NO177100B

NO177100B - Peptider

Info

Publication number: NO177100B
Application number: NO882386A
Authority: NO
Inventors: George Heavner
Original assignee: Ortho Pharma Corp
Priority date: 1981-06-16
Filing date: 1988-05-31
Publication date: 1995-04-10
Also published as: NO177100C; NO882386L; NO882386D0

Description

Foreliggende oppfinnelse angår peptider. ~

I US-P. 4.190.646 og 4.261.886 er det beskrevet forskjellige peptider som har tymisk og immunologisk funksjon. US patent 4.190.646 beskriver "tymopoietin pentapeptidet" (TP5), og substituerte derivater av dette, mens US patent 4.261.886 beskriver peptidanaloger av TP5 med større virkning enn TP5. I US patentene blir nevnte peptider fremstilt ved en synteseteknikk i fast fase, vanligvis beskrevet som "Merri-field-syntese". Videre angir patentene også at den klassiske teknikk, (dvs oppløsningssynteseteknikk) kan brukes for å fremstille visse peptider og derivater, men det er ikke beskrevet noen spesifikk klassisk fremgangsmåte eller syntesevei.

Skjønt Merrifields synteseteknikk i fast fase er hensiktsmessig for fremstilling av små mengder peptider i labora-toriet, så ville den være upraktisk og generelt uøkonomisk for fremstilling av store mengder (dvs mer enn 100 g) peptid, og for slike store mengder er det mer hensiktsmessig å bruke en oppløsningssynteseteknikk. Denne type teknikk er vanligvis langt billigere enn en teknikk hvor man bruker fast fase, noe som skyldes en lavere enhetspris på enkelte av reagensene som brukes. Man har nå tilveiebragt visse spesielle peptider som kan benyttes for fremstilling av ønskede sluttpeptider på en mer hensiktsmessig og økonomisk måte i forhold til de kjente teknikker.

Ifølge foreliggende oppfinnelse er det således tilveiebragt et dipeptid som er kjennetegnet ved formelen:

hvor R' er NH2 og Y er SAR.

Videre tilveiebringes et beskyttet dipeptid, som er kjennetegnet ved formelen:

alfa-T-X-omega-TJ-Z-OH — hvor X er SAR eller epsllon-T"-LYS; Z er ASP eller GLU; og T og T" er hver valgt fra gruppen bestående av: a) hvor Ri er benzyl, benzyl hvor fenylringen er substituert med fra 1 til 3 grupper valgt fra laverealky og t-butyl; og b)

hvor R2 er laverealkyl med 2-4 karbonatomer;

og U er benzyl.

Oppfinnelsen tilveiebringer også et beskyttet tetrapeptid som er kjennetegnet ved formelen:

hvor R<*> er OU eller NH2; U er benzyl; R^ er NH2; x er epsilon-T"-LYS og Y er VAL eller X og Y er begge SAR; Z er ASP; og T og T" er hver en gruppe valgt fra gruppen bestående av de som er definert i a)-b) ovenfor.

Ytterligere tilveiebringer oppfinnelsen et tetrapeptid som er kjennetegnet ved formelen:

hvor R' er OU eller NH2; TJ er benzyl; X er epsilon-T"-LYS og Y er VAL eller X og Y er begge SAR; Z er ASP; og T" er en gruppe valgt fra gruppen bestående av de som er definert i

a)-b) ovenfor.

Det tilveiebringes også et beskyttet pentapeptid som er

kjennetegnet ved formelen:

hvor R' er OH eller NH2; U er E eller benzyl; X er epsilon-T"-LYS og Y er VAL eller X og Y er begge SAR; Z er ASP; og T og T" er hver H eller en gruppe valgt fra gruppen bestående av de som er definert i a)-b) ovenfor.

Oppfinnelsen tilveiebringer dessuten et beskyttet tripeptid som er kjennetegnet ved formelen:

hvor Z er ASP; Y er VAL; R' er OU; U er benzyl hvor fenylringen er substituert med en laverealkyl; og T er valgt fra gruppen bestående av de som er definert i a)-b) ovenfor.

Sluttelig tilveiebringer oppfinnelsen et dipeptid som er kjennetegnet ved formelen: hvor X er SAR eller epsilon-T"-LYS; T og T" er hver valgt fra gruppen bestående av de som er definert i a)-b) ovenfor; T' er valgt fra gruppen bestående av

og andre benyttede symboler har de samme betydninger

som angitt ovenfor.

Foreliggende peptider kan anvendes for fremstilling av spesielle pentapeptider som har formelen:

hvor X er LYS og Y er VAL, eller X og Y er begge SAR, Z er ASP eller GLU, og R er OH eller NH2, og denne fremgangsmåten innbefatter at man: A) danner et fragment I, som består av H-Y-TYK-R', hvor R' er OU eller NB2; Y er SAR eller VAL; og U er benzyl eller benzyl hvor fenylgruppen er substituert med fra 1 til 3 grupper valgt fra halogen, nitro, C1-C3 laverealkyl, og cl-c3 laverealkoksy, ved i) beskyttelse av alfa-aminogruppen i Y-aminosyren ved å la den reagere med en reagens som vil introdusere beskyttelsesgruppen T, hvor gruppen T er valgt fra a) hvor Ri er fenyl; tolyl; xylyl; adamantyl; allyl; beta-cyanoetyl; fluorenylmetyl; benzyl; benzyl hvor fenylringen er substituert med fra 1 til 3 grupper valgt fra halogen, nitro, laverealkyl og laverealkoksy, nitropropylmetyl; difenylmetyl; cykloheksyl; cyklopentyl; vinyl; t-butyl; t-amyl; dimetyldifluormetylmetyl; eller dimetylbifenylmetyl; b) hvor R2 er laverealkyl med 2-4 karbonatomer eller laverealkyl med 1-4 karbonatomer substituert med fra 1 til 5 halogengrupper; c) V er S eller 0, og R3 og R3 hver er er benzyl eller laverealkyl; d)

