DE1518300B1

DE1518300B1 - Ein neues Hendekapeptid,seine pharmazeutisch verwendbaren Salze und ein Verfahren zu seiner Herstellung

Info

Publication number: DE1518300B1
Application number: DE1965S0095357
Authority: DE
Inventors: Luigi Bernardi; Germano Bosisio; Castiglione Roberto De; Onofrio Goffredo
Original assignee: Farmaceutici Italia SpA
Current assignee: Pfizer Italia SRL
Priority date: 1964-02-12
Filing date: 1965-02-08
Publication date: 1972-02-03
Also published as: CH464949A; FR1453820A; GB1050865A; AT262519B; BE659559A; FR4219M; SE319776B; NL6501206A; US3374218A; BR6566980D0; DK115264B

Description

mit einer Schutzgruppe blockiert sind, wie z. B. mit der Carbobenzoxygruppe, wird mit Glycin-äthylesterhydrochlorid kondensiert. Die besagte Kondensation wird in Gegenwart eines Kondensationsmittels, wie Dicyclohexylcarbodiimid, ausgeführt, wobei das geschützte Dipeptid Di-carbobenzoxy-L-tyrosyl-glycinäthylester (I) erhalten wird, dessen Carbobenzoxygruppen dann durch Behandlung mit wasserfreiem Bromwasserstoff in Eisessig abgespaltet werden. Das so er-Pentapeptid L-Alanyl-(j3-t.butyl)-L-aspartyl-L-proIyl-L-asparaginyl-(N^c-carbo-t.butoxy)-L-lysin entsteht, das mit einem geschützten Derivat der Pyroglutaminsäure, z. B. Carbo-t.butoxy-L-pyroglutaminsäure-p-nitro-phenylester, umgesetzt wird, wodurch das geschützte Hexapeptid Carbo-t.butoxy-L-pyroglutamyl-L-alanyl-(,S-t.buty^-L-aspartyl-L-prolyl-L-asparaginyl-CN^carbo-t.butoxy)-L-lysin (X) erhalten wird. Die Endkondensation zwischen dem Pentapeptid (V)

haltene Dipeptid L-Tyrosyl-glycin-äthyl-ester wird mit io und dem geschützten Hexapeptid (X) führt zu dem geeinem geschützten Derivat des Phenylalanine, wie z. B. schützten Hendekapeptid Carbo-t.butoxy-L-pyroglut-

Carbo-t-butoxy-L-phenylalanin, kondensiert, wobei ein geschütztes Derivat des L-Phenylalanyl-L-tyrosylglycin, wiez. B. Carbo-tbutoxy-L-phenylalanyl-L-tyrosyl-glycin-äthyl-ester (II), erhalten wird, dessen Estergruppe dann selektiv mit einem Alkali, wie verdünntem Natrium- oder Kaliumhydroxyd, zur freien Carboxylgruppe verseift wird.

Das so erhaltene Produkt, d. h. das Carbo-t-butoxyamyl-L-alanyI-(/3-t.butyl)-L-aspartyl-L-prolyl-L-asparaginyl-(N^E-carbo-t.butoxy)-L-lysyl-L-phenylalanyl-L-tyrosyl-glycyl-L-leucyl-L-methioninamid(XI), aus dem dann durch Abspaltung der Schutzgruppen das Hendekapeptid L-Pyroglutamyl-L-alanyl-L-aspartyl-L-prolyl-L-asparaginyl-L-lysyl-L-phenyl-alanyl-L-tyrosylglycyl-L-leucyl-L-methioninamid (XII) in Form des Salzes entsprechend der zur Abspaltung der Schutz-

L-phenylalanyl-L-tyrosyl-glycin (III), wird mit dem Di- ao gruppen verwendeten Halogenwasserstoff säure erhal-

peptid L-Leucyl-L-methioninamid kondensiert, wobei ein geschütztes Derivat des L-Phenylalanyl-L-tyrosylglycyl-L-leucyl-L-methioninamids, wie z. B. das Carbotbutoxy - L - phenylalanyl - l - tyrosyl - glycyl - l - leucyl-L-methioninamid (IV), erhalten wird, aus dem durch Abspaltung der Schutzgruppe durch wasserfreie Halogenwasserstoffsäuren in Eisessig, das erste Zwischenprodukt des erfindungsgemäßen Verfahrens, d. h. das Pentapeptid L-Phenylalanyl-L-tyrosyl-glycyl-L-leucyl-L-methioninamid (V) erhalten wird.

Das neue Hexapeptid L-Pyroglutamyl-L-alanyl-L-aspartyl-L-prolyl-L-asparaginyl-L-lysin kann auf folgende Weise hergestellt werden:

ten wird.

Wenn man an Stelle der obenerwähnten Schutzgruppen andere vorher angeführte verwendet, erzielt man die gleichen Resultate.

