Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung des neuen Polypeptidamids der Formel
EMI1.1
<tb> H-Cys-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Met-Leu-Gly-Lys <SEP>
<tb> -Leu-Ser-Gln-Asp-Leu-His-Lys-Leu-Gln-Thr-Phe-lPro- -Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Val-Gly-Ala-Pro-NH2 und seiner therapeutisch wirksamen Säureadditionssalze.
Das Polypeptidamid der obigen Formel kann nach für die Synthese von Verbindungen dieser Art allgemein bekannten Methoden hergestellt werden, wobei die Aminosäuren in der in der obigen Formel festgelegten Reihenfolge einzeln oder nach vorheriger Bildung kleinerer Peptideinheiten miteinander verknüpft werden und bei einer geeigneten Stufe der Synthese die Disulfldbrücke gebildet wird.
Die Verknüpfung der Aminosäure und/ oder Peptideinheiten erfolgt z.B. in der Weise, dass man eine Aminosäure mit geschützter a-Aminogruppe und aktivierter terminaler Carboxylgruppe mit einer Aminosäure oder einem Peptid mit freier a-Aminogruppe und freier oder geschützter terminaler Carboxylgruppe umsetzt oder dass man eine Aminosäure oder ein Peptid mit aktivierter sc-Aminogruppe und geschützter termina ler Carboxylgruppe mit einer Aminosäure oder einem Peptid mit freier terminaler Carboxylgruppe und geschützter x-Aminogruppe umsetzt.
Die Carboxylgruppe kann beispielsweise durch Über- führung in ein Säureazid, -anhydrid, -imidazolid, -isoxazolid oder einen aktivierten Ester oder durch Reaktion mittels eines Carbodiimids oder N,N'-Carbonyl-diimidazols aktiviert werden. Vorzugsweise wird als 1Konden- sationsmethode die Carbodiimidmethode, die Azidmethode, die Methode der aktivierten Ester, die sAnhydridme- thode und die Merrifieldmethode verwendet.
In der letzten Stufe der Kondensation sind jedoch Methoden zu verwenden, bei denen Racemisierung nicht auftritt oder gering gehalten werden kann, vorzugsweise durch Verwendung der Azide oder der aktivierten Ester, wobei die Aktivierung vorzugsweise mit N-Hydroxysuccinimid vorgenommen wird.
An der Reaktion nicht beteiligte freie, funktionelle Gruppen können beim Aufbau des erfindungsgemässen Peptids durch die von der Synthese langkettiger Peptide her bekannten Schutzgruppen geschützt werden.
So verwendet man beispielsweise für die Blockierung der Guanidogruppe des Argininrestes in der nachstehend beschriebenen Teilsequenz B die Nitrogruppe, doch können auch andere geeignete Schutzgruppen, wie die Tosylgruppe, die p-Nitrocarbobenzoxygruppe oder die 2-(Isopropyloxycarbonyl) -3 ,4,5,6-tetrachlorobenzoylgrup pe verwendet werden. Man kann auch den Schutzeffekt der Protonisierung der Guanidogruppe bei der Synthese verwenden.
Beim Aufbau des neuen Polypeptids hat sich für die Blockierung der y-Carboxylgruppe, beispielsweise in der nachstehend beschriebenen Teil sequenz D, die tert.-Butyloxygruppe bewährt, doch können auch andere Schutzgruppen, wie die Methoxy-, die Äthoxy-, die tert.-Amyi- oxy-, die Amid- oder die Benzyloxygruppe verwendet werden.
Für die Blockierung der < ss-Aminogruppe des Lysinrestes, beispielsweise in der nachstehend beschriebenen Teilsequenz C, kann eine Carbo-tert.-alkoxygruppe, vorzugsweise die Carbo-tert.-butoxygruppe verwendet werden.
Als Mercaptoschutzgruppe in den nachstehend beschriebenen Teilsequenzen EF verwendet man vorzugsweise die Benzyl- oder die Tritylgruppe. Üblicherweise werden die zum Schutz der SH-Gruppen verwendeten Benzyl- bzw. Tritylreste am Ende der Synthese durch Behandlung mit Natrium in flüssigem Ammoniak abgespalten. Es wurde nun gefunden, dass die Abspaltung der Benzyl- bzw. Tritylschutzgruppen sowie die Herstellung der S-S-Bindung vor der letzten Stufe zu besonders guten Ausbeuten an Endprodukt führt.
Die Umwandlung einer geschützten Mercapto- oder Aminogruppe in eine freie Gruppe sowie die Umwandlung einer funktionell abgewandelten Carboxylgruppe in eine freie Carboxylgruppe im Laufe des Verfahrens zur Herstellung des neuen Polypeptids erfolgt nach an sich bekannten Methoden durch Behandlung mit hydrolysierenden bzw. reduzierenden Mitteln.
Die Ausgangsprodukte zur Herstellung des neuen Polypeptids können, sofern sie bisher nicht bekannt waren, nach den für die Peptidchemie bekannten Methoden erhalten werden, wobei die Aminosäuren einzeln oder nach vorheriger Bildung kleinerer Peptideinheiten miteinander verknüpft werden.
Das neue Polypeptid lässt sich auch in Form seiner Salze gewinnen bzw. verwenden. Als Salze kommen solche mit organischen Säuren, wie beispielsweise Essigsäure, Milchsäure, Bernsteinsäure, Benzoesäure, Salicylsäure, Methansulfonsäure, Toluolsulfonsäure sowie polymere Säuren, wie Gerbsäure oder Carboxymethylcellulose und Salze mit anorganischen Säuren, wie Halogenwasserstoffsäuren, z.B. Salzsäure oder Schwefelsäure und Phosphorsäure in Frage. Als Schwermetallkomplex kommt z. B.
00+ derjenige vom Zink in Frage.
