DE2423549A1

DE2423549A1 - Verfahren zur herstellung von cystinhaltigen peptiden

Info

Publication number: DE2423549A1
Application number: DE2423549A
Authority: DE
Inventors: Bruno Dr Kamber; Bernhard Dr Riniker; Peter Sieber
Original assignee: Ciba Geigy AG
Current assignee: Novartis AG
Priority date: 1973-05-24
Filing date: 1974-05-15
Publication date: 1974-12-12
Also published as: FR2230622A1; USB471617I5; CA1045626A; US3994871A; SE399880B; GB1477002A; GB1477003A; HU172223B; GB1477004A; NL7406840A; JPS5019720A; GB1477001A; FR2230622B1

Description

CIBA-GEIGY AG, 4002 BASEL (SCHWEIZ) 2423549

Case 4-8802/1+2/+

DEUTSCHLAND

Verfahren zur Herstellung von Cystin-haltigen Peptiden.

Gegenstand der Erfindung ist ein neues Verfahren zur Herstellung von Peptiden, welche mehr als eine Cystin-Disulfidbindung enthalten. Solche Peptide sind z.B. Insuline, Proinsuline, Wachstumshormone, Ribonuclease, Lysozym, Apamin, Relaxine, Somatomedine, Nervenwachstumsfaktor(NGF) oder Wachsturnsfaktor für epidermales Gewebe (EGF) und Fragmente oder synthetische Analoge dieser .Naturstoffe oder Abkömmlinge davon, z.B..beim Insulin Verbindungen bestehend aus A- und B-Kette, die durch Peptidketten oder nicht-peptidische Brücken miteinander verknüpft sind, vgl. Biochem. Bio-

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phys. Res. Comm. 55., 60 (1973).

Bei der synthetischen Herstellung solcher Peptide stellt sich das Problem, die Cystein-haltigen Aminosäuresequenzen so zu oxidieren, dass die Disulfidbindungen zwischen den gewünschten Cysteinresten, die sich in einer oder in zwei Ketten befinden können, gebildet werden.

Durch Anwendung der bekannten selektiv abspaltbaren Mercapto-Schutzgruppen konnte das Problem bisher nicht in befriedigender Weise gelöst werden. Alkalisch oder hydrogenolytisch abspaltbare Gruppen sind schon deswegen nicht günstig, weil unter den Abspaltungsbedingungen eine teilweise Zersetzung des Peptids, speziell an der Disulfidbindung, eintritt. Bei den sauer abspaltbaren Schutzgruppen ist eine ausreichende Selektivität schwer zu erreichen. Eine grosse Schwierigkeit besteht auch darin, dass dann, wenn man mittels selektiv abspaltbarer Mercapto-Schutzgruppen die für die erste Disulfidbindung erforderlichen Mercaptogruppen freigesetzt und durch Oxidation daraus die Disulfidbindung gebildet hatte, eine weitere, durch eine andere Schutzgruppe noch geschützte Mercaptogruppe nach Abspaltbung der Schutzgruppe mit der Disulfidbindung unter Disproportionierung des Moleküls reagieren kann.

Es wurde nun ein Verfahren gefunden, nach dem Peptide oder Peptidderivate mit mehr als einer Disulfid-

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bindung in überraschender vorteilhafter Weise hergestellt werden können.

Das Verfahren beruht auf der selektiven Abspaltbarkeit von Mercapto-Schutzgruppen in polyhalogenierten niederen aliphatischen Oxy- oder Oxoverbindungen, vor allem Niederalkanolen, besonders Trifluoräthanol oder Hexafluor-2-propanol.

Als Mercaptoschutzgruppen für Cysteinreste sind solche vom Aralkyltypus, z.B. Trityl, und Acylaminomethylgruppen, z»B. Acetylaminomethyl, bekannt. Diese Gruppen können in vorteilhafter Weise mit Jod abgespalten werden, wobei gleichzeitig Oxidation zum Cystinrest eintritt, vgl. die britischen Patente 1 259 017 und 1 329 860. Es wurde gefunden, dass man diese beiden Arten von Mercaptoschutzgruppen sehr gut selektiv abspalten kann, wenn man das die beiden Arten von Schutzgruppen enthaltende Cysteinpeptid in den genannten polyhalogenierten Verbindungen, besonders Trifluoräthanol oder 1,1,1,3,3,3-Hexafluor-2-propanol mit Jod behandelt. Dabei werden nur die beiden Aralkyl-geschlitzten Cysteinreste zum Cystin oxidiert, während die Acylaminomethylschutzgruppe unverändert erhalten bleibt. Man erhält also ein Peptidderivat mit einer Cystin-S-S-Brücke an der.gewünschten Stelle, das noch einen oder zwei Acylaminotnethyl-geschützte Cysteinreste enthält. Die zweite Disulfidbindung kann nach Entfernung der polyhalogenierten Verbin-

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dung ebenfalls durch Behandlung mit Jod hergestellt werden. Man kann aber auch andere Oxidationsmittel zur Bildung der Disulfidbrücke aus den Acylaminomethyl-geschlitzten Mercaptogruppen verwenden, z.B. Phenyljodosoacetat oder Bromate wie Kaliumbromat. Die Acylaminomethyl-geschlitzten Mercaptogruppen können auch elektrochemisch, z.B. an einer Gold-, Platin- oder Kohle-Anode zum Disulfid oxidiert werden. Weiter kann man die Acylaminomethylgruppe durch Einwirkung von Schwermetallionen, z.B. Quecksilber(II)- oder Silberionen, abspalten und die dabei erhaltenen Mercaptide durch Oxidation, z.B. mit Jod, Kaliumferricyanat oder anderen Oxidationsmitteln^ in die Disulfidverbindung überführen. Die Bildung der zweiten Disulfidbrücke braucht nicht unmittelbar anschliessend an.die Bildung der ersten DisulfidbrUcke (aus den Ära lkyl-ge schlitzt en Mercaptogruppen) vorgenommen zu werden, sondern kann zu einem beliebigen Zeitpunkt der Peptidsynthese,- z.B. nach Verlängerung einer oder beider Aminosäureketten, erfolgen.

Das erfindungsgemässe Verfahren ist daher dadurch gekennzeichnet, dass man in einer oder zwei cysteinhaltigen AminosMuresequenzen, in welchen Disulfidbindungen hergestellt

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werden sollen, zwei zu verbindende Cysteinreste durch eine Mercaptoschutzgruppe R₁ vom Aralkyltypus, zwei weitere Cysteinreste durch eine Acylaminontethylgruppe. R₂ schützt, die Schutzgruppen R-, durch Behandlung mit Jod in Gegenwart einer polyhalogenierten niederen aliphatischen Oxy- oder Oxoverbindung entfernt, wobei gleichzeitig die Disulfidbindung zwischen diesen Cysteinresten, die durch R, geschützt waren, gebildet wird, und zu einem beliebigen Zeitpunkt nach Entfernung der polyhalogenierten Verbindung die zweite Disulfidbrücke bildet.

. Das Verfahren hat den Vorteil, dass in einfacher Weise eine gute selektive Oxidation der Cysteingruppen erreicht wird. Die Selektivität zeigt sich darin, dass z.B. S-Tritylgeschützte Cysteinreste mit Jod bei Zimmertemperatur in Gegenwart von Trifluoräthanol oder Hexafluor-2-propanol praktisch momentan in lOOXiger Ausbeute in Cystin übergeführt werden, während ■ Acetylaminomethyl-geschützte Cysteinreste unter diesen Umständen •gänzlich, unverändert bleiben.

Unter Mercapto-Schutzgruppen R, vom Aralkyltypus sind Gruppen zu verstehen, in denen das mindestens einen Arylrest tragende Kohlenstoffatom an den Schwefel der Mercaptogruppe gebunden ist. Ein Arylrest kann mono- oder bicyclisch (z.B. Naphthyl) sein; vor allem ist er ein unsubstituierter oder durch elektrotronenliefernde Substituenten substituierter, z.B. durch einen oder mehrere Reste aus der Gruppe von Niederalkyl-, Niederalkoxy

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und Halogen substituierter Phenylrest. Der aliphatische Teil des Aralkylrestes ist ein Niederalkyl- oder Cycloalkylrest mit bis zu 7 Kohlenstoffatomen, besonders Methyl. Ausser dem Arylrest enthält R, mindestens noch einen cyclischen Rest, der entweder ein Arylrest wie angegeben oder ein Cycloalkylrest mit 5-7 Kohlenstoffatomen ist. Als Beispiele der Reste R. sind zu nennen 1-Phenylcyclopentyl, 1-Pheny!cyclohexyl, 1-Phenylcycloheptyl, p-Methoxyphenylcyclohexyl, 1,1-Diphenyläthyl, Di-(p-Tolyl)-äthyl, insbesondere aber Triphenylmethyl(Trt).

" Unter der Acylaminomethylgruppe R2 ist eine Gruppe der Formel -CHo-NH-CO-R zu verstehen, worin CO-R den Acylrest einer Carbonsäure, wie einer aliphatischen, aromatischen, araliphatischen oder heterocyclischen Carbonsäure oder eines Kohlensäurederivates, wie einen Kohlensäureester- oder Carbaminsäurerest bedeutet. In erster Linie ist R ein gegebenenfalls substituierter .Niederalky !rest, z.B. Methyl-, Aethyl-, Propyl-, Isopropyl-, η-Butyl oder tert.Butylrest, der als Substituenten z.B. Halogenatome wie Fluor, Chlor, Brom oder Jod, Trifluormethyl oder die Nitrogruppe enthalten kann. Weiter ist R beispielsweise ein gegebenenfalls substituierter Cycloalkylrest mit 3-8, vor-

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zugsweise 5 - 6, Ringatomen wie der Cyelopentyl- oder Cyclohexylrest oder ein. gegebenenfalls substituierter aromatischer oder araliphatischer Rest, worin der aromatische Ring vorzugsweise der Benzolring ist, vor allem gegebenenfalls substituiertes Phenyl oder Benzyl, z.B. unsubstituiertes oder im Phenylrest durch Niederalkyl, Niederalkoxy, Halogen oder Nitro substituiertes Phenyl oder Benzyl, oder ein gegebenenfalls wie er-

•s

wähnt substituierter, vor allem monocyclischer Heterocyclylrest, z.B. Thienyl- oder Furylrest. Vorzugsweise steht R2 für die Acetylaminomethylgruppe(Acm).

Die Behandlung mit Jod zur Abspaltung der Mercapto-Schutzgruppe R, unter gleichzeitiger Oxidation der Cysteingruppen zur Cystingruppe wird erfindungsgemäss, wie bereits erwähnt, in Gegenwart einer polyhalogenierten niederen Oxy- oder Oxoverbindung vorgenommen, wobei als Halogenatome Brom, Chlor und insbesondere Fluor in Betracht kommen. Das Reaktionsmedium soll vorzugsweise mindestens 40 Gew.% der polyhalogenierten Verbindung enthalten. Ausserdem können im Reaktionsmedium Wasser oder wässerige oder organische Lösungsmittel bzw. Gemische von Lösungsmitteln, insbesondere Jodlösungsmittel oder Wasser, vorhanden sein. Wenn Wasser im Gemisch vorhanden ist, beträgt dessen Gewichtsanteil vorzugsweise 0-30%.