Die verfahrensgemäß hergestellten Verbindungen können in der Therapie von hypertensiven Anfällen oder jedenfalls zur schnellen Behandlung von schweren Anfällen infolge Hypertension, bei krampfartigen Gefäßsyndromen besonders im Oberflächenmuskelbereich (Bürgersche Krankheit, Raynaudsche Krankheit, Ulcera torpida usw.), der Netzhautgefäße (spastische Blindheit durch zentrale Spasmen der Netzhaut), der Hirnhautgefäße (spastische Kopfschmerzen und Migräne) und der Coronargefäße (Anginapectoris-An-

Ein geschütztes Derivat der Asparaginsäure, z. B. die

N-Carbobenzoxy-L-asparaginsäure-a-p-nitrophenyl- 35 fälle) angewendet werden,

ß-t.butyl-ester (VI), wird mit L-Prolin kondensiert, wo- Das neue Hendekapeptid kann subkutan, intra-

bei das geschützte Derivat N-Carbobenzoxy-(/?-t.bu- muskulär, intravenös (Injektion oder Infusion) oder

tyl)-L-aspartyl-L-prolin (VII) erhalten wird, das mit intraarteriell verabreicht werden,

dem geschützten Derivat des Dipeptids L-Asparaginyl- Die geeignetsten Lösungsmittel sind Wasser oder

(N^£-carbo-t.butoxy)-L-lysin-methylester kondensiert 40 physiologische, nicht alkalische Salzlösungen. Bei

wird. Somit wird das geschützte Tetrapeptid N-Carbo- subkutaner oder intramuskulärer Verabreichung kön-

benzoxy-(jS-tbutyl)-L-aspartyl-L-prolyl-L-aspara-ginyl nen den Lösungen absorptionsverzögernde Substanzen

(N^£-carbo-t.butoxy)-L-Iysin-methylester (VIII) erhal- beigemischt werden.

ten, aus dem durch Wasserstoff in Gegenwart eines Der Prozentgehalt an aktiven Bestandteilen kann

Palladiumkatalysators,der((S-t.Butyl)-L-aspartyl-L-pro- 45 sich nach den besonderen pharmazeutischen Formen

lyl-L-asparaginyl-(N^e-carbo-t.butoxy)-L-lysin-methyl- und nach der gewünschten hypotensiven Wirkung än-

ester gewonnen wird. Dieser wird mit einem geschützten Derivat des Alanins, z. B. Carbobenzoxy-L-alanin-p-nitrophenylester umgesetzt, wobei das geschützte Derivat des L-Alanyl-L-aspartyl-L-prolyl-L-asparaginyl-L-lysins, z. B. der Carbobenzoxy-L-alanyl -{ß- t.butyl) -L- aspartyl - l -prolyl - l - asparaginyl-(N⁹-carbo-t.butoxy)-L-lysin-methylester (IX), erhalten wird. Die Methylestergruppe des Pentapeptids IX wird dem, doch ist er gewöhnlich sehr niedrig.

Akute oder chronische Toxizität sind bei der Verabreichung von den besagten Verbindungen nicht bemerkt worden.

Das folgende Beispiel soll die Erfindung erläutern.

In der folgenden Tabelle sind einige Ergebnisse der Vergleichsversuche zwischen dem beanspruchten Hendekapeptid und Bradykinin aufgefüllt, aus denen die

dann selektiv zur freien Carboxylgruppe mit einem 55 überlegenen Eigenschaften des neuen Hendekapeptids

Alkali, wie verdünntem Natrium- oder Kaliumhydro- ersichtlich sind. Die Versuche sind beim anästhetisier-

xyd, verseift. Die Carbobenzoxygruppe des Pentapep- ten Hund durchgeführt und die Intraarteriell verab-

tids wird dann durch Wasserstoff in Gegenwart eines reichten Dosen in g/kg Köpergewicht ausgedrückt wor-

Palladiumkatalysators abgespaltet, wobei das saure den.

Vergleichbare Wirkung von gefäßerweiternden Arzneimitteln auf die periphere Durchblutung

Kontrolle beanspruchtes Hendekapeptid, g/kg
10-¹⁴ I ΙΟ"¹³ I ΙΟ"¹² 1 10-¹

Bradykinin, g/kg 10-¹² 10"^u ! 10-¹⁰

Durchblutung (Muskelfluß),
ml/Min

Prozentuelle Veränderung

50

71

+ 42 92,5

+ 113
+ 126

135
+ 170

58

+ 16

73 + 46

Die chromatographischen Analysen, die in den Beispielen angeführt werden, wurden mit aufsteigendem Verfahren auf Whatmanpapier Nr. 1 mit dem Lösungsmittelsystemn-Butanol/Essigsäure/Wasser (4:1:1) ausgeführt. Die analytische Angabe wird als Rf-Wert ausgedrückt. In den Beispielen werden außerdem die elektrophoretischen Wanderungskoeffizienten, die mit den in der Literatur bekannten Symbolen ausgedrückt sind, aufgeführt. Zum Beispiel zeigt die Angabe E₁₅₉ = 0,905 Leu, daß das geprüfte Polypeptid bei pH 1,9 mit einer Geschwindigkeit, die 0,905mal jener des gleich 1 festgesetzten Leucins ist, wandert.

