NO161744B

NO161744B - Fremgangsmaate for fremstilling av peptidet h-arg-x-z-y-tyr-r.

Info

Publication number: NO161744B
Application number: NO812035A
Authority: NO
Inventors: George Heavner
Original assignee: Ortho Pharma Corp
Priority date: 1980-06-17
Filing date: 1981-06-16
Publication date: 1989-06-12
Also published as: IL72392A; JPH01308297A; CA1188297A; EP0144103A2; AU4566685A; PH16501A; JPH0357118B2; DK154437C; CA1285099C; DK227787D0; NO164245C; DK263781A; AU4566785A; IE881720L; DE3177306D1; PT73201B; ES503012A0; NO900294D0; DK154653C; DK154437B

Description

Foreliggende oppfinnelse angår en fremgangsmåte

for fremstilling av peptidet H-ARG-X-Z-Y-TYR-R.

I US patenter 4.190.646 og 4.261.886 er det beskrevet forskjellige peptider som har thymisk og immuno-logisk funksjon. US patent 4.190.646 beskriver "thymo-poietin-peptapeptidet" (TP5) og substituerte derivater derav, mens US patent 4.261.886 beskriver peptidanaloger av TP5 med større virkning enn TP5. I US patentene blir nevnte peptider fremstilt ved en synteseteknikk i fast fase, vanligvis beskrevet som "Merrifield-syntese". Patentene beskriver også at den klassiske teknikk (dvs. oppløsnings-synteseteknikk) kan brukes for å fremstille visse peptider og derivater, men det er ikke beskrevet noen spesifikk klassisk fremgangsmåte eller syntesevei.

Skjønt Merrifield's synteseteknikk i fast fase

er hensiktsmessiq for fremstilling av små mengder peptider i laboratoriet, så ville den være upraktisk og generelt uøkonomisk for fremstilling av store mengder (dvs. mer enn 100 g) peptid, og for slike større mengder er det mer hensiktsmessig å bruke en oppløsningssynteseteknikk. Denne type teknikk er vanligvis langt billigere enn en teknikk hvor man bruker fast fase, noe som skyldes en lavere enhets-pris på enkelte av de reaaenser som brukes. Blant de mange typer oppløsningssynteseteknikker som er tilgjengelige for polypeptidfremstillinger, så har man nå oppdaget en spesiell syntetisk fremgangsmåte som gir det ønskede peptid en hensiktsmessig og økonomisk måte.

Ifølge foreliggende oppfinnelse er det således til-veiebragt en fremgangsmåte for fremstilling av peptidet H-ARG-X-Z-Y-TYR-R hvor X er LYS og Y er VAL, eller X og Y

er begge SAR, Z er ASP eller GLU, og R er OH eller NH2, og denne fremgangsmåten er kjennetegnet ved at man:

A) danner fragment I, som består av H-Y-TYR-R<1>

hvor R<1> er OU eller NH2; Y er SAR eller VAL; og U er benzyl eller benzyl hvori fenylgruppen er substituert med fra 1 til 3 grupper valgt fra halogen, nitro, C^-C^ laverealkyl, og C^-C-j laverealkoksy, ved

i) beskyttelse av alfa-aminogruppen i Y-aminosyren ved å la den reagere med en reagens som

vil introdusere beskyttelsesgruppen T, hvor gruppen T er valgt fra

a)

hvor R.^ er fenyl; tolyl; xylyl; adamantyl; allyl; beta-cyanoetyl; fluorenyl-metyl; benzyl; benzyl hvor fenylringen er substituert med fra 1 til 3 grupper valgt fra halogen, nitro, laverealkyl og laverealkoksy, nitropropylmetyl; difenylmetyl; cykloheksyl; cyklopentyl; vinyl; t-butyl; t-amyl; dimetylfluor-metylmetyl; eller dimetylbifenylmetyl; b) hvor R- er laverealkyl med 2-4 karbonatomer eller laverealkyl med 1-4 karbonatomer substituert med fra 1 til 5 halogengrupper; c) hvor V er S eller 0, og og R^ hver er benzyl eller laverealkyl; d)

hvor Rt- og R^ individuelt hver er

laverealkyl, eller R^ og Rg sammen er -CH2-C-CH2- hvor R7 og Rg hver

<R>7<R>8

er hydrogen eller laverealkyl;

e)

hvor Rg er hydrogen eller nitro;

og

f)

hvor R1Q er hydrogen, metyl, halogen

eller nitro,

forutsatt at T er monodentat når X er SAR;

ii) aktivering av den beskyttede Y dannet i trinn

i) med hensyn til nukleofilt angrep ved karboksygruppen av et amin, til dannelse av en karboksyaktivert beskyttet Y-aminosyre;

iii) omsetning av nevnte karboksyaktiverte beskyttede

Y med TYR-R' hvor R' har den ovenfor angitte betydning;

iv) fjerning av den beskyttede gruppe T, hvorved fragment I dannes,

B) danner fragment II, som består av alfa-T-(epsilon-T")X-omega-U-Z-OH, hvor Y, U og Z har de ovenfor angitte betydninger, og T" har samme betydning som T angitt ovenfor, ved