Das erfindungsgemäss hergestellte neue Polypeptid stellt ein wichtiges therapeutisches Prinzip dar. Es senkt den Calciumplasmaspiegel und bewirkt als Antagonist des Parathormons eine positive Calciumbilanz im Knochen. Die biologische Wirkung der neuen Verbindung wurde an Ratten geprüft.
Die zu verabreichende Dosis hängt von der gewünschten Wirkung sowie von der Applikationsart ab. Im allgemeinen werden jedoch mit einer einmal zu verabreichenden Tagesdosis von 1 bis 10 Einheiten pro kg Tiergewicht zufriedenstellende Resultate erzielt. Für grössere Säugetiere beträgt die Tagesdosis etwa 70 bis 700 Einheiten, die auf einmal oder in mehreren Anteilen verabreicht werden können. Für die intramuskuläre Applikation enthält eine geeignete Verabreichungsform etwa 70 bis 700 Einheiten der Wirksubstanz, vermischt mit einem flüssigen Träger.
Die erfindungsgemäss hergestellte Verbindung ist somit indiziert bei allen Zuständen, bei welchen eine Senkung des Plasmacalciumspiegels bzw. Beeinflussung des Knochenstoffwechsels erwünscht ist, z.B. Hypercalcämien infolge Mangels des endogenen Thyreocalcitonins durch Ausfall von Schilddrüsengewebe oder Hyperfunktion der Nebenschilddrüsen. Sie ist ferner indiziert bei allen Knochenaffektionen, die auf einem vermehrten Abbau beruhen oder bei welchen eine Calciumfixation im Knochen erwünscht ist, z.B.
Osteoporose verschiedener Genese (z.B. postklinaakterisch, posttraumatisch, bedingt durch Corticosteroidtherapie oder Inaktivität usw.), Frak turn, Osteomalacie, Rachitis und renal bedingte Osteodystrophie, sowie insbesondere zur Kombinationstherapie mit Calcium bzw. (Phosphat.
Die erfindungsgemäss hergestellte Verbindung kann als Heilmittel, z.B. in Form pharmazeutischer Präparate, Verwendung finden. Dieses enthält die genannte Verbin dung in Mischung mit einem für die parenterale Applikation geeigneten organischen oder anorganischen Trägermaterial. Sie kann auch in Form eines Depotpräpara tes veralbreicht werden.
Es werden folgende Abkürzungen verwendet:
Z = Carbobenzoxy (Benzyloxycarbonyl)
Bzl = Benzyl
BOC = tert.-Butyloxycarbonyl
Trt = Trityl = Triphenylmethyl
OTB = tert.-Butyloxy
ONP = p-Nitrophenylester
OCP = 2,4,5-Trichlorphenoxy
OMe = Methoxy
OEt = Äthoxy
NO2 = Nitro
Ser = L-Seryl
Asn = L-Asparaginyl
Asp = L-Aspartyl
Leu = L-Leucyl
Thr = L-Threonyl
Val = L-Valyl
Arg = L-Arginyl
Gln = L-Glutaminyl
His = L-Histidyl
Pro = L-Prolyl
Gly = Glycyl
Lys = L-Lysyl
Phe = L-Phenylalanin
Met = L-Methionyl
Cys = L-Cysteinyl
Ala = L-Alanyl
OSu = N-Oxysuccinimid
In den folgenden Beispielen, welche die Ausführung des Verfahrens erläutern, den Umfang der Erfindung aber in keiner Weise einschränken sollen, erfolgen alle Temperaturangaben in Celsiusgraden. Der Wert c für die optische Drehung beträgt 1.
Die Aminosäureanalyse in den folgenden Beispielen ergibt, dass die einzelnen Aminosäuren in den erwarteten Verhältnissen vorliegen.
Teilsequenz A: H-Val-Gly-A la-Pro-NH2, Sulfat
Man suspendiert 27,5 g Z-Val-Gly-Aia-Pro-NII5 in 550 ml Methanol und hydriert nach Zugabe von 3 ml 96%iger Schwefelsäure in Gegenwart von 4,1 ml Eisessig und 3,1 g Palladiumkohle (10%). Nach'Filtration und Eindampfen der Lösung zeigt das Produkt im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel Rf5 = 0,2.
Teilsequenz EB: BOC-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-NHNHS a) Z-Asn-Thr-Gly-OEt
Man löst 43 g Z-Thr-Gly-OEt in 500 ml Dimethylformamid und hydriert bei Normaldruck und Zimmertemperatur in Anwesenheit von Palladiumkohle. Man filtriert, gibt 60 g Z-Asn-OCP zu, lässt 16 Stunden bei 250 stehen, konzentriert auf ca. 250 ml, gibt Essigester zu, wäscht mit verdünnter Salzsäure, trocknet über Natriumsulfat und dampft zur Trockne ein. Der Rückstand wird mit Essigester gewaschen und getrocknet. Man erhält Z-Asn-Thr-Gly-OEt Smp. 2250, [odD' = 40 in Dimethylformamid.
b) Z-Thr-Asn-Thr-Gly-OEt
Man löst 29 g Z-Asn-Thr-lGly-OEt in 700 ml Dime- thylformamid, hydriert bei Normaldruck und Zimmertemperatur in Anwesenheit von Palladiumkohle, filtriert und versetzt das Filtrat mit Z-Thr-N2, das aus 30 g Z -Thr-NHNH2 hergestellt wurde. Nach 12 Stunden bei 0 dampft man zur Trockne ein, wäscht den Rückstand mit Wasser, Äther und Äthanol. Man erhält Z-Thr-Asn-Thr -Gly-t, Smp. 2300, ccD20 = - 80 in Dimethylformamid.
c) BOC-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-NHNH2
Man löst 22 g Z-Thr-Asn-Thr-Gly-OEt in 700 ml Dimethylformamid, hydriert bei Normaldruck und Zimmertemperatur in Anwesenheit von Palladiumkohle und filtriert. Man löst 23 g BOC-Arg(NO2)-OH in 500 ml Dimethylacetamid, gibt 12 ml Triäthylamin zu, kühlt auf -10 , gibt 9,4 ml Chlorameisensäureisobutylester hinzu, lässt 10 Minuten reagieren und gibt die oben erhaltene Tetrapeptidlösung zu. Nach 30 Min. bei 250 fügt man 100 ml Wasser hinzu, behandelt die erhaltene Lösung mit Amberlit-IRA-410 (O > H-Form) bis zur negativen Chlorreaktion, filtriert und dampft zur Trockne ab. Man wäscht den Rückstand mit Chloroform, Essigester und Äther und trocknet. Man erhält BOC-Arg(NO2)-Thr-Asn -Thr-Gly-OEt.
