalanyl-L-methionylamidu. C. 1,25 Hydrochlorid monoacetátu L-tyrosyl- -D-alanyl-L-aianyí-L-řenylalanyl-N“-me-thyl-L-methionylamidu (příklad 4). 48 D. Seskvihydrochlorid monoacetátu L-tyro-syI-D-leucyl-glycyl-L-fenylalanyl-N“-me-thyl-L-methionylamidu (příklad 2). E. Trihydrát hydrochloridu L-tyrosyl-D-ala-nyl-glycyl-N“-methyl-L-fenylalanyí-N“--methyl-L-methionylamidu (příklad 3). F. Acetát L-tyrosyl-D-alanyl-glycyl-L-fenyl-alanyl-N“-methyl-L-leucylamidu (příklad6). G. Acetát L-tyrosyl-D-alanyl-glycyl-L-fenyl-alanyl-L-N“-methyl-S-ethylcysteinylamidu(příklad 5). d) LT = lízání tlapekUV — únik výskokem e) Při testování v dávce 0,4 mg/kg bylalatence při lízání zadních tlapek 33,9 + 2,3sekund, latence při úniku výskokem 129,0+ 11,5 sekund; analgetická odezva 10% vprvém a 60% v druhém případě. PÍEDMST VYNALEZU

   1. Způsob přípravy substituovaných penta-peptidů obecného vzorce I, (L) ID) IL) O í? 0hpn-ch-c-nh-ch-c-nh~ch~c <· I I I (L) ID

   OH t II) kde L a D, přicházejí-li v úvahu, definují chi-ralitu, přičemž R< je C1-C4 primární nebo sekundární al-kyl, Rs je vodík nebo C1-C3 primární alkyl, Rs je vodík nebo C1-C3 primární alkyl, R7 je vodík nebo C1-C3 primární alkyl,Z je skupina O II —C—NH2 a W je isopropyl, skupina —-CH2SCH3,—S—CH2CH3 nebo s podmínkou, že je-li W isopropyl, pak R?je C1-C3 primární alkyl, a jejich farmaceutic-ky přijatelných adičních solí s netoxickýmikyselinami, vyznačující se tím, že se z odpo-vídající chráněné sloučeniny obecného vzor-ce II, ' 204011

   49 S0 o O O r6 o R?R^NH-CH-C-NH-qH-C-NH-CH-C-^-CH-C-N-CH-Z

   (II) kde Rio je benzyloxykarbonyl, terc.butyloxykar-bonyl, terc.amyloxykarbonyl, p-methoxybenz-yloxykarbonyl, adamantyloxykarbonyl neboisobornyloxykarbonyl a ostatní symboly ma-jí výše uvedený význam, odštěpí chránícískupiny v prostředí suché kyseliny.
2. 2. Způsob podle bodu 1, vyznačující setím, že se jako suché kyseliny použije kyse-liny trifluoroctové.
3. 3. Způsob podle bodu 1, vyznačující setím, že se jako suché kyseliny použije ledo-vé kyseliny octové s plynným chlorovodí-kem.
4. 4. Způsob podle bodu 1, vyznačující setím, že se jako suché kyseliny použije 98%kyseliny mravenčí.
5. 5. Způsob podle bodu 1 pro přípravu L--tyrosyl-D-alanyl-glycyl-L-fenylalanyl-N“--methyl-L-methionylamidhydrochlorídu, vy-značující se tím, že se N“-terc.butyloxykarbo-nyl-L-tyrosyl-D-alanyl-glycyl-L-fenylalanyl--N“-methyl-L-methionylamid nechá reagovats ledovou kyselinou octovou a suchým plyn-ným chlorovodíkem.
6. 6. Způsob podle bodu 1 pro přípravu L--tyrosyl-D-leucyl-glycyl-L-fenylalanyl-N“--methyl-L-methionyl-amidseskvihydrochlo-ridmonoacetátu, vyznačující se tím, že seN“-terc.butyloxykarbonyl-L-tyrosyl-D-leucyl--glycyl-L-fenylalanyl-N“-methyl-L-methio-nylamid nechá reagovat s ledovou kyselinouoctovou a suchým plynným chlorovodíkem,načež se lyofilizuje z vodné kyseliny octové.
7. 7. Způsob podle bodu 1 pro přípravu L-ty-rosyl-D-alanyl-glycyl-N“-methyl-L-fenylala-nyl-N“-methyl-L-methionylamldhydrochlo-ridtrihydrátu, vyznačující se tím, že se N“--terc.butyloxykarbonyl-L-tyrosyl-D-alanyl--glycyl-N“-methyl-L-fenylalanyl-N“-methyl--L-methionylamid nechá reagovat s ledovoukyselinou octovou a suchým plynným chlo-rovodíkem.
8. 8. Způsob podle bodu 1 pro přípravu L-ty- rosyl-D-alanyl-L-alanyl-L-fenylalanyl-N“- 1 $ -methyl-L-methionylamid-l,25-hydrochlorid-monoacetátu, vyznačující se tím, že se-N“--terc.butyloxykarbonyl-L-tyrosyl-D-alanyl-L--alanyl-L-fenylalanyl-N“-methyl-L-methionyl- amid nechá reagovat s ledovou kyselinouoctovou a suchým plynným chlorovodíkem.
9. 9. Způsob podle bodu 1 pro přípravu L--tyrosyl-D-alanyl-glycyl-L-fenylalanyl-L-N“--methyl-S-ethyl-cysteinylamidacetátu, vyzna-čující se tím, že se N“-terc.butyloxykarbonyl--L-tyrosyl-D-alanyl-glycyl-L-fenylalanyl-N“--methyl-S-ethyl-L-cysteinylamid nechá reago-vat s ledovou kyselinou octovou a suchýmplynným chlorovodíkem, načež se lyofilizujez kyseliny octové.
10. 10. Způsob podle bodu 1 pro přípravu L--tyrosyl-D-alanyl-glycyl-L-fenylalanyl-N“--methyl-L-leucylamidacetátu, vyznačující setím, že se N“-terc.butyloxykarbonyl-L-tyro-syl-D-alanyl-glycyl-L-fenylalanyl-N“-methyl--L-leucylamid nechá reagovat s kyselinoumravenčí, načež se lyofilizuje z kyseliny oc-tové.
11. 11. Způsob podle bodu 1 pro přípravu L- -tyrosyl-D-alanyl-glycyl-L-fenylalanyl-S-p--methoxybenzyl-L-cysteinylamidhydrochlori-du, vyznačující se tím, že se N“-terc.butyl-oxykarbonyl-L-tyrosyl-D-alanyl-glycyl-L--fenylalanyl-S-p-methoxybenzyl-L-cysteinyl- I amid nechá reagovat s ledovou kyselinou octovou a suchým plynným chlorovodíkem. j
12. 12. Způsob podle bodu 1 pro přípravu L--tyrosyl-D-alanyl-glycyl-L-fenylalanyl-Na--methyl-L-methionyl-amidacetátu, vyznačujícíse tím, že se N“-terc.butyloxykarbonyl-L-ty-rosyl-D-alanyl-glycyl-L-fenylalanyl-N“-me-thyl-L-methlonylamid nechá reagovat s ky-selinou trifluoroctovou, načež se lyofilizujez kyseliny octové. Severografia, o. p., závod 7, Most