Verfahren zur Herstellung von Peptiden
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein neues Verfahren zur Herstellung von Peptiden.
Bei der Synthese von Peptiden, welche a, M-Diamino- alkansäuren enthalten, ist es notwendig, die beiden Aminogruppen vorübergehend zu schützen, bzw. von den geschützten Gruppen lediglich die a-Aminogruppe selektiv freizusetzen. Die selektive, Abspaltung der a Aminoschutzgruppe konnte man bisher aber in vielen Fällen nicht durchführen, da bei den bekannten Schutzgruppe-Kombinationen in a-und co-Stellung gleichzeitig auch die unerwünschte Abspaltung der M-Amino- schutzgruppe eintrat.
Das erfindungsgemässe Verfahren zur Herstellung von Peptiden, welche von natürlichen a, cs-Diamino- alkansäuren sich ableitende a, a)-Diamino-alkanylreste enthalten, durch Vereinigung entsprechender Aminosäuren oder Peptide unter intermediärem Schutz von Amino-und/oder Carboxylgruppen ist, dadurch gekennzeichnet, dass man die #-Aminogruppe der a, co-Di- amino-alkanoylreste durch den Phthalylrest und die u-Aminogruppe der a, #-diaminoalkanoylreste durch die tert.-Butyloxycarbonylgruppe (BOC) schützt und dass man die Butyloxycarbonylgruppe nach Einführung der geschützten a, a)
-Diamino-alkanoylreste in die Aminosäurekette durch stark saure Agenzien bei einem pH unter 4 entfernt und die Phthalylgruppe in Gegen- wart eines Hydrazinsalzes in einem schwach sauren Medium mit einem pH von 4-7 abspaltet.
Die Vereinigung der a, aj-Diaminoalkansäure oder eines diese enthaltenden Peptids mit einer weiteren Aminosäure oder einem Peptid wird z. B. in an sich bekannter Weise nach der Carbodiimidmethode, der Azidmethcde, der Anhydridmethode oder der Methode der aktivierten Ester vorgenommen.
Wird die Diaminoalkansäure oder ein diese enthaltendes Peptid am Aminoende einer Aminosäure oder eines Peptids ankondensiert, so kann man das NQ-BOC- N-Phthalylderivat, z. B. N-BOC-N--Phthalyl-Lysin verwenden ; wird hingegen ein die Diaminoalkansäure enthaltendes Peptid am Carboxylende einer Aminosäure oder eines Peptids ankondensiert, so muss die erste eine freie Aminogruppe, z. B. eine freie a-Amino- gruppe aufweisen ; aus einem Na-BOGN-Phthalyl- derivat muss also z. B. zunächst die BOC-Gruppe abgespalten werden.
Die als Ausgangsstoffe verwendeten Derivate der Diaminoalkansäuren, in denen die Aminogruppen in der genannten Weise geschützt sind, sind neu. Ausgehend von bekannten Nt-Phthalylderivaten, z. B. dem NE Phthalyl-Lysin, lassen sie sich nicht herstellen. Über raschenderweise können die Ausgangsstoffe, z. B. das neue Na-tert.-Butyloxyzarbonyl-N-phthal-L-lysin (BOC Lys (Pht)-OH), wie folgt synthetisiert werden :
Die Carbobenzoxygruppe (Z) des bekannten BOC Lys (Z)-OH wird durch katalytische Hydrierung abgespalten. Das erhaltene, neue BOC-Lysin wird in alkalischem Medium mit N-Carbäthoxy-phthalimid umgesetzt, wobei das BOC-Lys (Pht)-OH in praktisch quantitativer Ausbeute erhalten wird.
In anaologer Weise lassen sich auch die anderen Na-BOC-Nt-phthalyl-diaminoalkan- säuren herstellen.
Wie bekannt, kann ein Phthalylrest durch alkalische Behandlung, insbesondere mit Hydrazin, leicht abge- spalten werden. Eine solche Abspaltung lässt sich aber bei vielen Peptiden, so z. B. bei Corticotropin und abzw. ss-MSH, die besonders alkaliempfindlich sind, nicht durchführen. Andererseits ist der Phthalylrest gegen- über starken Säuren sehr beständig. Es wurde nun überraschenderweise gefunden, das sich der Phthalylrest in schwach saurem Medium bei einem pH-Wert zwischen 4 und 7 in Gegenwart von einem Hydrazinsalz abspalten lässt. Die Lösungen werden z.
B. durch Kombination von Hydrazin mit einer organischen oder anorganischen Säure cder durch Auflösen eines Hydrazinsalzes in wässriger oder wässrig-organischer Lösung erhalten. Als Säuren können z. B. Salzsäure, Schwefelsäure, Phosphorsäure usw., oder Essigsäure, Propionsäure, Phthalsäure, Benzoesäure usw., verwendet werden.
Demgegenüber lässt sich der tert.-Butyloxycarbonyl- rest nur in stark sauren Medien, d. h. bei einem pH Wert unter 4, abspalten. Es können starke anorganische oder organische Säuren verwendet werden.
Das verschiedene Verhalten des Phthal-und des tert.-Butyloxycarbonylrestes gegenüber alkalischen, schwach und stark sauren Mitteln ist in der Peptidsynthese von grossem Vorteil. Während nämlich der Nu- Phthalylrest des N"-BOC-N'"-phthalyl-peptids bei der Synthese eines langkettigen Peptids durch mehrere Ver fahrensschritte, ja sogar bis zur Endstufe der Synthese, im Molekül intakt verbleiben sollte, lässt sich der tert. Butyloxycarbonylrest an jeder geeigneten Synthesestufe durch Behandlung mit starken Säuren abspalten. Wenn erwünscht, kann auch der tert.-Butyloxycarbonylrest belassen und der Phthalylrest in schwach saurem Medium eines Hydrazinsalzes abgespalten werden.