Smp. 1000, [1D20 = 40 in Dimethylformamid. Man löst 12 g BOC-Arg(NO2)-Thr-Asn-Thr -Gly-OEt in einem Gemisch von 200 ml Essigsäure und 40 ml Wasser, hydriert in Anwesenheit von Palladiumkohle bei 200 und Normaldruck, filtriert und dampft im Vakuum bei 200 zur Trockne ein. Man löst den Rückstand in Dimethylformamid und dampft ab. Diese Behandlung wird wiederholt, bis keine Essigsäure mehr nachweisbar ist. Man löst den Rückstand in 120 ml Dimethylformamid, gibt 6 ml Hydrazinhydrat zu, lässt 16 Stunden bei 250 stehen, dampft ab, wäscht den Rückstand mit Äther, Methanol/Äther (1:1) und danach wiederum mit Äther und trocknet.
Man erhält BOC-Arg -Thr-Asn-Thr-Gly-NHNH2, Smp. 1750 (mit Zersetzung), ,20 = ¯ 420 in Dimethylformamid/HCI 1 N (1:1).
Teilsequenz AB:
H-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Val-Gly-Ala-Pro-
NH2 .2 2 CHsCOOH
Man löst 13,5 g BOC-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-NHNH2 (Teilsequenz B) in 270 ml Dimethylformamid/Wasser (8 : 2), kühlt auf - 150, gibt 40 ml einer 4 N Lösung von Salzsäure in Dioxan und 2,5 ml tert.-Butylnitrit zu. Man rührt 10 Minuten bei - 150, gibt 28 ml Triäthylamin zu, filtriert ab, gibt 10,5 g H-Val-Gly-Ala-Pro-NH2 (Teilsequenz A) zu, rührt 16 Stunden bei 00. Danach dampft man zur Trockne ein, wäscht den Rückstand mit Äther und trocknet. Man löst den Rückstand in Methanol, gibt ein Zehntel Volumen Wasser und die siebenfache Menge
Chloroform hinzu und lässt die erhaltene Lösung durch eine Säule von 500 g Kieselgel.
Nach IEluierung mit einer steigenden Menge an Methanol erhält man nach Ein- dampfen BOC - Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Val-Gly-Ala-Pro- -NH2. Dieses suspendiert man in 200 ml einer 4 N Lö sung von Salzsäure in Dioxan und rührt während 2 Stun den bei 250. Man dampft zur Trockne ein, löst den
Rückstand in 0,2 N Essigsäure, behandelt mit Amberlit -IRA-410 (Acetat-Form) und lyophilisiert die wässrige
Lösung. Hierauf wäscht man den Rückstand mit Äther, Essigester und wieder Äther und trocknet über Natriumhydroxid-Späne. Man erhält H-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly -Val-Gly-Alaro-NH2 .2 2 CH3OOOH. Smp. 1950 (mit Zersetzung), [a]D20 = - 640 in Dimethylformamid/HC1 1 N(l: (1:1).
Teilsequenz C: Z-His-Lys(BOC)-Leu-Gln-Thr-Phe-Pro-OH a) H-Thr-Phe-Pro-OH
Man löst 176 g Z-wPhe-Pro-OMe in 1000 ml Metha nol/HCl 1 N, hydriert in Anwesenheit von Palladiumkohle bei 200 und 1 Atm. und dampft ein. Man löst den Rückstand in 400 ml Dimethylformamid, gibt bei 00 100 ml Triäthylamin zu, filtriert das auskristallisierte Triäthylaminhydrochlorid ab und versetzt das Filtrat mit Z-Thr-N3 (hergestellt aus 87 g Z-Thr-NHNH2 durch Lösen in 100 ml N Salzsäure und Versetzen mit 35 ml N Natriumnitrit). Man lässt hierauf 16 Stunden bei 00 stehen, dampft zur Trockne ein, löst den Rückstand in Essigester, wäscht nacheinander mit verdünnter Salzsäure und verdünntem Ammoniak, trocknet und dampft ein.
Man pulverisiert den Rückstand in Heptan, wäscht mit Petroläther und trocknet. Man erhält Z-Thr-Phe-Pro- -OMe, Smp. 920 (Zers.), [DO = - 160 in Dimethylformamid.
Man löst 53 g Z-Thr-iPhe-Pro-OMe in 530 ml Methanol, gibt 100 ml 2 N Natronlauge zu, lässt 1 Stunde bei 250 stehen, gibt 50 ml 2 N Salzsäure zu, konzentriert auf ca. 200 ml, gibt noch 100 ml Wasser zu, stellt das pH auf 10 ein, wäscht die wässrige Lösung zweimal mit Essigester, stellt anschliessend mit 4 N Salzsäure auf pH 1 ein, extrahiert das ausgeschiedene Tripeptid Z-Thr-Phe-:Pro- EH mit Essigester, trocknet und dampft ein. Smp. 1050, [au,2 = -280 in Dimethylformamid. Man löst den Rückstand in einem Gemisch von 500 ml Dioxan und l00 ml Wasser und hydriert bei 200 und Normaldruck in Gegenwart eines Palladiumkatalysators. Man filtriert, dampft zur Trockne ein, wäscht den Rückstand mit Äther und trocknet.
