CH437337A

CH437337A - Verfahren zur Herstellung von Peptiden

Info

Publication number: CH437337A
Application number: CH1059961A
Authority: CH
Inventors: Schwyzer Robert Dr Prof; Sieber Peter
Original assignee: Ciba Geigy
Priority date: 1961-09-13
Filing date: 1961-09-13
Publication date: 1967-06-15
Also published as: US3247178A

Description


  



  Verfahren zur Herstellung von Peptiden
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein neues Verfahren zur Herstellung von Peptiden.



   Bei der Synthese von Peptiden, welche a,   M-Diamino-    alkansäuren enthalten, ist es notwendig, die beiden Aminogruppen vorübergehend zu schützen, bzw. von den geschützten Gruppen lediglich die a-Aminogruppe selektiv freizusetzen. Die selektive, Abspaltung der a Aminoschutzgruppe konnte man bisher aber in vielen Fällen nicht durchführen, da bei den bekannten Schutzgruppe-Kombinationen in a-und co-Stellung gleichzeitig auch die unerwünschte Abspaltung der   M-Amino-    schutzgruppe eintrat.



   Das erfindungsgemässe Verfahren zur Herstellung von Peptiden, welche von natürlichen a,   cs-Diamino-    alkansäuren sich ableitende a,   a)-Diamino-alkanylreste    enthalten, durch Vereinigung entsprechender Aminosäuren oder Peptide unter intermediärem Schutz von   Amino-und/oder    Carboxylgruppen ist, dadurch gekennzeichnet, dass man die   #-Aminogruppe    der a,   co-Di-      amino-alkanoylreste    durch den Phthalylrest und die   u-Aminogruppe    der a,   #-diaminoalkanoylreste    durch die   tert.-Butyloxycarbonylgruppe    (BOC) schützt und dass man die Butyloxycarbonylgruppe nach Einführung der geschützten   a,      a)

  -Diamino-alkanoylreste    in die Aminosäurekette durch stark saure Agenzien bei einem pH unter 4 entfernt und die Phthalylgruppe in   Gegen-    wart eines Hydrazinsalzes in einem schwach sauren Medium mit einem pH von 4-7 abspaltet.



   Die Vereinigung der a,   aj-Diaminoalkansäure    oder eines diese enthaltenden Peptids mit einer weiteren Aminosäure oder einem Peptid wird z. B. in an sich bekannter Weise nach der   Carbodiimidmethode,    der Azidmethcde, der   Anhydridmethode    oder der Methode der aktivierten Ester vorgenommen.



   Wird die   Diaminoalkansäure oder    ein diese enthaltendes Peptid am Aminoende einer Aminosäure oder eines Peptids ankondensiert, so kann man das   NQ-BOC-      N-Phthalylderivat,    z. B.   N-BOC-N--Phthalyl-Lysin    verwenden ; wird hingegen ein die Diaminoalkansäure enthaltendes Peptid am   Carboxylende    einer Aminosäure oder eines Peptids ankondensiert, so muss die erste eine freie Aminogruppe, z.   B.    eine freie   a-Amino-    gruppe aufweisen ; aus einem   Na-BOGN-Phthalyl-    derivat muss also z. B. zunächst die   BOC-Gruppe    abgespalten werden.



   Die als Ausgangsstoffe verwendeten Derivate der Diaminoalkansäuren, in denen die Aminogruppen in der genannten Weise geschützt sind, sind neu. Ausgehend von bekannten   Nt-Phthalylderivaten,    z. B. dem NE Phthalyl-Lysin, lassen sie sich nicht herstellen. Über  raschenderweise    können die Ausgangsstoffe, z. B. das neue   Na-tert.-Butyloxyzarbonyl-N-phthal-L-lysin    (BOC Lys (Pht)-OH), wie folgt synthetisiert werden :
Die Carbobenzoxygruppe (Z) des bekannten BOC Lys (Z)-OH wird durch katalytische Hydrierung abgespalten. Das erhaltene, neue BOC-Lysin wird in alkalischem Medium mit N-Carbäthoxy-phthalimid umgesetzt, wobei das BOC-Lys (Pht)-OH in praktisch quantitativer Ausbeute erhalten wird.

   In anaologer Weise lassen sich auch die anderen   Na-BOC-Nt-phthalyl-diaminoalkan-    säuren herstellen.



   Wie bekannt, kann ein Phthalylrest durch alkalische Behandlung, insbesondere mit Hydrazin, leicht   abge-    spalten werden. Eine solche Abspaltung   lässt    sich aber bei vielen Peptiden, so z. B. bei   Corticotropin    und abzw.   ss-MSH,    die besonders   alkaliempfindlich    sind, nicht durchführen. Andererseits ist der Phthalylrest   gegen-    über starken Säuren sehr beständig. Es wurde nun überraschenderweise gefunden, das sich der Phthalylrest in schwach saurem Medium bei einem pH-Wert zwischen 4 und 7 in Gegenwart von einem Hydrazinsalz abspalten lässt. Die Lösungen werden z.

   B. durch Kombination von Hydrazin mit einer organischen oder anorganischen Säure cder durch Auflösen eines Hydrazinsalzes in wässriger oder   wässrig-organischer Lösung erhalten.    Als Säuren können z. B. Salzsäure, Schwefelsäure, Phosphorsäure usw., oder Essigsäure, Propionsäure, Phthalsäure, Benzoesäure usw., verwendet werden.



   Demgegenüber   lässt    sich der   tert.-Butyloxycarbonyl-    rest nur in stark sauren Medien, d. h. bei einem pH  Wert unter 4, abspalten. Es können starke anorganische oder organische Säuren verwendet werden.



   Das verschiedene Verhalten des Phthal-und des   tert.-Butyloxycarbonylrestes    gegenüber alkalischen, schwach und stark sauren Mitteln ist in der Peptidsynthese von grossem Vorteil. Während nämlich der   Nu-    Phthalylrest des   N"-BOC-N'"-phthalyl-peptids    bei der Synthese eines langkettigen Peptids durch mehrere Ver  fahrensschritte,    ja sogar bis zur Endstufe der Synthese, im Molekül intakt verbleiben sollte,   lässt    sich der tert. Butyloxycarbonylrest an jeder geeigneten Synthesestufe durch Behandlung mit starken Säuren abspalten. Wenn erwünscht, kann auch der   tert.-Butyloxycarbonylrest    belassen und der Phthalylrest in schwach saurem Medium eines Hydrazinsalzes abgespalten werden.



