Verfahren zur Herstellung eines bisher unbekannten Polypeptides
Es wurde gefunden, dass man zu einem bisher unbekannten Polypeptid mit blutdrucksenkender Wirksamkeit der Formel I
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gelangt, indem man aus einem Hendekapeptid-Derivat der Formel IV,
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in welchem R ein Wasserstoffatom oder eine zum Schutz der endständigen Amidgruppe eingeführte Gruppe, R'eine zum Schutz der Aminogruppe eingeführte Gruppe und R"'ein Wasserstoffatom oder eine zum Schutz der Carboxylgruppe eingeführte Gruppe bedeuten, sämtliche Schutzgruppen in einer einzigen oder in mehreren Stufen abspaltet.
Das bisher unbekannte Hendekapeptid-Derivat der allgemeinen Formel IV kann z. B. hergestellt werden, indem man das neue Tetrapeptid der Formel II,
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in welcher R und R'obige Bedeutung haben und R" eine Hydroxylgruppe oder eine mit Aminogruppen reaktionsfähige Gruppe bedeutet, mit dem Heptapeptid der Formel III,
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in welcher R"'obige Bedeutung hat, kondensiert.
Beispiele für die zum Schutze der endständigen Amidgruppe eingeführten Gruppen sind der Carbobenzoxy-, der Toluolsulfonyl-, der Carbo-tert.-butoxy-und der p-Nitro-carbobenzoxy-Rest. Beispiele für die zum Schutz der Aminogruppe eingeführten Gruppen sind der Carbobenzoxy-, der Toluolsulfonyl-, der Carbo-tert.-butoxy-, der Phthalyl-, der Formyl-, der Trifluoracetyl-und der p-Nitro-carbobenzoxy-Rest. Beispiele für die zum Schutz der Carboxylgruppe eingeführten Gruppen sind der Benzyl-, der p-Nitro-benzyl-, der Methyl-, der Athylund der tert.-Butyl-Rest. Beispiele für mit der Aminogruppe reaktionsfähigen Gruppen sind das Azid und der p-Nitro-phenylester, die unsymmetrischen Anhydride und das Reaktionsprodukt der Säure mit Dicyclohexyl-carbodiimid.
Es wurde gefunden, dass die Verbindung I eine stark blutdrucksenkende Wirksamkeit besitzt, die noch stärker ist als diejenige des Bradykinins. Es zeichnet sich durch eine hohe Gefässaktivität aus und kann beispielsweise in der Therapie bei der Behand lung von peripheren Durchblutungsstörungen sowie bei Hypertonie Verwendung finden.
In den nachfolgenden Beispielen, welche die Ausführung. des Verfahrens erläutern, die Erfindung aber in keiner Weise einschränken sollen, erfolgen alle Temperaturangaben in Celsiusgraden.
Beispiel a) N-Carbobenzoxy-L-alanyl-L-phenylalanyl- L-isoleucinmethylester
Man löst 168 g N-Carbobenzoxy-L-phenylalanin- p-nitro-phenylester und 58 g L-Isoleucinmethyl- ester in 1000 cm3 Chloroform, lässt über Nacht bei 20 stehen, wäscht mit Wasser, verdünnter Salzsäure und wässrigem Natriumbicarbonat, trocknet über Natriumsulfat, verdampft im Vakuum und versetzt den Rückstand mit Athyläther. Es kristallisiert 130 g N-Carbobenzoxy-L-phenylalanyl-L-isoleucinmethylester (Smp. 106 ), der in 1100 cm3 einer 3, 5n-Lösung von Bromwasserstoff in Eisessig gelöst wird.
Nach einer Stunde bei 20 verdampft man im Vakuum, versetzt mit Athyläther, löst das kristallisierte Produkt in 600 cm3 Chloroform und versetzt mit 48 cm3 Triäthylamin, 72 g Dicyclohexyl carbodiimid und 68 g N-Carbobenzoxy-L-alanin.
