DE1543895A1 - Ein bisher unbekanntes Polypeptid sowie ein Verfahren zu dessen Herstellung - Google Patents

Description

Ein bisher unbekanntes Polypeptid sowie ein Verfahren zu

dessen Herstellung

Die vorliegende Erfindung betrifft das neue Pentacosapeptid der Formel D-Seryl-L-tyrosyl-L-seryl-L-norleucyl-L-gliitaminyl-L-histidyl-L-phenyialanyl-L-arginyl-L-tryptophanyl-glycyl-L-lysyl-L-prolyl-L-valyl-glycyl-L·- lysyl-L-lysyl-L-arginyl-L-arginyl-L-prolyl-L-vaiyl-L-lysyl-L-valyl-L-tyrosyi-L-prolyl-L-valinamid, im Nachstehen-

14 S
den mit D-Ser -Nie -GIn -Pentacosapeptid bezeichnet, seine therapeutisch wirksamen Säureadditionssalze und Schwermetallkomplexe sowie ein Verfahren zu dessen Herstellung.

14 ¹S

D-Ser -Nie -GIn -Pentacosapeptid, seine Salze und Schwermetallkomplexe besitzen eine hohe adrenocorticotrope Wirksamkeit.

Es war bereits bekannt, dass man ein Pentacosapeptid der Sequenz L-Seryl-L-tyrosyl-L-seryl-L-norleucyl-L-glutamyl-

909886/1696

s. v

- 2 - 10-2292

L-histidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophanyl-glycyl-L-lysyl-L-prolyl-L-valyl-glycyl-L-lysyl-L-lysyl-L-arginyl-L-arginyl-L-prolyl-L-valyl-L-lysyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-prolyl-L-valinamid mit corticotroper Wirkung, im Nächste- ' 5 henden mit Nie -Pentacosapeptid bezeichnet, synthetisieren kann.

■ Nie -Pentacosapeptid besitzt gegenüber dem natürlichen ACTH

den Vorteil, dass es Iceine antigenen Eigenschaften auf-

L. weist. Ein weiterer Vorteil des Nie -Pentacosapeptids ist,

dass es in Stellung K nicht wie natürliches ACTH einen

Methioninrest besitzt, "der leicht oxydierbar ist und dadurch das Hormon in eine inaktivierte Form umwandelt, .sondern einen Norleucinrest, der dieselben sterischen Eigenschaften wie der Methioninrest aufweist, hingegen gegen Oxydation

beständig ist. Ueberdies weist das Nie -Pentacosapeptid in Stellung 25 einen Valinamidrest auf, der beim natürlichen ACTH an dieser Stelle nicht vorkommt. Der Valinamidrest am Carboxylende schützt die Peptidkette gegen abbauende Enzyme.

20 Gleich dem natürlichen ACTH weist jedoch das Nie -Pentacosapeptid in Stellung 1 einen endständigen L-Serinrest auf, der bekanntlich gegenüber der abbauenden Wirkung von Aminopeptidasen sehr empfindlich ist.

L-Serinrest des Nie -Pentacosapeptids durch einen Rest

Es wurde aus diesem Grunde versucht, den endständigen

k
Nie -Pentacosap«

909886/1696

BAD ORIGINAL

zu ersetzen, der gegenüber der abbauenden Wirkung der Aminopeptidasen stabil ist.

Tatsächlich gelang es, durch den Ersatz des entständigen

4 L-Serinrestes mit einem D-Serinrest beim Nie -Pentacosapeptid und durch den Ersatz des Glutaminsäurerestes in Stellung 5 durch einen Glutaminrest, das gegenüber Amino-

1 4 5 peptidasen unempfindliche D-Ser -Nie -GIn-Pentaccsapeptid zu erhalten. Da aber bekanntlich D-Aminosäufereste in den natürlichen, biologisch aktiven Peptidhormonen nicht vorhanden sind, war es überraschend und nicht vorauszusehen, dass durch den Ersatz eines natürlichen Aminosäurerestes durch seinen in der Natur nicht vorkommenden Antipoden eine Verbindung erhalten wird, die nicht nur qualitativ dieselben biologischen und therapeutischen Eigenschaften wie das natürliche ACTH aufweist, sondern auch noch quantitativ dem natürlichen ACTH, wie später eingehend dargelegt wird, überlegen ist.

1 4 5
D-Ser -Nie -GIn -Pentacosapeptid kann nach für die Synthese von Verbindungen dieser Art aligemein bekannten Methoden hergestellt werden, wobei die Aminosäuren in der, in der obigen Formel festgelegten Reihenfolge einsein oder nach vorheriger Bildung kleinerer Peptideinheiten miteinander

verknüpft werden.

1 4 5

Erfindungsgemäss kann D-Ser -Nie -GIn -Pentacosapeptid beispielsweise hergestellt werden, indem man L-Vaiyl- c -N-R-

909886/1696

BAD ORIGINAL

L-lysyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-prolyl-L-valinamid, worin R eine Carbo-tert.-butoxy- oder eine Carbo-tert.-amyloxy-, eine Carbobenzoxy-, eine Toluolsulfonyl-., eine Phthalyl-, eine Pormyl- oder eine Trifluoracetyl-Gruppe bedeutet, mit dem N-Carbobenzoxy-L-valyl-glycyl-^-N-R-L-lysyl-£ N-R-L-lysyl-nitro-L-arginyl-nitro-L-arginyl-L-prolin, worin R obige Bedeutung hat, kondensiert, das erhaltene N-Carbobenzoxy-L-valyl-glycyl- £-N-R-L-lysyl-£-N-R-L-• lysyl-nitro-L-arginyl-nitro-L-arginyl-L-prolyl-L-valyl-ί-N-R-L-lysyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-prolyl-L-valinamid,

worin R obige Bedeutung hat, nach Abspaltung der Carbobenzoxygruppe und der Nitrogruppen mit dem N-Tripbenylmethyl-L-glutaminyl-Im-triphenylmethyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophanyl-glyoyl-E-N-R-L-lysyl-L-prolin,