Man erhält H-Thr-Phe-Pro-OH, Smp. 1920 (mit Zersetzung), [a]D20 = -410 in Essigsäure (957,).
b) Z-Leu-Gln-OMe
Man löst 70 g Z-Gln-OH in 1,5 1 Dioxan und lässt so viel ätherische Diazomethanlösung zufliessen, bis die Lösung gelb gefärbt bleibt. Anschliessend wird die Lösung eingedampft und der weisse Rückstand mit Äther verarbeitet. Man erhält Z-Gln-OMe, Smp. 1360, [a]D20 210 in Dimethylformamid. Man löst 71 Ester in 1.71 Methanol. Danach werden 5 g 10% Palladium auf IAktiv- kohle mit 59 ml einer 4 N Salzsäure angerührt und in die Lösung gegeben. Das Ganze wird einer 3stündigen Hydrierung bei Raumtemperatur und Normaldruck un terworfen. Hierbei wird ca. 83% der theoretischen Men ge an Wasserstoff verbraucht.
Der Katalysator wird ab filtriert und das Filtrat vollständig eingedampft, wobei
H-Gln-OMe HCI in Form eines zähen Öls erhalten wird.
Man löst 64 g Z-Leu-OH in 200 ml Acetonitril, ver setzt mit 27,7 g N-Hydroxysuccinimid und kühlt auf - 100C ab. Dazu giesst man eine Lösung von 50 g Di cyclohexylcarbodiimid in 100 ml Acetonitril. In ca. 30
Minuten wird vom Dicyclohexylharnstoff abfiltriert. Das
Filtrat versetzt Tnan mit 47,3 g H-Gln-OMe HCl, gelöst in Dimethylformamid, unter gleichzeitiger Zugabe von einem äquivalenten N-Methylmorpholin. Man lässt 4 Std.
stehen und dampft ein. tDer Rückstand wird in Essigester gelöst und mit 5% Natriumbicarbonatlösung, 1 N Salz säure und Wasser gewaschen. Die organische Phase trock net man über Natriumsulfat und dampft im Vakuum ein.
Nach Umkristallisation aus Methanol und Äther erhält man Z-Leu;Gln-OMe, Smp. 1790C, [a],20 = - in
Dimethylformamid.
c) Z-Lys(BOC)-Leu-Gln-OMe
42 g ZLeu-Gln-OMe werden in 1500 ml Methanol ge löst. Danach werden 16 g 10% Palladium auf Aktivkohle mit 25,8 ml einer 4 N Salzsäure angerührt und in die Lösung gegeben. Das Ganze wird einer 8stündigen Hydrierung bei Raumtemperatur und Normaldruck unterworfen. Hierbei werden 95% der theoretischen Menge Was serstoff verbraucht. Der IKatalysator wird abfiltriert und das Filtrat eingedampft. Man erhält H-Leu-Gln-OMe HCI in Form eines Schaumes. Man löst hierauf H-Leu -Gln-OMe HCI in 300 ml Dimethylformamid, gibt 34 g Z-LyQB0C)-OCP u. 8,4 ml Triäthylamin zu. Nach Umschütteln lässt man während 16 Stunden stehen. Hierauf wird das Reaktionsgemisch am Vakuum eingedampft.
Der Rückstand wird mit Wasser behandelt und vom Wasser abfiltriert. Anschliessend löst man in wenig Methanol und fällt mit Äther. Nach Filtration und Trocknen erhält man Z-Lys(BOC);Leu-Gln-OMe, [a],20 = - 210 in Dimethylformamid.
d) Z-His-Lys(BOC)-Leu-Gln-NH-NHS
Man löst 38 g Lysi(BOC)Leu-Gln-OMe in 300 ml Dimethylformamid, gibt 15 g 10geige Palladiumkohle zu, hydriert bei Normaldruck und Zimmertemperatur und filtriert vom Katalysator ab. Hierauf versetzt man mit aus 25,2 g Z-His!NHNH2 hergestelltem Z-His-Na, lässt 5 Stunden bei 200 stehen, dampft ab, löst den Rückstand in Essigester, wäscht mit Wasser, trocknet über Natriumsulfat, dampft ab und wäscht den Rückstand mit Äther.
Man erhält ZHis-Lys(rBOC)-Leu-GIn-OMe, Smp. 1200 (mit Zersetzung), [O;]n20 = - 190 in Dimethylformamid.
Man löst 33 g Z-His-Lys(BOC)-Leu-Gln-OMe in 330 ml Methanol, versetzt mit 7,5 ml Hydrazinhydrat, lässt zwei Tage bei 250 stehen und dampft anschliessend zur Trockne ein. Man löst hierauf in Dimethylformamid, dampft ein und wiederholt diese Behandlung, bis keine Spuren von Hydrazin mehr nachweisbar sind. Man wäscht den Rückstand mit Äther, Wasser und Äther, trocknet und erhält Z-His-Lys(BOC)-Leu-Gln-NH-NH2, Smp. 1990, [a]D20 = 220 in Methanol.
e) Z-His-Lys(BOC)-Leu-GIn - Thr-Ph e-Pro-OH
Man löst 40 g Z-His-Lys(BOC)-Leu-Gln-NH-NH2 in 400 ml Dimethylformamid, kühlt auf - 200, gibt 75 ml Dioxan/HCI 2 N und anschliessend 6 ml tert.-Butylnitrit zu, rührt 10 Minuten bei - 200, gibt 30 ml Triäthylamin und 20 g H-Thr-Phe-Pro-OH zu und lässt 16 Stunden bei 250 reagieren. Man dampft hierauf zur Trockne ein, wäscht den Rückstand mit Äther, verdünnter Essigsäure, Äther und schliesslich mit heissem Essigester. Hierauf trocknet man im Hochvakuum und erhält ZHis-Lys- (BOC)-Leu-Gln-Thr Phe Pro-OH, Smp. 2000 (Zersetzung), [sc]D20 = - 470 in Dimethylformamid.