II wird mit Äthyläther extrahiert. Die Lösung wird bis zu pH = 1 mit verdünnter Salzsäure angesäuert und mit Äthylazetat extrahiert. Die Äthylazetat-Auszüge werden im Vakuum zur Trockene eingedampft und der Rückstand aus Azeton—Petroläther umkristallisiert, wobei 3,9 g Carbo-t.butoxy-L-phenylalanyl-L-tyrosylglycin (III) erhalten werden, das bei 144 bis 146⁰C schmilzt; j>]i⁰ = -14,3° (c = 0,5 in Dimethylformamid).

ίο Eine Lösung von 3,4 g Tripeptid III und 2,07 g L-Leucyl-L-methioninamid-hydrochlorid (in der belgischen Patentschrift 648 011 beschrieben) in 15 ml Dimethylformamid wird bei —10°C mit 0,7 g Triäthylamin und 1,44 g Dicyclohexylcarbodiimid versetzt. Das Reaktionsgemisch wird 2 Stunden bei —10°C, dann über Nacht bei 9°C und 2 Tage bei Raumtemperatur sich selbst überlassen und hierauf filtriert. Das Filtrat wird im Vakuum zur Trockene konzentriert, der Rückstand in 250 ml Wasser aufgenommen, filtriert, mit Wasser gewaschen und getrocknet. Schließlich wird der Rückstand in 150 ml kochendem Aceton aufgeschlämmt und in der Wärme filtriert, wobei 4,0 g Carbo-Lbutoxy-L-phenylalanyl-L-tyrosyl-glycyl-L-leucyl-L-methioninamid (VI) gewon-

Bei spiel

Carbo-t.butoxy-L-pyroglutamyl-L-alanyl-(jS-t.butyl)-L-aspartyl-L-prolyl-L-asparaginyl-(N^£-carbo-t.butoxy)-L-lysyl-L-phenylalanyl-L-tyrosyl-glycyl-L-leucyl-L-rnethioninmaid (XI)

Herstellung des ersten Zwischenproduktes

L-Phenylalanyl-L-tyrosyl-glycyl-L-leucyl-L-me-

thioninamids (V)

Zu einer Lösung von 9 g Di-carbobenzoxy-L-tyrosin in 70 ml Methylenchlorid werden bei O⁰C 2,8 g Glycin-

äthyl-esterhydrochlorid, 2,02 gTriäthylamin und4,12g «5 nen werden, das bei 229 bis 230⁰C schmilzt; Dicyclohexylcarbodümid zugefügt. Das Gemisch wird = —22,3° (c = 0,5 in Dimethylformamid), bei Raumtemperatur über Nacht sich selbst überlassen, Ig Pentapeptid IV wird in 20 ml einer 4,4%igen

worauf es filtriert wird. Das Filtrat wird dann in einem wasserfreien Chlorwasserstofflösung in Eisessig gelöst, Scheidetrichter mit einer 5°/₀igen Zitronensäurelösung 1 Stunde bei Raumtemperatur sich selbst überlassen und hierauf mit einer 5%igen Natriumbikarbonat- 3o und hierauf im Vakuum zur Trockene eingedampft, lösung gewaschen. Die Dichlormethanschnicht wird Der Rückstand wird danach in einer kleinen Menge Diüber wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und zur
Trockene eingedampft. Durch Umkristallisieren des
Rückstandes aus Äthanol werden 8,5 g Di-carbobenzoxy-L-tyrosyl-glycin-äthyl-ester (I) erhalten, der bei 35
165 bis 166°C schmilzt; [<x]f = -24,5⁰C (c = 0,5 in
Dimethylformamid).

8,7 g des Produktes I werden in 50 ml einer 32°/_oigen wasserfreien Bromwasserstofflösung in Eisessig gelöst. Das Reaktionsgemisch wird 2 Stunden bei Raumtem-

methylformamid gelöst und mit Äther verdünnt. 0,88 g L-Phenylalanyl-L-tyrosyl-glycyl-L-leucyl-L-methioninamid-hydrochlorid (V) werden erhalten, das bei 120 bis 122° C (Zersetzung) schmilzt; [<x]l° = -11,2° (c = 0,5 in CH₃COOH).

peratur sich selbst überlassen und hierauf in Vakuum zur Trockene eingedampft. Der Rückstand wird mit wasserfreiem Äthyläther behandelt und dann in 70 ml Dimethylformamid (Lösung A) gelöst. Dann wird

Herstellung des zweiten Zwischenproduktes

Carbo-t.butoxy-L-pyroglutamyl-L-alanyl-(|8-t.butyl)-L-aspartyl-L-proIyl-L-asparaginyI-(N^e-carbo-t.bu-

toxy)-L-Iysin (X)

Zu einer auf 0⁰C abgekühlten Lösung von 18,2 g Carbobenzoxy - l - asparaginsäure -ß - t.butyl - ester (von die folgende Lösung (Lösung B) hergestellt: 4,3 g 45 R. S c h w y ζ e r, HeIv. Chim. Acta, 44,1961, S. 2003, Carbo-t.butoxy-L-phenylalanin werden in 40 ml was- beschrieben) in 300 ml Äthylazetat werden 9,26 g serfreiem Tetrahydrofuran gelöst, worauf dann bei p-Nitrophenol und 1,14 g Dicyclohexylcarbodiimid -1O⁰C 3,03 g Tributylamin und 1,78 g Chlorameisen- zugefügt. Die Lösung wird 1 Stunde bei 0⁰C und über säureäthylester zugetropft werden und die Lösung Nacfit bei Raumtemperatur sich selbst überlassen und 30 min stehengelassen wird. Die beiden Lösungen wer- 5° hierauf filtriert. Das Filtrat wird mit weiterem Äthylazetat verdünnt, mehrmals mit 5%igem Natriumkarbonat gewaschen und im Vakuum zur Trockene eingedampft. Der Rückstand wird aus Äthyläther umkristallisiert, wobei 17 g Carbobenzoxy-asparaginsäure-«-p-nitrophenyl-/?-t.butylester (VI) erhalten werden, der bei 84 bis 86°C schmilzt; [«]!? = +3,5° (c = 3 in CHCI₃).

