Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zur Herstellung von neuen Tetracosapeptiden der allgemeinen Formel 1 D-Seryl-L-tyrosyl-(L-seryl-L-norleucyl-X-L-histidyl-L -phenylalanyl-L arginyl-L-tryptophanyllycyl-L-lysyl*L- prolyl-L-valyl-glycyl-L-lysyl-L-lysyl-L-arginyl-L-arginyl -L-prolyl-L-valyl-L-lysyl-L-valyl-L-tyrosylbprolin, worin X einen L-Glutamyl- oder L-Glutaminylrest bedeutet, dadurch gekennzeichnet, dass man entsprechende, zu seinem Aufbau notwendige Aminosäuren unter Bildung von CONH-Bindungen in beliebiger zeitlicher Reihenfolge miteinander kondensiert, wobei man nicht an der Reaktion teilnehmende Gruppen durch Einführung von zum Schutz solcher Gruppen geeigneten Schutzgruppen schützt,
die nach erfolgter Kondensation abgespalten werden und gegebenenfalls die Säureadditionssalze herstellt. indem man das Tetracosapeptid durch Umsetzung mit organischen Spuren in die entsprechenden Sal- ze überführt.
Das so erhaltene neue Tetracosapeptid kann zur Darstellung von Schwermetallkomplexen verwendet werden, indem man das Tetracosapeptid der obigen Formel durch Umsetzung mit Schwermetallsalzen in die entsprechenden Schwermetallkomplexe überführt. Die unter die allgemeine Formel I fallenden Tetracosapeptide können in abge- kürzter Schreibweise wie folgt bezeichnet werden: D*Serl-Nle4-Tetracosapeptid und D-Ser1-Nle4-Gln5-Tetracosapeptid.
Es war bereits aus dem belgischen Patent Nr. 653 017 bekannt, dass man ein Tetracosapeptid der Sequenz L-Seryl-L-tyrosyl-L-seryl-L-norleucyl-L-glutamyl-L -histidyl-L-pbenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophanylycyl- -L-lysyl-L-prolyl-L-valylslycylzL-lysyl-L-lysyl-L.
-arginyl-L-arginyl L-prolyl-lzvalyl L-lysyl-L-valyl L -tyrosyl-L-prolin mit corticotroper Wirkung, im nachstehenden mit Nle4- Tetracosapeptid bezeichnet, synthetisieren kann.
Nle4-Tetracosapeptid besitzt gegenüber dem natürlichen ACTH bereits folgende Vorteile:
1. Es hat als synthetisches Produkt im Gegensatz zum natürlichen ACTM keine antigenen Eigenschaften.
2. Im Gegensatz zum Methioninrest des natürlichen A ist der Norleucinrest in Steflung 4 gegen Oxydation unempfindlich.
Nle4-Tetracosapeptid ist jedoch noch, da es ebenso wie das natürliche ACIM in Stellung 1 einen L-Serinrest aufweist, gegenüber dem Abbau von Aminopeptidasen sehr empfindlich.
Es wurde nun gefunden. dass man durch Ersatz des L-Serinrestes in Stellung 1 durch einen Serinrest zu neuen Tetracosapeptiden der allgemeinen Formel I mit hoher adrenocorticotroper Wirkung gelangt, die nicht nur sämtliche Vorteile des Nle4-Tetracosapeptides gegenüber dem natürlichen ACTH besitzen, sondern auch noch zusätzlich gegenüber der abbauenden Wirkung der Aminopeptidasen stabil sind.
Überraschenderweise wurde nun auch festgestellt, dass beim D-Ser1-Nle4-Tetracosapeptid der Glutaminsäurerest in Stellung 5 durch einen Glutaminrest ohne Verlust der biologischen Wirkung ersetzt werden kann. Die auf diese Weise erhaltenen Verbindungen D-Ser1-Nle4-Tetracosa- peptid und D-Ser1-Nle4-Gln5-Tetracosapeptid weisen sämtliche oben beschriebenen Vorteile des D-Ser1-Nle4- -Tetracosapeptides gegenüber dem natürlichen ACH auf.
Die neuen Tetracosapeptide der allgemeinen Formel I können nach für die Synthese von Verbindungen dieser Art allgemein bekannten Methoden hergestellt werden, wobei die Aminosäuren in der, in der obigen Formel festgelegten Reihenfolge einzeln oder nach vorheriger Bildung kleinerer Peptideinheiten miteinander verknüpft werden.