Teilsequenz ABC:
H-His-Lys-BOC)-Leu-Gln-Thr-Phe-Pro-Arg-Thr- Asn-Thr-Gly-Val-Gly-Ala-Pro-NH2 3 CHSCO2H
Man löst 10 g Heptapeptid (Teilsequenz C) in 100 mi Dimethylformamid, dampft ein, löst den Rückstand in 100 ml Dimethylformamid, versetzt mit 15 g N-Hydroxysuccinimid, kühlt auf 0 ab, gibt 5 g Dicyclohexylcarbodiimid zu, lässt 3 Stunden reagieren, filtriert den ausgeschiedenen Dicyclohexylharnstoff ab, konzentriert auf 30 ml und fällt den entstandenen Heptapeptidoxysuccinimidester Z-His-Lys(BOC)-Leu-Gln-Thr-Phe-Pro-OSu durch Zusatz von Äther aus. Nach Auswaschen mit Äther löst man den Rückstand in 100 ml Dimethylformamid, versetzt mit 10 g Nonapeptidamid (Teilsequenz AB) und lässt während 16 Std. reagieren. Man gibt 500 ml Essigester zu und filtriert.
Man löst den Rückstand in Dimethylformamid, gibt 10 ml Essigsäure zu und fällt wiederum mit Essigester. Man flitriert, wäscht mit Essigester sowie Äther und trocknet. Man erhält Z-His-Lys(BOC) Leu-Gln-Thr-Phe-lPro-Arg-Thr-Asn - Thr-Gly - Va1 - Gly- -Ala-Pro-NH2 2 AcOH, [OG]D20 = 240 in Dimethylformamid, das man direkt in 80%iger Essigsäure löst.
Anschliessend werden 5 g Palladiumkohle hinzugefügt, bei Normaldruck und Zimmertemperatur hydriert. Man filtriert, dampft bei 200 im Hochvakuum zur Trockne u.
wäscht den Rückstand mit Äther. Nach Trocknen über KOH-Spänen erhält man die Teilsequenz ASC, Smp.
1850 (mit Zers.), [3D2O = -42 in 1 N Essigsäure.
Teilsequenz D:
Trt-cly-Lys(BoC)-Leu-Ser- Gln-A sp(O TB)-L;iu-
NHNHo a) Z-Asp(OTB)-Leu-OMe
Man löst 1151 g Z-Asp(OTB)-OH, 54 g N-Hydroxysuccinimid in 7üo ml Acetonitril und kühlt auf - 200 ab.
Anschliessend gibt man 96,5 g Dicyclohexyicarbodiimid, gelöst in 350 ml Acetonitril hinzu. Nach ca. 30 Minuten Stehenlassen wird der entstandene Dicyclohexylharnstoff abfiltriert. Zu dem Filtrat werden 71,2 g H-Leu-OMe gegeben, danach 4 Stunden stehengelassen und am Vakuum eingedampft. Den festen Rückstand versetzt man mit Essigester/Wasser (2:1). Die organische Phase wird hierauf mit 5% Natriumbicarbonatlösung, Wasser und mit verdünnter Schwefelsäure (pH 3) gewaschen, nach dem Neutralwaschen über Natnumsullat getrocknet und eingedampft.
Man löst den Rückstand mit Chloroform, dem 1% Methanol zugesetzt wurde, und filtriert über einer Kieselgelsäule (10facheMenge). Man erhält Z-Asp(OTB) Leu-OMe, Smp. 1310, []D20 = - 230 in Dimethylformamid.
b) H-Gln-Asp(OTB)-Leu-OMe
Man löst 118 g Z-Asp(OTB)-Leu-OMe in 2000 ml Methanol. Danach werden 15 g 10% Palladium auf Aktivkohle in 63 ml 4 N Salzsäure angerührt und in die Lösung gegeben. Das Ganze wird einer zweistündigen Hydrierung bei Raumtemperatur und Normaldruck unterworfen. Hierbei werden ca. 85% der theoretischen Menge Wasserstoff verbraucht. Der Katalysator wird abfiltriert und das Filtrat vollständig eingedampft, wobei H-Asp (OTB)-Leu-OMe . HC1 in Form eines amorphen Schaumes erhalten wird.
91,7 g Z-Gln-ONP und 93,8 g H-Asp(OTB)-Leu-OMe HC1 werden in 500 ml Dimethylformamid gelöst und mit 51 ml N-Methylmorpholin versetzt. Man lässt 15 Stunden bei' Zinunertemperatur stehen und dampft hierauf die Lösung am Vakuum vollständig ein. Der so erhaltene Rückstand wird mit Wasser gut verarbeitet und vom Wasser abfiltriert. Anschliessend wird aus Methanol umkristallisiert. Man erhält ZGln-Asp(OTB)-Leu-OMe, Smp. 1900 (Zers.), [l D20 = -28 in Dimethylformamid. Man löst 44,4 g Z-Gln-Asp(OTB)-Leu-OMe in 1200 ml Methanol/Dimethylformamid (1:1). Danach werden 15 g 10%iges Palladium auf Aktivkohle in 50 ml Wasser versetzt und in die Lösung gegeben. Nach ca.
2stündiger Hydrierzeit ist fast die quantitative Menge an Wasserstoff verbraucht. Der Katalysator wird abfiltriert und das Filtrat am Vakuum eingedampft. Der Rückstand wird in Essigester gelöst und dreimal mit gesättigter Natriumchloridlösung gewaschen. Die organische Phase trocknet man über Natriumsulfat und dampft das Filtrat auf ca. 1/,3 des ursprünglichen Volumens ein. Nach Zugabe von Petroläther lässt sich das feste Tripeptid abfiltrieren. Man erhält H-Gln-Asp(OTB) -Leu-OMe, Smp.
