FI79329C - Nytt foerfarande foer framstaellning av pentapeptiden h-arg-x-asp-y-tyr-r och vid foerfarandet anvaenda mellanprodukter. - Google Patents

Description

1 79329

Uusi menetelmä pentapeptidin H-ARG-X-ASP-Y-TYR-R valmistamiseksi ja menetelmässä käytettäviä välituotteita Tämä keksintö koskee uutta menetelmää hyödyllisten 5 pentapeptidien valmistamiseksi liuossynteesitekniikalla sekä menetelmässä käytettäviä välituotteita. Keksinnön mukaisella menetelmällä valmistetaan peptidejä, joilla on kaava H-ARG-X-ASP-Y-TYR-R, jossa X on LYS ja Y on VAL tai X ja Y ovat kumpikin SAR.

10 US-patentissa 4 190 646 ja US-patenttihakemuksessa

No 124 959, jätetty maaliskuun 13. päivänä 1980, kuvataan erilaisia peptidejä, jotka ovat käyttökelpoisia kateenkor-van toiminnan alueella ja immunologisilla alueilla. Mainitussa patentissa kuvataan "thymopoietin-pentapeptidi" 15 (TP5) ja sen substituoituja johdannaisia, kun taas patent tihakemuksessa kuvataan TP5:n peptidi-analogeja, joiden teho on parempi kuin TP5:n. Mainitussa patentissa ja patenttihakemuksessa kuvataan peptidien valmistus kiinteä-faasi-synteesimenetelmin, joista käytetään tavallisesti 20 nimitystä "Merrifield-synteesi", ja niissä esitetään myös, että eräiden näiden kaltaisten aineiden valmistamiseen voidaan käyttää klassisia menetelmiä (so. liuossynteesimene-telmiä), mutta mitään spesifistä klassista menetelmää tai synteettistä tapaa niissä ei ole paljastettu.

25 Merrifield'in kiinteäfaasi-synteesimenetelmän ol lessa tarkoituksenmukainen valmistettaessa pieniä määriä —: peptidejä laboratoriossa, se olisi epäkäytännöllinen ja ta- vallisesti epätaloudellinen menetelmä valmistettaessa suuria määriä (esim. suurempia kuin noin 100 gramman eriä) 30 peptidiä, johon tarkoitukseen liuos-synteesimenetelmät ovat sopivampia. Lisäksi liuos-synteesimenetelmät ovat yleensä paljon halvempia kuin kiinteäfaasi-menetelmät tiettyjen käytettävien reagenssien paljon pienempien yksikkökustannusten vuoksi. Polypeptiden valmistuksessa käyttökelpoisten 35 hyvin moninaisten liuossynteesimenetelmien joukosta paten- 2 79329 tinhakijat ovat keksineet erityisen synteettisen menetelmän, jolla haluttua pentapeptidiä saadaan valmistetuksi mukavasti ja taloudellisesti.

Keksintö koskee siten uutta menetelmää peptidin 5 H-ARG-X-ASP-Y-TYR-R valmistamiseksi, jossa kaavassa X on LYS ja Y on VAL tai X ja Y on kumpikin SAR ja R on NI^ tai OH, liuossynteesitekniikalla siten, että a) muodostetaan osa I, jolla on kaava H-Y-TYR-R' i) suojaamalla Y-aminohapon c<.-aminoryhmä antamalla sen 10 reagoida reagenssin kanssa, joka liittää suojaavan ryhmän T, ii) aktivoimalla vaiheessa i) muodostettu suojattu Y amiinin nukleofiilisen liittymisen suhteen karboksiryhmään, jolloin muodostuu karboksi-aktivoitu suojattu Y-aminohappo, iii) antamalla mainitun karboksi-aktivoidun suojatun Y:n 15 reagoida TYR-R':n kanssa ja iv) poistamalla suojaryhmä T, jolloin muodostuu osa I; b) muodostetaan osa IV, jolla on kaava c*;-T-6J-U-ASP-Y-TYR-R' i) suojaamalla asparagiinihapon 06-amino- ja («J-karboksi-20 ryhmät antamalla sen reagoida reagenssin kanssa, joka liittää siihen suojaryhmät T ja U, ii) aktivoimalla vaiheessa i) muodostettu suojattu as- * paragiinihappo amiinin nukleofiilisen liittymisen suhteen ; -karboksiryhmään, jolloin muodostuu karboksi-aktivoitu 25 suojattu asparagiinihappo, ja iii) antamalla mainitun karboksi-aktivoidun suojatun asparagiinihapon reagoida osan I kanssa, jolloin muodostuu osa IV; c) muodostetaan osa IVA, jolla on kaava 30 H-^-U-ASP-Y-TYR-R', poistamalla suojaryhmä T osasta IV? d) muodostetaan osa III, jolla on kaava °6—T-(£-T")-X-f-U-ASP-Y-TYR-R' i) suojaamalla X-aminohapon ^'-aminoryhmä (ja jos X on LYS, £-aminoryhmä) antamalla sen reagoida reagenssin (rea-35 genssien) kanssa, joka (jotka) liittää (liittävät) suoja-ryhmän (suojaryhmät) T (ja T"), 3 79329 ii) aktivoimalla vaiheessa i) muodostettu suojattu X, amiinin nukleofiilisen liittymisen suhteen karboksiryhmään, jolloin muodostuu karboksi-aktivoitu suojattu X-aminohappo, ja 5 iii) antamalla mainitun karboksi-aktivoidun suojatun X-aminohapon reagoida osan IVA kanssa, jolloin muodostuu osa III, e) poistetaan T-suojaryhmä osasta III, jolloin muodostuu osa IIIA, jolla on kaava H-(C-T")-Χ-ίΟ-U-ASP-Y-TYR-R'; 10 f) valmistetaan o<L-T-U-T1-ARG, jossa T on L-arginii- nin 'X-aminoryhmässä oleva suojaryhmä ja Τ' on L-arginiinin guanidinoryhmässä oleva suojaryhmä; g) osan IIIA annetaan reagoida '-ARG:n kans sa, jolloin muodostuu cC-T-C^-T '-ARG-(£-T" )-X-6J-U-ASP-Y-TYR- 15 R'; h) poistetaan ryhmät U, T, Τ' ja T", jolloin muodostuu peptidi H-ARG-X-ASP-Y-TYR-R; ja j) eristetään ja puhdistetaan saatu peptidi; jolloin edellä esitetyissä kaavoissa T ja T" on valittu ryh- 20 mästä, jonka muodostavat

