CH436327A

CH436327A - Verfahren zur Herstellung eines neuen Polypeptids

Info

Publication number: CH436327A
Application number: CH1445062A
Authority: CH
Inventors: Roger Dr Boissonnas; Sandrin Edmond
Original assignee: Sandoz Ag
Priority date: 1962-12-10
Filing date: 1962-12-10
Publication date: 1967-05-31
Also published as: BE641005A; FR3301M; ES294357A1; US3328382A; GB1060400A

Description

Verfahren zur Herstellung eines neuen Polypeptids
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines bisher unbekannten Nonapeptids der Formel
L-Prolyl-L-seryl-L-lysyl-L-alanyl-L-phenylalanyl
L-isoleucyl-glycyl-L-leucyl-L-methioninamid und seiner Säureadditionssalze, dadurch gekennzeichnet, dass man aus einem Nonapeptid der obigen Formel, in welcher die @-Aminogruppe des Lysinrestes durch eine geeignete Schutzgruppe und die endständige ceAmino- gruppe des L-Prolinrestes durch eine geeignete Schutzgruppe geschützt werden, die Schutzgruppen in einer einzigen oder in mehreren Stufen abspaltet und das so, erhal- tene, bisher unbekannte Nonapeptid der obigen Formel gegebenenfalls in seine Säureadditionssalze umwandelt.

Als Salze kommen z. B. das Acetat, Trifluoracetat, p-Toluolsulfonat, Tartrat, Gluconat, Maleat, Maleinat, Methansulfonat oder Citrat in Frage.

Beispiele für die zum Schutze der endständigen a Aminogruppe des Prolinrestes eingef hrten Gruppen sind der Carbobenzoxy-, der Toluolsulfonyl-, der Carbo-tert. butoxy-, der Formyl-, der Trifluoracetyl-und der p-Nitro-carbobenzoxy-Rest.

Beispiele für die zum Schutz der e-Aminogruppe des Lysinrestes eingeführten Gruppen sind der Carbobenzoxy-, der Toluolsulfonyl-, der Carbo-tert. butoxy-, der Phthalyl-, der Formyl-, der Trifluoracetyl- und der p-Nitrocarbobenzoxy-Rest.

Beispiele für die Carboxylgruppe des Lysinrestes, welche mit der endständigen Aminogruppe des Hexapeptides reaktionsfähig sind, sind vorzugsweise das Azid, der p-Nitrophenylester, der 2, 4, 5-Trichlorphenylester, die unsymmetrischen Anhydride und das Reaktionsprodukt der Säure mit Dicyclohexyl carbodiimid.

Das verfahrensgemäss hergestellte Nonapeptid besitzt eine stark blutdrucksenkende Wirksamkeit, die über- raschenderweise noch stärker ausgeprägt ist als diejenige des Hendekapeptids L-Pyroglutamyl-L-prolyl-L-seryl-L-lysyl-L-aspartyl-
L-alanyl, L-phenylalanyl-L-isoleucyl-glycyl-L-leucyl-
L-methioninamid, obgleich eine Aminosäure an dem Aminoende der Kette sowie eine weitere in der Mitte der Kette fehlt. Es kann als Antihypertensivum bei Hockdruck sowie als Mittel zur gesteuerten Blutdrucksenkung beispielsweise bei chirurgischen Eingriffen verwendet werden.

Wegen seiner gefässaktiven Eigenschaften kann das verfahrensgemäss erhaltene Nonapeptid auch als Vasodilatator bei Durchblutungsstörungen und Spasmen des Gefässsystems verwendet werden. Es kann als Mittel zur Steigerung der Durchblutung von Coronargefässen bei Coronarspasmen, bei pectanginösen Anfällen und Infarkten sowie als Mittel zur Aufhebung von Gefässspasmen im Durchblutungsbereich der Hirngefässe verwendet werden. Überdies kann die neue Verbindung als Mittel zur Förderung des Durchtrittes eines Medikamentes aus der Blutbahn ins Gewebe dienen.

Es besteht eine gro¯e Anzahl von Möglichkeiten, das neue Nonapeptid zu synthetisieren. Vorteilhaft kondensiert man N-Carbobenzoxy-L-phenylalanin-p-nitro-phe nylester mit L-Isoleucin-methylester, spaltet die Carbo benzoxygruppe ab und kondensiert den erhaltenen Dipeptidester mit N-Carbo-tert. butoxy-L-alanin. Der erhaltene Tripeptidester N-Carbo-tert. butoxy-L-alanyl-L- phenylalanyl-L-isoleucin-methylester wird über das Hydrazid (Fig. I) in das Azid übergaführt. Dieses wird mit Gllycyl-L-leucyl-L-methioninamid kondensiert, das durch Kondensation von N-Trityl-glycyl-L-leucin-mit L-Methioninamid und Abspaltung der Tritylgruppe erhalten wurde.