i) fremstilling av omega-U-Z-OH, hvor U er en beskyttende gruppe på omega-karboksygruppen i Z-aminosyren, og har den ovenfor angitte betydning;

ii) beskyttelse av alfa-aminogruppen (og dersom X er LYS, epsilon-aminogruppen) i X-aminosyren ved å la den reagere med reagens(er) som vil introdusere den beskyttende gruppen(e) T (og T"), hvor T og T" har de ovenfor angitte betydninger;

iii) aktivering av den beskyttede X dannet i trinn ii)

med hensyn til nukleofilt angrep ved karboksygruppen av et amin, til dannelse av en karboksyaktivert, beskyttet X-aminosyre;

iv) reaksjon av nevnte karboksyaktiverte beskyttede X-aminosyre med omega-U-Z-OH, hvorved fragment II dannes;

C) reagerer fragmenter I og II til dannelse av fragment III som består av T-(epsilon-T")X-omega-U-Z-Y-TYR-R<1>, hvor X, U, Z, Y, R', T og T" har de ovenfor angitte betydninger; D) fjerner T-beskyttelsesgruppen fra fragment II til dannelse av fragment HIA som består av H-(epsilon-T")X-omega-U-Z-Y-TYR-R<1> hvor symbolene har den ovenfor angitte betydning; E) fremstiller alfa-T-omega-T<1->ARG, hvor T er en beskyttende gruppe på alfa-aminogruppen i L-arginin, og T' er en beskyttende gruppe på guanidinogruppen i L-arginin,

hvor T" er en gruppe valgt fra gruppen bestående av

0

it

R-^-OC- hvor R-^ har den ovenfor angitte betydning, nitro, hydroklorid, p-metoksybenzylsulfonyl og tosyl; F) omsetter fragment HIA med alfa-T-omega-T'-ARG til dannelse av alfa-T-omega-T<1->ARG-(epsilon-T<1>)X-omega-U-Z-Y-TYR-R' , hvor symbolene har de ovenfor angitte betydninger; G) fjerner gruppene U, T, T' og T" til dannelse av peptidet

H-ARG-X-Z-Y-TYR-R; og

H) isolerer og renser det resulterende peptid.

Hvis X er LYS, så må selvsagt dets epsilon-aminogruppe også hensiktsmessig beskyttes ved hjelp av den aminobeskyttende gruppen T" under fremstillingen av fragmenter som inenholder X og under deres anvendelse for fremstilling av sluttpeptidet. Nevnte T"-gruppe må lett kunne fjernes under betingelser som ikke ødelegger det resulterende peptid, samtidig som nevnte gruppe må være stabil under fjerning av T-gruppene.

Den alfa-aminobeskyttende gruppen T kan være den samme eller forskjellig for hver av aminosyrene, og må være stabil overfor fjerning i de trinn som brukes for å knytte sammen aminosyregruppene, samtidig som den lett må la seg fjerne ved slutten av de forbindende trinn ved betingelser som ikke vil spalte noen av amidbindingene i peptidet. For visse grupper (f.eks. BOC) frembringes denne fjerning ved hjelp av en sterk syre (f.eks. trifluoreddiksyre) som resulterer i at det intermediære produkt fremstilles som det tilsvarende

syreaddisjonssalt (f.eks. trifluoracetat).

Den guanidinobeskyttende gruppen T' kan være enhver egnet aminobeskyttende gruppe slik dette er beskrevet neden-for, eller en nitrogruppe såvel som syreaddisjonssalter så som hydrokloridet. Blant de aminobeskyttende grupper er det foretrukket å bruke uretanbeskyttende grupper (formel a neden-for) og substituerte sulfonsyrederivater så som p_-metoksy-benzensulfonyl og tosyl. Hydrokloridsaltet er det mest foretrukne. Denne guanidinobeskyttende gruppen er her betegnet "omega"-gruppen for å indikere at den befinner seg på enden av kjeden. Den eksakte posisjon på mange guanidinobeskyttende grupper på kjeden er ikke definitivt kjent.

Den karboksy-beskyttende gruppen U bør la seg lett fjerne under betingelser som ikke ødelegger det resulterende peptid, samtidig som gruppen må være stabil under fjerning av T-gruppene.

R'-gruppen er enten NH2 (for produktpeptider hvor

R er NH2) eller OU (for produktpeptider hvor R er OH).

Den ovenfor ancdtte aminobeskyttende gruppen f) som er bidentat, kan bare brukes for alfa-aminogruppene på L-arginin eller L-valin eller alfa-amino eller epsilon-aminogruppene på L-lysin, men ikke for alfa-aminogruppen i sarkosin. Den aminobeskyttende gruppen for sarkosin-alfa-aminogruppen må være monodentat på grunn av metylsubstituenten på denne aminogruppen. De gjenværende aminobeskyttende grupper kan brukes for alle aminosyrer.