Erfindungsgemäss können die neuen Tetracosapeptide der allgemeinen Formel I beispielsweise hergestellt werden, indem man L-Valyl-#-N-R-L-lysyl-L-valyl-L-ty- rosyl-L-prolin-tert.butylester, worin R eine Carbo-tert. -butoxy- oder eine Carbo-tert.-amyloxy-, eine Toluolsulfonyl-, eine Phthalyl-, eine Formyl- oder eine Trifluorace tyl-Gruppe bedeutet, mit dem N-Carbobenzoxy-L-valyl- -glycyl-#-N-R-L-lysyl-#-N-R-L-lysyl-nitro-L-arginyl-nitro- -l--arginyl-L-prolin, worin R obige Bedeutung hat, kondensiert, das erhaltene N-Carbobenzoxy-L-valyl-glycyl-#-N-R-L-lysyl-#-N-R-L- -lysyl-nitro-L-arginyl-nitro-L-arginyl-L-prolyl-L-valyl -#-N-R-L-lysyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-prolin-tert.butylester, worin R obige Bedeutung hat,
nach Abspaltung der Carbobenzoxygruppe und der Nitrogruppen mit dem N-Tri phenylmethyl-LSlutaminyl (oder y-O-tert. -butyl-L-glut- amyl)- Im-triphenylmethyl-L-histidyl - L - phenylalanyl-L- -arginyl- L - tryptophanyl-glycyl - e-N-R-L - lysyl-L-prolin, worin R obige Bedeutung hat, kondensiert, das erhaltene N-Triphenylmethyl-L-glutaminyl (oder γ
;-O-tert.-butyl-L- -glutamyl)-Im-triphenylmethyl-L-histidyl-L-phenylalanyl -L-arginyl-L-tryptophanyl-glycyl-#-N-R-L-lysyl-L -propyl-L-valyl-glycyl-#-N-R-L-lysyl-#-N-R-L-lysyl-L -arginyl-L-arginyl-L-prolyl-L-valyl-#-N-R-L-lysyl-L- -valyl-L-tyrosyl-L-prolin-tert.butylester, worin R obige Bedeutung hat, nach Abspaltung der N -Triphenylmethyl-Gruppe mit dem N-R'-D-Seryl-L-ty rosyl-L-seryl-L-norleucylazid, worin R' eine Triphenylmethyl-, eine Carbo-tert.-butoxy- oder eine Carbo-tert. -amyloxy-, eine Carbobenzoxy-, eine Trifluoracetyl-, eine Acetyl-, eine Chloracetyl- oder eine Formylgruppe bedeutet, kondensiert und die gesamten Schutzgruppen der erhaltenen neuen, geschützten Tetracosapeptide N-R'-D-Seryl-L-tyrosyl-L-seryl-L-norleucyl-L-glutaminyl (oder γ
;-O-tert.-butyl-L-glutamyl)-Im-triphenylmethyl-L- lll5tidyl-L-phenylalanyl-L-arginylL-tryptophanyi-giycyl- -#-N-R-L-lysyl-L-prolyl-L-valyl-glycyl-#-N-R-L-lysyl -t-N-R-L lysyl-L-arginyl-L-arginyl-L-prolyl-L-valyl-t- -N-R-L-lysyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-prolin-tert.-butylester, worin R und R' obige Bedeutung haben. in einer oder in mehreren Stufen im sauren Milieu abspaltet.
,Die Ausgangsprodukte zur Herstellung der neuen Tetracosapeptide der allgemeinen Formel I können, sofern sie bisher noch nicht bekannt waren, nach den für die Peptidchemie bekannten Methoden erhalten werden, wobei die Aminosäuren einzeln oder nach vorheriger Bildung kleinerer Peptideinheiten miteinander verknüpft werden.
Die neuen Tetracosapeptide der allgemeinen Formel I lassen sich auch in Form ihrer Salze gewinnen bzw. verwenden. Als Salze kommen solche mit organischen Säuren, wie Essigsäure, Propionsäure, Glykolsäure, Milchsäure, Brenztraubensäure. Malonsäure, Bernsteinsäure, Maleinsäure, Fumarsäure, Weinsäure, Zitronensäure, Benzoesäure, Zimtsäure, Salicylsäure, 2-Phenoxy- oder 2 Acetoxybenzoesäure, Mandelsäure, Methansulfonsäure, Äthansulfonsäure, Hydroxyäthansulfonsäure. Benzol- od.
Toluolsulfonsäure, Naphthalinsulfonsäure, Sulfanilsäure sowie polymere Säuren wie Gerbsäure, Alginsäure. Po lygalacturonsäure, Polyphloretinphosphat, oder Carhoxy methylcellulose und Salze mit anorganischen Säuren wie
Halogenwasserstoffsäure, z.B. Salzsäure oder Bromwas serstofvfsäure, Salpetersäure, Thiocyansäure, Schwefelsäu re und Phosphorsäure in Frage. Als Schwermetallkom plex kommt z.B. derjenige des Zinks in Frage.
Die neuen Tetracosapeptide der allgemeinen Formel I ihre Salze und Schwermetallkomplexe können beispielsweise für die Behandlung der folgenden Erkrankungen verwendet werden: Akuter und chronischer Gelenkrheumatismus, Colitis ulcerosa, Nephrose, Kollagenosen, wie zB. Lupus erythematodes, Sklerodermie usw., Allergische Erkrankungen der verschiedenen Organsysteme, wie Asthma bronchiale, jEkzem, Urticaria, Dermatitis exfoliativa, anaphylaktischer Schock usw., Tumoren, wie z.B. Leukämien, Lymphosarcomen, Reticulosarcomen usw., zur Verhinderung der Nebennierenrindenatrophie bei der Therapie mit Corticosteroiden, Insuffizienzerscheinungen der Hypophyse.
Ein wesentlicher Vorteil gegenüber natürlichem, aus tierischem Material extrahiertem Hormon liegt darin, dass den synthetischen neuen Tetracosapeptiden der allgemeinen Formel I antigene Eigenschaften fehlen. Sie können somit bei den oben erwähnten Erkrankungen auch dann unbedenklich verwendet werden, wenn beim Patienten im Verlauf einer früheren Behandlung mit natürlichem ACflH allergische Erscheinungen auftraten.
In den für die Standardisierung üblichen und anerkannten Tests besitzen die neuen Tetracosapeptide der allgemeinen Formel I im Vergleich zum natürlichen Corticotropin folgende biologische Wirksamkeit: 625 ( + 150) Corticotropin lE pro mg D-Serl-Nle4-Tetracosapeptid 650 (1 150) Corticotropin IE pro mg D-Serl-Nle4-Gln6- -Tetracosapeptid
Zur Testung der verfahrensgemäss hergestellten Tetracosapeptide diente der 3. Internationale Standard für Corticotropin, welcher in Form des International Standard of Corticotropin zur Verfügung steht und die Einstellung von ACTH-Präparaten auf Internationale Einheiten ermöglicht.