Das erhaltene Hexapeptidamid wurde durch Behandlung mit Trifluoressigsäure in L-Alanyl-L-phe nylalanyl-Lisoleucyl-glycyl-L-leucyl-L-methioninamid (Fig. II) übergeführt.

Ferner wird N-Carbo-tert. butoxy-L-prolin mit L Serin-methylester kondensiert und der erhaltene N Carbo-tert.-butoxy-L-prolyl-L-serin-methylester wird über das Hydrazid in das Azid übergeführt, das mit E-N Carbo-tert. butoxy-L-lysin-methylesber kondensiert wird.

Der gebildete N-Carbo-tert. butoxy-L-prolyl-L-seryl-E-N- carbo-tert. butoxy-L-lysin-methylester (Fig. III) wird über das Hydrazid in das Azid übergeführt, das mit dem oben beschriebenen Hexapeptid kondensiert wird. Behandlung des geschützten Nonapeptids mit Trifluoressigsäure liefert das biologisch wirksame Nonapeptid (Fig. IV), welches gegebenenfalls in ein Salz umgewandelt wird.

In den nachfolgenden Beispielen sind die Temperaturangaben in Celsiusgraden gemacht.

Beispiel 1 bezieht sich auf die Herstellung von N Carbo-tert. butoxy-, LralanySL-phenylalanyl-L-isoleucin- methylester (vgl. Fig. I), Beispiel 2 auf die Herstellung von N-Carbo-tert. butoxy-L-alanyl-L-phenylalanyl-L-iso- leucin-hydrazid (vgl. Fig. I), Beispiel 3 auf die Herstellung von L-Alanyl+L-phenylalanyl-L-isoleucyl-glycyl-L- leucyl-L-methioninamid (vgl. Fig. II), Beispiel 4 auf die Herstellung von N-Carbo-tert. butoxy-L-prolyl-L-seryl-e- N-Carbo-tert. butoxy-L-lysin-methylester (vgl.

Fig. III), Beispiel 5 auf die Herstellung von L-Prolyl-L-seryl-L lysyl-L-alanyl-L-phenylalanyl-L-isoleucyl-glycyl-L-leu- cyl-L-methioninamid (vgl. Fig. IV).

Folgende Abkürzungen werden verwendet :
H-Pro-OH = L-Prolin
H-Ser-OH = L-Serin
H-Lys-OH = L-Lysin
H-Ala-OH = L-Alanin
H-Phe-OH = L-Phenylalanin
H-Ile-OH = L-Isoleucin
H-Gly-OH = Glycin H-Leu-OH = L-Leucin H-Met-NH2 = L-Methioninamid
CBO = Carbobenzoxy
CTB = Carbo-tert. butoxy
Tri = Trityl
ONP = p-Nitro-phenyloxy OMe = Methoxy
OBz = Benzyloxy
EMI2.1

EMI3.1

Beispiel 1 (vgl. Fig. 1)
CTB-Ala-Phe-Ile-OCH3
Man l¯st 168 g CBO-Phe-ONP und 58 g H-Ile-OCH3 in 1000 cm3 Chloroform, lÏ¯t ber Nacht bei 20¯ stehen, wÏscht mit Wasser, verd nnter SalzsÏure und wÏsserigem Natriumbicarbonat, trocknet ber Natriumsulfat, verdampft im Vakuum und versetzt den R ckstand mit ¯thylÏther.

Es kristallisiert 130 g CBO-Phe-Ile-OCH (Smp. 106¯), der in 1100 cm3 einer 3,5n L¯sung von Bromwasserstoff in Eisessig gel¯st wird.

Nach einer Stunde bei 20¯ verdampft man im Vakuum, versetzt mit ¯thylÏther, l¯st das kristallisierte Produkt in 600 cm3 Chloroform und versetzt mit 43 cm3 TriÏthylamin, 65 g Dicyclohexylcarbodiimid und 59 g CTB-Ala-OH. Man lÏ¯t ber Nacht bei 0¯ stehen, filtriert, wÏscht die L¯sung mit Wasser, verd nnter SalzsÏure und wÏsserigem Natriumbicarbonat, trocknet ber Natriumsulfat, verdampft im Vakuum und versetzt den R ckstand mit PetrolÏther. Es kristallisiert 105 g CTB-Ala-Phe-Ile-OCH3 (Smp. 50¯; [&alpha;] 20D =-20¯ in 95% EssigsÏure).