1750, [alo2o = - 180 in Dimethylformamid.
c) Z-Lys(BOC)-Leu-Ser-OMe
Man löst 43 g H-Leu-Ser-OMe HCI und 80 g Z-Lys (BOC)-OCP in 400 ml Dimethylformamid, gibt 22 ml Triäthylamin zu, lässt 25 Stunden bei 250 stehen, filtriert das ausgeschiedene Triäthylamin ab und dampft das Filtrat zur Trockne ein. Man löst den Rückstand in Essigester, wäscht mit verdünnter Salzsäure sowie verdünnter Kaliumbicarbonatlösung, trocknet über Natriumsulfat, filtriert und dampft ein. Man kristallisiert den Rückstand aus Essigester/Äther um und erhält Z-Lys(BOC)-Leu- -Ser-OMe, Smp. 1100, [X]X20 = - 140 in Dimethylformamid.
d) Trt-Gly-Lys(BOC)-Leu-Ser-NHNHs
Man löst 158 g Trt-Gly-OH in 2000 ml Dichloromethan und 72 ml Triäthylamin, kühlt auf -5 , versetzt mit 50 ml Chlorameisensäureäthylester und rührt 10 Minuten bei - 50. Gleichzeitig löst man 300 g Z-Lys(BOC) Leu-Ser-OMe in 3000 ml Dioxan/Wasser (8 : 2), hydriert in Anwesenheit von Palladiumkohle bei Zimmertemperatur und Normaldruck, filtriert und dampft ab. Man löst den Rückstand in Chloroform und versetzt mit dem oben erhaltenen gemischten Anhydrid. Man lässt 1 Stunde bei 0 stehen, wäscht die Chloroformlösung mit verdünnter Essigsäure und anschliessend mit verdünnter Kaliumbicarbonatlösung, trocknet und dampft zur Trockne ein. Man löst den Rückstand in 1250 ml Methanol, versetzt mit 175 ml Hydrazinhydrat und lässt 16 Stunden bei 250 stehen.
Man konzentriert auf 500 ml, versetzt mit Wasser, filtriert, wäscht den Rückstand mit Wasser und trocknet über Phosphorpentoxid. Man erhält Trt-Gly Lys(BOC)-Leu-Ser-NHNH2, Smp. 2040, [oil,"o = 60 in Dimethylformamid.
e) Trt-Gly-Lys(BOC)-Leu-Ser-Gln-Asp(OTB)-Leu- NHNH
Man löst 76 g Trt-Gly-Lys(BOC)-Leu-Ser-NHNtH2 in 300 ml Dimethylformamid, kühlt auf - 200, gibt 75 ml Dioxan/HCl 4 N und anschliessend 11,6 ml tert.-Butyl nitrit zu, rührt 10 Minuten bei - 150, versetzt mit 70 ml Triäthylamin und mit 49,5 g H-Gln-Asp(OTB)-Leu-OMe.
Hierauf rührt man während 16 Stunden bei 00. Man filtriert das ausgeschiedene Triäthylaminhydrochlorid ab, konzentriert das Filtrat auf ca. 100 ml und versetzt den Rückstand mit Wasser. Man filtriert den ausgeschiedenen Rückstand ab, der anschliessend mit Wasser durchgewaschen wird und trocknet schliesslich im Hochvakuum bei 500. Der Rückstand wird mit Essigester ausgekocht, mit Äther gewaschen und getrocknet. Der erhaltene Heptapeptid ester Trt-Gly-Lys(BOC)-Leu-Ser-Gln-Asp(OTB)- Leu-OMe (Smp. 2110, [2o = - 380 in Dimethylformamid) wird in 200 ml Dimethylformamid gelöst, mit 4 ml Hydrazin versetzt und 24 Stunden bei 250 stehengelassen. Nach Konzentrieren auf ca. 100 ml gibt man 500 ml Wasser zu, filtriert vom ausgeschiedenen Material ab. wäscht mit Wasser bis zur Neutralreaktion und trocknet über Phosphorpentoxid bei 500.
Man erhält Trt-Gly Lys(BOC)-Leu-Ser-Gln-Asp(OTB)-Leu-NHNH2, Smp.
2200, []D2O = - 290 in Dimethylformamid /'Wasser (8:2).
Teilsequenz ABCD:
H-Gly-Lys(BOC)-Leu-Ser-Gln-Asp(OTB)-Leu-His- L+s(BOC)-Leu-Gln-Thr-Phe-Pro-A rg-Thr-A sn-Thr Gly-Val-Gly-Ala-Pro-NH2 3 AcOH .3 3 H,O
Man löst 3 g Heptapeptidhydrazid (Teilsequenz D) in 30 ml Dimethylformamid, kühlt auf 200, gibt 2 ml Dioxan/HCl 4 N und anschliessend 0,3 ml tert.-Butylnitrit zu. Man rührt während 10 Minuten bei 200, gibt 2 ml Triäthylamin und 3 g Hexadecapeptidamid (Teilsequenz ABC) zu, rührt 16 Stunden bei 00, dampft zur Trockne ab.
Man wäscht den Rückstand bei 00 mit verdünnter Essigsäure und anschliessend mit Wasser, filtriert, löst den Rückstand in Methanol/Wasser (9: 1), filtriert über Kieselgel, dampft den Rückstand ab, wäscht mit Essigester, löst in 200 ml 80% Essigsäure auf, lässt 4 Stunden bei 250 stehen, dampft bei 200 zur Trockne, wäscht den Rückstand mit Äther, Essigester und Äther, filtriert und trocknet. Man erhält die Teilsequenz ABCD, Smp. 2080 (mit Zersetzung), [aL20 = -210 in Essigsäure.