hvor R5 og Rf, individuelt hver er

laverealkyl eller R5 og R5 sammen er

-CH2-C-CH2- hvor R7 og Rg hver er

R7 R8

hydrogen eller laverealkyl,

e)

hvor Rg er hydrogen eller nitro; og f)

5

hvor R^o er hydrogenmetyl, halogen eller nitro,

forutsatt at T er monodentat når X er SAR;

ii) aktivering av den beskyttede Y dannet i trinn i) med hensyn til nukleofilt angrep ved karboksygruppen av et amin, til dannelse av en karboksyaktivert beskyttet Y-aminosyre;

iii) omsetning av nevnte karboksyaktiverte beskyttede Y

med TYR-R' hvor R' har den ovenfor angitte betydning;

iv) fjerning av den beskyttede gruppe T, hvorved fragment

I dannes,

danner fragment II, som består av alfa-T-(epsilon-T")X-omega-Y-Z-OH, vhor Y, U og Z har de ovenfor angitte betydninger, og T" har samme betydning som T angitt ovenfor, ved

i) fremstilling av omega-U-Z-OH, hvor U er en beskyttende gruppe på omega-karboksygruppen i Z-aminosyren, og har den ovenfor angitte betydning;

ii) beskyttelse av alfa-aminogrupen (og dersom X er LYS,

epsilon-aminogruppen) i X-aminosyren ved å lan den reagere med reangens(er) som vil introdusere den beskyttende gruppen(e) og T (og T"), hvor T og T" har de ovenfor angitte betydninger;

iii) aktivering av den beskyttede X dannet i trinn ii) med hensyn til nukleofilt angrep ved karboksygruppen av et amin, til dannelse av en karboksyaktivert, beskyttet X-aminosyre;

iv) reaksjon av nevnte akrboksyaktiverte- beskyttede X-aminosyre med omega-U-Z-OH, hvorved fragment II dannes,

C) reagerer fragmenter I og II til dannelse av et fragment III som består av T-(epsilon-T")X-omega-U-Z-Y-TYR-R', hvor X, "U, Z, Y, R', T og T" har de ovenfor angitte betydninger ; D) fjerner T-beskyttelsesgruppen fra fragment III til dannelse av fragment HIA, som består av H-(epsilon-T")X-omega-U-Z-Y-TYR-R', hvor symbolene har den ovenfor angitte betydning;' E) fremstiller alfa-T-omega-T'-ARG, hvor T er en beskyttende gruppe på alfa-aminogruppen i L-arginin, og T<*> er en beskyttende gruppe på guanidinogruppen i L-arginin, hvor T' er en gruppe valgt fra gruppen bestående av

0

II

R^-OC- hvor Ri har den ovenfor angitte betydning, nitro, hydroklorid, p-metoksybenzylsulfonyl og tosyl, F) omsetter fragment 11 IA med alfa-T-omega-T'-ARG til dannelse av alfa-T-omega-T<*->ARG-(epsilon-T'-)X-omega-U-Z-Y-TYR-R', hvor symbolene har de ovenfor angitte betydninger ; G) fjerner gruppene U, T, T' og T" til dannelse av peptidet

E-ARG-X-Z-Y-TYR-R; og

H) isolerer og renser det resulterende peptid.

Evis X er LYS, så må selvsagt dets epsilon-aminogruppe også egnet beskyttes ved hjelp av den aminobeskyttende gruppen T" under fremstillingen av fragmenter som inneholder X og under deres anvendelse for fremstilling av sluttpeptidet. Nevte T"-gruppe må lett la seg fjerne under betingelser som Ikke ødelegger det resulterende peptid, samtidig som nevnte gruppe må være stabil under fjerning av T-gruppene.

Den alfa-aminobeskyttende gruppen T kan være den samme eller forskjellig for hver av aminosyrene, og må være stabil overfor fjerning i de trinn som brukes for å knytte sammen aminosyregruppene, samtidig som den lett må la seg fjerne ved sluttend av de forbindende trinn ved betingelser som ikke vil spalte noen av amidbindingene i peptidet. For visse grupper (f.eks BOC) frembringes denne fjerning ved hjelp av en sterk syre (f.eks trifluoreddiksyre), som resulterer i at det intermediære produkt fremstilles som det tilsvarende syreaddisjonssalt (f.eks trifluoracetat).

Den guanidinobeskyttende gruppen T" kan være enhver egnet aminobeskyttende gruppe slik dette er beskrevet nedenfor, eller en nitrogruppe såvel som syreaddisjonssalter så som hydrokloridet. Blant de aminobeskyttende grupper er det foretrukket å bruke uretanbeskyttende grupper (formel a nedenfor) og substituerte sulfonsyrederivater så som p-metoksybenzensulfonyl og tosyl. Hydrokloridsaltet er det mest foretrukne. Denne guanidinbeskyttende gruppen er her betegnet "omega"-gruppen for å indikere at den befinner seg på enden av kjeden. Den eksakte posisjon på mange guanidinbeskyttende grupper på kjeden er ikke definitivt kjent.