O

n a) R^-OC-, jossa R^ on fenyyli; tolyyli; ksylyyli; adamantyyli; allyyli; /3-syanoetyyli; fluorenyylimetyyli; fenyylirenkaastaan mahdollisesti 1-3 halogeenilla, nitrol- 25 la, pienalkyylillä ja/tai pienalkoksilla substituoitu bent-syyli; di-isopropyylimetyyli; difenyylimetyyli; syklohek-syyli; syklopentyyli; vinyyli; t-butyyli; t-amyyli; dime-tyylitrifluorimetyylimetyyli; tai dimetyylibifenyylimetyyli;

O

fl 30 b) R2C-, jossa R2 on pienalkyyli, jossa on 2-4 hiil tä tai pienalkyyli, jossa on 1-4 hiiltä ja substituentteina 1-5 halogeenia,

V

* * Il c) R^O-P-, jossa V on S tai O ja ja R4 on kum- 35 Ör4 pikin bentsyyli tai pienalkyyli; 4 79329 " " Rc jossa Rc ja Rc erikseen on j C- kumpikin pienalkyyli tai R5 "^a R6 yhdessä vastaavat . C=0 ryhmää -CH»-C-CH„- x I 1 / \ * 5 " ' R6 R7 R8 jossa R7 ja Rg on kumpikin vety tai pienalkyyli; m ^N^N—NOo 10 . I I Δ jossa Rq on vety tai nitro; e) ia

Rl°\ ? rhr- f) I |J jossa R10 on vety, metyyli, halogeeni tai nitro, 0 20 edellyttäen, että T on monovalenttinen kun X on SAR; U on fenyyliryhmästään mahdollisesti 1-3 halogeenilla, nitrolla, C^_g-alkyylillä ja/tai Cj^-alkoksilla substituoitu bentsyyli; ja Τ' on

O

II

25 R^-OC-, jossa R^ on edellä määritelty, nitro, hydrokloridi, p-metoksibentsyylisulfonyyli tai tosyyli, ja R' on NI^ tai OU, jossa U on edellä määritelty.

oi.-amino-suojaryhmä T voi olla jokaisen edellä mainitun aminohapon osalta sama tai erilainen ja sen on säi- 30 lyttävä stabiilina vaiheissa, joita käytetään aminohappo-ryhmiä liitettäessä, sen ollessa silti helposti poistettavissa yhdistämisvaiheiden päätyttyä olosuhteissa, jotka eivät lohkaise mitään peptidin amidisidoksista. Eräiden ryhmien osalta (esim. BOC) tämä poisto suoritetaan vahval- 35 la hapolla (esim. trifluorietikkahapolla), minkä seurauk- 5 79329 sena saadaan suojaamatonta väliyhdistettä vastaavana hap-poadditiosuolana (esim. trifluoriasetaattina).

Guanidino-suojaryhmänä Τ' voi olla mikä tahansa edellä määritelty sopiva amino-suojaryhmä, tai nitroryhmä 5 samoin kuin happoadditiosuolat, kuten hydrokloridi. Amino-suojaryhmistä ovat ensisijaisia uretaani-suojaryhmät (kaava a) edellä) ja substituoidut sulfonihappojohdannaiset, kuten p-metoksibentseenisulfonyyli ja tosyyli. Ensisijaisin on hydrokloridi-suola. Tästä guanidino-suojaryhmästä käy-10 tetään tässä nimitystä cj-ryhmä osoittamaan, että se on ketjun päässä. Monien guanidino-suojaryhmien tarkka sijainti ketjussa ei ole täsmällisesti tiedossa.

Karboksi-suojaryhmän U on oltava helposti poistettavissa olosuhteissa, jotka eivät tuhoa saatua peptidiä, 15 stabiilisuuden säilyessä T-ryhmiä poistettaessa.

R'-ryhmä on joko NH2 (peptidien valmistamiseksi, joissa R on NH2) tai OU (peptidien valmistamiseksi, joissa R on OH).

Amino-suojaryhmää f), joka on bidentaatti, voidaan 20 käyttää ainoastaan L-arginiinin tai L-valiinin evl-amino-ryhmien tai L-lysiinin tiramino- ja £-aminoryhmien, mutta ei sarkosiinin οί-aminoryhmän yhteydessä. Sarkosiinin 06-; aminoryhmän suojaryhmän on oltava monodentaatti tässä ami- noryhmässä olevan metyylisubstituentin vuoksi. Muita ami-25 nosuojaryhmiä voidaan käyttää kaikkien aminohappojen yh-‘r teydessä.

Tässä käytettynä "halogeeni" tarkoittaa fluoria, : klooria, bromia ja jodia, kloorin ja bromin ollessa kuiten kin ensisijaisia. Termit "pienalkyyli" ja "pienalkoksi" 30 merkitsevät vastaavasti tyydytettyjä alifaattisia hiilivetyjä/ joissa on 1-6 hiiliatomia, kuten metyyliä, etyyliä, isopropyyliä, t-butyyliä, n-heksyyliä ja näiden kaltaisia ryhmiä ja vastaavia alkoksiryhmiä kuten metoksia, etoksia, isopropoksia, t-butoksia, n-heksoksia, ja näiden kaltaisia 35 ryhmiä. Ensisijainen pienalkyyli on metyyli ja ensisijainen pienalkoksi on metoksi.

6 79329

Reagensseja, joita käytetään näiden suojaryhmien liittämiseen (tavallisesti vastaavia happoklorideja, joskin muitakin johdannaisia voidaan käyttää) nimitetään tässä joskus "suojaryhmäreagensseiksi". Muita sopivia suojaryhmiä 5 on esitetty esimerkiksi julkaisussa "Protective Groups in Organic Chemistry", J.F.W. McOmie, ed., Plenum Press, N.Y., 1973.

Pidetään ensisijaisena, että kukin T ja T" on sama ja on bentsyylioksikarbonyyli(CBZ) tai trifluoriasetyyli 10 (TFA). Pidetään ensisijaisena, että Τ' on hydrokloridisuola.

Edellä selostettujen karboksi-aktivoitujen suojattujen aminohappotähteiden valmistamiseen voidaan käyttää hyvin moninaisia reagensseja.