15 worin R obige Bedeutung hat, kondensiert, das erhaltene N-Tripheny!methyl-L-glutaminyl-Im-triphenylmethyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophanyl-glycyl-ί-N-R-L-lysyl-L-prolyl-L-valyl-glycyl- £-N-R-L-lysyl-£ N-R-L-lysyl-L-arginyl-L-arginyl-L-prolyl-L-valyl-£-N-R-L-

lysyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-prolyl-L-valinamid, worin R

obige Bedeutung hat,nach Abspaltung der N-Triphenylmethyl-Gruppe mit .dem N-R¹ -D-Seryl-L-tyrosyl-L-seryl-L-norleueylazid, worin R' eine Triphenylmethyl-, eine Carbo-tert.-butoxy- oder eine Garbo-tert.-amyloxy-, eine Carbobenzoxy-,

25 eine Triiluoracetyl-, eine Acetyl-, eine Chloracetyl- ode.r

909886/1696

BAD ORIGINAL

eine -Formylgruppe bedeutet, kondensiert und die gesamten Schutzgruppen des erhaltenen neuen, geschützten Pentacosapeptids N-R¹-D-Seryl-L-tyrosyl-L-setfyl-L-norleucyl-L-glutaminyl-Im-triphenylmethyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophanyl-glycylo-N-R-L-lysyl-L-prolyl- L-valyl-glyeyl- £"-N-R-L-Iy sy I- £-N-R-L~lysyl-L-arginyl-L-arginyl-L-prolyl-L-valyl-E-N-R-L-lysyl-L-valyl-L-tyrosyl· L-prolyl-L-valinamid, worin R und R' obige Bedeutung haben, in einer oder in mehreren Stufen im sauren Milieu abspaltet.

■ ' " " l' 4 5

Die Ausgangsprodukte zur Herstellung des D-Ser -Nie -GIn-.

Fentacosapeptids können, sofern sie bisher noch nicht bekannt waren, nach den für die Peptidchemie bekannten Methoden erhalten werden, wobei die Aminosäuren einzeln oder nach vorheriger Bildung kleinerer Peptideinheiten miteinander verknüpft werden.

D-Ser -Nie -GIn -Pentacosapeptid lässt sich auch in Form seiner Salze gewinnen bzw. verwenden. Als Salze kommen solche mit organischen Säuren, wie Essigsäure, Propionsäure, Glykolsäure, Milchsäure, Brenztraubensäure, Malonsäure, Bernsteinsäure, Maleinsäure, Fumarsäure, Weinsäure, Zitronensäure, Benzoesäure, Zimtsäure, Salicylsäure, 2-Phenoxy- oder 2-Acetoxy-benzoesäure, Mandelsäure, Methansulf onsäure, Aethansulfonsäure, Hydroxyäthansulfonsäure, Benzol- oder Toluolsulfonsäure, Naphathalinsulfonsäure,

909 88 6/1696

BAD ORIGINAL

Sulfanilsäure sowie polymere Säuren wie Gerbsäure, Alginsäure, Polygalacturonsaure, Polyphioretinphosphat oder Carboxymethylcellulose und Salze mit anorganischen Säuren wie Halogenwasserstoffsäure, z.B. Salzsäure oder Bromwasserstoffsäure, Salpetersäure, Thiocyansäure, Schwefelsäure und Phosphorsäure in Frage. Als Schwermetallkomplex, kommt z.B. derjenige des Zinks in Frage.

D-Ser -Nie -GIn-Pentacosapeptid, seine Salze und Schwerraetallkomplexe können beispielsweise für die Behandlung

der folgenden Erkrankungen verwendet werden: Akuter und chronischer Gelenkrheumatismus, Colitis ulcerosa,
Nephrose,
Kollagenosen, wie z.B. Lupus erythematodes, Sklerodermie usw.,

15 Allergische Erkrankungen der verschiedenen Organsysterne, wie Asthma bronchiale, Ekzem, Urticaria, Dermatitis exfoliativa, anaphylaktischer Schock usw.,
Intoxikationen verschiedener Genese,

Tumoren, wie z.B. Leukämien, Lymphosarcomen, Reticulosarcoir.en usv/., zur Verhinderung der Nebennierenrindenatrophie .bei der Therapie mit Corticosteroiden,
Insuffizienzerscheinungen der Hypophyse. Ein wesentlicher Vorteil gegenüber natürlichem, aus tierischem Material extrahierten Hormon liegt darin, dass dem

9 0 9 8 8 6/169G

SAD ORfGiNAL

synthetischen Pentacosapeptid antigene Eigenschaften fehlen. Es kann somit bei den obenerwähnten Erkrankungen auch dann unbedenklich verwendet werden, wenn beim Patienten im Verlauf einer früheren Behandlung mit natürlichem ACTK allergische Erscheinungen auftraten.

In den für die Standardisierung üblichen und anerkannten

■-■"■■'■■ τ 4 s
Tests besitzt D-Ser -Nie -GIn -Pentacosapeptid im Vergleich zum natürlichen Corticotropin eine biologische'Wirksamkeit von 545 - 120 Corticotropin IE pro mg freies Peptid. Sodienten zur Testung des verfahrensgemäss hergestellten Pentacosapeptids der 3. Internationale Standard für Corticotropin, welcher in Form des "international Standard of Corticotropin" zur Verfügung steht und die Einstellung von ACTH-Präparaten. auf Internationale Einheiten ermöglicht.

Es hat sich herausgestellt, dass das neue Pentacosapeptid nach intravenöser Verabreichung eine längere Wirkungsdauer besitzt als die bisher bekannten natürlichen und synthetischen ACTH-Präparate, was einen bedeutenden technischen Fortschritt darstellt. Die Dosierung des verfahrensgemäss hergestellten Pentacosapeptids variiert ungefähr zwischen 40 und 60 IE pro Tag, in besonderen Fällen zwischen 10 una

100 IE pro Tag·

Die unerwartete, bei der Standardisierung festgestellte hohe Wirksamkeit des neuen Pentacosapeptids hat sich bei der therapeutischen Anwendung voll bestätigt, so dass das

909886/1696

BAD ORIGINAL

- 8 - 10- 2292

neue 'Pentacosapeptid auf Gewichtsbasis stärker wirkt als alle, bis jetzt bekannten natürlichen und synthetischen ACTH-Präparate.