Polyhalogenierte niedere aliphatisch^ Oxy- oder Oxoverbindungen sind vor allem polyhalogenierte Niederalkanole und Diniederalkylketone mit 2 bis 5, insbesondere 2 bis 3 Kohlenstoffatomen, ferner entsprechende Niederalkansäurenieder-

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alkylester, z.B. polyhaLogenierte Essigsäureniederalkylester wie Trifluoressigsäuremethylester oder Trichloressigsäureäthylester. Die Verbindungen sind vorzugsweise perhalogenisiert, mindestens an einem sonst unsubstituierten Kohlenstoffatom. Bevorzugte Beispiele sind 2,2,2-Tribromäthanol, 2,2,2-Trichloräthanol, 1,1,1-Trifluoraceton, Hexachloraceton, Hexafluoraceton und besonders 2,2,2-Trifluoräthanol und 1,1,1,3,3,3-Hexafluor-2-propanol. Als Jodlösungsmittel· sind vor allem halogenierte Kohlenwasserstoffe, besonders chlorierte Niederalkane wie Methylenchlorid, Chloroform, Tetrachlorkohlenstoff, Tetrachloräthan zu nennen, ferner z.B. Niederalkanole wie Methanol, Aethanol, Propanol, Eisessig, Essigester, Dioxan, Acetonitril, Dimethylformamid, Dimethylsul·- foxid, wässerige Kaliumjodidlö'sung.

Eventuell kann ein Gehalt an Wasser oder wässeriger Essigsäure im Reaktionsmedium vorteilhaft sein.

Die Umsetzung mit Jod erfolgt unter an sich bekannten Reaktionsbedingungen, z.B. wie im britischen Patent Nr. 1 259 017 beschrieben. Vorzugsweise arbeitet man bei Zimmertemperatur, doch können auch, je nach Art des Peptids, niedrigere oder höhere Temperaturen, z.B. von 0 bis 100° angewendet werden.

Die Reaktion findet bei saurem pH statt, das durch den bei der Reaktion gebildeten Jodwasserstoff erreicht wird.

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Wenn erwünscht, kann das pH mittels Puffer auf 4-5 eingestellt werden. Wenn die Reaktion bei einem pH über 4 durchgeführt wird, sollten in der Peptidsequenz gegebenenfalls vorhandene Seitenkettenhydroxy!gruppen des Tyrosins geschützt werden, z.B. durch die tert.Butyläthergruppe, um eine Jodierung zu vermeiden.

Zweckmässig wird ein Ueberschuss an Jod verwendet. Das Jod kann i.n fester oder gelöster Form mit der Peptidlb'sung vermischt werden. Aus der erhaltenen Lösung kann das Überschüssige Jod beispielsweise durch Extraktion oder z.B. mit Thiosulfat oder Ascorbinsäure entfernt werden, oder man kann aus der Lösung das Peptid ausfällen und abtrennen.

Die Abspaltung der !.^-Schutzgruppe unter gleichzeitiger Bildung der .zweiten Disulfidbrücke kann, wenn erwünscht, ebenfalls mit Jod, wie im britischen Patent Nr. 1 329 860 beschrieben, vorgenommen werden. Man kann wässerige, wässerigorganische oder organische Lösungsmittel mit Ausnahme von polyhalogenierten Niederalkanolen verwenden, vorteilhaft reine oder wässerige Essigsäure.

Bei dem erfindungsgemässen Verfahren können in den als Ausgangsstoffen verwendeten Aminosäuresequen&en die Aminogruppen protoniert vorliegen oder durch übliche Aminoschutzgruppen geschützt sein. Auch Hydroxyl- und Carboxylgruppen können, wenn erwünscht, in geschützter Form vorliegen. Stark säurelabile Aminoschutzgruppen wie Trityl werden unter den Redaktionsbedingungen abgespalten.

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Als Aminoschutzgruppen sind beispielsweise zu nennen: Acylgruppen wie Formyl, Trifluoracetyl, Phthaloyl, p-Toluolsulfonyl, Benzylsulfonyl, Benzolsulfenyl, o-Nitrophenylsulfenyl, oder vor allem von der Kohlensäure oder Thiokohlensäure sich ableitende Gruppen, wie gegebenenfalls im aromatischen Rest durch Halogenatome, Nitrogruppen, Niederalkyl- oder Niederalkoxy- oder Niedercarbalkoxygruppen substituierte Carbobenzoxygruppen, z.B. Carbobenzoxy, o-Brom, p-Brom oder p-Chlorcarbobenzoxy, 2,4-Dichlorcarbobenzoxy, p-Nitrocarbobenzoxy, p-Methoxycarbobenzoxy, farbige Benzyloxycarbonylgruppen wie p-Phenylazo-benzyloxycarbonyl und p-(p'-Methoxyphenylazo)-benzyloxycarbonyl, Tolyloxycarbonyl, (a,a-Dimethyl-3,5-dimethoxybenzyl)-oxycarbonyl, Benzhydryloxycarbonyl, 2-Phenyl-isopropyloxycarbonyl, 2-Tolylisopropyloxycarbonyl und vor allem 2-(para-Biphenylyl)-2-propyloxycarbonyl, ferner aliphatische Oxycarbonylgruppen wie z.B. 1-Methylcyclobutyloxycarbonyl, Isonicotinyloxycarbonyl, Allyloxycarbonyl, Cyclopentyloxycarbonyl, tert.-Amyloxycarbonyl, Adamantyloxycarbonyl, Isobornyloxycarbonyl, und in erster Linie tert.-Butyloxycarbonyl.

Carboxylgruppen können beispielsweise durch Amid- oder Hydrazidbildung oder durch Veresterung geschützt sein. Zur Veresterung geeignet sind z.B. niedere gegebenenfalls substituierte Alkanole wie Methanol, Aethanol, Cyanmethy!alkohol,

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Benzoylmethylalkohol oder insbesondere tert.-Butanol, ferner Aralkanole wie Arylniederalkanole, z.B. gegebenenfalls durch Niederalkyl- oder Niederalkoxygruppen oder Halogenatome substituierte Benzyl- oder Benzhydrylalkohole wie p-Nitrobenzylalkohol oder 2,4,6-Trimethy!benzylalkohol, oder Phenole und Thiophenole wie Phenol, Thiophenol, Thiokresol.

Die Hydroxygruppen der Serin-, Threonin- und Tyrosinreste können z.B. durch Veresterung oder Verätherung geschützt werden. Als Acylreste bei der Veresterung sind z.B. Niederalkanoylreste wie Acetyl, Aroylreste wie Benzoyl und vor allem von der Kohlensäure sich ableitende Reste wie Benzyloxycarbonyl, o-Brombenzyloxycarbonyl oder Aethyloxycarbonyl geeignet. Zur Verätherung geeignete Gruppen sind z.B. Benzyl-, m-Brombenzyl, 2,6-Dichlorbenzyl, Tetrahydropyranyl- oder tert. ■ Butylreste. Ferner eignen sich zum Schutz der Hydroxylgruppen die in Ber. 100 (1967), 3838 - 3849 beschriebenen 2,2,2-Trifluor-1-tert.-butyloxycarbonylamino- oder -1-benzyloxycarbonyl·· aminoäthylgruppen (Weygand).

In erster Linie verwendet man acidolytisch, z.B. durch Essigsäure, Trifluoressigsäure, Salzsäure oder Fluorwasserstoff abspaltbare Schutzgruppen, insbesondere Gruppen vom tert.-Butyl-Typ wie die tert.Butyloxycarbonylgruppe, die tert.-Buty!ester- und tert.-Butylathergruppe. Dabei ist dem

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Umstand Rechnung zu tragen, dass beim Aufbau der Sequenzen durch Kettenverlängerung am Aminoende die verschiedenen Ketten selektiv gegenüber einander abspaltbare Aminoschutzgruppen tragen müssen, wie dies in der deutschen Offenlegungsschrift 2 346 147 oder dem belgischen Patent 805.147 (Case 4-8418) beschrieben ist. Wie dort ausgeführt, benötigt man sog. stabile Schutzgruppen als konstant beizubehaltende Gruppen, z.B. zum Schutz von Amino-, Hydroxy- und Carboxylgruppen der Seitenketten und zum Schutz von Endcarboxylgruppen, ferner zwei Arten von sog. labilen Schutzgruppen für die α-Aminogruppen der im Aufbau befindlichen verschiedenen Ketten. Das Verfahren ist in der deutschen Offenlegungsschrift 2 346 147 an einer Teilsequenz des menschlichen Insulins, nämlich A-Kette 14 - 21 + B-Kette 17 - 30, die auch in dem in der vorliegenden Anmeldung beschriebenen Verfahren zur Herstellung des menschlichen Insulins verwendet wird, illustriert. Dabei werden als Aminoschutzgruppen für die beiden Ketten die 2-(p-Biphenylyl)-2-isopropyloxycarbonylgruppe und die Trityl-

gruppe verwendet. Der Inhalt der genannten deutschen Offenlegungsschrift bzw. des belgischen Patentes 805 147 ist zur Ergänzung der vorliegenden Anmeldung heranzuziehen.

Wenn beim vorliegenden Verfahren Cystin-haltige geschützte Peptide erhalten werden, können diese direkt für die Synthese von Peptiden mit längerer Aminosäurekette verwendet werden, oder, wenn erwünscht, können die Schutzgruppen in bekannter Weise abgespalten werden.

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Die Ausgangsstoffe für das Verfahren der vorliegenden Anmeldung, nämlich cysteinhaltige AminosäureSequenzen, in denen die Cysteinreste durch Mercaptoschutzgruppen R₁ oder R₂ geschützt sind, sind bekannt oder können nach an sich bekannten Methoden hergestellt werden, vgl. z.B. die englischen Patente 1 259 017 (Case 4-6461) und 1 329 (Case 4-6914), in denen auch die Abspaltung dieser Schutzgruppen beschrieben ist. Die Cystein-haltigen Aminosäuresequenzen können auch eine oder mehr Cystin-S-S-Brücken, die in einem früheren Zeitpunkt der Synthese auf gleiche oder andere Weise gebildet wurden, enthalten.

Die cysteinhaltigen Ausgangsstoffe sowohl als auch die mittels cystinhaltiger Sequenzen herzustellenden Endprodukte, z.B. Insulin, werden erhalten, indem man die zum Aufbau des Peptide nötigen Aminosäuren unter Bildung von CONH-Bindungen in beliebiger zeitlicher Reihenfolge miteinander kondensiert, wobei nicht an der Reaktion teilnehmende funktionelle Gruppen intermediär geschützt und zu einem beliebigen Zeitpunkt die Cysteinreste zu Cystinresten oxidiert werden.

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Die zu verwendenden Schutzgruppen wurden bereits erwähnt.

Die Verknüpfung der Aminosäure- und/oder Peptideinheiten erfolgt z.B. in der Weise, dass man eine Aminosäure oder ein Peptid mit geschützter oc-Aminogruppe und aktivierter terminaler Carboxylgruppe mit einer Aminosäure oder einem Peptid mit freier α-Aminogruppe und freier oder geschützter, z.B. veresterter oder amidierter terminaler Carboxylgruppe, umsetzt oder dass man eine Aminosäure oder ein Peptid mit aktivierter «-Aminogruppe und geschützter terminaler Carboxylgruppe mit einer Aminosäure oder einem Peptid mit freier terminaler Carboxylgruppe und geschützter α-Aminogruppe umsetzt. Die Carboxylgruppe kann beispielsweise durch Ueberführung in ein Säureazid, -anhydrid, -imidazolid, -isoxazolid oder einen aktivierten Ester, wie Cyanmethylester, Carboxymethylester, p-Nitrophenylthioester, p-Nitrophenylester, 2,4,5-Trichlorphenylester, Pentachlorphenylester, N-Hydroxysuccinimidester, N-Hydroxyphthalimidester, 8-Hydroxychinolinester, N-Hydroxypiperidinester oder durch Reaktion mittels eines Carbodiimide (gegebenenfalls unter Zusatz von N-Hydroxysuccinimid oder einem unsubstituierten oder z.B. durch Halogen, Methyl oder Methoxy substituierten 1-Hydroxybenzotriazol) oder N,N^r-Carbonyl-diimidazols, die Aminogruppe beispielsweise durch Reaktion mit einem Phosphitamid akti-

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viert werden. Als gebräuchlichste Methoden sind zu nennen die Carbodiimidmethode, die Azidmethode, die Methode der aktivierten Ester und die Anhydridmethode, ferner die Merrifield-Methode und die Methode der N-Carboxyanhydride oder N-Thiocarboxyanhydride.