Eräs karboksi-aktivoitu suojattu aminohappotähde-15 tyyppi on reaktiokykyinen esteri. Esimerkkejä aineista, joita käytetään sopivien aktiivisten esterien valmistamiseen ovat fenoli; fenoli, jonka fenolirenkaassa on substi-tuentteina 1-5 radikaalia, jotka on valittu ryhmästä halogeeni (esim. kloori tai fluori), nitro, syano ja metoksi; 20 tiofenyyli; N-hydroksiftaali-imidi; N-hydroksisukkiini-imidi; N-hydroksiglutaari-imidi; N-hydroksibentsamidi; 1-hydroksibentsotriatsoli; ja näiden kaltaiset substituentit.

; Muita sopivia aineita on esitetty esimerkiksi edellä mai nitussa julkaisussa "Protective Groups in Organic Chemis-25 try", J.F.W. McOmie, ed. Seuraavissa alla esitetyissä spesifisissä esimerkeissä käytetään yleensä N-hydroksisukkii-ni-imidiä tai 1-hydroksibentsotriatsolia.

Alalla tunnetaan hyvin muitakin aikaisempia menetelmiä, kuten seka-anhydridimenetelmä tai symmetristen anhyd-30 ridien menetelmä, happokloridimenetelmä ja atsidimenetelmä, joita on selostettu esim. artikkelissa Bodanszky ym., "Peptide Synthesis", 2 nd ed., 1976, s. 85-128. Nämä muutkin menetelmät voivat olla käyttökelpoisia.

Viitattaessa eri aminohappoihin käytetään mukavuus-35 syistä seuraavia lyhenteitä: 7 79329

Aminohappo Lyhenne

L-lysiini LYS

L-valiini VAL

L-tyrosiini TYR

5 L-asparagiinihappo ASP

L-glutamiinihappo GLU

Sarkosiini SAR

L-arginiini ARG

8 79329

Keksinnön mukaista menetelmää kuvataan kaavamaisesti seuraavassa kaaviossa 5

ARG X Z Y TYR

T-OH

10 T--OAH--R' T---R'

U

T —-—OA H---R' 15 u T ---R'

rji »» U

T — OA H —L---R'

T" U

20 T —^-i---R'

T* T" U

*. T — -—OA H —1---R'

*. Τ’ U

*. T —^1-L---R' 25 !

HJ-1---h R

9 79329

Edellä esitetyissä kaavioissa suojaavat ryhmät on esitetty edellä mainituin merkein U, Tf Tf ja T", kun taas aminohappotähteiden karboksiaktivointi on osoitettu kirjaimin "OA".

5 Edellä esitettyyn kaavioon viitaten osaa I voidaan valmistaa tavallisesti seuraavasti. Sarkosiinin aminoryh-män suojaamiseksi muodostetaan sarkosiinin vesiliukoinen emäksinen additiosuola ja tämä liuotetaan veteen. Mukavuussyistä tätä emäksistä additiosuolaa voidaan muodostaa 10 liuottamalla sarkosiini pieneen ylimäärään natriumhydroksidia. Tähän liuokseen lisätään sitten samanaikaisesti vähäisin ylimäärin reagenssi suojaavan ryhmän T liittämiseksi (esim. vastaavaa happokloridia, kuten bentsyylioksikarbo-nyylikloridia) ja emäksen (esim. natriumhydroksidin) liu-15 osta reagoimaan reaktion aikana muodostuneen hapon (esim. HCl:n) kanssa. Suojaavan ryhmän lisäävä reagenssi voi olla liuoksessa tai pelkkänä ja se on lähinnä happokloridia. Reaktion päätyttyä ylimääräinen suojaryhmän lisäävä reagenssi poistetaan (esim. uuttamalla dietyylieetterillä tai 20 millä tahansa muulla orgaanisella veden kanssa sekoittumat-; tomalla liuottimena) , minkä jälkeen suojattu sarkosiini eristetään reagoimattoman sarkosiinin joukosta käsittele-:.*V mällä hapon (esim. kloorivetyhapon) kanssa. Happokäsitte- ly muuttaa suojaamattoman sarkosiinin emäksisen additiosuo-:*·: 25 lan suojaamattoman sarkosiinin happoadditiosuolaksi, joka suola liukenee veteen. Happokäsittely muuttaa kuitenkin suojatun sarkosiinin emäksisen additiosuolan ainoastaan suojatuksi sarkosiiniksi, koska suojatusta aminoryhmästä johtuen happoadditiosuolaa ei voida valmistaa. Tämä suo-30 jattu sarkosiini, ollen veteen liukenematon, on helposti erotettavissa suojaamattoman sarkosiinin suolasta, esi-*· · merkiksi uuttamalla sekoittamattomalla orgaanisella liuot- timella, kuten edellä on selostettu. Tässä käytettynä ter-min "sekoittamaton orgaaninen liuotin" piiriin sisältyvät / ; 35 kaikki tavalliset orgaaniset laboratorioliuottimet, jotka 10 79329 eivät sekoitu veden kanssa, kuten esimerkiksi dietyyli-eetteri, etyyliasetaatti, bentseeni, tolueeni, ksyleeni ja näiden kaltaiset liuottimet. Ensisijainen suojattu sarkosiini, N-bentsyylioksikarbonyylisarkosiini, on tun-5 nettu yhdiste. Menetelmän sen valmistamiseksi ovat esittäneet R.S. Tipton ja B.A. Pawson, J.Org.Chem., 26, 4698 (1961), ja yhdistettä on saatavana kaupallisena tuotteena toimittajalta Bachein, Inc., Torrance, CA.

Valmistettaessa, tämän suojatun sarkosiinin konden-10 soimiseksi L-tyrosiiniamidimolekyylin kanssa osan I muodostamiseksi, amino-suojattu sarkosiini on tavallisesti aktivoitava jollakin tavalla sidoksen muodostumisen edistämiseksi. Vaikkakin ensisijaisena tapana tämän aktivoinnin suorittamiseksi on "aktiivisen esterin" muodostaminen, 15 harkinnan arvoista on huomioida, että käyttökelpoisia voivat olla muutkin alalla aikaisemmin tunnetut aktivointi-menetelmät kuten seka-anhydridi-, symmetrinen anhydridi-, atsidi- tai happokloridi-menetelmät.