Es hat sich herausgestellt, dass die neuen Tetracosapeptide nach intravenöser Verabreichung eine längere Wirkungsdauer besitzen als die bisher bekannten natürlichen und synthetischen ACTH-Präparate, was einen bedeutenden technischen Fortschritt darstellt. Die ;Dosie- rung der verfahrensgemäss hergestellten Tetracosapeptide variiert ungefähr zwischen 40 und 60 IE pro Tag, in besonderen Fällen zwischen 10 und 100 IE pro Tag.
Die unerwartete, bei der Standardisierung festgestellte hohe Wirksamkeit der neuen Tetracosapeptide hat sich bei der therapeutischen Anwendung voll bestätigt, so dass die neuen Tetracosapeptide auf Gewichtsbasis stärker wirken als alle. bis jetzt bekannten natürlichen und synthetischen ACTH-Präparate.
,Die neuen Tetracosapeptide der allgemeinen Formel I können als Heilmittel, z.B. in Form pharmazeutischer Präparate, Verwendung finden. Diese enthalten die genannten Verbindungen in Mischung mit einem für die parenterale Applikation geeigneten organischen oder anorganischen Trägermaterial. Für dasselbe kommen solche Stoffe in Frage, die mit den neuen Verbindungen nicht reagieren, wie z.B. Gelatine, Milchzucker, Stärke, Magnesiumstearat, Talk, pflanzliche öle, Benzylalkohole, Gummi arabicum, Polyalkylenglykole, Vaseline, Chol esterin oder andere bekannte Arzneimittelträger. Die pharmazeutischen Präparate können z.B. in flüssiger Form als Lösungen, Suspensionen oder Emulsionen vor liegen. Gegebenenfalls sind sie sterilisiert und bzw. oder enthalten Hilfsstoffe wie Konservierungs-, Stabilisierungs-,
Netzmittel oder Emulgiermittel.
Sie können auch noch andere, therapeutisch wertvolle Stoffe enthalten. Die neuen Verbindungen können wie natürliches ACH auch in Form eines Depotpräparates verabreicht werden.
Die neuen Tetracosapeptide der allgemeinen Formel I und ihre Salze können auch als Zwischenprodukte zur Herstellung von pharmazeutischen Präparaten Verwendung finden.
Beim Aufbau der neuen Tetracosapeptide haben sich für die Blockierung der Aminogruppe des Serinrestes die Triphenylmethyl-, die Carbo-tert.-butoxy- und die Carbo -tert.-amyloxy-Gruppe bewährt, doch können auch an dere geeignete Schutzgruppen wie die Carbobenzoxy-, die Trifluoracetyl-, die Acetyl-, die Chloracetyl-, die Formylgruppe verwendet werden.
Für die Blockierung der e-Aminogruppe des Lysinrestes hat sich die Carbo-tert.-butoxy- und die Carbo-fert. -amyloxy-Gruppe bewährt, doch können auch andere geeignete Schutzgruppen wie die Carbobenzoxy-, die Toluolsulfonyl-, die Phthalyl-, die Formyl- und die Trifluor -acetyl-Gruppe verwendet werden.
Für die Blockierung der -Carboxyl-Gruppe des Glutaminsäurerestes hat sich die tert.-Butyloxy-Gruppe bewährt doch können auch andere geeignete Schutzgruppen, wie die Methoxy, die Äthoxy, die tert.-Amyloxy-, die Amid- oder die Benzyloxygruppe verwendet werden.
Für die Blockierung der Imidazolgruppe des Histidinrestes hat sich die Triphenylmethylgruppe bewährt, doch können auch andere geeignete Schutzgruppen, wie die Carbo-tert.-butoxy-, die Carbo-tert.-amyloxy-, die Carbobenzoxy- oder die Benzylgruppe verwendet werden.
Für die Blockierung der Guanidogruppe der Argininreste wurde die Nitro-Gruppe verwendet, doch können auch andere geeignete Schutzgruppen. wie die Tosylgruppe, die p-Nitrocarbobenzoxygruppe oder die 24Isopro- pyloxycarbonyl) - 3,4,5,6 - tetrachlorobenzoylgruppe verwendet werden. Man kann auch den Schutzeffekt der Protonisierung der Guanidogruppe bei der Synthese verwenden.
Es werden folgende Abkürzungen verwendet: CBO = Carbobenzox Trit = Trityl = Triphenylmethyl = = Carbo-tert.-butyloxy NO2 = nitro OGP = 2,4,5-Trichlorphenoxy OTB = tert. -Butyloxy OMe = Methoxy OBt = Äthoxy Arg = L-arginyl Glu = L-glutamyl Gln = L-glutaminyl Gly = Glycyl His = L-histidyl Lys = L-lysyl Nle = L-norleucyl Phe = L-phenylalanyl Pro = L-prolyl Ser = iL-wyl D-Ser = Try = Ltry$o-ny1 Tyr = L-tyrosyl Val = L-valyl Im = Imidazol:
In den folgenden Beispielen, die die Ausführung des Verfahrens erläutern, den Umfang der Erfindung aber in keiner Weise einschränken sollen, erfolgen alle Temperaturangaben in Celsiusgraden.
