DE2050434A1 - Neue Peptide und Verfahren zu ihrer Herstellung - Google Patents

Description

CIBA AKTIENGESELLSCHAFT, BASEL (SCHWEIZ) Case 6875/1+2/E

Deutschland

Neue Peptide und Verfahren zu Ihrer Herstellung

Gegenstand der Erfindung sind neue hypocalcämiseh wirksame Peptide der Formel I

l| 2 3 4 5 6 71 8 9 10 11 12 13 14

H-Cys-Gly-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys- X -Leu-Giy-Thr-Tyr-Thr-Gln-

15 16 17 l8 IQ 20 21 22 23 24 25 26 27 28 Asp-Phe-Asn-Lys-Phe-Hls-Thr-Phe-Pro-Gln-Thr-Ala-Ile-Gly-

29 30 31 32

VaI-GIy-AIa-PrO-MH₀, ·

worin X für den L-Methionin-, L-Valin-, L-Norvalin-, L-Leu-

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ein-, L-Isoleucin-, L-Norleucin- oder L-a-Aminobuttersäurerest steht und worin mindestens eine der Aminosäuren in den Stellungen 11, 12, 16, 17, 19, 20, 22 und 24 gegen eine andere Aminosäure ausgetauscht ist, und zwar L-Threonin gegen L-Lysin, L-Tyrosin gegen L-Leucin, L-Phenylalanin gegen L-Leucin, L-Aspa-

•17 IQ

raginsäure ' gegen- L-Histidln, L-Phenylalanin ^ gegen L-Leucin,

20 22

L-Histidin gegen L-Glutamin, L-Phenylalanin gegen L-Tyrosin und L-Glutamin gegen L-Arginin, ihre Derivate sowie Säureadditionssalze und Komplexe dieser Verbindungen und Verfahren zu ihrer Herstellung.

Als Derivate sind vor a'llem l·^ -Acylderivate sowie Desarnino -peptide zu-nennen. · . ■■

Acylgruppen für die Acylierung der N -Aminogruppe sind die Reste von Carbonsäuren wie aliphatischen^ aromatischen, araliphatischen, heterocyclischen' und heterocyclylaliphatischen Carbonsäuren, insbesondere von niederen ein- oder zweiwertigen Alkan- oder Alkensäuren wie Ameisensäure, Essigsäure, Propionsäure, Buttersäuren, Acrylsäure, Bernsteinsäure, von alicyclischen Carbonsäuren wie Cycloalkylcarbonsäuren, von ein- oder zweiwertigen monocyclischen aromatischen Carbonsäuren wie unsubstituierter und substituierter Benzoesäure oder Phthalsäure, von unsubatituierten und Aryl-substituierten Aryl-niederalkyl- oder alkenyl-carbonsäuren wie Phenylessigsäure, von unsubstituierten oder substituierten ein- oder zweiwertigen 5~ bis 6~gliedrigen

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heterocyclischen Säuren mit Stickstoff,. Schwefel und/oder Sauerstoff als Heteroatomen, wie Pyridincarbonsäuren, Thiophencarbonsauren,.oder von Heterocyclyl-niederalkansäuren wie Pyridylessigsäure, Imidazolylessigsaure, worin die Substituenten der Ringe z.B. Halogenatome, Nitrogruppen, Niederalkyl- oder Niederalkoxygruppen oder Niedercarbalkoxygruppen sind. Weiter sind als Acylreste vor allem Acyl roste von Aminosäuren, besonders von α-Aminosäuren, wie z.B. Glyeyl-L-Leucyl, L-Pyroglutamyl zu nennen, ferner Acylreste, die sich von Kohlensäure oder Thiokohlensäure bzw. ihren Estern · oder Amiden ableiten, z.B. Niederalkyloxycarbonylgruppen wie Aethoxycarbonyl, tert.-Butyloxycarbonyl, ferner unsubstitulertes und wie oben angegeben substituiertes Benzyloxycarbonyl, Carbamoyl und Thiocarbarnoyl sov/ie

N-substituiertes Carbamoyl und Thiocarbamoyl, z.B. N-Niederalkylcarbarcoyl, N-Phenylcarbanioyl, N-Phenyl-thiocarbajnoyl.

Als Säureadditionssalze sind besonders Salze

von therapeutisch anwendbaren Säuren wie Salzsäure, Essigsäure, Schwefeisäure, Phosphorsäure und Sulfonsäuren,

wie Niederalkansulfonsäuren, Benzol- oder Toluolsulfonsäure zu nennen.

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Hat er Koasplexen sind die %n i&rer aoeh nieM. abgeklärten. Verbindungen: tsxü versteh en _4: die bei» Zusatz gewisser anor^fcnisdlier oder organischer Stoffe zn langkettigen Peptiden entstehe« wnä diesen ein© ver-1 änderte . Wirkung verleihen·. Solche Stoffe sind beispielsweise beschrieben fur. ACTH und andere adrenocorticotrop, wirksame ^_s Peptide. Si nennen sind z.B. anorganische Verbindungen* die sich von Metallen wie CaIeium,. Magnesium, Aluminium, Cobalt wad inabesondere von Zink ableiten, vor allem schwerlösliche Salze wie Phosphate, Pyrophasphate und Polyphosphate sowie Hydroxyde dieser Metalle* ferner Alkalimetallpolyphosphate wie z.B. "Calgon N", Saigon 322", "CaIg_0n l88^rt oder "Polyron B 12^M♦ Organische Stoffe, die eine Verlängerung der Wirkung hervorrufen, sind beispielsweise nicht antigene Gelatine, z.B. Polyoxygelatine, Polyvinylpyrrolidon und Carboxymethylcellulose, ferner Sulfonsä'ure-Qder Phosphorsäureester von Alginsäure, Dextran, PoIy-

phenolen und Polyalkoholen, vor allem Polyphoretinphosphat und Phytinsäure, sowie Polymerisate und Copolymerisate von basischen oder vor allem sauren Aminosäuren, z.B. Protamin oder Polyglutaminsäure.

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Die neuen Verbindungen weisen eine hypocalcämische Wirkung auf. Sie senken den Plasma- Calcium und Phosphatgehalt des Blutes von Säugetieren, wie durch Versuche an Ratten nachgewiesen wurde. Sie können bei Hypercalcämien, Osteoporose oder Osteitis deformans verwendet werden.

Das erfindungsgemässe Verfahren zur Herstellung der

neuen Pept^idamide, ihrer Derivate, ihrer Säureadditionssalze und Komplexe ist dadurch gekennzeichnet, dass man

1. aus Verbindungen der Formel I

lj 2 3 4 5 o* f[ 8 9 10 11 12 13 14 · H-Cys-Gly-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys- X -Leu-Gly-Thr-Tyr-Thr-Gln-15 16 17 .18 19 20 21 22 23 * 24 25 26 27 28

Asp-Phe-Asn-Lys-Phe-His-Thr-Phe-Pro-Gln-Thr-Ala-Ile-GIy-

29 30 31
VaI-GIy-AIa-PrO-NH₃, '

worin X die angegebene Bedeutung hat und mindestens eine der Aminosäuren in den Stellungen 11,

12, Vq₉ 17, 19, 20, 22 und 24 durch die oben genannten Aminosäuren ersetzt ist, oder aus deren Derivaten, in welchen Verbindungen mindestens eine Aminogruppe oder eine Carboxylgruppe durch eine abspaltbare Schutzgruppe geschützt ist, die Schutzgruppe(n) abspaltet oder
2. Verbindungen der Formel II

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

H-Cys-Gly-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys- X -Leu-GIy-Thr-Tyr-Thr-

14 15 l6 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 Gln-Asp-Phe-Asn-Lya-Pho-His-Thr-Phe-Pro-Gln-Thr-Ala-Ile-

28 29 30 31 32

GIy-Va 1 -G1 y -A I a -Pro -EIL· 11,

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worin X die angegebene Bedeutung hat und mindestens eine der Aminosäuren in den Stellungen 11.,

12, 16, 17, 19, 20, 22 und 2Ά durch die oben genannten Aminosäuren ersetzt ist, oder deren Derivaten, worin die Mercapto*- · gruppen frei oder durch die Tritylgruppe geschützt sind, zu Disulfiden oxidiert und, wenn erwünscht, die erhaltenen Peptidarnide in ihre Säureadditionssalze oder Komplexe überführt.

Bei der Herstellung'der Ausgangsstoffe für die 1. Variante des erfindungsgemässen Verfahrens wie auch aller in den 2 Verfahrensvarianten benötigten Zwischenprodukte kommen als Schutzgruppen besonders die von der Synthese langkettiger Peptide her bekannten Schutzgruppen in Betracht, die .leicht

abgespalten werden können, z.B. durch Hydrolyse, Reduktion, Aminolyse oder Hydrazinolyse. *

So verwendet man z.B. als Schutzgruppen für Aminogruppen Acyl- oder Aralkylgruppen wie Formyl-, Trifluoracetyl-, Phthaloyl-, Benzolsulfonyi-, p-Toluolsulfonyl-, ο-Nitrophenylsulfenyl-, 2, ¹I-Dinitrophenylsulfenylgruppen (diese SuIfenylgruppen können auch durch Einwirkung nucleophiler Reagenzien, z.B. Sulfite, Thiosulfate, vgl. englisches Patent 1 10¹I 2¹Jl abgespalten werden) gegebenenfalls substituierte, wie z.B. durch Niederalkoxygruppen, besonders · o- oder p-Methoxygruppen substituierte Benzyl-,' oder Diphenyl- oder Triphenylmethylgruppen oder von der Kohlen-

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säure sich ableitende Gruppen wie·gegebenenfalls in den aromatischen Ringen* z.B.. durch. Halogens tome wie Chlor» oder Brom, iTitrogrtJtppen, Niederalkyl- ader Niederalkoxygruppen oder farbgebetide Gruppen, ζ JB* Äzogruppen substituierte ArylmethylQxycarbonylgruppenj. in denen die Methylengruppe durch einen weiteren Arylrest und/oder einen oder gegebenenfalls z.«ei niedere Alkylreste · · substituiert sein kann, wie Benzyl-, Benzhydryl- oder μ

2-PKenyl~isopropyl-Qxycärbonylgruppen_Jt z.B> Carbobenzoxy, p-Broßi- oder p-Chlorcarbobenzoxy, p-Nitrocarbobenzoxy oder p-PIethoxycarbobenzoxy, p-Fhenylazo-benzyloxycarbonyl und p-(p^t-Methoxy-phenylazo)-benzyloxycarbonyl_J> 2-Tolyl- · isopropylöxycarbonyl und insbesondere 2-(p-Biphenylyl)-

isopropyloxycarbonyl sowie aliphatische Oxycarbonylgruppen wie AdamantylQxycarbonyl, Cyclopentyloxycarb'onyl, 2,2,2-ΊΜβη1οΓ-äthyloxycarbonylj 2-Jodäthyloxycarbonyl^ tert.Arayloxycar- j bonyl oder vor allem tert.-Butyloxycarbonyl.

Die Aminogruppen können auch durch Bildung von Enaminen, erhalten durch Reaktion der Aminogruppe mit 1,3-Diketonen, z.B. Benzoylaceton, Acetylaceton oder Dimedon, geschützt werden.

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substituiert sela« <tl^r@ Amidgmppe

die Hydr

8.B·

die Tritylgruppe,

wl·© gruppe, ie Trif luoraoetylgruppe*

substituiert« Aiiea

€y^.im^ thy !alkohol, t^S»^r

insbesondere ferner Aralkanole durch Miederalk substituierte

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■ΐ"' Ii !"!iWlilPÜli !!"!läillllUIIIIIINIillllinillilSlllNIIIIIIIII .!»"ΨϋιΙΙΙίΙΙΙΙΙΙΙΙϋΙΙΐ;:]!!!¹

p-Nitrobenzylalkohol, p-Methoxybenzylalkohol oder 2,^,6-Trimethy!benzylalkohol, gegebenenfalls durch elektronenanziehende Substituenten substituierte Phenole und Thiophenole wie Thiophenole Thiokresol, p-Nitrothiophenol, 2,4,5- und 2,h, 6-Trichlorphenol, Pentachlorphenol, p-Nitrophenol, 2,4-Dinitrophenolj ρ-Cyanophenol, oder p-Methansiilfonylphenol, v/eiter z.B. N-Hydroxysuccinimid, N-Hydroxyphthaliraid, N-Hydroxypiperidin, 8-Hydroxychinolin·.

Die Hydroxygruppen der Serin-, Threonine und | Tyrosinreste können z.B. durch.Veresterung oder Verätherung geschützt werden. Als Acylreste bei der Veresterung sind z.B. Niederalkanoylreste v/i.e Acetyl, Aroylreste wie Benzoyl und vor allem von der Kohlensäure.sich ableitende Reste wie Benzyloxycarbonyl oder Aethyloxycarbonyl geeignet. Zur Verätherung geeignete Gruppen sind z.B. Benzyl-, Tetrahydropyranyl- oder tert. Butylreste. Ferner eignen sich zum Schutz der Hydroxylgruppen die in Ber. 100 (1967), |

3838 - 38^9 beschriebenen 2,2,2-Trifluor-1-tert.-butyloxycarbonylamino- oder -l-benzyloxycarbonylaminoäthylgruppen (Weygand). Die Hydroxylgruppen brauchen aber nicht notwendig geschützt zu werden.

Die Mercaptogruppen der Cysteinreste werden z.B. durch Acylierung oder Alkylierung geschützt. Zur" -.. Acylierung geeignet ist z.B. der Acetyl- oder Benzoylrest,

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der Aethylcarbamoylrest oder der gegebenenfalls substituierte Carbobenzoxyrest. Zur Alkylierung geeignet sind. z.B. der tert.-Butyl- oder Benzylthiomethylrest oder gegebenenfalls substituierte Arylmethylgruppen wie Benzyl, p-Nitrobenzyl, Diphenylmethyl, Dimethoxybenzhydryl oder Trityl, ferner Phenylcyclohexyl, Thienyl(2)-cyclohexyl u.a., vgl. Ber. 101 (1968), 681, ferner z.B. der Acetylaminomethylrest, vgl. Tetrahedron Letters No. 26 (I968) S. 3057· Die Iminogruppe des Histidins braucht nicht unbedingt geschützt zu werden, jedoch kann es vorteilhaft sein, sie zu schützen, z.B. durch Benzyl, Trityl, Carbohenzoxy, Adamantyloxycarbonyl oder die oben genannten Weygand'sehen Gruppen.

Vorzugsweise verwendet man bei der 1. Variante

des erfindungsgemässen Verfahrens zum Schutz der Carboxylgruppe der Seitenkette und gegebenenfalls der terminälen Carboxylgruppe die tert.-Butylestergruppe, zum Schutz der Aminogruppe der Seitenkette die tert.-Butyloxycarbonylgruppe, für die Hydroxylgruppen der Serin-, Threonin- und Tyrosin-. reste, sofern diese überhaupt geschützt-werden, die tert.-Butyläthergruppe und, wenn erwünscht, zum Schutz der Imino-, gruppe des Histidins die 2,2,2_rTrifluor-1-tert-butyloxycarbonylaminoäthylgruppe. Alle diese Schutzgruppen können, wenn erwünscht, in einer Stufe durch saure Hydrolyse, Z..B. mittels Trif luorpssigsäure^ _; Salgsävire, oder JB¹Iuorwasser-.,,, stoff, abgespalten werden. ,Beim Aufbau ,der „b^i, der 1 ..·· Ve,rf ahren-s-Variante als Ausgangsmaterial verwendeten geschützten,Dotriacontapeptide — -r■■———~

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unter Verweßdurag v<on mit Trifluorsaarfe oder Salzsäure ab~ spaltbaren Schutzgruppe^ «erden die Mercaptogruppen· vorzugsweise durch Beimjl öder 'frltyl geschützt» Öle S-Trlt^ligrupspem können aus den geschützten-!Peptid in organischer Losung selektiv {unter'Beibehaltung der mit TrIfluoressigsäure abspaltibaren Gruppen) mit Mercuriacetat und Schwefelwasserstoff abgespalten werden. Die S-Benzylgruppen können aus dem geschützten Peptid selektiv mit Natrium In -flüssigem Ammoniak abgespalten werden. In beiden Fällen erhält man das geschützte Peptid mit freien Mercaptogruppen., Dieses kann ei» geschützten Disulfide z»B. mit Jod In Bisessig, mit Mgodathan in organischen Lösungsmitteln oder, mit' Luftsauerstoff In flüssigem Ammoniak oxydiert werden.· Besonders vorteilhaft Ist esj die Mercaptogruppen durch TritylgTüppen zu schützen und diese aus dem geschützten Peptid unter gleichzeitiger Bildung der Dlsulfidbrücke mit Jod In Methanol oder Eisessig zu entfernen. Die Bildung des ■BisulfIdrlnges kann auf der Stufe einer der beiden Cystein-

reste enthaltenden Teilsequenz, z.B. des Decapeptids 1-10, •oder auf der Stufe des Dotriacontapeptidamlds ausgeführt werden,

Bei der 2, Verfahrensvariante des erfindungsgemässen Verfahrens kann das als Ausgangsmaterial verwendete offenkettige Peptid vorzugsweise ebenfalls mit den für Variante l) genannten Schutzgruppen hergestellt werden. Die S-Trityleruppen können mit Trifluoressigsäure entfernt

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und das freie of'fenkettige Peptid in bekannter Weise durch Kaliumferricyanid in wässeriger Lösung oder durch Jododer' mit Luft in flüssigem Ammoniak oxydiert werden. Man kann aber auch die /Tritylgruppen nach dem oben erwähnten Verfahren mit Jod und Methanol.unter gleichzeitiger Disulfide bildung entfernen. ■ '. .'..·· ' ."■'; ■"· '

.. . Bei der Herstellung der N-Acylderivate kann' die Acylgruppe als Aminoschutzgruppe verwendet werden.

Die erhaltenen Peptide können in an sich bekannter

™ Weise nachträglich in ihre Säureadditionssalze und/oder Komplexe übergeführt werden. ·

. ' · Die Bildung von Säureadditionssalzen wird in

bekannter Weise vorgenommen; · . - '

'Auch die Bildung von Komplexen erfolgt nach bekannten oder diesen äquivalenten Methoden.

Komplexe mit anorganischen Stoffen wie schwerlöslichen Metall-j z.B. Aluminium- oder Zinkverbindungen P werden vorzugsweise in analoger Weise wie für ACTH bekannt, "z.B. durch Umsetzung mit.einem löslichen Salz des . . '-.. betreffenden Metalls, z.B. Zinkchlorid oder Zinksulfat, und Ausfällung mit einem Alkalimetallphosphat und/oder -hydroxyd hergestellt. Komplexe mit organischen Verbindungen ° wie Polyoxygelatine, Carboxymethylcellulose, Polyvinyl-

■■ —» -pyrrolidon, Polyphloretinphosphat, Polyglutaminsaure etc. co ■ ■ ·■. .

ro werden durch Mischen dieser Substanzen mit dem Peptid ro

^ in wässeriger Lösung erhalten. In gleicher Weise können auch unlösliche Verbindungen mit Alkalimctallpolyphosphaten

- 13 - ■ '

hergestellt werden. ... -

Die Erfindung betrifft auch diejenigen Ausführungsformen des Verfahrens, bei denen man von einem auf irgendeiner Verfahrensstufe erhältlichen Zwischenprodukt ausgeht und die fehlenden Schritte vornimmt oder das Verfahren auf irgendeiner Stufe abbricht und/oder einen Ausgangsstoff in situ bildet und/oder in Form eines Salzes verwendet. '·. .- _. . .

Die als Ausgangsstoffe verwendeten Peptide

werden erhalten, indem man die Aminosäuren, wenn erforderlich oder erwünscht unter Verwendung leicht abspaltbarer Schutzgruppen, in der erwähnten Reihenfolge einzeln oder nach vorheriger Bildung kleinerer Peptideinheiten verknüpft, wobei gegebenenfalls auf einer geeigneten Stufe der Synthese die Disulfidbrücke gebildet wird. Man arbeitet zweckmässig nach den für die Herstellung langkettiger Peptide, unter Berücksichtigung der Disulfid-Brücke, geeigneten Verknüpf ungsniethoden, wie sie aus der Literatur bekannt sind.

Die Verknüpfung der Aminosäure- und/oder Peptideinheiten erfolgt daher z.B. in der Weise, dass man eine Aminosäure oder ein Peptid mit geschützter a-Aminogruppe und aktivierter terminaler Carboxylgruppe mit einer Amino-

säure oder einem Peptid mit freier a-Aminogruppe und freier

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oder geschützter, z.B. veresterter oder amidierter terminaler Carboxylgruppe umsetzt oder dass man eine Aminosäure oder ein Peptid mit aktivierter a-Aminogruppe und geschützter terminaler Carboxylgruppe mit einer Aminosäure oder einem Peptid mit freier terminaler Carboxylgruppe und geschützter a-Aminogruppe umsetzt. Die Carboxylgruppe kann beispielsweise durch* Ueberführung in ein Säureazid, -anhydrid, -imidazolid oder einen aktivierten Ester, wie Cyanmethylester, Thiophenylester, p-Nitrothiophenylester, Thiokresylester, p-Methansulfonylphenylester, p-Nitrophenylesterj/ 2.,^-Dinitrophenylester, 2,%,5- oder 2,4,6-Trichlorphenylester, Pentachlorphenylester, N-Hydroxysuccinimidesterj N-Hydroxyphthalimidester, 8-Hydroxychinolinesterj, N-Hydroxypiperidinester, oder durch Reaktion mittels eines Carbodiimids (gegebenenfalls unter Zusatz von N-Hydroxysuccinirnid oder unsubstituiertem oder z.B. Halogen-, Methyl- oder Methoxysubstituiertem 1-Hydroxybenzotriazol) oder N,N'-Carbonyldiimidazols, oder Isoxazoliumsalzes, z.B. Woodward Reagens, die Aminogruppe beispielsweise durch Reaktion mit einem Phosphit aktiviert werden. Als gebräuchlichste Methoden sind zu nennen die Carbodiimidmethode, die Methode nach Weygand-Wünsch (Carbodiimid in Gegenwart von N-Hydroxysuccinimid), die Azidmethode, die Methode der aktivierten E:-jter unu die Anhydridmethode', ferner die .Merrifield-Methocie und die Methode der N-Carboxyanliydride oder .N-Thiocarboxyanhydride.

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Bei der Herstellung der Ausgangsstoffe ist es vorteilhaft, von einer Sequenz auszugehen., \-jelche die ersten 10 N-terminalen Aminosäuren umfasst und mit diesem N-Terminus die gesamte restliche Sequenz zu kondensieren, vorzugsweise nach Vieygand-Wünsch.

Man kann aber auch die.genannte N-terminale Sequenz z.B. mit dem Fragment bis zur 28. Aminosäure (Glycin), mit freier terminaler Carboxylgruppe verknüpfen und das Octacosapeptid mit dem Tetrapeptid der Aminosäuren 29 - 32 kondensieren, beispielsweise nach Weygand-Wünsch.

Im folgenden wird als Beispiel für eine bevor- . zugte Ausfuhrungsform die Herstellung des Peptids der Formel I, in welchem die IJ· Aminosäure durch L-Histidin, die 19. durch. L-Leucin und die 20. durch L-Glutarain ersetzt ist3 erläutert. Die Schemata zeigen spezielle Arbeitsweisen, die selbstverständlich.durch äquivalente Arbeitsweisen ersetzt werden können.

In den Figuren und in den Beispielen bedeuten:

1) die Azidmethode .

2) die Methode der gemischten Anhydride

3) die Methode der aktivierten Ester, besonders p-Nitrophenylester (ONP) oder Hydroxysuccinimidester (OSU)

h) die Carbodiimidmethöde

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5) die Methode nach Weygand-V/ünsch • BOC tert. Butyloxycarbonyl, DPC ' 2-(ρ-Biphehylyl)-isopropyloxycarbonyl, Z Carbobenzoxy TRI Trifcyl BzI Benzyl

^' OtBu tert.-Butylester OBzI Benzylester ONB p-Nitrobenzylester ONP p-Nitrophenylester OMe Methylester OEt Aethylest.er

OCP 2,4,5-Trichlorphenylester tBu tert.-Butyläthcr

Ac Acetyl

Bmp ß-Mercaptopropionyl fc TFA Trifluoressigsäure

Das N-terminale Decapeptid (l-10) kann z.B. aus den Sequenzen 1-4 und 5-1° oder 1-5 und 6-10 oder 1-6 und 7-10 oder 1-7 und 8-10 aufgebaut werden, wie aus den Fig. 1-8 ersichtlich; man kann jedoch auch andere Bruchstücke zum Aufbau der Sequenz 1-10 verv.'enden. Als Schutzgruppe für die a-Aminogruppe am Cystein wird vorzugsvjoiso

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¹ ■■■■'■ ' ■■■ ·■ ■ ■-'■ linn hi

die tert.-Butyloxycarbonylgruppe oder eine äquivalente, durch saure Hydrolyse abspaltbare Gruppe verwendet, oder wenn ein Na-acyliertes Dotriacontapeptid hergestellt v/erden soll, die entsprechende Acyl- z.B. Acetylgruppe« Daneben verwendet man zweckrnässig als Mercaptoschutzgruppen solche, die selektiv gegenüber der durch saure Hydrolyse abspaltbaren N -Aminoschutzgruppe (z.B. tert.-Butyloxycarbonylgruppe) abgespalten werden können, z.B. die Benzyl- oder ■ Tritylgruppe. Die terminale Carboxylgruppe des Decapeptids braucht nicht notwendig geschützt zu werden, z.B. nicht, wenn Kondensationen nach der Azid- oder Anhydridmethode ausgeführt werden. Man kann diese Gruppe aber "auch durch Veresterung, wie oben angegeben, schützen, z.B. αμΓοη Veresterung mit Methanol oder Aethanol (Abspaltung der Estergruppe mit verdünnter Natronlauge) oder mit Benzylalkohol oder Analogen (Abspaltung der Estergruppe z.B. mit

Matriuni in flüssigem Ammoniak). Der Schutz der Aminogruppen der Zwischenprodukte erfolgt mittels der üblichen Schutzgruppen, z.B. Carbobenzoxy, Trityl, tert.-Butyloxycarbonyl oder 2-para-Diphenyl-isopropyloxycarbonyl. Die Carboxyl-

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gruppen der Zwischenprodukte werden, wenn erforderlich, in der üblichen V/eise verestert. Die Hydroxygruppen des Serin- und Threoninrestes können durch Verätherung, z.B. mit tert.-Butanol oder Aequivalenten geschützt werden.