Harkinnan arvoista on myös, että käyttökelpoinen 20 voi olla jokainen suojatun sarkosiinin esteri; eräs ensisijainen aktiivinen esteri on esteri, joka on muodostettu : hydroksisukkiini-imidiä käyttäen. Suojatun sarkosiinin aktiivista esteriä valmistetaan antamalla ekvivalenttimää-rien suojattua sarkosiinia ja aktiivista esterireagenssia 25 reagoida sopivan orgaanisen liuottimen,kuten esimerkiksi, tetrahydrofuraanin, dioksaanin, dimetyyliformamidin, pyri-diinin tai näiden kaltaisen liuottimen liuoksessa. Tähän liuokseen lisätään sitten ekvivalenttimäärin kytkentäainet-ta, tyypillisenä esimerkkinä disykloheksyylikarbodi-imidiä. 30 Vaikka muutkin kytkentäaineet ovat tehokkaita, disyklohek-: syylikarbodi-imidi on erityisen käyttökelpoinen koska kyt- kentäreaktiossa syntyvä sivutuote liukenee hyvin huonosti käytettäviin liuotinryhmän liuottimiin, ja sen vuoksi se on helposti poistettavissa suodattamalla, kytkentätuotteen 35 jäädessä liuokseen.

li 79329 L-tyrosiiniamidia on saatavissa kaupan olevana tuotteena (esim. yhtiöltä Sigma Chemical Company, St. Louis, MO) tai sitä voidaan valmistaa tunnetuin menetelmin.

Seuraavassa osan I valmistusvaiheessa mooliekviva-5 lenttimäärin käytettävän L-tyrosiiniamidin ja suojatun sarkosiinin aktiivisen esterin annetaan reagoida keskenään siten, että läsnä on yksi ekvivalentti suolan muodostavaa ainetta, kuten orgaanista tertiääristä amiinia. Vaikkakin voidaan käyttää mitä tahansa orgaanista tertiääristä amii-10 nia, trietyyliamiinin on todettu toimivan hyvin. Liuottimena on sopiva edellä esitetty orgaaninen liuotin. Reagoimattomat aminohapot poistetaan käsittelemällä reaktioseos-ta hapon kanssa (esim. etikkahapon kanssa) ja eristetään uuttamalla edellä selostetulla tavalla sekoittumattomalla 15 orgaanisella liuottimena.

Viimeisenä vaiheena on oC-amino-suojaryhmän poisto sarkosiinista, lähinnä trifluorietikkahapolla, jolloin saadaan osaa I.

Osaa IV valmistettaessa lähdetään L-asparagiiniha-20 poista, jonka /^-karboksi-ryhmä on suojattu. Tästä /S-kar-boksiryhmästä käytetään tavallisesti nimitystä <J-ryhmä hyväksytyn nimistön mukaisesti osoittamaan, että se on ketjun päässä.

Esimerkkejä sopivista karboksyyli-suojaryhmistä ovat 25 bentsyyli ja bentsyyli, jonka fenyyliryhmässä on 1-3 subs-tituenttia ryhmästä halogeeni (esim. kloori tai bromi), : nitro, C^C-^-alkoksi (esim. metoksi) ja C^-C^-alkyyli (esim. metyyli). Bentsyyli on ensisijainen ryhmä. Tätä ^-suojattua L-asparagiinihappoa on kaupallisena tuottee-30 na saatavissa toimittajalta Bachem, Inc. Torrance, California, tai sitä voidaan valmistaa tunnetuin menetelmin.

Osat I ja od-T-(*>-U-ASP yhdistetään, jolloin muodostuu suojattu tripeptidi cx>T-U)-U-ASP-Y-TYR-R' (osa IV) , antamalla ekvivalenttimäärien niitä reagoida sopivassa aprootti-35 sessa liuottimessa, kuten dimetyyliformamidissa vähäisen i2 79329 kytkentäaine-ylimäärän kuten disykloheksyylikarbodi-imidi-ylimäärän läsnäollessa. Sitten poistetaan ASP-ryhmässä oleva cxf-aminosuojaryhmä, lähinnä trifluorietikkahapolla, minkä jälkeen suojattu X-aminohappo lisätään osaan IV, esim.

5 aktiivisen esterin menetelmällä, jolloin saadaan valmistetuksi osaa III.

Osan III sarkosiinitähteessä oleva cK.-aminosuojaryh-mä poistetaan trifluorietikkahapolla, jolloin saadaan osaa IIIA.

10 Lopuksi o(-amino- ja guanidiini-suojattu L-arginiini- tähde yhdistetään osan IIIA amino-päätteeseen, ja saadusta yhdisteestä poistetaan kaikki suojaryhmät, jolloin saadaan haluttu pentapeptidiamidi.

Suojaryhmien poisto voidaan suorittaa esimerkiksi 15 käsittelemällä vetykaasulla hiilellä oleva palladium-katalyytin läsnäollessa pelkistykseen soveltuvassa edellä selostetussa liuottimessa (lähinnä vesipitoisessa etikkaha-possa). Vetykaasun paineen ei tarvitse olla suurempi kuin yksi ilmakehä, vaikkakin paineen käyttäminen on tarkoituk-20 senmukaista sen jouduttaessa pelkistymisnopeutta.

Saadun epäpuhtaan tuotteen eristäminen ja puhdistus voidaan suorittaa yhdistetyllä kiteytys- ja ioninvaihto-kromatografointi-menetelmällä (lähinnä käyttämällä eluent-tina ammoniumasetaatti-pH 5:ttä), käyttämällä ohutkerros-25 kromatografiaa kunkin fraktion aineiden identtisyyden seuraamiseen. Vaikkakin seuraavissa esimerkeissä on esitetty useita eristys- ja puhdistusmenetelmiä, ilmeisen selvää on, että muitakin menetelmiä voidaan harkita käytettäväksi.

Vaikkakin liuossynteesitekniikka sinänsä on pepti-30 dikemiassa tunnettu (esim. FI-patenttijulkaisuista 62823, 63018, 64139 ja 64349), niin keksinnön mukaisella uudella menetelmällä saavutetaan etuja, jotka ovat ennestään tunnetun tekniikan perusteella täysin odottamattomia. Keksinnön mukaisella menetelmällä valmistetaan pentapeptidiä edul-35 lisen tuotteen ollessa Arg-Lys-Asp-Val-Tyr (tunnettu sivulla 1 mainitusta US-patenttijulkaisusta 4 190 646 kuten välipäätöksessä on esitetty). Keksinnön mukaisen menetelmän edut käyvät selvästi ilmi hakijan suorittamista vertailu- i3 79329 kokeista, joissa yllä mainittu edullinen pentapeptidi on valmistettu sekä keksinnön mukaisella menetelmällä että tavanomaisella liuossynteesimenetelmällä, jota seuraavassa kutsutaan vertailumenetelmäksi. Seuraavassa esitetään yh-5 teenveto näistä synteeseistä ja saaduista tuloksista.