Beispiel I
L-Valyl-glycyl-carbo-tert.-butoxy-L-lysyl-carbo -tert.-butoxy-L-lysyl-L-arginyl-L-arginyl-L-prolyl-L -valyl-carbo-tert.-butoxy-L-lysyl-L-valyl-L-tyrosyl-L -prolin-tert.-butylester [H.Val-Gly-(CTB)Lys-(CTB)Lys -Arg-Arg-Pro-Val-(CTB)Lys-Val-Tyr-Pro-OTB]
Man löst 56 g CBO-Val-Gly-(CTB)Lys-(CTB)Lys- -(NO2)Arg{NO)Arg-Pro-OH in 900 ml Dimethylform- amid und 900 ml Tetrahydrofuran. Nach Zugabe von 6,2 ml Triäthylamin wird die Lösung auf - 100C abge kühlt und bei dieser Temperatur mit 4,2 ml Alorameisen säureäthylester versetzt. Nach 10 Min. werden 34 g H -Val-(CTB)Lys-Val-Tyr-Pro-OTB in 160 ml Dimethylformamid zugegeben und über 16 Stunden bei 200 weitergerührt.
Das Lösungsmittel wird im Vakuum verdampft und der Rückstand mit Wasser ausgewaschen, Man löst das Peptid in heissem Äthanol und ssUlt mit Essigester aus. Nach Abrutschen und Trocknen erhält man 70 g CBO - Val - Gly - (CTB)Lys - (CTB)Lys-(NO2)Arg -(NO2) Arg-Pro-Val-(CTB)Lys-Val-Tyr-Pro-OTB vom Smp.
190 (mit Zers.). [α]D20 = -38 in Dimethylformamid.
Man löst 70 g CBO-Val-Gly-(CTB)Lys-(CTB)Lys- -(NO2)Arg-(NO2)Arg - Pro-Val-(CTB)Lys - Val - Tyr-Pro -OTB in 1,5 L 80%iger Essigsäure versetzt mit Palla dium-Katalysator, hydriert bis zur Beendigung der Was serstoffaufnahme und filtriert vom Katalysator ab. Nach Einengen löst man den RLJcd in 500 ml Methanol auf. kühlt auf - 5 C, versetzt mit 4,1 g p-Toluolwlf säure und fällt anschliessend mit Äther. Man erhält 65 g H - Val - Gly - (CTB)Lys - (CTB)Lys - Arg - Arg - Pro - Val -(CrB)Lys-Val-Tyr-Pro-OTB als Trit-toluolsulfonat vom Smp. 1820 (mit Zers.). [α]D20 = 440 m Dimethylform- amid.
Beispiel 2
O-tert.-butyl-L-glutamyl-im-trityl-L-histidyl-L-phenyl alanyl-L-arginyl-L-tryptophanyl-glycyl-N-carbo-tert. -butoxy-L-lysyl-L-prolyl-L-valyl-glycyl-N-carbo-tert. -butoxy-L-lysyl-N-carbo-tert.-butoxy-L-lysyl-L-arginyl -L-arginyl-L-prolyl-L-valyl-N-carbo-tert.-butoxy-L-lysyl -L-valyl-L-tyrosyl-L-prolin-tert.-butylester [H-(OTB)Glu -(Trit)His-Phe-Arg-Try-Gly-(CTB)Lys-Pro-Val-Gly -(CTB)Lys-(CTB)Lys-Arg-Arg-Pro-Val-(CTB)
Lys-Val-Tyr-Pro-OTB]
Man löst 61 g H-Val-Gly-(CTB)Lys-(CTB)Lys-Arg- -Arg-Pro-Val-(CTB)Lys-Val-Tyr-Pro-OTB . 3 Tos-OH in 300 ml Pyridin und 300 ml Acetonitril auf. Anschliessend gibt man 57 g Trit-(OTB)Glu-CTnt)His-Phe-Arg-Try- -Gly-(CTB)Lys-Pro-OH zu und wenn alles in Lösung ist, kühlt man auf OOC ab, versetzt mit 28,6 g Dicyclohexylcarbodiimid.
Nach 24stündigem Schütteln bei 200 wird der Harnstoff abfiltriert und die Lösung mit Äther ge fällt. Das Produkt wird wiederholt in Methanol gelöst und mit Essigester gefällt.
Man erhält 88 g Trit-(OTB)Glu-(Trit)His-Phe-Arg -Try-Gly-(CTB)-Lys - Pro - Val - Gly-(CTB)Lys-(CTB)Lys -Arg-Arg-Pro- Val-(CTB)Lys-Val-Tyr- Pro - OTB Tri-toluolsulfonat. Smp. 1890 mit Zers. [ ]D20 = - 530 in Methanol.
Man löst 45 g Trit-(OTB)Glu-(Trit)His-Phe-Arg-Try -Gly-(CTB)Lys-Pro-Val - Gly-(CTB)Lys - (CTB)Lys-Arg -Arg-Pro-Val-(CTB)Lys-Val-Tyr-Pro-OTB . 3 Tos-OH in 500 ml 80%iger Essigsäure und lasst 2 Stunden bei 300 stehen. Man gibt 50 ml Amberlit IRA-410 in Azetatform zu, filtriert, verdampft im Vakuum und löst den Rückstand in Methanol auf. Nach Fallen mit Ather erhält man 40 g H-(OTB)Glu-(Trit)His - Phe-Arg-Try-Gly -(CTB)Lys-Pro-Val-Gly-(CTB)Lys - (CTB)Lys - Arg-Arg -Pro-Val-(CTB)Lys-Val-Tyr-Pro-OTB. Zersetzung bei 183 , [a]D90 = - 470 in Methanol.