So lässt sich z. B. die unten angegebene Teilsequenz der Aminosäuren 15-24 des Corticotropins durch Verwendung des neuen Lysinderivates, nämlich der Na- BOC-Ne-phthalyllysins, in ausgezeichneter Ausbeute herstellen.
Eine vorteilhafte Durchführung der Synthese der genannten Teilsequenz wird im Schema 1 aufgezeichnet.
In dieser Synthese wird zugleich gezeigt, dass zur Veresterung bzw. zum Schutze einer Carboxylgruppe der p-Phenylazobenzylalkohol sehr geeignet ist. Die erhaltenen Aminosäure-oder Peptidester sind farbig und er leichtern somit die Isolierung und die Reindarstellung dieser Zwischenprodukte, z. B. in der Verteilungschromatographie oder multiplikativen Verteilung. Die farbige Carboxylschutzgruppe lässt sich nachher durch Hydrazinolyse, Hydrolyse oder katalytische Hydrierung entfernen.
BOC bedeutet eine tert.-Butyloxycarbonylgruppe, Py Pyridin, TF Trifluoressigsäure, DCCI Dicyclohexylcarbodiimid, PAB p-Phenylazobenzyl udn gem. Anh. die Peptidverknüpfungsmethode der gemischten An hydride .
Die Verknüpfung eines Lysinderivates mit einem Peptid nach der Methode der aktivierten Ester ist in Beispiel 4 veranschaulicht (Kondensation von BOC-Lys (Pht)-pentachlorphenylester mit Arg-Arg-Pro-Val-Lys (Pht)-Val-Tyr-Pro-OPAB).
Weiter bietet das genannte Verfahren Vorteile bei der Synthese des a-melanophorenstimulierenden Hor mons (a-MSH) der Formel a-Acetyl-L-seryl-L-tyrosyl- L-seryl-L-methionyl-L-glutamyl-L-histidyl-L-phenyl- alanyl-L-arginyl-L-tryptophylglycyl-L-lysyl-L-prolyl-L- valin-amid. Dieses Tridekapeptid wurde von St. Guttmann et R. A. Boissonnas synthetisiert (Helv. Chim.
Acta 42,1257 [1959]), doch bot die Abspaltung der Schutzgruppen grosse Schwierigkeiten. Die hier beschriebene Synthese, bei der die Aminogruppe des Lysins durch den Phthalylrest geschützt ist, verläuft hingegen sehr glatt. Schema 2 zeigt den Verlauf der Synthese, bei der das bekannte Dekapeptidderivat BOC-Ser Tyr-Ser-Met-Glu (O-tert.-butyl)-His-Phe-Arg-Try-Gly- OH (vgl. Patent Nr. 408 948) mit dem Tripeptidderivat N8-Phthalyl-L-lysyl-L-propyl-L-valin-amid verknüpft wird.
Schema 1
EMI3.1
\\-Ul712UH
<tb> BOC-Pra-OH <SEP> . <SEP> BOC-Pro-OFAB <SEP> H-Pro-OPAB
<tb> CCI <SEP> > <SEP> BOC-| <SEP> Tyr <SEP> Pro <SEP> |-OPAB- > <SEP> H-| <SEP> Tyr <SEP> Pro <SEP> |-OPAB <SEP> OC <SEP> | <SEP> Val <SEP> |
-OHy
<tb> DCCI,Py
<tb> BOC-Tyr-OH <SEP> HCI <SEP> BOC-Val-OH
<tb> BOC-Tyr <SEP> Pro-OPAB-- <SEP> H-Tyr <SEP> Pro-OPAB
<tb> DCCI <SEP> gem. <SEP> Anhydrid
<tb> "-" <SEP> gem. <SEP> Anhydrid
<tb> Pht
<tb> FgCCOOH <SEP> BOC-Lys-OH
<tb> BOC-Val <SEP> Tyr <SEP> Pro <SEP> |-OPAB <SEP> > <SEP> H-t <SEP> Val <SEP> Tyr <SEP> Pro <SEP> OPAB
<tb> gem. <SEP> Anhydrid
<tb> Pht <SEP> Pht
<tb> TFBOC-Val-OH
<tb> BOC-Lys <SEP> Val <SEP> Tyr <SEP> Pro-OPAB-- <SEP> H-L <SEP> s <SEP> Val <SEP> Tyr <SEP> Pro-OPABgem.Anhydrid
<tb> Pht <SEP> Ph
<tb> TF <SEP> BOC-Pro-QH
<tb> BOC-Val <SEP> Lys <SEP> Val <SEP> Tyr <SEP> Pro-OPAB-- <SEP> H-Val <SEP> Lys <SEP> Val <SEP> Tyr <SEP> Pro-OPAB
<tb> gem.
<SEP> Anhydrid
<tb> Pht <SEP> Pht
<tb> TUF
<tb> BOC-| <SEP> Pro <SEP> Val <SEP> L$s <SEP> Váí <SEP> Tyr <SEP> Pra-OPAB--- <SEP> H-Fro <SEP> Val <SEP> Lys <SEP> Val <SEP> Tyr <SEP> Pro <SEP> -OPAB
<tb> N 2
<tb> N02 <SEP> Pht <SEP> N02 <SEP> Pht
<tb> BOC-Aig-OH <SEP> TF
<tb> BOC-Arg <SEP> Pro <SEP> Val <SEP> Lys <SEP> Val <SEP> Tyr-OPAB <SEP> H-I <SEP> Arg <SEP> Pro <SEP> Val <SEP> Lys <SEP> Val <SEP> Tyr <SEP> Pro-OPAB
<tb> gem.Anhydrid
<tb> N0
<tb> N02 <SEP> NO.