Jos valmistetun pentapeptidin rakenneyksiköistä lyhyyden vuoksi käytetään seuraavaa numerointia:

Arg-Lys-Asp-Val-Tyr 1 2 3 4 5 10 niin keksinnön mukainen menetelmä voidaan esittää seuraavasti : 4 + 5 ==* (4-5) 3 + (4-5) 3» (3-4-5) 2 + (3-4-5) -55» (2-3-4-5) 15 1 + (2-3-4-5) -==- (1-2-3-4-5)

Vertailumenetelmässä reaktiojärjestys oli seuraava: 3 + 4 =*. (3-4) 2 + (3-4) ==v (2-3-4) 1 + (2-3-4) -(1-2-3-4) 20 (1-2-3-4) + 5 _-s, (1-2-3-4-5)

Keksinnön mukaisen kahdeksanvaiheisen menetelmän kokonaissaanto oli 46,4 %. Tämä oli täysin yllättävä verrattuna vertailumenetelmään, joka käsitti seitsemän vaihetta, ja jonka kokonaissaanto oli 6,4 %. Huomattakoon lisäk-25 si, että keksinnön mukaisen menetelmän viimeisessä vaiheessa saanto on 88 %, kun taas vertailumenetelmän viimeisessä vaiheessa saanto on vain 23 %.

Tämän keksinnön piiriin sisällytettäviä ovat myös suojatut yhdisteet, jotka ovat käyttökelpoisia välituottei-30 na keksinnön mukaista menetelmää sovellettaessa.

Esimerkki I

Osan I valmistus: SAR-TYR-Itt^ A. BOC-sarkosiini-hydroksisukkiini-imidi-esteri (BOC-SAR-OSu): 35 BOC-sarkosiinia (24,78 g, 0,13 moolia) ja N-hydroksi- sukkiini-imidiä (15,5 g, 0,13 moolia) liuotettiin 30 ml:aan i4 79329 kuivaa THF:a ja jäähdytettiin -5°:seen. 15 minuutin kuluessa lisättiin liuos, jossa oli disykloheksyylikarbo-di-imidiä (26,98 g, 0,13 moolia) 100 ml:ssa kuivaa THF:a. Saätua reaktioseosta sekoitettiin yön ajan ja annettiin 5 lämmetä ympäristön lämpötilaan. Kiinteä aine poistettiin suodattamalla ja liuotin haihdutettiin pois vakuumissa, jolloin saatiin valkeata kiinteätä ainetta. Kiinteä aine kiteytettiin 250 ml:sta absoluuttista etanolia 4°:ssa, jolloin saatiin 32 g (86 %) valkeata kiinteätä ainetta, 10 sp. 121-123°.

Analyysi laskettu: C, 50,35, H, 6,34, N, 9,79 saatu: C, 50,23, H, 6,44, N, 9,97 TLC: Rf = 0,81, CHCl3/MeOH 9/1 15 (Silica Gel G, 250 mikronia) p.m.r, ( o , CDC13): 1,45, S, 9H, BOC; 2,83, S, 4H, -OSu; 2,93, S, 3H, N-CH3; 4,27, S, 2H, -CH2~.

M.S.: M+ 286 B. BOC-sarkosyyli-L-tyrosiiniamidi (BOC-SAR-TYR-HiU): 20 L-tyrosiiniamidia (2,17 g, 10 mmoolia) ja trietyyli- amiinia (1,01 g, 10 mmoolia) liuotettiin 25 ml:aan kuivaa metanolia. Lisättiin BOC-sarkosiini-hydroksisukkiini-imi-diä (2,86 g, 10 mmoolia) ja reaktioseosta sekoitettiin yön ajan ympäristön lämpötilassa. Haihtuvat osat poistettiin 25 vakuumissa ja jäännös jaettiin etyyliasetaattiin (50 ml) ja NaCl-liuokseen /50 ml (25 ml H20 + 25 ml kyllästettyä NaCl)/ liukeneviin osiin. Faasit erotettiin ja orgaaninen faasi pestiin vielä kaksi kertaa saman koostumuksen omaavalla NaCl-liuoksella ja sitten kuivattiin MgS04:lla. Kuivaus-30 aine poistettiin suodattamalla ja liuotin haihdutettiin vakuumissa. Jäännös kromatografoitiin 75 grammalla valmistetta Silicar CCT l":n pylväässä käyttämällä eluenttina etyyliasetaattia. Yhdistettä alkoi ilmaantua kohdalla 390 Seuraavat 475 ml koottiin talteen ja haihdutettiin kuiviin, is 79329 jolloin saatiin 1,55 g (44 %) valkeata kiinteätä ainetta. Analyysi laskettu: C, 58,11, H, 7,17, N, 11,96 saatu: C, 57,96, H, 9,96, N, 11,45 5 TLC: (Silica Gel GF) Rf = 0,46 CHCl3/MeOH 9/1

C. Sarkosyyli-L-tyrosiiniamidi, trifluoriasetaatti (TFA SAR-TYR-NHQ

BOC-sarkosyyli-L-tyrosiiniamidia (1,30 g, 3,7 mmoo-lia) liuotettiin 15 inl:aan trifluorietikkahappoa 0°:ssa.

10 Liuosta sekoitettiin tunnin ajan 0°:ssa ja liuotin poistettiin vakuumissa. Saatua öljyä trituroitiin 50 ml:n kanssa kuivaa eetteriä, jolloin saatiin 1,27 g (94 %) valkeata kiinteätä ainetta.

p.m.r. (<£, CD3OD): 2,3, S, 3H, N-CH3? 3,00, d, 2H, 15 -CH2-C-j 3,7, S, 2H, -N-CH2~C=0,· 6,9, q, 4H, aro maattinen .

Esimerkki II

BOC-SAR-^-bentsyyli-ASP

(BOC-sarkosyyli- /Q -bentsyyli-L-asparagiinihappo) 20 Trietyyliamiinia (2,02 g, 20 mmoolia) ja /Ö-bentsyy- li-L-asparagiinihappoa (2,23 g, 10 mmoolia) sekoitettiin 50 mlrssa kuivaa RHF:ssa kuivaa THF:a. Lisättiin BOC-sarko-siini-hydroksisukkiini-imidiesteriä (2,68 g, 10 mmoolia) ja liuosta sekoitettiin ympäristön lämpötilassa yön ajan.