Den karboksybeskyttende gruppen U bør la seg lett fjerne under betingelser som ikke ødelegger det resulterende peptid, samtidig som gruppen må være stabil under fjerning av T-gruppene.

R'-gruppen er enten NH2 (for produktpeptider hvor R er NH2 ) eller OU (for produktpeptider hvor R er OH).

Den ovenfor angitte aminobeskyttende gruppen f) som bidentat, kan bare brukes for alfa-aminogruppene på L-arginin eller L-valin eller alfa-amino eller epsilon-aminogruppene på L-lysln, men Ikke for alfa-aminogruppen 1. sarkosin. Den aminobeskyttende gruppen for sarkosin-alfa-aminogruppen må være monodentat på grunn av metylsubstituenten på denne aminogruppen. De gjenværende aminobeskyttende grupper kan brukes for alle aminosyrer.

Slik det brukes her, innbefatter begrepet "halogen" fluor, klor, brom og iod, men klor og brom er foretrukne. Begrepene laverealkyl og laverealkoksy innbefatter henholdsvis mettede alifatiske hydrokarboner med fra ett til seks karbonatomer så som metyl, etyl, isopropyl, t-butyl, n-heksyl og lignende, samt de tilsvarende alkoksyder så som metoksy, etoksy, lsopropoksy, t-butoksy, n-heksoksy og lignende. Metyl er den foretrukne laverealkylgruppe og metoksy er den foretrukne laverealkoksygruppe.

De reagenser som brukes for å innføre disse beskyttende grupper (vanligvis de tilsvarende syreklorider, skjønt andre derivater også kan brukes) vil i enkelte tilfeller her bli betenget som "beskyttende gruppereagenser". Andre egnede beskyttende grupper er f.eks beskrevet i "Protective Groups in Organic Chemistry", J.F.W McOmie, red. Plenum Press, N.Y., 1973.

Det er foretrukket at hver T og T" er de samme og kan være benzyloksyoksykarbonyl (CBZ) eller trifluoracetyl (TFA). Det er foretrukket at T- er hydrokloridsaltet.

En rekke forskjellige reagenser kan brukes for å fremstille de karboksyaktiverte, beskyttende aminosyregrupper som er beskrevet ovenfor.

En type karboksyaktivert, beskyttet aminosyregruppe er en reaktiv ester. Eksempler på reagenser som kan brukes for å fremstille egnede aktiverte estere er fenol, fenol hvor fenylringen er substituert med fra en til fem grupper valgt fra gruppen bestående av halogen (f.eks klor eller fluor), nitro, cyano og metoksy; tiofenyl; N-hydroksyftalimid; N-hydroksysuccinimid; N-hydroksyglutaramid; N-hydroksybenzamid; 1-hydroksybenzotriazol og lignende. Andre egnede midler er f.eks beskrevet i "Protective Groups in Organic Chemistry"; J.F.W. McOmie, red., slik denne er referert ovenfor. I de etterfølgende spesifikke eksempler vil man vanligvis anvende N-hydroksysuccinimid eller 1-hydroksybenzotriazol.

Akdre aktiveringsmetoder så som den blnadede eller symmet-riske anhydridmetoden, syrekloridmetoden og azidmetoden er velkjente, og er f.eks beskrevet i Bodanszky et al, "Peptide Synthesis", 2. utgave, 1976, sidene 85-128. Disse andre fremgangsmåter kan også brukes.

Av hensiktsmessighetsgrupper vil de følgende forbindelser bli brukt for å betegne de forskjellige aminosyrer:

Fremstilling og anvendelse av foreliggende peptider er vist skjematisk på følgende figur 1:

Et eksempel på fremstilling av H-ARG-SAR-ASP-SAR-TYR-NH2 er vist skjematisk på følgende figur 2:

Et eksempel på fremstillingen av H-ARG-LYS-ASP-VAL-TYR-OH er vist skjematisk på følgende figur 3:

I den ovennevnte figurer er de beskyttende grupper represen-tert ved U, T, T<*> og T" som angitt ovenfor, mens karboksy-aktiveringen av aminosyregruppen er angitt med bokstavene

"OA" .