Beispiel 3 N Trityl-L-Glutaminyl-lm-trityl-L-histidyl-L-phenyl- alanyl-L-arginyl-L-tryptophanyl-glycyl-N-carbo -tert.butoxy-L-lysyl-L-proline [Trit-Gln-(Trit)His-Phe -Arg-Try-Gly-(CTB)Lys-Pro-OH]
Man löst 45 g H-His-Phe-OMe 2 HBr und 26 ml Triäthylamin in 100 ml Dimethylformamid, rührt 10 Min. bei 0 . filtriert, gibt dem Filtrat 45 g @BO-Gln-OCP zu und lässt 16 Std. bei 200 stehen. Man dampft das Dimetylformamid ab, löst den Rückstand in Essigester, wäscht mit verdünntem Essigsäure-Wasser und 1 N Na triumbicarbonatlösung > trocknet über Natriumsulfat, dampft ab und kristallisiert den Rückstand aus Essigester. Man erhält 38 g CBO-Gln-His-Phe-OMe.
Smp 1870. Man löst das aben erhaltene Tripeptid in 300 ml Methanol und 33 ml HCI 2 N, hydriert in Anwesenheit von 5 g Palladium-Kohle 10%, filtriert, dampft ab, löst den Rückstand in 150 ml Methylenchlorid. kühlt auf 0 , gibt 21 ml Triäthylamin und anschliessend 27 g Triphe nylchlormethan zu, lässt 16 Std. bei 200 stehen, wäscht mit verdünnter Essigsäure, Wasser und 1 N Natriumbicarbonatlösung, trocknet und dampft ab. Man löst den Rückstand in Diäthyläther und fällt mit Petroläther. Man erhält 49 g Tri-Gln-(Tri)His-Phe-OMe. das man in 100 ml Methanol löst. Man gibt 5 ml Hydrazin zu. Iässt 24 Std. bei 200 stehen, konzentriert auf 50 ml gibt 500 ml Diäthyläther zu, wäscht mit 0,1 N Kochsalzlösung, trocknet,konzentriert auf 50 ml und fällt mit Petroläther. Man erhält 40 g Tri-Gln-(Tri)His-Phe-NHNH2.
Smp. 850 mit Zers. [a]D20 = - 150 in Dimethylformamid.
Man löst 40 g Tri-GIn-(Tri)His-Phe-NHNH2 in 100 ml Dimethylformamid und 100 ml Isopropanol, kühlt auf -100 und gibt 40 ml 4 N Salzsäure und, anschliessend, unter Rühren 9 ml 5 N Natriumnitritlösung zu. Nach 5 Min. fügt man 28 ml Triäthylamin und 1000 ml Eiswasser zu, nutscht ab, löst den Niederschlag in Essigester, wäscht mit einer gesättigten Kochsalzlösung. trocknet, dampft bei 0 ab, löst den Rückstand in 100 ml Dimethylformamid, gibt 26 g H-Arg-Try-Gly-(CTB)Lys-Pro-OH, 3 Fig. A. Herstellung von H-Val-Gly-(R)Lys-(R)Lys-Arg-Arg-Pro-Val-(R)Lys-Val-Tyr-Pro-OTB
EMI4.1
R = CTB oder CAT
EMI4.2
Fig. B.
Herstellung von H-D-Ser-Tyr-Ser-Nle-Glu(R")His-Phe-Arg-Try-Gly-Lys-Pro-Val-Gly-Lys-Lys-Arg-Arg-Pro-Val-Lys-Val-Tyr-Pro-OH
EMI4.3
RR = CTB oder CAT R' = NH2 oder OTB R" = NH2 oder OH
EMI4.4
AcOH und 4,5 ml Triäthylamin zu, lässt 16 Stunden bei 00 stehen, gibt 1000 ml Essigester zu, wäscht mit 0,5 N Essigsäure, Wasser und 0,5 N Pyritln, dampft ab, löst den Rückstand in 100 ml Essigester und fällt mit Diäthyl äther. Man erhält 55 g TriN3lnari)His-Phe-Arg-Try- -Gly-(CTB)Lys-Pro-OH, Smp. 185 [α]D20 = - 15 in Dimethylformamid.
Beispiel 4
L-Glutaminyl-Im-trityl-L-histidyl-L-phenylalanyl-L arginyl-L-tryptophanyl-glycyl-N-carbo-tert-butoxy-L -lysyl-L-prolyl-L-valyl-glycyl-N-carbo-tert.-butoxy-L -lysyl-N-carbo-tert.-butoxy-L-lysyl-L-arginyl-L-arginyl -L-prolyl-L-valyl-N-carbo-tert.-butoxy-L-lysyl-L-valyl -L-tyrosyl-L-prolin-tert.butylester [H-Gln-(Trit)His-Phe -Arg-Try-Gly-(CTB)Lys-Pro-Val-Gly-(CTB)Lys-(CTB)
Lys-Arg-Arg-Pro-Val-(CTB)Lys-Val-Tyr-Pro-OTB]
Man löst 60 g H- Val-Gly-(CTB)Lys-(CTB)Lys-Arg -Arg-Pro-Val-(CTB)Lys-Val-Tyr-Pro-OTB . 3 Tos-OH in 30 ml Pyridin und 300 ml Acetonitril auf. Anschliessend gibt man 55 g Trit-Gin-(Trit)His-Phe-Arg-Try-Gly -(CTB)Lys-Pro-OH zu und wenn alles in Lösung ist, kühlt man auf 0 ab, versetzt mit 28,6 g Dicyclohexylcarbodiimid.