25 Kiinteät aineet poistettiin suodattamalla ja liuotin poistettiin vakuumissa. Jäännös jaettiin etyyliasetaattiin (100 ml) ja 2-norm. HCl:oon (100 ml) liukeneviin osiin. Faasit erotettiin ja orgaaninen faasi pestiin vedellä (2 x 100 ml), kyllästetyllä NaCl-liuoksella (1 x 100 ml) 30 ja kuivattiin (MgSO^). Kuivausaine poistettiin suodattamalla ja liuotin poistettiin vakuumissa. Jäännöstä trituroitiin heksaanin kanssa. Heksaani dekantoitiin pois ja jäännös kuivattiin vakuumissa, jolloin saatiin 2,64 g (67 %) hygroskooppista kiinteätä ainetta.

ie 79 329 TLC: = 0/73 + jälkiä epäpuhtauksista kohdalla 0,48, CHCl3/MeOH/HOAc 85/10/5 (Silica Gel G, 250 mikronia) p.m.r. ( S, CH2OD): 1,45, S, 9H, BOC; 2,82, S, 3H, 5 N-CH3; 2,95, M, 2H, -CH2-C; 3,85, S, 2H, -N-CH2“C=0; 4,85, t, 1H, -CH-f 5,08, S, 2H, -CH2; 5,46, S, 2H, -NH + -CO„H; 7,3, S, 5H, -0 ,,170 ^ = +13,3° (C = 1,032, MeOH)

Esimerkki III

Osan III valmistus: BQC-sarkosyyli-/Ö-bentsyyli-L-10 aspartyyli-sarkosyyli-L-tyrosiiniamidi (BOC-SAR- i5 -

Bzl-ASP-SAR-TYR-NH-,) BOC-sarkosyyli-^-bentsyyli-L-asparagiinihappoa (0,52 g 1.3 mmoolia) ja 1-hydroksibentsotriatsoli-monohydraattia (0,18 g, 1,3 mmoolia) liuotettiin 10 ml:aan kuivaa DMFsa 15 ja liuos jäähdytettiin 0°:seen. Lisättiin disykloheksyyli-karbodi-imidiä (0,27 g, 1,3 mmoolia) 7,5 ml:ssa kuivaa DMF:a ja saatua liuosta sekoitettiin tunnin ajan 0°:ssa. Sarkosyyli-L-tyrosiiniamidia, trifluoriasetaattia (0,50 g, 1.3 mmoolia) ja di-isopropyylietyyliamiinia (0,17 g, 1,3 20 mmoolia) liuotettiin 5 ml:aan kuivaa DMF:a ja lisättiin heti ensimmäiseen liuokseen. Reaktioseosta sekoitettiin yön ajan ja annettiin lämmetä ympäristön lämpötilaan. Kiinteä aine poistettiin suodattamalla ja jäännös liuotettiin 25 ml:aan etyyliasetaattia. Orgaaninen faasi pestiin pe-25 räkkäin 10-prosenttisella sitruunahapolla (2 x 25 ml), vedellä (2 x 25 ml), 5-prosenttisella NaHC03:lla (2 x 25 ml), H20:lla (2 x 25 ml), kyllästetyllä NaCl-liuoksella (25 ml) ja kuivattiin vedettömällä MgSO^:lla. Kuivausaine poistettiin suodattamalla ja liuotin poistettiin vakuumissa, jol-30 loin saatiin 0,6 g (73,5 %) valkeata kiinteätä ainetta.

TLC: Rf = 0,31, CHCl3/MeOH 9/1, (Silica Gel G, 250 mikronia) p.m.r. (d, CDC13) : 1,45, S, 9H, BOC; 2,95, m, 10H, 2 x N-CH3, -CH2-CH (Asp), -ch2-CH (Tyr); 3,8, m, 4H, 17 79329 2x H-CH.-OO» 4,6, m, 2H, -CH-CHj-, Asp, -CH-CH,- (Tyr); 5,1, m, 2H, -CH2-0; 6,92, q, 4H, tyrosiini aromaattinen; 7,25, S, 5H, aromaattinen bentsyyli /C^/pl0= 12,4° (C = 0,1046, MeOH)

Analyysi yhdisteelle C3iH4]_N5°9 5 laskettu: C, 59,32; H, 6,58; N, 11,16 saatu: C, 58,73; H, 6,80; N, 10,76

Esimerkki IV

Osan ΙΣΙΑ valmistus: Sarkosyyli-/ff-bentsyyli-L-aspar-tyyli-sarkosyyli-L-tyrosiiniamidi, trifluoriasetaat-10 ti (TFA SAR-&-Bz1-ASP-SAR-TYR-NH^) BOC-sarkosyyli- β-bentsyyli-L-aspartyyli-sarkosyyli-L-tyrosiiniamidia (0,48 g, 0,76 mmoolia) liuotettiin 10 ml: aan TFA:a 0°:ssa ja sekoitettiin 0°:ssa tunnin ajan. Liuotin poistettiin vakuumissa ja jäännöstä trituroitiin yön 15 ajan 50 ml:n kanssa kuivaa eetteriä. Suspensio suodatettiin ja kiinteä aine pestiin hyvin eetterillä ja kuivattiin vakuumissa, jolloin saatiin 0,4 g (82 %) valkeata kiinteätä ainetta.

TLC: Rf = 0,56, n-BuOH/HOAc/H20 (Silica Gel GF).