Das Verfahren gemäss der Erfindung kann bei der Synthese beliebiger Cystin-haltiger Peptide oder Peptidderivate verwendet werden. Unter Derivaten sind insbesondere Peptidamide zu verstehen, ferner Peptide oder Peptidamide, in denen funktioneile Gruppen wie z.B. Aminogruppen, Carboxylgruppen, Hydroxylgruppen, in bekannter Weise geschützt sind_s ferner Verbindungen, die statt einer oder mehrerer der Cystinhälften β-Mercaptopropionsäurereste (Desaminocystein) aufweisen.

Als Cystin-haltige Peptide sind gemäss dem erfindungsgemässen Verfahren sowohl Peptide zu verstehen, welche mehrere Cystinreste in derselben Kette enthalten, als vor allem auch solche, in welchen eine oder mehrere DisulfidbrUcken verschiedene Aminosäuresequenzen verbinden, wie es z.B. beim Insulin in bezug auf den Cystinrest der A-Kette (7-Stellung) und der B-Kette (7-Stellung) und der Α-Kette (20-Stellung) und der B-Kette (19-Stellung) der Fall ist. Ein Beispiel für das Vorhandensein einer DisulfidbrUcke in derselben Kette und

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einer zweiten Disulfidbrücke zwischen zwei verschiedenen Ketten wäre die Cystingruppe der Stellungen 6 und 11 der Α-Kette des Insulins und die Cystingruppe der Stellung 7 der A-Kette
und der Stellung 7 der B-Kette.

Die Erfindung betrifft auch ein neues Verfahren zur Herstellung von Insulin, bei dem von der genannten Kombination von Mercaptoschutzgruppen und deren Abspaltung in einer polyhalogenierten Oxy- oder Oxoverbindung Gebrauch
gemacht wird. Dieses Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass man eine Sequenz herstellt, welche mindestens die Aminosäuren 6-11 der Α-Kette enthält, deren Amino-, Carboxyl- und/oder Hydroxylgruppen gegebenenfalls geschützt sind und in der die Cysteingruppen in 6- und 11-Stellung durch eine Schutzgruppe R, vom Aralkyltypus und die Cysteingruppe in 7-Stellung durch eine Acylaminomethylgruppe R^ geschützt
ist und dass man in dieser Sequenz die Schutzgruppen R, mit Jod in einer polyhalogenierten Oxy- oder Oxoverbindung unter Bildung der Disulfidbrücke abspaltet und dann, gegebenenfalls nach Verlängerung der Α-Kette zum Amino- und/oder Carboxylende hin, mit einer Sequenz, welche die Disulfidbrücke des Cystins der Α-Kette in 20-Stellung und der B-Kette in 19-Stellung enthält, kondensiert, wobei eine gegebenenfalls in dieser Sequenz vorhandene Cysteingruppe in 7-Stellung der B-Kette durch

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eine Acylaminomethylgruppe R^ geschlitzt ist, dann die A-Kette und B-Kette, wenn erforderlich, vervollständigt, wobei die Cysteingruppe in 7-Stellung der B-Kette durch eine Acylaminomethylgruppe R^ geschützt wird, die Amino-, Carboxyl- und/oder Hydroxylschutzgruppen abspaltet und, vor oder nach dieser Abspaltung, die Disulfidbrücke zwischen den beiden Cystein -Resten der A- und B-Kette durch Abspaltung der Acylaminomethylgruppen R„ und gegebenenfalls gleichzeitige Oxidation zur Disulfidbrücke bildet.

Die hier angegebene Reihenfolge der Bildung der verschiedenen Disulfidbindungen ist besonders günstig. Man kann die Reihenfolge aber auch ändern. So kann man zum Beispiel ein Peptid aufbauen, dass die A- und B-Ketten des Insulins verbunden mit der Disulfidbrücke A^₀ B,g enthält. Darin können die Cysteinreste A (7) und B (7) durch Schutzgruppe R, geschützt sein, die Cysteinreste A (6) und A (11) durch die Acylamino gruppe R«. Dann wird in der angegebenen

Weise erst die Disulfidbrücke A₇ 9* B₇ gebildet und zum

Schluss der Synthese der Disulfidring A,- fer- A,,.

Die Erfindung wird in nachfolgenden Bexspielen illustriert. Die Temperaturen sind in Celsiusgraden angegeben. Folgende Abkürzungen werden verwendet:

Boc = tert.-Butyloxycarbonyl
Acm - Acetylaminomethyl
Trt = Trityl

Z = Carbobenzoxy

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But = tert.-Butyl

Me = Methyl

Bpoc = 2-(p-Biphenylyl)-2-propyloxycarbonyl

ONp - p-Nitrophenylester

OSu = N-Hydroxysuccinimidester

DMF = Dimethylformamid.

In der DUnnschichtchromatographie werden die folgenden Systeme verwendet:

System 3 : Essigester-Pyridin-Wasser (65:20:15)

System 43A: tert.-Amylalkohol-Isopropanol-Wasser (67:26:7)

System 43C: tert.-Amylalkohol-Isopropanol-Wasser (51:21:28)

System 43E: tert.-Amylalkohol-Isopropanol-Wasser (32:32:36)

System 45 : sec. Butanol-3%iges wässeriges Ammoniak (70:30)

System 52 : n-Butanol-Eisessig-Wasser (75:7,5:21)

System 52A: n-Butanol-Eisessig-Wasser (67:10:23)

System 70 : Aethylacetat-Pyridin-Wasser (40:20:40), Oberphase

System 87 : Isopropanol-Ameisensäure-Wasser (77:4:19)

System 100: Aethylacetat-Pyridin-Eisessig-Wasser (62:21:6:11)

System 101: n-Butanol-Pyridin-Eisessig-Wasser (38:24:8:30)

System 101A: n-Butanol-Pyridin-Eisessig-Wasser (42:24:4:30)

System 102A: Essigester-Methyläthylketon-Ameisensäure-Wasser

(50:30:10:10)

System 107: Aethylacetat-Pyridin-Wasser (49:24:27)

System 110: Aethylacetat-n-Butanol-Pyridin-Eisessig-Wasser

(42:21:21:6:10)

System 112A: n-Butanol-Pyridin-Ameisensäure-Wasser (42:24:4:20)

System 115: Aethylacetat-Pyridin-Ameiseiisäure-Wasser (63:21:10:6)

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Beispiel 1:

H-Cys-Cys(Acm) -Thr(But)-Ser(But)-Ile-Cys-Ser(But) -Leu-OH

0,47 g H-Cys(Trt)-Cys(Acm)-Thr(But)-Ser(But)-Ile-Cys (Trt)-S er (But)-Leu-OH in 15 ml Trifluoräthanol werden innert 10 Minuten zu einem stark gerührten Gemisch von 18 ml mit Jod gesättigtem Methylenchlorid und 180 ml Trifluoräthanol gegeben. 2 Minuten nach beendetem Eintragen wird eine Lösung von 3,2 g Ascorbinsäure in 60 ml Wasser und 30 ml 1-m. Ammoniumacetat zugegeben, die Lösung mit verdünntem Ammoniak auf pH 5,6 gebracht und bei vermindertem Druck das Trifluor-Uthanol grösstenteils entfernt. Das Gemisch wird dann in 100 ml Chloroform-Methanol- (95:5) aufgenommen und die organische Phase zweimal mit V/asser gewaschen. Nach dem Trocknen über Natriumsulfat wird eingedampft und das Titelprodukt durch eine Gelfiltration an Sephadex-LH 20 (Säule : 2 χ 100 cm) gereinigt. Elutionsmittel: Chloroform-Methanol (1:1).

Im Dünnschichtehromatogramm an Silicagel ist Rfinn ~ 0,32; Rf₅₂ - 0,35. ■

Das Ausgangspeptid kann wie folgt hergestellt werden:

1. Trt-Cys(Trt)-Cys(Acm)-OMe " · .

till I I 1 I 1 ■ I I *

7.0 g Trt-Cys(Trt)-0Su und 2.0 g H-Cys(Acm)-OMe werden in 50 ml Chloroform 20 Stunden bei Raumtemperatur stehen gelassen. Die Lösung wird dann mit 100 ml Chloroform verdünnt und mit

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1-n. Ciüronensäux-e, 1-n. Natriumbicarbonat und Wasser gevaschen, Über Natriumsulfat getrocknet und eingedampft. Der Rückstand wird aus Essigester-Aether umkristallisiert. F. 197-198°. .

2. Trt-Cys(Trt)-Cys(Acm)-OH

5,63 g Trt-Cys(Trt)-Cys(Acm)-OMe werden in 75 ml Dioxan aufgelöst und die Lösung vorsichtig mit 17,5 ml Wasser und 3,71 ml 2-n. Natronlauge versetzt. Nach 1 Stunde bei 20° wird auf 0° gekühlt, 3,71 ml 2-n. Salzsäure zugegeben, die Lösung bei vermindertem Druck und Raumtemperatur auf ca. 30 ml eingeengt und dann mit 200 ml Chloroform verdünnt. Die Lösung wird dreimal mit Wasser gewaschen und über Natriumsulfat getrocknet. Beim Abdampfen des Lösungsmittels erhält man das dünnschichtchromatographisch reine Produkt als weissen Schaum.

Im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel ist RLr *= 0,45; Rf₁₀₀- 0,65.

3. Z-Thr(Eut)-Ser(But)-OMe

Zu 200 ml Essigester werden 16,25 g Z-Thr(But)-OSu und 8,47 g H-SGr(BUt)-OMe, HCl zugefügt, bei 0° mit 5,6 ml Triethylamin versetzt und 15 Stunden bei 20° gerührt und mit 1-n. Citronensäure, 1-n. Natriumbicarbonat und Wasser gewaschen. Nach dem Trocknen über Natriumsulfat wird die Lösung eingedampft /wobei das diinn-

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■ - 21 -

schichtchromatographisch reine Produkt als OeI erhalten wird.

Im pUnnschichtchromatogramm an Silicagel ist Rf = 0,60 in Chloroform-Methanol (95:5)-und Rf «= 0,75 in Toluol-Aceton (1:1). . ·

4. H-Thr(But)-Ser(But)-OMe

3,27 g Z-Thr(But)-Ser(But)-OMe werden in 50 ml Essig-, ester in Gegenwart von 0,5 Palladiumkohle (10%) hydriert. Nach beendeter Wasserstoffaufnahme ( 1 Stunde) wird vom Katalysator abfiltriert und die Lösung eingedampft. Das als OeI anfällende Produkt ist dünnschichtchromatographisch einheitlich.

Im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel ist Rf *= 0,30 in Chloroform-Methanol (95:5).