Nach 24stündigem Schütteln bei 20 wird der Harn- Stoff abfiltriert und die Lösung mit Äther gefällt. Das Produkt wird wiederholt in Methanol gelöst und mit Essigester gefällt.
Man erhält 87 g Trit-Gln-(Trit)His-Phe-Arg-Try-Gly -(CTB)Lys-Pro-Val-Gly-(CTB)Lys - (CTB)Lys - Arg-Arg -Pro- Val-(CTB)-Lys - Val- Tyr - Pro-OTB Tritoluolsulfat.
Smp. 180 mit Zers. [α]D20 = - 50 in Methanol.
Man löst 43 g Trit-Gln-(Trit)His-Phe-Arg-Try-Gly -(CTB)Lys-Pro- Val-Gly-(CTB)Lys-(CTB)Lys - Arg - Arg -Pro- Val-(CTB)Lys-Val-Tyr-Pro-OTB 3 Tos-OH in 500 ml 80%iger Essigsäure und lässt 2 Stunden bei 30 stehen. Man gibt 50 ml Amberlit IRA-410 in Azetatform zu, filtriert, verdampft im Vakuum und 16st den Rückstand in Methanol auf. Nach Fällen mit Äther erhält man 39 g H-Gln-(Trit)His-Phe-Arg-Try-Gly-(CTB)Lys-Prp -Val-Gly-(CTB)Lys-(CTB)Lys-Arg-Arg-Pro-Val - (CTB) Lys-Val-Tyr-Pro-OTB. Zersetzung bei 170 . [α]D20 = - 44 in Methanol.
Beispiel 5
Carbo-tert.-butoxy-D-Seryl-L-tyrosyl-L-seryl-L -norleucin-hydrazid. (CTB-D-Ser-Tyr-Ser-Nle-NHNH2)
Man löst 60 g DSerinmethylester hydrochlorid in 200 ml Dimethyl-formamid und 54 ml Triäthylamin, kühlt auf 00 und filtriert das Triäthylaminhydrochlorid ab. Dimethylformamid wird bei Hochvakuum eingedampft und der Rückstand in 150 ml Pyridin aufgelöst.
Man tropft 100 g tert.-13utoxycrbonylazid zu und lässt 2 Tage bei 200 stehen.
Man dampft das Lösungsmittel ab und nimmt das Produkt in Essigester auf. Nach Waschen mit Wasser, verdünnter Salzsäure und Kaliumhydrogencarbonat-Lösung trocknet man über Natriumsulfat.
Nach Abdampfen des Essigesters bleibt das CTB-D -Ser-OMe als ein öl zurück. Man löst den Ester in 500 ml Methanol auf und lässt mit 50 ml Hydrazinhydrat 2 Tage bei 200 stehen. Nach Verdampfen des Methanols kristallisiert das Hydrazid. Aus heissern Essigester umkristallisiert isoliert man 53 g CTB-D-Ser-NHNH2 vom Smp.
114 . [α]D21 - 3 in Dimethylformamid.
Man löst 54 g H-Ser-Nle-OMe . HCl und 63 g CBO - Tyr-OH in 860 ml Azetonitril, kühlt auf 0 , gibt 28 ml Triäthylamin zu, kühlt auf -100 und gibt 41 g Dicyclohexylcarbodiimid zu. Das Gemisch wird während 16 Std.
bei 00 gerührt, dann abfiltriert. Der Niederschlag wird mit 1400 ml Pyridin gewaschen. Die vereinigten Filtrate werden abgedampft und der Rückstand aus Essigester kristallisiert. Man erhält 101 g CBO-Tyr-Ser-Nle-OMe (Smp. 140-142 [a]D20 = - 150 in Dimethylformamid).
Man löst 51 g von dem so erhaltenen Produkt in 2 L einer 1 N Lösung von HCI in Methanol und hydriert in Anwesenheit von 10 g Palladium/Kohle. Nach ca. 2 Std.
beendigt die Aufnahme des Wasserstoffs. Man filtriert, dampft ab und kristallisiert den Rückstand aus einem Gemisch von Methanol-Äther (3:1). Man erhält 42 g H-Tyr-Ser-Nle-OMe HCl. Smp. 2270. t ]D20 = - 70 in Dimethylformamid.
Man löst bei - 10 C 10 g CTB-D-Serinhydrazid in 136 ml 1 N Salzsäure die 15 g Natriumchlorid enthält, Bei dieser Temperatur werden 160 ml Essigester und anschliessend 38 g Natriumnitrit in 3 Portionen zugegeben.
Unter ständigem Rühren wird bei -100 noch 5 Minuten reagieren gelassen. Die Essigesterphase wird abgetrennt, mit kalter 10%iger Kaliumhydrogencarbonatlösung gewaschen und mit Natriumsulfat getrocknet. Die getrocknete Lösung wird mit einer Lösung bestehend aus 13 g H-Tyr-Ser-Nle-OMe Hydrochlorid in 60 ml Dimethylformamid und 6 ml Triäthylamin versetzt. Anschliessend dampft man den Essigester im Vakuum ab und lässt 16 Stunden bei 200 stehen.
Das zurückgebliebene Lösungsmittel wird im Vakuum eingedampft und der Rückstand in Essigester gelöst. Man wäscht mit verdünnter Phosphorsäure und Kaliumhydrogencarbonatlösung aus und trocknet über Natriumsulfat.
Nach Einengen des Lösungsmittels und Fällung mit Äther erhält man 15 g CTB-D-Ser-Tyr-Ser-Nle-OMe. Smp.