   So   lässt    sich z. B. die unten angegebene Teilsequenz der Aminosäuren 15-24 des   Corticotropins    durch Verwendung des neuen Lysinderivates, nämlich der   Na-      BOC-Ne-phthalyllysins,    in ausgezeichneter Ausbeute herstellen.



   Eine vorteilhafte Durchführung der Synthese der genannten Teilsequenz wird im Schema 1 aufgezeichnet.



  In dieser Synthese wird zugleich gezeigt, dass zur Veresterung bzw. zum Schutze einer Carboxylgruppe der   p-Phenylazobenzylalkohol    sehr geeignet ist. Die erhaltenen Aminosäure-oder Peptidester sind farbig und er  leichtern    somit die Isolierung und die   Reindarstellung    dieser Zwischenprodukte, z. B. in der Verteilungschromatographie oder multiplikativen Verteilung. Die farbige Carboxylschutzgruppe   lässt    sich nachher durch Hydrazinolyse, Hydrolyse oder katalytische Hydrierung entfernen.



   BOC bedeutet eine tert.-Butyloxycarbonylgruppe, Py Pyridin, TF Trifluoressigsäure, DCCI Dicyclohexylcarbodiimid, PAB p-Phenylazobenzyl udn  gem. Anh.  die   Peptidverknüpfungsmethode    der   gemischten An  hydride  .   



   Die Verknüpfung eines Lysinderivates mit einem Peptid nach der Methode der aktivierten Ester ist in Beispiel 4 veranschaulicht (Kondensation von BOC-Lys (Pht)-pentachlorphenylester mit Arg-Arg-Pro-Val-Lys (Pht)-Val-Tyr-Pro-OPAB).



   Weiter bietet das genannte Verfahren Vorteile bei der Synthese   des a-melanophorenstimulierenden    Hor  mons      (a-MSH)    der Formel   a-Acetyl-L-seryl-L-tyrosyl-      L-seryl-L-methionyl-L-glutamyl-L-histidyl-L-phenyl- alanyl-L-arginyl-L-tryptophylglycyl-L-lysyl-L-prolyl-L-      valin-amid.    Dieses Tridekapeptid wurde von St. Guttmann et R. A. Boissonnas synthetisiert (Helv. Chim.



  Acta 42,1257 [1959]), doch bot die Abspaltung der Schutzgruppen grosse Schwierigkeiten. Die hier beschriebene Synthese, bei der die Aminogruppe des Lysins durch den Phthalylrest geschützt ist, verläuft hingegen sehr glatt. Schema 2 zeigt den Verlauf der Synthese, bei der das bekannte Dekapeptidderivat BOC-Ser Tyr-Ser-Met-Glu   (O-tert.-butyl)-His-Phe-Arg-Try-Gly-    OH (vgl. Patent Nr. 408 948) mit dem Tripeptidderivat   N8-Phthalyl-L-lysyl-L-propyl-L-valin-amid    verknüpft wird. 



     Schema 1   
EMI3.1     

 \\-Ul712UH
<tb> BOC-Pra-OH <SEP> . <SEP> BOC-Pro-OFAB <SEP> H-Pro-OPAB
<tb> CCI <SEP>  >  <SEP> BOC-&verbar; <SEP> Tyr <SEP> Pro <SEP> &verbar;-OPAB- >  <SEP> H-&verbar; <SEP> Tyr <SEP> Pro <SEP> &verbar;-OPAB <SEP> OC <SEP> &verbar; <SEP> Val <SEP> &verbar;

  -OHy
<tb> DCCI,Py
<tb> BOC-Tyr-OH <SEP> HCI <SEP> BOC-Val-OH
<tb> BOC-Tyr <SEP> Pro-OPAB-- <SEP> H-Tyr <SEP> Pro-OPAB
<tb> DCCI <SEP> gem. <SEP> Anhydrid
<tb> "-" <SEP> gem. <SEP> Anhydrid
<tb> Pht
<tb> FgCCOOH <SEP> BOC-Lys-OH
<tb> BOC-Val <SEP> Tyr <SEP> Pro <SEP> |-OPAB <SEP>  >  <SEP> H-t <SEP> Val <SEP> Tyr <SEP> Pro <SEP> OPAB
<tb> gem. <SEP> Anhydrid
<tb> Pht <SEP> Pht
<tb> TFBOC-Val-OH
<tb> BOC-Lys <SEP> Val <SEP> Tyr <SEP> Pro-OPAB-- <SEP> H-L <SEP> s <SEP> Val <SEP> Tyr <SEP> Pro-OPABgem.Anhydrid
<tb> Pht <SEP> Ph
<tb> TF <SEP> BOC-Pro-QH
<tb> BOC-Val <SEP> Lys <SEP> Val <SEP> Tyr <SEP> Pro-OPAB-- <SEP> H-Val <SEP> Lys <SEP> Val <SEP> Tyr <SEP> Pro-OPAB
<tb> gem.

   <SEP> Anhydrid
<tb> Pht <SEP> Pht
<tb> TUF
<tb> BOC-| <SEP> Pro <SEP> Val <SEP> L$s <SEP> Váí <SEP> Tyr <SEP> Pra-OPAB--- <SEP> H-Fro <SEP> Val <SEP> Lys <SEP> Val <SEP> Tyr <SEP> Pro <SEP> -OPAB
<tb> N 2
<tb> N02 <SEP> Pht <SEP> N02 <SEP> Pht
<tb> BOC-Aig-OH <SEP> TF
<tb> BOC-Arg <SEP> Pro <SEP> Val <SEP> Lys <SEP> Val <SEP> Tyr-OPAB <SEP> H-I <SEP> Arg <SEP> Pro <SEP> Val <SEP> Lys <SEP> Val <SEP> Tyr <SEP> Pro-OPAB
<tb> gem.Anhydrid
<tb> N0
<tb> N02 <SEP> NO.