5. Trt-Cys (Trt) -Cy s (Acm) -Thr (But) -Ser (But) -OMe

¹¹ ' III j

5,43 g Trt-C ys (Trt)-Cys(Acm)-OH und 2,33 g H-Thr (But)-Ser(But)-OMe werden in 70 ml Essigester gelöst und bei 0° mit 1.55 g Dicyclohexylcarbodiimid und 1,02 g N-Hydroxybenzotriazol versetzt. Nach 4 Stunden bei 0° und 17 Stunden bei 4° wird filtriert, die Lösung mit 200 ml Essigester verdünnt und mit 1-n. Citronensäure, 1-n. Natriumbicarbonat und Wasser gewaschen. Nach dem Trocknen über Natriumsulfat wird eingedampft und der Rückstand aus Essigester-Petrol'äther um-

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gefällt. .

Im DUnnschichtchromatogramm an Silicagel ist Rf *= 0,60 in Toluol-Aceton (1:1) und Rf = 0,45 in Essigester.

6. Trt-Cys (Trt) -Cys (Acm) -Thr (But) -Ser (But) -NHNH₂

4,7 g Trt-Cys(Trt)-Gys(Asm)-Thr(But)-Ser(But)-OMe in 11 ml Methanol werden nach Zugabe von 2,2 ml Hydrazinhydrat 6 1/2 Stunden bei Raumtemperatur belassen. Das Hydrazid wird mit 50 ml eiskaltem Wasser gefällt, abgenutscht und gut mit Wasser gewaschen Das getrocknete Rohprodukt wird in 80 ml heissem Toluol gelöst, etwas eingeengt und bei 60° mit 80 ml Hexan versetzt. Es wird langsam auf 0° gekühlt, das ausgefallene Produkt abgenutscht und mit Toluol-Hexan 1:2 und Hexan gewaschen. Ausbeute 4,06 g.

Im DUnnschichtchromatogramm an Silicagel ist Rf = 0,26 in Chloroform-Methanol.

7. Z-Ser(But)-Leu-OMe -

5,9 g Z-Ser(But)-OH in 20 ml Essigester werden bei -10° mit 2,75 ml Triäthylamin und 2,63 ml Chlorameisensäure-isobutyleßter versetzt. Nach. 10 Minuten .werden 4,0 g H-Leu-OMe -HCl und 3,05 ml Triäthylamin zugefügt. Nach 1 1/2 Stunden Rühren im Eisbad wird mit Phosphorsäure und Natriumhydrogencarbonatlösung ausgeschüttelt und nach Trocknen über Natriumsulfat der Essigester vollständig verdampft. Man erhält 8,2 g einer wachsartigen

. 409850/1135

Masse. F. (nach Kristallisation aus Hexan): 56-58°.

. . ..-■- Im' Bünnschichtdhromatogramm an Silicagel ist Rf ■= 0,58 in Essigester.

8. Trt-Cys(Trt)-Ser(But)-Leu-OMe "

. 8,5 g des obigen Dipeptide'werden in 130 ml Essigester gelöst, nach Abkühlen auf 0° mit 19,4 ml 1-n. Salzsäure und 0,6 g 10%, Palladiumkohle versetzt und hydriert. Nach Abfiltrieren des Katalysators wird der Essigester verdampft, der Rückstand in 60 ml Methylenchlorid aufgenommen und mit 14,7 g Trt-Cys(Trt)-OSu und 2,2 ml N-Methylmorpholin versetzt. Nach 48 Stunden bei Raumtemperatur V7ird mit Essigester verdünnt und mit kalter, verdünnter Phosphorsäure und Natriumhydrogeiicarbonatlösung ausge-.schüttelt. Der nach Trocknen und Verdampfen der Lösungsmittel erhaltene Rückstand wird im System Methanol-Hexan-Wasser (20:20:1) durch Craig-Verteilung über 600 Stufen gereinigt, k = 0,33. Man erhält 10,1 g eines farblosen Schaums..

Im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel ist Rf =0,46 in Essigester-Hexan (1:1).

9. Bpoc-Ilc~Cys(Trt)-Ser(But)-Leu-OMe

1,72 g des obigen, geschützen Tripeptids werden bei Raumtemperatur in 17,2 ml Eisessig gelöst, mit 4,2 ml "Wasser versetzt und 30 Minuten gerührt. Nach Zugabe von 5 ml Eisessig

• 4.09 8 50/1 T3 5

wird gefriergetrocknet, der Rückstand in 35 ml 70% tert.-Butanol suspendiert, noch mit 5 ml Wasser versetzt, des Triphenylcarbinol abfiltriert und das Filtrat erneut gefriergetrocknet. Man erhält 1,3 g eines weissen Pulvers-, Rf 0,30 in Essigester, das zu dem wie folgt bereiteten gemischten Anhydrid gegeben wird: 830 mg Bpoc-Ile-OH in 4 ml Dimethylformamid werden bei -15° mit 0,25 ml N-Methylmorpholin und 0,295 ml Chlorameisensäureisobutylester versetzt·« Nach 10 Minuten \-?ird das oben erhaltene Tripeptid zugesetzt, gefolgt von 0,166 ml N-Methylmorpholin und 4 ml Dimethylformamid. Man lüsst über Nacht bei 0° stehen, fällt das Produkt durch .Eintropfen in eiskalte wässerige Kaliumhydrogencarbonatlösung, nutscht ab, wäscht gut mit Wasser und trocknet bei 40°. Das erhaltene Produkt (1,98 g) ist rein genug für die weitere Verwendung, kann jedoch auch aus Methanol-Wasser umkristallisiert werden, F.: 175-177°.

..Im Dlinnschichtchromatogramm an Silicagel ist Rf *= 0,55 in Essigester-Hexan (8:2). '

10. Trt-Cy.s (Trt) -Cys (Acm) -Thr (But)-Ser (But) -Ile-Cys (Trt) Ser(But)-Leu-OMe

5,1 g Bpoc-Ile-Cys(Trt)-Ser(But)-Leu-OMe in 44 ml Eisessig und 11 ml Wasser.werden 18 Stunden bei Raumtemperatur belassen. Nach Zugabe von 20 ml Eisessig wird lyophilisiert,·

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dann noch zweimal aus tert.-Butanol gefriergetrocknet. Das klebrige Material wird mit 10 ml Aether zerrieben, nach Zugabe von 70 ml Hexan abgenutscht und mit Aether-Hexan 1:9 gewaschen. Ausbeute 2,92 g.

Im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel ist Rf = 0,16 in Essigester. · ■

3,96 g Trt-Cys(Trt)-Cys(Acm)-Thr(But)-Ser(But)-KIMH₂ in 15 ml Dimethylformamid werden bei -30° mit 3,3 ml 3,3-n. Salzsäure in Dioxan und bei -15° mit 0,56 ml tert. Butylnitrit versetzt. Nach 15 Hinuten bei -20° werden das obige Tetx^apeptid und 2,4 ml N-Methylmorpholin zugefügt und über Nacht bei 0° belassend Das mit eiskaltem Wasser gefällte Rohprodukt wird nach Trocknen mit Essigester-Hexan 8:2 an 290 g Kieselgel chromatographiert. Die dünnschichtchromatographisch reinen Fraktionen werden vereinigt und zur Trockne verdampft, man erhält 4,6 eines weissen Pulvers.

. Im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel ist Rf = 0,38 in Essigester. ' . ·

11. Trt-Cys(Trt)-Cys(Acm)-Thr(But)-Ser(But)-Ile-Cys(Trt)-Ser(But)-Leu-OH

3,6 g Trt-Cys(Trt)-Cys(Acm)-Thr(But)-Ser(But)-ile-Cys·

(Trt)-Ser(But)-Leu-OMe werden in 50 ml Dioxan gelöst und 17 ml Wasser und 4 ml 1-n. Natronlauge zugegeben. Nach 1 Stunde bei

■·■ 409850/1135

20° wird auf 0° abgekühlt und tropfenweise 4 ml 1-n. Salzsäure zugegeben. Bei 20° und vermindertem Druck wird dann das Dioxan weitgehend abgedampft, 20 ml Wasser zugegeben, der Niederschlag abfiltriert und über Kaliumhydroxid getrocknet. .

Im Dünnschicht chromatogramm an Silicagel ist Rf. ,-=0,55 und Rf₃ = 0,60.

12. H-Cys (Trt) -Cys (Acm) -Thr (But) -Ser (But) -Ile-Cys (Trt) Ser(But)-Leu-OH . 2 HCl. [ .

6,94 g Trt-Cys(Trt)-Cys(Acm)-Thr(But)-Ser(But)-Ile-Cys (Trt) -Ser (But) -Leu -OH werden in 72 ml Trifluor'äthanol gelöst, 8 ml VJasser zugegeben und mit 1,2-n. Salzsäure in 90% Trifluoräthanol ein pH von 4,0 eingestellt und mittels eines pH-States bei dieser Säurest'ärke gehalten. Nach 50 Minuten werden 50 ml tert.Butanol zugegeben, das Trifluor'äthanol· bei vermindertem Druck abgedampft und die Lösung lyophilisiert. Rf *= 0,40.

409850/1 135 ·

Beispiel 2: '

H-Cys-Cys-Thr(But)-Ser(But)-Ile-Cys-Ser(But)-Leu-OMe

I
Boc-Ala-Cys-OMe.

Das in Beispiel 1 erhaltene H-Cys-Cys(Acm)-Thr(But)-

Ser(But)-Ile-Cys-Ser(But)-Leu-OH wird in Methanol, das eine äquivalente Menge Chlorwasserstoff enthält, gelöst und mittels ätherischer Diazomethanlösung in den Methylester Übergeführt. Dieser zeigt im Dünnschichtchromatogramtn an Silicagel im System Chloroform-Methanol (85:15) Rf = 0,32. 55 mg des erhaltenen Octapeptidmethylester-hydrochloride und 19 mg Boc-Ala~Cys(Acm)~OMe werden in 8,5 ml Methanol gelöst mid mit 1,5 ml 0,5-M. Jodlösung in Methanol versetzt. Nach 10 Minuten bei Raumtemperatur lässt man das Gemisch in 30 ml l%ige wässerige Ascorbinsäurelösung, die 260 mg Ammoniumacetat enthält, eintropfen. Dabei fällt das Titelprodukt aus, zusammen mit einer kleinen Menge der beiden symmetrischen Disulfide I und II,

I » H-Cys-Cys-Thr(But)-Ser(But)-Ile-Cys-Ser(But)-Leu-OMe

I
H-Cys-Cys-Thr(But)-Ser(But)-Ile-Cys-Ser(But)-Leu-OMe;

II = Boc-Ala-Cys-OMe

I ·
Boc-Ala-Cys-OMe.

Der Niederschlag wird abzentrifugiert, mit Wasser gewaschen und an Dickschicht-Silicagel-platten in Chloroform-Methanol (85ι15) chromatographiert. Das Titelprodukt mit

A098 50/1135

Rf ^β 0,55 in dem genannten System wird abgetrennt. Das symmetrische Peptid I weist Rf - 0,41 auf, das symmetrische Peptid II : Rf « 0,64.