Die p-Nitrobenzylester- und Benzylestergruppen können mit Natrium in flüssigem Ammoniak oder durch Hydrogenolyse in Gegenwart von Palladiurakohle abgespalten werden, die Carbobenzoxygruppe ebenfalls durch Hydrogenolyse, die N-Tritylgruppe mit wässeriger Essigsäure, die tert.-Butyloxycarbonylgruppe mit Trifluoressigsäure, die 2-(p-Biphenylyl) -lsopropyloxycarbonylgruppe mit .wässeriger Essigsäure oder z.B. mit einem Gemisch von Eisessig, Ameisensäure (82,8^ig) und Wasser (7:1:2). Der' p-Nitrobenzyl- oder Methylester kann mit Hydrazinhydrat in das Hydrazid übergeführt werden. Mit verdünnter Natronlauge wird die Methyl- oder Aethylestergruppe hydrolysiert. Der tert.-Butylester wird mit Trifluoressigsäure gespalten, ebenso der tert.-Butyläther, Die S-Tritylgruppen werden mit Mercuriacetat und Schwefelwasserstoff entfernt, die . S-Benzylgruppe mit' Natrium in flüssigem Ammoniak, wobei

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gegebenenfalls vorhandene Benzyl- oder p-Nitrobenzylqstergruppen gleichzeitig abgespalten werden. "Der Ringschluss zum Disulfid erfolgt z.B. durch Oxydation mit 1,2-Dijodäthan, derjenige der, S-Trityl-geschützten Verbindungen mit Jod in Methanol. · ·

Die mit der N-terminalen Sequenz zu verbindende C-terminale Sequenz umfassend die 11. bis 32. bzw. 11. bis 28. Aminosäure wird beispielsweise aus den Sequenzen Il-l6,. 17-20, 21-28 und 29-32 zusammengesetzt, wie Fig. 9 zeigt.

In diesem Schema sind die Hydroxylgruppen der Threoninreste und des Tyrosinrestes geschützt, dies ist nicht unbedingt' erforderlieh. Es können auch andere Teil-Sequenzen miteinander vereinigt und andere Schutzgruppen verwendet werden.

Fig. 10 zeigt den Aufbau des Hexapeptids (in Form des Hydrazids) der Aminosäuren 11-16\ Es kann nach der Azidmethode mit der Sequenz 17-28 oder 17-32 verknüpft werden.

Die Sequenz 17-28 kann nach der Azidrnethode aus den Fragmenten 17-20 und 21-28 aufgebaut v/erden.

Fig. 11 zeigt die Synthese des Tetrapeptidhydrazids der Aminosäuren 17-20, Fig. 12 den Aufbau des Octapeptids 21-28. Nach der Verknüpfung der beiden Sequenzen wird die a-Aminoschutzgruppe abgespalten (die

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Carbobenzoxygruppe durch Hydrogenolyse in Gegenwart von Palladiumkohle) und das so erhaltene Dodecapeptid mifc geschützten Seitenketten nach der Azidmethode mit dem . Hexapeptidhydrazid 11~ΐβ (Pig.lO) kondensiert. ·

Die so erhaltene Sequenz 11-28 kann mit dem Tetrapeptidamid der Aminosäuren 29-32., dessen Herstellung Fig. 13 zeigt, verbunden werden, z.B. nach der Methode von V/eygand-Wünsch. Man erhält dann das geschützte ^ Docosapeptidamid 11-32. Aus diesem kann man die a-Amino-

schutzgruppe abspalten (Carbobenzoxy z.B. hydrogenolytisch., DPC mit QO^iger Essigsäure oder Eisessig-Ameisensäure (82,8^ig) - V/asser (7:1:2) und die so erhaltene Verbindung mit freier α-Aminogruppe nach Entfernung der Essigsäure mit dem N-terminalen Decapeptid (Fig. 1-8) verknüpfen., ' beispielsweise nach der. Methode der gemischten Anhydride, · der aktivierten Ester (OSU) oder nach "Weygand-Wünsch. Man kann, aber auch die Sequenz 11-28 mit freier C-terminaler Carboxylgruppe nach Abspaltung der a-Aminoschutzgruppe in der genannten V/eise, mit dem N-terminalen Decapeptid nach der Methode der gemischten Anhydride verknüpfen und das so erhaltene Produkt mit dem Tetrapeptidaniid, 29-32 kondensieren,. z.B. nach Weygand-Wünsch. ■

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Aus dem geschützten Dotriacontapeptidamid worden die Schutzgruppen abgespalten, beispielsweise mit Trifluoressigsäure., oder mit konzentrierter Salzsäure. ·

.' Das für das Verfahren gemäss Variante 2) zu verwendende Dotriacontapeptid mit freien bzw. Tritylgeschützten SH-Gruppen- kann in analoger V/eise wie das oben beschriebene geschützte Dotriacontapeptid hergestellt werden, mit dem Unterschied, dass die geschützten SH_rGruppen bis zum Schluss der Synthese beibehalten werden. Erst

nachdem alle übrigen Schutzgruppen aus dem geschützten Dotriacontapeptid entfernt worden sind, spaltet man die SH-Schutzgruppen bzw. oxydiert die Tritylgeschützte Verbindung direkt wie oben' erwähnt.' ' ' · ·' '

Je nach der Arbeitsweise erhält man die neuen Verbindungen in Form von Basen oder ihren Salzen. Aus

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den Salzen können in an sich bekannter V/eise dio Basen .

gewonnen werden. Von letzteren wiederum lassen sich durch Umsetzung mit Säuren, die zur Bildung therapeutisch verwendbarer Salze geeignet sind, Salze gewinnen, wie z.B. solche mit anorganischen Säuren, wie Halogenwasserstoffsäur en, beispielsweise Salzsäure oder Bromwasserstoffsäure, Perchlorsäure, Salpetersäure oder Thiocyansäure', Schwefel-, oder Phosphorsäuren, oder organischen Säuren, wie Ameisensäure, Essigsäure, Propionsäure, Glykolsäure, Milchsäure, Brenztraubensäure, Oxalsäure, Malonsäure, Bernsteinsäure, Maleinsäure, Fumarsäure, Aepfelsäure, Weinsäure, Zitronensäure, Ascorbinsäure, Hydroxymaleinsäure, Dihydroxymaleinsäure, Benzoesäure, Phenylessigsäure, 4-Aminobenzoesäure, 4-Hydroxybenzoesäure, Anthranil-

säure, Zimtsäure, Mandelsäure, Salicylsäure, 4-Aminosalicylsäure, 2-Phenoxybenzoesäure, 2-Acetoxybenzoesäure, Methansulfonsäure, Aethansulfonsäure, Hydroxyäthansulfonsäure, Benzolsulfonsäure, p-Toluolsulfons&ure, Naphthalinsulf onsäure oder Sulfanilsäure. ·

Die 'verfahrensgemäss erhaltenen Peptide können in Form von pharmazeutischen Präparaten Verwendung finden. Diese enthalten die Peptide in Mischung mit einem für

die enterale oder parenterale Applikation geeigneten pharmazeutischen, organischen oder anorganischen Träger-

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material. Für dasselbe kommen solche Stoffe in Frage, die mit den Polypeptiden nicht reagieren, wie z.B. Gelatine, Milchzucker, Glukose, Kochsalz, Stärke, Magnesiumstearat, Talk, pflanzliche OeIe, Benzylalkohol, Gummi, Polyalkylen- " glykole, ^aseline, Cholesterin oder andere bekannte Arzneimittelträger. Die pharmazeutischen Präparate können z.B. als Lyophilisat oder· in flüssiger Form als Lösungen, Suspensionen oder Emulsionen vorliegen. Gegebenenfalls sind sie "sterilisiert und bzw. oder enthalten Hilfsstoffe, wie Konservierungs-, Stabilisierungs-, Netz- oder Emulgiermittel. Sie können, auch noch andere therapeutisch wertvolle Stoffe enthalten.

Die Erfindung wird in den folgenden Beispielen beschrieben. Die Temperaturen sind in Celsiusgraden angegeben.

In der Dünnschichtchromatographie werden die folgenden Systeme verwendet:

System 37

System 43C

System 43E

System 45

System 52

System 52A

n-Butanol-Pyridin-Wasser (46:31:

tert.Amylalkohol-Isopropanol-Wasser(51:21:28) tert.-Amylalkohol-Isopropanol-Wasser (32:32:36) see. Butanol-3$iges wässriges Ammoniak (70:30) n-Butanol-Eisessig-Wasser (75:7,5:21.) n-Butanol-Eisessig-Wasser (67:10:23)

109819/2249

System 70 «· : Aethylacetat-Pyridin-Wasser (4θ:2Ο:4θ) System 79 : n-Buj;anol-Pyridin-Wasser (77:4:19) System 96 System 100

sek.-Butanol-Eisessig-Wasser (67;10:23) .Aethylacetat-Pyridin-Eisessig-Wasser (62:21:6:

System 101A : n-Butanol-Pyridin-Eisesslg-Wasser (42:24:4:30) System 107 : Aethylacetat-Pyridin-Wasser (49:24:27)

System 110 System II5

Aethylacetat-n-Butanol-Pyridin-Eisessig-Wasser (42:21:21:6:10)

Aethylacetat-Pyridin-Ameisensäure-Wasser (63:21:10:6)

In der Craig-Verteilung wird, wenn nichts anders ange geben, der folgende Puffer verwendet: 29 ml Eisessig, I9 g Ammoniumacetat, mit Wasser auf 1 Liter aufgefüllt.

1098 19/22

Anlage zur Eingabe vom 27.1.1371.-i. Sachen der Patentanmeldung

Anmelder : CIBA-G-EIG-YAC- - tf.Zoichsns 21 754-BH/bu

Gase 6875/1+2/E **~~.~.

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Beispiel 1 :

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H-Cys-Gly-Asn-Leu-Ser-mr-Cys-Met-Leu-Gly-Thr-Tyr-Thr-GIn-Asp-Phe-Asn-Lys-Phe-His-Thr-Tyr-Pro-Gln-Thr-Ala-Ile-GIy-Val-Gly-Ala-Pro-NHp, Tyr²²-C&lcitonin M

50 mg BOC-Cys-Gly-Asn-Leu-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Cys-Met-Leu-Gly-Thr(tBu)-^rryr(tBu)-Thr(tBu)Gln-Asp(OtBu)-Phe-Asn-Lys (BOG)-Phe-His-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Pro-Gln-Thr(tBu)-Ala-Ile-GIy-P Val-Gly-Ala-Pro-NHp werden bei 0 in 1,2 ml konzentrierter Salzsäure gelöst, mit Stickstoff bespült und während 10 Minuten bei 0° stehen gelassen. Man kühlt dann mit Trockeneis, evakuiert im Hochvakuum und engt die Lösung unter langsamem Steigern der Temperatur bis auf 0 zum Sirup ein. ITach Zugabe von 2 ml Wasser wird lyophilisiert, der Rückstand in 1 ml Wasser gelöst und zur Umwandlung in das Acetat langsam durch eine mit 0,02-n. Essigsäure äquilibriertB Säule (Durchmesser = 7 .»5 mm; 1 = 100 mm) von schwach basischem Ionenaustauscher (Merck Nr. Il) filtriert. Man spült mit 0,02-n. Essigsäure bis zur Polin-negativen Reaktion nach, konzentriert das Eluat bis auf ca. 2 ml und lyophili.siert. Das so erhaltene Produkt

22

(Acetat von Tyr -Calcitonin M) wird durch Stehenlassen im offenen Gefäss mit Luftfeuchtigkeit äquilibriert. Es ist ein amorphes,, weisses Pulver. In der Dünnschichtchromatographie auf·Aluminiumoxyd (Alox D-O der Pa. Camag, Muttenz, mit

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Zusatz von 12$ Gips) weist es die' folgenden Rf-Werte auf: Rf₅₂ = 0,48, Rf₇₉ = 0,60.

In der Dünnschicht-Elektrophorese auf Cellulose ("Avicel"-Fertigplatten l440 der Fa. Schleicher & Schuell) läuft es bei pH 1,9 [Puffer _aus 95,2 _ni Eisessig, 26,5 ml Ameisensäure und 1000ml Wasser]und l6 Volt/cm in 1 /2 Stunden 3.» 7 cm zur Kathode. Das geschützte Dotriacontapeptid-amid wird z.B. auf folgendem Weg hergestellt: .

.-Z-Tyr(tBu)-0H wird in Tetrahydrofuranlösung mit Isobutylchlorcarbonat zum gemischten Anhydrid umgesetzt und dieses mit. Prolin-triäthylammoniumsalz (gelöst in Dimethylformamid Wasser (4:1)) zum Dipeptid kondensiert. Dieses wird in Methanol mit Palladiumkohle hydriert, mit Z~Thr(tBu)-0SU in Dimethylformamid-Lösung zum Tripeptid Z-Thr ('tBu)-Tyr(tBü) Pro-OH umgesetzt und dieses wiederum über das gemischte Anhydrid mit Isobutylchlorcarbonat mit H-Gln-Thr(tBu)-Ala-Ile-GIy-OH-HCl(hergestellt durch Kondensation von H-IIe-GIy-OMe mit Z-AIa-ONP in Dimethylformamid, Hydrierung des erhaltenen geschützten Tripeptidmethylesters in Methanol mit Palladiumkohle. Kondensation des so erhaltenen H-Ala-Ile-GIy-OMe mit Z-Thr(tBu)-OSU in Dimethylformamid, Hydrierung der Carbobenzoxyverbiiid'ung in Methanol mit Palladiumkohle zu H-Thr(tBu)-Ala-Ile-Gly-OMc, Verseifung des Esters in Methanol mit 1-n. Natronlauge, Kondensation des so erhaltenen H-Thr(tBu)-Ala-Ile-Gly-

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OH mit Z-GIn-ONP in Dimethylformamid und Hydrierung von Z-Gln-ThrCtBu)-AIa-IIe-GIy-OH in salzsaurcm 80#igem . wässrigen Methanol in Gegenwart von PalladiurnkohleV zu Z-Thr(tBu)-Tyr(tDu)-Pro-Gln-Thr(tBu)-Ala-Ile-Gly-OH kondensiert. Durch katalytische Hydrierung in 80$igcr Essigsäure wird die Carbobenz oxy gruppe entfernt und das so erhaltene partiell geschützte Octapeptid in 90$iß^em Dimethylformamid mit einer frisch zubereiteten Lösung von Z--Asn-Lys(BOC) -Phe-His-N, in Dimethylformamid (hergestellt durch Kondensation von Z-Lys(DOC)-ONP mit H-Phe-OMe in Dimethylformamid, Umsetzung des Z-Lys(-BOC) -Phe-OMe mit Hydrazinhydrat zu Hydrazid, Ueberführung des Hydrazids in das Azid mit tort.-Butylnitr.it und Kondensation mit H-His-OMe, Hydrierung des erhaltenen Z-Lys(BOC)-Phe-His-OMe in Methanol mit' Palladiumkohle,, Kondensation des erhaltenen H-Lys(BOC)-Phe-His-OMe mit Z-Asn-ONP in Dimethylformamid, Ueberführung des Z-Asn-Lys(BOG)-Phe-His-OMe in das Hydrazid mit Hydrazinhydrat in Methanol und Umsetzung des Hydrazids in Dimethyl formamid mit Natriumnitrit und Salzsäure zum.Azid ) zum Dodecapeptid Z-Asn-Lys(BOG)-Phe-His-Thr(UBu)-Tyr(tBu)-Pro-Gln-Thr(tBu)-Ala-Ile-Gly-OH urngesetzt. Nach katalytischer Hydrierung in. 80-''iger Essigsäure wird dieses in Dirnethylformamidlösung mit Z-Thr(tDu) -Tyr (tBu) -Thr(tBu) -Gln-Asp(OtBu) Phc-N, (hergestcl.lt durch Kondensation von Z-Asp(OtBu) -ONP

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mit H-Phe-OMe in Dimethylformamid., Hydrierung des Z-Asp(otBu)-Phe-OMe in Methanol unter Zusatz von Chlorwasserstoff in Dioxan und in Gegenwart von Palladiumkohle., Kondensation des erhaltenen H-Asp(OtBu)-Phe-OMe, HCl mit Z-GIn-ONP in Dimethylformamid und Triäthylamin, Hydrierung des Z-Gln-Asp(OtBu)-Phe-OMe in Methanol unter Zusatz von Chlorwasserstoff in Dioxan und in Gegenwart von Palladiumkohle., Kondensation des erhaltenen H-GIn-Asp(OtBu)-Phe-OMe in Methylenchlorid mit Z-Thr(tBu)-OH in Gegenwart von Dieyclohexylcarbodiimid, Hydrierung des Z-Thr(tBu)-Gln-Asp(OtBu)-Phe-OMe in Methanol mit P-alladiumkohle, Kondensation des H-Thr(tBu)-Gln-Asp(OtBu)-Phe-OMe mit Z-Tyr(tBu)-OH in Acetonitril in Gegenwart von Dicyelohexylcarbodiimid., Hydrierung des Z-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Gln-Asp(otBu)-Phe-OMe in Dimethylformamid in Gegenwart von Palladiumkohle, Kondensation des H-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Gln-Asp(QtBu)-Phe-OMe in Acetonitril mit Z-Thr(tBu)-OH in Gegenwart von Dicyclohexylcarbodümid, Ueberführung ' des erhaltenen Z-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Gln-Asp(OtBu)-Phe-OMe in das Hydrazid mit Hydrazinhydrat in Methanol und Umsetzung des Ilydrazids in Dimethylformamid mit Natriumnitrit und 'J)-Vl. Salzsäure zum Azid) kondensiert und das entstandene Z-Thr(tBu) -Tyr (tBu) -Thr (tBu) -GIn-A^p(OtBu) -Phe-Ann-Lys(BOC)-Phe-IIiß-Thr (tßu) -Tyr(tBu) -Pro-Gln-Thr (tBu) -Ala-Ile-GIy-OH

1.0 9819/2249

mittels Dicyclohexyl-carbodiimid und N-Hydroxysuceiniraid in Dimethylformamid mit H-VaI-Gly-Ala-Pro-NH₂ (hergestellt durch Kondensation von H-Pro-NH_p mit Z-AIa-ONP in Dimethyl- ' formamid, Hydrierung des erhaltenen Z-Ala-Pro-NEL in salz-. saurem wässrigen Aethanol in Gegenwart von Palladiumkohle, Kondensation mit Z-GIy-ONP in Dimethylformamid, Hydrierung de.s erhaltenen Z-Gly-Ala-Pro-NHp in Dimethylformamid in. Gegenwart von Palladiumkohle, Kondensation von H-Gly-Ala-Pro-NIL· mit Z-VaI-ONP in Dimethylformamid und Hydrierung des Z-VaI-Gly-Ala-Pro-NHp in 8o#igem Methanol in Gegenwart von Palladiumkohle) zum vollständig geschützten Docosapeptidamid umgesetzt. Diese Verbindung wird mit Hilfe einer.Craig-Verteilung im Lösungsmittelsystem Methanol-Puffer-Chloroförm-Tetrachlorkohlenstoff (lO:3:5'6) gereinigt und anschliessend in So^iger Essigsäure hydriert. Durch Lösen in Methanol und Eintropfen in eine 0,1-n. wässerige Sodalösung erhält man die acetatfreie Form, die mittels Dicyclohexylcarbodiimid und N-Hydroxysuccin-

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imid mit BOC-Cys-Gly-Asn-Leu-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Cys-Met-Leu-GIy-OH zum vollständig geschützten Dotriacontapeptidarnid kondensiert wird. Diese Verbindung wird in einer Craig-Verteilung im System Methanol-Puffer-Chloroform-Tetrachlorkohlenstoff (11:3:6:7) gereinigt.

Vorteilhaft stellt man das geschützte Docosapeptidamid wie folgt her :

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1. Z-Ty^tBu)-PrO-OH

12.95 g Z-Tyr(tBu)-OH werden.in I30 ml absolutem Tetrahydrofuran gelöst., 3/86" ml N-Methylmorpholin zugegeben, die Lösung auf -22° gekühlt und innert 4 Minuten 4,79 ^ml Chlorameisensaureisobutylester zugetropft. Die erhaltene, trübe Lösung wird 30 Minuten bei -10 gerührt, ansehliessend auf -30. gekühlt, eine Lösung von 6,03 g Prolin in 110 ml 80$igem Dimethylformamid zugegeben und a

die erhaltene, klare Losung 30. Minuten bei -10 , 2 Stunden bei 0 sowie I3 Stunden bei Raumtemperatur stehen gelassen. Die klare, gelbe Lösung wird eingedampft, das dunkelgelbe OeI in Essigester .gelöst und viermal mit verdünnter, wässriger Zitronensäurelösung sowie mit Wasser gewaschen, bis das Waschwasser neutral reagiert. Die Essigesterphase wird über Natriumsulfat getrocknet. Der entstandene weisse Schaum zeigt im Dünnschichtehromatogramm auf Silicagel folgende Rf-Werte II5 = 0,78, Rf 45 = 0,40 uiid Rf 43 C = 0,37. i

2. H-Tyr(tBu)-Pro-OH

U.»75 g Z-Tyr(tBu)-Pro-OH werden in II8 ml Methanol gelöst und unter Zusatz.von 2,35 g'Palladiumkohle (10$ Pd) mit Wasserstoff bei Raumtemperatur hydriert. Nach Beendigung der Wasserstoffaufnahme wird filtriert, eingedampft und das erhaltene OeI soX'ort weiterverarbeitet..

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3. Z-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Pro-OH

Das unter 2. erhaltene OeI wird in 39 ml Dimethyl-

formamid gelöst, die klare Lösung im Eisbad gekühlt und 2,81 ml N-Methylmorpholin sowie 12,2 g festes Z-Thr(tBu) OSU zugegeben. Die erhaltene Lösung wird 23 Stunden bei Raumtemperatur stehen gelassen, eingedampft, das erhaltene

gelbbraune OeI in Essigester gelöst und dreimal mit verdünnter Zitronensäurelösung, dann mit Wasser gewaschen, bis das Waschwasser neutral reagiert. Nach dem Trocknen der Essigesterphase mittels Natriumsulfat wird eingedampft. Man erhält einen weissen Schaum, der einer Gegenstromverteilung nach Craig unterworfen wird: ΐβ,5 g des Produktes werden auf die ersten fünf Rohre eine,s Verteilungsapparates (Phasenvolumen je 20 ml) verteilt, wobei das Lösungsmittelsystem Methanol-Wasser-Chloroform-Tetrachlorkohlenstoff (4:1:1:3) Verwendung findet. Man verteilt multiplikativ über 836 Stufen ( r ^ = 128, K = 0,l8). Die erhaltenen, reinen Fraktionen (Verteilungselemente Nr. 120 - 135) werden am Wasserstrahlvakuum bei 40° Badtemperatur eingedampft und am Hochvakuum bei 40 getrocknet. P.: 9O~94 , [cc]„ = -23 ( c= 1 in Methanol). Im Dünnschiehtchromatogramm auf Silicagel ist· Rf₁₁C = 0,79; Rf₅₂ = 0,87.

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4. ■ H-Gln-Thr(tBu)-Ala-Ile-GIy-OMe

4,97 g Z-Gln-Thr(tBu)-Ala-Ile-GIy-OMe (vgl. BeIg. Patent 737 89O, Case 6548/1-6) werden in 107 ml 80$igem t-Butanol suspendiert und unter Zusatz von 1,0 g Palladiumkohle (10$ PD) mit Wasserstoff zunächst 2 Stunden bei Raumtemperatur, dann bei 40 bis zur beendeten Wasserstoffaufnahme hydriert. Dann wird filtriert, eingedampft, das gelbrote OeI in t-Butanol gelöst und lyophilisiert. Das erhaltene weisse Pulver zeigt einen Schmelzpunkt von 243-244°; im Dünnschichtehromatogramm auf Silicagel ist Rf₁₀₀ = 0,30 und Rf₁-τ_K = 0,44.

5. Z-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Pro-Gln-Thr(tBu)-Ala-Ile-Gly-OMe

4,94 g Z-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Pro-0H werden in 40 ml Dimethylformamid gelöst, 3,95 g H-GIn-Thr(tBu)-Ala-Ile-GIy-OMe sowie 1,07 g N-Hydroxysuceinimid zugegeben, die erhaltene Lösung im Eisbad auf 0 gekühlt und 2,07 S festes Dicyclohexylearbodiimid zugefügt. Man lässt die Lösung 15 Stunden bei Raumtemperatur stehen, filtriert vom ausgefallenen Dieyclohexylharnstoff ab, versetzt das Piltrat mit Wasser und filtriert den ausgefallenen Niederschlag ab. Derselbe wird mit Aether gewaschen und dann aus Methanol· Essigester-Petroläther umgefällt. Man erhält ein dünnschicht· Chromatographisch einheitliches Pulver vom F.: I87-I88⁰; im Dünnschichtohromatogramm auf Silicagel ist Rf₁₀₀ = 0,90; Rf₂^₅ ---- 0,78 und Rf₁₁₅ - 0,70.

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6. Z-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Pro-Gln-Thr(tBu)-Ala-Ile-Gly-OHxHgD

Man löst 6,43 S ^des unter 5· erhaltenen geschützten Oktapepidmethylesters in· 110 ml ewigem Methanol, tropft unter starkem Rühren, bei Raumtemperatur 16,53 ml 1-n. Natronlauge rasch zu und rührt dann noch 10 Minuten bei Raumtemperatur. Zu der Lösung fügt man 9² ml Wasser, filtriert und gibt das Piltrat zu 390 ml vorgelegter, mit Eis gekühlter 0,05-n. Salzsäure. Die Suspension wird 3 Stunden bei 0 gerührt, abfiltriert, und der Pi It er rückst and mit Wasser chloridfrei gewaschen. Man erhält ein dünnschicht chromatographisch einheitliches, weisses Pulver vom P.: 224-225°, [ct]p⁰= -54° ( c = 1 in Methanol).