Under henvisning til figur 2 så kan fragment I vanligvis fremstilles på følgende måte. For å beskytte aminogruppen i sarkosin, så fremstiller man et vannoppløselig, basisk addisjonssalt av sarkosin i vann. Hensiktsmessig kan dette basiske addisjonssalt fremstilles ved å oppløse sarkosin i et svakt molart overskudd av natriumhydroksyd. Denne oppløsning blir så samtidig tilsatt et svakt overskudd av en reagens for å innføre den beskyttende gruppen T (f.eks-det tilsvarende syrekloridet så som benzyloksykarbonylklorid) og en opp-løsning av en base (f.eks natriumhydroksyd) for å reagere med syren (f.eks HC1) som dannes under reaksjonen. Reagensen med den beskyttende gruppen må være i oppløsning og er fortrinnsvis syrekloridet. Etter at reaksjonen er ferdig ble over-skuddet av den reagens som innførte den beskyttende gruppe fjernet (f.eks ved ekstraksjon med dietyleter eller et annet organisk oppløsningsmiddel som er ublandbart med vann), fulgt av en isolasjon av det beskyttende sarkosin fra uomsatt sarkosin, noe som skjer ved en behandling med syre (f.eks saltsyre). Syrebehandlingen omdanner det basiske addisjonssaltet av ubeskyttet sarkosin, og dette er oppløselig i vann. Imidlertid så vil syrebehandlingen omdanne det beskyttede sarkoisnbasiske addisjonssaltet bare til beskyttet sarkosin, ettersom det nå ikke er mulig å fremstille et syreaddisjonssalt på grunn av den beskyttende aminogruppen. Dette beskyttede sarkosin er uppløselig i vann, og det lar seg lett utskille fra saltet av det ubeskyttede sarkosin, f.eks ved en ekstraksjon med et ublandbart organisk oppløsningsmiddel slik dette er beskrevet ovenfor. Med begrepet "ublandbart organisk oppløsningsmiddel" forstås alle vanlige kjente organiske oppløsningsmidler som ikke lar seg blande med vann, f.eks dietyleter, etylacetat, benzen, toluen, xylen og lignende. Det foretrukne beskyttede sarkosin, N-benzyloksykarbonyl-sarkosin er en kjent forbindelse. En fremgangsmåte for dets fremstilling er vist av R.S. Tipton og B.A. Pawson, J. Org. Chem., 26, 4698 (1961), og forbindelsen er kommersielt tilgjengelig fra Bachem, Inc., Torrance, CA.

I syntense for kondensasjonen av dette beskyttede sarkosin med L-tyrosinamidmolekylet for fremstilling av fragment I, bør det aminobeskyttede sarkosin vanligvis aktiveres på en eller annen måte for å fremme dannelsen av bindingen. Skjønt det vanligvis er foretrukket å utføre denne aktivering ved at man danner en "aktivester", så kan man også bruke andre aktiveringsmetoder, så som ved hjelp av et- blandet eller symmetrisk anhydrid, azid eller syreklorid.

Man kan bruke enhver av det beskyttede saroksin, skjønt den foretrukne aktive ester er den som dannes ved hjelp av hydroksysuccinimid. Den aktive ester av det beskyttede sarkosin fremstilles ved å reagere ekvivalente mengder av det beskyttede sarkosin og en aktiv esterreagens i en oppløsning av et egnet organisk oppløsningsmiddel så som tetrahydro-furan, dioksan, dimetylformamid, pyridin og lignende. Denne oppløsning blir så tilsatt en ekvivalent mengde av et koblingsmiddel, typisk dicykloheksylkarbodiimid. Skjønt andre koblingsmidler også er effektive, så er dicykloheksylkarbodiimid spesielt brukbart p grunn av at biproduktet fra koblingsreaksjonen er meget lite oppløselig i de typer oppløsningsmidler som brukes, hvorved det lett kan fjernes ved filtrering og man får det koblede produkt i oppløsning. L-tyrosinamid er kommersielt tilgjengelig (f.eks fra Sigma Chemical Company, St. Louis, MO) eller kan fremstilles ved hjelp av kjente fremgangsmåter.

Det neste trinn i fremstillingen av fragment I består i at man reagerer en molar ekvivalent mengde av L-tyrosinamid med en beskyttende sarkosinaktive ester i nærvær av en ekvivalent av et saltdannende materiale så som et organisk tertiært amin. Skjønt ethvert organisk tertiært amin kan brukes, så har man funnet det meget tilfredsstillende å bruke trietylamin. Oppløsningsmidlet er et egnet organisk oppløsnings-middel av den type som er beskrevet ovenfor. De uomsatte aminosyrer fjernes ved behandling av reaksjonsblandingen med en syre (f.eks eddiksyre) eller ved ekstraksjon med et ublandbart organisk oppløsningsmiddel slik det er beskrevet ovenfor.

Til slutt fjerner man den alfa-aminobeskyttede gruppen fra sarkosin, fortrinnsvis med trifluoreddiksyre,-hvorved man får fragment I.

Fremstillingen av fragment II starter vanligvis med L-aspartinsyre som beskyttes på sin beta-karboksygruppe eller L-glutaminsyre som beskyttes på sin gamma-karboksygruppe. Denne beta- eller gamma-karboksygruppen blir vanligvis betegnet som "omega"-gruppen i overensstemmelse med vanlig nomenklatur for å indikere at den sitter i enden av kjeden.

Eksempler på egnede karboksylbeskyttende grupper er benzyl og benzyl for fenylgruppen er substituert med fra en til tre, gruppen valgt fra gruppen bestående av halogen (f.eks klor eller brom), nitro, Ci-C^-laverealkoksy (f.eks metoksy) eller Ci-C3~laverealkyl (f.eks metyl). Se ovenfor refererte bok av McOmie for ytterligere beskrivelse av slike grupper. Benzyl er den foretrukne gruppe. Denne betabeskyttende L-aspartinsyre eller gamma-beskyttede L-glutaminsyre er kommersielt tilgjengelig fra Bachem, Inc. Torrance, California, eller kan fremstilles ved kjente fremgangsmåter.