<SEP> Pht <SEP> N02 <SEP> N02 <SEP> Pht
<tb> BOC-X-OH
<tb> DOC-FXrgArg <SEP> Pro <SEP> Val <SEP> Lµs <SEP> Váí <SEP> Tyr <SEP> Pro <SEP> |-OPAB <SEP> > <SEP> H-| <SEP> Arg <SEP> Arg <SEP> Pro <SEP> Val <SEP> Lys <SEP> Val <SEP> Tyr <SEP> Pro <SEP> OPAB
<tb> Pht
<tb> Pht <SEP> NO <SEP> NO <SEP> Pht <SEP> Pht <SEP> N02 <SEP> N02 <SEP> Pht
<tb> BOC-Lys-OH <SEP> TF
<tb> BOC-Lys <SEP> Arg <SEP> Arg <SEP> Pro <SEP> Val <SEP> Lys <SEP> Val <SEP> Tyr <SEP> Pro-OPAB <SEP> H-FLys <SEP> Arg <SEP> g <SEP> Pro <SEP> Val <SEP> Lys <SEP> Val <SEP> Tyr <SEP> Pro <SEP> -OPAB
<tb> gem.Anhydrid
<tb> Pht
<tb> Pht <SEP> Pht <SEP> Pht <SEP> NO2 <SEP> Pht
<tb> BOC-s-OH
<tb> gem. <SEP> BOC- <SEP> Lys <SEP> Lys <SEP> Arg <SEP> Arg <SEP> Pro <SEP> Val <SEP> Lys <SEP> Val <SEP> Tyr <SEP> Pro <SEP> |-OPAB
<tb> gem.
<SEP> Anhydrid
<tb> Schema 2
EMI4.1
O-C4Hg <SEP> (tert.) <SEP> Pht
<tb> BOC-Ser <SEP> Tyr <SEP> Ser <SEP> Met <SEP> Glu <SEP> His <SEP> Phe <SEP> Arg <SEP> Try <SEP> Gly-OH <SEP> BOC-Lys-OH <SEP> BOC-Pra-OH <SEP> Z-Val-OH
<tb> NHg <SEP> gem. <SEP> Anhydrid
<tb> V
<tb> Z-1 <SEP> Val <SEP> 1-NH2
<tb> H, <SEP> (Pd) <SEP> in <SEP> Essigsäure
<tb> Y
<tb> Val-NH2, <SEP> CH3COOH
<tb> gem. <SEP> Anhydrid
<tb> BOC-ProVal <SEP> !-NHa
<tb> TF
<tb> H-Pro <SEP> Val-NH2, <SEP> CFgCOOH
<tb> Amberlite <SEP> IRA-400) <SEP> >
<tb> (Acetatform)
<tb> H-Pro <SEP> Val-NH2, <SEP> CHSCOOH
<tb> Pht <SEP> gem.
<SEP> Anhydrid
<tb> VU
<tb> BOC-Lys <SEP> Pro <SEP> Val-NH2
<tb> Pht <SEP> > | <SEP> HCl <SEP> in <SEP> Essigester
<tb> H-| <SEP> Lys <SEP> Pro <SEP> Val-NH2, <SEP> HCl
<tb> O-C4Hg <SEP> (tert.) <SEP> Pht <SEP> DCCI
<tb> .t-,
<tb> BOC-Ser <SEP> Tyr <SEP> Ser <SEP> Met <SEP> Glu <SEP> His <SEP> Phe <SEP> Arg <SEP> Try <SEP> Gly <SEP> Lys <SEP> Pro <SEP> Val-NH2
<tb> PhtTF
<tb> I
<tb> H-Ser <SEP> Tyr <SEP> Ser <SEP> Met <SEP> Glu <SEP> His <SEP> Phe <SEP> Arg <SEP> Try <SEP> Gly <SEP> Lys <SEP> Pro <SEP> Val-NH2
<tb> PhtCHCOOCHNO, <SEP> (p)
<tb> CHgCO-.
<SEP> Ser <SEP> Tyr <SEP> Ser <SEP> Met <SEP> Glu <SEP> His <SEP> Phe <SEP> Arg <SEP> Try <SEP> Gly <SEP> Lys <SEP> Pro <SEP> Val <SEP> 1-NH2
<tb> H2N-NH2, <SEP> 2CH, <SEP> COOH
<tb> CHgCO-Ser <SEP> Tyr <SEP> Ser <SEP> Met <SEP> Glu <SEP> His <SEP> Phe <SEP> Arg <SEP> Try <SEP> Gly <SEP> Lys <SEP> Pro <SEP> Vall-NH2
<tb>
In den nachfolgenden Beispielen sind die Temperaturen in Celsiusgraden angegeben.
Beispiel 1
BOC-Lys (Pht)-OH
41 g BOC-Lys (Z)-OH [Lit. : G. H. Anderson und A. C. McGregor, J. A. C. S. 79,6180 (1957] werden in 400 ml 95"/tigem Methanol in Gegenwart von 4,1 g 10 /oiger Paladiumkohle hydriert. Nach dem Abfiltrie- ren des Katalysators wird das Filtrat im Vakuum verdampft. Der zurückgebliebene Schaum wird in 100 ml abs. Athanol gelöst ; beim Aufbewahren der Lösung kristallisiert das BOC-L-lysin aus. Total werden 24 g = 90 ouzo erhalten. F. 204-205 C und Zers. Die Substanz kann aus Wasser-Aceton umkristalisiert werden.