Slik det brukes her, innbefatter begrepet "halogen" fluor, klor brom og jod, men klor og brom er de foretrukne. Begrepene laverealkyl og laverealkoksy innbefatter henholds-vis mettede alifatiske hydrokarboner med fra ett til seks karbonatomer så som metyl, etyl, isopropyl, t-butyl, n-heksyl o.l., samt de tilsvarende alkoksyder så som metoksy, etoksy, isopropoksy, t-butoksy, n-heksoksy o.l. Metyl er den foretrukne laverealkylgruppe og metoksy er den foretrukne lavere-alkoksygruppe.

De reagenser som brukes for å innføre disse beskyttende grupper (vanligvis de tilsvarende syreklorider, skjønt andre derivater også kan brukes) vil i enkelte tilfeller her bli betegnet som "beskyttende gruppereagenser". Andre egnede beskyttende grupper er f.eks. beskrevet i "Protective Groups in Organic Chemistry", J.F.W. McOmie, redaktør, Plenum Press, N.Y., 1973.

Det er foretrukket at hver T og T" er de samme og kan være benzyloksyoksykarbonyl (CBZ) eller trifluoracetyl (TFA). Det er foretrukket at T' er hydrokloridsaltet.

En rekke forskjellige reagenser kan brukes for å fremstille de karboksyaktiverte, beskyttede aminosyregrupper som er beskrevet ovenfor.

En type karboksyaktivert, beskyttet aminosyregruppe er en reaktiv ester. Eksempler på reagenser som kan brukes for å fremstille egnede aktiverte estere er .fenol, fenol hvor fenylringen er substituert med fra en til fem grupper valgt fra gruppen bestående av halogen (f.eks. klor eller fluor), nitro, cyano og metoksy; tiofenyl; N-hydroksyftal-imid; N-hydroksysuccinimid; N-hydroksyglutarimid; N-hydrok-sybenzamid; 1-hydroksybenzotriazol o.l. Andre egnede midler er f.eks. beskrevet i "Protective Groups in Organic Chemistry", J.F.W. McOmie, redaktør, slik denne er referert ovenfor. I de etterfølgende spesifikke eksempler vil man vanligvis anvende N-hydroksysuccinimid eller 1-hydroksybenzotriazol .

Andre aktiveringsmetoder så som den blandede eller symmetriske anhydridmetoden, syrekloridmetoden og azid-metoden er velkjente, og er f.eks. beskrevet i Bodanszky,

et al., "Peptide Synthesis", 2. utgave, 1976, sidene 85-128. Disse andre fremgangsmåtene kan også brukes.

Av hensiktsmessighetsgrunner vil de følgende for-kortelser bli brukt for å betegne de forskjellige aminosyrer:

Foreliggende fremgangsmåte er diagrammessig vist på følgende fig. 1:

Et eksempel på fremstilling av H-ARG-SAR-ASP-SAR-TYR-NH2 er diagrammessig vist på følgende fig. 2:

Et eksempel på fremstillingen av H-ARG-LYS-ASP-VAL-TYR-OH er diagrammessig vist på følgende figur 3:

I de ovennevnte figurer er de beskyttende grupper representert ved U, T, T<1> og T" som angitt ovenfor, mens karboksyaktiveringen av aminosyregruppen er angitt med bokstavene "OA".

Med henvisning til figur 2 så kan fragment I vanligvis fremstilles på følgende måte. For å beskytte aminogruppen i sarkosin, så fremstiller man et vannoppløselig, basisk addisjonssalt av sarkosin i vann. Hensiktsmessig kan dette basiske addisjonssalt fremstilles ved å oppløse sarkosin i et svakt molart overskudd av natriumhydroksyd. Denne oppløsning blir så samtidig tilsatt et svakt overskudd av en reagens for å innføre den beskyttende gruppen T (f.eks. det tilsvarende syrekloridet så som benzyloksykarbonyl-klorid) og en oppløsning av en base (f.eks. natriumhydroksyd) for å reagere med syren (f.eks. HCl) som dannes under reaksjonen. Reagensen med den beskyttende gruppen må være i opp-løsning og er fortrinnsvis syrekloridet. Etter at reaksjonen er ferdig ble overskuddet av den reagens som innførte den beskyttende gruppe fjernet (f.eks. ved ekstraksjon med dietyleter eller et annet organisk oppløsningsmiddel som er ublandbart med vann), fulgt av en isolasjon av det beskyttede sarkosin fra uomsatt sarkosin, noe som skjer ved en behandling med syre (f.eks. saltsyre). Syrebehandlingen om-danner det basiske addisjonssaltet av det ubeskyttede sarkosin til et syreaddisjonssalt av ubeskyttet sarkosin, og dette er oppløselig i vann. Imidlertid så vil syrebehandlingen omdanne det beskyttede sarkosinbasiske addisjonssaltet bare til beskyttet sarkosin, ettersom det nå ikke er mulig å fremstille et syreaddisjonssalt på grunn av den beskyttede aminogruppen. Dette beskyttede sarkosin er uopp-løselig i vann, og det lar seg lett utskille fra saltet av det ubeskyttede sarkosin,. f.eks. ved en ekstraksjon med et ublandbart organisk oppløsningsmiddel slik dette er beskrevet ovenfor. Med begrepet "ublandbart organisk oppløsnings-middel" forstås alle vanlige kjente organiske oppløsnings-midler som ikke lar seg blande med vann, f.eks. dietyleter, etylacetat, benzen, toluen, xylen o.l. Det foretrukne beskyttede sarkosin, N-benzyloksykarbonylsarkosin er en kjent forbindelse. En fremgangsmåte for dets fremstilling er vist av R.S. Tipton og B.A. Pawson, J. Org. Chem., 26, 4698 (1961), og forbindelsen er kommersielt tilgjengelig fra Bachem, Inc., Torrance, CA.