1350. [α]D20@ = - 60 in Methanol.
Man löst 11 g CTB-D-Ser-Tyr-Ser-Nle-OMe in 100 ml Methanol und versetzt mit 4.5 ml Hydrazinhydrat.
Über Nacht lässt man bei 200 stehen, worauf das Produkt auskristallisiert. Man filtriert und wäscht mit Methanol und Petroläther. Man erhält 77 g CrB.D-Ser-Tyr-Ser- -Nle-hydrazid vom Smp. 2100. [a]D20' = + 6,40 in Dimethylformamid.
Beispiel 6
D-Seryl-L-tyrosyl-L-seryl-L-norleucyl-L-ghutamyl-L -histidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophanyl -glyeyl-L4ysyl-L-prolyl-L-valyl-glycyl-L4ysyl-L4ysyl-L- arginyl-L-arginyl-L-prolyl-L-valyl-L-lysyl-L-valyl-L- -tyrosyl-L-prolin. [D-Ser-Tyr-Ser-Nle-Glu-His-Phe-Arg -Try-Gly-Lys-Pro-Val-Gly-Lys-Lys-Arg-Arg-Pro-Val -Lys-Val-Tyr-Pro-OH]
Man löst 2 > 0 g CTB-D-Ser-Tyr-Ser-Nle-NHNH2 (Bsp.
5) in 12 ml Dimethylformamid, gibt 4 ml Wasser zu. kühlt auf - 10 , gibt 2 ml 6 N Salzsäure zu, versetzt mit 280 mg Natriumnitrit, rührt 5 Min. bei -5 , gibt 300 ml 0,2 N Kaliumbicarbonatlösung hinzu und zentrifugiert. Man löst das erhaltene CTBJD-Ser-Tyr-Ser-Nle-Ns in 50 ml Dimethylformamid, versetzt mit 10,5 g H-Glu(OTB)- -(Trit)His - Phe - Arg - Try - Gly - (CTB)Lys - Pro - Val-Gly -(CTB)Lys-(CTB)Lys-Arg-Arg-Pro - Val-(CTB)Lys- Val -Tyr-Pro-OTB Azetat, lässt 12 Std. bei 00 stehen, gibt noch eine weitere, aus 2,0 g CIB-D-Ser-Tyr-Ser-Nle- -NHNH, hergestellte Menge von Tetrapeptidazid zu, lässt 6 Std. bei 00 stehen, dampft ab, verarbeitet mit Essig ester, wäscht mit heissem Azeton und Essigester und trocknet im Vakuum.
Man löst das erhaltene Produkt in
100 ml 90%'iger Trifluoressigsäure, lässt 1 Std. bei 200 unter Stickstoff stehen, dampft ab, verarbeitet mit Essigester, filtriert und trocknet. Man löst das erhaltene Produkt in 500 ml 0,2 N Essigsäure, behandelt die Lösung mit Amberlit-IRA-410 in Azetatform, filtriert und lyophilisiert.
Nach Trocknen über Natriumhydroxyd erhält man 7,3 g H D-Ser-Tyr-Ser-Nle-Glu-His - Phe-Arg-Try-Gly -Lys-Pro-Val-Gly- Lys - fiLys - Arg-Arg-Pro - Val - Lys-Val- -Tyr-Pro-OH Heptaacetat Dekahydrat, das sich bei der Chromatographie und der Elektrophorese homogen verhält. (Totalhydrolyse gibt die folgende Aminosäurezusammensetzung: Ser2,0Tyr2,1Nle1,0Glu1,0His1,1Phe0,9Arg3,1Gly2,1Lys3,9 Pro3,0Val2,9) Mikroanalyse:
Ber.: C 51,6 H 7,4 N 15,9 0 25,0
Gef.: C 51,4 H 7,3 N 15,7 0 25,2 Smp.: 2060 mit Zers. []D20 = - 820 in 1 N Essigsäure.
Beispiel 7
D-Seryl-L-tyrosyl-L-seryl-L-norleucyl-L-glutaminyl-L -histidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophanyl-glycyl- -L-lysyl-L-prolyl-L-valyl-glycyl-L-lysyl-L-lysyl-L arginyl-L-arginyl-L-prnlyl-L-va(yl-L-lysyl-L-valyl-L- -tyrosyl-L-prolin. pD-Ser-Tyr-Ser-NJe-Oln-His-Phe -Arg-Try-Gly-Lys-Pro -Val-Gly-Lys-Lys-Arg-Arg-Pro -Val-Lys-Val-Tyr-Pro-OH]
Man löst 2,0 g CTB-D-Ser-Tyr-Ser-Nle-NHNH2 (Bsp.
5) in 12 ml Dimethylformamid, gibt 4 ml Wasser zu kühlt auf -100, gibt 2 ml 6 N Salzsäure zu, versetzt mit 280 mg Natriumnitrit, rührt 5 Min. bei -50, gibt 300 ml 0,2 N Kaliumbicarbonatlösung hinzu und zentrifugiert.
Man löst das erhaltene CTBzD-Ser-Tyr-Ser-Nle-Ns in 50 ml Dimethylformamid, versetzt mit 10,5 g H-Gln-(Tnt)- His-Phe-Arg-Try-Gly-(CTB)Lys-Pro-Val-Gly-(CTB)Lys-] -(CTB)Lys - Arg - Arg - Pro - Val - (CTB)Lys-Val-Tyr-Pro- -OTB @ Azetat, lässt 12 Std. bei 0 stehen, gibt noch eine weitere, aus 2,0 g CTB-D-Ser-Tyr-Ser-Nle-NHNH2 hergestellte Menge von Tetrapeptidazid zu, lässt 6 Std. bei 00 stehen, dampft ab, verarbeitet mit Essigester, wäscht mit heissem Azeton und Essigester und trocknet im Vakuum. Man löst das erhaltene Produkt in 100 ml 90%iger
Trifluoressigsäure, lässt 1 Std. bei 200 unter Stickstoff stehen, dampft ab, verarbeitet mit Essigester, filtriert und trocknet.