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Synthese von menschlichem Insulin der Formel

H-Gly-Ile-Val-Glu-Gln^ (A-Kette) 1 2 3 4 5 )

Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Asn-OH 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21

■Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu.^ 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21

H-Phe-Val.-Asn-Gln-His-^ (B-Kette)

L 2 3 4 5 C

^Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys-Thr-OH

22 23 24 25 26 27 28 29 30 Das obige Produkt wird mittels des in Beispiel 1 erhaltenen Bruchstückes der Aminosäuren 6-13 der Α-Kette, nämlich H-Cys-Cys-(Acm)-Thr(But)-Ser(But)-Ile-Cys-Ser(But)-Leu-OH (I), und der folgenden weiteren Bruchstücke hergestellt:

II = Boc-Gly-Ile-Val-Glu(OBut)-GIn-NH-NH₂ (A-Kette 1-5)

III = Boc-Phe-Val-Asn-Gln-His-LeU-CyS(ACm)-Gly-Ser(But)-His-

Leu-Val-Glu(OBut)-Ala-Leu-Tyr(But)-OH (B-Kette 1-16)

IV = Bpoc-Tyr(But)-GIn-LeU-GIu(OBUt)-Asn-Tyr(But)-Cvs-Asn-OBut H-Leu-Val-Cys-Gly-Glu(OBut) -Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr (But) -Thr (But) -t

^Pro-Lys (Boc) -Thr (But) -OBut (A-Kette 14-21 + B-Kette 17-30) Das Bruchstück IV ist in der deutschen Anmeldung

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2423543

Nr. P2346147.4 (Case 4-8418+, Schweizer Anmeldung Ges. Nr. 13865/72, deutsche Offenlegungsschrift Nr. 2.346.147) beschrieben.

Das Bruchstück II kann wie folgt hergestellt werden:

1. BoC-GIy-IIe-VaI-GIu(OBUt)-GIn-OCH₃

Zu einer Suspension von 8,80 g Boc-Gly-Ile-Val-Glu (OBUt)-NH-NH₂ (vgl. Zahn et al, Z. Naturf. 21b, 763 (1966)) in 60 ml abs. DMF werden bei -35° 15 ml 3-n. HCl in Dioxan und 2,24 ml tert.Butylnitrit gegeben. Nach 15 minlitigem Rühren bei -20° werden zu der klaren Lösung nacheinander 2,95 g H-GIn-OCHo. HCl und 10 ml N-Methylmorpholin hinzugefügt. Das Reaktionsgemisch wird während 28 Stunden im Eisbad gerührt. Man fällt das Produkt mit 450 ml kaltem Wasser aus, wäscht den Niederschlag und trocknet ihn. Nach mehrfachem Verreiben mit Methanol-Essigsäureäthylester (1:20) verbleiben 8,60 g eines farblosen Pulvers. F. 223-226° (Zers.). [α]^° - -13° +1° ( c = 1 in DMF).

Im DUnnschichtchromatogramm an Silicagel ist Rf^ ⁼ 0,70, Rf im System Chloroform-Methanol-Trifluoräthanol (7:2:1) = 0,65; Rf im System Methyläthylketon-Pyridin-Wasser (65:5:20) - 0,65.

2. BoC-GIy-IIe-VaI-GIu(OBUt) -GIn-NH-NH₂

7,15 g BoC-GIy-IIe-VaI-GIu(OBUt)-GIn-OCH₃ werden in 100 ml Methanol-DMF (1:7) gelöst und mit 10 ml Hydraζinhydrat-versetzt. Nach 22-stUndigem Stehen bei Raumtemperatur verdünnt

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man die feste Masse mit 70 ml Methanol, rUhrt im Eisbad und filtriert. Der Niederschlag wird mit Methanol verrieben. Man erhält 6,2 g eines farblosen Pulvers. Es schmilzt unter Zersetzung bei 243-270°. Ia]Z. = -37° +1° (c= 0,75 in Trifluoräthanol). Im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel ist Rf₅₂ ⁼ 0,40; Rf im System Chloroform-Methanol-Trifluoräthanol (7:2:1) = 0,23; Rf im System Methyläthylketon-Pyridin-Wasser 65:5:20 = 0,57.

Die Bruchstücke I und II können wie folgt kondensiert werden zum Bruchstück V (A-Kette 1 - 13)

3. Boc-Gly-Ile-Val-Glu(OBut)-Gln-Cys-Cys(Acm)-Thr(But)-Ser(But)-Ile-Cys-Ser(But)-Leu-OH (V)

3,33 g BoC-GIy-IIe-VaI-GIu(OBUt)-GIn-NH-NH₂ in 40 ml DMF werden bei -15° mit 5,59 ml 2,5-n. Chlorwasserstoff in Essigester und 0.7 ml tert.-Butylnitrit versetzt. Nach 10 Minuten bei dieser Temperatur wird eine Lösung von 2.48 g

H-Cys-Cys (Acm) -Thr (But) -Ser(But) -Ile-Cys-Ser (But)-Leu-0H und 2,64ml N-Aethylmorpholin in 12 ml DMF zugetropft. Man lässt 1 Std. bei -10° und 15 Std. bei 0° stehen, engt dann die Reaktionslösung auf ein kleines Volumen ein und fällt mit Aether aus. Das erhaltene Rohprodukt wird einer Gegenstromverteilung unterworfen. System : Methanol-0.075-m.

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Atnmoniumacetat (pH 4. 75)-Chloroform-Tetrachlorkohlenstoff (10:3:8:4). Nach 740 Verteilungsschritten befindet sich die Substanz in den Rohren 50-83. K= 0,1.

Im DUnnschichtchromatogramni an Silicagel ist Rfο = 0,35, Rf₅₂ = 0,70.

Das Bruchstück III kann wie folgt hergestellt werden: 4. Boc-Cys (Aem) -GIy-OMe

20,5 g Boc-Cys(Äcm)-OH und 7,5 g H-GIy-OCH₃ (letztes frisch aus dem Hydrochlorid freigesetzt) werden in 250 ml Chloroform gelöst, mit 4,7 g N-Hydroxybenzotriazol und 17,3 g Dicyclohexylcarbodiimid versetzt und während 4 Std. bei 25° gerührt. Nach Abfiltrieren des Dicyclohexylharnstoffs wird mit weiteren 200 ml Chloroform verdünnt und nacheinander mit wenig 1-n. Zitronensäure, 1-m. NaHCO₃ und mit Kochsalzlösung gewaschen, über Na^SO, getrocknet und zur Trockne eingeengt. Den öligen Rückstand reinigt man durch Chromatographieren an einer Säule mit 300 g Silicagel, eingefüllt mit Essigester-Petroläther(2:1). Das reine Produkt wird mit Essigester eluiert; es ist ein OeI, das aus Essigester-Petroläther kristallisiert werden kann, F. 83 - 86°.

DUnnschichtchromatogramm auf Silicagel: Rf,~. = 0,49; Rf im System Chloroform-Methanol (9:1) = 0,42.

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5 g Boc-Cys(Acm)-GIy-OMe werden in 20 ml Methanol gelöst und mit 50 ml 4,4-n. HCl in Dioxan versetzt. Nach 10 Minuten bei 25° engt man das Volumen auf die Hälfte ein und gibt 100 ml Aether zu. Die Mutterlauge wird vom entstandenen amorphen Niederschlag abgetrennt und dieser getrocknet.

Im DUnnschichtchromatogramm auf Silicagel ist Rf in Chloroform-Methanol (7:3) - 0,45; Rf₅₂ » 0,21.

6. Boc-Leu-Cys (ACm)-GIy-OMe

32,45 g H-Cys(Acm)-GIy-OMe.HCl und 12,5 ml N-Methylmprpholin werden in 130 ml DMF gelöst, auf 0° gekühlt und mit 46 g Boc-Leu-ONp versetzt. Man rührt während 1 Std. bei 0°, dann 2 Std. bei 25°, gibt nochmals 11,8 ml N-Methylmorpholin zu und lässt über Nacht bei 25° stehen. Man kühlt sodann auf 0°, filtriert vom auskristallisierten N-Methylmorpholinhydrochlorid ab und engt das Filtrat im Hochvakuum ein. Der ölige Rückstand wird in 300 ml Essigester gelöst und nacheinander mit KOH-Lösung (5,4 g KOH in 100 ml H₂O), 0,5-n. Na₂CO₃, 1-n. Zitronensäure und NaCl-gesättigtem Wasser gewaschen und zur Trockne eingeengt. Das rohe Produkt wird durch Zerreiben mit Aether und durch Umfallen aus Benzol-Petroläther gereinigt, wobei man ein amorphes Pulver vom F. 112-113° erhält.

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Im DUnnschichtchromatogramm auf Silicagel ist Rf₅₂ ~ Oj62; Rf₁₀₀ =» 0,90; Rf in Chloroform-Methanol (8:2) = 0,65.

7. H-Leu-Cys(Acm)-GIy-OMe . HCl

30 g des unter 6. erhaltenen Produktes werden in 120 ml Methanol gelöst, mit 300 ml 4,1-n. HCl in Dioxan versetzt und während 20 Minuten bei 25° stehen gelassen. Man engt sodann auf das halbe Volumen ein, gibt 600 ml Aether zu, pulverisiert die anfänglich schmierige Fällung, filtriert ab, wäscht mit Aether und trocknet den Rückstand im Hochvakuum über KOH. Das Produkt enthält gemäss Titration mit 0,1-n. NaOH 1,1-1,3 Aequivalent HCl, je nach Trocknungsbedingungen.

Auf Silicagel ist Rf₅₂ - 0,20; Rf₁₀₀ ^s 0,23; Rf in Chloroform-Methanol (8:2) « 0,31.

8. BoC-GIn-HiS-NH-NH₂

27,9 g BoC-GIn-HiS-OCH₃ (Marchiori et al, J.Chem. Soc(C) 1967, 81) werden in 280 ml reinstem Methanol gelöst, mit 28 ml Hydrazinhydrat versetzt und während 20 Std. bei 25° stehen gelassen. Man engt im Hochvakuum zur Trockne ein und kristallisiert den Rückstand aus Methanol-Essigester-Petroläther um.

F. 187 - 189°.

Im DUnnschichtchromatogramm auf Silicagel ist Rf^₂ ~ ^,12; Rf₁₀₀= 0,1.

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9. Boc-Gln-His-Leu-CysCAcm)-Gly-OMe

25,3 g des gemäss 8. erhaltenen und fein pulverisierten Produktes werden in 260 ml DMF suspendiert und bei -20° mit 40 ml 3,2-n. HCl in Dioxan und anschliessend mit 9,45 ml tert.-Butylnitrit versetzt. Man rührt während 15 Minuten bei -12° und gibt dann eine auf 0° vorgekühlte Lösung von 28,6 g des unter 7. erhaltenen Produktes in 120 ml DMF und 28 ml N-Methyl-morpholin zu. Nach einstündigem Rühren bei 0° gibt man nochmals 10,5 ml N-Methylmorpholin zu und lässt dann während 20 Std. bei 0° stehen. Das auskristallisierte Methylmorpholin-hydrochlorid wird abfiltriert, das Filtrat im Hochvakuum eingeengt, zweimal mit Essigester verrieben und der pulverige Rückstand getrocknet» Man reinigt durch Gegenstromverteilung über 200 Stufen im System Methanol-Puffer-Chloroform (2:1:4) (Puffer:38,5 g Ammoniumacetat + 57,2 ml Eisessig + 1000 ml Wasser). Das chromatographisch reine Pentapeptidderivat erhält man aus den Rohren 54 - 88 (r = 71; K = 0,55) durch Einengen zur Trock-

max

ne und Wegsublimieren des Puffersalzes im Hochvakuum bei 45°. Es wird nochmals 5%ig in Wasser gelöst und lyophilisert; man erhält auf diese Weise das Acetat des Produktes. Im Dünnschichtehromatοgramm auf Silicagel ist Rf^q =0,4; =0,5; Rf_101A =0,73.