I syntesen for kondensasjonen av dette beskyttede sarkosin med L-tyrosinamidmolekylet for fremstilling av fragment I, bør det amino-beskyttede sarkosin vanligvis aktiveres på en eller annen måte for å fremme dannelsen av bindingen. Skjønt det vanligvis er foretrukket å utføre denne aktivering ved at man danner en "aktivester", så kan man også bruke andre aktiveringsmetoder, så som ved hjelp av et blandet eller symmetrisk anhydrid, azid eller syre-klorid.

Man kan bruke enhver aktivester av det beskyttede sarkosin, skjønt den foretrukne aktive ester er den som dannes ved hjelp av hydroksysuccinimid. Den aktive ester av det beskyttede sarkosin fremstilles ved å reagere ekvivalente mengder av det beskyttede sarkosin og en aktiv ester-reagens i en oppløsning av et egnet organisk oppløsnings-middel så som tetrahydrofuran, dioksan, dimetylformamid, pyridin o.l. Denne oppløsning blir så tilsatt en ekvivalent mengde av et koblingsmiddel, typisk dicykloheksylkarbodiimid. Skjønt andre koblingsmidler også er effektive, så er dicykloheksylkarbodiimid skesielt brukbart på grunn av at biproduktet fra koblingsreaksjonen er meget lite oppløselig i de typer oppløsningsmidler som brukes, hvorved det lett kan fjernes ved filtrering og man får det koblede produkt i oppløsning. L-tyrosinamid er kommersielt tilgjengelig (f.eks. fra Sigma Chemical Company, St. Louis, MO) eller kan fremstilles ved hjelp av kjente fremgangsmåter.

Det neste trinn i fremstillingen av fragment I består i at man reagerer en molar ekvivalent mengde av L-tyrosinamid med den beskyttede sarkosinaktive ester i nærvær av en ekvivalent av et saltdannende materiale så som et organisk tertiært amin. Skjønt et hvert organisk tertiært amin kan brukes, så har man funnet det meget tilfredsstillende å bruke trietylamin. Oppløsningsmiddelet er et egnet organisk oppløsningsmiddel av den type som er beskrevet ovenfor.

De uomsatte aminosyrer fjernes ved behandling av reaksjonsblandingen med en syre (f.eks. eddiksyre) eller ved ekstraksjon med et ublandbart organisk oppløsningsmiddel slik det er beskrevet ovenfor.

Til slutt fjerner man den alfa-aminobeskyttende gruppen fra sarkosin, fortrinnsvis med trifluoreddiksyre, hvorved man får fragment I.

Fremstillingen av fragment II starter vanligvis med L-aspartinsyre som beskyttes på sin beta-karboksygruppe eller L-glutaminsyre som beskyttes på sin gamma-karboksygruppe. Denne beta- eller gamma-karboksygruppen blir vanligvis betegnet som "omega"-gruppen i overensstemmelse med vanlig nomenklatur for å indikere at den sitter i enden av kjeden.

Eksempler på egnede karboksylbeskyttende grupper er benzyl og benzyl hvor fenylgruppen er substituert med fra en til tre gruppen valgt fra gruppen bestående av halogen (f.eks. klor eller brom), nitro, C^-C^-laverealkoksy (f.eks. metoksy) eller -C^-laverealkyl (f.eks. metyl). Se ovenfor refererte bok av McOmie for ytterligere beskrivelse av slike grupper. Benzyl er den foretrukne gruppe. Denne beta-beskyttede L-aspartinsyre eller gamma-beskyttede L-glutaminsyre er kommersielt tilgjengelig fra Bachem, Inc., Torrance, California, eller kan fremstilles ved kjente fremgangsmåter.

Denne beta-beskyttede L-aspartinsyre eller gamma-beskyttede L-glutaminsyre (omega-U-Z) reageres så med nevnte alfa-aminobeskyttede sarkosin som er blitt aktivert (f-reks. ved en omdannelse til en aktiv ester) slik dette er beskrevet ovenfor, hvorved man får fremstilt fragment II. På figur 2 er Z ASP.