Man löst das erhaltene Produkt in 500 ml 0,2 N Essigsäure, behandelt die Lösung mit Amberlit-IRA-410 in Azetatform filtriert und lyophilisiert. Nach Trocknen über Natriumhydroxyd erhält man 7,6 g H-D-Ser-Tyr -Ser-Nle-Gln-His-Phe-Arg-Try-Oly-Lys-Pro-Val-Gly-Lys- -Lys-Arg-Arg-Pro-Val-Lys-Val-Tyr-Pro-OH Heptaacetat . Dekahydrat. das sich bei der Chromatographie und der Elektrophorese homogen verhält. (Totalhydrolyse gibt die folgende Amtinosäurezusammensetzung: Ser1,9Tyr2,0Nle1,1Glu0,9His1,1Phe1,0Arg3,1Gly2,0Lys3,9 Pro2,9Val3,l) Mikroanalyse:
Ber.: C 51,6 H 7,5 N 16,3 0 24,6
Gef.: C 51,3 H 7,6 N 16,1 0 24,8 Smp.: 2050 [ ]D90 = 780.
IATENTANSPRüa?E
I. Verfahren zur Herstellung von neuen Tetracosapeptiden der allgemeinen Formel I D-Seryl-L-tyrosyl-L-seryl-L-norleucyl-X-L-histidyl-L- -phenylalanyl-L-arginyl-L4ryptophanyl-glycyl-L-lysyl-L- -prolyl-L-valyl-glycyl-L-lysyl-L-lysyl-L-arginyl-L-arginyl- -L-prolyl-L-valyl-L-lysyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-prolin, worin X einen Glutamyl- oder L-Glutaminylrest bedeutet, dadurch gekennzeichnet, dass man entsprechende, zu seinem Aufbau notwendige Aminosäuren unter Bildung von CDONH-Bindungen in beliebiger zeitlicher Reihenfolge miteinander kondensiert, wobei man nicht an der Reaktion teilnehmende Gruppen durch Einführung von zum Schutz solcher Gruppen geeigneten Schutzgruppen schützt, die nach erfolgter Kondensation abgespalten werden und gegebenenfalls die Säureadditionssalze herstellt,
indem man das Tetracosapeptid durch Umsetzung mit organischen oder anorganischen Säuren in die entsprechenden Salze überführt.
II. Verwendung der gemäss dem Verfahren nach Patentanspruch I erhaltenen neuen Tetracosapeptide der allgemeinen Formel I q:)-Seryl-L-tyrosylzL-seryl-L-norleucyl-X-L-histidyl-L- -phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophanyl-glycyl-L-lysyl -L-prolyl-L-valyl-glycyl-L-1ysyl-L-lysyl-L-arginyl-L- -arginyl-L-prolyl-L-valyl-L"lysyl-L-valyl-L-tyrosyl-L- -prolin, worin X einen Glutamyl- oder L-Glutaminylrest bedeutet, zur Herstellung von Schwermetallkomplexen, dadurch gekennzeichnet, dass man das Tetracosapeptid der obigen Formel durch Umsetzung mit Schwermetalisalzen in die entsprechenden Schwermetallkomplexe überführt.
UNTER ANSPRÜCHE
1. Verfahren zur Herstellung der neuen Tetracosapeptide nach Patentanspruch I, dadurch gekennzeichnet, dass man aus dem geschützten Tetracosapeptid N-,R'-lD-Seryl-L-tyrosyl-L-seryl-L-norleucyl-L-glutami- nyl-Im-triphenylmethyl-L-histidyl -L-phenylaSanyl-L- -arginyl-L-tryptophanyl-glycyl-±-N-R-L-lysyl-L-prolyl- -L-valyl-glycyl-#-N-R-L-lysyl-#-N-R-L-lysyl-L-arginyl-L -arginyl-L-prolyl-L-valyl-#-N-R-L-lysyl-L-valyl-L- -tyrosyl-L-prolin, worin R und R' in der Peptidchemie zum Schutz der Aminogruppe verwendete Schutzgruppen bedeuten, die Schutzgruppen in einer einzigen oder gegebenenfalls in mehreren Stufen abspaltet.
2. Verfahren zur Herstellung der neuen Tetracosapeptide nach Patentanspruch I, dadurch gekennzeichnet, dass man aus dem geschützten Tetracosapeptid N-R'-D-Seryl-L-tyrosyl-L-seryl-L-norleucyl-Y-O-tert- -butyl-L-glutamyl-Im-triphenylmethyl-L-histidyl-L -phenylalanyl*L-arginyl-L-tryptophanyl-glycyl-±-N-R-L- -Iysyl-L-prolyl-L-valyl-glycyl-±-N-R-L-lysyl-±-N-R-L- -lysyl-L-arginyl-L-arginyl-L-prolyl-L-valyl-#-N-R-L -lysyl L-valyl-L-tyrosyl-L-prolin, worin R und R' in der Peptidchemie zum Schutz der Aminogruppe verwendete Schutzgruppen bedeuten, die Schutzgruppen in einer einzigen oder gegebenenfalls in mehreren Stufen abspaltet.
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