   <SEP> Pht <SEP> N02 <SEP> N02 <SEP> Pht
<tb> BOC-X-OH
<tb> DOC-FXrgArg <SEP> Pro <SEP> Val <SEP> Lµs <SEP> Váí <SEP> Tyr <SEP> Pro <SEP> |-OPAB <SEP>  >  <SEP> H-| <SEP> Arg <SEP> Arg <SEP> Pro <SEP> Val <SEP> Lys <SEP> Val <SEP> Tyr <SEP> Pro <SEP> OPAB
<tb> Pht
<tb> Pht <SEP> NO <SEP> NO <SEP> Pht <SEP> Pht <SEP> N02 <SEP> N02 <SEP> Pht
<tb> BOC-Lys-OH <SEP> TF
<tb> BOC-Lys <SEP> Arg <SEP> Arg <SEP> Pro <SEP> Val <SEP> Lys <SEP> Val <SEP> Tyr <SEP> Pro-OPAB <SEP> H-FLys <SEP> Arg <SEP> g <SEP> Pro <SEP> Val <SEP> Lys <SEP> Val <SEP> Tyr <SEP> Pro <SEP> -OPAB
<tb> gem.Anhydrid
<tb> Pht
<tb> Pht <SEP> Pht <SEP> Pht <SEP> NO2 <SEP> Pht
<tb> BOC-s-OH
<tb> gem. <SEP> BOC- <SEP> Lys <SEP> Lys <SEP> Arg <SEP> Arg <SEP> Pro <SEP> Val <SEP> Lys <SEP> Val <SEP> Tyr <SEP> Pro <SEP> |-OPAB
<tb> gem.

   <SEP> Anhydrid
<tb>    Schema 2   
EMI4.1     

 O-C4Hg <SEP> (tert.) <SEP> Pht
<tb> BOC-Ser <SEP> Tyr <SEP> Ser <SEP> Met <SEP> Glu <SEP> His <SEP> Phe <SEP> Arg <SEP> Try <SEP> Gly-OH <SEP> BOC-Lys-OH <SEP> BOC-Pra-OH <SEP> Z-Val-OH
<tb> NHg <SEP> gem. <SEP> Anhydrid
<tb> V
<tb> Z-1 <SEP> Val <SEP> 1-NH2
<tb> H, <SEP> (Pd) <SEP> in <SEP> Essigsäure
<tb> Y
<tb> Val-NH2, <SEP> CH3COOH
<tb> gem. <SEP> Anhydrid
<tb> BOC-ProVal <SEP> !-NHa
<tb> TF
<tb> H-Pro <SEP> Val-NH2, <SEP> CFgCOOH
<tb>  Amberlite <SEP> IRA-400) <SEP>  > 
<tb> (Acetatform)
<tb> H-Pro <SEP> Val-NH2, <SEP> CHSCOOH
<tb> Pht <SEP> gem.

   <SEP> Anhydrid
<tb> VU
<tb> BOC-Lys <SEP> Pro <SEP> Val-NH2
<tb> Pht <SEP>  > | <SEP> HCl <SEP> in <SEP> Essigester
<tb> H-| <SEP> Lys <SEP> Pro <SEP> Val-NH2, <SEP> HCl
<tb> O-C4Hg <SEP> (tert.) <SEP> Pht <SEP> DCCI
<tb> .t-,
<tb> BOC-Ser <SEP> Tyr <SEP> Ser <SEP> Met <SEP> Glu <SEP> His <SEP> Phe <SEP> Arg <SEP> Try <SEP> Gly <SEP> Lys <SEP> Pro <SEP> Val-NH2
<tb> PhtTF
<tb> I
<tb> H-Ser <SEP> Tyr <SEP> Ser <SEP> Met <SEP> Glu <SEP> His <SEP> Phe <SEP> Arg <SEP> Try <SEP> Gly <SEP> Lys <SEP> Pro <SEP> Val-NH2
<tb> PhtCHCOOCHNO, <SEP> (p)
<tb> CHgCO-.

   <SEP> Ser <SEP> Tyr <SEP> Ser <SEP> Met <SEP> Glu <SEP> His <SEP> Phe <SEP> Arg <SEP> Try <SEP> Gly <SEP> Lys <SEP> Pro <SEP> Val <SEP> 1-NH2
<tb> H2N-NH2, <SEP> 2CH, <SEP> COOH
<tb> CHgCO-Ser <SEP> Tyr <SEP> Ser <SEP> Met <SEP> Glu <SEP> His <SEP> Phe <SEP> Arg <SEP> Try <SEP> Gly <SEP> Lys <SEP> Pro <SEP> Vall-NH2
<tb>  
In den nachfolgenden Beispielen sind die Temperaturen in Celsiusgraden angegeben.



   Beispiel   1   
BOC-Lys (Pht)-OH
41 g BOC-Lys (Z)-OH [Lit. : G. H. Anderson und A. C.   McGregor,    J. A. C. S. 79,6180 (1957] werden in 400 ml   95"/tigem Methanol    in Gegenwart von 4,1 g   10  /oiger    Paladiumkohle hydriert. Nach dem   Abfiltrie-    ren des Katalysators wird das Filtrat im Vakuum verdampft. Der zurückgebliebene Schaum wird in 100 ml abs. Athanol gelöst ; beim Aufbewahren der Lösung kristallisiert das   BOC-L-lysin    aus. Total werden 24 g  =   90 ouzo    erhalten. F.   204-205  C    und Zers. Die Substanz kann aus Wasser-Aceton umkristalisiert werden.



  Sie ist   papierchromatographisch    einheitlich. Der Schmelzpunkt ändert sich nicht. 17,6 g des obigen BOC  L-lysins    werden in 70 ml Wasser mit 7,6 g wasserfreiem Natriumcarbonat gelöst. Unter Rühren werden 19,7 g   N-Carbäthoxyphthalimid    zugegeben und 30 Min. rühren gelassen. Die Lösung wird klar filtriert, auf   0  C ge-    kühlt, mit 2-n. Salzsäure auf pH 2 angesäuert und mit Essigester extrahiert. Die Essigesterauszüge werden mit 120 ml gesättigter Natriumhydrogencarbonatlösung ausgezogen, diese wiederum mit 2-n. Salzsäure angesäuert und mit Essigester extrahiert. Aus den Essigesterextrakten erhält man nach Waschen, Trocknen und Verdampfen 26,6 g =   99 O/o    d. Th. eines farblosen glasartigen Produktes.