Denne beta-beskyttede L-aspartinsyre eller gammabeskyttede L-glutaminsyre (omega-U-Z) reageres så med nevnte alfa-aminobeskyttede sarkosin som er blitt aktivert (f.eks ved en omdannelse til en aktiv ester) slik dette er beskrevet ovenfor, hvorved man får fremstilt fragment II. På figur 2 er

Z ASP.

Fragmentene I og II knyttes sammen til det beskyttede tetrapeptid alfa-T-SAR-beta-U-ASP-SAR-TYR-NH2 (fragment III) ved å reagere ekvivalente mengder i et passende aprotisk oppløsningsmiddel så som dimetylformamid i et nærvær av et svakt overskudd av et koblingsmiddel så som dicykloheksylkarbodiimid. Det er også foretrukket å utføre denne reaksjonen i nærvær av en forbindelse som gjør at man for minimal racemisering i tilknytning til karboksylgruppen på L-lysindelen av fragment I, og øke reaksjonshastigheten, og man kan f.eks bruke 1-hydroksybenzotriazol. Som i—forbindelse med fragment II, så blir den alfa-aminobeskyttende gruppen på sarkosindelen av fragment III fjernet med trifluoreddiksyre, hvorved man får fragment IIIA.

Etter en koblingsreaksjon som tilsvarer den som ble brukt for å binde sammen fragmentene I og II, så blir til slutt en alfa-amino og guanidinbeskyttet L-arginingruppe knyttet til aminosluttgruppen i fragment HIA, hvoretter man fjerner alle beskyttende grupper og får det ønskede pentapeptidamid. Fjerningen av de beskyttede grupper kan f.eks utføres ved behandling med hydrogengass i nærvær av en palladium-på-karbon-katalysator i et egnet reduserende oppløsningsmiddel slik dette er beskrevet ovenfor (fortrinnsvis vandig eddiksyre). Hydrogengassen trenger ikke å være under et trykk som er høyere enn en atmosfære, skjønt bruken av trykk er hensiktsmessig ettersom dette akselererer reduksjonshastig-heten.

Isolasjon oppnås ved en kombinasjon av utkrystallisering og ioneutbytningskromatografi (fortrinnsvis ved å bruke ammoniumacetat-pH 5 som elueringsmiddel), og ved å bruke tynnsjiktskromatografi for å fastslå identiteten på for-bindelsene i hver fraksjon. Skjønt der er angitt flere eksempler på isolasjons- og rensingsteknikk i følgende eksempler, så er det selvsagt underforstått at også andre metoder kan brukes.

Fremstilling og anvendelse av foreliggende peptidmellom-produkter illustreres i de nedenstående eksempler.

EKSEMPEL I

Fremstilling av fragment I: SAR-TYR-NH2

A. BOC- sarkosln- hvdroksvsuccinimidester ( BOC- SAR- OSu): BOC-sakrison (24,78 g, 0,13 mol) og N-hydroksysuccinimid (15,5 g, 0,13 mol) ble oppløst i 300 ml tørr THF og avkjølt til -5°C. En oppløsning av dicykloheksylkarbodiimid (26,98 g, 0,13 mol) i 100 ml tørr THF ble tilsatt i løpet av 15 minutter. Reaksjonsblandingen ble omrørt over natten og hensatt ved romtemperatur. Det utskilte faste stoff ble frafUtrert, og oppløsningsmidlet fordampet under redusert trykk til et hvitt, fast stoff. Dette ble utkrystallisert fra 250 ml absolutt etanol ved 4°C og man fikk 32 g (86 %) av et hvitt, fast stoff, smeltepunkt 121-123°C

Analyse: Beregnet: C, 50,35; H, 6,34; N, 9,79

Funnet: C, 50,23; H, 6,44; N, 9,67

TLC: RF = 0,81, CHCl3/MeOH 9/1

(silisiumdioksydgel, G, 250 pm)

p.m.r (S, CDC13); 1,45, S, 9H, B0C; 2,83, S, 4H, -OSu; 2,93, S, 3H, N-CH3; 4,27, S, 2H, -CH2-.

M.S.: M+ 286

B. BOC- sarkosvl- L- tvrosinamid ( BOC- SAR- TYR- NHo ^ L-tyrosinamid (2,17 g, 10 mmol) og trietylamin (1,01 g, 10 mmol) ble oppløst i 25 ml tørr metanol. BOC-sarkosin-hydroksysuccinimid (2,86 g, 10 mmol) ble tilsatt og blandingen ble omrørt over natten ved romtemperatur.

Flyktige forbindelser ble fjernet under redusert trykk, og resten delt mellom EtOAc (50 ml) og en NaCl-oppløsning [50 ml (25 ml H20 + 25 ml mettet NaCl)]. Fasene ble skilt, og den organiske fase vasket to ganger til med samme type NaCl-oppløsning og så tørket med magnesiumsulfat. Tørkemidlet ble fjernet ved filtrering og oppløsningsmidlet fordampet under redusert trykk. Resten ble kromatografert på 75 g, 2,5 cm vid kolonne av Silicar CC7 idet man brukte etylacetat som elueringsmiddel. Forbindelsen ble eluert ved omkring 390 ml. De neste 475 ml ble oppsamlet og fordampet til 1,55 (44 #) av et hvitt fast stoff.