1 4 5
D-Ser -Nie -GIn -Pentacosapeptid kann als Heilmittel, z.B.

in Form pharmazeutischer Präparate, Verwendung finden. Diese enthalten die genannte Verbindung in Mischung mit einem für die parenterale Applikation geeigneten organischen oder anorganischen Trägermaterial. Für dasselbe kommen solche Stoffe in Frage, die mit der neuen Verbin-

10 dung nicht reagieren, wie z.B. Gelatine, Milchzucker,

Stärke, Magnesiumstearat, Talk, pflanzliche Gele, Benzylalkohole, Gummi arabicum, Polyalkylenglykole, Vaseline, Cholesterin oder andere bekannte Arzneimittelträger. Die pharmazeutischen Präparate können z.B. in flüssiger Form als Lösungen, Suspensionen oder Emulsionen vorliegen. Gegebenenfalls sind sie sterilisiert und bzw. oder enthalten Hilfsstoffe wie Konservierung-, Stabilisierungs-, Netzmittel oder Emulgiermittel. Sie können auch noch andere, therapeutisch wertvolle Stoffe enthalten. Die neue Verbindung kann wie natürliches ACTH auch in Form eines Depotpräparates verabreicht werden.

ι it c ^;

D-Ser -Nie -GIn -Pentacosapeptid und seine Salze kann auch als Zwischenprodukt zur Herstellung von pharmazeutischen . Präparaten Verwendung finden.
Beim Aufbau des neuen Pentäcosapeptids haben sich für die ■ Blockierung der Aminogruppe des Serinrestes die Triphenyl-

909886/1698

BAD ORIGINAL·

-9- I Q^OQVQ 10- 2292

methyl-, die Carbo-tert.-butoxy- und die Carbo-tert.-amyloxy-Gruppe bewährt, doch können auch andere geeignete Schutzgruppen wie die Carbobensoxy-, die Trifluoraeetyl-, die Acetyl-, die Chloracetyl-, die Formylgruppe verwendet werden.

■ Für die. Blockierung der £-Aminogruppe des Lysinrestes hat sich die Carbo-tert.-butoxy- und die.Carbo-tert.-amyloxy-Gruppe bewährt, doch können auch andere geeignete Schutzgruppen wie die Carbobenzoxy-, die Toluolsulfonyl-* die Phthalyl-, die Formyl- und die Trifluor-acetyl-Gruppe verwendet werden.

Für die Blockierung der Imidazölgruppe des Histidinrestes hat sich die Triphenylmethylgruppe bewährt, doch können auch andere geeignete Schutzgruppen, wie die Carbo-tert.-butoxy-, die Carbo-tert.-amyloxy-, die Carbobenzoxy- oder die.Benzylgruppe verwendet werden.

Für die Blockierung der Guanidogruppe der Argininreste wurde die Nitro-Gruppe verwendet, doch können auch andere geeignete Sc hut ζ gruppen, wie die Tosylgruppe, die p-Kifcroearbobenzoxygruppe oder die 2-(Isopropyloxycarbonyl)-3,4, 5,6-tetrachlorobenzoylgruppe verwendet werden. Man kann auch den Schutzeffekt der Protonisierung der Guanidogruppe bei der Synthese verwenden.

90 98 86/1696.

BAD OBVGlNAt

- 10 - 10-2292

Es werden folgende Abkürzungen verwendet:

CBO ■= Carbobenzoxy

Tr t = Trityl = Triphenylmethyl

CTB = Carbo-tert.-butyloxy

NO₂ = Nitro

OCP = 2,4,5-Trichlorphenoxy

OTB = tert.-Butyloxy

OMe = Methoxy

OEt = Aethoxy

Arg = L-Arginyl

GIn = ^ L-Glutaminyl

GIy = Glycyl

His = L-Histidyl

Lys = L-Lysyl

Nie = L-Norleueyl

Phe β L-Phenylalanyl

Pro = L-Prolyl

Ser = L-Seryl

D-Ser = D-Seryl

Try - L-Tryptophanyl

Tyr = L-Tyrosyl

VaI - L-Valyl

Im =s Imidazolyl

In den folgenden Beispielen, die die Ausführung des Ver-25 fahrens erläutern, den Umfang der Erfindung aber in keiner Weise einschränken sollen, erfolgen alle Temperaturangaben

■ 90
in Celsiusgraden. 909886/1696

SAD ORIGINAL

969 L /988606
Pig. A. Herstellung von H-VaI-OIy-(R)LyS-(R)Lys-Arg-Arg-Pro-Val-(R)Lys-Val-Tyr-Pro-Val-NH,

R R +

NO« NO

VaI GIy Lye Lys

-N, H-

Arg Arg Pro

-OH

R R

4-

NO_p NO A

VaI GIy Lys Lys Arg Arg Pro

-OH H-

VaI Lys VaI Tyr Pro VaI

-NH,

VaI

Qiy

R ι

R ι

N0a

NQ2

Pro

VaI

R I

VaI

Tyr

Pro

VaI

CBO-

Lys

Lys

I Arg

Arg

Lys

VaI

GIy

R I

R I

Pro

VaI

R ι

VaI

Tyr

Pro

VaI

H-

Lys

Lys

Arg

Arg

Lys

-NH,

-NH,

CaJ OD CD

ru ro vo ro

Pig. B. Herstellung von H-D-Ser-Tyr-Ser-Nle-Gln-His-Phe-Arg-Try-Gly-Lys-Pro-Val-Gly-Lys-Lys-Arg-Arg-Pro-Val-Lys-Val-Tyr-Pro-Val-NH,,