   Die Verbindung ist chromatographisch   ein-    heitlich.



   Beispiel 2
Abspaltungsversuche der Phthalylgruppe a) aus   Lys (Pht)-OH   
1,565 g   Nf-Phthal-L-lysin-hydrochlorid    [Lit. : G. H.



  L. Nefkens, G. I. Tesser und R. J. F. Nivard, Rec. Trav. chim. Pays-Bas 79,688 (1960)] werden in 8 ml Wasser gelöst, Bei 50  werden dazu eine Lösung von 1,46 ml Hydrazinhydrat und 1,43 ml Eisessig in 3 ml Methanol gegeben, kurz zum Sieden erhitzt und noch 2 Stunden bei   50  aufbewahrt.    Es bildet sich eine dicke Fällung.



  Auf 0  gekühlt, abgenutscht, mit Wasser gewaschen.



  Es werden 747 mg Phthalylhydrazid =   92 I/o    d. Th. erhalten. Das Filtrat wird dünnschichtchromatographisch untersucht : Es enthält neben sehr viel Lysin noch wenig   N-Phthalyl-lysin.    b) aus BOC-Lys (Pht)-Val-Tyr-Prop-p phenylazobenzylester
465 mg BOC-Lys (Pht)-Val-Tyr-Pro-OPAB (Herstellung in Beispiel 3e beschrieben) werden mit 5 ml 2-m. Hydrazinhydrat + 2-m. Essigsäure (pH 6,5) in Methanol bei   50  aufbewahrt    und nach verschiedenen Zeiten 0,5 ml Proben entnommen. Diese werden mit Essigester verdünnt, mit Kaliumcarbonatlösung extrahiert, zur Trockene verdampft und   dünnschichtchro-      matographisch    untersucht im   System Chloroform-Aceton    7 : 3.



   Ergebnis : Nach 2 Stunden ist der   grösste    Teil des Ausgangsmaterials verschwunden, nach 17 Stunden ist das Ausgangsmaterial vollständig verschwunden. Entsprechend nimmt der Flecken an   BOC-Lys-Val-Tyr-    Pro-OPAB zu.



   Als Nebenreaktion verläuft die Hydrazinolyse des Esters, erkenntlich an der Bildung von p-Phenylazobenzylalkohol. Diese Nebenreaktion geht wesentlich langsamer als die Abspaltung der Phthalylgruppe vor sich.



   Beispiel 3 a) Pro-OPAB, HC1
20,9 g   BOC-L-prolin    und 22,7 g p-Phenylazobenzylalkohol werden in 200 ml Pyridin gelost, bei   0  mit      22      g    Dicyclohexylcarbodiimid versetzt und dann über Nacht bei Raumtemperatur stehen gelassen. Nach Zusatz von einigen ml Eisessig wird auf 0  gekühlt und der   Dicyclohexylhamstoff    abgenutscht. Das Filtrat wird nach Verdampfen des Pyridins in Essigester gelöst und mit 0,5-n. Salzsäure und   Natriumhydrogencarbonat-    lösung auf Neutralprodukt aufgearbeitet. Erhalten   wer-    den ca. 40 g eines roten Ols.



   Dieses wird in 100 ml abs. Essigester gelöst und mit 500 ml 3-n. Salzsäure in Essigester versetzt. Nach   Va    Stunde wird im Vakuum bei   40  zur    Trockene verdampft. Der Rückstand wird in 500 ml Chloroform gelöst und durch eine Säule aus 1 kg Silicagel filtriert. Mit Chloroform   lässt    sich eine Verunreinigung eluieren, dann wird die gesuchte Substanz mit Chloroform +10 Prozent Methanol herausgewaschen. Erhalten werden 34 g Pro-OPAB, HC1. Diese werden aus abs. Äthanol umkristallisiert. Ausbeute : 26,0 g =   77 I/o    d. Th. ; F.



  (177)   180 .    b) Tyr-Pro-OPAB,   HCI   
1,39 g Pro-OPAB, HC1 werden in 10 ml Wasser gelöst, mit Essigester überschichtet und bei   0  mit    Kaliumcarbonat alkalisiert. Der Essigesterextrakt wird neutral gewaschen und im Vakuum bei   40  verdampft.    Der Rückstand und 1,13 g   BOC-Tyr-OH    werden in 20 ml Acetonitril und 1 ml Dimethylfcrmamid gelöst und bei   0  mit    0,91 g Dicyclohexylcarbodiimid versetzt. Nach Stehen über Nacht bei   0  wird    der Dicyclohexylharnstoff abgenutscht, das Filtrat eingeengt, in Essigester aufgenommen und mit 0,5-n. Salzsäure und Natriumhydrogencarbonatlösung ausgeschüttelt. Das erhaltene Neutralprodukt wird mit Salzsäure in Essigester von der   BOC-Gruppe    befreit.

   Das Hydrochlorid kristallisiert aus   Methanol-Ather.    Ausbeute : 1,68 g =   82 /e    d. Th. ; F.



     204  u.    Zers. c) BOC-Val-Tyr-Pro-OPAB
9 g BOC-Val-OH, gelöst in 90 ml abs.   Tetrahydro-    furan und 5,7 ml Triäthylamin, werden   bei-10  bis    -15  mit 5,0 ml Isobutylchlorocarbonat versetzt. Nach 15-20 Minuten werden gleichzeitig 17,25 g   Tyr-Pro-    OPAB, HC1, gelöst in 120 ml abs. Dimethylformamid und 4,7 ml Triäthylamin, in 45 ml abs. Tetrahydrofuran zugetropft. Anschliessend wird noch eine Stunde bei   0     gerührt, dann über Nacht im Kühlschrank stehen gelassen. Die Mischung wird eingeengt, in Essigester aufge  nommen    und bei   0  mit    0,5-n. Salzsäure und Natriumhydrogencarbonatlösung ausgeschüttelt. Das erhaltene Neutralprodukt wird aus Methanol-Wasser umkristallisiert.