Sie ist papierchromatographisch einheitlich. Der Schmelzpunkt ändert sich nicht. 17,6 g des obigen BOC L-lysins werden in 70 ml Wasser mit 7,6 g wasserfreiem Natriumcarbonat gelöst. Unter Rühren werden 19,7 g N-Carbäthoxyphthalimid zugegeben und 30 Min. rühren gelassen. Die Lösung wird klar filtriert, auf 0 C ge- kühlt, mit 2-n. Salzsäure auf pH 2 angesäuert und mit Essigester extrahiert. Die Essigesterauszüge werden mit 120 ml gesättigter Natriumhydrogencarbonatlösung ausgezogen, diese wiederum mit 2-n. Salzsäure angesäuert und mit Essigester extrahiert. Aus den Essigesterextrakten erhält man nach Waschen, Trocknen und Verdampfen 26,6 g = 99 O/o d. Th. eines farblosen glasartigen Produktes.
Die Verbindung ist chromatographisch ein- heitlich.
Beispiel 2
Abspaltungsversuche der Phthalylgruppe a) aus Lys (Pht)-OH
1,565 g Nf-Phthal-L-lysin-hydrochlorid [Lit. : G. H.
L. Nefkens, G. I. Tesser und R. J. F. Nivard, Rec. Trav. chim. Pays-Bas 79,688 (1960)] werden in 8 ml Wasser gelöst, Bei 50 werden dazu eine Lösung von 1,46 ml Hydrazinhydrat und 1,43 ml Eisessig in 3 ml Methanol gegeben, kurz zum Sieden erhitzt und noch 2 Stunden bei 50 aufbewahrt. Es bildet sich eine dicke Fällung.
Auf 0 gekühlt, abgenutscht, mit Wasser gewaschen.
Es werden 747 mg Phthalylhydrazid = 92 I/o d. Th. erhalten. Das Filtrat wird dünnschichtchromatographisch untersucht : Es enthält neben sehr viel Lysin noch wenig N-Phthalyl-lysin. b) aus BOC-Lys (Pht)-Val-Tyr-Prop-p phenylazobenzylester
465 mg BOC-Lys (Pht)-Val-Tyr-Pro-OPAB (Herstellung in Beispiel 3e beschrieben) werden mit 5 ml 2-m. Hydrazinhydrat + 2-m. Essigsäure (pH 6,5) in Methanol bei 50 aufbewahrt und nach verschiedenen Zeiten 0,5 ml Proben entnommen. Diese werden mit Essigester verdünnt, mit Kaliumcarbonatlösung extrahiert, zur Trockene verdampft und dünnschichtchro- matographisch untersucht im System Chloroform-Aceton 7 : 3.
Ergebnis : Nach 2 Stunden ist der grösste Teil des Ausgangsmaterials verschwunden, nach 17 Stunden ist das Ausgangsmaterial vollständig verschwunden. Entsprechend nimmt der Flecken an BOC-Lys-Val-Tyr- Pro-OPAB zu.
Als Nebenreaktion verläuft die Hydrazinolyse des Esters, erkenntlich an der Bildung von p-Phenylazobenzylalkohol. Diese Nebenreaktion geht wesentlich langsamer als die Abspaltung der Phthalylgruppe vor sich.
Beispiel 3 a) Pro-OPAB, HC1
20,9 g BOC-L-prolin und 22,7 g p-Phenylazobenzylalkohol werden in 200 ml Pyridin gelost, bei 0 mit 22 g Dicyclohexylcarbodiimid versetzt und dann über Nacht bei Raumtemperatur stehen gelassen. Nach Zusatz von einigen ml Eisessig wird auf 0 gekühlt und der Dicyclohexylhamstoff abgenutscht. Das Filtrat wird nach Verdampfen des Pyridins in Essigester gelöst und mit 0,5-n. Salzsäure und Natriumhydrogencarbonat- lösung auf Neutralprodukt aufgearbeitet. Erhalten wer- den ca. 40 g eines roten Ols.
Dieses wird in 100 ml abs. Essigester gelöst und mit 500 ml 3-n. Salzsäure in Essigester versetzt. Nach Va Stunde wird im Vakuum bei 40 zur Trockene verdampft. Der Rückstand wird in 500 ml Chloroform gelöst und durch eine Säule aus 1 kg Silicagel filtriert. Mit Chloroform lässt sich eine Verunreinigung eluieren, dann wird die gesuchte Substanz mit Chloroform +10 Prozent Methanol herausgewaschen. Erhalten werden 34 g Pro-OPAB, HC1. Diese werden aus abs. Äthanol umkristallisiert. Ausbeute : 26,0 g = 77 I/o d. Th. ; F.
(177) 180 . b) Tyr-Pro-OPAB, HCI
1,39 g Pro-OPAB, HC1 werden in 10 ml Wasser gelöst, mit Essigester überschichtet und bei 0 mit Kaliumcarbonat alkalisiert. Der Essigesterextrakt wird neutral gewaschen und im Vakuum bei 40 verdampft. Der Rückstand und 1,13 g BOC-Tyr-OH werden in 20 ml Acetonitril und 1 ml Dimethylfcrmamid gelöst und bei 0 mit 0,91 g Dicyclohexylcarbodiimid versetzt. Nach Stehen über Nacht bei 0 wird der Dicyclohexylharnstoff abgenutscht, das Filtrat eingeengt, in Essigester aufgenommen und mit 0,5-n. Salzsäure und Natriumhydrogencarbonatlösung ausgeschüttelt. Das erhaltene Neutralprodukt wird mit Salzsäure in Essigester von der BOC-Gruppe befreit.
Das Hydrochlorid kristallisiert aus Methanol-Ather. Ausbeute : 1,68 g = 82 /e d. Th. ; F.