H •Η

CBO-

Tyr

-OH H-

CBO-

Tyr

co ο «ο R¹-

D-Ser

-N, H-

- R¹-

D-Ser

R^f-

D-Ser

R'-

D-Ser

Tyr

Tyr

Tyr

Tyr

Ser Nie

-OMe

Ser Nie

-OMe

Ser Nie

-OMe

Trt

Ser Nie

-OMe Trt-

R ■4-

GIn His Phe Arg Try GIy Lys Pro

Trt

Ser Nie

-NHNH« Trt-

Gin His Phe Arg Try GIy Lys Pro Trt

Ser Nie

-N, H-

GIn His Phe Arg Try GIy Lys Pro

D-Ser

Tyr

Ser

Nie

GIn

Trt J

Phe

Arg

Try

GIy

R I

Pro

R1-

His

Lys

D-Ser

Tyr

Ser

Nie

GIn

Phe

Arg

Try

GIy

Pro

H-

His

Lys

oo co co cn

-A-

CU

CU

i-l

U Ph

to

CL,

CO

O H

Vt-

β*

CQ

!μ

< CO

CQ

H Ö

CVI

CU

PS-

PS-

Ph

IQ

O U Ph

PS--

-PS-

OS-

β}

tu

S? V)

I?

SU

CQ

0 9 8 8 6/1 6*9

- j 10-2292

' 15A3895

Beispiel It L-VaIy 1-glycyl-o'arbo-tert.-buboxy-L-lysyl-oarbotert.-butoxy-L-lysyl-L-arglnyl-L-arglnyl-L-prolyl-L-valyl-carbo-.tert. -butoxy-L-lysyl-L-yalyl-L-tyrosyl-L-prolyl-L-vallnamid (H-VaI-GIy-5 (CTB)Lys-(CTB)Lys-Arg-Arg-Pro-Val-(CTB)Lys-

Val-Tyr-Pro-Val-NH₂)

Man löst 88 g C30-(X0₂)Arg--(N0₂)Ar£-:?ro--Gi£e in einsa 9G#-igea Dioxan-Vasser Gemisch und versetzt "mit 220 ecm 2-n Natronlauge. 2«aoh.2 Sta. vard mit 1 L liasssr verdünnt ur.d v/iederholt ait Sssig«

.0· ester ausgewaschen. Anschliesssnd säusr"5 nan die vässsrige Lüsuns mit 4-n Salzsäure an, löst das ausgafallene Produkt in einea Geaisch von Methanol-Aceton (1:1) auf und fällt durch Zugabe von Aethyläther. Man erhält 70 g 0B0-(IT0₂)Arg-(K0₂)Arg-Pro-0H von Snip. 108° (ait Zersetzung). [a]_D » -19° in Dlaetliylforcaffiia· ϊί&η löst das oben-

.5 .erhaltene Tripeptid in .400 al einer 335*-i£^e^ Lösung von Bromwasserstoff in Bisessig, lässt 1 Std. "bei 20° stehen, konzentriert aui 200'ml, fällt ait Aethyläther aus, filtrier?, wäscht ait Aethylacetat und trocknet. Man erhält 72 g H-(HO₀)Arg-(3J0 )Arg-?ro-CH · 3 HBr voa Sap. 84° (mit Zersetzung). C«]^¹ = -19° in95^~iger Sssigsäure. In

Ό eine Lösung von 72 g K-(K0₂)Arg-(K0₂)Arg-Pro-0H Hydrobroiiid in 6C0 al Dirnethylforaamid und 56 al Triäthylaiain wurde "bei 0° C 84 s CBO-VaI-GlyJ(CTB)Lys-^vCT3)Lys-I!r-, (aus 85 g des eatspre.chenaen Kydrazids her • gestellt) eingetragen. Kan lässt die lösung 16 Stunden stehen und dampft das lösungsmittel ein. Dar Rückstand wird in einea Geaißch von n-3utanol-2ssigester 2:8 gelöst und wiederholt ait verdünnter

909886/1696

-H- 10-2292

Schwefelsäure nachgewaschen. Man konzentriert die Lösung im Vakuum ein und fällt mit Aether aus. Man erhält 90 g CBO-Väl- · GIy-(CTB)Lys-(CTB)Lys-(NO₂)Arg-(NO₂)Arg-Pro-OH vom Smp. 151° (mit Zersetzung). [a]_D = -38⁰ in Methanol.

!-lan löst ,56 g C33-Val-Gly-(CT3)Lys-(CO?B)Lys-{S0₂)Are-(S0₂)Ar«-. Pro-OK in SCO al Dixiethylforaaaia -und SCO ri Tetrahydrofuran. Sach. Zugabe von 6,2 el Iriäthylaziin wird dio Losung auf - 10° C a"bgaldlhit und "bei dieser Temperatur mit 4,2 LiI Chlorassiscnsäurö-' aethylester versetzt. Kach 10 KIr,. ^T.mrden 36 g H-YaI-(C23)!Lys-

^10 Val-Tyr-Pro-Val-XHp irx 160 nl Dipotkylfpi^asid augegeban und ü'oer 15 Stunden "bsi 20° veiter gerührt. Das !»ösuri^saittöl vurdo in VaVaius verdampft ur.d dar FJickstar.d nix Vasssr ausgewaschen. lian löst das Peptid in heisscn Aethancl und fällt mit Bssi^esxör aus.. Xacii Abnutsehen und Iroclcnen erhält s^.r* 72 g CBO-VaI-GIy-(CCS)IyS--

.(C23-)Lys-(N0₂)Arg-(lvO )Ar--:³ro-Val-(CC3)Xys-Val-2yr_rPro-Val-:S₂ voa Sap. I9O⁰ (mit Zers.). [a]_D = -36° in Diaethylforaasaia.