   Ausbeute : 20,15 g   BOC-Val-Tyr-Pro-OPAB =      88 O/o    d. Th. ; F.   106-108 .   



   Dünnschichtchromatogramm : Einheitlich in Chloroform-Aceton 7 : 3 ; Rf 0,54. d) Val-Tyr-Pro-OPAB
17,0 g   BOC-Val-Tyr-ProWOPAB    werden unter   Küh-    lung mit kaltem Wasser mit 50 ml Trifluoressigsäure übergossen und geschüttelt bis gelöst. Die Lösung wird 5 Minuten bei Raumtemperatur aufbewahrt, dann im Vakuum bei Raumtemperatur verdampft. Das   61    wird in Chloroform gelöst, einmal mit Wasser extrahiert, dann die Chloroformlösung bei   0  mit gesättigter Na-    triumhydrogencarbonatlösung gerührt bis keine Kohlenstoffdioxyd-Entwicklung mehr statfindet. Die Chloro   formschicht    wird abgetrennt, mit Natriumsulfat getrocknet und zur Trockene verdampft. Ausbeute : 14,8 g   Val-Tyr-Pro-OPAB = 100 0/c, d.    Th.



   Dünnschichtchromatogramm :   Chloroform-Aceton    7 : 3 : Einheitlich Rf 0,2 ; Benzol-Aceton 1 : 1 : Einheitlich Rf 0, 45.    e)    BOC-Lys   (Pllt)-Val-Tyr-Pro-OPAB   
Aus 7,4 g BOC-Lys (Pht)-OH wird wie in Beispiel 3c beschrieben, das gemischte Anhydrid hergestellt und dieses mit 6,43 g Val-Tyr-Pro-OPAB umgesetzt. Ausbeute : 9,08 g BOC-Lys (Pht)-Val-Tyr-Pro-OPAB =   87 O/o    d. Th.



     Dünnschichtchromato, gramm    : Chloroform-Aceton 7 : 3 : Einheitlich Rf 0,4 ;   Benzol-Aceton    1 : 1 : Einheitlich Rf 0,62.    f)    Lys   (Pht)-Val-Tyr-Pro-OPAB   
9,08 g   BOC-tetrapeptid    werden wie im Beispiel 3d mit Trifluoressigsäure behandelt und aufgearbeitet. Ausbeute : 8, 1 g Lys(Pht)-Val-Tyr-Pro-OPAB =   100 0/0    d. Th.



     Dünnschichtchromatcgramm    : Chloroform-Aceton 7 : 3 : Einheitlich Rf 0,16 ;   Benzol-Aceton    1 : 1 : Einheitlich Rf 0,42.    g) BOC-Val-Lys (Pht)-Val-Tyr-Pro-OPAB       Aus 3,    5 g   BOC-Val-OH    und 8,1 g Lys (Pht)-Val Tyr-Prc-OPAB werden nach der in Beispiel 3c beschrie  b :. nen Methede    8,8 g   BOC-pentapeptid    =   88 O/o    d. Th. erhalten.



   Dünnschichtchromatogramm :   Chloroform-Aceton    7 : 3 : Einheitlich Rf 0,36 ; Benzol-Aceton 1 : 1 : Einheitlich Rf 0,65. h)   Val-r, ys (Pht)-Val-Tyr-Pro-OPAB   
Aus obigen 8,8   g      BOC-pentapeptidester    wird mit Trifluoressigsäure entsprechend der im Beispiel 3d be  schriebenen    Methode 8,2 g Val-Lys (Pht)-Val-Tyr-Pro OPAB =   10"/c    d. Th. erhalten.



   Dünnschichtchromatogramm :   Chloroform-Aceton    7 : 3 : Einheitlich Rf 0,14 ;   Benzol-Aceton    1 : 1 : Einheitlich Rf 0, 33. i) BOC-Pro-Val-Lys   (Pht)-Val-Tyr-Pro-OPAB   
3,3   g BOC-Pro-C) H und    8,2 g Val-Lys (Pht)-Val  Tyr-Pro-OPAB    werden analog der im Beispiel 3c be  schriebenen    Methode umgesetzt und aufgearbeitet. Ausbeute : 9,05 g BOC-Pro-Val-Lys (Pht)-Val-Tyr-Pro OPAB = 91 % d. Th.



     Dünnschichtchromatcgramm    :   Chloroform-Aceton    7 : 3 : Einheitlich Rf 0,25 ; Benzol-Aceton 1 : 1 : Einheitlich Rf   0,    49 ;   Chloroform-Methanol    9 : 1 : Einheitlich Rf 0,75. k) Pro-Val-Lys(Pht)-Val-Tyr-Pro-OPAB
9,05 g BOC-Pro-Val-Lys (Pht)-Val-Tyr-Pro-OPAB werden wie im Beispiel 3d beschrieben, mit Trifluoressigsäure behandelt. Ausbeute : 8,65 g Pro-Val-Lys   (Pht)-Val-Tyr-Pro-OPAB    = 100 % d. Th.



   Dünnschichtchromatogramm : Chloroform-Methanol 9 : 1 :   Rf 0,    38.



   Eine Probe des Peptids wird durch Hydrierung in Pro-Val-Lys (Pht)-Val-Tyr-Pro-OH übergeführt. Dieses Prcdukt wird wie in Beispiel2 beschrieben, mitHydrazin und Essigsäure von der Phthalylgruppe befreit. Das freie Hexapeptid wird papierchromatographisch und   elektro-      pheretisch    geprüft und einheitlich befunden. Vom freien Peptid wird nach   Totalhydrolyse    eine quantitative Aminosäureanalyse durchgeführt. Gefunden wurden : Lysin 0,96 ; Ammoniak 0,28 ; Valin 2,0 ; Prolin 2,13 ; Tyrosin 0,87.