Im Dünnschichtehromatogramm auf Silicagel ist Rf, =

0,67, Rf^ = 0,38 und Rf₁₁,- = 0,67.

7. H-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Pro-Gln-Thr(tBu)-Ala-Ile-GIy OH x CH COOH

Ij30 g des unter 6. beschriebenen Produktes werden in 40 ml 8o^iger Essigsäure gelöst und unter Zusatz von 75 mg Palladiumkohle (10$) mittels Wasserstoff bei Raumtemperatur hydriert. Man filtriert," engt das Piltrat auf die Hälfte ein, setzt Eisessig zu und lyophilisiert. Das Lyophilisat wird in 80$igem t-Butanol gelöst, nochmals lyophilisiert und am Hochvakuum bei 40 nachgetrocknet. Das erhaltene

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weisse Pulver zeigt im Dünnschichtchromatogramm folgende Rf-Werte:

Rf₇₀ = 0,37 J , ■

Rf₁₀₀ = 0,21 ;

im System Isopropanol-konz. Ammoniak (9^;l) Rf = 0,36.

8. Z-Asn-Lys(BOC)-Phe-His-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Pro-GIn-Thr (tBu)-Ala-Ile-GIy-OH.

1,3^ g Z-Asn-Lys(BOC)-Phe-His-NHNH₂ (vgl. BeIg. Patent 737 890) werden in 6,2 ml Dimethylformamid gelöst, die Lösung auf -20° gekühlt und 1,40 ml 3,0-n. HCl in Dioxan sowie 0,252 ml t-Butylnitrit zugegeben. Die Lösung wird 15 Minuten bei -15° stehen gelassen, 0,724 ml N-Aethyldiisopropylamin zugegeben, dann auf -20 gekühlt und eine Lösung von 1,12 g H-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Pro-Gln-Thr(tBu)-Ala-Ile-GIy-OH in 24 ml Dimethylformamid zugegeben. Man lässt die Lösung l6 Stunden bei +5 stehen, dampft dann weitgehend ein und gibt Aether zu. Der ausgefallene Niederschlag wird zweimal mit Aether durchgeknetet. Das erhaltene Pulver wird abfiltriert, mit V/asser chloridfrei gewaschen, in 70$ig^em Acetonitril gelöst und durch Zusatz von 100$lgem Acetonitril wieder ausgefällt. Zur weiteren Reinigung wird es einer Gegenstromverteilung nach Craig unterworfen. Dazu x^erden 1,72 des Pro-

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duktes auf die ersten drei Rohre eines Verteilungsapparates (Phasenvolumen je 10 ml).verteilt, wobei das Lösungsmittel- . •system Methanol-Puffer-Chloroform-Tetrachlorkohlenstoff 10:3:5:4 (Puffer : 28,6 ml Eisessig und 19,25 g Ammoniumacetat werden in 96O ml Wasser gelöst) Verwendung findet. Man'verteilt multiplikativ über 200 Stufen ( r = 1,90,

IHcI-X

K = 19). Aus den erhaltenen reinen Fraktionen (Verteilungselemente Nr. 174 - 2oo) wird das Ammoniumacetat am Hochvakuum bei 40 absublimiert. Man erhält das geschützte Docosapeptid. .

Im Dünnschichtchromatogramm auf Silicagel ist Rf_7n = 0,46, Rf₁₀₀ = 0,29 und im System Isopropanol-konz. Ammoniak (9:1) Rf = 0,32.

9. H-Asn-Lys(BOC)-Phe-His-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Pro-Gln-Thr(tBu)-

Ala-Ile-Gly-OH

93O mg des unter 8. erhaltenen Produktes werden in 110 ml 80$iger Essigsäure gelöst und unter Zusatz von 100 mg Palladiumkohle (10$ Pd) mittels Wasserstoff bei Raumtemperatur hydriert. Man filtriert, engt das Filtrat weitgehend ein, versetzt mit Eisessig und lyophilisiert. Das erhaltene Produkt wird in 70^igem t-Butanol gelöst, abermals lyophilisiert und am Hochvakuum bei 4o nachgetrocknet.

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10. Z-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Gln-Asp(OtBu)-Phe-Asn-Lys(BOC)-Phe-His-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Pro-Gln-Thr(tBu)-Ala-Ile-GIy-OH

770 mg Z-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Gln-Asp(OtBu)-Phe-■ NHNH (vgl. BeIg. Patent 737 890) werden in 3,2 ml Dimethylformamid gelöst, die leicht trübe Lösung auf -20 gekühlt und 588 μΐ 3,0-n. Salzsäure in Dioxan sowie 98 M-I t-Butylnitrit zugegeben. Man lässt die Lösung 15 Minuten bei -I5 stehen, gibt dann eine Lösung von 778 mg des unter 9· beschriebenen Produktes in 14 ml Dimethylformamid sowie 0,303 N-Aethyldiisopropylamin zu und rührt die erhaltene Lösung 5 1/2 Stunden unter Eiskühlung; während dieser Zeit werden 0,076 ml N-Aethyldiisopropylamin in sechs Portionen zugegeben. Die Lösung wird 15 Stunden bei +5 stehen gelassen, dann in Aether getropft, der erhaltene, weisse Niederschlag in Dirnethylformamid gelöst und zu auf 0 gekühlter 0,02-n. Salzsäure (welcher auf 100 ml Volumen 10 ml gesättigte Kochsalzlösung zugesetzt wird) getropft. Das dabei erhaltene Produkt wird in 80$igem Acetonitril gelöst und bei 50 mittels V/asser gefällt. Zur weiteren Reinigung wird das Produkt aus Dimethylformamid-Aether sowie Acetonitril-Wasser umgefällt.

Im Dünns chichtchromatogramm auf Silicagel ist Rf₁

100

0,50 und Rf₇ = 0,63.

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11.' Z-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Gln-Asp(OtBu)-Phe-Asn-Lys(BOC)-Phe-His-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Pro-Gln-Thr(tBu)-AIa-IIe-GIy-VaI-GIy-AIa-PrO-NH₂

Man löst 755 mg des unter 10. beschriebenen Produktes

in 8 ml Dimethylformamid., gibt zu der Lösung bei Raumtempera-• · ■

tür 139 mg H-Vai-GIy-AIa-PrO-NH₂ (vgl. BeIg. Patent 737 89Q), 47 mg N-Hydroxysuccinimid sowie 84 mg Dicyclohexylcarbodi- Ψ imid und rührt 18 Stunden bei 45°. Die Lösung wird ansehliessend in Aether getropft und das ausgefällte weisse Pulver einer Gegenstromverteilung nach Craig unterworfen: 844 mg des Docosapeptidamids werden auf die ersten fünf Rohre eines Verteilungsapparates" (Phasenvolumen je 3 ^ml) verteilt, wobei das Lösungsmittelsystem Methanol-Puffer-Chloroform-Tetrachlorkohlenstoff 10:3:5:6 (Puffer wie unter 8) Verwendung findet. Man verteilt multiplikativ übe.r 400

»Stufen (r · = I33, K = 0,5). Aus den erhaltenen reinen Frak-ΙΠ3.Χ

tionen wird das Ammoniumacetat am Hochvakuum bei 40 absublimiert; das reine geschützte Docosapeptidamid weist im Dünnschichtehromatogramm auf Silicagel Rf_{1 ΛΛ} = 0,46 auf.

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12. H-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Gln-Asp(OtBu)-Phe-Äsn-Lys(BOC) -Phe -Hi s -Thr (tBu) -Tyr (tBu) -Pro -GIn-Thr(tBu)-AIa-IIe-GIy-VaI-GIy-AIa-PrO-NH₂

233 ^mg des unter 11. beschriebenen Produktes werden in 2h ml_% 80$iger Essigsäure gelöst und unter Zusatz von 40 rag Palladiumkohle (10$ Pd) mit Wasserstoff l8 Stunden bei Raumtemperatur hydriert. Dann wird filtriert* bis fast zur Trockne eingedampft, in Eisessig gelöst und lyophilisiert. Das erhaltene Lyophilisat wird in wenig Methanol gelöst, mit gesättigter Natriumhydrogenearbonatlösung auf einen pH-Wert zwischen 7 und 8 eingestellt und dann in eine 0',1-n. Natriumearbonatlösung eingetropft. Man erhält ein weisses Pulver, das im Dünnschichtehromatogramm auf SiIicagel Rf₁₀₀ = 0,34; Rf₇₀ = 0,67 und Rf _ψ = 0,57 zeigt.

13. BÖC-Cys-Gly-Asn-Leu-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Cys-Met-Leu-GIy-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Gln-Asp(OtBu)-Phe-Asn-Lys(BOC)-Phe-His-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Pro-Gln-Thr (tBu)-AIa-IIe-GIy-VaI-GIy-AIa-PrO-NH₂

171 mg des unter 12. beschriebenen Docosapeptidamids sowie 83*5 mg des geschützten Dekapeptides BOC-Cys-Gly-Asn-Leu-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Cys-Met-Leu-Gly-OH werden in I,l6 ml Dimethylformamid in der Wärme gelöst, dann bei Raumtemperatur mit 15*9 ^fflg festem N-Hydroxysuccinirnid und 21,4 mg Dicyclohexylcarbodiimid versetzt und 3 1/2 Stunden

10 9819/2249

bei 45° gerührt. Anschliessend wird die Lösung zu 23 ml peroxidfreiem Aether getropft und das als Niederschlag erhaltene, weisse Pulver zur Reinigung einer Gegenstromverteilung nach Craig unterworfen: 234 mg des Produktes werden auf die ersten vier Rohre eines Verteilungsapparates (Phasenvolumen je 3 ml) verteilt, wobei das Lösungsmittelsystem Methanol-Puffer-Chloroform-Tetrachlorkohlenstoff 11:3:6:7 (Puffer wie unter 8.) Verwendung findet. Man verteilt multiplikativ über insgesamt" 2βΟ Stufen (r = 60, K = 0,3)· Aus den. erhaltenen reinen Fraktionen wird das Ammoniumacetat am Hochvakuum bei 40 absublimiert; das geschützte Dotriacontapeptidamid zeigt im Dünnschichtchromatogramm auf Silicagel Rf _Q = 0,32 und Rf₁₀₀ =0,48.

Das BOC-Cys-GIy-Asn-Leu-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Cys-Met-Leu-GlyOH kann wie folgt hergestellt werden (vgl. BeIg. Patent 737 890 (Case .6548/1-6) :

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1. Z-Asn-

S K-Leu-OMe und W,0 g Z-Asn-ONP v/erden in 100 ml frisch destilliertem Dimethylformamid gelöst. Die Lösung wird 19 Stunden bei 25 stehen gelassen. Hierauf gibt · man 1,2 Liter Wasser zu und nutscht die kristalline Fällung ab, Das Dipeptidderivat wird bei kö im Vakuum getrocknet und dann zweimal aus'Methanol-Wasser umkristallisiert. ⁰; [al⁰ +9°

F. 18O-I81⁰; [alß⁰= +9° (c = 2,05 in Chloroform).

2. H-Äsn-Leu'-OMe " ·

15,0 g Z-Asn-Leu-OMe werden in' 400 ml t-Butanol-Wasser (9:1) gelöst und in Gegenwart von 2 g Palladium-Kohle (lO^ Pd) hydriert. Nach Beendigung der Hydrierung wird vom Katalysator abgenutscht und bei 40° eingedampft. Der Rückstand wird direkt weiter.*verwendet.

3. Z~Gly--Asn-Leu-OMe

hjh rnMol H-Asn-Leu-OMe werden in 15 ml Dimethylformamid

gelöst und dann 5,5 rnMol Z-GIy~p-Nitrophenylester zugegeben.

Die klare, gelbe Lösung wird l8 Stunden bei 27 belassen..

Dann wird im Hochvakuum bei ¹IQ⁰ eingedampft, getrocknet und der Rückstand -mit Essigester versetzt, wobei er kristallisiert. Nach 1 Stunde bei 0° wird abgenutscht und getrocknet. Dann wird das Produkt nochmals in 25 ml Essigester · suspendiert, zerrieben, abgenutscht und getrocknet; F. 159 ·

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4. H -GIy -A sn -Leu -OMe

2,0 g Z-GIy-Asn-Leu-OMe werden unter Erwärmen in 20 ml Methanol gelöst und mit 200 mg P'alladiumkohle (lOJo Pd) bis zur Beendigung der Wasserstoffaufnahme hydriert. Der Katalysator wird abfiltriert und das Filtrat bei ^iO Bädtemperatur zur Trockene eingeengt, wobei der Tripeptidmethylester direkt in kristalliner, reiner Form '(1,34 g; P. I38-I39⁰) erhalten wird.

_K B0G-Cys-(TRl)-Gly-Asn-Leu-0Me

D· —■ .

5,7 g H-Gly-Asn-Leu-OMe, 9,2 g BOG-Cys(TRl)^0H und

4,16 g N-Hydroxysuceinimid werden in 200 ml Dimethylformamid· gelöst, auf 0° gekühlt und unter Rühren mit 5,57 S Dicyclohexylcarbodiimid in fester Form-versetzt. Man rührt noch während 1 Stunde bei 0°, lässt dann über Nacht bei ca. 20° stehen, engt im Hochvakuum auf ein Volumen

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von ca." 100 ml ein und filtriert den ausgeschiedenen " Dicyclohexylharnstoff ab. Das Piltrat wird sodann in Hochvakuum bis zur Bildung einer klebrigen Masse weiter eingeengt, in 200 ml n-Butanol gelöst und nacheinander mit Wasser, 5^>iger Weinsäurelösung ,1-n. Natriumbiearbonat, und wiederum mit Wasser gewaschen. Die Lösung wird nun auf ein Volumen von ca. 50 ml konzentriert, und .daraus das Tetrapeptid-derivat durch Zugabe von 3^{00 113}I Petrolather ausgefällt. Man reinigt durch Umfallen aus Dimethylformamid-Wasser und aus Methanol-Essigester-Petroläther und erhält · so das Tetrapeptidderivtit als amorphes Pulver vom Schmelzpunkt 1^5-1^8°. Es weist im Dünn schicht ehr omatogramm. auf Silicagel die folgenden R_f-Werte auf: . -

Rf 115 = 0,68; Rf (Aceton) = 0,59; Rf (Chloroform-Methanol 8:2} =.0,60.

6. BOC-CyS-(TRI)-GIy-ASn-LeU-NHNH₂

.2,7 g BOC-Cys(TRI)-GIy-Asn-Leu-OMe werden in 22 ml Methanol gelöst, auf 0 gekühlt und mit 2,2 ml Hydrazinhydrat versetzt. Nach ca. ~$Q Minuten bei 0 lässt man die Lösung über Nacht bei ca. 20 stehen, kühlt wieder auf 0° ab und versetzt dann mit 102 ml 3^ig^er eiskalter Essigsäure. Die Fällung v/ird gut homogenisiert, abfiltriert und auf der Nutsche mit eiskalter, ~5?oiger Essigsäure bis zur Folin-negativen Reaktion der Waschflüssigkeit gewaschen

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und anschliessend getrocknet. Man erhält 2,2 g chromatographisch reines Tetrapeptid-hydrazid vom Zersetzungspunkt ' ca. 195 · Es weist, im Dünnschichtchromatogramm auf Silicagel . folgende Rf-Werte auf: Rf (Chloroform-Methanol 8:2) =0,30; Rf (Aceton-Methanol 9:1) = 0,53.

7·. BOC-Met-Leu-Gly-OMe

6,72 g Z-Leu-GIy-OMe werden in 50 ml Methanol mit 500 mg Palladiumkohie (10$ Pd) bis zur Beendigung der Wasser-

stoffaufnähme hydriert. Die Lösung wird vom Katalysator abfiltriert und im Vakuum auf ca. 10 ml eingeengt, mit

30 ml Dimethylformamid verdünnt und im Hochvakuum nochmals auf ca. 20 ml konzentriert. Dazu gibt man unter Eiskühlung Ί>Ί S BOC-Met-OCP, lässt die klare Lösung während 6 Stunden bei 20 stehen und verdampft das Lösungsmittel im Hochvakuum. Der ölige Rückstand wird in Essigester gelöst und nacheinander bei 0 mit 5i^iger Pottaschelösung, P 0,2-n. Salzsäure und schliesslich mit Wasser gewaschen^ die organische Phase über Natriumsulfat getrocknet und zur Trockene eingeengt. Der ölige Rückstand wird aus Benzol-Petroläther kristallisiert; P. 126-127°; auf Silicagel ist Rf 43 C = 0,66; Rf (Toluol-Aceton l:l) = 0,58.

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_ 57 -

8. H-Mot-Leu-GIy-OMe, Hydrochlorid

3,2²Kg BOC-Met-Leu-Gly-QMe werden in 13 ml 3,8-n-Chlorwasserstoff in Essigester gelöst und während 30 Hinuten bei 20° stehen gelassen. Durch Zugabe von 100 ml Petroläther Vfird das Tripeptidesterhydrochlorid als klebrige Masse ausgefällt und die überstehende Lösung abdekantiert. Durch Zerreiben mit 100 ml peroxidfreiem Aether bei 0° wird ein feinpulveriges Produkt erhalten, das abfiltriert und über Kaliumhydroxid bei Zimmertemperatur im Sxsikkator bis zur Gewi ent s>ons tanz getrocknet wird. Die Verbindung ist' chromatographisch rein, jedoch amorph und stark hygroskopisch. Sie weist auf Silicagel die folgenden Rf-Werte auf: , Rf43Q = 0,48; Rf (Toluol-Aceton l:l) = 0,35. ■

9. TRI-Cys(TRI)-Met-Leu-GIy-OMe ' ■ '

3,22 g TRI-Cys(TRI)-OH, 1,97 g H-Met-Leu-Gly-OMe- " Hydrochlorid und 0,7^ ml Triäthylamin werden in 32 ml Acetonitril gelöst und 1,5¹I- S Dicyclohexylcarbodiirnid wird in fester Form zugegeben. Die vorerst klare Lösung, aus der 'sich Dicyclohexylharnstoff ausscheidet, wird während l6 Stunden bei 20° stehen gelassen. Man kühlt alsdann auf 0°, gibt 100 ml Wasser zu, homogenisiert und filtriert die weisse Fällung ab. Sie wird mit Wasser gewaschen, getrocknet und dann während 5 Minuten bei 40° mit 50 ml Essigester

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fein zerrieben. Der unlösliche Dicyclohexylharnstoff wird bei Zimmertemperatur abfiltriert und mit 20 ml Essigester gewaschen. Aus dem Piltrat wird das Tetrapeptidderivat durch Zugabe von 3^0 ^ml Petroläther als gallertiger Niederschlag ausgefällt, abfiltriert und'getrocknet. Beim Umfallen dieses Rohproduktes aus Methanol-Essigester-Petroläther erhält man ein chromatographisch einheitliches Produkt vom P. ca. 215°. Auf Silicagel weist es folgende RT-Werte auf: P im System: CHCl -Methanol (97:3) Rf= 0,57;

in n-Butylacetat Rf = 0,51.' '

10. H-Cys(-TR'])-Met-Leu-Gly~0Me, Acetat · ' ■

Zu einer Lösung von 1,862 g TRI-Cys (TRl)-Met-Leu-Gly-OMe in ΐβ ml Eisessig werden Λ ml V/asser so zugetropft., dass sich der gebildete Niederschlag jeweils wieder löst. Die klare Lösung wird eine Stunde bei Raumtemperatur gerührt und dann bei 0° mit 12 ml Wasser versetzt, filtriert und der Niederschlag mit kalter 50$iger Essigsäure gewaschen. Das. Piltrat wird am Hochvakuum bei 30 zu einem OeI ein- ■ gedampft, dieses mit V/asser verrieben und lyophilisiert. Das erhaltene weisse Pulver wird 15 Stunden über Kaliurahydrqxid am Hochvakuum getrocknet. Das Produkt erweist sich im Dünnschichtchromatogramra an Silicagel als einheitlich. In Toluol-Aceton (7:3) Rf =0,28, in Chloroform-Methanol (95:5) Rf = 0,48.

109011/2141 * '

11. H-Thr (tBu)-OMe- ■

12,92 g (40 mMol) Z-Thr(tBu)-OMe werden in 200 ml· Bisessig und 3 g Pd-Kohle (l0$) bei Zimmertemperatur hydriert. Die Aufnahme von Wasserstoff ist nach einer Stunde beendet. Die Lösung wird vom Katalysator abfiltriert und am Wasserstrahlvakuum bei 35° eingedampft. Nach dem Trocknen am Hochvakuum bei 35° resultieren 7,3 g eines OeIs, das gemäss Dünnschichtchromatogramm einheitlich ist und direkt vielter verwendet wird. "

; DPC-Ser(tBu)-Thr(tBuy-OMe

19*3 S (38,6 mMol) DPC-Ser(tBu)~OH, Cyelohexylaminsalz werden in 500 ral Chloroform aufgenommen ynd bei 0° dreimal mit 25 ml 1-n. Zitronensäure und fünfmal mit h0 ml halbgesättigter Kochsalzlösung ausgeschüttelt. Nach dem Trocknen der Lösung über Natriumsulfat wird eingedampft und der erhaltene Schaum in 250 ml Essigester aufgenommen. Man gibt 5,36 ml (38,6 mMol) Triäthylamin zu, kühlt die; Lösung auf -10° ab und versetzt unter Rühren mit 5,13 ml (38,6 mMol) Isobutylchlorocarbonat. Es wird 10 Minuten bei -10 gerührt und dann die auf -12° gekühlte Lösung von 7,3 S (38,6 mMol) H-Thr(tBu)-OMe in 100 ml Essigester so zugetropft, dass die Reaktionstemperatur -10° nie

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tibersteigt. Näe% 4Äendet.em Eintragen wird noch eine Stunde· t>ei -10 gerührt und dann über Macht' bei Zimmertemperatur stehen gelassen.: Die Lösung wird vom ausgeschiedenen Triäthylamin-Hydrochlorid abfiltriert und bei. 0° dreimal mit je 20 ml 1-n. Zitronensäure und fünfmal mit gesättigter Kochsalzlösung gewaschen,, getrocknet und eingedänjpft. Rohprodukt (Oel): 22,07 δ· Zur Reinigung wird 1 g an einer Silicagelsäule (2,5 cm, ~*>0 cm) chromatographiert. Mit Petroläther-Essigester (l:l) werden nach einem Vorlauf von 110 ml 787 nig reines. Produkt eluiert,« Im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel in Toluol-Aceton (7:3) ΐώ Rf = 0,51.

13. pPC-Ser(tBu)-Thr(tBu)-NH-UH₀

²^253 g (7,4 mMol) DPG-Ser(tBu)-Thr(tBu)-0Me in l8 ml· Methanol werden mit 5j55 ml (ea. 110 mMol) Hydrazinhydrat ψ versetzt und 10 Stunden bei Zimmertemperatur und 2 Stunden bei Λθ stehen gelassen. Die Reaktionslösung wird in 45Ο ml Essigester aufgenommen und' viermal mit halbgesättigter Kochsalzlösung gewaschen. Nach dom Trocknen der Lösung über Natriumsulfat wird auf ca. 15 ml eingeengt und mit

ca. 5 ^ml Petroläther versetzt. Ueber' Nacht kristallisieren

3,17 g des Hydrazi&s vom Ψ. O2-13^° aps. Im ©ünnschiöhtchromatogramii an Siliea^el in Toluol-Ajc-eton

- 6i -

¹^* DPC-SerCtBu)-Thr(tBu)-Cys(TRl)-Met-LeU-GIy-OMe

2,28:4 g DPG-Ser (tBu).-Thr CtBu)-NH-NH₂-in 15 ml Dimethylformamid werden bei -20 mit 6,5 ml l>53-n. Chlorwasserstoff in Essigester und 0,51 ml" t-Butylnitrit versetzt und 15 Minuten bei -10 gerührt. Nach Zugabe von 1,4 ml Triäthylamin wird die auf -10° gekühlte Lösung von 1,406 g H-CysCTRl)-Met-Leu-GIy-OMe-Acetat in 10 ml Dimethylformamid zugetropft. Das pH der Reaktionslösung beträgt^ dann ^-5· Durch Zugabe von 2 Tropfen Triäthylamin in Dimethylformamid [2,8 ml Triäthylamin mit Dimethylformamid auf 10 ml aufgefüllt] wird das pH 7-8 eingestellt. Nach 5j 10 und 20 Minuten wird mit je 2 Tropfen Triäthylaminlösung das pH wieder auf 7-8 erhöht.'Nachher ' · bleibt dieser Wert konstant. Die Reaktionslösung wird, eine Stunde bei -10° und 15 Stunden bei 0° gehalten. Dann wird vom ausgeschiedenen Triäthylaminhydrochlorid abfiltriert und das Filtrat bei 30° am Hochvakuum zu einem OeI eingedampft. Durch Zerreiben mit V/asser erhält man ein Pulver, das mit V/asser gewaschen und dann mit Wasser zerrieben und lyophilisiert wird. Durch zweimaliges Zerreiben mit ·. 10 ml Benzol-Petroläther (l:2) wird das Hexapeptidderivat rein erhalten. Im Dünnschientchromatogramrn an Silicagel in Toluol-Aceton (7:3) ist Rf = 0,42.