20 Esimerkki V

Pentapeptidin valmistus A. o(-fenyylimetoksikarbonyyli-L-arginyyli(HCl)-sarko-syyli-β -bentsyyli-L-aspartyyli-sarkosyyli-L-tyro-siiniamidi 25 /CDZ-ARG (HCl) -SAR-/3 -Bz 1-ASP-SAR-TYR-NHu/ o^-fenyylimetoksikarbonyyli-L-arginiini-HCl:a (2,66 g, 7.8 mmoolia) ja 1-hydroksibentsotriatsoli-monohydraattia (1,06 g, 7,8 mmoolia) liuotettiin 20 ml:aan kuivaa dimetyy-liformamidia ja jäähdytettiin 0°:seen. Disykloheksyyli- 30 karbodi-imidiä (1,61 g, 7,8 mmoolia) liuotettiin 5 mlraan ja lisättiin ensimmäiseen liuokseen. Saatua reaktioseosta sekoitettiin tunnin ajan 0°:ssa. Sarkosyyli-/Ö-bentsyyli-L-aspartyyli-sarkosyyli-L-tyrosiiniamidin TFA-suolaa (5,0 g, 7.8 mmoolia) liuotettiin 15 ml:aan kuivaa DMF:a trietyyli- ie 79329 amiinin (0,79 g, 7,8 mmoolia) kanssa ja lisättiin ensimmäiseen liuokseen. Reaktioseosta sekoitettiin yön ajan ja annettiin lämmetä ympäristön lämpötilaan. Kiinteä aine poistettiin suodattamalla ja haihtuvat osat pois-5 tettiin vakuumissa. Jäännöstä trituroitiin veden kanssa, jolloin saatiin jäännöstä (3 g).

TLC: Rf = 0,60, n-Bu0H/H0Ac/H20 3/1/1 (Silica Gel GF).

B. L-arginyyli-sarkosyyli-L-aspartyyli*sarkosyyli-L- tyrosiiniamidi 10 (arg-sar-asp-sar-tyr-nh2) oC-fenyylimetoksikarbonyyli-L-arginyyli(HC1)-sarko-syyli -β -bentsyyli-L-aspartyyli-sarkosyyli-L-tyrosiiniami-dia (1,0 g) liuotettiin 100 ml:aan 75-prosenttista etikka-hapon vesiliuosta ja pelkistettiin 0,5 grammalla katalyyt-15 tiä 10 % Pd/C 50 psi:n paineessa 15 tuntia. Katalyytti poistettiin suodattamalla ja liuos kylmäkuivattiin, jolloin saatiin 0,8 g ainetta. Aine liuotettiin 7 ml:aan vettä, suodatettiin 3^u:n multipore-suodattimen läpi, pH säädettiin arvoon 5 NH^OHrlla (väk.) ja kromatografoitiin 20 SP-C-25-kolonnissa (2,5 x 100 cm) 0,20-mol. ammoniumase-taatilla, pH 5,0, 100 ml/t, 20 ml/putki. Putket 71-78 yhdistettiin ja kylmäkuivattiin, jolloin saatiin 0,35 g yhdistettä Arg-Sar-Asp-Sar-Tyr-NH2.

TLC: Rf = 0,23, n-Bu0H/H0Ac/H20 3/1/1, (Silica Gel GF) 25 = = 0,1-norm. HOAc)

Esimerkki VI

Noudattamalla esimerkkien I-V menetelmiä, mutta korvaamalla niissä käytetty suojattu sarkosiini ekvivalentti-määrällä sopivasti suojattua L-valiinia esimerkissä I ja 30 ekvivalenttimäärällä sopivasti suojattua L-lysiiniä esimerkissä II, valmistetaan yhdistettä H-ARG-LYS-ASP-VAL-TYR-NH2.

Esimerkki VII

Noudattamalla esimerkkien I-V menetelmiä, mutta 35 käyttämällä ekvivalenttimäärin sopivia lähtöaineita, valmistetaan yhdisteitä: 19 79329

h-val-tyr-nh2 H-VAL-TYR-bentsyyliesteri H-SAR-TYR-bentsyyliesteri H-ARG-LYS-ASP-VAL-TYR-OH 5 BOC-£-CBZ-LYS-/?-bentsyyli-ASP-OH

BOC-epsilon-CBZ-LYS-^-bentsyyli-ASP-VAL-TYR-OH-bentsyyli- esteri

Esimerkki VIII

Osan IVA valmistus: H-^-bentsyyli-ASP-VAL-TYR-bent-10 syyliesteri, trifluoriasetaatti (/^-bentsyyli-L-as- partyyli-L-valyyli-L-tyrosiini-bentsyyliesteri, tri-fluoriasetaatti) BOC-^bentsyyli-L-asparagiinihappoa ja mooliekviva-lenttimäärä 1-hydroksibentsotriatsoli-monohydraattia liuo-15 tetaan kuivaan DMF:iin ja liuos jäähdytetään 0°:seen. Sitten liuokseen lisätään mooliekvivalenttimäärä disyklohek-syylikarbodi-imidiä ja koko seosta sekoitetaan tunnin ajan 0°:ssa. Reaktioseokseen lisätään sitten liuos, jossa on DMF:ssa mooliekvivalenttimäärin trietyyliamiinia ja L-va-20 lyyli-L-tyrosiini-bentsyyliesteriä, trifluoriasetaattia (valmistettu noudattamalla esimerkin I menetelmää, mutta korvaamalla siinä käytetty sarkosiini ekvivalenttimäärällä L-valiinia) ja koko seosta sekoitetaan yön ajan ympäristön lämpötilassa. Tuote eristetään reaktioseoksesta reaktion 25 päätyttyä ja BOC-ryhmä poistetaan, jolloin saadaan haluttua ainetta.

Esimerkki IX

Osan III (vaihtoehtoinen) valmistus: BOC-epsilon-CBZ-LYS-^-bentsyyli-ASP-VAL-TYR-bentsyyliesteri 30 (BOC-epsilon-CBZ-L-lysyyli-ft-bentsyyli-L-aspartyy- li-L-valyyli-L-tyrosiini-bentsyyliesteri BOC-epsilon-CBZ-L-lysiini-hydroksisukkiini-imidiä lisätään liuokseen, jossa on mooliekvivalenttimäärin trietyyliamiinia ja /3-bentsyyli-L-aspartyyli-L-valyyli-L-tyro-35 siini-bentsyyliesteri-trifluoriasetaattia kuivassa THF:ssa ja koko seosta sekoitetaan yön ajan. Kiinteiden aineiden poistamisen jälkeen tuote eristetään liuoksesta.