204 u. Zers. c) BOC-Val-Tyr-Pro-OPAB
9 g BOC-Val-OH, gelöst in 90 ml abs. Tetrahydro- furan und 5,7 ml Triäthylamin, werden bei-10 bis -15 mit 5,0 ml Isobutylchlorocarbonat versetzt. Nach 15-20 Minuten werden gleichzeitig 17,25 g Tyr-Pro- OPAB, HC1, gelöst in 120 ml abs. Dimethylformamid und 4,7 ml Triäthylamin, in 45 ml abs. Tetrahydrofuran zugetropft. Anschliessend wird noch eine Stunde bei 0 gerührt, dann über Nacht im Kühlschrank stehen gelassen. Die Mischung wird eingeengt, in Essigester aufge nommen und bei 0 mit 0,5-n. Salzsäure und Natriumhydrogencarbonatlösung ausgeschüttelt. Das erhaltene Neutralprodukt wird aus Methanol-Wasser umkristallisiert.
Ausbeute : 20,15 g BOC-Val-Tyr-Pro-OPAB = 88 O/o d. Th. ; F. 106-108 .
Dünnschichtchromatogramm : Einheitlich in Chloroform-Aceton 7 : 3 ; Rf 0,54. d) Val-Tyr-Pro-OPAB
17,0 g BOC-Val-Tyr-ProWOPAB werden unter Küh- lung mit kaltem Wasser mit 50 ml Trifluoressigsäure übergossen und geschüttelt bis gelöst. Die Lösung wird 5 Minuten bei Raumtemperatur aufbewahrt, dann im Vakuum bei Raumtemperatur verdampft. Das 61 wird in Chloroform gelöst, einmal mit Wasser extrahiert, dann die Chloroformlösung bei 0 mit gesättigter Na- triumhydrogencarbonatlösung gerührt bis keine Kohlenstoffdioxyd-Entwicklung mehr statfindet. Die Chloro formschicht wird abgetrennt, mit Natriumsulfat getrocknet und zur Trockene verdampft. Ausbeute : 14,8 g Val-Tyr-Pro-OPAB = 100 0/c, d. Th.
Dünnschichtchromatogramm : Chloroform-Aceton 7 : 3 : Einheitlich Rf 0,2 ; Benzol-Aceton 1 : 1 : Einheitlich Rf 0, 45. e) BOC-Lys (Pllt)-Val-Tyr-Pro-OPAB
Aus 7,4 g BOC-Lys (Pht)-OH wird wie in Beispiel 3c beschrieben, das gemischte Anhydrid hergestellt und dieses mit 6,43 g Val-Tyr-Pro-OPAB umgesetzt. Ausbeute : 9,08 g BOC-Lys (Pht)-Val-Tyr-Pro-OPAB = 87 O/o d. Th.
Dünnschichtchromato, gramm : Chloroform-Aceton 7 : 3 : Einheitlich Rf 0,4 ; Benzol-Aceton 1 : 1 : Einheitlich Rf 0,62. f) Lys (Pht)-Val-Tyr-Pro-OPAB
9,08 g BOC-tetrapeptid werden wie im Beispiel 3d mit Trifluoressigsäure behandelt und aufgearbeitet. Ausbeute : 8, 1 g Lys(Pht)-Val-Tyr-Pro-OPAB = 100 0/0 d. Th.
Dünnschichtchromatcgramm : Chloroform-Aceton 7 : 3 : Einheitlich Rf 0,16 ; Benzol-Aceton 1 : 1 : Einheitlich Rf 0,42. g) BOC-Val-Lys (Pht)-Val-Tyr-Pro-OPAB Aus 3, 5 g BOC-Val-OH und 8,1 g Lys (Pht)-Val Tyr-Prc-OPAB werden nach der in Beispiel 3c beschrie b :. nen Methede 8,8 g BOC-pentapeptid = 88 O/o d. Th. erhalten.
Dünnschichtchromatogramm : Chloroform-Aceton 7 : 3 : Einheitlich Rf 0,36 ; Benzol-Aceton 1 : 1 : Einheitlich Rf 0,65. h) Val-r, ys (Pht)-Val-Tyr-Pro-OPAB
Aus obigen 8,8 g BOC-pentapeptidester wird mit Trifluoressigsäure entsprechend der im Beispiel 3d be schriebenen Methode 8,2 g Val-Lys (Pht)-Val-Tyr-Pro OPAB = 10"/c d. Th. erhalten.
Dünnschichtchromatogramm : Chloroform-Aceton 7 : 3 : Einheitlich Rf 0,14 ; Benzol-Aceton 1 : 1 : Einheitlich Rf 0, 33. i) BOC-Pro-Val-Lys (Pht)-Val-Tyr-Pro-OPAB
3,3 g BOC-Pro-C) H und 8,2 g Val-Lys (Pht)-Val Tyr-Pro-OPAB werden analog der im Beispiel 3c be schriebenen Methode umgesetzt und aufgearbeitet. Ausbeute : 9,05 g BOC-Pro-Val-Lys (Pht)-Val-Tyr-Pro OPAB = 91 % d. Th.
Dünnschichtchromatcgramm : Chloroform-Aceton 7 : 3 : Einheitlich Rf 0,25 ; Benzol-Aceton 1 : 1 : Einheitlich Rf 0, 49 ; Chloroform-Methanol 9 : 1 : Einheitlich Rf 0,75. k) Pro-Val-Lys(Pht)-Val-Tyr-Pro-OPAB
9,05 g BOC-Pro-Val-Lys (Pht)-Val-Tyr-Pro-OPAB werden wie im Beispiel 3d beschrieben, mit Trifluoressigsäure behandelt. Ausbeute : 8,65 g Pro-Val-Lys (Pht)-Val-Tyr-Pro-OPAB = 100 % d. Th.