Ί098 19/2249

-62 - 2Q50434

15- H-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Cys(TRl)-Met-Leu-Gly-OMe

2 g DPC-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Cys(TRI)-Met-Leu-Gly-OMe werden bei 45 in 40 ml 80?oigern Eisessig* gelöst und anschliessend während Ϊ Stunde bei 45 stehen gelassen. Man engt sodann im Vakuum auf ein Volumen von ca. 10 ml ein¹ und lyophilisiert. Der Rückstand wird zur vollständigen Entfernung von Essigsäure in 15 ml tert. Butanol und 1,5 nil Wasser gelöst und nochmals lyophilisiert. Man erhält einen· pulverigen Rückstand, der in 5 ml Methanol und 20 ml'Essigester gelöst und durch Zugabe von I50 ml Petroläther.wieder gefällt wird. Mach kurzem Stehenlassen bei 0. wird abfiltriert, mit Petroläther gewaschen und getrocknet. Man erhält ein amorphes Pulver vom P. ΐδΟ, das nur noch Spuren von 2-(p-Biphenylyl)-propanol(-2) als einzige Verunreinigung enthält. Das Hexapeptid wird in dieser Form zur Weiterverarbeitung verwendet. Es weist im Dünnschicht-· chromatogramm auf Silicagel die folgenden R -Werte auf: in Chloroform-Aceton (l:l) R.f - 0,48 ; in Chloroform-Methanol (9:l) Rf = 0,54- J in Toluol-Aceton (l:l) Rf= 0,49·

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16. H-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Cys(TRl)-Met-Leu-GIy-OH 1,4 g'Hexapeptid -methylester werden bei 45 in ΐβ ml cjO^igern Methanol gelöst, auf 20° abgekühlt (wobei das Peptid teilweise wieder ausfällt) und mit 4,32 ml 1-n. Natronlauge versetzt. Man rührt die Suspension während 25 Minuten bei 22° (nach ca. 15 Minuten ist.alles klar gelöst) und fällt dann das Hexapeptid durch Zugabe von 4,32 ml 1-n. Salzsäure und 30 ml V/asser als feinflockigen Niederschlag aus. Man lässt noch während I5 Minuten bei 0 ' stehen, filtriert, und wäscht mit Wasser, bis das Filtrafc frei von Chloridionen ist. Nach Trocknen über Kaliumhydroxid und Phosphorpentoxid erhält man 1,3 S Rohprodukt, das zur Reinigung während 5 Minuten bei 80 mit einer Mischung von 25 ml Dimethylformamid und 60 ml Benzol homogenisiert und durch Zugabe von 120 ml Petroläther gefällt wird. Nach 10 niinütigem Stehenlassen bei 0 wird abfiltriert, mit Benzol und Petroläther gewaschen und t

getrocknet. Das so erhaltene,'chromatographisch" reine Hexapeptidderivat weist einen Zersetzungspunkt von ca. 210° auf und ist in vielen Lösungsmitteln sehr schwer löslich. Bei" der Dünnschichtchromatographie auf Silicagel ist IT 45 = 0,39 , . ·

. Ri52 = 0,77 . · .

RfIOO,= 0,47.

103*10/224«

17. BOC-Cys(TRI) -Gly-Asn-Leu-Ser (tBu) -Thr(tBu) -Cys(TRl) -

■Met-Leu-G Iy-OH .

1,04 s-BOC-CyS₁(TRI)-GIy-AsIt-LeU-NH-NH₂ werden in 8 ml· absolutem Dimethylformamid gelost, auf -25 gekühlt und dazu langsam 0,92 ml 3,6-n. Salzsäure in Dioxan zügetropft, dann 0,179 ml tert. Butylnitrit. Diese Mischung wird während 15 Minuten bei -10°'gerührt, auf -15° abgekühlt und in eine auf -15° gekühlte Lösung von 878 mg H-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Cys(TRI)-Met-Leu-Gly-ÖH und 0,588 ml Triethylamin in 12-ml' absolutem Dimethylformamid hinein pipettiert. Man rührt ^<vwährend ca. 10 Minuten bei -10 und während 3 Stunden bei 0 . Zur Aufrechterhaltung einer schwach basischen Reaktion" (pH ca. 8) gibt man anfänglich noch 2 MaI_- je 0,065 ml Triäthylamin zu. Die Mischung wird v/ährend 15 ^tunden bei 0 stehen gelassen und dann im Hochvakuum bis zur breiartigen Konsistenz eingeengt. Durch Zugabe von 50 ml Methanol wird das Decapeptidderivat ausgefällt. Man erwärmt die Suspension 5 Minuten auf 40 , lässt 10 Minuten bei 0° stehen, filtriert ab und wäscht den Niederschlag mit 20 ml Methanol. Man erhält beim Trocknen im Hochvakuum über Kaliurnhydroxid und Phosphorpentbxid reines Decapeptidderivat von unscharfem Zersetzungspunkt bei ca. 220-2j$0 . Es weist im Dünnschichtchrornatogramm auf Silicagel die folgenden Rf-Werte auf:

1098 19/2249

im System Chlorof orm-Metb anol (S:.?) ^R£ - 0.28;

¹¹ " 70 Rf = 0,55;

" . " 10* Rf = 0,75 J

" " 121 Λ Rf= 0,59·

18. BOC-Cys-GIy-Asn-Leu~Ser(tBu)-Thr(tBu)-Cys-Met-Leu-GIy-OH

1,7 g BOC^ystTRI^ly-Asn-Leu-SeritBu^ThrttBu Met-Leu-Gly-OH werden in I70 ml heissem Dimethylformamid gelöst und nach dem Abkühlen auf Raumtemperatur im Verlauf von 1 Stunde zu einer intensiv gerührten Lösung von 2,5 g Jod in 500 ml Methanol getropft. Anschliessend rührt man noch eine weitere Stunde'und entfärbt dann die auf 0 gekühlte Lösung mit 1-n. Natriurnthiosulfat fast vollständig. Nach Einengen der Lösung im Vakuum, zuletzt im Hochvakuum bei *0°, auf ca. 100 ml fällt man mit Aether vollständig aus, wobei das ausfallende OeI rasch erstarrt . Mach Abgiessen der. Aetherlösung wird der Rückstand kurz im Vakuum getrocknet und dann mit Wasser zerrieben. Das ausgefallene Dekapeptidderivat wird abgenutscht, mit Viasser gewaschen und getrocknet. Zur Reinigung wird in 25 ml Chloroform gelöst, wenig unlöslichen'Material abfiltriert, das Filtrat auf etwa die Hälfte eingeengt und mit Hexan ausgefällt. Man erhält das reine Dekapeptidderivat, das im Dünrischichtchromatogramm auf Silicagel FT,100 = 0,^8 und 1^5 = 0,30 zeigt.

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Beispiel 2 :

H-Cys-Gly-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Met-Leu-Gly-Thr-Leu-Thr-Gln-Asp-Leu-Asn-Lys-Leu-His-Thr-Phe-Pro-Gln-Thr~Ala-Ile-GIy-Val-Gly-Ala-Pro-NH₂, Leu¹²'¹ '¹⁹-Calcitonin M

50 mg. BOC-Cys-Gly-Asn-Leu-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Cys-Met-Leu-GIy-Thr(tBu)-Leü-Thr(tBu)-Gln-Asp(OtBu)-Leu-Asn-Lys(BOC)- Leu-His-Thr(tBu)-Phe-Pro-Gln-Thr(tBu)-Ala-lie-GIy-VaI-GIy-Ala-Pro■

NHp werden bei 0 in 1,2 ml konzentrierter Salzsäure gelöst, mit Stickstoff bespült und während 10 Minuten bei 0 stehen gelassen. Die Aufarbeitung der Lösung erfolgt in gleicher V/eise wie in Beispiel 1 beschrieben. Das so erhaltene Produkt (Acetat von Leu ^{J 3} . -Calcitonih M) wird durch Stehenlassenim offenen Gefäss mit Luftfeuchtigkeit äquilibriert und ist ein amorphes, weisses Pulver. In der Dünnschichtchromatographie auf Aluminiumoxyd "Alox" D-O weist es die folgenden Rf-Werte . auf: Rf₅₂ =-0,39, Rf₇₉ = 0,48.

In der Elektrophorese auf Cellulose-Dünnschichtplatten ("Avicel" Pertigplatten l44O) läuft es bei pH 1,9 und l6 Volt/cm in 1 /2 Stunden. 3*7 cm zur Kathode.

Das geschützte Dotriacontapeptid wird z.B. auf folgende Weise hergestellt:

a) Ausgehend von H-Leu-OMe wird das Ilexapeptidderivat Z-Thr (tBu)-Leu-Thr(tBu)-Gln-Asp(OtBu)-LeU-OMe in stufenweiaem Aufbau synthetisiert, unter Verwendung der folgenden Reihenfolge von aktivierten Estern:

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Z-ASp(OtBu)-ONPj Z-GIn-ONP., Z-Thr(tBu)~0SU, Z-Leü-ONP, Z-Thr(tBu)-OSU. Die Kondensationen werden in Dimethylformamidlösung vorgenommen, die katalyt. Hydrierungen - mit Ausnähme von -Z-As-p (OtBu)-Le u-OMe wo 1 Aequivalent HCl zugefügt wird - in neutraler, methanolischer Lösung. Zuletzt .wird die C-terminale Methylestergruppe mittels Hydrazinhydrat 'in methanolischer Lösung ins Hydrazid übergeführt.-b) Durch Kondensation von Z-Lys(BOC)-Leu-N- mit H-His-OMe in Tetrahydrofuran erhält man Z-Lys(BOC)-Leu-His-OMe, das in methanolischer Lösung hydriert und ausschliessend in Dimethylformamid mit Z-Asn-ONP zum- Tetrapeptrd Z-Asn-Lys(BOC)-Leu-His-OMe umgesetzt wird. Dieses wird wie üblich ins Hydrazid übergeführt, welches wiederum nach der Azidmethode mit H-Thr(tBu)-Phe-Pro-Gln-Thr(tBu)-Ala-Ile-Gly-OH - CH COOH (hergestellt durch Kondensation von - ' '

Z-Thr(tBu)-Phe-Pro-OH, das man aus Z-Thr (tBu) OSU und H-Phe-Pro-OH in Dimethylformamid erhält, mit H-Gln-Thr(tBu)-Ala-Ile-Gly-OMe, HCl in Dimethylformamid in Gegenwart von Dicyclohexylcarbodiimid und N-Hydroxysuccinimid/ Verseifung des Esters in 90/^igem Methanol mit 1-n. !Natronlauge und Hydrierung des Z-Thr(tBu)-Phe-Pro-Gln-Thr(tBu)-Ala-Ile-Gly-

O- ,

OH in SO^iger Essigsäure in Gegenwart von Palladiumkohle) in 9Q^igem Dimethylformamid zum podecapeptid kondensiert wird. Das so erhaltene Z-Asn-Lys(BOC)-Leu-His-Thr(.tBu)-Phe-Pro-GIn-Thr(tBu)-Ala-Ile-GIy-OH wird in 80Joigem Essigsäure hydriert

109819/2249 " .

und dann mit einer frisch zubereiteten Lösung von Z-Thr(tBu)-Leu-Thr(tBu)-Gln-Asp(OtBu)-Leu-N^ in Dimethylformamid kondensiert, Das entstandene Octadecapeptid wird mittels Dicyclohexylcarbodiimid und N-Hydroxysuccinirnid in Dimethylformamid mit H-VaI-GIy-AIa-Pro-NHp kondensiert, das rohe Docosapeptidamid in einer Craig-Verteilung im Lösungsrnittelsystem Methanol-Puffer-Chloroform-Tetrachlorkohlenstoff (10:4:5:6) gereinigt und anschliessend in SO^iger Essigsäure hydriert. Durch Lösen in Methanol und Eintropfen in eine 0,1-n. wässerige Sodalösung erhält man die acetatfreie Form,'die mittels Dicyclohexylcar-

bodiimid und N-Hydrcxysuccinimid mit BOC-Cys-Gly-Asn-Leu-Ser-(tBu)-Thr(tBu)-Cys-Met-Leu-Gly-OH zum vollständig geschützten Dotriacontapeptidamid kondensiert wird. Dieses wird wiederum in einer Craig-Verteilung im System Methanol-Puffer-Chloroform-Tetrachlorkohlenstoff (11:4:6:7) gereinigt.

Im einzelnen verläuft die Synthese des Ausgangsmaterials über folgende Stufen: ' ·

:ii ; ".

-.69 -

1.. Z-Asp(OtBu)-LeU-OMe

^t97 g Z-Asp(OtBu)-ONP werden zusammen mit 2,54 g Leucinmethylester-hydrochlorid in 20 ml absolutem Dimethylformamid gelöst und unter Rühren bei Raumtemperatur innert 1 Stunde Ι,βΟ ml N-Methylmorpholin zugetropft. Die zitronengelbe Suspension wird 16 Stunden bei Raumtemperatur stehen gelassenj das ausgefallene N-Methylmorpholin-hydrochlorid abfiltriert und das Piltrat eingedampft. Das erhaltene OeI wird "in Essigester gelöst, ί dann bei 0 zweimal mit verdünnter, wässeriger Zitronensäurelösung, einmal mit verdünnter wässriger Natronlauge, sechsmal mit verdünnter wässriger Sodalösung und zuletzt mit Wasser so lange gewaschen, bis die Waschflüssigkeit neutral bleibt. Nach dem Trocknen über Natriumsulfat wird eingedampft und das erhaltene OeI aus Aether-Petroläther umkristallisiert;- F: 72 - 74°, Ed]^⁰ = -27° ( c = 1,9 in Methanol). Auf Silicagel betragen die Rf-Werte im Dünnschichtchromatogramm im System 43 A = 0,68, im System 89 = 0,75.

2. H-Asp(0tBu)-Leu-0Me, HCI

4,23 Z-Asp(0tBu)-Leu-0Me werden in 30 ml Methanol gelöst und unter Zusatz von 4,64- ml Chlorwasserstoff in Methanol.(2,03 N, 9,4 m Mol) und 420 mg Palladiumkohle-Katalysator (10^) mit Wasserstoff bei Raumtemperatur decarbobenzoxyliert. Nach Beendigung der Wasserstoffauf-

1 0 9 8 1 9 / 2 2 4 S

: - γο -

r ■ ■ . ■■. r ' .2656A34

nähme wird'filtriert, eingedampft, das erhaltene gelbe OeI in l8 ml Ν,Ν-Dimethylformamid gelöst, wieder eingedampft und in I9 ml Dimethylformamid gelost. Diese 'Lösung wird ohne weitere Reinigung für die nächste Stufe ; verwendet.

3. Z-Gln-Asp(0tBu)-Leu-0Me

Zur Lösung von 3,31 g H-Asp(OtBu)-Leu-OMe, HCl in 19 ml Dimethylformamid werden bei Raumtemperatur 4,90 g

W festes Z-GIn-ONP sowie 1,07 ml N-Methylmorpholin gegeben und die Lösung 15 Stunden bei Raumtemperatur stehen gelassen. Dann wird die Lösung eingedampft, das erhaltene, kristalline Produkt in einer Mischung von n-Butanol-Essigester (1:5) gelöst und wie unter 1. beschrieben ausgeschüttelt, getrocknet und eingedampft. ■

, Das erhaltene, feste Produkt wird aus Methanol-Essig-

ester-Petroläther umkristallisiert, F.: I86 - IÖ7⁰,

^ ^[a^D° ⁼ "^3° ( ^{c = l}*9 in. Methanol). Auf Silicagel betragen die Rf-Werte im Dünnschichtehromatogramm im System 89 = 0,46, im System 43A = 0,.6l.

4.. H-GIn-Asp(OtBu)-Leu-OMe

4,12 g Z-Gln-Asp(OtBu)-Leu-OMe werden in 30 ml Methanol suspendiert und unter Zusatz von 410 mg Palladiumkohle -Katalysator (ΙΟ %) mit Wasserstoff bei Raumtemperatür decarbobenzoxyliert. Nach Beendigung der Wasserstoff-

aufnahme wird filtriert, eingedampft und das erhaltene, fast farblose OeI in 13 ml Dimethylformamid gelöst, wieder eingedampft und in 13 ml Dimethylformamid gelöst. Die Lösung wird ohne weitere Reinigung für die nächste Stufe verwendet.

5. Z-Thr(tBu)-Gln-Asp(OtBu)-Leu-OMe

Zur Lösung von 3,16 g H-Gln-Asp(otBu)-Leu-OMe in 13 ml Dimethylformamid werden 3.» 47 S festes Z-Thr(tBu)OSU gegeben und die erhaltene, klare Lösung 18 Stunden bei Raumtemperatur stehen gelassen. Anschliessend wird die Lösung bis fast zur Trockne eingedampft, mit Aether versetzt und der ausgefallene, weisse Niederschlag abfiltriert.. Das dünnschichtchromatographisch einheitliche Pulver schmilzt bei l8O - l82 . Im Dünnschicht chromatogramm auf SiIicage 1 ist Rf o_Q = 0,53; ^Ri\pi ^{= 0}^77-

6. H-Thr(tBu)-Gln-Asp(OtBu)-Leu-OMe

4,28 g Z-Thr(tBu)-Gln-Asp(OtBu)-Leu-OMe werden in 40 ml Methanol gelöst und unter Zusatz von 420 mg Palladiumkohle (10 %) mit Wasserstoff bei Raumtemperatur deearbobenzoxyliert. Nach Beendigung der Wasserstoffaufnähme wird filtriert und eingedampft, wobei das Produkt als dünnschichtchromatographisch einheitlicher, klebriger Schaum anfällt. Im Dünnschichtchromatogramm auf Silicagel ist Ri'₁₂i = 0*04; Rf im System Chloroform-Methanol (9:1) = 0,16.

7· Z~Leu-Thr(tBu)-Gln-Asp(OtBu)-Leu-OMe

3,52 g H-Thr(tBu)Gln-Äsp(OtBu)-Leu-OMe werden in 15 ml Dimethylformamid gelöst, eingedampft, wieder in 20 ml Dimethylformamid gelöst und 2,86 g festes Z-Leu-ONP zugegeben. Die klare, intensiv gelbe Lösung wird 15 Stunden bei Raumtemperatur stehen gelassen, wobei das obige Pentapeptidderivat kristallin ausfällt. Zu dieser Suspension werden 20 ml Wasser sowie 50 ml einer Mischung von Dimethylformamid-Wasser (l:3) gegeben, das ausgefallene Produkt abfiltriert und aus Chloroform-Methanol -Pe troläther umkristallisiert. F.: 222 - 223°, [a]^° = -19° ( c = 0,9 in Chloroform). Im Dünnschichtchromatogramm auf Silicagel ist Rfo_Q = 0, 57.

8. Z-Thr(tBu)-Leu-Thr(tBu)-Gln-Asp(OtBu)-Leu-NHNHp

1,5 g Z-Leu-Thr(tBu)-Gln-Asp(0tBu)-Leu-0Me werden in 75ml Methanol gelöst und unter Eiskühlung 7*5 ml Hydrazinhydrat zugegeben. Die klare Lösung wird 15 Stunden bei Raumtemperatur stehen gelassen, dann mit einer eiskalten Mischung von 250 ml Wasser und 8,8 ml Eisessig versetzt, wobei das Produkt als feinflpckiger Niederschlag ausfällt. Es wird durch Gegenstromverteilung nach Craig gereinigt. 1,06 g des Hexapeptidderivates

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• werden^auf die ersten fünf Rohre einer Verteilungsapparatur (Phasenvoluraen je 3 ^ml) verteilt. Dabei fin det das Lösungsmittelsystem Methanol-Puffer-Chloroform-Tetrachlorkohlenstoff (10:3:5:4) (Puffer: 28,6 Eisessig und 19*3 S Ammoniumacetat in 96O ml Wasser gelöst) Verwendung. Man verteilt multiblikativ über

240 Stufen ( r = 52, K = 0,28). Aus den erhaltenen max . '

reinen Fraktionen.(Verteilungselememte Nr. Al - 66) wird das Ammoniumacetat am Hochvakuum bei 40 absublimiert und das Hexapeptidhydrazid aus Methanol-Wasser umkristallisiert. Im Dünnschichtehromatogramm auf Silicagel ist Rfg_Q = 0,47; im System Chloroform-Methanol (85:15) ist Rf =0,44.

9. Z-LyS(BOC)-LeU-HIs-OMe

3,02 Z-Lys(BOC)-LeU-NH-NH₂ in 30 ml Dimethylformamid werden bei -20° mit 5,25 ml 3,0 N HCl in Dioxan und mit 0,9 ml t-Butylnitrit versetzt. Nach 10 Minuten bei -13⁰ bis -10° wird auf -30⁰ gekühlt und 2,38 ml N-Aethyldiisopropylamin zugegeben. Dann wird bei -30⁰ eine auf 0° vorgekühlte Lösung von

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-Vi -

1,8;5 g Histidinmethylester-dihydröchlorid in 30 ml Dimethylformamid zugefügt. Die dabei erhaltenen Suspension wird eine Stunde bei -1-0° und l8 Stunden bei 0° stehen gelassen. Nach dem Eindampfen wird das erhaltene OeI in Essigester aufgenommen, dreimal mit verdünnter, wässriger Natriumhydrogencarbonatlösung und dann mit Wasser gewaschen, bis die Waschflüssigkeit neutral bleibt. Nach dem Abdampfen des Essigesters wird das erhaltene, feste Produkt aus Methanol-Chloroform-Aether umgefällt, wobei man ein dünnschichtChromatograph!sch einheitliches, schwach gelb gefärbtes Pulver erhält. F.: 144 - l45°>

p = +15° ( c= 2,0 in Chloroform).

Die Rf-Werte im Dünnschichtehromatogramm auf SiIicagel betragen im System 52 = 0,60.; im System 89 = 0,35·

10. H-Lys(BOC)-Leu-His-OMe

2,65 g Z-Lys(BOC)-Leu-His-OMe werden in 30 ml Me'thafc nol gelöst und unter Zusatz von 270 mg Palladiumkohle (10$) mit Wasserstoff bei Raumtemperatur hydriert. Nach beendeter Wasserstoffaufnahme wird filtriert und eingedampft, wobei ein gelbes OeI erhalten wird, welches man sofort weiterverarbeitet.

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11. Z--Asn-Lys (BOC)-Leu-His-OMe

ι·

2,10 g des unter 10. erhaltenen Tripeptidmethylesters werden in 15 ml'Dimethylformamid gelöst und bei Raumtemperatur mit 2^07 g festem Z-Asn-ONP versetzt. Nach 15 Stunden wird die klare ₃ gelbe Lösung eingedampft und der Rückstand aus Methanol-Chloroform-Aether, dann aus Methanol-Aeeton-Aether und dann aus Methanol-Essigester-Petrolather umgefällt. Das weisse Pulver schmilzt bei 178 - l80°. ' _ä

Im Dünnschiehtehromatogramm auf Silicagel ist Rf₅₂ = 0,40; Rf₈₉ = 0,16.

12. Z-Asn-Lys(BOC)-LeU-HIs-NH-NH₀

g Z-Asn-Lys(BOC)-Leu-His-OMe werden in einer ■ Mischung aus 20 ml Methanol und 3*5 ml Dimethylformamid gelöst und bei Raumtemperatur mit 1^65 ml Hydrazinhydrat versetzt. Die Lösung wird l8 Stunden bei Raumtemperatur stehen gelassen, wobei das obige Tetrapeptidhydrazid ausfällt. Dann werden 100 ml Wasser zugefügt, der Niederschlag wird abfiltriert und so lange mit Wasser gewaschen, bis das Waschwasser neutral reagiert. Das erhaltene, weisse, amorphe Pulver wird aus Chloroform-Methanol-Aether umgefällt-F.: 209 - 210°

Im Dünnsehiehtehromatogramm auf Silicagel ist Rf,_OQ=0,36; Rf im System Isopropanol-konz. Ammoniak (90:10) = 0,54.

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13. Z-Asn-Lys(BOC)-Leu-His-Thr(tBu)-Phe-Pro-Gln-Kir (tBu)-Ala-lie-GIy-OH

1^03 g Z-Asn-Lys(BOC)-Leu-His-NH-NHp werden in 11 ml Dimethylformamid gelöst., die Lösung auf -20° gekühlt, und dann 1,13 DiX 3,0-n. HCl in Dioxan sowie 0,202 ml t-Butylnitril zugegeben. Man lässt die Lösung 15 Minuten bei -15 stehen, kühlt dann auf -20° und tropft eine Lösung von 856 mg H~Thr(tBu)-Phe-Pro-Gln-Thr(tBu)-Ala-Ile-GIy-OH in 20 ml Dimethylformamid sowie 0,584. ml N-Aethyldiisopropylamin zu. Die Lösung

wird 16 Stunden bei +5° stehen gelassen, dann gibt man 85 ml l$ige Essigsaure zu, filtriert den ausgefallenen Niederschlag ab und wäscht ihn mit Wasser chloridfrei. Zur Reinigung wird das Produkt aus Methanol-Chloroform-Petroläther, dann aus Dimethylformamid-Wasser und aus Methanol-Wasser umgefällt. F.: 209 ~ 211°.

Im Dünnschichtchromatogramm auf Silieagel ist Rf₁₀₀ = 0,35;

^Rf70 ^{= Of}^J ^Rf im. System Isopropanol-konz. Ammoniak (90:10) = O,32_P

14. H-Asn-Lys(BOC)-Leu-His-Thr(tBu)-Phe-Pro-Gln-Thr(tBu)-Ala-Ile-GIy-OH

ο 678 mg des unter 13. beschriebenen Produktes werden

_j in 80 ml 8o#iger Essigsäure gelöst und unter Zusatz von

*-» '73 mg Palladiumkohle (10^6 Pd) mit Wasserstoff bei Raumtempera

js, tür hydriert. Nach beendeter Wasserstoff auf nähme wird co

filtriert, das Piltrat bis fast zur Trockne eingedampft.

der Rückstand in Eisessig aufgenommen und lyophilisiert. Das Lyophilisat wird in 70$igem t-Butanol gelöst und abermals lyophilisiert. - ,

Im Dünnschi chtchrornatogramm auf Silicagel ist Rf₅₂ = 0,17; Rf₇₀ = .0,36. . .

15. Z-Thr(tBu)-Leu-Thr(tBu)-Gin-Asp(OtBu)-Leu-Asn-Lys (BOC)-Leu-His-Thr(tBu)-Phe-Prο-GIn-Thr(tBu)-AIa-Ile-Gly-OH . *■

368 mg Z-Thr(tBu)-Leu-Thr(tBu)-Gln-Asp(OtBu)-Leu-NH-NHp werden in 3,1 ml Dimethylformamid gelöst, die Lösung auf -20° gekühlt und 325 μΐ 3,0-n. HCl in Dioxan sowie 55 ΜΊ t-Butylnitrit zugegehen. Die Lösung wird 15 Minuten bei -15° bis-10° stehen gelassen; dann gibt man bei -15° eine Lösung von H-Asn-Lys(BOC)-Leu-His-Thr(tBu)-Phe-Pro-Gln-Thr(tBu)-Ala-Ile-GIy-OH in 7,5 ml Dimethylformamid sowie 169 μ1· N-Aethyldiisopropylamin zu. Die Lösung wird 2 Stunden im Eisbad gerührt und während dieser Zeit werden | weitere 42 μΐ N-Aethyldiisopropylamin in 4 Portionen zugegeben. Nun lässt man die Lösung I5 Stunden bei +5 stehen und lässt sie dann in Aether eintropfen. Der erhaltene weisse Niederschlag wird in Dimethylformamid gelöst, nochmals in Aether getropft, der erhaltene Niederschlag abermals in Dimethylformamid gelöst und die Lösung zu auf 0 gekühlter 0,02-n. HCl (welcher auf 100-ml Volumen 10 ml gesättigte Kochsalzlösung zugesetzt wird) getropft. Das dabei erhaltene,

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2Ö5GA34

amorphe Produkt wird in 80$igem Acetonitril gelöst und bei 50 mit Wasser gefällt.