Analyse: Beregnet: C, 58,11; H, 7,17; N, 11,96

Funnet: C, 57,96; H, 6,96; N, 11,45

TLC: (Silisiumdioksydgel GF) Rf = 0,46 CHCl3/Me0H 9/1

C. Sarkosvl- L- tvrosinamid. trifluoracetat ( TFA- SAR- TYR- NH2): BOC-sarkosyl-L-tyrosinamid (1,30 g, 3,7 mmol) ble oppløst i 15 ml trifluoreddiksyre ved 0°C. Oppløsningen ble rørt i 1 time ved 0°C og oppløsningsmidlet fjernet ved redusert trykk. Den resulterende olje ble behandlet med 50 ml vannfri eter og ga 1,27 g (94 %) av et hvitt faststoff.

p.m.r. (5, CD30D): 2,3, S, 3H, N-CH3; 3,00, d, 2E, -CH2-C-; 3,7, S, 2H, -N-CH2-C=0; 6,9; q, 4H, aromatis,

EKSEMPEL II

Fremstilling av fragment II: BOC-SAR-beta-benzyl-ASP (BOC-sarkosyl-beta-benzyl-L-asparaginsyre)

Trietylamin (2,02 g, 20 mmol) og beta-benzyl-L-asparaginsyre (2,23 g, 10 mmol) ble omrørt i 50 ml tørr THF. BOC-sarkosin-hydroksysuccinimidester (2,68 g, 10 mmol) ble tilsatt, og oppløsningen omrør ved romtemperatur over— natten. Faste stoffer ble frafUtrert, og oppløsningsmidlet fjernet under redusert trykk. Resten ble delt mellom 100 ml etylacetat og 100 ml 2 N saltsyre. Fasene ble skilt, og den organiske fase ble vasket med 2 x 100 ml vann, 1 x 100 ml mettet natrium-kloridoppløsning og så tørket over magnesiumsulfat. Sistnevnte ble frafUtrert, og oppløsningsmidlet ble fjernet under redusert trykk. Resten ble behandlet med heksan. Sistnevnte ble så avhellet, og resten tørket under redusert trykk til 2,64 g (67 %) av et hygroskopisk faststoff.

TLC: Rf = 0,73 + sporurenheter ved 0,48

CECl3/MeOH/EOAc 85/10/5

(Silisiumdiksydgel G, 250 pm)

p.m.r. (S, CE30D): 1,45, S, 9E, BOC; 2,82, S, 3E, N-CE3; 2,95, M, 2E, -CE2-C; 3,85, S, 2E, -N-CH2-C=0; 4,85, t, 1E,-CE-; 5,08, S, 2E, -CE2; 5,46, S, 2E, -NE + C02E; 7,3, S, 5E,

-9

[a]D17° = +13,3° (C = 1,032, MeOH)

EKSEMPEL III

Fremstilling av fragment III: BOC-sarkosyl-beta-benzyl-L-aspartyl-sarkosyl-L-tyros inamid (BOC-SAR-beta-Bzl-ASP-SAR-TYR-NE2)

BOC-sarkosyl-beta-benzyl-L-aspartinsyre (0,52 g, 1,3 mmol) og 1-hydroksybenzotriazolmonohydrat (0,18 g, 1,3 mmol) ble oppløst i 10 ml tørr DMF, og oppløsningen avkjølt til 0°C. Dicykloheksylkarbodiimid (0,27 g, 1,3 mmol) i 7,5 ml tørr DMF ble tilsatt, og oppløsningen ble omrørt i 1 time ved 0°C. Sarkosyl-L-tyrosinamid, trifluoracetat (0,50 g, 1,3 mmol) og diisopropyletylamin (0,17 g, 1,3 mmol) ble oppløst i 5 ml tørr DMF og umiddelbart tilsatt til den første oppløsningen. Reaksjonsblandingen ble omrørt over natten og hensatt ved romtemperatur. Det faste stoff ble f raf iltrerlr, og resten ble oppløst i 25 ml etylacetat. Den organiske fasen ble vasket først med 2 x 25 ml 10 # sitronsyre, 2 x 25 ml vann, 2 x 25 ml 5 % NaHC03, 2 x 25 ml H20, 25 ml mettet natriumkloridopp-løsning og så tørket over vannfritt magnesiumsulfat. Tørkemidlet ble frafUtrert og oppløsningsmidlet fjernet under redusert trykk, hvilket ga 0,6 g (73,5 %) av et hvitt faststoff.

TLC: Rf = 0,31

CECl2/Me0H 9/1

(Silisiumdioksydgel G, 250 pm)

p.m.r. (S, CDC13): 1,45, S, 9H, BOC; 2,95, m, 10H, 2x, N-CH3,

-CH2-CH (Asp), -CB2-CH (Tyr); 3,8, m, 4E, 2x, N-CH2-C=0; 4,6, m, 2H, -CH-CH2-, Asp, -CH-CH2- (Tyr); 5,1, m, 2H, -CH2-cp; 6,92, q, 4E, tyrosinaromatisk; 7,25, S, 5H, aromatisk benzyl [a]D21° - 12,4° (C = 0,1046, MeOH)

Analyse: Beregnet for C31H41N50g: C, 59,32, H, 6,58, N, 11,16

Funnet: C, 58,73; H, 6,80; N, 10,76

EKSEMPEL IV

Fremstilling av fragment IIIA: Sarkosyl-beta-benzyl-L-aspartyl-sarkosyl-L-tyrosinamid, trifluoracetat (TFA-SAR-beta-Bzl-ASP-SAR-TYR-NE2)

BOC -sarko syl-be ta-benzyl-L-aspar ty 1-sarkosyl-L-tyrosinamid (0,48 g, 0,76 mmol) ble oppløst i 10 ml TFA ved 0° C og omrørt i 1 time. Oppløsningsmidlet ble fjernet under redusert trykk, og resten behandlet over natten med 50 ml vannfri eter. Suspensjonen ble filtrert, og det faste stoff vasket med eter og tørket under vakuum til 0,4 g (82 5é) av et hvitt faststoff.