  1) BOC-Arg   (NO2)-Pro-Val-Lys (Pht)-Val-Tyr-Pro-OPAB   
Aus 893 mg BOC-Arg   (NO2)-OH    und 2,05 g Pro Val-Lys   (Pht)-Val-Tyr-Pro   OPAB    werden nach der im Beispiel 3c beschriebenen Methode 2,21 g =   83  /o    d. Th.   BOC-heptapeptid    erhalten.



   Dünnschichtchromatogramm : Chloroform-Methanol 9 : 1 : Hauptkomponente 0,58 ; Verunreinigung 0,79.



   Die Verunreinigung lässt sich leichter nach Abspaltung der   BOC-Gruppe    abtrennen, weshalb das Produkt auf dieser Stufe nicht gereinigt wird. m)   Arg (NO)-Pro-Val-Lys (Pht)-Val-Tyr-Pro-OPAB   
3,06 g des im Beispiel 31 beschriebenen Gemisches werden nach der im Beispiel 3d beschriebenen Methode mit Trifluoressigsäure umgesetzt und aufgearbeitet. Das erhaltene Rohprodukt wird an der 30fachen Menge Aluminiumoxyd (Aktivität III) chromatographiert. Mit   Chloroform-Aceton    7 : 3   lässt    sich die Verunreinigung eluieren. Das Arg   (NO2)-Pro-Val-Lys    (Pht)-Val-Tyr-Pro OPAB verbleibt zuoberst in der Säule. Es wird nach Austscssen der Säule mit   Tetrahydrofuran-Wasser    9 : 1 extrahiert. Ausbeute : 2,14 g =   76 ouzo    d.

   Th.



   Dünnschichtchromatogramm : Chloroform-Methanol 9 : 1 : Einheitlich Rf 0,13. n) BOC-Arg(NO2)-Arg(NO2)-Pro-Val-Lys(Pht)   Val-Tyr-Pro-OPAB   
Aus 910 mg BOC-Arg   (NOa)-OH    und obigen 2, 14 g Arg   (N02)-Pro-Val-Lys (Pht)-Val-Tyr-Pro-OPAB    werden nach der in Beispiel 3c beschriebenen Methode 2,33 g = 87 % d. Th. BOC-Oktapeptidester erhalten.



   Dünnschichtchromatogramm : Chloroform-Methanol 9 :   1    : Einheitlich Rf 0,   36.    o)Arg(NO2)-Arg(NO2)-Pro-Val-Lys(Pht)
Val-Tyr-Pro-OPAB
Aus 3,4 g   BOC-Oktapeptidester    wird nach der in Beispiel 3d beschriebenen Methode 3,3 g Arg (NO2) Arg   (NO2)-Pro-Val-Lys      (Pht)-Val-Tyr-Pro¯OPAB'=    100 Prozent d. Th. erhalten.



   Dünnschichtchromatogramm : Chloroform-Methanol 9 :   1    : Einheitlich Rf 0,03. p) BOC-Lys (Pht)-Arg(NO2)-Arg(NO2)
Pro-Val-Lys(Pht)-Val-Tyr-Pro-OPAB
1,29 g BOC-Lys (Pht)-OH und 3,1 g   Oktapeptid-    ester werden wie in Beispiel 3c beschrieben, umgesetzt.



  Die Aufarbeitung erfolgt etwas anders : Das   ausgefal-    lene Triäthylammoniumchlorid wird abgenutscht und das Filtrat in   Ather    eingetropft. Die Fällung wird abgenutscht. Ausbeute : 3,56 g   =      92 I/o    d. Th.



   Dünnschichtchromatogramm : Chloroform-Methanol 9 : 1 : Einheitlich Rf 0,5 ;   Dioxan-Wasser    9 : 1 : Einheitlich Rf 0,73. q) Lys   (Pht)-Arg (NO2)-Arg (NO2)-Pro-Val-Lys (Pht)-   
Val-Tyr-Pro-OPAB
3,40 g BOC-Nonapeptidester werden wie in Beispiel 3d beschrieben, mit Trifluoressigsäure behandelt. Ausbeute 3,30 g Lys (Pht)-Arg   (NO.)-Arg      (NO2)-Pro-Val-    Lys   (Pht)-Val-Tyr-Pro-OPAB    =   100  /o d.    Th.



   Dünnschichtchromatogramm : Chloroform-Methanol 9 : 1 : Einheitlich Rf 0,12 ;   Dioxan-Wasser    9 : 1 : Einheitlich Rf 0,62. r) BOC-Lys (Pht)-Lys(Pht)-Arg(NO2)-Arg(NO2)
Pro-Val-Lys (Pht)-Val-Tyr-Pro-OPAB
Aus 1355 mg BOC-Lys   (Pht)-OH    und 3,30 g Lys (Pht)-Arg   (NO)-Arg    (NO2)-Pro-Val-Lys (Pht)-Val-Tyr Pro-OPAB werden analog der inBeispiel 3c beschriebenen Methode 3,43 g   BOC-Dekapeptidester    = 86 % d. Th. erhalten.



   Dünnschichtchromatogramm : Chloroform-Methanol 9 : 1 : Einheitlich Rf 0,57 ; Dioxan-Wasser 9 : 1 : Einheitlich Rf 0, 74.



   Beispiel 4 a) BOC-Lys (Pht)-pentachlorphenylester
50,9 g BOC-Lys (Pht)-OH und 43,2 g Pentachlorphenol werden in 160 ml abs. Essigester gelöst und bei   0  mit    30,7 g Dicyclohexylcarbodiimid versetzt. Nach Stehen über Nacht bei 0  wird der Dicyclohexylharnstoff abgenutscht und gut mit eiskaltem Essigester gewaschen.



  Das Filtrat wird im Vakuum zur Trockene verdampft und der Rückstand aus 500 ml Athanol umkristallisiert.



  Man erhält eine 1. Fraktion von 40,8 g Pentachlorphenylester vom F.   140-142 .   



   Aus der Mutterlauge wird noch eine 2. Fraktion von
16,7 g erhalten, total   68  /o    d. Th.