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10. H-Gln-His-Leu-CysCAcm)-Gly-OMe. 2 HCl

28 g des unter 9. erhaltenen Produktes werden in 140 ml Trifluoräthanol und 140 ml Methanol gelöst, auf gekühlt und mit 280 ml 4,4-n. HCl in Dioxan versetzt. Man lässt während 5 Minuten bei 25° reagieren, kühlt wieder auf 0°j fällt durch Zugabe von 560 ml Essigester und 280 ml Petroläther aus und dekantiert die überstehende Lösung. Der amorphe Rückstand wird durch Zerreiben mit Essigester-Petroläther (2:1) pulverisiert und im Hochvakuum über KOH bei Raumtemperatur getrocknet.

Auf Silicagel ist Rf_101A = 0,4; Rf₁₀₇ = 0,35.

11. Boc-Asn-Gln-His-Leu-Cys(Acm)-Gly-OMe

27,3 g des unter 10 erhaltenen Produktes und 40,5 g Boc-Asn-ONp werden in 140 ml DMF gelöst, mit 12,6 ml N-Methylmorpholin versetzt, 1 Std. bei 25° gerührt, nochmals mit 8,4 ml N-Methylmorpholin versetzt und über Nacht stehen gelassen. Nach Abkühlen auf 0° wird das Methylmorpholinhydrochlorid abfiltriert, das Rohprodukt aus dem Filtrat mit Essigester ausgefällt und durch Umfallen aus Methanol-Aether gereinigt.

Man erhält das Hexapeptidderivat als amorphes Pulver vom F. 175 - 77° (Zers.)·

Auf Silicagel· ist Rf₁₀₁A ⁼ °>⁶» ^Rf107 ⁼ °>^65;

^Rf43C - °>³; ^RfH0 ⁼ °'⁴⁵·

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12. H-ASn-GIn-HiS-LeU-CyS(AcOi)-GIy-OMe . 2HCl

26 g des unter 11. erhaltenen Produktes werden in 130 ml Trifluoräthanol und 130 ml Methanol gelöst, mit 260 ml 4,8-n. HCl in Dioxan versetzt und während 20 Minuten bei 25° stehen gelassen. Das Hexapeptidderivat wird alsdann durch Zufliessenlassen von 520 ml Essigester und 260 ml Petroläther bei 0° in pulveriger Form ausgefällt, abfiltriert und im Hochvakuum liber KOH getrocknet. Auf Silicagel: Rf_101A = 0,3; Rf₄₃₀ = 0,12.

13. Boc-Val-Asn-Gln-His-Leu-CysCAcm)-GIy-OMe

33 g Boc-Val-ONp, 27 g des unter 12. erhaltenen Produktes und 18 ml N-Methylmorpholin werden in 400 ml DMF gelöst und während 6 1/2 Stunden auf 50° erwärmt. Man engt sodann im Hochvakuum bis zum OeI ein und fällt das Rohprodukt durch Zugabe von Aether aus. Es wird durch Umfallen aus Methanol-5%iger NaHCO.,-Lösung und aus Methanol-Essigester gereinigt, F. 210-12°. Auf Silicagel: Rf_101A ^β 0,6; Rf₅₂ ⁼ · 0,15; Rf₄₃₀ = 0,35.

14. Boc-Val-Asn-Gln-His-Leu-CysCAcm) -GIy-OH

20,6 g des unter 13. erhaltenen Produktes werden in 164 ml Methanol und 226 ml Wasser unter Erhitzen zum Sieden gelöst, auf 10° abgekühlt, mit 82 ml 1-n. NaOH versetzt und dann während 8 Minuten bei 25° stehen gelassen. Man neu-

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tralisiert durch Zugabe von 82 ml 1-n. HCl, engt auf ein Volumen von ca. 250 ml ein und unterwirft diese Lösung zur Reinigung einer Gegenstromverteilung im System n-Butanol-Ammonacetatpuffer (7,7 g Ammoniumacetat + 5,72 ml Eisessig + 1000 ml Wasser; pH = 4,75). Nach 166 Stufen isoliert man das reine Heptapeptidderivat aus den Rohren

Nr. 54 - 75 (r _o = 64; K= 0,63) durch Eindampfen zur Trockmax

ne, Absublimieren des Puffers und Trocknen bei 45° im Hochvakuum als amorphes Pulver vom F. 220° (Zers.) . Auf Silicagel: Rf_43E = 0,45; Rf₁₀I ^{= 0>5; Rf}87 ⁼ °'⁵⁵·

15. H-Val-Asn-Gln-His-Leu-CysCAcm)-GIy-OH . 2HCl.

9 g des unter 14. erhaltenen Produktes werden in 225 ml 0,72-n. HCl in 94%igem Eisessig suspendiert und während 30 Minuten bei 25° gerührt, wobei man nach ca. 20 Minuten eine klare Lösung erhält. Diese wird lyophilisiert und der Trockenrlickstand im Hochvakuum bei 30° nach getrocknet .
Auf Silicagel: Rf_43E = 0,18; Rf₄₅ = 0,18; Rf_101A =0,3.

16. Boc-Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys (Acm) -GIy-OH

467 mg des unter 15. erhaltenen Produktes werden in 10 ml DMF und 0,5 ml Wasser gelöst, mit 765 mg (Boc-Phe^O

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und 275 uX N-Methylmorpholin versetzt und während 3 Std. bei 50° stehen gelassen. Man engt sodann im Hochvakuum bis zur Bildung eines gallertigen Rückstandes ein, der mit 0,1-m. Ammoniumacetatpuffer (pH 4,75) verrieben, abfüttert, mit Wasser gewaschen und getrocknet wird. Das Rohprodukt wird durch Verreiben mit Aether und anschliessend durch Umfallen aus Trifluoräthanol-Aether gereignigt. Auf Silicagel: Rf_43E " 0,45; Rf₄₅ =0,27; Rf₅₂ = 0,21.

17. Boc-Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys(Acm)-Gly-Ser(But)-His-LeU-VaI-GIu(OBUt) -AIa-Leu-Tyr (But) -OMe

1,66 g des unter 16. erhaltenen Produktes und 290 mg Toluolsulfonsäure-monohydrat werden unter Erwärmen auf 45° in 32 ml absolutem DMF gelöst und nacheinander mit einer Lösung von 1,7 g H-Ser(But)-His-Leu-VaI-GIu(OBut)-Ala-Leu-Tyr(But)-0Me (vgl. Zahn et al, Ann. Chem. 731, (1970)) in 18 ml DMF und von 467 mg N-Hydroxybenzotriazol in 6 ml DMF versetzt; zuletzt gibt man nach 2,51 g Dicyclohexylcarbodiimid in fester Form zu und rührt während 40 Minuten bei 45°. Die zu einer Gallerte erstarrende Masse wird mit 300 ml Aether homogenisiert, die sich bildende feinflockige Fällung abfiltriert, mit Aether gewaschen und getrocknet. Zur Reinigung wird das Rohprodukt in 80 ml

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Trifluoräthanol-Eisessig (19:1, Volumenteile) während 40 Min« auf 50° erwärmt, durch Zugabe von 250 ml Aether ausgefällt, abfiltriert und im Hochvakuum über KOH getrocknet. Es ist ein amorphes, in den meisten Lösungsmitteln schwerlösliches Pulver vom Zersetzungspunkt bei ca. 250°. Gemäss Titrationen enthält es 1,15 Aequ. Toluolsulfonsäure und 0,85 Aequ. Essigsäure.

Auf Silicagel: Rf₁₀₀ = 0,3; Rf₄₃₀ = 0,35; Rf₇₀ » 0,6; Rf₁₁₀ =0,6.

18. Boc-Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys(Acm)-Gly-Ser(But)-His-Leu-Val-Glu(OBut)-Ala-Leu-Tyr(But)-OH (III)

6,4 g des unter 17. erhaltenen Produktes werden bei 65° in 470 ml Trifluoraethanol gelöst, mit 145 ml Wasser und 191 ml 1-n. NaOH versetzt, während 5 Std. bei 50° gerührt, auf 20° gekühlt und mit 191 ml 1-n. HCl neutralisiert. Durch Einengen auf das halbe Volumen und Zugeben von 950 ml Wasser wird das Rohprodukt ausgefällt. Man stellt das pH durch Zugabe von 1-n. NaOH auf 7,0, lässt über Nacht bei 0° stehen, filtriert ab, wäscht mit Wasser und trocknet. Zur Reinigung verteilt man über 680 Stufen im System Methanol-1-n. Essigsäure-Chloroform-Tetrachlorkohlenstoff (10:3:5:4); Apparatur mit 200 Verteilungselementen und je

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25 ml Phasenvolumen, Kreislaufverfahren. Das reine Hexadecapeptid isoliert man aus den Rohren 540 - 594 (r =

max

550; K = 4,2) durch Einengen bis zur Gelbildung und Lyophilisation. Zur Entfernung der gebundenen Essigsäure wird in Trifluoräthanol gelöst, das 5-fache Volumen Wasser zugegeben, ein pH-Wert von 7,0 eingestellt, über Nacht bei -10° stehen gelassen, abfiltriert, gewaschen und getrocknet. Man erhält ein amorphes, schwerlösliches Pulver vom Zersetzungspunkt bei ca. 230°.

Auf SÜicagel :
Rf₁₁₀ -0,45.

Das Bruchstück III kann wie folgt mit dem in der deutschen Offenlegungsschrift Nr. 2 346 147 beschriebenen Bruchstück IV zur geschützten A-Kette 14-21+ geschützte B-Kette 1-30 (VI) kondensiert werden:

14 15 16 17 18 19 20 21 19. Bpoc-Tyr(But)-Gln-Leu-Glu(OBut)-Asn-Tyr(But)-Cys-Asn-OBut

■Ser(But)-His-Leu-Val·-Glu(OBut)-Ala-Leu-Tyr(But)-Leu-Val-Cys-Gl·y-*·^ _9 10 11 12 13 . 14. 15 16 17 18 19 20 \

r Boc-Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys (Acm) -GIy ¹^ J

1 2 3 4 5 6 7 8_ S

M31u(0But) -Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr (But) -Thr (But) -Pro-Lys (Boc) -Thr (But) -OBut 22 23 24 25 26 · 27 28 29 30

2,12 g des unter 18. beschriebenen Produktes (III) und

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14 15 16 17 18 19 20 21

2,74 g Bpoc-Tyr(But)-Gln-Leu-Glu(OBut)-Asn-Tyr(But)-Cys-Asn-OBut

Η-Leu-VaI-Cys-Gly-Glu(OBut] 17 18 19 20

vArg-Gly-Phe-Phe-Tyr(But)-Thr(But)-Pro-Lys(Boc)-Thr(But)-OBut 22 23 24 25 26 27 28 29 30

als Hydrochloric! sowie 0,94 g N-Hydroxybenzotriazol (Hydrat) werden in 92 ml IMF bei 45° gelöst, mit 0,63 g Dicyclohexylcarbodiimid versetzt und während 4 1/2 Std. bei 45° gerührt. Die Lösung wird dann in 850 ml Aether eingetropft, der feinflockige Niederschlag abfiltriert und mit Aether gewaschen.

Das Rohprodukt wird einer Gegenstromverteilung im System Methanol-0.1-m. Ammoniumacetat (pH 7.0)-Chloroform-Tetrachlorkohlenstoff (10:3:5:4) unterworfen. Nach 1200 Verteilungsschritten befindet sich das Produkt in den Rohren 15 - 42; K= 0.03.