Man löst 72 g C30-Val-Gly-(CT3)Lys-(C23)Lys-(iK)₂)Ars-(N0₂)Ars-?ro-VaI-(CTB)Iys-Val-Tyr-Pro-Val-SK₂ in 1,5 Z 50?i-is5r Essigsäura, versetzt nit Palladium-katalysator, nydriert "bis zur Beendigung der Vasserstoffaufnahze und filtriert vos Katalysator ab. Xach Binengen löst aan den Rückstand in 5CO nl Kethanol auf, kühlt auf - 5°, versetzt nit 4,1 g p-Toluolsulfonsäura und fällt anschliessend nit Aether. Kaa erhält 66 g K-Val-Gly-(C23)Lys-(CT3)Lys-Arg-Arg-Pro-Vai· (CTB)Lys-Val-Tyr-Pr0-VaI-IsH₂ als Trit-toluolsulfonat vein Smp. I85⁰

^qO ·

25 . (nit Zers.). [alj §°

Beispiel 2- Ι\^τ-ΤΓΐ^γ1-ί~&1η±»_πΐΐΓ7ΐ^1η-ΐΓΐ-8;γ1-»Ι

lyayl-L-prolia (Trit-G-lii- (2rit )His-Phe-Arg-2ry-Gly-(COS)Iys-Pro-OH).

Man löst 45 g H-His-Phe-OKe · 2 E3r und 26 ml Siriäthylarain 'in 100 al Dimethylformamid, rührt 10 Min. bei 0°, filtriert, gibt des Filtrat 45 g CBO-GIn-OCP zu und lässt 16 Std* bei 20° stehen. Kaa dampft das Dimethylformamid ab, löst den Rückstand in Bssigestar, wäscht mit veraünntem Essigsäure-Wasser und 1 IS ITatriumbicarbonatlösung, trocli2ot über liatriuiasulfa-c, dampft ab und kristallisiert dän Rückstand aus Essigaster. Kan erhält 33 g CEO-GIn-His-?he-OHe. Siap. 187°.

löst das oben erhaltene Tripeptid in 300 al Methanol und 33":

genwart
Salzsäure, hydriert in Ge-/ von 5 g Palladium-Kohle 10 &, filtriert, dampft ab, löst den Rückstand in 150 al Methylenchlorid, kühlt auf 0°, gibt 21 ml Triäthylaain und anschliessend 27 g Triphenylchlormethan zu, lässt 16 Std. bei 20 stehen, wäscht mit verdünnter Essigsäure, Wasser und 1 N Natriumbicarbonatlösung, trocknet und dampft ab. Kan löst den Rückstand in Diäthyläther und fällt mit Petroläther. Man erhält

49 g Tri&-Gln-(TriBHis-Phe-OHe, das man in 100 ml Methanol löst. Man gibt 5 ml Hydrazin zu, lässt 24 Std. bei 20° stehen, konzentriert auf

50 ml, gibt 500 al Diäthyläther zu, wäscht mit 0,1 N Kochsalzlösung, trocknet, konzentriert auf 50 ml und fällt mit Petroläther. Kan erhält 40 g TrIt-GIn-(TrIt)HiS-PhO-NHNH₂, Smp. 85° mit Zers., CaJ^⁰ = -.15* in Dimethylformamid.
Man löst 40 g Tri£Gln-(TriJ?Eis-Phe-KHEE₂ in 100 ml Dimethylformamid und

909886/1696

10-2292

100 ml Isopropanol, kühlt auf -10° und gibt 40 ml 4 N Salzsäure und anschliessend unter Rühren 9 ml 5 N Natriumnitritlösung zu. Nach 5 Min. fügt man 28 ml Triäthylamin und 1000 ml Eiswasser zu, nutscht ab,

löst den Niederschlag in Essigester, wäscht mit einer gesättigten Kochsalzlösung, trocknet, dampft bsi 0° ab, löst den Rückstand in 100 ml Dimethylformamid, gibt 26 g K-Arg-Try-Gly-(CTB)-Lys-Pro-OH, 3 AcOH und 4,5 ml Triäthylamin zu, lässt Io Stunden bei 0° stehen, gibt 1000 al Essigester zu, wäscht mit 0,5 Ii Essigsäure, Wasser und 0,5 N Pyridin, dampft ab, löst den Rückstand in 100 ml Essigester und fällt rait Diäthylather. Man erhält 55 S Trit-Gin-(Trit)Kis-Phe-Arg-Try-Gly.-(CTB)Lys-?ro-OH.

20

Smp. 185° Ea3_D = -15° in Dimethylformamid,

Beispiel p: L-glutaminyl-Irn-trityl-L-histidyl-L-phenyj.alanyl-L-arKinyl-L-tryOtophanyl-glycyl-N-carbo-tert«-

■ ' butoxy-L-lysyl-L-prolyl-L-valyl-glycyl-K-carbo-tert. -

butoxy-L-lysyl-N-carbo-tart.-butoxy-L-lysyl-L-ar^inyl-L-arginyl-L-prolyl-L-valyl-N-carbo-tert.'-bxitoxy-L-lysyl-L-vaj-yl-L-tyrosyl-L-prolyl-L-valinamid.

(H-GIn-(TrIt)His-Phe-Arg-Try-Gly-(CTB)Lys-Pro-Val-

GIy-(CTB)Lys-(CTB)Lys-Arg-Arg-Pro-Val-(CT3)Lys-Val-Tyr-Pr0-VaI-NH₂)

Man löst 62 g H-Val-Gly-(CTB)Lys-(CTB)Iys-Arg-Ars-?ro-Val-(CTB) Lys-Val-Tyr-Pro-Val-NH₂ ·■ 3 Tos-OK in 300 ml Pyridin und 300 .nl

9 0 9886/1696

Acetonitril auf. Anschliessend gibt man ρβ g Trit-Gln-(Trit)Kis-Phe-Arg-Try-Gly-(C?B)Lys~Pro-OK zu und wenn alles in Lösung ist, kühlt man auf 0° ab, versetzt mit 28,6 g Dicyclohexylcarbodiinid. Nach 24-stün.digen Schütteln bei 20° wird der Harnstoff abfiltriert und die Lösung mix: Aether gefällt. Das Produkt wird wiederholt in Methanol gelöst und mit Essigester gefällt. Man erhält 89 g Trit-Gln-CTritjKis-Phe-Arg-Sry-Gly-CCTBjLys-Pro-Val-Gly-CCTBjLys-.CCTBjLys-Arg-Arg-Pro-Val-XCTBjLys-Val-Tyr-Pro-VaI-NH₂ Tri-toluolsuifonat. Smp. 186° mit Zers., [aj^⁰ « -50° in Methanol.