TLC: Rf = 0,56

n-BUOH/HOAc/H20

(Silisiumdioksydgel GF)

EKSEMPEL V

Fremstilling av pentapeptid

A. Alfa-fenyImetoksykarbonyl-L-arginyl(HC1 )-sarkosyl-beta-benzyl-L-aspartyl-sarkosyl-L-tyrosinamid

[CBZ-ARG(CE1)-SAR-beta-Bzl-ASP-SAR-TYR-NH2]

Alfa-fenylmetoksykarbonyl-L-arginin HC1 (2,66 g, 7,8 mmol) og 1-hydroksybenzotriazolmonohydrat (lk06 g, 7,8 mmol) ble opplsøt i 20 ml tørr dimetylformamaid og avkjølt til 0°C. Dicykloheksylkarbodiimid (1,61 g, 7,8 mmol) ble oppløst i 5 ml eter og tilsatt den første oppløsningen. Reaksjonsblandingen ble omrørt 1 time ved 0°C. TFA-saltet av sarkosyl-beta-benzyl-L-aspartyl-sarkosyl-L-tyrosinamid (5,0 g, 7,8 mmol) ble oppløst i 15 ml tørr DMF med trietylamin (0,79 g, 7,8 mmol) og tilsatt den første oppløsningen. Reaksjonsblandingen ble omrørt over natten og hensatt ved romtemperatur. Det faste stoff ble frafUtrert, og de flyktige forbindelser fjernet under redusert trykk. Resten ble behandlet med vann og dette ga 3 g av en rest.

TLC: Rf = 0,60

n-BU0E/H0Ac/H20 3/1/1

(Silisiumdioksydgel GF)

B. L-arginyl-sarkosyl-L-aspratyl-sarkosyl-L-tyrosinamid

(ARG-SAR-ASP-SAR-TYR-NE2)

Al f a-f eny Ime t oksykarbonyl-L-asginyl (EC1 )-sarkosyl-beta-benzyl-L-aspartyl-sarkosyl-L-tyrosinamid (1,0 g) ble oppløst i 100 ml 75 1o vandig eddiksyre og redusert med 0,5 g 10 % Pd/C ved et trykk på 3,5 kg/cm<z> i 15 timer. Ka-talysatoren ble frafiltrert, og oppløsningen lyofilisert til et produkt på 0,8 g. Dette ble oppløst i 7 ml vann, filtrert gjennom et 3 p multiporefilter, justert til pH 5 med NH4OH (konsentrert) og kromatografert på en SP-C-25-kolonne (2,5 x 100 cm) med 0,20 M NH4OAX, pH 5,0, 100 ml/time, 20 ml/rør. Rørene 71 til 78 ble kombinert og lyofilisert til 0,35 g av ARG-SAR-ASP-SAR-TYR-NHg.

TLC: Rf = 0,23

n-Bu0H/H0Ac/H20 3/1/1

(Silisiumdioksydgel GF)

[a]D21° = +54,9 (C = 0,091, 0,1 N HOAc)

EKSEMPEL VI

Ved å bruke de fremgangsmåter som er beskrevet i eksemplene I-V, men ved å bruke ekvivalente mengder av egnede utgangs-forbindelser ble følgende fremstilt: BOC-epsilon-CBz-LYS-beta-benzyl-ASP-OH

BOC-epsilon-CBz-LYS-gamma-benzyl-GLU-OH

BOC-SAR-gamma-benzyl-GLU-OH

BOC-epsilon-CBZ-LYS-beta-benzyl-ASP-VAL-TYR-OE-benzylester BOC-epsilon-CBZ-LYS-gamma-benzyl-GLU-VAL-TYR-OH-benzylester BOC-SAR-gamma-benzyl-GLU-SAR-TYR-NH2

EKSEMPEL VII

Fremstilling av fragment IVA: H-beta-benzyl-ASP-VAL-TYR-benzylester, trifluoracetat (beta-benzyl-L-aspartyl-L-valyl-L-tyrosin-benzylester, trifluoracetat)

BOC-beta-benzyl-L-aspartaginsyre og en molar ekvivalent mengde av 1-hydroksybenzotriazolmonohydrat ble oppløst i tørr

DMF og oppløsningen avkjølt til 0°C. Deretter—tilsatte man en molar ekvivalent mengde av dicykloheksylkarbodiimid, og det hele ble omrørt 1 time ved 0"C. Reaksjonsblandingen ble så tilsatt til en oppløsning i DMF av en molar ekvivalent mengde av trietylamin og L-valyl-L-tyrosin-benzylester, trifluoracetat (fremstilt ved å bruke fremgangsmåtene fra eksempel I, men å bruke en ekvivalent mengde av L-valin i steden for det der nevnte sarkosin), og det hele ble omrørt over natten ved romtemperatur. Produktet ble isolert fra reaksjonsblandingen etter at reaksjonen var ferdig, og BOC-gruppen ble fjernet hvorved man fikk det ønskede produkt.