Zu einer Suspension von 2.19 g L-Prolin in 300 ml Chloroform und 1,9 g Triäthylamin werden 8,5 g der geschützten Aminosäure VI zugefügt. Die Lösung wird unter Rühren 2 Tage bei 35° C gehalten, dann im Vakuum zur Trockene eingedampft, der Rückstand mit 200 ml wässerigem Natriumbicarbonat aufgenommen und die wässerige alkalische Lösung mit Äthyl-Natronlauge versetzt und 20 Minuten sich selbst über- 65 äther gewaschen. Die wässerige alkalische Lösung wird lassen. Hierauf wird sie mit 50 ml Wasser bis zu pH- auf —10⁰C abgekühlt, mit Salzsäure bis zu pH = 1

den auf —10°C abgekühlt, und die Lösung A wird zu der Lösung B zugefügt. Schließlich wird das Reaktionsgemisch mit 1,66 g Triäthylamin versetzt und zuerst 2 Stunden bei —10°C, dann 2 Stunden bei O⁰C und zuletzt über Nacht bei Raumtemperatur sich selbst überlassen. Das Reaktionsgemisch wird im Vakuum zur Trockene eingedampft, der Rückstand wird mit Wasser gewaschen und aus Methylenchlorid—Petroläther umkristallisiert, wobei 7,8 g Carbo-tbutoxy-L-phenylalanyl-L-tyrosyl-glycin-äthyl-ester (II) erhalten werden, der bei 190 bis 191°C schmilzt; [«]f = -16° (c = 0,7 in Dimethylformamid).

Eine__ Lösung von 5 g geschütztem Tripeptid II in 25 ml Äthanol wird bei Raumtemperatur mit 25 ml in

Wert von 6 verdünnt, mit verdünnter Salzsäure angesäuert, und ein Teil des nicht reagierten Tripeptids

angesäuert und mit Methylenchlorid extrahiert. Die Auszüge werden im Vakuum zur Trockene eingedampft,

7 8

der aus rohem Carbobenzoxy-(jS-t.butyl)-L-as]Dartyl- 50 ml Äthanol wird mit 25 ml Natronlauge und mit

L-proIin bestehende Rückstand wird in 30 ml Äthyl- 10 ml Wasser versetzt. Das Reaktionsgemisch wird

äther gelöst, mit 3,3 g Dicyclohexylamin versetzt und 1 Stunde bei Raumtemperatur sich selbst überlassen,

eine Nacht bei Raumtemperatur sich selbst überlassen. worauf dann 2 ml 5°/_oige Natriumbicarbonatlösung zu-Es werden so 9,6 g Carbobenzoxy-(jS-t.butyl)-L-aspar- 5 gefügt werden. Die Mischung wird dann mit 180 ml

tyl-L-prolin-dicyclohexyl-ammoniumsalz erhalten, das Wasser verdünnt und 2mal mit Äthylacetat ausge-

bei 132 bis 133⁰C schmilzt; [«]?? = -30° (c = 0,5 in schüttelt. Danach wird sie auf -10⁰C abgekühlt, mit

Dimethylformamid). ln-Salzsäure bis zum Kongorot-Farbumschlag ange-

Das Produkt wird in 250 ml Wasser und Eis ange- säuert und mit Äthylacetat extrahiert. Durch Verschlämmt und mit 1,31 g phosphoriger Säure versetzt. io dampfen des Äthylacetats werden 1,6 g Carboben-Dann wird es mit Dichlormethan extrahiert und im zoxy-L-alanyl-(/?-t.butyl)-L-aspartyl-L-prolyl-L-aspara-Vakuum zur Trockene eingedampft, wobei man 7,2 g ginyl-(N^£-carbo-t.butoxy)-L-lysin als amorphes Pro-Carbobenzoxy-(/3-t.butyl)-L-aspartyl-L-prolin (VII) als dukt erhalten: E₅,₈ = 0,27 GIu.
ölige Substanz erhält. Dieser Schaum wird in 120 ml Äthanol und 120 ml

2,54 g Carbobenzoxy-L-asparaginyl-(N*-carbo-t.bu- 15 Tetrahydrofuran gelöst und in Gegenwart von 1 g toxy)-L-lysin-methyl-ester (von S a η d r i n, HeIv. 10°/₀igem Palladium auf Kohle hydriert. Wenn die Chim. Acta, 46, 1963, S. 1637, beschrieben) werdenin Entwicklung von CO₂ beendet ist, wird die Lösung 150 ml Äthanol und 150 ml Tetrahydrofuran gelöst filtriert und im Vakuum zur Trockene konzentriert: und in Gegenwart von 1,5 g 10%igem Palladium auf der Rückstand wird in 12 ml Dimethylformamid geKohle hydriert. 20 löst, worauf 0,7 g p-Nitrophenyl-carbo-t.butoxy-L-py-