Man lässt über Nacht bei 0 stehen, filtriert, wäscht die Lösung mit Wasser, verdünnter Salzsäure und wässerigem Natriumbicarbonat, trocknet über Natriumsulfat, verdampft im Vakuum und versetzt den Rückstand mit Athyläther. Es kristallisiert 132 g N-Carbobenzoxy-L-alanyl-L-phenylalanyl-Lisoleucinmethylester (Smp. 152 ; [a] 21D =-18 in 95 % Essigsäure).
b) N-Carbo-tert.-butoxy-L-aspartyl-L-alanyl
L-phenylalanyl-L-isoleucin-hydrazid
Man löst 132 g N-Carbobenzoxy-L-alanyl-L phenylalanyl-L-isoleucinmethylester in 1500 cm3 einer 3, 5n Lösung von Bromwasserstoff m Eisessig, lässt eine Stunde bei 20 stehen, verdampft im Vakuum, versetzt mit Athyläther, löst das kristallisierte Produkt in 1200 cm3 Chloroform, versetzt mit 95 g N-Carbobenzoxy-L-asparaginsäure-ss-benzyl- ester, 37 cm3 Triäthylamin und 60 g Dicyclohexylcarbodiimid. Man lässt über Nacht bei 0 stehen, filtriert, wäscht die Lösung mit Wasser, verdünnter Salzsäure und wässerigem Natriumbicarbonat, trocknet über Natriumsulfat, verdampft im Vakuum und versetzt den Rückstand mit Äthyläther.
Es kristallisiert 140 g Tetrapeptid (Smp. 135 mit Zers. ; [a] 11 =-17'in 95 % Essigsiiure), das man in
1600 cm3 90 % Methanol löst und bei 20 und Normaldruck in Gegenwart von Palladiumkatalysator zur Abspaltung der Carbobenzoxy-und der Benzyl-Gruppen hydriert. Man filtriert, verdampft im Vakuum, löst in 1200 cm3 Dimethyl-formamid und versetzt mit 28 cm3 Triäthylamin und 200 g tert.-Butyl-pnitro-phenyl-carbonat. Nach 40 Stunden bei 20 ver- dampft man im Vakuum, löst in Athylacetat, wäscht mit verdünnter Essigsäure, trocknet über Natriumsulfat, verdampft im Vakuum und versetzt mit Athyl äther.
Es kristallisiert 93 g N-Carbo-tert.-butoxy-Laspartyl-L-alanyl-L-phenylalanyl-L-isoleucinmethylester (Smp. 120 mit Zers,. ; [a] 21D =-55 in Meth- anol), den man mit einer Lösung von 250 g Hydrazinhydrat in 1000 cm3 Methanol versetzt. Nach 4 Tagen bei 20'verdampft man im Vakuum, löst den Rückstand in 300 cm3 Wasser, bringt zu pH 4, 5 mit 4n Salzsäure, kühlt zu 0 und filtriert.
Man erhält 73 g N-Carbo-tert.-butoxy-L-aspar tyl-L-alanyl-L-isoleucyl-hydrazid (Smp. 220 mit Zers.). c) L-Aspartyl-L-alanyl-L-phenylalanyl L-isoleucyl-glycyl-L-leucyl-L-methioninamid
Man löst 129 g N-Trityl-glycyl-L-leucin, 45 g L-Methioninamid und 65 g Dicyclohexylcarbodiimid in 1300 cm3 Methylenchlorid, salut über Nacht bei 0 stehen, filtriert, wäscht die Lösung mit verdünnter Salzsäure und wässerigem Natriumbicarbonat, trocknet über Natriumsulfat, verdampft im Vakuum und versetzt mit Athyläther. Man erhält 112 g N-Tritylglycyl-L-leucyl-L-methioninamid (Smp. 212 ;
[a] 2D =-4 in Dimethylformamid), das man in einer Mischung von 600 cm3 Eisessig und 600 cm3 Wasser 20 Minuten bei 90 stehen lässt, auf 20 kühlt, filtriert ; man verdampft die Lösung im Vakuum, wäscht den Rückstand mit Äthyläther und kristalli- siert aus Methanol-Äther.