   Zur Analyse wird nochmals aus Athanol umkristallisiert, worauf der Schmelzpunkt 142-143  beträgt. b)   BOC-Lys (Plit)-Arg-Arg-Pro-Val-Lys (Pht)-   
Val-Tyr-Pro-OPAB, 2   CH3COOH   
1,06 g   Arg-Arg-Pro-Val-Lys      (Pht)-Val-Tyr-ProF    OPAB, 3   CH3COOH, 850    mg BOC-Lys (Pht)-pentachlorphenylester, 2,5 ml Dimethylformamid und 0,094 ml Triäthylamin werden während 17 Stunden bei   40     gerührt. Nach Verdünnen mit Chloroform wird der geschützte   Nonapeptidester    mit Ather ausgefällt, abgenutscht und gut mit Äther gewaschen. Ausbeute : 1,24 g    = 98"/. d.    Th.



   Dünnschichtchromatogramm : Einheitlich im System Essigester-Methyläthylketon-Ameisensäure-Wasser 5 : 3 : 1 :   1.      Rf = 0,    4.



   Beispiel 5 a) Z-Val-NH2
25,1 g Z-Val-OH (R. L. M.   Synge,    Biochem. J. 42, 99 [1948]) werden in 200 ml abs. Tetrahydrofuran gelöst und mit 13,8 ml Triäthylamin versetzt. Bei-10  werden langsam unter Rühren und Feuchtigkeitsausschluss 13,25 ml Chlorameisensäureisobutylester zugetropft. Nachdem sich das gemischte Anhydrid gebildet hat (30 Minuten), wird bei-10  trockenes Ammoniak eingeleitet (bis zur Sättigung).

   Nach weiteren 15 Stunden bei   0  wird    das gebildete   ZVal-NH,    abgenutscht und aus Athanol umkristalisiert ; F.   205-206 ,    Ausbeute fast quantitativ (24 g). b)   Val-NH2,      CH3COOH   
20,3 g Z-Val-NH2 werden in einem Gemisch von
160 ml Eisessig und 40 ml Wasser unter Zusatz von 2 g 10 %iger Palladiumkohle bei Normaldruck hydriert bis kein Wasserstoff mehr verbraucht wird. Nach Filtration vom Katalysator und Verdampfen des Filtrates wird der Rückstand aus 20   ml    Athanol umkristallisiert ;
13,4   g Val-NH"CH3COOH,    F.   102 .   



   Das Acetat wird direkt mit dem gemischten Anhydrid aus   Chlorameisensäure-isobutylester    und tert.  Butoxy-carbonyl-L-prolin    umgesetzt. c)   BOC-Pro-Val-NH2   
Aus 13,6 g   BOC-Pro-OH,    8,75 ml Triäthylamin und 8,4 ml Chlorameisensäure-isobutylester wird das gemischte Anhydrid hergestellt (30   Minuten,-10 ).    Zum Reaktionsgemisch wird dann die Lösung von 11,15 g   Val-NH2,      CH3COOH    in 50 ml absolutem Tetrahydrofuran und 30 ml absolutem Dimethylformamid   zuge-    tropft. Nach   1    Stunde   bei-5  und    15 Stunden bei 0  wird in der üblichen Weise auf Neutralprodukte aufgearbeitet (in Essigester).

   Das Produkt wird aus Äther kristallisiert ; 7,73 g   BOC-Pro-Val-NH2,    F. 85  (Zers.). d)   Pro-Val-NH2,      CH3COOH   
7,73 g   BOC-Pro-Val-NH2    werden unter Kühlung in 25 ml Trifluoressigsäure gelöst. Die Lösung wird nach 5 Minuten im Vakuum verdampft und der Rückstand aus Äthanol-Äther kristallisiert. Ausbeute : 7,5 g Pro  Val-NH2,      CHCOOH    ; F.   167-168     (Zers.).



   7,0 g des Salzes werden in   50"/oigem Methanol    gelöst und durch eine Säule eines stark basischen Anionenaustauschers, z. B. des unter dem Markennamen Amberlite IRA-400 bekannten Produktes von Rohm und Haas (in der Acetat-Form) laufen gelassen. Das Filtrat wird im Vakuum verdampft und der Rückstand aus   Äther-Petroläther    kristallisiert ;

   5,66 g Pro-Val-NH2,   CH3COOH,    F.   137-138 .    e)   BOC-Lys (Pht)-Pro-Val-NH2   
Aus 5,26 g BOC-Lys (Pht)-OH und 1,67 ml   Chlor-      ameisensäure-isobutylester    wird in 30 ml   Tetrahydro    furan und 1,94 ml   Triäthylamin bei-10  das    gemischte Anhydrid hergestellt, welches (ohne isoliert zu werden) mit der Lösung von 2,73 g   Pro-Val-NHQ, CHgCOOH    in 14 ml absolutem Dimethylformamid umgesetzt wird.



  Nach 15 Stunden Reaktionsdauer (bis   0 )    wird die Lösung im Vakuum stark eingeengt, der Rückstand in Essigester und Wasser gelöst und in der üblichen Weise bei   0     (mit verdünnter Salzsäure und   Natriumbicarbon,    at) auf   Neutralprodukte aufgearbeitet.    Das Neutralprodukt wird aus siedendem Essigester kristallisiert ; BOC Lys   (Pht)-Pro-Val-NH2,    Ausbeute : 65 %, F. 172,5  173 .

   Dünnschichtchromatographie    auf Silicagel mit dem Lösungsmittel Essigester-Methanol 1 : 3 zeigt, dass die Verbindung einheitlich ist (Rf = 0,73) und durch die Kristallisation von einer geringen Menge einer Verunreinigung mit Rf = 0,55 abgetrennt worden ist.    fI, ys (Pht)-Pro-Val-NH2, HCI   
1 g BOC-Lys   (Pht)-Pro-Val-NH2    wird in 10 ml absolutem Essigester gelöst (siedend), schnell abgekühlt und, bevor Kristallisation einsetzt, mit 6 ml 2,9-n. Salzsäure in Essigester versetzt. Nach einiger Zeit beginnt das Hydrochlorid   auszukristillisieren.    Nach   1    Stunde werden die Kristalle abfiltriert und mit absolutem Essigester und Ather gewaschen ; 613 mg (=   69 ouzo    der Theorie).