Man löst 45 g Trit-Gln-(TrIt)His-Phe-Arg-Try-Giy-(CTB)Lys-?ro-Val-Gly-(CT3)Lys-(CT3)I^3-Ars-Ärs-Pro-Val-(CTB)Lys-Val-Tyr-Pro-Val-SHg' · 3 Tos-OK in 500 ml 80 ^-iger Essigsäure und lässt 2 Stunden bei 30° stehen. Man gibt 50 al Amberlit IRA-410 in Acetatform zu, filtriert, verdampft im Vakuum und löst den Rückstand in Methanol auf. Nach Fällen mit Aether erhält man 40 g H-GIn-(TrIt )Eis-Phe-Arg-Try-Gly-(CTB)Li'8_rPro-

Val-Gly- (CTB )Lys- (CTB)Lys-Arg-Arg-Pro-Val- (CTB)lys-Val-Tyr-

20 Pro-Val-NHg. Zersetzung bei 170°* Ca3^ - -48° in Methanol.

909886/1696 BAD ORIGINAL

Beispiel 4: Cai-bo-tert. -butoxy-D-Seryl-L-tyrosyl-L-seryl-L-nor1euc in-hydrazid (CTB-D-Ser-Tyr-S er-NIe-NHNHg) Man löst 60 g D-Serinniethylester-hydrochlorid in 200 ml Dimethylformamid und 54 ml Triäthylamin, kühlt auf 0° und filtriert das Triethylamin-hydrochlorid ab. Dimethylformamid wird bei Hochvakuum eingedampft und der Rückstand in 150 ml Pyridin aufgelöst. Man tropft 100 g tert.-Butyloxycarbonylazid zu und lässt 2 Tage bei 20° stehen. Dann dampft man das Lösungsmittel ab und nimmt das Produkt in Essigester auf. Nach Waschen mit V/asser, verdünnter Salzsäure und Kaliurshydrogencarbcnat-Lösung trocknet man über Natriumsulfat. Nach Abdampfen des Essigesters bleibt das CT3-D-Ser-0Me als ein OeI zurück. Man löst den Ester in 500 ml Methanol auf und lässt mit 50 ml Hydrazinhydrat 2 Tage bei 20° stehen. Nach Verdampfen des Methanols kristallisiert das Hydrazid. Aus heissem Essigester umkristallisiert, isoliert man 55 Z ^c?3~

21
D-Ser-NHNH₂ vom Smp. 114°, [a.L· = -3° in Dime-chylformamid.

Man löst bei -10° 10 g CT3-D-Serinhydrazid in 1J6 ml i N Salzsäure, die 15 g Natriumchlorid enthält. Bei dieser Temperatur werden l6o ml Essigester und anschliessend 3,3 g Natriumnitrit in 3 Portionen zugegeben. Unter ständigem Rühren wird bei -10° noch 5 Minuten reagieren gelassen. Die Essigesterphase wird abgetrennt, mit kalter 10-giger Kaliumhycrogencarbonatlösung gewaschen und mit Natriumsulfat getrocknet.

Die getrocknete Lösung wird mit einer Lösung, bestehend aus

909886/1696

g'H-Tyr-Ser-Nle-OMe-Hydrochlorid in 60 ml Dimethylformamid und 6 ml Triäthylamin, versetzt. Anschliessend dampft man den Essigester im Vakuum ab und lässt 1β Stunden bei 20° stehen. Das zurückgebliebene Lösungsmittel wird im 5 Vakuum eingedampft und der Rückstand in Essigester gelöst. Man wäscht mit verdünnter Phosphorsäure und Kaliumhydrogencarbonatlösung aus und trocknet über Natriumsulfat. Nach

Einengen des Lösungsmittels und Fällung mit Aether erhält

20

man 15 g CTB-D-Ser-Tyr-Ser-Nle-OMe. Smp. 135°$ taiL -6° in Methanol.

Man löst 11 g CTB-D-Ser-Tyr-Ser-Nle-OMe in 100 ml Methanol und versetzt mit 4,5 nil Hydrazinhydrat. Ueber Nacht lässt man bei 20° stehen, worauf das Produkt auskristallisiert. Man filtriert und wäscht mit Methanol und Petroläther. Man erhält 7,7 g CTB-D-Ser-Tyr-Ser-Nle-hydrazid vom Smp. 210°,

20
[o]q = +6,4° in Dimethylformamid.

Beispiel 5: D-Seryl-L-tyrosyl-L-seryl-L-norleucyl-L-glutarr.inyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophanyl-KIyCyI-L-IySyI-L-PrOIyI-L-VaIyI-EIyOyI-L-IySyI-L'-20 lysyl-L-arginyl-L-arginyl-L-prolyl-L-vg-lyl-L-lysyl-

L-valyl-L-tyros?/l-L-prolyl-L-valinamid (D-Ser-Tyr-Ser-Nle-Gln-His-Phe-Arg-Try-Gly-Lys-Pro-Val-Gly-Lys-Lys-Arg-Arg-Pro-Val-Lys-Val-Tyr-Pro-Val-NHg) · Man löst 2,0 g CTB-D-Ser-Tyr-Ser-Nle-NHNHg (Beispiel 4) in 25 12 ml Dimethylformamid, gibt 4 ml Wasser zu, kühlt auf -10°,