Im Dünnschichtehromatogramm auf Silicagel ist

Rf₅₂ = 0,36; Rf₇₀ = 0,50; Rf₁₀₀ = 0,37-

l6. H-VaI-GIy-Ala-Pro-

194 mg Z-VaI-GIy-AIa-PrO-NH₂ werden in IT ml 8o$igem Methanol suspendiert und unter Zusatz von 60 mg Palladiumkohle (10$) mit Wasserstoff bei Raumtemperatur hydriert. Nach beendeter Wasserstoffaufnähme wird filtriert, eingedampft, das erhaltene OeI in t-Butanol gelöst und lyophilisiert. Die Rf-Werte des dabei erhaltenen weissen Pulvers im Dünnschichtehromatogramm auf Silicagel sind im System 96 = 0,22; im System Chloroform-Methanol (1:1) = 0,17.

17. Z-Thr(tBu)-Leu-Thr(tBu)-Gln-Asp(OtBu)-Leu-Asn-Lys (BOC)-Leu-His-Thr(tBu)-Phe-Prο-Gln-Thr(tBu)-Ala-He-GIy-VaI-GIy-AIa-PrO-NH₂

375 mg der unter 15· beschriebenen Verbindung werden in 4,4l ml Dimethylformamid gelöst und bei Raumtemperatur 77 mg H-Val~Gly-Ala-Pro-NH₂, 26 mg N-Hydroxysuccinimid sowie 46 mg Dicyclohexylcarbodiimid zugegeben und die Lösung l8 Stunden bei 45 gerührt. Diese Lösung wird anschliessend in Aether getropft und das erhaltene weisse Pulver einer Gegenstromverteilung nach Craig unterworfen: 435 mg des Docosapeptidamids werden auf die ersten vier Rohre eines Ver-

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- 19 -

teilimgsapparates (Phasenvolumen je 3 ml) verteilt, wobei .das Lösungsmittelsystem Methanol-Puffer-Chloroform-Tetrachlorkohlenstoff 10:4:5:6 (Puffer wie unten) Verwendung findet. Man verteilt multiplikativ über insgesamt 550 Stufen (r = TQ, K = 0,15)* Aus den reinen Frak-

ΓΠ3Χ

tionen wird das Ammoniumacetat

am Hochvakuum bei 40 absublimiert* Das reine, geschützte Doeosapeptidamid weist im Dünnschichtchromatogramm auf Sili.cagel folgende Rf-Werte auf : Rf„_Q = 0,68; Rf₅₂ = 0,31

Rf₁₀₀=0,40i Rf_43E=0,62.

l8. H-Thr(tBu)-Leu-Thr(tBu)-Gln-Asp(OtBu)-Leu-Asn-Lys (BOC)-Leu-His-Thr(tBu)-Phe-Pro-Gln-Thr(tBu)-Ala-He -GIy -VaI -Gly-Ala-Pro -

13811g des unter 17· beschriebenen Produktes werden in 13.» 8 ml 8ö$iger Essigsäure gelöst und unter Zusatz von 25 mg Palladiumkohle-Katalysator (10$ Pd) mit Wasserstoff 18 Stunden bei Raumtemperatur hydriert. Dann wird filtriert, eingedampft, der Rückstand in Eisessig gelöst und lyophilisiertDas erhaltene Lyophilisat wird in wenig Methanol gelöst, mit gesättigter Natriumhydrogencarbonatlösung auf einen pH-Wert zwischen 7 und 8 eingestellt und dann in eine 0,1-n.

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Natriumcarbonatlösung eingetropft. Man erhält ein weisses Pulver; irn^ Dünnschichtchromatogramra auf Silicagel ist Rf₁₀₀. = 0,24; Rf₇₀ = 0,64 ; Rf₄₃^ = 0,57«

19. BOC-Cys-Gly-Äsn-Leu-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Cys-Met-ieu-GIy-Thr(tBu)-Leu-Thr(tBu)-Gln-Asp(OtBu)-Leu-Asn-Lys (BpC)-Leu-His-Thr(tBu)-Phe-Pro-GIn-Thr(tBu)-Ala-Ile■ GIy-VaI-GIy-AIa-PrO-NH₂

93 ^mg des unter l8 beschriebenen Docosapeptidamids.

sowie 50 mg des geschützten Dekapeptides BOC-Cys-Gly-Asn-Leu-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Cys-Met-Leu-Gly-OH werden in 0,7 ml Dimethylformamid in der Wärme gelöst, dann bei Raumtemperatur mit 9/5 ¹¹¹S festem N-Hydroxysuccinimid sowie 12,8 mg festem Dicyclohexylcarbodiimid versetzt und 3 1/2 Stunden bei 45 gerührt. Anschliessend wird die Lösung zu 14 ml vorgelegten, peroxidfreien Aether getropft und das dabei erhaltene,'weisse Pulver zur Reinigung einer Gegenstromverteilung nach Craig unterworfen: 126 mg des rohen Dotriacontapeptidamids werden auf die ersten zwei Rohre eines Verteilungsapparates (Phasenvolumen je 3 ml) verteilt, wobei das Lösungsmittelsystem Methanol-Puffer-Chloroform-Tetrachlorkohlenstoff 11:4:6:7 (Puffer wie unten) Verwendung findet. Man verteilt multiplikativ über ingesamt 210 Stufen (r_max = 87, K = 0,7).

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reinen Fraktionen wird das Ammoniumacetat am

Hochvakuum bei 4o absublimiert, das geschützte Dotriacontapeptidamid weist im Dünnschichtchromatogramm auf Sili-cagel Rf₁₀₀ = 0,40 und Rf = 0,58 auf.

Beispiel 3 : '

's

i f

H-Cys-Gly-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Met-Leu-Gly-Lys-Tyr-Thr-GIn-

Asp-Phe-Asn-Lys-Phe-Hi s-Thr-Phe-Pro-Arg-Thr-Ala-lie-GIy-Val-Gly-Ala-Pro-NH₂ (Lys¹¹- Arg^22f-Calcitonln M).

_r

81 mg BOC-Cys-Gly-Asn-Leu-Ser-(tBu)-03ir(tBu)-Cys-Met·

Leu-Gly-Lys(BOC)-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Gln-Asp(OtBu)-Phe-Asn-Lys (BOC)-Phe-His-Thr(tBu)-Phe-Prο-Arg-Thr(tBu)-Ala-He-GIy-VaI-Gly-Ala-Pro-NH₂ werden bei 0° mit 2 ml eiskalter, konzentrierter Salzsäure übergössen, mit Stickstoff gespült und 10 Minuten in verschlossenem Gefäss bei 0 'gerührt. Nach Abkühlen auf ca. -6Ö wird am Hochvakuum evakuiert, und die Lösung unter langsamer Temperatursteigerung bis 0 eingeengt. An- ·■ schliessend gibt man 2 ml V/asser zu und lyophilisiert. Zwecks Austausch der Chlorid- gegen Acetationen wird dann

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das in 2 ml O,l-N Essigsäure gelöste Lyophilisat durch eine Säule (Durchmesser. 6 mm, 1 = 12 cm) von Amberlite CG-45 (schwach basischen Ionenaustauscher/ in Acetatform) durchlaufen gelassen. Das mittels UV kontrollierte Eluat wird lyophilisiert, über Phosphorpentoxyd am Hochvakuum nachgetrocknet und durch Stehenlassen im offenen Gefäss mit der Luftfeuchtigkeit äquilibriert. Man erhält so das Acetat von Lys , Arg -Calcitonin M.
In der Dünnschichtchromatographie weist das Dotriakontapeptidamid als einzige Verunreinigung eine Spur des ent-

o
sprechenden Met -SuIfoxid-Derivats auf. Im Dünnschichtchromatogramm «an. "Alox" -D-O ist Rf co = 0,51; Rf u_r = O,kJ>} an Cellulose "Selecta" (Fertigplatten der Fa. Schleicher und Schuell) ist Rf₄₃ = 0,49; Rf_lolA = 0,55-

In der Elektrophorese auf Cellulose "Selecta" l44O wandert die Substanz bei pH 1,9 in 1,5 Stunden bei 280 Volt 5,6 cm zur Kathode.

Das Ausgangsmaterial kann z.B. wie folgt hergestellt werden: ·

Z-Arg-OH wird in Dimethylformamid mit H-Thr(tBu)-Ala-Ile-Gly-OH in Gegenwart von Dicyclohexylcarbodiimid zu Z-Arg-Thr(tBu)-AIa-Ile-Gly-rOH umgesetzt und die Carbobenzoxygruppe in salzsaurem. 80$igem wässerigen Methanol in Gegenwart von Palladiumkohle abgespalten. Z-Thr(tBu)-Phe-Pro-OH wird in Form des gemischten

109819/22*9 ^ς

Anhydrids (mij; Kohlensäureisobutylester) mit dem erhaltenen H-ATg-TIwCtBu)-AIa-IIe^GIy-OH zum Z~Thr(tBu)-Phe-Pro-Arg-Thr (tBu)-Ala-Ile-GIy-OH kondensiert. Nach katalytischer Hydrierung in 80$iger Essigsäure in Gegenwart von Palladiumkohle wird dieses mit einer Lösung von Z-Asn-Lys(BOC)-Phe-His-Azid in Dimethylformamid zum .Z-Asn-Lys(BOC)-Phe-His-Thr(tBu)-Phe-Pro-Arg-Thr(tBu)-Ala-Ile-GIy-OH umgesetzt. Das in 80^iger Essigsäure in Gegenwart von Palladiumkohle decarbobenzoxylierte Do- a decapeptidderivat wird kondensiert mit Z-Lys(BOC)-Tyr(tBu)-Thr CtBu}-Gin-AspCOtBu)-PtIe-AzId, das man erhält durch Kondensation des gemischten Anhydrids von Z-Lys(B0C)-0H (mit Kohlensäureisobutylester) mit H-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Gln-Asp(0tBu)-Phe-0Me zu Z-Lys(B0C)-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Gln-Asp(0tBu)-Phe-0Me, dessen Ueberführung ins Hydrazid mit Hydrazinhydrat in Methanol und Umsetzung des Hydrazide zum Azid mittels tert.Butylnitrit in Dimethylformamid mit Zusatz von Chlorwasserstoff in Dioxan. Das so erhaltene Z-Lys(BOC)-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Gln-Asp(OtBu>- i Phe-Asn-LysiBOCj-Phe-His-ThritBui-Phe-Pro-Arg-ThritBui-Ala-Ile-Gly-OH wird mittels Dicyclohexylcarbodiimid und N-Hydroxysuccinimid in Dimethylformamid mit H-VaI-Gly-Ala-Pro-NH« zum geschützten Docosapeptidamid umgesetzt. Dieses wird durch Craig-Verteilung gereinigt und dann in 80$iger Essigsäure in Gegenwart von Palladiumkohle hydriert. Durch Umfallen aus Methanol in 0_Λ1-η. Natriumcarbonat erhält man die freie

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- 8k

Base, die in Dimethylformamid mittels Dicyelohexylcarboailmid

* ■!.*■- Il I' ■■ ' ■ · I"»" J'—.

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und- Hydroxysuccinimid mit -BQC-Cys-Gly-Asn-Leu-Ser(tEu)-iEhr (tBu)-Cys-Met-Leu-Gly-GH zum geschützten Dotrlaeont apeptidamdd kondensiert wird. E)as Produkt wird wiederum durch Craig-Verteilung gereinigt.

Beispiel

H-Cys -Gly-Asn-Leu-Ser -Thr-Cys -Me t -Leu -Gly-Thr -Tyr-Thr-QJuck-Asp -Ph e -His--Ly's -Leu-Gin -Thr-Phe-Pro -Gln-Thr-Ala -He -GCly-Vai-GIy-AIa-PrO-NH₀ (His¹⁷- 'Leu¹^ -GIn²⁰ -Calcitonin M ).

470 mg BOC-Cys-Gly-Asn-Leu-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Cy/S-Me t -Leu-GIy-Thr (tBu) -Tyr (tBu) -Thr (tBu) -Gin-Asp (01Bu) -Phe-His Lys(BOC)-Leu-Gln-Thr(tBu)-Phe-Prο-Gln-Thr(tBu)-Ala-He-GIy-Val-Gly-Ala-Pro-NHg werden bei 0 mit 10 ml eiskalter,, konzentrierter Salzsäure Übergossen. Man spült mit Stickstoff und rührt dann im geschlossenen Gefäss 10 Minuten bei 0 . Nach Abkühlen auf ca. -60 wird am Hochvakuum evakuiert und die Lösung unter langsamer Steigerung der Temperatur auf 0° eingeengt. Anschliessend gibt man 15 ml Wasser zu und lyophilisiert. Das Lyophilisat wird in 6 ml 0,1-n. Essigsäure gelöst und zwecks Austausch der Chlorid- gegen Acetationen

109819/22 it

durch eine Säule (Durchmesser = 10 mm t = 16 cm) Amberlite CG-45 (schwach basischer Anionenaustauscher in Acetatform) fliessen .gelassen. Das am UV-Durohflussanalysator kontrollierte Eluat wird lyophilisiert, über Phosphorpentoxid am Hochvakuum · nachgetrocknet und durch Stehenlassen im offenen Gefäss mit der Luftfeuchtigkeit äquilibriert. Man erhält auf diese Weise das

17 IQ 20
Acetat von His ' —Leu ^y — GIn -Calcitonin M. Das Produkt ist

elektrophoretisch einheitlich. ' * .

In der Dünnschicht-Elektrophorese auf Cellulose "Selecta" l44O (Fertigplatten von Schleicher und Schüll) wandert es bei pH 1,9 (Puffer wie in Beispiel l) bei 280 Volt in 1,5 Stunden 3,5 cm zur Kathode. Das Dotrikontapeptidamid zeigt in der Dünnschichtchromatographie an Cellulose "Selecta" l44O Rf₂^ = 0,52; Rf_{101 A} = 0,60; an "Alox" D-O: Rf₄₅ = 0,.46, Rf₅₂= 0,57; Rf₇₉ = 0,68. . . ^;

Das geschützte'Dotriacontapeptidamid wird z.B. wie folgt hergestellt: .

Z-Lys('B0C)-0H wird zum gemischten Anhydrid mit Isobutylehlorcarbonat umgesetzt und dieses mit H-Leu-OMe zum geschützten Dipeptidester Z-Lys(BOC)-Leu-OMe vom F. 113-114° kondensiert. Dieser wird mit Hydrazinhydrat in Methanol in das Hydrazid (F. 154-155°) übergeführt. Aus dem Hydrazid steUt man nach Rudinger mit

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' tert.Butylnitrit in Dioxan unter Zusatz von Chlorwasserstoff das Azid her und kuppelt es unter Zugabe von Diisopropyläthylämin mit H-GIn-OMe zu Z-Lys(BOC)-LeU-GIn-OMe. Durch neutrale Hydrierung in Methanol mit„Palladiumkohle 'erhält man Lys(BOC)-Leu-Gln-OMe. Dieses wird mit Z-His-l·^, nach der Äzidmethode von Rudinger wie oben gekuppelt, so dass man Z-His-Lys(BÖC)-Leu-Gln-OMe erhält. Diesen Ester führt man wiederum nach Rudinger über dasilydrazld in dssfeid über

^ und kuppelt es nach Rudinger mit H-Thr(tBu)-Phe-Pro-Gln-Thr(tBu)-Ala-Ile-GIy-OH (vgl. Beispiel 2) unter Verwendung von Diiso-. propyläthylamin als Base. Katalytische Hydrierung mit Palladiumkohle in 80$iger Essigsäure ergibt H-His-Lys(BOC)-Leu-Gin-Thr, (tBu)-Phe-Pro-Gln-Thr(tBu)-Ala-Ile-GIy-OH, das nach der Äzidmethode wie vorher mit Z-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Gln-Asp (OtBu)-Phe-N.. (vgl. Beispiel lf zu Z-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Gin-Asp(OtBu)-Phe-His-Lys(BOC)-Leu-Gln-Thr(tBu)-Phe-Pro-Gln-Thr (tBu)-Ala-Ile-GIy-OH kondensiert wird. Man reinigt das Produkt

" durch Urnfällen aus Dimethylformamid und Essigester und kondensiert es mittels Dicyclohexylcarbodiimid und N-Hydroxysuccinimid in Dimethylformamid mit H-VaI-GIy-Ala-Pro-NHp, vgl. Beispiel Das so erhaltene geschützte Docosapeptidamid wird durch Craig-Verteilung im Lösungsmittelsystem Methanol-Puffer-Chloroform-Tetrachlorkohlenstoff (50:10:6) gereinigt und dann in 80#iger Essigsäure in Gegenwart von Palladiumkohle decarbobenzoxyliert

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zu H~Thr(tBu)-Tyr (tBu)-Thr(tBu)-Gin-Asp(OtBu)-Phe-His-Lys(BOC)-Leu-Gln-Thr(tBu)-Phe-Pro-Gln-Thr(tBu)-AXa-IIe-Gly-Val-Gly-Ala-Pro-NH_, Mittels 0,1-n. Natriumbicarbonat stellt man die· freie Base her und, kondensiert diese wie.in Beispiel 1 mittels Dlcyclohexylcarbodilraid und N-Hydroxysuccininiid mit BOC-Cys-Gly-Asn-Leu-Ser(tBu)-<aiir(tBu)-Cys-Met-Leu-Gly-OH zum geschützten Dotriacontapeptidamid, das wie in Beispiel 1 gereinigt wird.

Beispiel 5 »

H-Cys-Gly-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-VaI-Leu-Gly-Thr-Tyr-Thr-Gln-Asp-.Phe -Asn -Ly s -Phe -Hi s -Thr -Tyr -Pro -GIn -Thr -AIa-Il e -GIy -VaI -GIy-Ala-Pro-NH₂ χ 3HCl "(VaI -Tyr²²-Calcitonin M). ■

7,0 mg BOC-Cys-Gly-Asn-Leu-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Cys-Val-Leu-Gly-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Gln-AspCotBuJ-Phe-Asn-Lys (BOC)-Phe-His-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Pro-Gln-Thr(tBu)-Ala-Ile-Gly-VaI-GIy-AIa-PrO-NH₂ werden in einem Kölbchen im Eisbad unter Stickstoff auf 0° gekühlt, dann 0,2 ml konzentrierte Salzsäure zugegeben, 7 Minuten bei 0° stehengelassen, mit Aceton/ Kohlendioxid tiefgekühlt und am Hochvakuum .entgast, dann im Eisbad gekühlt und bis zum glasig-sirupösen Rückstand konzentriert. Dieser wird in wenig Wasser gelöst und lyophilisiert.

In den Dünnschichtehromatogrammen zeigt das erhaltene Dotriacontapeptidamidtrihydrochlorid folgende Rf-Werte:

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auf "Alox" D-Θ (Fa. Ca»ag; Rf„-_O = Q,fl

Aluminiumoxyd . mit %% Gips) auf Cellulose "Sölecta" l4% ^Ef

l01A= Ό 39 "

(Pertigplatten der Fa. Schleicher und Schüll) .

ElektrOphorese auf Cellulose pH 1,9, 1 1/2 Stunden, 2Ö0 YoIt₅, Laufstrecke:

4,8 cm zur Kathode.

Das Äusgangsmaterial kann wie folgt hergestellt ^ werden: ·

1. Z-Leu-Gly-OMe

115,8 g Z-Leu-ONP werden la 2βθ ml Diwethylforfflaiil-d gelöst,. 37'»1 € festes Glfcinmethylester-liydrochlorid zugegeben und unter Eiskühlung 47,1 nal Triäthylamin zugetropft. Pie Lösung wird 18 Stunden bei +5 belassen, vom ausgefallenen

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Triäthylaminhydrochlorid abfiltriort und das Biltaat eingedampft» Das erhaltene, dunkelgelbe OeI.wird in Essigester, gelöst und unter Eiskühlung einmal mit Wasser, viermal mit verdünnter, wässriger Kaliumcarbonatlösung, einmal mit verdünnter Kochsalzlösung, zweimal mit 0,2-n. HCl und dann mit Wasser so lange gewaschen, bis das Waschwasser neutral reagiert. Die Essigesterphase wird über Natriumsulfat getrocknet, eingedampft und der gelbe, kristalline Rückstand aus Benzol-Petroläther umkristallisiert. F.: 91 - 92°. . .

Die Rf-Werte im Dünnschichtchromatogramm auf SiIicagel betragen im System 115 = 0,87., im System Toluol-Aceton (1:1).= 0,60.
2. H-Le u-GIy-OMe '„■ . ' '

79jO g Z-Leu-Gly-OMe werden in 400 ml Methanol gelöst und unter Zusatz von l6,5 g Palladiumkohle (10$) bei Raumtemperatur mittels Wasserstoff in der Schüttelente hydriert. Nach Beendigung der Wasserstoffaufnähme wird filtriert, eingedampft und das erhaltene, gelbe OeI sofort weiterverarbeitet.

3. Z-Val-Leu-Gly-OMe ' .

Zu einer Lösung von h'J,4 g H-Leu-Gly-OMe in 250 ml N,N-Dimethylformamid werden bei Raumtemperatur 2,68 ml Eisessig sowie 87,5 g festes Z-VaI-ONP gegeben und die

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2Ö5Ö43.4

erhaltene "Lösung l8 Stunden bei Raumtemperatur belassen. Dann wird bis zur öligen Konsistenz eingedampft, in einer Mischung aus 1,5 Litern Essigester sowie 0,5 Liter n-Butanoi" gelöst und bei 0 einmal mit Q,8 Aequivalenten (bezogen auf* die theoretisch entstehende Menge p-Nitrophenol) verdünnter Natronlauge, fünfmal mit verdünnter, wässeriger Kaliumcarbonatlösung, einmal mit Wasser> ein-

fe mal mit verdünnter Weinsäurelösung und dann mit Wasser so länge gewaschen, bis das Waschwasser neutral reagiert. Die organische Phase wird über Natriumsulfat getrocknet, eingedampft und der weisse, kristalline Rückstand aus Methanol-Wasser sowie Chloroform-Petroläther umkristallisiert. Das dünnschichtchromatographisch einheitliche Produkt zeigt einen Schmelzpunkt von I69 ·

Die Rf-Werte im Dünnschichtehromatogramm auf Silicagel betragen im System Chloroform-Methanol (§6:4) 0,45; im

" System Toluol-Aceton (l:l) 0,57.

4. H-VaI-Leu-GIy-OMe

5g Z-VaI-Leu-Gly-OMe werden in 100 ml Methanol gelöst und unter Zusatz von 1,0 g Palladiumkohle-Katalysator (10 %) mittels Wasserstoff bei Raumtemperatur in der Schüttelente hydriert. Nach dem Filtrieren und Eindampfen

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wird das dünnschichtehroinatographisch einheitliehe Produkt sofort weiterverarbeitet.

5. ' TRI-Cys(TRI)-Val-Leu-Gly-OMe

1*70 g H-VaI-Leu-Gly-OMe werden in 20 ml Acetonitril gelöst, #, 70 g festes TRI-Cys(TRI)-OH zugegeben, die erhaltene Lösung auf 0° gekühlt, 1,90 g festes Dicyclohexylearbodiimid zugefügt und l8 Stunden bei Raumtemperatur belassen. Die bereits nach kurzer Zeit festgewordene Masse wird abgenutseht und aus Chloroform-Essigester-Petroläther umkri s t al1isier t«

Die Rf-Werte im Dünnschichtehromatogramm auf SiIicagel betragen im System Chloroform-Methanol (9:1) 0,73, in Butylacetat 0,53· . -

6. H-CyS(TRI)-VaI-LeU-GIy-OMe

3,8 g des unter 5 beschriebenen Produktes werden mit 36*3 ml Eisessig versetzt, 6,3 ml Wasser zugegeben und die Mischung gut homogenisiert. Nach kurzer Zeit wird die zunächst trübe Lösung klar, dann beginnt sieh allmählich weisses, feinkristallines Triphenylcarbinol abzuscheiden. Man filtriert nach 1 Stunde, dampft das Piltrat ein, löst es in einer Mischung aus Essigester und n-Butanol, wäscht

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dreimal mit verdünnter, wässeriger Natriumhydrogencarbonatlösurtg und dann mit Wasser, bis das Waschwasser neutral reagiert.' Die organische Phase wird eingedampft, der Rückstand in einer Mischung aus Chloroform und Benzol gelöst und mittels Essigester sowie Petroläther wieder aus· gefällt. Das erhaltene, schwach rosa gefärbte Pulver zeigt im Dünnschichtchromatogramm auf Silicagel im System Chloroform-Methanol (98:2) den Rf-Wert 0,20.

* 7. · DPC-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Cys(TRI)-VaI-Leu-Gly-OMe

l,60 g DPC-Ser(tBu)-Thr(tBu)-NH-NHp werden in 13 ml Dimethylformamid gelöst, die Lösung auf -15° gekühlt und 3,5 ml 2-n. HCl in Essigester sowie 0,39 t-Butylnitrit zugegeben. Die Lösung wird I5 Minuten bei -10 belassen, dann auf -20 gekühlt und eine auf 0° gekühlte Lösung von 2,50 g H-Cys(TRl)-VaI-Leu-Gly-OMe sowie 0,975 ml Triäthylamin in 9 ml Dimethylformamid rasch zügetropft. Die erhaltene Lösung wird 1 Stunde bei -10° gerührt und l8 Stunden bei 0° belassen. Man filtriert das auskristallisierte Triäthylaminhydrochlorld ab, dampft das Piltrat ein, löst den gelbroten, harzigen Rückstand in Essigester und wascht zweimal mit verdünnter, wässriger Zitronensäurelösung, einmal mit V/asser, zweimal mit verdünnter, wässriger Natriumhydrogencarbonatlösung und mit Wasser, bis das Waschwasser neutral reagiert. Die Essig-

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esterphase trocknet man über Natriumsulfat, löst den gelbroten, pulvrigen Rückstand in Essigester und fällt bei mit Petroläther. Das erhaltene hellbraune, amorphe Pulver wird aus Acetonitril' umkristallisiert. F.: 200 - 201°. ·

Die Rf-Werte im Dünnschichtchromatogramm auf SiIicagel betragen im System Toluol-Aceton (6:4) = 0/51; in Chloroform-Methanol (97:3) = 0,37 und in Butylacetat 0,28.