Wenn die Entwicklung des Kohlendioxyds beendet roglutamate (wie im nachstehenden hergestellt) und ist, wird das Reaktionsgemisch bei niedriger Tempera- 0,25 g Triäthylamin zugefügt werden. Das Reaktionstur im Vakuum zur Trockene eingedampft und der gemisch wird bei 35° C sich selbst überlassen und im Rückstand in 20 ml Tetrahydrofuran gelöst. Zu dieser Vakuum zur Trockene eingedampft. Der Rückstand auf —10⁰C abgekühlten Lösung wird eine Lösung zu- 25 wird mit wässerig verdünntem Natriumbicarbonat aufgefügt, die wie folgt erhalten wurde: genommen und mit Äthylacetat 2mal ausgeschüttelt.

2,1 g geschütztes Dipeptid VII werden in 25 ml Te- Der pH-Wert der alkalischen Lösung wird bei -1O⁰C

trahydrofuran und 0,7 ml Triäthylamin gelöst. Der auf mit ln-Salzsäure auf 5,5 eingestellt. Die Lösung wird

-1O⁰C abgekühlten Lösung werden 0,5 ml Chlor- nun mit Äthyläther ausgeschüttelt, hierauf bis zu

ameisensäureäthylester zugefügt, und die Mischung 30 pH = 1 angesäuert und mit Äthylacetat erschöpfend

wird 30 Minuten bei — 10⁰C sich selbst überlassen. extrahiert, wobei das Carbo-t.butoxy-L-pyroglutamyl-

Nach Vereinigung der zwei Lösungen wird die Tempe- L-alanyl-(/?-t.butyl)-L-aspartyl-L-prolyl-L-asparaginyl-

ratur 2 Stunden bei —10°C gehalten, worauf die Lö- (N"-carbo-t.butoxy)-L-lysin (X) erhalten wird, das bei

sung über Nacht bei Raumtemperatur stehengelassen 143 bis 148° (Zersetzung) schmilzt; [tx]² _D° — — 67°

wird. Dann wird sie im Vakuum zur Trockene einge- 35 (^c = 0,5 in Äthanol); E₅,₈ = 0,20 GIu.

dampft, mit Äthylacetat aufgenommen und in einem Das Carbo-tbutoxy-pyroglutaminsäure-p-nitrophe-

Scheidetrichter mit einer Natriumchlorid- und ver- nyl-ester wird folgendermaßen hergestellt: zu einer

dünnten Salzsäurelösung bei -5⁰C und schließlich mit Suspension von 14 g Glutaminsäure in 200 ml Dime-

einer 5%igen Bicarbonatlösung und Wasser gewaschen thylformamid werden 23,9 g Terbutyl-p-nitrophenyl-

und dann im Vakuum zur Trockene eingedampft. Der 40 carbonat und 40 ml Triäthylamin zugefügt. Die Lösung

Rückstand wird aus Äthylacetat—Petroläther umkri- wird 3 Tage bei 37⁰C unter Rühren gehalten, dann im

stallisiert, wobei man 2,5 g Carbobenzoxy-(/3-t.butyl)- Vakuum zur Trockene eingedampft, und der Rückstand

L-aspartyl-L-prolyl-L-asparaginyl-(N^e-carbo-t.butoxy)- wird mit 5°/_oigem Natriumbicarbonat wieder auf genom-

L-lysin-methyl-ester (VIII) erhält, der bei 105 bis men.

107⁰C schmilzt; [α]?? = —40° (c = 0,3 in Dimethyl- 45 Die Lösung wird auf einem pH-Wert von 5,3 einge-

formamid). stellt und 2mal mit Äthyläther extrahiert, worauf sie

1,42 g geschütztes Tetrapeptid VIII werden in 100ml bei —10⁰C bis zu pH = 1 mit konzentrierter Salzsäure Äthanol gelöst und in Gegenwart von 2 g 10°/„igem angesäuert und dann mit Äthyläther extrahiert wird. Palladium auf Kohle hydriert. Wenn die Hydrierung Der Ätherauszug wird im Vakuum zur Trockene eingebeendet ist, wird filtriert und das Filtrat im Vakuum 50 dampft und der Rückstand in 170 ml Tetrahydrozur Trockene eingedampft. Der Rückstand wird mit furan gelöst; die resultierende Lösung wird bei 0⁰C 10 ml Dimethylformamid aufgenommen, worauf 0,46 g mit 15,1g Dicyclohexylcarbodiimid versetzt. Das Carbobenzoxy-L-alanin-p-nitrophenylester hinzugefügt Reaktionsgemisch wird über Nacht bei Raumtemperawerden. Die Reaktionsmischung wird 2 Tage bei Raum- tür sich selbst überlassen, dann filtriert und im Vakuum temperatur sich selbst überlassen, dann im Vakuum zur 55 zur Trockene eingedampft. Der Rückstand wird in Trockene eingedampft, der Rückstand wird in Äthyl- 130 ml Äthyläther aufgelöst und die Lösung mit acetat gelöst und bei—10° C mit verdünnten Lösungen 13,6 g Dicyclohexylamin versetzt. Ein reichlicher von Salzsäure und Natriumchlorid und schließlich mit Niederschlag von Carbo-t.butoxy-L-pyroglutamin-säu-Natriumbicarbonatlösung gewaschen. Die Lösung wird re-dicyclohexylammoniumsalz fällt aus: Ausbeute dann im Vakuum zur Trockene eingedampft und der 60 21,3 g; Fp. = 180 bis 181⁰C; [«]?? = —7° (c = 0,5 in Rückstand 3mal mit warmem Äthyläther gewaschen. Chloroform).