Die Substanz zeigt im DUnnschichtchromatogramm auf Silicagel folgende Rf-Werte: R^f ₁₀₂A ^β °>⁵⁰; ^Rf52A ⁼ °>^55; ^Rf100 ⁼ °'⁴⁵·

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14 15 16 17 18 19 20 21

20. H-Tyr(But)-GIn-LeU-GIu(OBUt)-Asn-Tyr (But)-Cys-Asn-OBut

10 11 12 13 14 15 16 17 18\19 (But) -His -Leu-VaI -GIu (OBut) -Ala-Leu -Tyr (But) -Leu-Val-Cys-Gly

Boc-Phe-Val-Asn-Glu-His-Leu-Cys (Acm) -GIy ^: 12345 67 8

Glu(OBut) -Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr(But) -Thr (But) -Pro-Lys (Boc) -Thr (But) -OBut 22 23 24 25 26 27 28 29 30

(VII)

Aus dem unter 19 beschriebenen Produkt (VI) kann die Bpoc-Gruppe nach dem Verfahren der deutschen Offenelegungsschrift Nr. 2.346.147 abgespalten werden, wobei man das obige Produkt (VII) erhält:

I₅1 g des unter 19 beschriebenen Produktes V werden in 150 ml 90%igem Trifluoräthanol gelöst, mit 0,12-n. Chlorwasserstoff in 90%igem Trifluoräthanol auf pH 0,5 gestellt und mittels eines pH-Staten auf diesem Wert gehalten. Nach 1 1/2 Std. gibt man 1' ml Pyridin zu und dampft die Lösung zur Trockne ein. Der Rückstand wird zweimal mit Aether verrieben, filtriert und getrocknet. Das Produkt (Hydrochlorid von VII) weist im Dünnschicht ehromatοgramm auf Silicagel folgende Rf-Werte auf: Rf_52A = 0,25 i Rf₁₀₀ = 0,30; Rf₄₃₀ - 0,40; Rf^ - 0,35.

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Das Bruchstück VII kann mit dem unter 3. beschriebenen Bruchstück V zu den über eine Disulfidbrücke verbundenen geschützten Sequenzen A und B des ratenschiisehen Insulins (VIII) kondensiert werden:

1234 567 8 .9

21. BoC-GIy-IIe-VaI-GIu(OBUt) -Gln-Cys-Cys(Acm) -Thr(But)-Ser(But) -Hell 12 .13 14 15 16 17 18 19 20 21 Cy s-Ser (But) -Leu-Tyr (But) -Gln-Leu-Glu(OBut) -Asn-Tyr (But) -Cys-Asn-OBut

10 11. 12 13 14 15 16 17 18 I9/ 20 ^Ser(But)-His-Leu-Val-Glu(OBut)-Ala-Leu-Tyr(But)-Leu-Val-Cys-Gly-

I 2 3 4 5 6 7 8 Boc-Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys(Acm)-

(21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 ^Glu(OBut)-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr(But)-Thr(But)-Pro-Lys(Boc)-Thr(But)-OBut

950 mg BoC-GIy-IIe-VaI-GIu(OBUt)-GIn-CyS-CyS(ACm)-

Thr(But)-Ser(But)-Ile-Cys-Ser(But)-Leu-OH (V) und 360 mg des unter 20. beschriebenen Produktes werden in 15 ml DMF gelöst, 70 jU/1 N-Aethylmorpholin, 136 mg N-Hydroxybenzotriazol und 150 mg Dicyclohexylcarbodiimid zugegeben. Die Lösung wird 5 Std. bei 45° gehalten, dann abgekühlt und mit 100 ml Aether versetzt. Der Niederschlag wird abfiltriert, mit Aether gewaschen und getrocknet.

Zur Reinigung wird das Rohprodukt einer Gegenstromverteilung im System Methanol-0,l-m. Ammoniumacetat (pH 4.75)-Chloroform-Tetrachlorkohlenstoff (20:6:11:9) unterworfen.

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Nach 1425 Verteilungsschritten befindet sich die Substanz in den Rohren 42 - 66. K = 0,05 . Das Produkt weist im Dünnschichtchromatogramm auf Silicagel folgende Rf-Werte auf: Rf₄₅ = 0,35; Rf₅₂ = 0,40; Rf., -, _ς = 0,60.

22. Menschliches Insulin (h-Insulin)

a) Aus dem unter 21. beschriebenen Produkt werden die Schutzgruppen vom tert.Butyl-Typ mit Trifluoressigsäure und die Mercaptoschutzgruppen mittels Jod abgespalten, wobei gleichzeitig die zweite Disulfidbrücke zwischen den Ketten A und B gebildet wird:

55 mg des unter 21. beschriebenen Produktes werden bei Raumtemperatur 30 Minuten mit 95%iger Trifluoressigsäure behandelt. Die Lösung wird mit 60 ml 50%iger Essigsäure verdünnt und sofort zu 15 ml 0,l~^m· Jodlösung in Eisessig getropft. Nach 10 Minuten wird mit 1,8 ml 1-m. wässeriger Ascorbinsäurelösung entfärbt und diese Lösung auf einer 450 ml ■ Säule aus Sephadex G 25 in 50%iger Essigsäure entsalzt. Das im UV bei 280 nm absorbierende Eluat wird im Vakuum eingeengt und gefriergetrocknet. Aus diesem Rohprodukt wird das h-Insulin durch Verteilung im System tert.Butanol- 1-m. Ammoniumacetat (pH 7,1)-Chloroform (10:10:0,5) gevonnen; K= 0,35.

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Das Produkt kristallisiert aus einem 0,095-m. Na-citrat-Puffer pH 6,0, enthaltend 0,03-m. NaCl, 0,012-m. Zn Cl₂ und 16 Vol%

Aceton, in den typischen rhombοedrisehen Kristallen.

Im Dünnschichtchromatogramm an Cellulose ist Rf,_m = 0,55; Rf₁₁^. = 0,45. Elektrophoresen auf Celluloseacetat:

pH 1,9: Laufstrecke 9 cm gegen die Anode; pH 8,6: Laufstrecke 7 cm gegen die Kathode (Puffer nach Brandenburg et al, Hoppe-Seyler^rs Z. Physiol. Chem. 3_5_3, 599 (1972)).

b) Aus dem unter 21. beschriebenen Produkt werden zuerst die Mercaptoschutzgruppen mittels Jod abgespalten unter gleichzeitiger Bildung der zweiten Disulfidbrücke, anschliessend werden die Schutzgruppen vom tert.Butyl-Tyρ mit Trifluoressigsäure entfernt.

55 mg des unter 21. beschriebenen Produktes in 20 ml 87,5%iger Essigsäure werden zu 15 ml 0,1-m. Jodlösung in Eisessig, verdünnt mit 40 ml 50%iger Essigsäure, getropft und 10 Minuten bei Raumtemperatur gerührt. Das überschüssige Jod wird mit 1,8 ml 1—m wässeriger Ascorbinsäurelösung entfärbt und das Reaktionsgemisch auf einer 450 ml Säule aus Sephadex G 25 in 50%iger Essigsäure entsalzt. Das im UV bei 280 nm absorbierende Eluat wird im Vakuum eingeengt und gefriergetrocknet. Der Rückstand wird 30 Minuten mit 95%iger Trifluoressigsäure behandelt und mit Aether gefällt. Aus diesem Rohprodukt wird das h-Insulin wie bei 22. beschrieben erhalten.

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Beispiel 4:

Bildung der Cystinverbindung aus S-Trityl-cysteinpeptidketten in Anwesenheit einer S-Acm-Cysteinpeptidkette.

Zu 2,7 mg (5ILMoI) Acetyl-GIy-Cy sCTrt)-GIy-OCH₀ (I) und 2,7 mg (5 UMoI) Z-Phe-Cys(ACm)-GIy-OCH₃ (II), gelöst in 0,8 ml 1,l,l,3,3,3-Hexafluor-2-propanol werden 0,3 ml 0,2-m. Jodlösung in Methylenchlorid gegeben. Nach 10 Minuten Rühren bei Zimmertemperatur wird mit 0,4 ml 1-m. wässeriger Ascorbinsäurelösung entfärbt. Laut DUnnschichtchromatogramra an Silicagel enthält die Reaktionslösung als einziges Cystinpeptid das (Acetyl-Gly-Cys-Gly-0CH^)₉ (III) und ausserdem unverändertes Acm-Cysteinpeptid (II). Die Rf-Werte der Verbindungen I, II und III in den Systemen Chloroform-Methanol (85:15, V:V) = System A, und Chloroform-Trifluoräthanol (85:15, V:V) System B, Laufstrecke 15 cm, sind folgende:

II III

0,	53	0,	58	0,	17
0,	24	0,	26	0,	00

Die Ausgangsstoffe können wie folgt hergestellt werden:

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I. a) Trt-Cys(Trt)-GIy-OMe

Eine Suspension von 3,86 g H-GIy-OMe.HCl in 60 ml DMF wird unter Rühren bei 22° mit 4,28 ml Triäthylamin und anschliessend mit 20 g Trt-Cys(Trt)-OSu . C₆H,. (B. Kamber et al., HeIv. Chim. Acta 53, 556 (1970)) versetzt, während 2 Stunden gerührt und über Nacht stehen gelassen. Man filtriert sodann das entstandene Triäthylatninhydrochlorid ab, und fällt das Dipeptidderivat durch Eintropfen des Filtrats in 500 ml Wasser bei 0° als amorphes Pulver aus. Im DUnnschichtchromatogramm auf Silicagel ist Rf im System Cyclohexan-Essigester (1:1) = 0,51; Rf in Toluol-Aceton (8:2) - 0,6.

b) H-Cys(Trt)-GIy-OMe

.4 g Trt-Cys(Trt)-Gly-0Me werden in 40 ml Eisessig gelöst und während 5 Minuten tropfenweise mit insgesamt 10 ml Wasser versetzt. Nach beendigtem Zutropfen rührt man noch während 30 Minuten bei Raumtemperatur, gibt weitere 30 ml Wasser zu, rührt noch während 30 Minuten bei 0° und filtriert dann das entstandene Triphenylcarbinol ab. Das Filtrat wird mit Essigester überschichtet und bei 0° mit gesättigter Sodalösung auf pH 9 - 10 gestellt. Die organische Phase wird

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mit Wasser gewaschen und zur Trockne eingeengt, wobei man ein gelbes, harziges Produkt erhält. Auf Silicagel ist Rf in CHCl₃ - MeOH (9:1) = 0,6; Rf in Butylacetat-MeOH (9:1) - 0,35; Rf₅₂ = 0,6.

c) Acetyl-Gly-Cys(Trt)-GIy-OMe

1,27 g Acetyl-Gly-OH und 1,51 ml Triäthylamin werden in 11 ml Essigester und 2 ml DMF gelöst, auf -20° gekühlt und mit 1,33 ml Pivalinsäurechlorid versetzt. Man rührt während 15 Minuten bei -10°, gibt dann eine Lösung von 3,62 g H-Cys(Trt)-GIy-OMe in 15 ml Essigester und 1 ml DMF zu, rührt während 1 Stunde bei 0° und lässt über Nacht bei 5° stehen. Man verdünnt mit Essigester,.wäscht nacheinander mit Zitronensäurelösung, Natriumbicarbonatlösung und Wasser und engt zur Trockne ein. Den Rückstand kristallisiert man aus Essigester-Petroläther; F. 192-193°.