Dünnschichtchromatogramm : Chloroform-Methanol 9 : 1 : Rf 0, 38.
Eine Probe des Peptids wird durch Hydrierung in Pro-Val-Lys (Pht)-Val-Tyr-Pro-OH übergeführt. Dieses Prcdukt wird wie in Beispiel2 beschrieben, mitHydrazin und Essigsäure von der Phthalylgruppe befreit. Das freie Hexapeptid wird papierchromatographisch und elektro- pheretisch geprüft und einheitlich befunden. Vom freien Peptid wird nach Totalhydrolyse eine quantitative Aminosäureanalyse durchgeführt. Gefunden wurden : Lysin 0,96 ; Ammoniak 0,28 ; Valin 2,0 ; Prolin 2,13 ; Tyrosin 0,87.
1) BOC-Arg (NO2)-Pro-Val-Lys (Pht)-Val-Tyr-Pro-OPAB
Aus 893 mg BOC-Arg (NO2)-OH und 2,05 g Pro Val-Lys (Pht)-Val-Tyr-Pro OPAB werden nach der im Beispiel 3c beschriebenen Methode 2,21 g = 83 /o d. Th. BOC-heptapeptid erhalten.
Dünnschichtchromatogramm : Chloroform-Methanol 9 : 1 : Hauptkomponente 0,58 ; Verunreinigung 0,79.
Die Verunreinigung lässt sich leichter nach Abspaltung der BOC-Gruppe abtrennen, weshalb das Produkt auf dieser Stufe nicht gereinigt wird. m) Arg (NO)-Pro-Val-Lys (Pht)-Val-Tyr-Pro-OPAB
3,06 g des im Beispiel 31 beschriebenen Gemisches werden nach der im Beispiel 3d beschriebenen Methode mit Trifluoressigsäure umgesetzt und aufgearbeitet. Das erhaltene Rohprodukt wird an der 30fachen Menge Aluminiumoxyd (Aktivität III) chromatographiert. Mit Chloroform-Aceton 7 : 3 lässt sich die Verunreinigung eluieren. Das Arg (NO2)-Pro-Val-Lys (Pht)-Val-Tyr-Pro OPAB verbleibt zuoberst in der Säule. Es wird nach Austscssen der Säule mit Tetrahydrofuran-Wasser 9 : 1 extrahiert. Ausbeute : 2,14 g = 76 ouzo d.
Th.
Dünnschichtchromatogramm : Chloroform-Methanol 9 : 1 : Einheitlich Rf 0,13. n) BOC-Arg(NO2)-Arg(NO2)-Pro-Val-Lys(Pht) Val-Tyr-Pro-OPAB
Aus 910 mg BOC-Arg (NOa)-OH und obigen 2, 14 g Arg (N02)-Pro-Val-Lys (Pht)-Val-Tyr-Pro-OPAB werden nach der in Beispiel 3c beschriebenen Methode 2,33 g = 87 % d. Th. BOC-Oktapeptidester erhalten.
Dünnschichtchromatogramm : Chloroform-Methanol 9 : 1 : Einheitlich Rf 0, 36. o)Arg(NO2)-Arg(NO2)-Pro-Val-Lys(Pht)
Val-Tyr-Pro-OPAB
Aus 3,4 g BOC-Oktapeptidester wird nach der in Beispiel 3d beschriebenen Methode 3,3 g Arg (NO2) Arg (NO2)-Pro-Val-Lys (Pht)-Val-Tyr-Pro¯OPAB'= 100 Prozent d. Th. erhalten.
Dünnschichtchromatogramm : Chloroform-Methanol 9 : 1 : Einheitlich Rf 0,03. p) BOC-Lys (Pht)-Arg(NO2)-Arg(NO2)
Pro-Val-Lys(Pht)-Val-Tyr-Pro-OPAB
1,29 g BOC-Lys (Pht)-OH und 3,1 g Oktapeptid- ester werden wie in Beispiel 3c beschrieben, umgesetzt.
Die Aufarbeitung erfolgt etwas anders : Das ausgefal- lene Triäthylammoniumchlorid wird abgenutscht und das Filtrat in Ather eingetropft. Die Fällung wird abgenutscht. Ausbeute : 3,56 g = 92 I/o d. Th.
Dünnschichtchromatogramm : Chloroform-Methanol 9 : 1 : Einheitlich Rf 0,5 ; Dioxan-Wasser 9 : 1 : Einheitlich Rf 0,73. q) Lys (Pht)-Arg (NO2)-Arg (NO2)-Pro-Val-Lys (Pht)-
Val-Tyr-Pro-OPAB
3,40 g BOC-Nonapeptidester werden wie in Beispiel 3d beschrieben, mit Trifluoressigsäure behandelt. Ausbeute 3,30 g Lys (Pht)-Arg (NO.)-Arg (NO2)-Pro-Val- Lys (Pht)-Val-Tyr-Pro-OPAB = 100 /o d. Th.
Dünnschichtchromatogramm : Chloroform-Methanol 9 : 1 : Einheitlich Rf 0,12 ; Dioxan-Wasser 9 : 1 : Einheitlich Rf 0,62. r) BOC-Lys (Pht)-Lys(Pht)-Arg(NO2)-Arg(NO2)
Pro-Val-Lys (Pht)-Val-Tyr-Pro-OPAB
Aus 1355 mg BOC-Lys (Pht)-OH und 3,30 g Lys (Pht)-Arg (NO)-Arg (NO2)-Pro-Val-Lys (Pht)-Val-Tyr Pro-OPAB werden analog der inBeispiel 3c beschriebenen Methode 3,43 g BOC-Dekapeptidester = 86 % d. Th. erhalten.