Beispiel 2 (vgl. Fig. I)
CTB-Ala-Phe-Ile-NH-NH2
Man l¯st 105 g CTB-Ala-Phe-Ile-OCH3 und 200 g Hydrazinhydrat in 1000 cm3 Methanol. Nach 4 Tagen bei 20 verdampft man im Vakuum, l¯st den R ckstand in 300 cm3 Wasser, bringt zu pH 7,5 mit 4n SalzsÏure, k hlt auf 0¯ und filtriert. Man erhÏlt 55 g CTB-Ala-Phe-Ile-NH-NH2 (Smp. 250¯ mit Zers.) (nach vorherigem Erhitzen oberhalb 100 ) [a] D1 =-23 in Dimethylformamid.

Beispiel 3 (vgl. Fig. II) H-Ala-Phe-Ile-Gly-Leu-Met-NH2
Man l¯st 129 g Tri-Gly-Leu-OH, 45 g H-Met-NH2 und 65 g Dicyclohexylcarbodiimid in 1300 cm3 Methylenchlorid, lÏ¯t ber Nacht bei 0¯ stehen, filtriert, wÏscht die Lösung mit verdünnter Salzsäure und wässerigem Natriumbicarbonat, trocknet über Natriumsulfat, verdampft im Vakuum und versetzt mit Athyläther. Man erhÏlt 112 g Tri-Gly-Leu-Met-NH2 (Smp. 212¯; [&alpha;]21D= -4¯ in Dimethylformamid), das man in einer Mischung von 600 cm3 Eisessig und 600 cm3 Wasser 20 Minuten bei 90 stehenlässt, auf 20 kühIt, filtriert ; man verdampft die Lösung im Vakuum, wÏscht den Rückstand mit Athyläther und kristallisiert aus Methanol Ather.

Man erhält 62 g H-Gly-Leu-Met-NH2-Acetat.

(Smp. 130 mit Zers. ; [&alpha;]21D =-35¯ in 95 % EssigsÏure), das man mit einer Lösung versetzt, die durch L¯sen von 72 g CTB-Ala-Phe-Ile-NH-NH2 in 300 cm3 2n SalzsÏure und 900 cm3 Dimethylformamid bei5 und Ver- setzen mit 85 cm3 2n Natriumndtrit und nach 5 Minuten mit 85 cm3 Triäthylamin und 600 cm3 Dimethylformamid hergestellt wurde. Man lässt ber Nacht bei 0 stehen, verdampft im Vakuum, wÏscht den Rückstand mit kalter, verdünnter Salzsäure, löst in Tetrahydrofuran und fÏllt durch Versetzen mit Wasser.

Man erhält 75 g CTB-Ala-Phe-Ile-Gly-Leu-Met-NH2 (Smp. 250 ; [&alpha;]21 D= -30¯ in Dimethylformamid), das man in 2000 cm3 Trifluoressigsäure löst und 1 Stunde bei 28 stehenlässt. Man verdampft im Vakuum, l¯st in Methanol, gibt 16 cm Tri-n-butylamin zu und fällt mit Athylather. Man erhält 60 g H-Ala-Phe-Ile-Gly-Leu- Met-NH2 (Smp. 250 mit Zers. ; [&alpha;] 22 D =-20 in 95 % Essigsäure).

Beispiel 4 (vgl. Fig. III) CTB-Pro-Ser-Lys (CTB)-OCH3
Man l¯st 86 g CTB-Pro-OH, 62 g H-Ser- OCHs 56 ml Triäthylamin und 86 g Dicyclohexyl- carbodiimid bei 0 in 600 cm3 Chloroform, lasst ber Nacht bei 0 stehen, filtriert, verdampft im Vakuum, versetzt mit Athyläther, filriert, versetzt die Lösung mit Petroläther. Man erhÏlt 102 g CTB-Pro-Ser-OCH3, das man in 1100 cm3 Methanol und 220 cm3 Hydrazinhydrat bei 0¯ l¯st.

Nach 3 Tagen bei-20 verdampft man im Vakuum, l¯st in Methanol und versetzt mit Athylund Petroläther. Man erhÏlt 79 g CTB-Pro-Ser-NHNH2 (Smp. 80¯ [&alpha;]22 D= -75¯ in 95 % Essigsäure), das man in 750 cm3 ln Salzsäure bei-5 löst. Man versetzt mit 270 cm3 ln Natriumnitrit und, nach 10 Minuten, mit festem Natriumcarbonat und extrahiert das gebildete Azid bei-5 mit Athylacetat. Man trocknet die organische Lösung mit Natriumsulfat und versetzt sie mit 71 g H-Lys (CTB)-OCH3.