Fragmentene I og II knyttes sammen til det beskyttede tetrapeptid alfa-T-SAR-beta-U-ASP-SAR-TYR-NH2 (fragment III) ved å reagere ekvivalente mengder i et passende aprotisk oppløsningsmiddel så som dimetylformamid i et nærvær av et svakt overskudd av et koblingsmiddel så som dicykloheksylkarbodiimid. Det er også foretrukket å utføre denne reaksjon i nærvær av en forbindelse som gjør at man får minimal rase-misering i tilknytning til karboksylgruppen på L-lysindelen av fragment I, og øke reaksjonshastigheten, og man kan f.eks. bruke 1-hydroksybenzotriazol. Som i forbindelse med fragment II, så blir den alfa-aminobeskyttende gruppen på sarkosin-delen av fragment III fjernet med trifluoreddiksyre, hvorved man får fragment HIA.

Etter en koblingsreaksjon som tilsvarer den som ble brukt for å binde sammen fragmentene I og II, så blir til slutt en alfa-amino og guanidinobeskyttet L-arginingruppe knyttet til aminosluttgruppen i fragment HIA, hvoretter man fjerner alle beskyttende grupper og får det forønskede pentapeptidamid. Fjerningen av de beskyttende grupper kan f.eks. utføres ved behandling med hydrogengass i nærvær av en palladium-på-karbon-katalysator i et egnet reduserende oppløsningsmiddel slik dette er beskrevet ovenfor (fortrinnsvis vandig eddiksyre). Hydrogengassen trenger ikke å være under et trykk som er høyere enn en atmosfære, skjønt bruken av trykk er hensiktsmessig ettersom dette akselererer reduk--= jonshastigheten.

Isolasjon og rensing av det resulterende urene produkt kan oppnås ved en kombinasjon av utkrystallisering og ioneutbytningskromatografi (fortrinnsvis ved å bruke ammoniumacetat-pH 5 som elueringsmiddel), og ved å bruke tynnsjiktskromatografi for å fastslå identiteten på forbind-elsene i hver fraksjon. Skjønt det er angitt flere eksempler på isolasjons- og rensningsteknikk i følgende eksempler, så er det selvsagt underforstått at også andre fremgangsmåter kan brukes.

Eksempel I

EEemstillin2_av_fragment_l£ SA^lTXElN^

A • §OC-sarkosin-hydroksy_succi : BOC-sarkosin (24,78 g, 0,13 mol) og N-hydroksysuccinimid (15,5 g, 0,13 mol) ble oppløst i 300 ml tørr THF og avkjølt til -5°. En oppløsning av dicykloheksylkarbodiimid (26,98 g, 0,13 mol) i 100 ml tørr THF ble tilsatt i løpet av 15 minutter. Reaksjonsblandingen ble rørt over natten og hensatt ved romtemperatur. Det utskilte faste stoff ble frafiltrert, og oppløsningsmiddelet fordampet under redusert trykk til et hvitt, fast stoff. Dette ble utkrystallisert fra 250 ml absolutt etanol ved 4° og man fikk 32 g (86%) av et hvitt, fast stoff, smeltepunkt 121-123°.

Analyse: Beregnet: C, 50,35; H, 6,34; N, 9,79

Funnet: C, 50,23; H, 6,44; N, 9,67

TLC: RF = 0,81, CHCl3/MeOH 9/1

(silisiumdioksydgel G, 250 /<um>)•

p.m.r. (6, CDC13): 1,45, S, 9H, BOC; 2,83, S, 4H,

-OSu; 2,93, S, 3H, N-CH3; 4,27, S, 2H, -CH2~.

M.S.: M+ 286

B • §2Ql§§Ek°§Yiltl£Y.£2£iQ§5id_ jBOC-SAR^

L-tyrosinamid (2,17 g, 10 mmol) og trietylamin

(1,01 g, 10 mmol) ble oppløst i 25 ml tørr metanol. BOC-sarkosin-hydroksysuccinimid (2,86 g, 10 mmol) ble tilsatt, og blandingen ble rørt over natten ved romtemperatur. Flyktige forbindelser ble fjernet under redusert trykk, og residuet delt mellom EtOAc (50 ml) og en NaCl-oppløsning /50 ml (25 ml H20 + 25 ml mettet NaCl).?. Fasene ble skilt, og den organiske fase vasket to ganger til med samme type NaCl-oppløsning og så tørket med magnesiumsulfat. Tørke-middelet ble fjernet ved filtrering, og oppløsningsmiddelet fordampet under redusert trykk. Residuet ble kromatografert på 75 g 2,5 cm vid kolonne av Silicar CC7 idet man brukte

etylacetat som elueringsmiddel. Forbindelsen ble eluert ved omkring 390 ml. De neste 475 ml ble oppsamlet og fordampet til 1,55 g (44%) av et hvitt faststoff.