Der Rückstand wird in Äthylacetat gelöst: durch Zu- Zu einer Suspension von 5,3 g Carbo-t.butoxy-

satz von Äthyläther fällt eine gelatineartige Substanz L- pyroglutamsäure-dicyclohexyl- ammoniumsalz in

aus. Man erhält 0,9 g Carbobenzoxy-L-alanyl-(/5-t.bu- 150 ml Eiswasser werden 1,4 g phosphorige Säure zu-

tyl)-L-aspartyl-L-prolyl-L-asparaginyl-(N⁵-carbo-t.bu- 65 gefügt und lange mit 250 ml Äthyläther geschüttelt.

toyx)-L-lysin-methyl-ester (IX), der bei 103 bis 106⁰C Der Ätherauszug wird im Vakuum zur Trockene einge-

schmilzt; [oc]f = —59° (c = 1 in Äthanol). dampft und der Rückstand in 50 ml Äthylacetat auf-

Eine Lösung von 2,12 g geschütztes Pentapeptid IX gelöst.

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Die resultierende Lösung wird bei 0⁰C mit 2,1 g p-Nitrophenol und 2,55 g Dicyclohexylcarbodiimid versetzt. Sie wird über Nacht bei Raumtemperatur sich selbst überlassen, filtriert und das Filtrat im Vakuum zur Trockene eingedampft.

Durch Umkristallisieren des Rückstandes aus Äther erhältman2,5gp-Nitro-phenyl-carbo-t.butoxy-L-pyroglutamat, das bei 143 bis 145°C schmilzt; [«]o° = —26° (c = 0,5 in Äthanol).

IO

Endkondensation

Carbo-tbutoxy-L-pyroglutamyl-L-alanyl-OS-t.butyl)-L-aspartyl-L-prolyl-L-asparaginyl-

(N^f-carbo-t.butoxy)-L-Lysyl-L-phenylalanyl- ¹S L-tyroysl-glycyl-L-leucyl-L-methioninamid (XI)

Eine Lösung von 0,7 g des geschützten Hexapeptids X in und 0,83 g L-Phenylalanyl-L-tyrosyl-glycyl-L-leucyl-L-methioninamid-hydrochlorid 10 ml wasser- a° freiem Pyridin (V) wird mit 0,21 g Dicyclohexylcarbodiimid versetzt. Das Reaktionsgemisch wird 2 Tage bei Raumtemperatur sich selbst überlassen, dann im Vakuum zur Trockene eingedampft, und der Rückstand wird in 150 ml der unteren Schicht der separat herge- »5 stellten Mischung CHsOH/HaO/CClj/CHCIs (8:3:3:7) gelöst und mit 300 ml in Wasser verdünnt. Der ausgefallene, gelatinartige Niederschlag wird abgetrennt und in einer weiteren Menge der unteren Schicht obenerwähnter Mischung gelöst und bei —10°C mit einer gleichen Menge der oberen, mit 1 ml konzentrierter Salzsäure versetzten Schicht geschüttelt; die resultierende obere Schicht wird nun verworfen, und die untere Schicht wird mit einer gleichen Menge der oberen Schicht der besagten Mischung geschüttelt, zu der etwas Natriumbikarbonat zugesetzt wurde. Die Mischung wird im Vakuum zur Trockene eingedampft und durch Umkristallisieren aus Methanol/Tetrachlorkohlenstoff/Äther gereinigt.

Nach zwei Umkristallisierungen werden 0,4 g Carbo - t.butoxy - L - pyroglutamyl - L - alanyl - (ß - tbutyl) L-aspartyl-L-prolyl-L-asparaginyl-(N^e-carbo-t.butoxy)-L-lysyl-L-phenylalanyl-L-tyrosyl-glycyl-L-leucyl-L-me- thioninamid erhalten, das bei 155 bis 158°C (2er-Setzung) schmilzt; [«]!? = —59° (c = 0,3 in Äthanol). Wenn man das durch andere Schutzgruppen geschützte Hexapeptid verwendet und unter denselben experimentellen Bedingungen in bekannter Weise vorgeht, werden die entsprechenden geschützten Derivate des Hendekapeptids L-Pyroglutamyl-L-alanyl-L-aspartyl-L-prolyl-L-asparaginyl-L-lysyl-L-phenylalanyl-L-tyrosyl-glycyl-L-leucyl-L-methioninamid erhalten,