Man erhält 62 g Glycyl L-leucyl-L-methioninamid (Smp. 130 mit Zers. ; [a] 21D =-35 in 95 % Essigsäure), das man mit einer Lösung versetzt, die durch Lösen von 116 g N Carbo-tert.-butoxy-L-aspartyl-L-alanyl-Lphenylalanyl-L-isoleucylhydrazid in 400 cm3 2n Salzsäure und 600 cm3 Dimethylformamid bei-5 und Versetzen mit 105 cm3 2n Natriumnitrit und nach 5 Minuten mit 140 cm3 Triäthylamin und 600 cm3 Dimethylformamid hergestellt wurde. Man lässt über Nacht bei 0 stehen, verdampft im Vakuum, wäscht den Rückstand mit kalter, verdünnter Salzsäure, löst in Tetrahydrofuran und fällt durch Versetzen mit Wasser.
Man erhält 92 g N-Carbo-tert.butoxy-L-aspartyl-L-alanyl-L-phenylalanyl L-isoleucyl-glycyl-L-leucyl-L-methioninamid (Smp. 245 ; [a] 21D = -35 in Dimethylformamid), das man in 2000 cm3 Trifluoressigsäure löst und I Stunde bei 28 stehen lässt. Man verdampft im Va kuum, löst in Methanol, gibt 16 cm3 Tri-n-butyl- amin zu und fällt mit Athyläther. Man erhält 77 g L-Aspartyl-L-alanyl-L-phenyl-alanyl-L-iso- leucylglycyl-L-leucyl-L-methioninamid. d)
L-Pyroglutamyl-L-proplyl-L-seryl e-N-carbo-tert.-butoxy-L-lysinmethylester
Man löst 280 g N-Carbobenzoxy-L-pyroglut aminsäure-p-nitro-phenylester und 92 g L-Prolin in einer Mischung von 1000 cm3 Tetrahydrofuran und 300 cm3 Wasser, gibt innert 20 Minuten 400 cm3 NaOH 2n zu und lässt noch über Nacht bei 20 ste- hen. Man verdampft im Vakuum, versetzt den Rückstand mit 1500 cm3 Wasser, wäscht mit Athylacetat, säuert die wässerige Lösung mit 4n Salzsäure an, extrahiert mit Methylenchlorid, trocknet die organische Lösung über Natriumsulfat, verdampft im Vakuum und versetzt den Rückstand mit Athyl äther.
Es kristallisiert 170 g N-Carbobenzoxy-Lproglutamyl-L-prolin (Smp. 198 ; [a] 21D =-109 in 95 % Essigsäure).
Anderseits löst man bei 0 270 g e-N-Carbo- benzoxy-L-lysinmethyl-esterchlorhydrat, 195 cm3 Tri-n-butylamin, 280 g N-Trityl-L-serin und 172 g Dicyclohexylcarbodiimid in 5000 cm3 Chloroform, lässt über Nacht bei 0 stehen, filtriert, wäscht die Lösung mit verdünnter Salzsäure und wässerigem Natriumbicarbonat, trocknet über Natriumsulfat, verdampft im Vakuum und versetzt mit Athyläther.
Es kristallisiert 342 g N-Trityl-L-seryl-e-N-Carbo- benzoxy-L-lysinmethylester (Smp. 102 ; [a] 21D =-45 in Dimethylformamid), das man in 2000 cm3 Eisessig und 2000 cm3 Wasser löst und bei 95 wäh- rend 20 Minuten stehenlässt. Man gibt 2000 cm3 Wasser zu, kühlt zu 5 , filtriert und verdampft die Lösung im Vakuum. Man löst den Rückstand in In Ammoniak, extrahiert mit Methylenchlorid, trocknet die organische Phase über Natriumsulfat, verdampft im Vakuum und versetzt den Rückstand mit Äthyläther.