Nach 10 Stunden bei 0 und 3 Tagen bei 20 wäscht man mit verdünnter Salzsäure und wässerigem Natriumbicarbonat, trocknet ber Natrumsulfat, verdampft im Vakuum, l¯st den Rückstand in Athyläther und versetzt mit Petroläther. Man erhält 95 g CTB-Pro-Ser-Lys (CTB)-OCH3 (Smp. 60¯ mit Zers. ; [a] 22 D= -56¯ in 95% EssigsÏure).

Beispiel 5 (vgl. Fig. IV)
H-Pro-Ser-Lys-Ala-Phe-Ile-Gly-Leu-Met-NH2
Man löst 80 g CTB-Pro-Ser-Lys (CTB)-OCH3 in 750 cm3 Methanol, versetzt mit 200 cm3 Hydrazinhydrat, lässt ber Nacht bei 20 stehen, verdampft im Vakuum, l¯st in 900 cm3 Methanol und versetzt mit 5000 ce ¯thylÏther. Es kristallisiert 59 g CTB-Pro-Ser-Lys (CTB)-NH-NH2 (Smp. 160¯; [&alpha;] 21D = -58¯ in Essig- säure 95%), das man in 440 cm3 ln Salzsäure und 880 cm3 Dimethylformamid l¯st und bei-5 mit 60 cm3 2n Natriumnitrit und nach 5 Minuten mit noch 82 cm3 Triäthylamin und 57 g H-Ala-Phe-Ile-Gly-Leu-Met NH2 versetzt.

Man lässt über Nacht bei 0 stehen, verdampft im Vakuum und wäscht den Rückstand mit Athyläther und mit verdünnter Essigsäure. Man erhält 75 g Nonapeptid (Smp. 260 mit Zers. ; [&alpha;] 20 D=-50¯ in Essigsäure 95%), das man in 2000 cm3 Trifluoressig- säure löst. Man lässt 1 Stunde bei 25 stehen, verdampft im Vakuum, wäscht den Rückstand mit 1000 cm3 Wasser, das man durch Zugabe von Natriumbicarbonat zum pH 6, 5 bringt.

Man erhält 57 g H-ProWer-Lys-Ala- Phe-Ile-Gly-Leu-Met-NH2, in Form eines in neutralem Wasser schwer löslichen Pulvers. ([&alpha;] 20 D = -73¯ in Trifluoressigsäure 95 % ; Smp. 220 mit Zers.). Durch saure Hydrolyse unter Stickstoff liefert es Prolin, Serin, Lysin, Alanin, Phenylalanin, Isoleucin, Glycin, Leucin, Methionin und Ammoniak in äquimolaren Mengen. Das freie Peptid kann durch Zugabe eines Aquivalentes einer Säure in Wasser gelöst werden. Durch Abdampfen erhält man das entsprechende Salz.

Claims

PATENTANSPRUCHE I. Verfahren zur Herstellung eines bisher unbekannten Nonapeptides der Formel L-Prolyl ; L-seryl-L-lysyl- L-alanyl-L-phenylalanyl-L-isoleucyl-glycyl-L-leucyl-L- methioninamid, dadurch gekennzeichnet, dass man aus einem Nonapeptid der obigen Formel, in welcher die e-Aminogruppe des Lysinrestes durch eine geeignete Schutzgruppe und die endständige a-Aminogruppe des L-Prolinrestes durch eine geeignete Schutzgruppe geschützt werden, die Schutzgruppen in einer einzigen oder in mehreren Stufen abspaltet.

II. Verwendung des nach dem Verfahren gemäss Patentanspruch I erhaltenen, bisher unbekannten Nonapeptids der Formel L-Prolyl-L-seryl-L-lysyl-L-alanyl-L- phenylalanyl- L-isotleucyl - glycyl- L-leucyl- L-methioninamid zur Herstellung von Säureadditionssalzen, dadurch gekennzeichnet, dass man das Nonapeptid obiger Formel durch Umsetzung mit organischen oder anorganischen Säuren in die entsprechenden Salze überführt.

UNTERANSPRUCH Verfahren nach Patentanspruch I, dadurch gekennzeichnet, dass im geschützten Nonapeptid der Formel L Prolyl-L-seryl-L-lysyl-L-alanyl-L-phenylalanyl-L-iso- leucyl-glycyl-L-leucyl-L-methioninamid die e-Aminogruppe des Lysinrestes durch einen Carbobenzoxy-, einen Toluolsuvonyl-, einen Carbo-tert. butoxy-, einen Phtha lyl-, einen Formyl-, einen Trifluoracetyl-oder einen p Nitro-carbobenzoxy-Rest und die endständige a-Aminogruppe des L-Prolinrestes durch einen Carbobenzoxy-, einen Toluolsulfonyl-, einen Carbo-tert.

butoxy-, einen Formyl-, einen Trifluoracetyl- oder einen p-Nitro-carbobenzoxy-Rest geschützt ist.