Analyse: Beregnet: C, 58,11; H, 7,17; N, 11,96

Funnet: C, 57,96; H, 6,96; N, 11,45

TLC: (Silisiumdioksydgel GF) Rf = 0,46 CHCl3/MeOH 9/1

C. §aEk°SYl-L-tYrosinamidi_trif luoracetat_ jTFA=SAR3TYR=NH2)_: BOC-sarkosyl-L-tyrosinamid (1,30 g, 3,7 mmol) ble oppløst i 15 ml trifluoreddiksyre ved 0°. Oppløsningen ble rørt i en time ved 0° og oppløsningsmiddelet fjernet ved redusert trykk. Den resulterende olje ble behandlet med 50 ml vannfri eter og ga 1,27 g (94%) av et hvitt faststoff.

p.m.r. (6, CD3OD): 2,3, S, 3H, N-CH3; 3,00, d, 2H, -CH2"C-; 3,7, S, 2H, -N-CH2-C=0; 6,9; q, 4H, aromatisk

Ek sempel II

Fremstilling av fragment II: BOC-SAR-beta-benzyl-ASP !§QQl§åElS2§Yilfe§t5lef§25Yil^l§§Eål£i2§Y£§!

Trietylamin (2,02 g, 20 mmol) og beta-benzy1-L-aspartinsyre (2,23 g, 10 mmol) ble rørt i 50 ml tørr THF. BOC-sarkosin-hydroksysuccinimidester (2,68 g, 10 mmol) ble tilsatt, og oppløsningen rørt ved romtemperatur over natten. Faste stoffer ble frafiltrert, og oppløsningsmiddelet fjernet under redusert trykk. Residuet ble delt mellom 100 ml etylacetat og 100 ml 2N saltsyre. Fasene ble skilt, og den organiske fase vasket med 2 x 100 ml vann, 1 x 100 ml mettet natriumkloridoppløsning og så tørket over magnesiumsulfat. Sistnevnte ble frafiltrert, og oppløsningsmiddelet ble fjernet under redusert trykk. Residuet ble behandlet med heksan. Sistnevnte ble så avheilet, og residuet tørket under redusert trykk til 2,64 g (67%) av et hygroskopisk faststoff.

TLC: Rf= 0,73 + sporurenheter ved 0,48

CHCl3/MeOH/HOAc 85/10/5

(Silisiumdioksydgel G, 250^um)

p.m.r. (6, CH3OD): 1,45, S, 9H, BOC; 2,82, S, 3H,

N-CH3; 2,95, M, 2H, -CH^-C; 3,85, S, 2H,

-N-CH2-C=0; 4,85, t, 1H, -CH-; 5,08, S, 2H, -CH2; 5,46, S, 2H, -NH + -C02H; 7,3, S, 5H,-<f>

/u_7D17° = +13,3° (C = 1,032, MeOH)

Eksempel III

Fremstilling av fragment III: BOC-sarkosyl-beta-benzyl-L-aspartyl-sarkosyl-L-tyrosinamid (BOC-SAR-beta-Bzl-ASP-SAR-TYR=NH2)_

BOC-sarkosyl-beta-benzyl-L-aspartinsyre (0,52 g, 1,3 mmol) og 1-hydroksybenzotriazolmonohydrat (0,18 g, 1,3 mmol) ble oppløst i 10 ml tørr DMF, og oppløsningen avkjølt til 0°. Dicykloheksylkarbodiimid (0,27 g, 1,3 mmol) i 7,5 ml tørr DMF ble tilsatt, og oppløsningen ble rørt 1 time ved 0°. Sarkosyl-L-tyrosinamid, trifluoracetat (0,50 g, 1,3 mmol) og diisopropyletylamin (0,17 g, 1,3 mmol) ble oppløst i 5 ml tørr DMF og umiddelbart tilsatt den første oppløs-ningen. Reaksjonsblandingen ble rørt over natten og hensatt ved romtemperatur. Det faste stoff ble frafiltrert, og residuet ble oppløst i 25 ml etylacetat. Den organiske fase ble vasket først med 2 x 25 ml 10% sitronsyre, 2 x 25 ml vann, 2 x 25 ml 5% NaHC03, 2 x 25 ml H20, 25 ml mettet natriumkloridoppløsning og så tørket over vannfritt magnesiumsulfat. Tørkemiddelet ble frafiltrert, og oppløs-ningsmiddelet fjernet under redusert trykk, noe som ga 0,6 g 1/3,5%) av et hvitt faststoff.

TLC: Rf= 0,31

CHCl3/MeOH 9/1

(Silisiumdioksydgel G, 250 xum)

p.m.r. (6, CDC13): 1,45, S, 9H, BOC; 2,95, m, 10H, 2x N-CH3, -CH2-CH (Asp), -CH2"CH (Tyr); 3,8, m,

4H, 2x N-CH2-C=0; 4,6, m, 2H, -CH-CH2~, Asp,

-CH-CH2- (Tyr); 5,1, m, 2H, -CH2~<t>; 6,92, q, 4H, tyrosinaromatisk; 7,25, S, 5H, aromatisk benzyl /"a7D21° = 12,4° (C = 0,1046, MeOH)

Analyse: Beregnet for C31H41N5Og: C, 59,32; H, 6,58; N, 11,16

Funnet: C, 58,73; H, 6,80; N, 10,76

Eksempel IV

Fremstilling av fragment HIA: Sarkosyl-beta-benzyl-L-aspartyl-sarkosyl-L-tyrosinamid, trifluoracetat (TFA §ABr^§ta-Bzl=ASP:SAR-TYRzNH2)_

BOC-sarkosyl-beta-benzyl-L-aspartyl-sarkosyl-L-tyrosinamid (0,48 g, 0,76 mmol) ble oppløst i 10 ml TFA ved 0° og rørt 1 time. Oppløsningsmiddelet ble fjernet under redusert trykk, og residuet behandlet over natten med 50 ml vannfri eter. Suspensjonen ble filtrert, og det faste stoff vasket med eter og tørket under vakuum til 0,4 g (82%) av et hvitt faststoff.