Teilsequenz E:
H-Thr-Cys(Bzl)-Met-Leu-OH a) H-Cys(Bzl)-Met-Leu-OMe HBr
Man löst 21.0 g Z-Cys(Bzl)-OCP und 12,3 g H-Met Leu-OMe HCI in 120 ml ,Dimethylformamid. Danach gibt man 5,9 ml Triäthylamin hinzu, lässt 16 Stunden bei 250 stehen, fügt Essigester hinzu, wäscht mit verdünnter Salzsäure, trocknet über Natriumsulfat, dampft zur Trockne ab und kristallisiert den Rückstand aus Essigsäure äthylester/ Diäthyläther. Man erhält Z;;Cys(Bzl)-Met-Leu- OMe, Smp. 1380, [X]D20 = 410 in Dimethylformamid, das man in 210 ml einer 40%igen Lösung von Bromwasserstoff in Eisessig löst. Man lässt 1 Stunde bei 250 stehen, dampft zur Trockne ein und kristallisiert den Rückstand aus Isopropanol/Diäthyläther um.
Man erhält H Cys(Bzl)-Met-Leu-OMe HBr, Smp. 1720, [X]D20 = + 80 in Dimethylformamid.
b) H-ThrXys(Bzl)-Met-Leu-OMe . 1,3 HBr
Man löst 20 g Z-Thr-NHNH2 in 350 ml Dimethylformamid, kühlt auf 200, gibt 100 ml einer Lösung von 2 N Salzsäure in Dioxan und anschliessend noch 10 ml tert.-Butylnitrit zu. Nach 10 Minuten bei - 200 werden 45 ml Triäthylamin und 25,5 g H-Cys(Bzl)-Met Leu-OMe HBr hinzugefügt und das erhaltene Gemisch während 16 Stunden,bei 0 geschüttelt. Man dampft zur Trockne ein, löst den Rückstand in einem Gemisch von Essigsäureäthylester/Wasser, wäscht die organische Phase mit verdünnter Salzsäure, trocknet über Natriumsulfat, dampft ein und kristallisiert den Rückstand aus Essigester um.
Man erhält Z-Thr-Cys(Bzl)-Met-'Lau-OMe: Smp. 1740, [a]D20 = -310 in ;Dimethylformamid. Man löst 20 g von dem oben erhaltenen Tetrapeptid in 200 ml eines Gemisches von Trifluoressigsäure/Essigester (1:1) auf, leitet während 1 Stunde bei 0 einen Strom gasförmigen Bromwasserstoffs ein, dampft anschliessend ein und kristallisiert den Rückstand aus Methanol/Diäthyl äther um. Man erhält H-Thr-Cys(Bzl)-Met-Leu-OMe - 1,3 HBr, Smp. 2100, [cck20 = - 5 in Dimethylformamid.
c) H-Tlu-Cys(Bzr)-Met-Leu-OH
Man löst 372 g H-Thr-Cys(Bzl)-Met-Leu-OMe . 1,3 HBr in 1800 ml Methanol, gibt 900 ml 2 N Natronlauge zu, lässt 1 Stunde bei 250 stehen, gibt 240 ml Eisessig zu und lässt 2 Stunden bei 0 stehen. Man filtriert die ausgeschiedene kristalline Masse ab, wäscht diese zuerst mit 1 N Essigsäure, anschliessend mit Wasser und trocknet bei 500 im Hochtakuum. Man erhält H-Thr-Cys(Bzl)- Met-Leu-OH, Smp. 2280, [OC]D20 = -410 in 1 N Ammoniak.
Teilsequenz F:
BOC-Cys(Bzl)-Ser-Asn-Leu-Ser-NHNH2 a) H-Asn-Leu-Ser-OMe HCI
Man löst 43 g H-Leu-Ser-OMe HCI und 53 g BOC Asn-ONP in 400 ml Dimethylformamid auf, gibt 22 ml Triäthylamin zu, lässt 16 Stunden bei 250 stehen, dampft zur Trockne ein und kristallisiert den Rückstand aus Methanol um. Man erhält BOC-Asn-Leu-Ser-OMe, Smp.
1900, [al0 = - 240 in Dimethylformamid, das man in 500 ml einer 4 N Lösung von Salzsäure in Methanol löst. Man lässt 1 Stunde bei 250 stehen, dampft zur Trockne ein, löst den Rückstand in Methanol und fällt mit Di äthyläther. Man erhält H-Asn-Leu-Ser-OMe HCI, Smp.
1800, [OC1D2 = - 230 in Dimethylformamid.
b) H-Ser-Asn-Leu-Ser-OMe .HCI
Man löst 39,5 g BOC-Ser-NHNH2 in 500 ml Dimethylformamid, kühlt auf -200, gibt 200 ml einer 2 N Lösung von Salzsäure in Dioxan und anschliessend 20 ml tert.-Butylnitrit zu. Nach 10 Minuten bei 200 werden 90 ml Triäthylamin und 38,0 g H-Asn-Leu-Ser-OMe - HCI hinzugefügt, danach 16 Std. bei 0 gerührt, zur Trockne eingedampft und der Rückstand aus Chloroform/Diäthyläther umkristallisiert. Man erhält BOC-Ser Asn-Leu-Ser-OMe, Smp. 1350, [a]D20 = - 220 in Dime- thylformamid, das man in 420 ml einer 4 N Salzsäurelösung in Methanol löst.
Man lässt 1 Stunde bei 250 stehen. dampft zur Trockne ein und kristallisiert aus Methanol/Essigsäureäthylester um. Man erhält H-Ser-Asn Leu-Ser-OMe HCI, Smp. 1550 (Zers.), [a]D20 = - 150 in Dimethylformamid.
c) BOC-Cys(Bzl)-Ser-Asn-Leu-Ser-NHNH2
Man löst 18,5 g H-Ser-Asn-Leu-Ser-OMe HCI und 18 g BOC-Cys(Bzl)-ONP in 100 ml Dimethylformamid auf, gibt 10 ml Wasser, 3,5 ml Essigsäure und 5,6 ml Tri äthylamin zu, lässt 16 Stunden bei 250 stehen, dampft zur Trockne ein und kristallisiert aus Methanol um. Man erhält BOC-Cys(Bzl)-Ser-Asn-Leu-Ser-OMe, Smp. 1820, [CC]D20 = -170 in Dimethylformamid, das man unter leichtem Erwärmen in 200 ml Dimethylformamid löst.