Dünnschichtchromatogramm : Chloroform-Methanol 9 : 1 : Einheitlich Rf 0,57 ; Dioxan-Wasser 9 : 1 : Einheitlich Rf 0, 74.
Beispiel 4 a) BOC-Lys (Pht)-pentachlorphenylester
50,9 g BOC-Lys (Pht)-OH und 43,2 g Pentachlorphenol werden in 160 ml abs. Essigester gelöst und bei 0 mit 30,7 g Dicyclohexylcarbodiimid versetzt. Nach Stehen über Nacht bei 0 wird der Dicyclohexylharnstoff abgenutscht und gut mit eiskaltem Essigester gewaschen.
Das Filtrat wird im Vakuum zur Trockene verdampft und der Rückstand aus 500 ml Athanol umkristallisiert.
Man erhält eine 1. Fraktion von 40,8 g Pentachlorphenylester vom F. 140-142 .
Aus der Mutterlauge wird noch eine 2. Fraktion von
16,7 g erhalten, total 68 /o d. Th.
Zur Analyse wird nochmals aus Athanol umkristallisiert, worauf der Schmelzpunkt 142-143 beträgt. b) BOC-Lys (Plit)-Arg-Arg-Pro-Val-Lys (Pht)-
Val-Tyr-Pro-OPAB, 2 CH3COOH
1,06 g Arg-Arg-Pro-Val-Lys (Pht)-Val-Tyr-ProF OPAB, 3 CH3COOH, 850 mg BOC-Lys (Pht)-pentachlorphenylester, 2,5 ml Dimethylformamid und 0,094 ml Triäthylamin werden während 17 Stunden bei 40 gerührt. Nach Verdünnen mit Chloroform wird der geschützte Nonapeptidester mit Ather ausgefällt, abgenutscht und gut mit Äther gewaschen. Ausbeute : 1,24 g = 98"/. d. Th.
Dünnschichtchromatogramm : Einheitlich im System Essigester-Methyläthylketon-Ameisensäure-Wasser 5 : 3 : 1 : 1. Rf = 0, 4.
Beispiel 5 a) Z-Val-NH2
25,1 g Z-Val-OH (R. L. M. Synge, Biochem. J. 42, 99 [1948]) werden in 200 ml abs. Tetrahydrofuran gelöst und mit 13,8 ml Triäthylamin versetzt. Bei-10 werden langsam unter Rühren und Feuchtigkeitsausschluss 13,25 ml Chlorameisensäureisobutylester zugetropft. Nachdem sich das gemischte Anhydrid gebildet hat (30 Minuten), wird bei-10 trockenes Ammoniak eingeleitet (bis zur Sättigung).
Nach weiteren 15 Stunden bei 0 wird das gebildete ZVal-NH, abgenutscht und aus Athanol umkristalisiert ; F. 205-206 , Ausbeute fast quantitativ (24 g). b) Val-NH2, CH3COOH
20,3 g Z-Val-NH2 werden in einem Gemisch von
160 ml Eisessig und 40 ml Wasser unter Zusatz von 2 g 10 %iger Palladiumkohle bei Normaldruck hydriert bis kein Wasserstoff mehr verbraucht wird. Nach Filtration vom Katalysator und Verdampfen des Filtrates wird der Rückstand aus 20 ml Athanol umkristallisiert ;
13,4 g Val-NH"CH3COOH, F. 102 .
Das Acetat wird direkt mit dem gemischten Anhydrid aus Chlorameisensäure-isobutylester und tert. Butoxy-carbonyl-L-prolin umgesetzt. c) BOC-Pro-Val-NH2
Aus 13,6 g BOC-Pro-OH, 8,75 ml Triäthylamin und 8,4 ml Chlorameisensäure-isobutylester wird das gemischte Anhydrid hergestellt (30 Minuten,-10 ). Zum Reaktionsgemisch wird dann die Lösung von 11,15 g Val-NH2, CH3COOH in 50 ml absolutem Tetrahydrofuran und 30 ml absolutem Dimethylformamid zuge- tropft. Nach 1 Stunde bei-5 und 15 Stunden bei 0 wird in der üblichen Weise auf Neutralprodukte aufgearbeitet (in Essigester).
Das Produkt wird aus Äther kristallisiert ; 7,73 g BOC-Pro-Val-NH2, F. 85 (Zers.). d) Pro-Val-NH2, CH3COOH
7,73 g BOC-Pro-Val-NH2 werden unter Kühlung in 25 ml Trifluoressigsäure gelöst. Die Lösung wird nach 5 Minuten im Vakuum verdampft und der Rückstand aus Äthanol-Äther kristallisiert. Ausbeute : 7,5 g Pro Val-NH2, CHCOOH ; F. 167-168 (Zers.).
7,0 g des Salzes werden in 50"/oigem Methanol gelöst und durch eine Säule eines stark basischen Anionenaustauschers, z. B. des unter dem Markennamen Amberlite IRA-400 bekannten Produktes von Rohm und Haas (in der Acetat-Form) laufen gelassen. Das Filtrat wird im Vakuum verdampft und der Rückstand aus Äther-Petroläther kristallisiert ;
5,66 g Pro-Val-NH2, CH3COOH, F. 137-138 . e) BOC-Lys (Pht)-Pro-Val-NH2
Aus 5,26 g BOC-Lys (Pht)-OH und 1,67 ml Chlor- ameisensäure-isobutylester wird in 30 ml Tetrahydro furan und 1,94 ml Triäthylamin bei-10 das gemischte Anhydrid hergestellt, welches (ohne isoliert zu werden) mit der Lösung von 2,73 g Pro-Val-NHQ, CHgCOOH in 14 ml absolutem Dimethylformamid umgesetzt wird.