• ^; · ι

8. H-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Cys(TRl)-Val-Leu-Gly-OMe_J CH COOH

1,64 g des unter 7 beschriebenen Produktes werden bei 45 in 8,9 ml Eissessig gelöst und unter starkem Rühren 2,2 ml Wasser zugetropft. Die nach der Wasserzugabe jeweils ausfallende, gelbliche Substanz geht wieder rasch in Lösung. Diese Lösung wird 75 Minuten bei 45° belassen, am Wasserstrahlvakuum bei 50 Badtemperatur bis fast zur Trockne'

eingedampft und lyophilisiert. ^:— : ■ r

Das Lyophilisat wird in wenig Wasser suspendiert, abermals lyophilisiert und am Hochvakuum bei 40° nachgetrocknet. Zur Reinigung wird das Lyophilisat bei 50° in 10 ml Methanol suspendiert, 35 ml Essigester und, bei Raumtemperatur, 300 ml Petroläther zugegeben. Der ausgefallene, feinflockige Niederschlag wird 15 Minuten bei 0° gerührt und abfiltriert.. Das weisse Pulver besitzt einen Schmelz-

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punkt von 204 - 206°.

Die Rf-Werte im Dünnschichtehromatogramm auf SiIicagel betragen im System 96 = 0,69;'in 43C = 0,71 und in Chloroform-Methanol.(7:3) = 0,80.

9. H-Ser(tBu)-Thr(tBu)-CyS(TRI)-VaI-LeU-GIy-OH

799 ^mS ^des unter 8 beschriebenen Produktes werden mit 11 ml Dimethylformamid versetzt, auf 50 erwärmt, fein suspendiert und 2,7 ml Wasser zugegeben, wobei ein vjeisser, feinflockiger Niederschlag ausfällt. Die Suspension wird unter starkem Rühren bei Raumtemperatur mit 2,4 ml 1-n. NaOH versetzt und 10 Minuten bei Raumtemperatur gerührt. Die erhaltene, fast völlig klare Lösung wird bei 0° mit 2,4 ml 1-n. HCl sowie 8 ml Wasser versetzt, der ausgefallene Niederschlag 90 Minuten bei 0° gerührt, abfiltriert, mit Wasser chloridfrei gewaschen und aus Methanol-Chloroform-Petroläther umgefällt. Die Vollständigkeit der Verseifung wird dünnschichtchromatographisch auf Silieagel .geprüft:

Rf-Werte : System 43C =. 0,37,

System 100 = 0,48,

Chloroform-Methanol (7:3)= 0,30.

10. BOC-Cys(TRI)-Gly-Asn-Leu-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Cys(TRl)-VaI-Leu-GIy-OH

476 mg BOC-CyS(TRI)-GIy-ASn-LeU-NHNH₂ werden in 5,2 ml 1098 19/2249 *

Dimethylformamid in der Wärme gelöst, die erhaltene Lösung auf -15° gekühlt und 796 μΐ 1,96-n. HCl in Essigester sowie 89 M-I t-Butylnitrit zugegeben. Die Lösung wird 10 Minuten bei -10 belassen, auf -20 gekühlt und eine auf -10 vorgekühlte Lösung von 389 ^mS des unter 9 beschriebenen Produktes^in 8,2 ml Dimethylformamid und 276 plTriäthylamin zugegeben. Die erhaltene, hochviskose Lösung wird 1 Stunde bei -10 und 18 Stunden bei +5 belassen. Die erstarrte j

Reaktionsmischung wird mit N,N-Dimethylformamid verdünnt, Wasser zugefügt, der ausgefallene Niederschlag abfiltriert, getrocknet und die in demselben enthaltenen Verunreinigungen durch mehrmaliges Extrahieren mit Methanol bei 60° herausgelöst.

Die Rf-Werte des erhaltenen, weissen Pulvers betragen im Dünnschichtchromatogramm auf Silieagel im System 45 = 0,47; im System Chloroform-Methanol (7:3) = 0,54; im System 70 =■ 0,53 und im System 100= 0,73. (

11. BOC-Cys-Gly-Asn-Leu-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Cys-Val-Leu-Gly-ÖH

4o6 mg des unter 10. beschriebenen Produktes werden in 4o ml Dimethylformamid in der Wärme gelöst und bei Raumtemperatur 0,033 mll-n. Salzsäure zugegeben. Die erhaltene Lösung wird innert 30 Minuten zu einer schwach gerührten,

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unter Stickstoffatmosphäre gehaltenen Lösung von 620 mg Jod in 125 ml Methanol getropft. Die klare, dunkelbraune Lösung wird noch 1 Stunde bei Raumtemperatur gerührt, dann auf 0° abgekühlt und tropfenweise mit 1-n. Natriumthiosulfatlösung versetzt, bis die braune Lösung entfärbt ist. Anschliessend dampft man weitgehend ein und gibt unter Eiskühlung peroxidfreien Aether zu. Man erhält einen zunächst schmierigen Miederschlag der allmählich .pulvrig wird„ Der Aether wird abdgkantiert und der Rückstand bei 0° nochmals mit Wasser durchgerührt. Das

Pulver wird zur weiteren Reinigung einer Gegehstromverteilung nach Craig unterworfen: 216 mg des Produktes werden amf die ersten vier Rohre eines Verteilungsapparates (Phasenvolumen je 3 ™1) verteilt, wobei das Lösungsmittelsystem Methanol-Puffer-Chloroform-Tetrachlorkohlenstoff (5:2:3:1; Puffer wie in Beispiel 1 unter 8.) Verwendung findet. Man verteilt multiplikativüberinsgesamt ψ 220 Stufen (1· = 111, K = 1,0). Aus den erhaltenen reinen Fraktionen (Verteilungsrohre Nr. 98 - 127) wird das Ammoniumacetat am Hochvakuum bei 4θ absubliniert. Das geschützte Dekapeptid im Dünnschichtchromatogramm auf SiIicagel zeigt Rf₁^₅ = 0,35, Rf₇₀ = 0,48 und Rf₁₀₀ = 0,44.

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12. BOC-Cys-Gly-Asn-Leu-Ser (tBu)-Th^tBu)-CyS-VaI-LeU-Gly-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Gin-Asp(OtBu)-Phe-■Asn-Lys(BOC)-Phe-His-Thr(tBu) -Tyr(tBu)-Pro-Gln-Thr(tBu)-AIa-Ile-GIy-VaI-GIy-Ala-Pro-

Man löst 22,0 mg des geschützten Docosapeptldamids H-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Gin-Asp(OtBu)-Phe-Asn-Lys(BOC)-Phe-His-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Pro-Gln-Thr(tBu)-Ala-lie-GIy-VaI-GIy-AIa-PrOvNH₂ (vgl. Beispiel 1 unter 12.) sowie 13/1 mg des Dekapeptid.es BOC-Cys-Gly-Asn-Leu-SerCtBu)-Thr(tBu)-Cys-VaI-Leu-GIy-OH in der Wärme in 0,15 ml Dimethylformamid, kühlt die Lösung auf Raumtemperatur ab, gibt 2,0 mg N-HydroxysucclniiTild sowie 2,8 mg Dicyclohexylcarbodiimid zu und lässt 3 1/2 Stunden bei 45° stehen. An-

schliessend wird die Lösung zu 3 ml vorgelegtem peroxidfreien Aether gegeben und das dabei ausgefallene Pulver nach dem Trocknen einer Gegenstromverteilung nach Craig unterworfen: 30,0 mg des Produktes werden in das dritte Rohr eines Verteilungsapparates (Phasenvolumen je 3 ml) gegeben, wobei das Lösungsmittelsystem Methanol-Puffer-Chloroform-Tetrachlorkohlenstoff 11:3:6:7 (Puffer wie in Beispiel 1 unter 8.) Verwendung findet. Man verteilt multiplikativ über insgesamt 250 Stufen C r _mov = 97, K = 0,63). Aus dem durch Eindampfen der Fraktionen Nr. 93 - 107 erhaltenen Produkt wird das Ammoniumacetat am Hochvakuum bei 40° absublimiertj man erhält das reine, geschützte Dotriacontapeptidamid. Die Rf-Were im DUnnschichtchromatogramm auf Silicagel sind Rf₇₀ =

0,57; Rf_10n « 0,31. ■

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Beispiel 6 :

H-Cys-Gly-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Val-Leu-Gly-Thr-Leu-Thr-Gln-Asp-Leu-Asn-Lys-Leu-His-Thr-Phe-Pro-Gln-Thr-AIa-Ile-GIy-Val-Gly-Ala-Pro-NH₂ χ 3HCl (Val⁸ -Leu¹²*^l6'¹⁹-Calcitonin M).

64,2 rag BOC-Cys-Gly-Asn-Leu-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Cys-Val-Leu-Gly-Thr(tBu)-Leu-Thr(tBu)-Gln-Asp(OtBu)-Leu-Asn-Lyä

* (BOC)-Leu-His-Thr(tBu)-Phe-Pro-Gln-Thr(tBu)-Ala-Ile-GIy-VaI-GIy-AIa-Pro-NHp werden in einem· Kölbchen im Eisbad unter Stickstoff auf 0° gekühlt, dann 1,29 ^ml konzentrierte Salzsäure auf einmal zugegeben, wobei nach ungefähr 1 Minute die Substanz gelöst ist. Nun wird noch 7 Minuten bei 0 gerührt, dann werden auf einmal 1~5 ml Eisessig zugegeben, die Lösung wird gut durchgerührt und lyophilisiert. Das Lyophilisat wird in wenig Wasser gelöst, abermals lyophilisiert und anschliessend noch 3 Stunden bei Raumtemperatur am Hochvakuum

Ψ über Phosphorpentoxid/Kaliumhydroxid belassen.

Im Dünnschichtchromatogramm zeigt das erhaltene Do.triacontapeptidamid-trihydrochlorid folgende Rf-Werte : auf "Alox" D-O (Pa. Camag ; . - f"^Rf52A ° °'⁷¹ Aluminiumoxyd mit 8# Gips) L^Rf7Q ⁼ °'⁵²

auf Celluslose "Selecta" l44o ~^Rf45 ^{= Oj59}

(Pertigplatten der Pa. Schleicher ^Rf101A ⁼ °'^

und Schüll)

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Elektrophorese auf Cellulose "Selecta" 144O pH 1,9, 1 1/2 Stunden, 28o Volt, Laufstrecke : 4,8 cm zur Kathode.

Das Ausgangsmaterial kann wie folgt hergestellt werden: . . ,

Man*löst 100 .mg des geschützten Docosapeptidamids H-Thr(tBu)-Leu-Thr(tBu)-Gln-Asp(OtBu)-Leu-Asn-Lys(BDC)-Leu-His-Thr(tBu)-Phe-Pro-Gln-ThrCtBu)-Ala-Ile-Gly-Val-GIy-AIa-Pro-NH₂ (vgl. Beispiel. 2 unter 18.) sowie 52,4- mg | BOC-Cys-Gly-Asn-Leu-Ser(tBu)--Thr(tBu)-Cys-Val-Leu-Gly-OH in der Wärme in 0,75 ml Dimethylformamid kühlt die Losung auf Raumtemperatur ab, gibt 10,2 mg N-Hydroxysuccinimid und 13,8 mg Dicyclohexylearbodiimid zu und rührt 3 1/2 Stunden bei 45 · Anschliessend wird die Lösung zu 15 ml vorgelegtem peroxidfreiem Aether gegeben und der dabei ausgefallene weisse Niederschlag nach dem Trocknen einer Gegenstromverteilung nach Craig unterworfen : I29 mg des Produktes werden in das dritte und vierte Rohr eines Verteilungs- "

apparates (Phasenvolumen je 3 ^l) gegeben, wobei das Lösungsmittelsystem Methanol-Puffer-Chloroform-Tetrachlorkohlenstoff 11:3:6:7 (Puffer wie im Beispiel 1 unter 8) Verwendung findet. Man verteilt multiplikativ über insgesamt 200 Stufen (r = 117, K = 1,4). Aus dem durch Eindampfen

ΓΠ3.Χ

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der Fraktionen erhaltenen Produkt wird das Ammoniumacetat am Hochvakuum bei 40 absublimiert; man erhält das reine, geschützte Dotriacontapeptidamid. Die Rf-Werte im Dünnschichtchromatogramm auf Silicagel sind: Rf₇₀ = 0,69,- Rf₁₀₀ = 0,37; Rf₁₁₀ = 0,66.

• ■

Beispiel 7 :

17

Bmp-GIy-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Me t-Leu-GIy-Thr-Leu-Thr-GIn-Asp-Leu-Asn-Lys-Leu-His-Thr-Phe-Pro-GIn-Thr-Ala-Ile-GIy-VaI-GIy-AIa-Pro-NHp (Desamino-Leu * . ' "-Calcitonin M).

35 mg Bmp-Gly-Asn-Leu-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Cys-Met-Leu-Gly-Thr(tBu)-L@u-Thr(tBu)-Gln-Asp(OtBu)-Leu-Asn-Lys (BOCj-Leu-His-ThrCtBui-Phe-Pro-Gin-ThritBui-Ala-Ile-Gly-VaI-GIy-AIa-Pro-MH₉ werden in einem Kölbchen im Eisbad unter Stickstoff auf 0° gekühlt, dann 0,75 ml konzentrierte Salzsäure zugegeben und nach dem vollständigen Auflösen noch 7 Minuten bei 0° gerührt. Anschliessend wird am Hochvakuum eingeengt, der glasige Rückstand in 2 ml Wasser gelöst, lyophilisiert, abermals in 3 rol Wasser gelöst, nochmals lyophilisiert und 2 Stunden am Hochvakuum bei Raumtemperatur nachgetrpcknet. Im Dünnschichtchromatogramm zeigt das erhaltene Dotriacontapeptid-trihydrochlorid folgende Rf-Werte:

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	2050434
Rf52	= 0,78
"Rf45	= 0,68
Rf101A	= 0,71

auf "Alox? D-O (Fa. Carnag,

Aluminiumoxid mit 8 % Gips)

auf Cellulose "Selecta" l440

(Fertigplatten der Fa. Schleichter

und Schüll) ·

Elektrophorese auf Cellulose "Selecta" l44O = pH 1,9, 1 1/2 Stunden, 280 Volt, Laufstrecke = 3,9 cm zur

Kathode. ■

Das Ausgangsmaterial kann wie folgt hergestellt werden: ■

Man löst 101 mg'des geschützten Docosapeptidamids H-Thr (tBu) -Leu-Thr (tBu)'-Gln-Asp(QtBu) -Leu-Asn-Lys (BOC) Leu-His-Thr(tBu)-Phe-Pro-Gln-Thr(tBu)-Ala-Ile-Gly-ValGIy-AIa-Pro-NH₀ (vgl. Beispiel 2 unter .18. ) sowie 61,3 mg Bmp-Gly-Asn-Leu-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Cys-Met-Leu-GIy-OH (vgl. belg. Patent 737 89O) in der Wärme in 0,755 ml Dimethylformamid, kühlt die Lösung auf Raumtemperatur ab, gibt 10,3 N-Hydroxysuccininimid sowie 13*9 ^m§ Dicyclohexylcarbodiimid zu und rührt unter Stickstoff 3 1/2 Stunden bei 45°. Anschliessendwird die Lösung zu 20 ml peroxidfreiem Aether gegeben und der dabei ausgefallene weisse Niederschlag nach dem Trocknen einer Gegenstromverteilmig nach Craig unterworfen: 146 mg des Produktes werden in das dritte und vierte Rohr eines Verteilungsapparates (Phasenvolumen ,^: " je 3 ffll) gegeben, wobei das Lösungsmittelsystem Methanol-

109819/2249

Puffer-Chloroform-Tetrachlorkohlenstoff 11:3:9:6 (Puffer wie im Beispiel 1 unter 8,) Verwendung findet. Man verteilt multiplikativ über insgesamt 300 Stufen (r = 95*

max

K = 0,46). Aus dem durch Eindampfen der Fraktionen 78 - 102 erhaltenen Produkt wird das Ammoniumacetat am Hochvakuum bei 40 absublimiert, man erhält das reine, geschützte Dotriacontapeptidamid. Die Rf-Werte im Dünnschichtchromatogramm auf Silicagel sind': Rf = 0,44, Rf₁₀₇ = 0,61.

Beispiel 8 :

Bmp-Gly-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Met-Leu-Gly-Thr-Tyr-Thr-GIn-Asp-Phe-Asn-Lys-Phe-His-Thr-Tyr-Pro-Gln-Thr-Ala-Ile-Gly-Val-·

Gly-Ala-Pro-NH ■(Desamino-Tyr -Calcitonin M)

1OQ mg Bmp-Gly~Asn-Leu-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Cys-Met-Leu-Gly-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Gin-Asp(OtBu)-Phe-Asn-Lys(BOC)-Phe-His-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Pro-Gln-Thr(tBu)-AIa-Ile-Gly-Val-Gly-Ala-Pro-NHp werden bei 0° mit 2 ml konzentrierter, reiner Salzsäure Übergossen,, mit Stickstoff bespühlt und nach Auflösung (ca. 1-2 Min;) noch während weiterer 7 Minuten in verschlossenen Kölbchen bei 0 stehen gelassen. Man kühlt dann mit Trockeneis, evakuiert im Hochvakuum und engt die Lösung anschliessend bei 0 zum Sirup ein. Dieser wird in 2 ml Wasser gelost, lyophilisl^rt und der Rückstand nochmals in.3 ml Wasser gelöst und

109819/2249

lyophilisiert. Der Rückstand ist ein amorphes Pulver. Es zeigt bei der Dünnschichtchromatographie folgende

Rf-Werte; · ' \

auf "Alox^tr D-O : RfV₀ =,65, Rf _7Q = 0,76, auf Cellulose ("Selecta" l44o") : Rf_101A = 0,68.

Bei der pünnsehicht-Elektrophorese bei pH 1^9 (wie Beispiel 5) ist die Laufstrecke 2,4 cm zur Kathode.

Das Ausgangsmaterial kann wie folgt hergestellt werden:

166 mg Bmp-Gly-Asn-Leu-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Cys-Met-Leu-Gly-OH (vgl. belg. "Patent 737 890), 290 rag H-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Gin-Asp(OtBu)-Phe-Asn-Lys(BOC)-Phe-His-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Pro-Gin-Thr(tBu)-Ala-Ile-Gly-Val-Gly-Ala-Pro-NHp (vgl. Beispiel 1 unter 12.) und 21 mg N-Hydroxysuccinimid werden in 2,5 ml absolutem Dimethylformamid gelöst und mit 28 ml Dicyclohexylcarbodiimid versetzt. Man spült das Reaktionskölbchen kurz mit Stickstoff, verschliesst und rührt mit Magnet während 15 Stunden bei 45 » Der auskristallisierte Dicyclohexylharnstoff wird durch zentrifugieren abgetrennt und das rohe, geschützte Dotriacontapeptidamid aus der überstehenden Lösung durch Zugabe von 30 ml absolutem, peroxidfreien Aether ausgefällt und abfiltriert. Die Reinigung erfolgt mittels Craig-Verteilung im System Methanol-Puffer-Chloroform-Tetrachlorkohlenstoff (11:4:6:7; Volumenteile) [Puffer wie im Beispiel 1 unter 8.] Die laut DünnschichtChromatographie einheitlichen Haupt-

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fraktionen werden vereinigt, zur Trockne eingeengt und

* ο

das Ammoniumacetat im Hochvakuum bei 4O wegsublimiert.

Man erhält ein weieses, amorphes Pulver, das auf Silicagel •die folgenden Rf-Werte aufweist:

^Rf52A ⁼ °'²⁵' ^Rf100 ⁼ °'^{27i Rf}7O

Beispiel 9 ^:

Bmp-Gly-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Val-Leu-Gly-Thr-Leu-Thr-Gln-Asp-Leu-Asn-Lys-Le u-His-Thr-Phe-Pro-Gln-Thr-Ala-Ile-GIy-VaI-GIy-AIa-Pro-NH₀ (Desamino-Val -Leu¹²' '¹⁹-Calcitonin M)

53 mg Bmp-Gly-Asn-Leu-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Cys-Val-Leu-Gly-Thr(tBu)-Leu-Thr(tBu)-Gln-Asp(OtBu)-Leu-Asn-Lys(BOC) Leu-His-Thr(tBu)-Phe-Pro-Gln-Thr(tBu)-Ala-Ile-GIy-VaI-GIy-Ala-Pro-NH2 werden in einem Kölbchen im Eisbad unter Stickstoff auf O gekühlt, dann 1,1 ml konzentrierte Salzsäure zugegeben und nach dem vollständigen Auflösen (Dauer ca. 1 Min.)nach 7 Minuten bei O gerührt. Anschliessend wird am Hochvakuum eingeengt, der glasige Rückstand in 2 ml Wasser gelöst und lyophilisiert. Im Dünnschichtchromatogramm zeigt das erhaltene Dotriacontapeptidamid-trihydrochlorid folgende Rf-Werte :

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auf "Alox"» D-O (Pa. Camag, Rf₅₂ = O..75

Aluminiumoxid mit 8% Gips)

auf Cellulose "Selecta" l44O ' ' Γ Ri^₅ =0,72

(Fertigplatten der Fa. Schleicher 1 R^f _1OlA ⁼ °-*^9 · und Schüll)

Elektrophorese auf Cellulose "Seleta" l440 = pH !.,9, 1 1/2 Stunden,'28O Volt, Laufstrecke =4,0 cm zur

Kathode. · |

Das Ausgangsmaterial kann wie folgt hergestellt werden:
1. Bmp(TRI) -GIy-Asn-Leu-Ser (tBu) -Thr (tBu) -Cys (TRI) -VaL-Leu-G]y-CH

Man löst 3,79 g Bmp(TRI)-Gly-Asn-Leu-NH-NH₂ (vgl. belg. Patent 737 890) in 50 ml Dimethylformamid, kühlt auf -10°, tropft langsam 6,8l ml 2,15-n. Salzsäure in Essigester und dann 0,69 ml tert.Butylnitrit zu. Nach I5 Minuten bei -10 wird eine auf diese Temperatur gekühlte Lösung von 5,^7 g H-Ser(tBu)-Thr{tBu)-Cys(TRI)-VaI-Leu-Gly-OH (vgl. Beispiel 5 ■ unter 9.) und 2,85 ml Triäthylamin in 100 ml Dimethylformamid zugegeben. Nach 2 Stunden bei -10 und 15 Stunden bei 0° wird das,Reaktionsgemisch am Hochvakuum auf ca. 30 eingeengt und dann mit 100 ml Methanol versetzt. Man erwärmt die Suspension 5 Minuten auf 40 , rührt dann auf 0 ab, filtriert und wäscht den Niederschlag mit 50 ml kaltem

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Methanol. Nach Trocknen im Hochvakuum über Kaliumhydroxid und Phosphorpentoxid erhält man die reine Verbindung, die sich bei ca. 23O - 250 srsetzt . Sie weist im Dünnschi chtchromaogramm auf Silicagel folgende. Rf-Werte auf: im System Chloroform-Methanol (8:2) Rf = 0,22, Rf^ = 0,45, Rf₇₀ = 0,50, - ·

2. Bmp-Gly-Asn-Leu-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Cys-Val-Leu-Gly-OH '

3,87 g Bmp(TRl)-Gly-Asn-Leu-Ser(fBu)-Thr(tBu)-Cys(TRl)-Val-ißu-GIy-OH werden unter Erwärmen in 200 ml Dimethylformamid gelöst und nach Abkühlen auf Raumtemperatur im Verlauf von einer Stunde in eine.stark gerührte Lösung.von 6^35 g Jod in 1 Liter Methanol getropft. Anschliessend wird noch eine Stunde gerührt, die Lösung dann auf 0 gekühlt und mit 1,0-n. Natriumthiosulfat entfärbt. Nach Einengen im Wasserstrahl- und Hochvakuum auf ca. 50 ml fällt man mit Aether aus. Der Niederschlag wird bei 0° zweimal mit je 50 ml Wasser zerrieben und über KaIiumhydroxid und Phosphorpentoxid getrocknet. Dieses Produkt wird zur Reinigung einer Gegenstromverteilung im System Methanol-Puffer-Chloroform-Tetrachlokohlenstoff (5:2:3:1) unterworfen (Puffer;wie im Beispiel 1 unter 8.). Die einheitlichen Fraktionen (K=I,42) werden vereinigt, eingedampft und durch Trocknen bei 35 am Hochvakuum während 4 Stunden vom Ammoniumacetat befreit. Das auf diese Weise rein erhaltene Peptidderivat zeigt im

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2Q50V34

Dunnschichtehromatogramm auf Sillcagel folgende Rf-Werte: Rf₇₀ = 0,20, Rf₁₀₀ = 0,30, Rf₄₃₀ =0,25.