909886/1696

BAD ORIGINAL

gibt'2 ml β N Salzsäure zu, versetzt mit 280 mg Natriumnitrit, rührt 5 Minuten bei -5°, gibt 300 ml 0,2 N.Kaliusibicarbonatlösung hinzu und zentrifugiert. Man löst das erhaltene CTB-D-Ser-Tyr-Ser-Nle-N-, in 50 ml Dimethylformamid, versetzt mit 10,5 g H-Gln-(Trit)His-Phe-Arg-Try-Gly-(CT3)Lys-PrO-VaI-GIy-(CTB)IyS-(CTB)LyS-ATg-ArS-PrO-VaI-(CTB)Lys-Val-Tyr-Pro-Val-NHg · Acetat, lässt 12 Stunden bei 0° stehen, gibt noch eine weitere, aus 2,0 g CTB-D-Ser-Tyr-Ser-Nle-NHNH₂ hergestellte Menge von Tetrapeptidazid zu, lässt 6 Stunden bei 0° stehen, dampft ab, verarbeitet mit Essigester, wäscht mit heissem Aceton und Essigester und trocknet im Vakuum. Man löst das erhaltene Produkt in 100 ml 90-^iger Trifluoressigsaure, lässt 1 Stunde bei 20° unter Stickstoff stehen, dampft ab, verarbeitet mit Essigester, filtriert und trocknet. Man löst das erhaltene Produkt in 500 ml 0,2 N Essigsäure, behandelt die Lösung mit Amberlit-IRA-410 in Acetatform, filtriert und lyophilisiert. Nach Trocknen über Natriumhydroxyd erhält man H-D-Ser-Tyr-Ser-Nle-Gln-His-Phe-Arg-Try-Gly-Lys-Pro-Val-Gly-Lys-Lys-Arg-Arg-Pro-Val-Lys-Val-Tyr-Pro-Val-NHp · Heptaacetat · Dekahydrat, das sich bei der Chromatographie und der Elektrophorese homogen verhält (Totalhydrolyse gibt die folgende Aminosäurezusammensetzung: Ser_{o n}Tyr_n -JJIe_{1 A}Glu, ,HiS_{1 n}Phe_{n n}Arg_{v Λ}

c,υ J-ty ^tV ·*·#■*· ■*·»« u,y «^*w

909886/1696

99 ■

Mikroanalyse: Ber.: C 51,9 H 7,6 N l6,7 0 23,9 % Gef.: C 52,2 H 7,7 N 16,5 0 23,7 % Snip.: 210° mit Zers., Ca]^ = -8l° in 1 N Essigsäure.

909886/1696 ^BAD ORIGINAL

Claims (8)

Patentansprüche;

1. Verfahren zur Herstellung des Pentacosapeptids der Formel D-Seryl-L-tyrosyl-L-seryl-L-norleucyl-L-glutaminyl-L-hisfi- dyl-L-phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophanyl-glycyl-L-lysyl-L-prolyl-L-valyl-glycyl-L-lysyl-L-lysyl-L-arginyl-L-argi- nyl-L-prolyl-L-valyl-L-lysyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-prolyi-L-valinamid, seiner Säureadditionssalze und Schwermetal!komplexe, dadurch gekennzeichnet, dass man das Peptid der obigen Formel nach aus der Peptidchemie an sich bekannten Methoden darstellt und anschliessend gegebenenfalls auf an sich bekannte Weise in seine therapeutisch wirksamen Säureadditionssalze mit organischen oder anorganischen Säuren oder Polysäuren oder Schwermetallkomplexe überführt.

2. Verfahren zur Herstellung des bisher unbekannten Penta- ' cosapeptids der Formel D-Seryl-L-tyrosyl-L-seryl-L-norleucyl-L-glutaminyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophar.ylglycyl-L-lysyl-L-prolyl-L-valyl-glycyl-L-lysyl-L-lysyl-L-arginyl-L-arginyl-L-prolyl-L-valyl-L-lysyl-L-valyi-L-tyrosyl-L-prolyl-L-valinamid, seiner Salze und Schwermetalikomplexe, dadurch gekennzeichnet, dass man zweckmässigerweise unter Schutz der an der Reaktion nicht beteiligten Amino- und Carboxylgruppen, das Tetrapeptid D-Seryl-L-tyrosyl-L-seryl-L-norleucin oder ein Derivat dieses Tetrapeptide mit aktivierter endständiger Carboxylgruppe und das Henecosapep-id L-Glutaminyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl-L-tryatophanyl-glycyl-L-lysyl-L-prolyl-L-valyl-glycyl-L-lysyl-L-lysyi-

909886/1 696

J 10-2292

^ 15A3895

L-arginyl-L-arginyl-L-prolyi-L-valyl-L-lysyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-prolyl-L-valinamld oder ein Derivat dieses Henecosapeptids mit aktivierter α-Aminogruppe kondensiert, nach Beendigung der Kondensation die geschützten Aminogruppen und Carboxylgruppen in Freiheit setzt und, wenn erwünscht, das erhaltene Pentacosapeptid in seine therapeutisch wirksamen Salze oder Schwermetallkomplexe überführt.

3· Verfahren zur Herstellung des bisher unbekannter. Pentacosapeptids der Formel D-Seryi-L-tyrosyl-L-seryl-L-norleucyl-L-glutaminyl-L-histidyl-L-phenylaianyl-L-arginyl-L-tryptophanyl-glycyl-L-lysyl-L-prolyl-L-valyl-glycyl-L-lysyl-L- · iysyl-L-arginyl-L-arginyl-L-prolyl-L-valyl-L-lysyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-prolyl-L-valinamid, seiner therapeutisch wirksamen Säureadditionssalze· oder Schwermetallkomplexe, dadurch gekennzeichnet, dass man L-Valyl- ^-N-R-L-lysyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-prolyl-L-valinamid, worin R eine Carbotert.-butoxy-, eine Carbo-tert.-amyloxy-, eine Toluolsulfonyl-, eine Phthalyl-, eine Formyl- oder eine Trifluor-

20 acetyl-Gruppe bedeutet, mit dem N-Carbobenzoxy-L-valyl-

glycyl- £-N-R-L-lysyl~ £-N-R-L-lysyl-nitro-L-arginyl-nitro-L-arginyl-Lr-prolin, worin R obige Bedeutung hat, kondensiert, das erhaltene N-Carbobenzoxy-L-valyl-glycyl- £-N-R-L-lysylf-N-R-L-lysyl-nitro-L-arginyl-nitro-L-arginyl-L-

prolyl-L-valyl- ζ-N-R-L-lysyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-prolyl-L- -