TLC: Rf = 0,56

n-BUOH/HOAc/H20

(Silisiumdioksydgel GF)

Eksempel V

A. Alfa-fenylmetoksykarbonyl-L-arginyl(HCL)-sarkosyl-beta-benzyl-L-aspartyl-sarkosyl-L-tyrosinamid

,'CBZ-ARG(HC1) -SAR-beta-Bzl-ASP-SAR-TYR-NH.,7 — 1-Alfa-fenylmetoksykarbonyl-L-arginin HC1 (2,66 g,

7,8 mmol) og 1-hydroksybenzotriazolmonohydrat (1,06 g, 7,8 mmol) ble oppløst i 20 ml tørr dimetylformamid og avkjølt til 0°. Dicykloheksylkarbodiimid (1,61 g, 7,8 mmol) ble oppløst i 5 ml eter og tilsatt den første oppløsningen. Reaksjonsblandingen ble rørt 1 time ved 0°. TFA-saltet av sarkosyl-beta-benzyl-L-aspartyl-sarkosyl-L-tyrosinamid (5,0 g, 7,8 mmol) ble oppløst i 15 ml tørr DMF med trietylamin (0,79 g, 7,8 mmol) og tilsatt den første oppløsningen. Reaksjonsblandingen ble rørt over natten og hensatt ved romtemperatur. Det faste stoff ble frafiltrert, og de flyktige forbindelser fjernet under redusert trykk. Residuet ble behandlet med vann og man fikk 3 g av et residuum.

TLC: Rf = 0,60

n-BUOH/HOAc/H20 3/1/1

(Silisiumdioksydgel GF)

B. L-arginyl-sarkosyl-L-aspartyl-sarkosyl-L-tyrosinamid iARG;SAR=ASP=SARzTYRzNH2)_

Alfa-fenylmetoksykarbonyl-L-arginyl(HC1)-sarkosyl-beta-benzyl-L-aspartyl-sarkosyl-L-tyrosinamid (1,0 g) ble oppløst i 100 ml 75% vandig eddiksyre og redusert med 0,5 g 10% Pd/C ved et trykk på 3,5 kg/cm<2> i 15 timer. Katalysa-toren ble frafiltrert, og oppløsningen lyofilisert til et produkt på 0,8 g. Dette ble oppløst i 7 ml vann, filtrert gjennom et 3y multiporefilter, justert til pH 5 med NH^OH (konsentrert) og kromatografert på en SP-C-25-kolonne (2,5 x 100 cm) med 0,20 M NH4OAc, pH 5,0, 100 ml/time, 20 ml/rør. Rørene 71 til 78 ble slått sammen og lyofilisert til 0,35 g av ARG-SAR-ASP-SAR-TYR-NH2.

TLC: Rf = 0,23

n-BuOH/HOAc/H20 3/1/1

(Silisiumdioksydgel GF)

/a_7D21° = +54,9 (C = 0,091, 0,1 N HOAc)

Eksempel VI

Ved å bruke de fremgangsmåter som er beskrevet i eksemplene I-V, men istedenfor det der nevnte beskyttede sarkosin bruke en ekvivalent mengde av et egnet beskyttet L-valin i fremgangsmåten fra eksempel I, og en ekvivalent mengde av et egnet beskyttet L-lysin i fremgangsmåten fra eksempel II, fikk man fremstilt H-ARG-LYS-ASP-VAL-TYR-NH2.

Eksempel VII

Ved å bruke de fremgangsmåter som er beskrevet i eksemplene I-V, men ved å bruke ekvivalente mengder av egnede utgangsforbindelser fikk man fremstilt:

H-VAL-TYR-NH2

H-VAL-TYR-benzylester

H-SAR-TYR-benzylester

H-ARG-LYS-ASP-VAL-TYR-OH

H-ARG-LYS-GLU-VAL-TYR-OH

H-ARG-SAR-GLU-SAR-TYR-NH2

H-ARG-LYS-GLU-VAL-TYR-NH2

BOC-epsilon-CBz-LYS-beta-benzyl-ASP-OH

BOC-epsilon-CBZ-LYS-gamma-benzyl-GLU-OH

BOC-SAR-gamma-benzyl-GLU-OH

BOC-epsilon-CBZ-LYS-beta-benzyl-ASP-VAL-TYR-OH-benzylester BOC-epsilon-CBZ-LYS-gamma-benzyl-GLU-VAL-TYR-OH-benzylester BOC-SAR-gamma-benzyl-GLU-SAR-TYR-NH2

De pentapeptider som er fremstilt i ovennevnte eksempler, hadde alle den samme farmakologiske aktivitet som TP5 som er beskrevet i de forannevnte patenter.