Es kristallisiert 179 g L-Seryl-N-carbo benzoxy-L-lysinmethylester (Smp. 78 ), den man gemeinsam mit den hier oben erhaltenen 170 g N-Car bobenzoxy-L-pyroglutamyl-L-prolin in 1700 cm3 Chloroform und 1130 cm3 Acetonitril löst und mit 102 g Dicyclohexylcarbodiimid versetzt.
Man lässt über Nacht bei 0 stehen, filtriert, verdampft die Lösung im Vakuum, löst den Rückstand in Athyl- acetat, wäscht mit verdünnter Salzsäure und wässerigem Natriumbicarbonat, trocknet über Natriumsulfat, verdampft im Vakuum und versetzt den Rückstand mit Athyläther. Es kristallisiert 285 g Tetrapeptid (Smp. 60 [a] 21D = 50 in 95 % Essigsäure), das man in 2500 cm3 Methanol löst und in Gegenwart von Platinkatalysator bei 20 und Normaldruck zur Entfernung der Carbobenzoxygruppen hydriert.
Man filtriert, versetzt die Lösung mit Athyl- äther und filtriert den erhaltenen L-Pyroglutamyl-L propyl-L-seryl-L-lysinmethylester (145 g ; Smp. 80 ; [a] D =-94 in 95 % Essigsäure), den man in 700 cm3 Dimethylformamid löst und mit 150 g tert.-Butyl-p-nitro-phenyl-carbonat versetzt. Man lässt vier Tage bei 25 stehen, verdampft im Vakuum, wäscht den Rückstand mit Äthyläther und kristalli- siert aus Methylenchlorid-Äthyläther um.
Man erhält
140 g L-Pyroglutamyl-L-prolyl-L-seryl-E-N-carbo- tert.-butoxy-L-lysin-methylester (Smp. 90 mit Zers. ; [a] D =-69 in Methanol). e) L-Pyroglutamyl-L-propyl-L-seryl-L-lysyl-L aspartyl-L-alanyl-L-phenylalanyl-L-isoleucyl glycyl-L-leucyl-L-methioninamid
Man löst 81 g L-Pyroglutamyl-L-prolyl-L-seryl- e-N-carbo-tert.-butoxy-L-lysinmethylester in 750 cm3 Methanol, versetzt mit 200 cm3 Hydrazinhydrat, lässt über Nacht bei 20 stehen, verdampft im Vakuum,
löst in 900 cm3 Methanol und versetzt mit 5000 cm3 Athyläther. Es kristallisiert
61 g L-Pyroglutamyl-L-prolyl-L-seryl-e-N- carbo-tert.-butoxy-L-lysinhydrazid (Smp. 120 ; [a] D1 =-64 in Methanol), das man in 440 cm3 ln Salzsäure und 880 cm3 Dimethylformamid löst und bei-5 mit 60 cm3 2n Natriumnitrit und nach 5 Minuten mit noch 92 cm3 Triäthylamin und 77 g L-Aspartyl-L-alanyl-L-phenylalanyl-L-isoleucyl-glycyl-L-leucyl-L-methioninamid versetzt. Man lässt über Nacht bei 0 stehen, verdampft im Vakuum und wäscht den Rückstand mit Athyl äther und mit verdünnter Essigsäure.
Man erhält 82 g Hendekapeptid (Smp. 200 mit Zers.), das man in 2000 cm3 Trifluoressigsäure löst. Man lässt 1 Stunde bei 25 stehen, verdampft im Vakuum und wäscht den Rückstand mit 1000 cm3 Wasser, das man durch Zugabe von Natriumbicarbonat zum pH 6, 5 bringt. Man erhält 71 g L-Pyroglutamyl-L prolyl-L-seryl-L-lysyl-L-aspartyl-L-alanyl- L-phenylalanyl-L-isoleucyl-glycyl-L-leucyl L-methioninamid, in Form eines in neutralem Wasser schwer löslichen Pulvers. Durch saure Hydrolyse unter Stickstoff liefert es Glutaminsäure, Prolin, Serin, Lyse, Asparaginsäure, Alanin, Phenylalanin, Isoleucin, Glycin, Leucin, Methionin und Ammoniak in äquimolekulfaren Mengen.