909886/1696 BAD ORIGINAL

10-2292

valinamid, worin R obige Bedeutung hat, nach Abspaltung der Nitro- und Carbobenzoxy-Gruppe mit dem N-Triphenylmethyl-L-glutaminyl-Im-triphenylmethyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophanyl-glycyl-S-N-R-L-lysyl-L-prolin kondensiert und das erhaltene N-Triphenylmethyl-L-glutaminyl-Im-triphenylmethyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl-Btryptophanyl-glycyl-ζ-N-R-L-lysyl-L-prolyl-L-valyl-glycyl-£ -N-R-L-lysyl- £-N-R-L-lysyl-L-arginyl-L-arginyl-L-prolyl-L-valyl- £*-N-R-L-lysyl-L-vaiyl-L-tyrosyl-L-prolyl-L-valinamid, v/orin R obige bedeutung hat, nach Abspaltung der a-N-Triphenylmethyl-Gruppe mit dem N-R'-D-Seryl-L-tyrosyl-L-seryl-L-norleucylazid, worin R¹ eine Triphenylmethyl-, eine Carbo-tert.-butoxy- oder eine Carbotert.-amyloxy-, eine Carbobenzoxy-, eine Trifluoracetyl-, eine Acetyl-, eine Chloracetyl-, eine Formylgruppe bedeutet, kondensiert, die gesamten Schutzgruppen des erhaltenen n&uen, geschützten Pentacosapeptids N-R' -D-Seryl-L^tyrosyl-L-seryl-L-norleucyl-L-glutaminyl-Im-triphenylmethyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophanyl-glycyl-C-N-R-L-lysyl-L-prolyl-L-valyl-glycyl- £-N-R-L-lysyl- £-N-R-L-iysyl-L-arginyl-L-arginyl-L-prolyl-L-valyl- ^-N-R-L-lysyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-prolyl-L-valinamid, worin R und R' obige Bedeutung haben, in einer oder in mehreren Stufen abspaltet und das so erhaltene Pentacosapeptid gegebenenfalls anschliessend in seine therapeutisch wirksamen Säureadditionssalse oder Schwermetallkomplexe überführt.

909886/1696

10-2292

4. Verfahrer, zur Herstellung des bisher unbekannten Polypeptide der Formel D-Seryl-L-tyrosyl-L-seryl-L-norleucyl-L-gluta:ninyl-L-histidyl-L-phenyialanyl-L-arginyl-L-tryptophanyl-glycyl-L-lysyl-L-prolyl-L-valyl-glycyl-L-lysyl-L-5 lysyl-L-arginyl-L-arginyl-L-prolyl-L-valyl-L-lysyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-prolyl-L-valinamid, dadurch gekennzeichnet, dass man aus N-R'-D-Seryl-L-tyrosyl-L-seryl-L-norleucyl-L-glutaminyl-Im-triphenylmethyl-L-histidyl-L-phenylaianyi- L-arginyl-L-tryptophanyl-glycyl-C -N-R-L-lysyl-L-prolyl-

L-valyl-glycyl-£-N-R-L-lysyl-S-N-R-L-lysyl-L-arginyl-L-arginyl-L-prolyl-L-valyl-β-N-R-L-lysyl-L-valyl-L-tyrosyi-L-prolyl-L-valinamid, worin R und R¹ in der Peptidcheinie zum Schutz von Aminogruppen verwendete Schutzgruppen bedeuten, die Schutzgruppen in einer oder in mehreren Stufen abspaltet.

5· Verfahren nach Patentanspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass R eine Carbo-tert.-butoxy-, eine Carbo-tert.-amyloxy-, eine Carbobenzoxy-, eine Toluolsulfonyl-, eine Phthalyl-, eine Pormyl- und eine Trifluoracetyl-Gruppe und R' eine Triphenylmethyl-, eine Carbo-tert.-butoxy-,

eine Carbo-tert.-amyloxy-, eine Carbobenzoxy-, eine Trifluor acetyl-, eine Acetyl-, eine Chloracetyl und eine Formylgruppe bedeuten.

6. Verfahren zur Herstellung des bisher unbekannten PoIy-

909886/1696 ^{ßAD 0RIG}'^NAL

10-2292

pepti'ds der Formel D-Seryl-L-tyrosyl-L-seryl-L-norleucyl-L-glutaminyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-arsinyl-L-tryptophanyl-glycyl-L-lysyl-L-prolyl-L-valyl-glycyl-L-lysyl-L-lysyl-L-arginyl-L-arginyl-L-prolyl-L-vaiyl-L-lysyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-prolyl-L-valinamid, dadurch gekennzeichnet, dass man aus K-R' -D-Seryl-L-tyrosyl-L-seryl-L-norleucyl-L-glutaniinyl-Im-R"-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl-L-oryptophanyl-glycyl-£"-N-R-L-Iysyl-L-prolyl-L-valylglycylf-N-R-L-lysyl- <f-N-R-L-lysyl-L-arginia-L-arginyl-L-prolyl-L-valyl- £-N-R-L-lysyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-prolyl-L-valinamid, worin R und R¹ eine in der Peptidchemie zum Schutz der Aminogruppe verwendete Schutzgruppe und R" entweder eine Imidazol-Schutzgruppe oder wasserstoff bedeuten, diese Schutzgruppen in einer oder in mehreren Stufen abspaltet.

7. Pentaeosapeptid der Formel D-Seryl-L-tyrosyl-L-seryl-L-norleucyl-L-glutaminyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophanyl-glycyl-L-lysyl-L-prolyl-L-valyl-glycyl-L-lysyl-L-lysyl-L'-arginyl-L-arginyl-L-prolyl-L-valyl-L-lysyl-

L-valyl-L-tyrosyl-L-prolyl-L-valinamid.

8. Arzneimittel, dadurch gekennzeichnet, dass es das Pentaeosapeptid nach Anspruch 7 bzw. dessen Säureadditionssalze und Schwermetallkomplexe enthält.

Der Patentanwalt:

909886/1696

SANDOZ flCf