Auf Silicagel: Rf in CHCl₃-MeOH (9:1) = 0,36; Rf in Butylacetat-MeOH (8:2) = 0,35; Rf₅₂ = 0,65.

II. Z-Phe-Cys(Acm)-GIy-OMe

1,95 g Z-Phe-OH und 0,77 ml N-Methylmorpholin werden in 10 ml Essigester gelöst, bei -20° mit 0,8 ml Pivalinsäureehlorid versetzt und während 15 Minuten bei -10° gerührt.

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Man gibt sodann eine Lösung von 1,5 g H-Cys(Acm) -GIy-OMe . HCl (vgl. Beisp. 3 unter 5) in 5 ml DMF und 20 ml Essigester sowie 0,66 ml N-Methylmorpholin zu, rührt während 1 Stunde bei 0° und lasst über Nacht bei 5° stehen. Zur Aufarbeitung wird in n-Butanol aufgenommen und nacheinander mit Zitronens'äurelö'sung, Natriumbicarbonat und Wasser gewaschen und die organische Phase zur Trockne eingeengt. Der Rückstand wird aus Methanol-Essigester-Petroläther umkristallisiert; F. 185 - 186°. Auf Silicagel: Rf in CHCl₃-MeOH (9:1) - 0,6; Rf₅₂ - 0,65; Rf₄₃₀ = 0,6.

In gleicher Weise wie oben beschrieben werden 2,7 mg Peptid I und 2,7 mg Peptid II, gelöst in 1,2 ml 2,2,2-Trifluoräthanol mit 0,3 ml 0,2-m. KJ-haltiger wässeriger Jodlösung (Titrisol-Merck) behandelt. Nach 10 Minuten bei Zimmertemperatur wird wie angegeben aufgearbeitet. In der Reaktionslösung werden das Cystinpeptid III und das Cysteinpeptid II als einzige Peptide dünnschichtchromatographisch eruiert. Rf-Werte wie oben.

Zu denselben Resultaten gelangt man, wenn man statt des Trifluoräthanols folgende Lösungsmittel verwendet:

1,1,1,3,3,3-Hexachloraceton; 1,1,1,3,3,3-Hexafluoraceton-trihydrat; 2,2,2-Trichloräthanol; 2,2,2-Tribromäthanol; 1,1,1-Trifluoraceton.

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Claims

Patentansprüche:

Γ. Verfahren zur Herstellung von Peptiden, welche mehr als eine Disulfidbindung enthalten, dadurch gekennzeichnet, dass man in einer oder zwei cysteinhaltigen Aminosäuresequenzen, in welchen Disulfidbindungen hergestellt werden sollen, zwei zu verbindende Cysteinreste durch eine Mercaptoschutzgruppe R, vom Aralkyltypus, zwei weitere -Cysteinreste durch eine Acylaminomethylgruppe R2 schützt, und die Schutzgruppen R, durch Behandlung mit Jod in Gegenwart' einer ροlyhaIogenierten niederen aliphatischen Oxy- oder Oxoverbindung oder einem entsprechenden Niederalkansäureniederalkylester entfernt, wobei gleichzeitig die Disulfidbindung zwischen diesen Cysteinresten, die durch R, geschützt waren, gebildet wird, und zu einem beliebigen Zeitpunkt nach Entfernung der polyhalogenierten Verbindung die zweite Disulfidbrücke in üblicher Weise bildet.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man als polyhalogenierte Verbindung Trifluoräthanol oder Hexafluor-2-propanol verwendet.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man die Reaktion in einem Gemisch von Trifluoräthanol und einem chlorierten Kohlenwasserstoff durchführt.

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4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man die Reaktion in einem Gemisch von Trifluoräthanol und Methylenchlorid durchführt.
5. Verfahren nach Anspruch 1-4, dadurch gekennzeichnet, dass man als Mercaptoschutzgruppe R, eine Gruppe verwendet, in der das mindestens einen,Ary!rest tragende Kohlenstoffatom an den Schwefel der Mercaptοgruppe gebunden ist.
6. Verfahren nach 1-4, dadurch gekennzeichnet, dass man als Mercaptoschutzgruppe R, die Tritylgruppe verwendet.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-6, dadurch gekennzeichnet, dass man als Mercaptoschutzgruppe R2 eine Niederalkanoylaminomethylgruppe verwendet.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-6, dadurch gekennzeichnet, dass man als Mercaptoschutzgruppe R2 die Acetylaminomethylgruppe verwendet.
9. Verfahren zur Herstellung von Peptiden wie in den Beispielen beschrieben.

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10. Trt-Cys(Trt)-Cys (Acm)-OMe.
11. Trt-Cys(Trt)-Cys(Acm)-OH.
12. Trt-Cy s (Trt)-Cy s (Acm)-Thr (But)-Ser (But)-Ile-Cys (Trt)-Ser (But)-Leu-OMe.
13. Trt-Cys (Trt) -Cys (Acm) -Thr (But) -Ser (But) -Ile-Cys (Trt)-Ser(But)-Leu-OH.
14. H-Cys (Trt)-Cys (Acm)-Thr (But)-Ser (But)-Ile-Cys (Trt.)-Ser(But)-Leu-QH.
15. H-Cy s-Cys (Acm) -Thr (But) -Ser (But) -He-Cy s-Ser (But) Leu-OH.
16. Die in den Beispielen beschriebenen neuen Bruchstücke des menschlichen Insulins frei oder geschützt.
17. Boc-Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys(Acm)-Gly-Ser(But)-His-Leu-Val-GIu (OBut)-Ala-Leu-Ty r (But)-OH.

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18.

Ser (But) -He-Cy s -Ser (But) -Leu-OH

14 15 16 17 18 19 20 21
19. Bpoc-Tyr (But) -Gln-Leu-Glu (OBut) -Asn-Tyr (But) -Cys-Asn-OBut

•Ser(But)-His-Leu-Val-Glu(OBut)-Ala-Leu-Tyr(But)-Leu-Val-Cys-Gly 9 10 11 12 13 14. 15 .16 17 18 19

Boc-Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys(Acm)-Gly· 1234567 8

GIu (OBut) -Arg-Gly-Phe-Phe-Ty r (But) -Thr (But) -Pro-Ly s (Boc) -Thr (But) -OBut 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30*/ *

14 15 16 17 18 19 20 21
20. H-Tyr (But)-Gln-Leu-Glu (OBut)-Asn-Tyr (But)-Cys-Asn-OBut

10 11 12 13

14 15 16

rSer (But) -His-Leu-Val-GIu (OBut) -Ala-Leu -Tyr (But) -Leu-Val -Cy s-Gly>

Boc-Phe-Val-Asn-Glu-His-Leu-Cys (Acm) -GIy-^ 12345 67 8

Glu(OBut)-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr(But)-Thr(But)-Pro-Lys(Boc)-Thr(But)-OBut 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 :

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12 3 4 5 6 7 8 9 10_
21. Boc-Gly-Ile-Val-Glu (OBut) -Gln-Cys-Cys(Acm)-Thr(But)-Ser (But) -Hell 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 Cys-Ser(But)-Leu-Tyr(But)-Gln-Leu-Glu(OBut)-Asn-Tyr(But)-Cys-Asn-OBut

9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 Ser(But)-His-Leu-Val-Glu(OBut)-Ala-Leu-Tyr(But)-Leu-Val-Cys-Gly

1234567 8 BoC-PlIe-VaI-ASn-GIn-HiS-LeU-CyS(ACnI)-GIy

21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 GIu (OBut) -Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr (But) -Thr (But) -Pro-Lys(Boc)-Thr (But)

-12 3 4 5 6
22. H-Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cyl^

7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21

Cys(Acm)-Th.r-Ser-Ile-Cys-Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu-Gln-Asn-Tyr-Cys-Asn-OH 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 Λθ 21

Cys(Acm)-Gly-Ser-Thr-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu

1 2 3 4 5Ρ) H-Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-^

22 23 24 25 26 27 28 29 30 Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys-Thr-OHo

A09850/1 1 35

12 3 4 5 6 7 8 9
23. BoC-GIy-IIe-VaI-GIu(OBUt)-GIn-CyS-CyS-Thr (But)-Ser (But)-Hell 12 13 14 15 16 17 / 18 19 20 21 Cys-Ser (But)-Leu-Tyr (But)-Gin-ueu-GluiOBut)-Asn-Tyr (But)-Cy s-Asn-OBut

9 10 11 12 13 14 (15 16 17 18 19J 20

SCr(BUt)-HiS-LeU-VaI-GIu(OBUt)-AIaI-LeU-TyX(BUt)-LeU-VaI-CyS-GIy

12 3 4 5 6 771 λ Boc-Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-^

22 23 24 25 26 27 28 29 30

GIu(OBut)-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr(But)-Thr(But)-Pro-Lys (Boc)-Thr(But)

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24. Verfahren zur Herstellung von Insulin, dadurch gekennzeichnet, dass man eine Sequenz herstellt, welche mindestens die Aminosäuren 6-11 der Α-Kette enthält, deren Amino-, Carboxyl- und/oder Hydroxylgruppen gegebenenfalls geschützt sind und i.n der die Cy stein gruppen in 6- und 11-Stellung durch eine Schutzgruppe R, vom Aralkyltypus und die Cysteingruppe in 7-Stellung durch eine Acylaminomethylgruppe R^ geschützt ist und dass man in dieser Sequenz die Schutzgruppen R, mit Jod in einer polyhalogenierten Oxy- oder Oxoverbindung unter Bildung der Disulfidbrücke abspaltet und dann, gegebenenfalls nach Verlängerung der Α-Kette zum Amino- und/oder Carboxylende hin, mit einer Sequenz, welche die Disulfidbrücke des Cystins der Α-Kette in 20-Stellung und der B-Kette in 19-Stellung enthält, kondensiert, wobei eiiie gegebenenfalls in dieser Sequenz vorhandene Cysteingruppe in 7-Stellung der B-Kette durch eine Acylaminomethylgruppe R^ geschützt ist, dann die A-Kette und B-Kette, wenn erforderlich, vervollständigt, wobei die Cysteingruppe in 7-Stellung der B-Kette durch eine Acylaminomethylgruppe ^ geschützt wird, die Amino-, Carboxyl- und/oder Hydroxylschutzgruppen abspaltet und, vor oder nach dieser Abspaltung, die Disulfidbrücke zwischen den beiden Cystein -Resten der A- und B-Kette durch Abspaltung der Acylaminomethylgruppen R^ und gegebenenfalls gleichzeitige Oxidation zur Disulfidbrücke bildet.

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CO
25. Verfahren nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet,

dass man als Mercaptoschutzgruppe R. die Tritylgruppe verwendet .
26. Verfahren nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, dass man als Mercapto schutzgruppe R2 die Acetylatninomethylgruppe verwendet.

,
27. Verfahren nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, dass man die Hydroxylgruppen durch die tert.-Butyläthergruppe schützt.

28. Verfahren nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, dass man die Carboxylgruppen durch die tert.-Butylestergruppe schützt.

29. Verfahren nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, dass man die Aminogruppen durch die tert.Butyloxycarbonyl- gruppe schlitzt.

30. Verfahren nach Anspruch 24-29 , dadurch gekennzeichnet, dass man als polyhalogenierte Verbindung Trifluoräthanol verwendet.

³¹ Verfahren nach Anspruch 24 - 30, dadurch gekenn- ^

zeichnet, dass man menschliches Insulin herstellt. ^

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