Claims

Fremgangsmåte for fremstilling av peptidet

H-ARG-X-Z-Y-TYR-R hvor X er LYS og Y er VAL, eller

X og Y er begge SAR, Z er ASP eller GLU, og R er OH

eller NH2, karakterisert ved at

man A) danner fragment I, som består av H-Y-TYR-R',

hvor R' er OU eller NH2; Y er SAR eller VAL; og U er benzyl eller benzyl hvor fenylgruppen er substituert med fra 1 til 3 grupper valgt fra halogen, nitro,

C1~C3 laverealkyl, og Cj-C^ laverealkoksy, ved i) beskyttelse av alfa-aminogruppen i Y-aminosyren ved å la den reagere med en reagens som vil introdusere beskyttelsesgruppen T, hvor gruppen T er valgt fra a)

ivor R^ er fenyl; tolyl; xylyl; adamantyl; allyl; beta-cyanoetyl; fluorenyl- metyl; benzyl, benzyl hvor fenylringen er substituert med fra 1 til 3 grupper valgt fra halogen, nitro, laverealkyl og lavere- alkoksy, nitropropylmetyl; difenylmetyl; cykloheksyl; cyklopentyl; vinyl; t-butyl; t-amyl; dimetyldifluormetylmetyl; eller dimetylbifenylmetyl; b)

hvor R2 er laverealkyl med 2-4 karbonatomer eller laverealkyl med 1-4 karbonatomer substituert med fra 1 til 5 halogengrupper; c)

hvor V er S eller 0, og R^ og R^ hver er benzyl eller laverealkyl;

hvor Rj. og R^ individuelt hver er laverealkyl, eller R^ og Rg sammen er -CH2-C-CH2~ hvor R7 R? Rg og Rg hver er hydrogen eller laverealkyl, e) hvor Rg er hydrogen eller nitro;

og f) hver R10 er hydrogen, metyl, halogen eller nitro,

forutsatt at T er monodentat når X er SAR; ii) aktivering av den beskyttede Y dannet i trinn i) med hensyn til nukleofilt angrep ved karboksygruppen av et amin, til dannelse av en karboksyaktivert beskyttet Y-aminosyre; iii) omsetning av nevnte karboksyaktiverte beskyttede Y med TYR-R<1> hvor R<1> har den ovenfor angitte betydning; iv) fjerning av den beskyttede gruppe T, hvorved fragment I dannes, B) danner fragment II, som består av alfa-T-(epsilon-T")X-omega-U-Z-OH, hvor Y, U og Z har de ovenfor angitte betydninger, og T" har samme betydning som T angitt ovenfor, ved i) fremstilling av omega-U-Z-OH, hvor U er en beskyttende gruppe på omega-karboksygruppen i Z-aminosyren, og har den ovenfor angitte betydning; ii) beskyttelse av alfa-aminogruppen (og dersom X er er LYS, epsilon-aminogruppen) i X-aminosyren ved å la den reagere med reagens(er) som vil introdusere den beskyttende gruppen(e) T (og T"), hvor T og T" har de ovenfor angitte betydninger; iii) aktivering av den beskyttede X dannet i trinn ii) med hensyn til nukleofilt angrep ved karboksygruppen av et amin, til dannelse av en karboksyaktivert, beskyttet X-aminosyre; iv) reaksjon av nevnte karboksyaktiverte beskyttede X-aminosyre med omeaa-U-Z-OH, hvorved fragment II dannes,C) reaoerer fraamenter I oa II til dannelse av et fragment III som består av T-(epsilon-T")X-omega-U-Z-Y-TYR-R', hvor X, U, Z, Y, R', T og T" har de ovenfor angitte betydninger; D) fjerner T-beskyttelsesgruppen fra fragment III til dannelse av fragment HIA, som består av H-(epsilon-T")X-omega-U-Z-Y-TYR-R', hvor symbolene har den ovenfor angitte betydning; E) fremstiller alfa-T-omega-T'-ARG, hvor T er enbeskyt-tende gruppe på alfa-aminogruppen i L-arginin, og T' er en beskyttende gruppe på guanidinogruppen i L-arginin, hvor T' er en gruppe valgt fra gruppen bestående av ^ hvor R, har den ovenfor angitte

R^OC-

betydning, nitro, hydroklorid, p-metoksybenzylsulfonyl og tosyl, F) omsetter fragment HIA med alfa-T-omega-T'-ARG til dannelse av alfa-T-omega-T'-ARG-(epsilon-T'-)X-omega-U-Z-Y-TYR-R' , hvor symbolene har de ovenfor angitte betydninger; G) fjerner gruppene U, T, T<1> og T" til dannelse av peptidet H-ARG-X-Z-Y-TYR-R; og H) isolerer og renser det resulterende peptid.