Claims (8)

20 79329

1. Menetelmä peptidin H-ARG-X-ASP-Y-TYR-R valmistamiseksi, jossa X on LYS ja Y on VAL tai X ja Y on kumpikin 5 SAR ja R on OH tai NH2, liuossynteesitekniikalla, tunnettu siitä, että a) muodostetaan osa I, jolla on kaava H-Y-TYR-R' i) suojaamalla Y-aminohapon oC-aminoryhmä antamalla sen reagoida reagenssin kanssa, joka liittää suojaavan ryhmän

10 T, ii) aktivoimalla vaiheessa i) muodostettu suojattu Y amiinin nukleofiilisen liittymisen suhteen karboksiryhmään, jolloin muodostuu karboksi-aktivoitu suojattu Y-aminohappo, iii) antamalla mainitun karboksi-aktivoidun suojatun Y:n 15 reagoida TYR-R':n kanssa ja iv) poistamalla suojaryhmä T, jolloin muodostuu osa I; b) muodostetaan osa IV, jolla on kaava Ci -Τ-ω-U-ASP-Y-TYR-R1 i) suojaamalla asparagiinihapon 06-amino- ja ϋ-karbok-20 siryhmät antamalla sen reagoida reagenssin kanssa, joka liittää siihen suojaryhmät T ja U, ii) aktivoimalla vaiheessa i) muodostettu suojattu aspa-ragiinihappo amiinin nukleofiilisen liittymisen suhteen oC-karboksiryhmään, jolloin muodostuu karboksi-aktivoitu 25 suojattu asparagiinihappo, ja iii) antamalla mainitun karboksi-aktivoidun suojatun asparagiinihapon reagoida osan I kanssa, jolloin muodostuu osa IV; c) muodostetaan osa IVA, jolla on kaava 30 Η-ϋ-ϋ-ASP-Y-TYR-R', poistamalla suojaryhmä T osasta IV; d) muodostetaan osa III, jolla on kaava OC-T-(£-T")-Χ-ω-U-ASP-Y-TYR-R' i) suojaamalla X-aminohapon ot-aminoryhmä (ja jos X on LYS, £-aminoryhmä) antamalla sen reagoida reagenssin (rea-35 genssien) kanssa, joka (jotka) liittää (liittävät) suoja-ryhmän (suojaryhmät) T (ja T"), 21 79329 ii) aktivoimalla vaiheessa i) muodostettu suojattu X, amiinin nukleofiilisen liittymisen suhteen karboksiryhmään, jolloin muodostuu karboksi-aktivoitu suojattu X-aminohap-po, ja 5 iii) antamalla mainitun karboksi-aktivoidun suojatun X-aminohapon reagoida osan IVA kanssa, jolloin muodostuu osa III; e) poistetaan T-suojaryhmä osasta III, jolloin muodostuu osa IIIA, jolla on kaava H-(£-T")-Χ-ω-U-ASP-Y-TYR-

10 R'; f) valmistetaan ot-T-(#&-T' -ARG, jossa T on L-arginii-nin ct-aminoryhmässä oleva suojaryhmä ja Τ' on L-arginiinin guanidinoryhmässä oleva suojaryhmä; g) osan IIIA annetaan reagoida cC-T-id-T'-ARG:n kans- 15 sa, jolloin muodostuu ct-T-O-T'-ARG- (£-T")-X-(i*-U-ASP-Y-TYR- R'; h) poistetaan ryhmät U, T, Τ’ ja T", jolloin muodostuu peptidi H-ARG-X-ASP-Y-TYR-R; ja j) eristetään ja puhdistetaan saatu peptidi; jolloin 20 edellä esitetyissä kaavoissa T ja T" on valittu ryhmästä, jonka muodostavat 0 N a) R^-OC-, jossa Rj^ on fenyyli; tolyyli; ksylyyli; adamantyyli; allyyli; /ö-syaanoetyyli; fluorenyylimetyyli; 25 fenyylirenkaastaan mahdollisesti 1-3 halogeenilla, nitrolla, pienalkyylillä ja/tai pienalkoksilla substituoitu bentsyy-li; di-isopropyylimetyyli; difenyylimetyyli; sykloheksyyli; syklopentyyli; vinyyli; t-butyyli; t-amyyli; dimetyylitri-fluoriraetyyliraetyyli, tai dimetyylibifenyylimetyyli;

30 O H b) R2c“f jossa R2 on pienalkyyli, jossa on 2-4 hiiltä tai pienalkyyli, jossa on 1-4 hiiltä ja substituenttei-na 1-5 halogeenia; V II 35 c) R^O-P-, jossa V on S tai O ja ja R^ on kumpi- 0R„ 4 ..... kin bentsyyli tai pienalkyyli; „ 79329 22 - ' Rg jossa R,- ja Rg erikseen on kumpi- j - kin pienalkyyli tai R,. ja Rg yh- d) dessä vastaavat ryhmää -CHj-C-CHj- 5 ^ ^0=0 R7 R8 x ^ jossa R7 ja Rg on kumpikin vety ® tai pienalkyyli; R9 e) 7i 2 jossa Rq on vety tai nitro; ja 10 ux xs \ R ° R10\ Il jossa R^q on vety, metyyli, halo-15 geeni tai nitro, <5 edellyttäen, että T on monovalenttinen kun X on SAR; U on fenyyliryhmästään mahdollisesti 1-3 halogeenilla, nitrolla, C^_2“alkyylillä ja/tai C^_ ^-^ko^silla substituoitu 20 bentsyyli; ja T" on 0 r^-OC-, jossa on edellä määritelty, nitro, hydroklori- di, p-metoksibentsyylisulfonyyli tai tosyyli, ja R’ on NH2 tai OU, jossa U on edellä määritelty.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tun nettu siitä, että sekä X että Y on SAR.

3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että R on N^.

4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, t u n -30 n e t t u siitä, että X on LYS ja Y on VAL.

5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että R on OH. 23 79329

6. Patenttivaatimuksen 1 mukaisessa menetelmässä välituotteena käyttökelpoinen suojattu tetrapeptidi, tunnettu siitä, että se on BOC-sarkosyyli-/5-bents-yyli-L-aspartyyli-sarkosyyli-L-tyrosiiniamidi.

7. Patenttivaatimuksen 1 mukaisessa menetelmässä välituotteena käyttökelpoinen suojattu tetrapeptidi, tunnettu siitä, että se on sarkosyyli-/3-bentsyyli-L-aspartyyli-sarkosyyli-L-tyrosiiniamidi.

8. Patenttivaatimuksen 1 mukaisessa menetelmässä 10 välituotteena käyttökelpoinen suojattu pentapeptidi, tunnettu siitä, että se on Ct-bentsyylioksikarbo-nyyli-L-arginyyli(HC1)-sarkosyyli-/^-bentsyyli-L-aspartyy-li-sarkosyyli-L-tyrosiiniamidi. 24 79329