   Aus der Mutterlauge lassen sich nochmals 98 mg (=   11  /o)    gewinnen. Im Papierchromatogramm erweist sich die Substanz in verschiedenen Systemen als einheitliche Verbindung.    g)    BOC-Ser-Tyr-Ser-Met-Glu   (O-C, Hgt.)-       His-Phe-Arg-Try-Gly-Lys (Pht)-Pro-Val-NH2   
504 mg BOC'-Ser-Try-Ser-met-Glu(OC4H9t.)-His  Phe-Arg-Try-Gly-OH,    208 mg Lys (Pht)-Pro-Val-NH2, HC1, und 145 mg Dicyclohexylcarbodiimid werden in 5 ml Pyridin während 5 Tagen bei   20  gerührt,    wobei alles in Lösung geht. Das Produkt wird mit einer Mi schung von absolutem Chloroform und Methanol als Gallerte ausgefällt. Durch Waschen mit Wasser wird überschüsiges Tripeptid entfernt.

   Das erhaltene BOC  Ser-Tyr-Ser-Met-Glu (OC=, H9t.)-His-Phe-Arg-Try-Gly-    Lys   (Pht)-Pro-Val-NH2    ist rein, wie das Dünnschicht  chromatogramm    auf   Al203    zeigt. h) H-Ser-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Try    Gly-Lys (Pht)-Pro-Val-NH2,    3   F3CCOOH   
530 mg des Tridekapeptidderivates werden in 7 ml Trifluoressigsäure gelöst, 15 Minuten bei   Zimmertem-    peratur gehalten und im Vakuum bei 40  Badtemperatur vom Lösungsmittel befreit. Ausbeute 518 mg   H-Ser-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Try-Gly-Lys (Pht)-      Pro-Val-NH2,    3 FgCCOOH.

   Es ist elektrophoretisch rein ;   1    Fleck bei 13,2 cm (positive Reaktion mit Ninhydrin, Sakaguchi, Pauly, Ehrlich) nach 5 Stunden und 7 Volt/cm in 1-n. Essigsäure auf Papier. i)   CHCO-Ser-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-       Try-Gly-Lys (Pht)-Pro-Fal-NH2   
Die gemäss h erhaltene Verbindung, deren   Sert-a-    Aminogruppe frei, deren   Lysll-a-Aminogruppe    dagegen geschützt ist, wird mittels des   Essigsäure-p-nitrophenyl-    esters selektiv an der   a-Aminogruppe    acetyliert.



   500 mg des   Ne-Phthalyl-tridekapeptidamid-tri-tri-      fluoracetates    werden in 3 ml absolutem Pyridin und 0,4 ml absolutem Dimethylformamid mit 35 mm3 Tri  äthylamin    und 92 mg O-Acetyl-p-nitrophenol während 22 Stunden bei Zimmertemperatur behandelt. Darauf wird das Reaktionsprodukt mit Äther ausgefällt ; 440 mg (=   91"/o    der Theorie)   CH3CO-Ser-Tyr-Ser-Met-Glu-    His-Phe-Arg-Try-Gly-Lys (Pht)-Pro-Val-NH2   (Lysll-Ne-    phthalyl-a-MSH).

   Es ist elektrophoretisch rein ;   1    Fleck bei 14 cm (positive Reaktion mit den Reagentien nach Pauly,   Sakaguchi    und Ehrlich) nach 7 Stunden und 7 Vol/cm in   1-n.    Essigsäure auf Papier. k) Ac-Ser-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Try-Gly   Lys-Pro-Val-NH2, CH3COOH       440      mg des Lysll-Ns-phthalyl-a-MSH    werden in 20 ml 2-m. Hydrazinacetatlösung in Methanol während 15 Stunden auf   50  erwärmt.    Danach wird die Lösung im Vakuum stark eingeengt, mit 20 ml warmem Aceton   (35-40 )    aufgenommen und das   a-MSH    durch langsame Zugabe von   Ather    ausgefällt.

   Durch kontinuierliche Elektrophorese in   1-n.    Essigsäure lässt sich das Ac-Ser Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Try-Gly-Lys-Pro-Val  NH,      CH3COOH    (a-MSH) von etwa   30 ouzo    unumgesetztem Ausgangsmaterial in reiner Form abtrennen   (Kon-    trolle durch Elektrophorese in Pyridin-Eisessig-Wasser 9 : 1 : 90, pH 5,9). Das Ausgangsmaterial kann durch nochmaliges Umsetzen mit Hydrazinacetat vollständig in das gewünschte   a-MSH    umgesetzt werden.

Claims

PATENTANSPRUCH Verfahren zur Herstellung von Peptiden, welche von natürlichen a, co-Diamino-alkansäuren sich ableitende a, co-Diamino-alkanoylreste enthalten, durchVereinigung entsprechender Aminosäuren oder Peptide unter intermediärem Schutz von Amino und/oder Carboxylgrup- pen, dadurch gekennzeichnet, dass man die co-Amino- gruppe der a, co-Diamino-alkanoylreste durch den Phthalylrest und die a-Aminogruppe der a, o)-Diaminoalkanoyl- reste durch die tert.-Butyloxycarbonylgruppe schützt und dass man die tert.-Butyloxycarbonylgruppe nach Einführung der geschützten La,

-Diamino-alkanoylreste in die Aminosäurekette durch stark saure Agenzien bei einem pH unter 4 entfernt und die Phthalylgruppe in Gegenwart eines Hydrazinsalzes in einem schwach sauren Medium mit einem pH von 4-7 abspaltet.

UNTERANSPRtJCHE 1. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch gekennzeichnet, dass man die Abspaltung des Phthalylrestes bei einem pH-Wert von ca. 6,5 vornimmt.

2. Verfahren nach Patentanspruch und Unteran spruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man zur Abspaltung des Phthalylrestes Hydrazin-monoacetat verwendet.

3. Verfahren nach Patentanspruch und den Unteransprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, dass man als a,-Diaminoalkansäure L-Lysin verwendet.

4. Verfahren nach Patentanspruch und den Unteransprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, dass man als a, --Diaminoalkansäure L-Ornithin verwendet.