EKSEMPEL VIII

Fremstilling av fragment III (alternativt): BOC-epsilon-CBZ-LYS-beta-benzyl-ASP-VAL-TYR-benzylester' (BOC-epsilon-CBZ-L-lysyl-beta-benzyl-L-aspartyl-L-valyl-L-tyrosin-benzylester)

BOC-epsilon-CBZ-L-lysin-hydroksysuccinimid ble tilsatt en oppløsning av molare ekvivalenter av trietylamin og beta-benzy1-L-aspartyl-L-valyl-L-tyrosin-benzylester-trif luor-acetat i tørr THF, og det hele ble omrørt over natten. Etter at faste stoffer var fjernet, ble produktet isolert fra oppløsningen.

EKSEMPEL IX

Fremstilling av fragment V: tri-CBZ-ARG-epsilon-CBZ-LYS-OH

(tri-CBZ-L-arginin-epsilon-CBL-L-lysin)

En suspensjon av tri-CBZ-L-arginin-para-nitrofenylester (1,40 g, 2 mmol) i 3 ml THF ble tilsatt epsilon-CBZ-L-lysin (625 mg, 2,2 mmol). Deretter tilsatte man trietylamin (400 mg, 4,4 mmol) og det hele ble omrørt i 48 timer ved romtemperatur. Deretter ble oppløsningsmidlet fjernet under redusert trykk, og 20 ml metanol ble tilsatt resten. Metanolen ble fjernet, og det faste stoff ble vasket med ytterligere- 10 ml metanol. Det samlede filtrat og vaskeoppløsning ble fordampet under redusert trykk til en olje, og denne ble kromatografert på en 10 ml silisiumdioksydgelkolonne idet man brukte 0-5 H metanol/kloroform som elueringsmiddel. Den annen forbindelse som kom ut av kolonnen var det ønskede produkt, slik dette kunne påvises ved p.m.r.; utbytte 75 mg.

Analyse: Beregnet for C^Eso^O-j^ • 2/3 CEC13:

C, 58,41; H, 5,56; N, 9,15 Funnet: C, 58,88; E, 5,50; N, 9,29

EKSEMPEL X

Fremstilling av pentapeptid (annet alternativ)

Molare ekvivalenter av tri-CBZ-L-arginyl-epsllon-CBZ-L-lysin og 1-hydroksybenzotriazol ble oppløst i tørr DMF hvoretter man tilsatte en molar ekvivalent av dicykloheksylkarbodiimid. Oppløsningen ble tilsatt en oppløsning av molare ekvivalenter av beta-benzyl-L-aspartyl-L-valyl-L-tyrosin-benzylester-trifluoracetat og trietylamin i DMF, og hele blandingen ble omrørt over natten. Produktet ble isolert fra reaksjonsblandingen etter fjerning av faste residua, hvoretter de beksyttede grupper ble fjernet, hvilket ga E-ARG-LYS-ASP-VAL-TYR-OH.

Claims

1. Dipeptid, karakterisert ved formelen: hvor R' er NH2 og Y er SAR.

2. Beskyttet dipeptid, karakterisert ved formelen: hvor X er SAR eller epsilon-T"-LYS; Z er ASP eller GLU; og T og T" er hver valgt fra gruppen bestående av: a) hvor Ri er benzyl, benzyl hvor fenylringen er substituert med fra 1 til 3 grupper valgt fra laverealky og t-butyl; og b) hvor R2 er laverealkyl med 2-4 karbonatomer; og U er benzyl.

3. Beskyttet tetrapeptid, karakterisert ved formelen: hvor R' er OU eller NH2; U er benzyl; R]^ er NH2; X er epsilon-T"-LYS og Y er VAL eller X og Y er begge SAR; Z er ASP; og T og T" er hver en gruppe valgt fra gruppen bestående av de som er definert i krav 2.

4 . Tetrapeptid, karakterisert ved formelen: hvor R' er OU eller NH2; U er benzyl; X er epsilon-T"-LYS og Y er VAL eller X og Y er begge SAR; Z er ASP; og T" er en gruppe valgt fra gruppen bestående av de som er definert i a)-b) i krav 2.

5 . Beskyttet pentapeptid, karakterisert ved formelen: hvor R' er OH eller NH2; U er H eller benzyl; X er epsilon-T"-LYS og Y er VAL eller X og Y er begge SAR; Z er ASP; og T og T" er hver H eller en gruppe valgt fra gruppen bestående av de som er definert i a)-b) i krav 2.

6. Beskyttet tripeptid, karakterisert ved formelen: hvor Z er ASP; Y er VAL; R' er OU; U er benzyl hvor fenylringen er substituert med en laverealkyl; og T er valgt fra gruppen bestående av de som er definert i a)-b) i krav 2.

7 . Dipeptid, karakterisert ved formelen: hvor X er SAR eller epsilon-T"-LYS; T og T" er hver valgt fra gruppen bestående av de som er definert i a)-b) ovenfor; T' er valgt fra gruppen bestående av og andre benyttede symboler har de samme betydninger som angitt i krav 2.