3. Bmp-Gly-Asn-Leu-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Cys-Val-Leu-Gly-Thr(tBu)-Leu-Thr(tBu)-Gln-Asp(OtBu)-Leu-Asn-Lys(BOC)-•Leu-His-Thr(tBu)-Phe-Pro-Gln-Thr(tBu)-Ala-Ile-Gly-Val-GIy-AIa-PrO-NH₂ . '

Man löst 101 mg des geschützten Docosapepidamids H-Thr - I (tBu)-Leu-Thr(tBu)-Gln-Asp(OtBu)-Leu-Asn-Lys(BOC)-Leu-Hls-Thr (tBu)-Phe-Pro-Gln-Thr(tBu)-Ala-Ile-Gly-Val-Gly-Ala-Pro-NHg (vgl. Beispiel 2 unter l8.)^s°VJie 52,8 mg Bmp-Gly-Asn-Leu-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Cys-Val-Leu-Gly-OH in der Wärme' in 0,755 ml Dimethylformamid, kühlt die Lösung auf Raumtemperatur ab, gibt 10,3 mg N-Hydroxysucciniimid sowie 13*9 mg Dicyclohexylearbodiimid zu und rührt 3 1/2 Stunden bei. 45°. Anschliessend wird die Lösung zu 20 ml peroxidfreiem Aether gegeben und der dabei ausgefallene, weisse Niederschlag nach dem Trocknen einer Gegenstromverteilung nach Craig unterworfen: 144 mg des Produktes werden in das dritte und vierte Rohr eines Verteilungsapparates (Phasenvolumen je 3 ml) gegeben, wobei das Lösungsmittelsystem Methanol-Puffer-Chloroform-Tetrachlorkohlenstoff 11:3:9:6 (Puffer wie im Beispiel 1 unter 8.) Verwendung findet. Man verteilt multiplikativ über insgesamt 350 Stufen (r = 125; K = 0,56).

max

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Aus dem durch Eindampfen der Fraktionen Nr. Il8 - I37 erhaltenen Produkt wird das Ammoniumacetat am Hochvakuum bei 40 absublimiert^ man erhält das reine, geschützte Dotriacontapeptidamid. Die Rf-Werte im Dünnschichtehromatogramm auf Silicagel sind : Rf₇₀ =0,49., Rf₁₀₇ = 0,60.

Beispiel 10 :

H-Cys-Gly-Asn-Leu-Ser-ThrrCys-Met-Leu-Gly-Thr-Leu-Thr-Gln- ^ Asp-Leu-Asn-Lys-Leu-His-Thr-Tyr-Pro-Gln-Thr-Ala-Ile-Gly-

Val-Gly-Ala-Pro-NHg χ 3HCl (Leu¹²'¹ '¹⁹-Tyr²²-Calcitonin M)

30 mg BOC-Cys-Gly-Asn-Leu-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Cys-Met-Leu-Gly-Thr(tBuO-Le^-Thr(tBu)-Gln-Asp(OtBu)-Leu-Asn-Lys(BOC)-Leu-His-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Pro-Gln-Thr(tBu)-Ala-Ile-Gly-Val-Gly-Ala-Pro-NHp werden in einem Kölbchen im Eisbad auf 0° gekühl tj dann unter Stickstoff 0,65 ml konzentrierte Salzsäure zugeben, wobei das Produkt nach ungefähr 1 Minute gelöst ist. Nun rührt man die Lösung noch 7 Minuten bei 0 und gibt dann 7,3 ml Eisessig zu. Die dabei erhaltene Lösung wird lyophilisiert, das Lyophilisat in wenig Wasser gelöst, abermals lyophilisiert und der weisse Rückstand noch 3 Stunden bei Raumtemperatur am Hochvakuum über Phosphorpentoxid/Kaliumhydroxid getrocknet. Im Dünnschichtchromatogramm auf Silicagel zeigt das erhaltene Dotriacontapeptidamid-trihydrochlorid folgende Rf-Werte:

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auf "Alox" "D-O (Pa. Carnage Aluminiumoxid mit o% Gips

Rf₅₂ = 0,50

₅₂ Rf₇₉ =0,58

auf Cellulose "Selecta" 144O FRf

"79

101A (Fertigplatten der Fa. Schleicher J Rf₂,^ = 0,60 ·

und Schüll)

Elektrophorese auf Cellulose "Selecta" l440 = pH 1,9, 1 1/2 Stunden, 280 Volt, Laufstrecke 4,8 cm Kathode,

Das Ausgangsmaterial kann wie folgt hergestellt i

werden: ■ ■ . ·

1. Z-Asn-Lys(BOC)-Leu-His-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Pro-Gln-Thr (tBu)-Ala-Ile-GIy-OH

Man löst 3,66 g Z-Asn-Lys(BOC)-Leu-HiS-NHNH₂ (vgl. Beispiel 2 unter 12.) in 32 ml Dimethylformamid, kühlt die Lösung auf -20° ab und gibt 3,75 ml 3,23-n. HCl in Dioxan sowie 0,718 ml t-Butylnitrit zugegeben. Die Lösung wird 20 Minuten beo -15° gerührt, auf -20° gekühlt und eine Lösung von 3,46 g H-Thr(tBu)-Tyr(tBu)~Pro-Gln-Thr(tBu)-Ala-He-GIy-OH χ AcOH (vgl. Beispiel l) in 52 ml Dirnethylformamjd, dann 2,08 ml N-Aethyldiisopropyiamin zugegeben. Diese Lösung wird 15 Stunden bei 0 stehen gelassen, dann auf 20 ml eingeengt, 200 ml Wasser zugegeben, der ausgefallene, weisse Niederschlag abfiltriert und noch zweimal aus Dimethylformamid -Wasser umgefällt.

Die erhaltene, dünnschichtchromatographisch einheitliche Substanz zersetzt sich bei ca. I76 unter Aufschäumen,

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Die Rf-Werte im Dünnschichtehromatogramm auf Silicagel sind: Rf_kxn *= 0,32, Rf₇₀ = 0,55, Rf₁₀₀ = 0,33-

2. Z-Asn-Lys(BOC)-Leu-His-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Pro-Gln-Thr(tBu)-AIa-IIe-GIy-VaI-GIy-AIa-PrO-NH₂

Man löst 3*79 S der unter 1 beschriebeneneVerbindung und 1,11 g H-Val-Gly-Ala-Pro-NH₂ in 43 ml Dimethylformamid., _ " gibt zu der Lösung 0,375 g N-Hydroxysuccinimid sowie 0,671 g Dicyclohexylcarbidiimid und rührt die erhaltene Lösung 15 Stunden bei 45°. Diese Lösung wird anschliessend zu 400 ml vorgelegtem, peroxidfreien Aether getropft, der Niederschlag abgenutscht* und aus Methanol-Essigester-Petroläther sowie Acetonnitril-Wasser umgefällt. Das erhaltene, praktisch reine Produkt zeigt im Dünnschichtehromatogramm auf Silicagel folgende Rf-Werte:
Rf₃₇ = 0,71,' Rf_üw· =0,62, Rf₁ ^ = 0,66.

3. H-Asn-Lys(BOC)-Leu-His-Ihr(tBu) -Tyr (tBu) -Pro-Gln-Thr(tBu) AIa-IIe-GIy-VaI-GIy-AIa-PrO-NH₂ χ ACOH

1,0 g des unter 2 beschriebenen Produktes wird in 80 ml 80$iger Essigsäure gelöst und unter Zusatz von 100 mg Palladiumkohle (l0# Pd) mittels Wasserstoff bei Raumtemperatur hydriert. Nach dem Filtrieren wird das Piltrat auf ca. 40 ml eingeengt und lyophilisiert. Das Produkt zeigt auf Silicagel folgende Rf-Werte: Rfw_£ = 0,48, Rf₇₀ = 0,48, Rf₁₀₇ = 0,68.

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4. Z-Thr(tBu)-Leu-Thr(tBu)-Gln-Asp(OtBu)-Leu-Asn-Lys " (BOC)-Leu-His-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Pro-Gln-Thr(tBu)-AIa-IIe-GIy-VaI-GIy-AIa-PrO-NH₂

705 mg Z-Thr(tBu)-Leu-Thr(tBu)-Gln-Asp(OtBu)-Leu-NHNH₂ (vgl. Beispiel 2) werden in der Wärme in 10 ml Dimethylformamid gelöst, die erhaltene Lösung auf -20 gekühlt und 0,584 ml 3,2-n. HCl in Dioxan sowie 1,043 ml t-Butylnitrit zugegeben. Die Lösung wird 15 Minuten bei -10° bis -15° gerührt, auf -20 gekühlt und eine Lösung von i 932 mg des unter 3. beschriebenen Produktes in 10 ml Dimethylformamid, dann 0,321 ml N-Aethyldiisopropylamin zugefügt. Man rührt diese Lösung anschliessend im Eisbad bei 0°, gibt im Verlauf von 5 Stunden 80,2 1 N-Aethyldiisopropylamin in 4 Portionen von je ca. 20 1 zu, lässt die Lösung · nach der letzten Basenzugabe 15 Stunden bei 0° sbsbai und tropft s.ie dann zu 100 ml vorgelegtem peroxidfreien Aether. Der dabei ausgefallene weisse Niederschlag wird nach' dem Abfiltrieren und' Trocknen einer Gegenstromverteilung nach Craig unter- "

worfen: 1,24 g. des erhaltenen^geschützten Docosapeptidamids werden auf das zweite bis vierte Rohr eines Verteilungsapparates (Phasenvolumen je 10 ml) verteilt, wobei das Lösungsmittelsystem Methanol-Puffer-Chloroform-Tetrachlorkohlenstoff (10:3:5:5) (Puffer wie im Beispiel 1 unter 8.) Verwendung findet. Man verteilt multiplikativ über insgesamt 300 Stufen. Aus den erhaltenen reinen Fraktionen wird das Ammoniumacetat am Hochvakuum bei 40 absüblimiert, man erhält das reine, geschützte Docosapeptidamid.

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5. · H-Thr(tBu)-Leu-iI?hr(tBu)-Gln-Asp(OtBu)-Leu-Asn-Lys (BOC)-Leu-His-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Prο-Gin-Thr(tBu)- ' Ala-Ile-Gly-Val-Gly-Ala-Pro-NH,

100 mg des unter 4. erhaltnen Produktes werden in 30 ml iger Essigsäure gelöst und unter Zusatz von 20 mg Palladiumkohle (lO# Pd) mit Wasserstoff 20 Stunden, bei Raumtemperatur hydriert. Dann wird filtriert, das Piltrat auf ca. 10 ml eingeengt und lyophilisiert. Das Lyophilisat wird "* in wenig Methanol gelöst, mit gesättigter Natriumhydrogencarbonatlösung auf ein pH zwischen 7 und 8 eingestellt und dann in eine 0,1-n. Natriumcarbonatlösung getropft. Man erhält einen weissen Niederschlag der folgende Rf-Werte im Dünnschichtehromatogramm auf Silicagel zeigt: R 0,57, Rf₇₀ = 0,65, Rf₁₀₀ = 0,24,

6. BOC-Cys-Gly-Asn-Leu-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Gys'-Met-Leu-'Gly- * Thr(tBu)-Leu-Thr(tBu)-GIn-Asp(0tBu)-Leu-Asn-Lys(BOG)-Leu-His-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Pro-Gln-Thr(tBu)-Ala-Ile-Gly- VaI - GIy -Al a -Pro -NH,

Man löst 60 mg des unter 5· beschriebenen Docosapeptidamids sowie 31,4 mg BOC-Cys-Gly-Asn-Leu-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Cys-Met-Leu-GIy-OH in der Wärme in 0,437 ml Dimethylformamid, kühlb die Lösung auf Raumtemperatur ab, gibt 6,0 mg N-Hydroxysuccinimid

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sowie 8,0 mg Dicyclohexylcarbodiimid zu und rührt unter Stick stoff 3 1/2 Stunden bei 45°. Anschliessend wird die Lösung zu 9 ml peroxidfreiem Aether gegeben und der dabei ausgefallene wei.sse Niederschlag nach dem Trocknen einer Gegenstromverteilung nach Craig unterworfen: 80 mg des Produktes werden in das dritte Rohr eines Verteilungsapparates (Phasenvolumen je 3 ml) gegeben., wobei das Lösungsmittelsystem Methanol-Puffer-Chloroform-Tetrachlorkohlenstoff 11:3:6:7 (Puffer wie im Beispiel 1 unter 8.) Verwendung findet. Man verteilt multiplikativ über insgesamt 200 Stufen (r = 100

Ul el Jt

K = 1,0). Aus den reinen-Fraktionen wird das Ammoniumacetat am Hochvakuum bei 40° absublimiert; man erhält das geschützte Dotriacontapeptidamid. Die Rf-Werte im Dünnschichtchromatogramm auf Silicagel wird Rf₇₀ = 0,50 und Rf₁₀₀ =0,44.

Beispiel 11:

J — j J

H-Cys-Gly-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Val-Leu-Gly-Thr-Leu-Thr-Gln- · f Asp-Leu-Asn-Lys-Leu-His-Thr-Tyr-Pro-Gin-Thr.-Ala-Ile-Gly-Val-

GIy-AIa-PrO-NH₂ (VaI -Leu¹²' ^j19 -Tyr²²-Calcitonin M)

112,5 mg BOC-Cys-Gly-Asn-Leu-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Cys-Val-Leu-Gly-Thr(tBu)-Leu-Thr(tBu)-Gln-Asp(OtBu)-Leu-Asn-Lys (BOC)-Leu-His-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Pro-Gln-Thr(tBu)-Ala-Ile-Gly-Val-ffily-Ala-Pro-NHp löst man in 0,35 ml 98#iger Ameisensäure, kühlt auf 0°, versetzt mit 1,2 ml eiskalte^ konzentrierter Salzsäure und lässt 12 Minuten bei 0° stehen. Dann gibt .

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man 15 ml Eisessig zu, kühlt auf -25 und lyophilisiert

* ο

unter anfänglicher Kühlung auf -25 . Das erhaltene Produkt löst man in 3 ^ml Wasser und lyophilisiert abermals. Dabei erhält man das VaI⁸, Leu¹²'¹⁶'¹⁹, Tyr²²-Calcitonin M als weisses Pulver, das bei Dünnschichtelektrophorese (Avicel Fertigplatten) (pH = 1,9j 2 Stunden 16 V/cm) eine Laufstrecke von 4,3 ein gegen die Kathode aufweist. Bei Dünnschi-ehtchromatographie auf Aluminiumoxidplatten (D-O der Fa. Camag, mit 12 % Gipszusatz) ist Rf₅₂ = 0,48. .

Das Ausgangsmaterial kann wie folgt hergestellt werden:

171 mg BOC-Cys-Gly-Asn-Leu-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Cys-Val-Leu-Gly-OH (vgl. Beispiel 2) und 266 mg H-Thr(tBu)-Leu-Thr(tBu)-Gln-Asp(OtBu)-Leu-Asn-Lys(BOC)-Leu-His-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Gln-Thr(tBu)-Ala-Ile-GIy-VaI-GIy-Ala-Prο-NH₂ (vgl. Beispiel 10) we'rden mit 2 ml Dimethylformamid und 20 mg N-Hydroxysuccinimid versetzt. Man rührt 1 Stun.de bei 45 ψ und kühlt dann.auf 30 ab. Dann gibt man.30 mg Dicyclohexylcarbodiimid zu, rührt l6 Stunden, bei 35 - 40° und transferiert die Reaktionsmasse sodann in 50 ml Aether. Nach 5 Stunden bei 0° filtriert man das ausgeschiedene Rohprodukt ab, trocknet es und unterwirft es einer Gegenstromverteilung im System Chloroform-Tetrachlorkohlenstoff-Methanol-Puffer (6:7:11:3., Volumteile ) (Puffer wie im Beispiel 1 unter 8). Nach 30Ö Verteilungsschritten befindet sich die reine Substanz in den Ele·· menten 157 — I8I (K =1,3). Man vereinigt diese Fraktionen,

109819/22ASj'

dampft im Vakuum zur Trockne ein und befreit den Eindampfrückstand vom Ammoniumacetat durch Trocknen bei 45 und 0,01 Torr.

Das gereinigte, geschützte Peptid zeigt bei Dünnschicht Chromatographie auf Silicagel Rf(T₂A ⁼ °'²9.> Rf₇₀ = 0,46.

Beispiel 12:

Bmp-Gly-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-VaI-Leu-Gly-Thr-Leu-Thr-GIn-Asp-Leu-Asn-Lys-Leu-His-Thr-Tyr-Pro-Gln-Thr-Ala-Ile-Gly-Val-Gly-Ala-Pro-NH₂ (Desamino. -VaI -Leu¹²'¹ '¹^ -Tyr²²-Calcitonin).

17 mg Bmp-Gly-Asn-Leu-SeritBuO-ThritBui-Cys-Val-Leu-Gly-Thr(tBu)-Leu-Thr(tBu)-Gln-Asp(OtBu)-Leu-Asn-Lys (BOC)-Leu-His-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Pro-Gln-Thr(tBu)-Ala-Ile-Gly-Val-Gly-Ala-Pro-NHp versetzt man mit 0,5 ml eiskalter,

J konzentrierter Salzsäure, lässt 12 Minuten bei 0° stehen, . " evakuiert dann zur Entfernung der gasförmig gelöster Salzsäure 1 Minute bei 0° und 0*01 Torr, gibt dann 6 ml Eis-

essig zu und lyophilisiert. Man erhält 15 mg Desamino-Val ,

Leu¹²V¹^'¹^-Tyr²²-Calcitonin M-dihydrochlorid als fast farbloses Pulver. Bei DünnschichtChromatographie auf Aluminiumoxid (D-O der Fa. Camag, 12$ Gips) ist Rf₅₂ = 0,6; Rf„_g = 0,72.

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Das »Ausgangsmaterial kann wie folgt hergestellt werden: ,

48 mg Bmp-Gly-Asn-Leu-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Cys-Val-Leu-Gly-OH (vgl. Beispiel 9) , 77 mg H-Thr(tBu)-Leu-Thr (tBu)-Gln-Asp(OtBu)-Leu-Asn-Lys(BOC)-Leu-His-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Pro-Gln-Thr(tBu)-Ala-Ile-Gly-Val-Gly-Ala-Pro-NH₂ (vgl. Beispiel 10), 5 mg N-Hydroxysuccinimid.und OJ ml Dimethylformamid werden 90 Minuten bei 45° gerührt

^ und darin 10 ml Dicyclohexylcarbodiimid zügegeben. Nach weiteren 16 Stunden Rühren bei 40 - 45 trägt man in 10 ml Aether ein,, lässt über Nacht bei 0 stehen, zentrifugiert den feinen Niederschlag ab, wäscht ihn mit Aether und trocknet ihn bei 4o und 11 mm Hg. Zur Reinigung fällt man zweimal aus Dimethylformamid-Aether um; hierauf chromatographiert man nach Lösen im Methanol über eine in Methanol bereitete Säule (0 - 2,8, h = 40 cm) aus Sephadex LH-20.

ft Man eluiert mit Methanol, wobei man Fraktionen ä 3 ^m^- auffängt, Die im UV-absorbierenden Fraktionen dampft man zur Trockne ein und prüft ihre Reinheit durch Dünnschichtchromatographie auf Silicagelplatte in den Systemen52j52A, 70 und 100. Man vereinigt die reinen Fraktionen, dampft zur Trockne ein und erhält dabei 40 mg geschütztes Dotriacontapeptid.

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Beispiel

H-Cys-Gly-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Met-Leu-Gly-Thr-Leu-Thr-GIn-Asp-Phe-Asn-Lys-Phe-His-Thr-Phe-Pro-Gln-Thr-Ala-Ile-GIy-Val-Gly-Ala-Pr.o-NHg. 3ICl(Leu¹²-Calcitonin M)

auf Cellulose "Selecta" 1440 (Pa. Schleicher und Schüll)

Rf₄₅ = 0,61

₄₅

0,60

Elektrophorese auf Cellulose "Selecta" l44O, pH 1,9,.

1 1/2 Stunden Laufzeit, 280 V, Laufstrecke : 5,1 cm zur Kathode.

60 mg BOC-Gys-Gly-Asn-Leu-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Cys-Met-Leu-Gl.y-Thr (tBu) -Leu-Thr (tBu) -Gln-Asp (OtBu) -Phe -Asn-Lys-(BOC)-Phe-His-Thr (tBu)-Phe-Pro-Gln-Tlir(tBu)-Ala-Ile-Gly-Val-Gly-Ala-Pro-NHp werden in einem Kölbchen im Eisbad unter Stickstoff auf 0° gekühlt, dann 1,29 ml konzentrierte Salzsäure auf einmal zugegeben, wobei nach ungefähr 1 Minute die Substanz gelöst ist. Nun wird noch 7 Minuten bei 0° gerührt, dann werden auf einmal I5 ml Eisessig zugegeben, die Lösung wird gut durchgerührt und lyophilisiert. Das Lyophilisat wird in wenig Wasser gelöst, abermals lyophilisiert und anschllessend noch 3 Stunden bei Raumtemperatur am Hochvakuum über Phosphorpentoxid/Kaliumhydroxid 'belassen.

Im Dünnschichtehromatogramm zeigt das erhaltene Dotriacontapeptidamid-trihydrochlorid folgende Rf-Werte:

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- 118 - ^ UO U 4

Das„Ausgangsmaterial kann wie folgt hergestellt ': werden:

1. Z-Thr(tBu)-Leu-Thr(tBu)-Gln-Asp(OtBu)-Phe-NH-NH₂

Das im belgischen Patent 737 89O beschriebene Tetrapeptidderivat Z-Thr(tBu)-Gln-Asp(OtBu)-Phe-OMe wird in Methanol, in Gegenwart von Palladiumkohle mit Wasserstoff ' decarbobenzoxyliert und das erhaltene H-Thr(tBu)-Gln-Asp (OtBu)-Phe-OMe mit Z-Leu-ONP in Dimethylformamid zum Z-

P Leu-Thr(tBu)-Gin-Asp(OtBu)-Phe-OMe kondensiert, das aus

ο 20

Methanol + Wasser kristallisiert. P. 204 - 205 > LaJ₀ =

+6° (c = 1,978 in Chloroform).

Dieses Pentapeptidderivat wird in Methanol, in Gegenwart von Palladiumkohle durch Hydrierung decarbobenzoxyliert und das erhaltene Produkt mit Z-Thr(tBu)-OSU in Dimethylformamid zu Z-Thr(tBu)-Leu-Thr(tBu)-Gin-Asp(OtBu)-Phe-OMe kondensiert. Dieses schmilzt, nach Fällung aus Methanol + Wasser, bei 197 - I99⁰; [α]ί:⁰ = +12° (c·= 1,828 in Chloroform). "^ Der Hexapeptidmethylester wird mit Hydrazinhydrat in Methanol in das Hydrazid Z-Thr(tBu)-Leu-Thr(tBu)-Gln-Asp(OtBu)-Phe-NH-NH₀ übergeführt. Dieses wird aus Dimethylformamid + Was-

Dei d.d.O - cLdL } Id]

(c = 1,65 in Dimethylformamid).

ser umgefällt und schmilzt dann bei 220 - 221°; ta] = -65°

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2. H-Asn-Lys (BOC) -Phe -His -Thr (tBu) -Phe -Prο-Gln-Thr (tBu) -

AIa-IIe-GIy-VaI-GIy-AIa-PrO-NH₂ (Acetat).

Das im belgischen Patent 737 890 beschriebene Z-Asn-Lys(BOC)-Phe-His-Thr(tBu)-Phe-Pro-Gln-Thr(tBu)-Ala-Ile-Gly-OH · wird mit dem darin ebenfalls beschriebenen Tetrapeptidamid H-VaI-GIy-Ala-Pro-NHp nach Weygand-Wünsch mit Dicyclohexylcarbodiimid in Gegenwart von N-Hydroxysuccinimid in Dimethylformamid bei ^5° kondensiert. Das Hexadecapeptidderivat Z- (| Asn-Lys (BOC)-Phe-His-Thr( tBu )-Phe-Pro-Gln-Thr( tBu)-Ala-Ile-GIy-VaI-GIy-AIa-Pro-NHp wird durch Eintropfen in Aether ausgefällt, das abgetrennte Pulver aus Methanol + Chloroform + Petroläther umgefällt und einer 850-stufigen Gegenstromverteilung nach Craig im System Acetonitril-Puffer-Chloroform-Methanol (1:1:1:1, Vol.teile; Puffer = 5 g Ammoniumacetat in 1 Liter 2n. Essigsäure gelöst) unterworfen. Das Hexadecapeptidderivat zeigt K = Oji 33* i^m Dürinschichtchromatogramm an Silicagel ist Rf₇₀ = 0,50; Rf_qg = 0,4l; Rf₅₂ = 0,23. Das Pro- ' dukt wird zwecks Decarbobenzoxylierung in SO^iger Essigsäure hydriert. Das erhaltene Monoacetat des H-Asn-Lys(BOC)-Phe-His-Thr(tBu)-Phe-Pro-Gln-Thr(tBu)-Ala-Ile-Gly-Val-Gly-Ala-Pro-NHp'zeigt im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel Rf₁₀₀ = 0,18.

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3. H-Thr(tBu)-Leu-Thr(tBu)-Gin-Asp(OtBu)-Phe-Asn-Lys(BOC)- ·

Phe-His-Thr(tBu)-Phe-Pro-Gln-Thr(tBu)-Ala-lie-Gly-Val-GIy-AIa-PrO-NH₂

Das unter 1. beschriebene Z-Thr(tBu)-Leu-Thr(tBu).-GIn-; Asp(OtBu)-Phe-NH-NHp wird mit dem unter 2. beschriebenen Hexa- ' decapeptidamidmonoacetat nach der Azidmethode in der im Beispiel unter 4. angegebenen Weise kondensiert. Durch Eintropfen in fc Aether erhält man das Docosapeptidderivat in Form eines Pulvers, das einer 700-stufigen Gegenstromverteilung nach Craig im System Methanol-Puffer-Chloroform-Tetrachlorkohlenstoff (4:2:1:1, Vol.teile) unterworfen wird. Das Docosapeptidderivat zeigt K = 0,7; Rf₇₀ = 0,55; Rf₁₀₀ - 0,43; Rf₁₀₇ = 0,65 (an Silicagel).

Zur Entfernung der Carbobenzoxygruppe wird in 80%iger Essigsäure hydriert. Das decarbobenzoxylierte Produkt wird in Essigester + n-Butanol aufgenommen, mit verdünnter Sodalösung und dann mit Wasser gewaschen. Man erhält so das im Titel angegebene Docosapeptidderivat, das im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel Rf₁₀₀ = 0,21 zeigt.

4. BOC-Cys-GIy-Asn-Leu-Sef(tBu)-Thr(tBu)-Cys-Met-Leu-GIy-Thr(tBu)-Leu-Thr(tBu)-Gln-Asp(0tBu)-Phe-Asn-Lys(B0C)-Phe-His-Thr(tBu)-Phe-^Pro-Gln-Thr(tBu)-Ala-Ile-Gly-Val-Gly-Ala-Pro-NH₂ : .