L-Pyroglutamyl-L-alanyl-L-aspartyl-L-proIyl-

L-asparaginyl-L-lysyl-L-phenylalanyl-L-tyrosyl-

glycyl-L-leucyl-L-methioninamid (XII)

0=1 g Hendekapeptid (XI) werden in 40 ml wasserfreier 4°/₀ Chlorwasserstoff enthaltender Trifluöressigsäure gelöst. Das Reaktionsgemisch wird 3 Stunden bei Raumtemperatur sich selbst überlassen, dann filtriert, im Vakuum zur Trockene eingedampft, und der Rückstand wird 3mal mit Äthyläther und dann lmal mit 15 ml Aceton zerrieben. Die abfiltrierte feste Substanz wird in 5 ml absolutem Äthanol gelöst. Die Lösung wird von einer kleinen Menge an pechartigem Rückstand abfiltriert und im Vakuum zur Trockene eingedampft.

Der Rückstand wird mit wenig Äther zerrieben und filtriert, wobei man 0,065 g L-Pyroglutamyl-L-alanyl-L-aspartyl-L-proIyl-L-asparagmyl-L-Iysyl-L-phenylalanyl-L-tyrosyl-glycyl-L-leucyl-L-methioninamid-trifluoracetat (XII) erhält ,das bei 180° C (Zersetzung) schmilzt; [a]f = —57° (c = 0,3 in Äthanol); E₁₎₉ = 0,43 Leu.

Bei Umsetzung obigen Produktes mit einer geeigneten Base in bekannter Weise wird das freie Hendekapeptid erhalten, das mit organischen oder anorganischen pharmazeutisch verträglichen Säuren in andere Salze übergeführt werden kann.

Falls die Aminogruppen des Pyroglutamyl- und Lysylrestes und die Carboxylgruppe des Aspartylrestes des Hendekapeptids mit anderen Schutzgruppen blockiert sind, können diese mit anderen aus der PoIypeptidchemie bekannten Abspaltungsmitteln, wie Wasserstoff, in Gegenwart von Palladium oder metallisches Natrium in flüssigem Ammoniak, abgespaltet werden.

Claims

1 2 Patentansprüche· Moleküls und der Carboxylgruppe eines anderen MoIe- ' küls, um die Peptidbindung zu erzielen, kann nach den

1. Das Hendekapeptid L-Pyroglutamyl-L-alanyl- üblichen in der Polypeptidchemie bekannten Methoden L-aspartyl-L-prolyl-L-asparaginyl-L-lysyl-L-phenyl- ausgeführt werden, z. B. über ein aktiviertes Acylderialanyl - l - tyrosylglycyl - L - leucyl - l - methioninamid 5 vat wie das Azid und den p-Nitrophenylester oder vor- und seine Salze mit einer organischen oder anorga- zugsweise durch direkte Kondensation der freien nischen pharmazeutisch verträglichen Säure. Amino- und der freien Carboxylgruppe in Gegenwart

2. Verfahren zur Herstellung des neuen Hende- geeigneter Kondensationsmittel aus der Gruppe der kapeptids L-Pyroglutamyl-L-alanyl-L-aspartyl- Carbodiimidderivate, wie Dicyclohexylcarbodiimid, L-prolyl-L-asparaginyl-L-lysyl-L-phenylalanyl- io l-cyclohexyl-S-morpholinyl-carbodiimid und anderer L-tyrosyl-glycyl-L-leucyl-L-methionin-amid, da- aus der Literatur bekannter Kondensationsmittel. Die durch gekennzeichnet, daß man in an sich bekann- Kondensation kann in einem geeigneten Lösungsmittel ter Weise das PentapeptidL-Phenylalanyl-L-tyrosyl- wie Ν,Ν-Dialkylformamid, niederen aliphatischen glycyl-L-leucyl-L-methioninamid mit dem sauren Nitrilen und Pyridin, vorzugsweise Dimethylformamid, Hexapeptid L-Pyroglutamyl-L-alanyl-L-aspartyl- 15 Acetonitril und Pyridin ausgeführt werden; die Reak-L-prolyl-L-asparaginyl-L-Iysin kondensiert, wobei tion beginnt zwischen —10⁰C und Raumtemperatur die Iminogruppe des Pyroglutamylrestes, die und wird bei Raumtemperatur innerhalb von etwa 10 ε-Aminogruppe des Lysylrestes und die /J-Car- bis 70 Stunden vervollständigt.