Man gibt 200 ml Methanol und 20 ml Hydrazinhydrat zu, lässt 16 Stunden bei 300 stehen, fällt mit Diäthyläther, wäscht den Niederschlag mit Diäthyläther / Methanol (1:1) und trocknet das so erhaltene BOC-Cys(Bzl)-Ser Asn-Lau-Ser-NHNH2, Smp. 2240, [20 = ¯ -130 in Di- methylformamid.
Teilsequenz EtF:
EMI6.1
<tb> BOC-Cys-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Met-Leu-OH <SEP>
<tb>
Man löst 18,4 g BOC-Cys(Bzl)-Ser-Asn-Leu-Ser-NH- NH2 (Teilsequenz F) in 150 ml Dimethylformamid, kühlt auf - 200, gibt 40 ml einer 2 N Lösung von Salzsäure in Dioxan und 15 ml tert-Butylnitrit zu. Nach 10 Minuten bei - 200 gibt man noch 28 mi Triäthylamin und 16,2 g H-Thr-Cys(Bzl)-Met-Leu-OH (Teilsequenz IE) zu und rührt 16 Stunden bei 250. Danach wird filtriert, die Lösung eingedampft und der Rückstand mit 1 N Essigsäure durchgewaschen.
Man erhält BOC-Cys(Bz -Ser-Asn-Leu- Ser-Thr-Cys(Bzl)-Met-Lau-OH, Smp. 2040, [a]i > 20 = - 360 in Dimethylformamid. Man löst das erhaltene 9ro- dukt in 5000 ml getrocknetem Ammoniak, gibt unter Rühren und Sieden des Ammoniaks Natriummetall bis zur tiefblauen Färbung zu. Zwecks Entfärbung wird Ammoniumchlorid hinzugefügt. Man dampft zur Trockne ein und wäscht den Rückstand mit 1 N Essigsäure und Aceton durch. Nach Trocknen erhält man BOC-Cys-Ser Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Met-keu-OH, Smp. 2360 (Zers.), taL20 = - 200 in Dimethylformamid/Wasser (3:1).
Man löst das so erhaltene Nonapeptid in 5000 ml 0,01 N Ammoniak auf, gibt unter Rühren 1 N Wasserstoffperoxid bis zur negativen Nitroprussiatreaktion zu, dann noch 200 ml Eisessig, filtriert und lyophilisiert, Man
EMI6.2
<tb> erhält <SEP> BOC-Cys-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Met-Leu-OH, <SEP>
<tb> Smp. 2400 (Zers.), taL20 = - 190 in Dimethylformamid/ Wasser (3 1).
Beispiel 1
EMI6.3
<tb> <SEP> #
<tb> BOC-Cys-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Met-Leu-Gly-Lys (BOC)-Leu-Ser-Gln-Asp(OTB)-Leu-His-Lys(BOC)-Leu-
Gln-Thr-Phe-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Val-Gly-Ala- Pro-NH2 -2 2 CH2CO2H 3 H20
Man löst 1,0 g Nonapeptid (Teilsequenz EF) in 10 ml Dimethylformamid, gibt 1,5 g N-Hydroxysuccinimid und 0,52 g Dicyclohexylcarbodiimid zu, rührt 6 Stunden bei 250, filtriert und dampft das Filtrat zur Trockne ein. Man wäscht den Rückstand mit Essigester und Diäthyläther
EMI6.4
<tb> und <SEP> trocknet. <SEP> Man <SEP> erhält <SEP> BOC-Cys-Ser-Asn-Leu-Ser
<tb> Thr-Cys-Met-Leu-OSu, <SEP> Smp. <SEP> 2610, <SEP> das <SEP> man <SEP> in <SEP> 10 <SEP> ml <SEP> Di methylformamid löst.
Zu dieser Lösung gibt man 3,1 g Tricosapeptid-Diacetat (Teilsequenz ABCD) und 1,2 g N-Hydroxysuccinimid und rührt 16 Stunden bei 250.
Man dampft zur Trockne ein, wäscht den Rückstand mit Diäthyläther, Chloroform und Aceton. So erhält man das rohe, geschützte Dotriacontapeptid, das man in 50 ml eines Gemisches von Chloroform/Methanol/Wasser (70: 30: 5) löst: Man schichtet die erhaltene Lösung auf eine Kieselgelsäule (5 X 100 cm), die mit dem obengenannten Gemisch äquilibriert wurde. Die Elution wird mit einer steigenden Konzentration von Methanol durchgeführt. Die vereinigten Fraktionen, die das reine Peptid enthalten, werden abgedampft, anschliessend mit Di äthyläther gewaschen und über Kaliumhydroxid im Hochvakuum getrocknet. Man erhält die Titelverbindung, Smp.
2210 (Zers.), taL'0 = - 380 in 50%iger Essigsäure.
Beispiel 2
EMI6.5
<tb> H-Cys-Ser-A <SEP> sn-Leu-Ser- <SEP> Thr-Cys-Met-Leu-Gly-Lys-Leu- <SEP>
<tb>
Ser-Gln-Asp-Leu-His-Lys-Leu-Gln-Thr-Phe-Pro-Arg- Thr-Asn-Thr-Gly-Val-Gly-Ala-Pro-NH2 - Hexaacetat - Decahydrat
Man löst 3,3 g geschütztes Dotriacontapeptid - diacetat trihydrat (Beispiel 1) unter Stickstoffatmosphäre in 100 ml Trifluoressigsäure, lässt 15 Minuten bei 200 stehen und dampft zur Trockne ein. Man löst in 300 ml 0,2 N Essigsäure, behandelt mit 20 ml Amberlit-iRA-410 (Acetat), lyophilisiert, wäscht mit Diäthyläther und trocknet über Kaliumhydroxid im Hochvakuum. Man erhält die Titelverbindung, Smp. 2300 (Zers.), taL20 = - 210 in 50%iger Essigsäure.