Das unter 3.· beschriebene Docosapeptidderivat wird nach

dem im Beispiel 6 angegebenen Verfahren mit BOC-Cys-GIy-Asn-

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Leu-Ser(tBu)_rThr(tBu)-Cys-Val-Leu-Gly-OH kondensiert. Das Dotriacontapeptidderivat wird durch Eintropfen in Aether als Pulver erhalten, das einer 400-stufigen Gegenstromverteilung nach Craig im System Methanol-Puffer-Chloroform-Tetrachlorkohlenstoff (11:3:6:7; Vol.teile) unterworfen wird. Pur das reine Produkt ist K =1,0; Rf₁₀₇ = 0,73 (an. Silicagel).

Beispiel l4:

H-Cys-Gly-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Met-Leu-Gly-Thr-Tyr-Thr-Gln-Asp-Leu-Asn-Lys-Phe-His-Thr-Phe-Pro-Gin-Thr-Ala-lie-GIy-VaI-GIy-Ala-Pro-NHp, 3 HCl (Leu -Calcitonin M).

6o mg ■BOC-Cys-Gly-Asn-Leu-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Cys-Met-Leu-Gly-Thr(tBu)-Tyr-Thr(tBu)-Gln-Asp(OtBu)-Leu-Asn-Lys(BOC)-Phe-His-Thr(tBu)-Phe-Pro-GIn-Thr(tBu)-Ala-Ile-Gly-Val-Gly-Ala-Pro-NHp werden in einem Kölbchen im Eisbad unter Stickstoff auf 0° gekühlt, dann 1,29 ml konzentrierte Salzsäure auf einmal zugegeben, wobei nach ungefähr 1 Minute die Substanz gelöst ist. Nun wird noch 7 Minuten bei 0° gerührt, dann werden auf einmal 15 ml Eisessig zugegeben, die Lösung wird gut durchgerührt und lyophilisiert. Das Lyophilisat wird in wenig Wasser gelöst, abermals lyophilisiert und anschliessend noch 3 Stunden bei Raumtemperatur am Hochvakuum über Phosphorpentoxid/Kaliumhydroxid belassen.

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Im Dünnschichtehromatogramm zeigt das erhaltene Dotriacontapeptidamid-trihydrochlorid folgende Rf-Werte : auf "Alox" D-O (Pa. Camag; f^Rf52 ⁼ °

Aluminiumoxyd mit 8$ Gips) L^Rf7Q = ^Q*&7

auf Cellulose "Selecta" l44O - f^Rf45 ^{= 0}^

(Fertigplatten der Pa. Schleicher [Rf₁-.= 0,57 und Schüll) . .

Elektrophorese auf Cellulose "Selecta" 1440, pH 1,9, 1,5 Stunden, 280 Volt, Laufstrecke 5*5 cm zur Kathode. Das Ausgangsmaterial kann wie folgt hergestellt werden: . -

1. Z-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Gin-Asp(OtBu)-Leu-NH-NH,

Z-Asp(0tBu)-0NP wird mit H-Leu-OMe, HCl unter Zusatz von N-Methylmorpholin in Dimethylformamid zu Z-Asp(OtBu)-Leu-OMe kondensiert. Das Produkt kristallisiert aus Aether + Petroläther. P. 6l - 62°. [a]p°= -27° ( c = 1,682 in Methanol). Es

^ wird in Methanol unter Zugabe von Chlorwasserstoff in Gegen-

wart von Palladiumkohle mit Wasserstoff decarböbenzoxyliert.

Das erhaltene H-Asp(0tBu)-Leu-0Me wird mit Z-GIn-ONP in Dimethylformamid unter Zusatz von N-Methylmorpholin zu Z-Gin-Asp(OtBu)-Leu-OMe kondensiert. Dieses kristallisiert aus Aceton. + Petroläther. P. 184 - 185°. M^⁰ = -37° (c = 1,891 in Methanol). Das Produkt wird in Methanol in Gegenwart von Palladiumkohle hydriert. Das erhaltene H-Gln-Asp(OtBr)-Leu-OMe wird in Dimethylformamid mit Z-Thr(tBu)-OSU zu Z-Thr(tBu)-Gin-Asp ' (OtBu)-Leu-OMe kondensiert, das aus Methanol + Wasser kristalli-

109819/2249 "

siert. F. 175 - l80°. La]^⁰ = -28° (c = 1,95 in Methanol). Durch Hydrierung in Methanol in Gegenwart von Palladiumkohle erhalt man daraus das H-Thr(tBu) -Gln-Asp(OtBu) -Leu-OMe. Dieses wird mit Z-Tyr(tBu)-0H in Dimethylformamid in Gegenwart von Dicyclohexylcarbodiimid zu Z-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Gln-Asp(0tBu)-Leu-0Me kondensiert, welches aus Methanol + Wasser kristallisiert. P. I76 - 185°. Ia]^⁰ = + 1° ( c = 2,005 in Chloroform). Die Carbobenzoxygruppe wird in Methanol in Gegenwart von Palladiumkohle abhydriert und das er-

'·■'■■ i

haltene H-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Gin-Asp(OtBu)-LeU-OMe mit Z- '

Thr(tBu)-OSU in Dimethylformamid kondensiert. Man fällt das Z-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Gin-Asp(OtBu)-Leu-OMe aus Methanol +Wasser. F. 153 - 159°. Ia]J"⁰ = -10° ·( G = 1,981 in Methanol). Durch Umsetzung des Methylesters mit Hydrazinhydrat in Methanol erhält man das Z-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Thr (tBu)-Gln-Asp(OtBu)-Leu-NH-NHp, das aus Methanol + Wasser als Pulver ausgefällt wird. Es schmilzt bei I75 - 204°.

2. H-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-GIn-AsP(OtBu)-LeU-ASn- ' Lys(BOC)-Phe-His-Thr(tBu)-Phe-Pro-GIn-Thr(tBu)-AIa-Ile-Gly-Val-Gly-Ala-Pro-NHg

.Z-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Gln-Asp(OtBu)-LeU-NHNH₂ wird'mit dem Hexadecapeptidamid-mohoacetat H-Asn-Lys(BOC)'-Phe-His-Thr(tBu)-Phe-Pro'-Gln-Thr (tBu) -Ala-Ile-Gly-Val-Gly-

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Ala'-Pro-NEU, AcOH (vgl, Beispiel 13) nach der Azidmethode wie im Beispiel 10 unter 4. angegeben kondensiert und das durch Eintropfen in Aether erhaltene Pulver einer 630-stufigen Gegenstromverteilung nach Craig im System Methanol-Puffer-Chloroform-Tetrachlorkohlenstoff (4:1:2:2, Vol..teile) unterworfen. Für das Docosapeptidderivat ist K = 0,6 ; Rf₁₀₀ = 0,38 (an Silicagel). Das Produkt wird in $0$iger Essigsäure hydriert, das decarbobenzoxylierte Produkt in Essigester + n-Butanol aufgenommen, die Lösung mit verdünnter Sodalösung und mit Wasser gewaschen und eingedampft. Im Dünnschichtchromatο-gramm an Silicagel· ist Rf₁₀₀ = 0,33; Rf₇₀ = 0,79·

3. BOC-Cys-Gly-Asn-Leu-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Cys-Met-Leu-Gly-Thr (tBu) -Tyr-Thr (tBu) -Gin-Asp (OtBu) -Leu-Asn-Lys (BOC.) Phe -Hi s -Thr (tBu) -Phe -Pro -Gln-Thr (tBu) -Ala -He -GIy -VaI-GIy-AIa-PrO-NH₂

Das unter 2. erhaltene Docosapeptidderivat wird nach

dem im Beispiel 6 angegebenen Verfahren mit BOC-Cys-Gly-Asn-Leu-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Cys-Val-Leu-Gly-OH kondensiert. Durch Eintropfen in Aether erhält man das Dotriacontapeptidderivat als Pulver. Dieses wird einer 230-stufigen Gegenstromverteilung' im System Methanol-Puffer-Chloroform-Tetrachlorkohlenstoff (11:3:6:7* Vol.teile) Unterworfen; K = 0,9· Das Produkt zeigt im Dünnschichtchromatogramm an" Silicagel Rf_7n = 0,67; R 0,84; Rf₁₀₀ = 0,40.

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Beispiel 15 :

H-Cys-Gly-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Met-Leu-Gly-Thr-Tyr-Thr-GIn-Asp-Phe-Asn-Lys-Leu-Hi s-Thr-Phe-Prο-GIn-Thr-Ala-Ile-GIy-VaI-GIy-AIa-PrO-NH₀, 3HCl (Leu¹⁹-Calcitonin M)

6θ mg BOC-Cys-Gly-Asn-Leu-Ser(tBu)-Thr(tBu)-CysHVIet--Leu-Gly-Thr(tBu) -Tyr(tBu)-Thr(tBu) -Gin-Asp (OtBu) -Phe-Asn-Lys-(BOC)-Leu-His-Thr(tBu)-Phe-Pro-Gln-Thr(tBu)-Ala-Ile-Gly- ^

VaI-GIy-Ala-Pro-NH_p werden in einem Kölbchen im Eisbad unter Stickstoff auf 0° gekühlt, dann 1,29 ml konzentrierte Salzsäure auf einmal zugegeben, wobei nach ungefähr 1 Minute die Substanz gelöst ist. Nun wird noch 7 Minuten bei 0° gerührt, dann werden auf einmal 15 ml Eisessig zugegeben, die Lösung wird gut,durchgerührt und lyophilisiert. Das Lyophilisat wird in wenig Wasser gelöst* abermals lyophilisiert und anschliessend noch 3 Stunden bei Raumtemperatur am Hochvakuum über Phosphorpentoxid/Kaliumhydroxid belassen. |

Im Dünnschichtehromatogramm zeigt das erhaltene Dotriaconatapeptidamid-trihydrochlorid folgende Rf-Werte: auf "Alox" D-O (Fa. Camag, f^Rf52

Aluminiumoxid mit 8$ Gips) l?^f7Q

auf Cellulose "Selecta" i^

(Pertigplatten der Fa. Schleicher i?^fl01A und Schüll)

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Elektrophorese auf Cellulose "Selecta" l440, pH 1,9,

·*
1,5 Stunden, 280 V, Laufstrecke zur Kathode 5*6 cm.

Das Ausgangsmaterial kann wie folgt hergestellt werden:
1. H-Asn-Lys(BOC)-Leu-His-Thr(tBu)-Phe-Pro-GIn-Thr

(tBu)-AIa-IIe-GIy-VaI-GIy-AIa-PrO-NH₂

Z-Asn-Lys(BOC)-Leu-Hi s-Thr(tBu)-Phe-Pro-GIn-Thr (tBu)-Ala-Ile-GIy-OH (Beispiel 2, 13) wird mit H-VaI-GIy- W Ala-Pro-NHp (Beispiel 2, 16) mittels Carbodiimid + N-Hydroxysuccinimid in Dimethylformamid bei 45 kondensiert und das durch Eintropfen in Aether erhaltene Pulver wird einer 700-stufigen Gegenstrumverteilung nach Craig im System Acetonitril -Puffer-Chloroform-Methanol (gleiche Volumenteile, Puffer: 5*0 g Ammoniumacetat in 1 Liter 2n. Essigsäure gelöst) unterworfen..Die erhaltene, reine Fraktion ( K-Wert = 0,54, Rf-Wferte an Silicagel : Rf₇₀ = 0,66, Rf₁₀₀ =0,32, Hf^ = 0,39)

wird wie üblich in 80$iger Essigsäure hydriert; man erhält

das Hexadecapeptid-monoacetat. Rf-Werte an Silicagel :

Rf₇₀ = 0,53; Rf₁₀₇ = 0,57; Rf₄₃₁₅ = 0,46.

2. H-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Gin-Asp(OtBu)-Phe-Asn-

Lys(BOC)-Leu-His-TfarCtBu)-Phe-Pro-GIn-Thr(tBu)-AIa-He-GIy-VaI-GIy-AIa-PrO-NH₂ ^:

Z-Thr (tBu) -TyKtBu)-ThFCtRu) -σΐη-Asp(OtBu) -Phe-NH-NH₂ (vgl. belgisches Patent 737 h_y^ Beispiel 2, 28) wird mit dem Hexadecapeptidamid-monoaeetat H-Asn-Lys (BOC )-Leiu-His-Thr

10981 i/22 4 a

(tBu)-Phe-Pro-Gln-mr(tBu)-Ala-Ile-Gly-Val-Gly-Ala-Pro-NHg, AcOH nach der.Azidmethode ms im Beispiel 10 unter 4. angegeben kondensiert Das durch Eintropfen, in Aether erhaltene Pulver wird einer 500-stufigen Gegenstromverteilung nach Craig im System Methanol-Puffer-Chlorofoms-Tetrachlorkohlenstoff (4:1:2:2, Vol.teile) unterworfen. Aus dem gewonnenen reinen Fraktionen ,CK-Wert Oj6) wird das Amraoniumaeetat absubliiniert. Das erhaltene geschützte Eocosapeptidamid weist auf Silicagel,folgende Rf-Werte auf: Rf„_ = 0,72; Rf,„ = 0,44. Das Produkt wird wie üblich in 80$iger Essigsäure hydriert. Durch Aufnehmen in Essigestern-Butanol, Waschen Mit verdünnter Sodalösung und Neutralwaschen mit Wasser und Eindampfen wird das im Titel genannte Docosapeptidamid erhalten; Rf₁₀₀ = 0*36 (an Silicagel).

dem im Beispiel 6 angegebenen Verfahren mit BOC-Cys-Gly-Asn-Leu-Ser (tBu)-Thr(tBa)-Cys-Met-Leu-Gly-0H kondensiert. Durch Eintropfen in Aether erhält man das Dotriacontapeptidderivat als Pulver. Es wird einer 200-stufigen Gegenstromverteilung

3." BOC-Cys-Gly-Asn-Leu-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Cys-Met-Leu-Gly-Thr (tBu)-lyr( tBu)-Thr (tBu)-Gln-Asp ( OtBu)-Phe-Asn-Lys (BOC) Leu-His-"Ehr(tBu)-Phe-Pro-Gln-Thr (tBu) -Ala-I le-GIy-VaI-GIy-AIa-PrO-IH₂

Das unter 2- erhaltene Doeosapeptidderivat wird nach

109819/2249

im System Methanol-Puffer-Chloroform-Tetrachlorkohlenstoff ("11:3:6:7, Vol.teile) unterworfen; K = 1,2. Das Produkt zeigt- im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel Rf_7n =0,5·

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Claims (1)

1. Patentansprüche : .

   1. . Verfahren zur Herstellung neuer Peptide, dadurch gekennzeichnet, dass man Dotriacontapeptidamide der Formel I

   1Γ 2 3 4 56 7J 8 9 10 11 ' 12 13 14

   H-Cys-Gly-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys- X -Leu-Gly-Thr-Tyr-Thr-Gln-· ■

   15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 j

   Asp-Phe-Asn-Lys-Phe-Hi s-Thr-Phe-Pro-Gln-Thr-Ala-Ile-GIy-29 30 31 32.

   VaI-GIy-Ala-Prο-MH₂,·.„-

   worin X für den L-Methionin-, L-Valin-, L-Nörvalin~, L-Leu- ' ' ein-, L-Isoleucin-, L-Norleucin- oder L-a-Aminobuttersäurerest. steht und worin mindestens eine der Aminosäuren in den Stellungen 11, 12, 16, 17, 19/ 20, 22 und 24 gegen eine andere Aminosäure ausgetauscht ist, und zwar L-Threonin gegen L-Lysin, L-Tyro- ' " |

   12 ' ι fs

   sin gegen L-Leucin, L-Phenylalanin gegen L-Leucin, L-Aspa-

   raginsäure ' gegen L-Histidin, L-Phenylalanin¹^ gegen L-Leucin,

   20 V?

   L-Histidin gegen L-Glutamin, L-Phenylalanin gegen L-Tyro-

   24'

   sin und L-Glutamin gegen L-Arginin, ihre Derivate sowie Säureadditionssalze und Komplexe dieser Verbindungen nach an sich bekannten Methoden herstellt*

   109813/2249

   2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man die Verbindungen der Formel I, _ _ _ _ g ₈ ^ _io ^ _i2

   H-Cys-Gly-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-'X -Leu-GIy-Thr-Tyr-Thr-GIn-15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28-

   Asp ~Phe-Asn-Lys-Phe rHis-Thr-Phe-Pro-Gln-Thr-Als-He-GIy-29 30 31 32

   VaI-GIy-AIa-PrO-NH₂, "

   worin X für den L-Methionin-, L-Valin-, L-Norvalin-, L-Leu-

   cin-, L-Isoleucin-j L-Norleucin- oder L-a-Aminobuttersäurerest steht und

   worin mindestens eine der Aminosäuren in den Stellungen 11, 12, l6, 17,'19j 20, 22 und 24 gegen eine andere Aminosäure- " ausgetauscht ist, und zwar L-Threonin gegen L-Lysin, L-Tyrosin gegen L-Leucin, L-Phenylalanin gegen L-Leuein, L-Asparaginsäure ' gegen L-Histidin, L-Phenylalanin " gegen L-Leucin,

   20 22

   L-Histidin gegen L-Glutamin, L-Phenylalanin gegen L-Tyro-

   24

   sin und L-Glutamin gegen L-Arginln, ihre Derivate sowie Säureadditionssalze und Komplexe dieser Verbindungen dadurch hergestellt, dass man

   1. aus Verbindungen der Formel I l[ 2 3 4 5β7| 8 9 10 11 12 13 Ik

   H-Cys-Gly-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys—X—Leu-Gly-Thr-Tyr-Thr-Gln-

   15 16 17 l8 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 Asp -Phe -Asn -Lys -Phe -His -Thr -Phe -Pro -Gln-Thr -Ala -He -GIy-

   29 30 31 32

   VaI-GIy-Al a-Pro-NH₂, . ' '

   109819/2249

   - 131 - '

   worin X die angegebene Bedeutung hat und worin mindestens eine der Aminosäuren in den Stellungen 11, 12, 16, 17, 19, 20, 22 und 24 durch die oben genannten Aminosäuren ersetzt ist, oder aus deren Derivaten, in welchen Verbindungen' mindestens eine Aminogruppe oder eine Carboxyl-" gruppe durch eine abspaltbare Schutzgruppe geschützt ist, die Schutzgruppe (n) abspaltet oder , . ^

   2. ' Verbindungen der Formel II

   1 2 34567 8 9 10 11 12 13 H-Cys-Gly-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys- X--Leu-Gly--Thr-Tyr-Thr-

   14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27

   Gln-Asp-Phe-Asn-Lys -Phe -His-Thr -Phe -Pro -Gln-Thr-Ala-Ile 28 29 30 31 32 Gly-Val-Gly-Ala-Pro-NHg . ^ιτ>

   worin X die angegebene Bedeutung hat und worin mindestens eine der Aminosäuren in den Stellungen 11, 12, l6, 17* 19,

   22 und 24 durch die oben genannten Aminosäuren ersetzt |

   ist, oder deren Derivate, worin die Mercaptogruppen frei oder durch die Tritylgruppe geschützt sind, zu Disulfiden oxidiert und, wenn erwünscht, die erhaltenen Peptidamide in ihre Säureadditionssalze oder Komplexe überfuhrt.

   109819/2249

   -.132 -

   20SD434

   3· " Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass man von Verbindungen ausgeht, in denen die Car- _boxyigruppen durch die tert.Butylestergruppe geschützt sind.

   4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 - 3.» dadurch gekennzeichnet, dass man. von Verbindungen ausgeht, in denen die Aminogruppen durch die tert.Butyloxycarbonylgruppe ge-. schützt sind. . .

   5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-4, dadurch gekennzeichnet, dass man von Verbindungen ausgeht, in denen die Hydroxylgruppen in d.en Seitenketten durch die tert. Butyläthergruppe geschützt sind.'

   •6. Verfahren zur Herstellung neuer Peptide wie in den schematischen Darstellungen gezeigt oder in den Beispielen beschrieben.

   7· Verfahren nach einem der Ansprüche 1 - 6, dg,-

   11 24 durch gekennzeichnet, dass map Lys -Arg -Calcitonin M, seine Derivate, Säureadditionssalze oder Komplexe herstellt.

   109819/2249

   8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 - 6, dadurch

   17 IQ 20

   gekennzeichnet, dass.man His '-Leu ^-GIn -Calcitonin M, seine Derivate, Säureadditionssalze oder Komplexe herstellt.

   9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-6, dadurch

   gekennzeichnet, dass man Tyr -Calcitonin M, seine Derivate,*

   Saureadditionssalze oder Komplexe herstellt. · -1

   10. Verfahren nach einem der·Ansprüche 1-6, dadurch gekennzeichnet, dass man Leu ' ^J "-Calcitonin M, seine Derivate, Saureadditionssalze oder Komplexe herstellt.

   11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-6, dadurch

   O pp

   gekennzeichnet, dass man VaI -Tyr -Calcitonin M, seine Derivate, Saureadditionssalze oder Komplexe herstellt.

   12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 r 6, dadurch gekennzeichnet, dass man VaI -Leu * ' "-Calcitonin M, seine Derivate, Saureadditionssalze oder Komplexe herstellt.

   13. · Verfahren nach einem der Ansprüche 1 - 6, dadurch

   gekennzeichnet, dass man VaI -Leu ■' ' "-Tyr -Calcitonin M, seine Derivate, Saureadditionssalze oder Komplexe herstellt.

   109819/2249

   l4. ■' Verfahren nach einem der Ansprüche 1-6, dadurch gekennzeichnet, dass man Leu ' * -Tyr -Calcitonin M,
   seine Derivate, Säureadditionssalze oder Komplexe herstellt.

   15. Verfahren nach einem der Ansprüche 1- - 6, dadurch

   22

   gekennzeichnet, dass man Desamino-Tyr -Calcitonin M, seine

   Derivate, Säureadditionssalze oder Komplexe herstellt.

   16. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-6, dadurch gekennzeichnet, dass man Desamino-Leu * * -Calcitonin M,
   seine Derivate, Säureadditionssalze oder Komplexe herstellt.

   17. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 - 6, dadurch gekennzeichnet, dass man Desamino-Val -Leu ' * "-Calei-

   tonin M, seine Derivate, Säureadditionssalze oder Komplexe
   herstellt. -

   18. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-6, dadurch

   O TOT £\ "T C*k QQ

   gekennzeichnet, dass man Desaraino-Val -Leu * ' -Tyr
   Calcitonin M, seine Derivate, Säureadditionssalze oder Komplexe herstellt.

   19. Verfahren zur Herstellung neuer Dotriacontapeptidamide wie in den Beispielen beschrieben.

   109819/2249

   20. Peptidaraide der Formel I .

   l[ ~2 3~ 4 5 6 7| 8 9 10 11 12 -13 14

   H-Cys-Gly-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys- X -Leu-Gly-Thr-Tyr-Thr-Gln 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28

   Asp-Phe-Asn-Lys-Phe-His-Thr-Phe-Pro-Gln-Thr-Ala-lie-GIy-

   29 30 31 32
   VaI-GIy-Ala-Pro-

   worin X für den L-Methibnin-, LrValin-, L-Norvalin-, L-Leu-

   ■ ein-, L-Isoleucin-, L-Norleucin- oder L-a-Aminobuttersäurerest steht und worin mindestens eine der Aminosäuren in den Stellungen 11, 12, 16, 17, 20, 22 und 24 gegen eine andere Aminosäure ausgetauscht ist, und zwar L-Threonin gegen L-Lysin, L-Tyrosin gegen L-Leuein, L-Phenylalanin gegen L-Leucin, L-Aspa-

   17 ' IQ

   raginsäure ' gegen L-Histidin, L-Phenylalanin * gegen L-Leucin,

   20 * 22

   L-Histidin gegen L-Glutamin, L-Phenylalanin gegen·L-Tyro-

   24

   sin und L-Glutarain gegen L-Arginin, ihre Derivate sowie Säureadditionssalze und Komplexe dieser Verbindungen.

   11 24
   21. Lys -Arg -Calcitonin M, seine Derivate, Säure· additionssalze und Komplexe.

   22. His¹⁷-Leu^l9-Gln²⁰-Calcitonin M, seine Derivate,

   rf-

   Säureadditionssalze und Komplexe. ' .

   109819/2249

   22 ' ·

   Tyr -Calcitonin M, seine Derivate, Saureadditions-

   salze und Komplexe.

   12 l6 IQ

   ,ν 24. Leu ' ' ^-Calcitonin M, seine Derivate, Säureadditionssalze und Komplexe.

   8 22

   25. VaI -Tyr-Calcitonin M, seine Derivate, Säureadditionssalze und Komplexe.

   -26. ' Val⁸-Leu^12> '¹⁹-Calci'tonin M, seine Derivate, Säureadditionssalze und Komplexe. -^

   27. Val^Ö-Leu^l2'^l6'¹⁹-Tyr²²-Calcitonin M, seine Derivate, Säureadditionssalze und Komplexe.

   Tp Λ f. IQ QQ

   28. . . Leu ''^-Tyr -Calcitonin M, seine Derivate, Säureadditionssalze und Komplexe.

   22

   29· Desamino-Tyr -Calcitonin M, seine Derivate, Säureadditionssalze und Komplexe.

   ■50. Desamino-Leu¹²*'¹^-CaIcItonin M, seine Derivate, ,'Uiureadditionssalze und Komplexe.

   1. Do.ianiino-Va^-Leu^'^^^-Calcitonin M, seine

   ■111 Derivate, Säuroadditions-salze und Komplexe.

   109819/22A9

   32.. Desamino-Val -Leu^12>l6'¹⁹-Tyr²²-Calcitonin M, seine Derivate, Säureadditionssalze und Komplexe.

   33. Die in den Beispielen beschriebenen Analogen von Caleitonin M, seine Derivate, Säureadditionssalze und Komplexe.

   N -Acylderivate der Peptide gemäss den Ansprüchen

   20-33·

   35« Komplexe der Verbindungen gemäss den Ansprüchen 20 - 3^ .mit Zinkphosphat, Zinkpyrophosphat und/oder Zinkhydroxid. '

   36. Komplexe der Verbindungen gemäss den Ansprüchen 20 - 3^ roit Polyoxygelatine, Polyphloretinphosphat, PoIyphosphaten oder Polyglutaminsäure.

   37· Pharmazeutische Präparate enthaltend Verbindungen gemäss den Ansprüchen 20 - 36.

   109819/224« onto»*«.'