Nach 15 Stunden Reaktionsdauer (bis 0 ) wird die Lösung im Vakuum stark eingeengt, der Rückstand in Essigester und Wasser gelöst und in der üblichen Weise bei 0 (mit verdünnter Salzsäure und Natriumbicarbon, at) auf Neutralprodukte aufgearbeitet. Das Neutralprodukt wird aus siedendem Essigester kristallisiert ; BOC Lys (Pht)-Pro-Val-NH2, Ausbeute : 65 %, F. 172,5 173 .
Dünnschichtchromatographie auf Silicagel mit dem Lösungsmittel Essigester-Methanol 1 : 3 zeigt, dass die Verbindung einheitlich ist (Rf = 0,73) und durch die Kristallisation von einer geringen Menge einer Verunreinigung mit Rf = 0,55 abgetrennt worden ist. fI, ys (Pht)-Pro-Val-NH2, HCI
1 g BOC-Lys (Pht)-Pro-Val-NH2 wird in 10 ml absolutem Essigester gelöst (siedend), schnell abgekühlt und, bevor Kristallisation einsetzt, mit 6 ml 2,9-n. Salzsäure in Essigester versetzt. Nach einiger Zeit beginnt das Hydrochlorid auszukristillisieren. Nach 1 Stunde werden die Kristalle abfiltriert und mit absolutem Essigester und Ather gewaschen ; 613 mg (= 69 ouzo der Theorie).
Aus der Mutterlauge lassen sich nochmals 98 mg (= 11 /o) gewinnen. Im Papierchromatogramm erweist sich die Substanz in verschiedenen Systemen als einheitliche Verbindung. g) BOC-Ser-Tyr-Ser-Met-Glu (O-C, Hgt.)- His-Phe-Arg-Try-Gly-Lys (Pht)-Pro-Val-NH2
504 mg BOC'-Ser-Try-Ser-met-Glu(OC4H9t.)-His Phe-Arg-Try-Gly-OH, 208 mg Lys (Pht)-Pro-Val-NH2, HC1, und 145 mg Dicyclohexylcarbodiimid werden in 5 ml Pyridin während 5 Tagen bei 20 gerührt, wobei alles in Lösung geht. Das Produkt wird mit einer Mi schung von absolutem Chloroform und Methanol als Gallerte ausgefällt. Durch Waschen mit Wasser wird überschüsiges Tripeptid entfernt.
Das erhaltene BOC Ser-Tyr-Ser-Met-Glu (OC=, H9t.)-His-Phe-Arg-Try-Gly- Lys (Pht)-Pro-Val-NH2 ist rein, wie das Dünnschicht chromatogramm auf Al203 zeigt. h) H-Ser-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Try Gly-Lys (Pht)-Pro-Val-NH2, 3 F3CCOOH
530 mg des Tridekapeptidderivates werden in 7 ml Trifluoressigsäure gelöst, 15 Minuten bei Zimmertem- peratur gehalten und im Vakuum bei 40 Badtemperatur vom Lösungsmittel befreit. Ausbeute 518 mg H-Ser-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Try-Gly-Lys (Pht)- Pro-Val-NH2, 3 FgCCOOH.
Es ist elektrophoretisch rein ; 1 Fleck bei 13,2 cm (positive Reaktion mit Ninhydrin, Sakaguchi, Pauly, Ehrlich) nach 5 Stunden und 7 Volt/cm in 1-n. Essigsäure auf Papier. i) CHCO-Ser-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg- Try-Gly-Lys (Pht)-Pro-Fal-NH2
Die gemäss h erhaltene Verbindung, deren Sert-a- Aminogruppe frei, deren Lysll-a-Aminogruppe dagegen geschützt ist, wird mittels des Essigsäure-p-nitrophenyl- esters selektiv an der a-Aminogruppe acetyliert.
500 mg des Ne-Phthalyl-tridekapeptidamid-tri-tri- fluoracetates werden in 3 ml absolutem Pyridin und 0,4 ml absolutem Dimethylformamid mit 35 mm3 Tri äthylamin und 92 mg O-Acetyl-p-nitrophenol während 22 Stunden bei Zimmertemperatur behandelt. Darauf wird das Reaktionsprodukt mit Äther ausgefällt ; 440 mg (= 91"/o der Theorie) CH3CO-Ser-Tyr-Ser-Met-Glu- His-Phe-Arg-Try-Gly-Lys (Pht)-Pro-Val-NH2 (Lysll-Ne- phthalyl-a-MSH).
Es ist elektrophoretisch rein ; 1 Fleck bei 14 cm (positive Reaktion mit den Reagentien nach Pauly, Sakaguchi und Ehrlich) nach 7 Stunden und 7 Vol/cm in 1-n. Essigsäure auf Papier. k) Ac-Ser-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Try-Gly Lys-Pro-Val-NH2, CH3COOH 440 mg des Lysll-Ns-phthalyl-a-MSH werden in 20 ml 2-m. Hydrazinacetatlösung in Methanol während 15 Stunden auf 50 erwärmt. Danach wird die Lösung im Vakuum stark eingeengt, mit 20 ml warmem Aceton (35-40 ) aufgenommen und das a-MSH durch langsame Zugabe von Ather ausgefällt.
Durch kontinuierliche Elektrophorese in 1-n. Essigsäure lässt sich das Ac-Ser Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Try-Gly-Lys-Pro-Val NH, CH3COOH (a-MSH) von etwa 30 ouzo unumgesetztem Ausgangsmaterial in reiner Form abtrennen (Kon- trolle durch Elektrophorese in Pyridin-Eisessig-Wasser 9 : 1 : 90, pH 5,9). Das Ausgangsmaterial kann durch nochmaliges Umsetzen mit Hydrazinacetat vollständig in das gewünschte a-MSH umgesetzt werden.