boxylgruppe des Aspartylrestes durch eine Schutz- Aus dem geschützten Hendekapeptid wird durch

gruppe blockiert sind, und die Kondensation in 20 Abspaltung der Schutzgruppen in an sich bekannter Gegenwart eines Carbodiimids bei einer Tempera- Weise das entsprechende freie oder mit organischen tür zwischen —10 und +20⁰C innerhalb 10 bis 70 oder anorganischen Säuren kombinierte Hendekapep-Stunden unter Bildung des neuen, entsprechend ge- tid entsprechend dem zur Abspaltung der Schutzgrupschützten Hendekapeptids durchgeführt wird und pen angewendeten Abspaltungsmittel erhalten. Die daß man die Schutzgruppe der Iminogruppe des 25 Wahl des besagten Abspaltungsmittels hängt von der Pyroglutamylrestes, der ε-Aminogruppe des Lysyl- Natur der Schutzgruppen ab; hierfür können z. B. restes und der ^-Carboxylgruppe des Aspartyl- Natriummetall in flüssigem Ammoniak, Wasserstoff restes durch Acidolyse oder Hydrogenolyse ab- in Gegenwart eines Palladiumkatalysators, wasserspaltet, und das Hendekapeptid in freier Form oder freie Halogenwasserstoff säuren in Eisessig und Triin Form eines Salzes mit einer organischen oder 30 fluoressigsäure in an sich bekannter Weise verwendet anorganischen pharmazeutisch verträglichen Säure werden,
isoliert. Aus den entsprechenden Salzen kann das freie

Hendekapeptid durch Versetzen mit einer geeigneten

Base oder durch Chromatographie an Ionenaustausch-

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf das 35 harzen, beispielsweise der neuen Art von verzögerten neue hypotensiv wirksame Hendekapeptid L-Pyro- Ionenaustauschharzen, die von den Bio-Bad Laboraglutamyl-L-alanyl-L-aspartyl-L-prolyl-L-asparaginyltories Richmond, California, USA., unter dem Kennx-lysyl-L-phenylalanyl-L-tyrosyl-glycyl-L-leucyl-L-mezeichen AG 11 AB im Handel sind, gewonnen werden, thioninamid, seine pharmazeutisch verwendbaren Salze Auch die Reinigung des Hendekapeptids kann nach

und ein Verfahren zu seiner Herstellung. 4° den in der Polypeptidchemie bekannten Verfahren, wie

Das erfindungsgemäß herstellbare Hendekapeptid durch Gegenstromverteilung, Chromatographie an und seine pharmazeutisch verwendbaren Salze besitzen basischer Tonerde, Zellulose oder an Ionenaustauscheine stark peripher gefäßerweiternde Wirkung und harzen, z. B. »Amberlite IRC 50«, ausgeführt werden, können besonders zur Therapie von schwerer Hyperten- Typische Beispiele von pharmazeutisch verwend-

sion verwendet werden. 45 baren Salzen sind: Chlorhydrat, Sulfat, Azetat, Tri-

Es bestehen zahlreiche Möglichkeiten zur Herstel- fluorazetat, Glukonat, Tartrat, Malat, Maleinat, Cilung des erfindungsgemäßen Hendekapeptids, die trat, Methansulfonat, Pamoat und andere nicht hauptsächlich auf der geeigneten aufeinanderfolgenden toxische, pharmazeutisch verträgliche Salze.
Kondensation von geschützten Aminosäuren und Poly- Wie schon oben erwähnt, bestehen zahlreiche Mög-

peptiden beruhen, die auf solche Weise ausgeführt wird, 5° lichkeiten zur Herstellung des erfindungsgemäßen daß das resultierende Hendekapeptid jene gewünschte Hendekapeptids.
Reihenfolge von den bezüglichen elf Aminosäuren hat. Als Beispiel wird das folgende Verfahren zur Her-

Bei den Aminosäuren und Polypeptiden, die mitein- stellung angeführt.

ander kondensiert werden, sind die an der Knüpfung Das erfindungsgemäße Verfahren, dessen Einzel-

der Peptidbindung nicht teilnehmenden Amino- und 55 heiten im Nachstehenden erläutert werden, beruht Carboxylgruppen mit geeigneten Schutzgruppen blök- hauptsächlich auf der Kondensation des neuen Penkiert, die leicht durch Acidolyse und Hydrogenolyse tapeptids L-Phenylalanyl-L-tyrosyl-glycyl-L-leucylin bekannter Weise abgespaltet werden können. L-methioninamid (V) mit dem neuen sauren Hexapep-Zum Schutz der Aminogruppe können z. B. folgende tid L-Pyroglutamyl-L-alanyl-L-aspartyl-L-prolyl-Gruppen verwendet werden: Tosyl (p-Toluolsulfonyl), 60 L-asparaginyl-L-lysin (X), worin die Carboxylgruppe Carbobenzoxy (Carbobenzyloxy), Carbo-t.butoxy, Tri- des Aspartylrestes sowie die Aminogruppe des Lysintyl (Triphenylmethyl), Formyl, Trifluoracetyl und an- und Pyroglutamylrestes mit geeigneten Schutzgruppen dere in der Polypeptidchemie übliche Schutzgruppen. blockiert sind, die leicht durch Acidolyse oder Hydro-

Beispiele für die zum Schütze der Carboxylgruppen genolyse abgespaltet werden können,
eingeführten Gruppen sind: Methyl-, Äthyl-, tButyl-, 65 Das neue Pentapeptid L-Phenylalanyl-L-tyrosyl-Benzyl-, p-Nitrophenylgruppen und andere für diesen glycyl-L-leucyl-L-methioninamid kann vorzugsweise Zweck übliche Schutzgruppen. auf folgende Weise hergestellt werden.

Die Kondensation zwischen der Aminogruppe eines Das L-Tyrosin, dessen Phenol- und Aminogruppen