AT398766B - Verfahren zur intramolekularen oxidation von zwei -sh gruppen in einer peptidverbindung zu einer disulfidbrücke - Google Patents
Verfahren zur intramolekularen oxidation von zwei -sh gruppen in einer peptidverbindung zu einer disulfidbrücke Download PDFInfo
- Publication number
- AT398766B AT398766B AT137988A AT137988A AT398766B AT 398766 B AT398766 B AT 398766B AT 137988 A AT137988 A AT 137988A AT 137988 A AT137988 A AT 137988A AT 398766 B AT398766 B AT 398766B
- Authority
- AT
- Austria
- Prior art keywords
- peptide
- oxidized
- groups
- peptide compound
- oxidizing agent
- Prior art date
Links
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 49
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 37
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 title claims abstract description 26
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 title claims abstract description 16
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 title claims abstract description 16
- 239000007800 oxidant agent Substances 0.000 claims abstract description 17
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 11
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims abstract description 10
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims abstract description 10
- 238000003756 stirring Methods 0.000 claims abstract description 10
- 239000000376 reactant Substances 0.000 claims abstract description 7
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 claims abstract description 4
- KBZOIRJILGZLEJ-LGYYRGKSSA-N argipressin Chemical compound C([C@H]1C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@@H](C(N[C@@H](CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)N1)=O)N)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)NCC(N)=O)C1=CC=CC=C1 KBZOIRJILGZLEJ-LGYYRGKSSA-N 0.000 claims description 6
- 102000055006 Calcitonin Human genes 0.000 claims description 5
- 108060001064 Calcitonin Proteins 0.000 claims description 5
- GXBMIBRIOWHPDT-UHFFFAOYSA-N Vasopressin Natural products N1C(=O)C(CC=2C=C(O)C=CC=2)NC(=O)C(N)CSSCC(C(=O)N2C(CCC2)C(=O)NC(CCCN=C(N)N)C(=O)NCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C1CC1=CC=CC=C1 GXBMIBRIOWHPDT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 108010004977 Vasopressins Proteins 0.000 claims description 5
- 102000002852 Vasopressins Human genes 0.000 claims description 5
- BBBFJLBPOGFECG-VJVYQDLKSA-N calcitonin Chemical compound N([C@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1NC=NC=1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(N)=O)C(C)C)C(=O)[C@@H]1CSSC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1 BBBFJLBPOGFECG-VJVYQDLKSA-N 0.000 claims description 5
- 229960004015 calcitonin Drugs 0.000 claims description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 5
- 229960003726 vasopressin Drugs 0.000 claims description 5
- 102000005157 Somatostatin Human genes 0.000 claims description 4
- 108010056088 Somatostatin Proteins 0.000 claims description 4
- 108010010056 Terlipressin Proteins 0.000 claims description 4
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 claims description 4
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 claims description 4
- NHXLMOGPVYXJNR-ATOGVRKGSA-N somatostatin Chemical compound C([C@H]1C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@@H](CC=2C3=CC=CC=C3NC=2)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@H](C(=O)N1)[C@@H](C)O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)N)C(O)=O)=O)[C@H](O)C)C1=CC=CC=C1 NHXLMOGPVYXJNR-ATOGVRKGSA-N 0.000 claims description 4
- 229960000553 somatostatin Drugs 0.000 claims description 4
- 229960003813 terlipressin Drugs 0.000 claims description 4
- BENFXAYNYRLAIU-QSVFAHTRSA-N terlipressin Chemical compound NCCCC[C@@H](C(=O)NCC(N)=O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)[C@H]1NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC=2C=CC=CC=2)NC(=O)[C@H](CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)CNC(=O)CN)CSSC1 BENFXAYNYRLAIU-QSVFAHTRSA-N 0.000 claims description 4
- ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 7553-56-2 Chemical compound [I] ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- PPBRXRYQALVLMV-UHFFFAOYSA-N Styrene Natural products C=CC1=CC=CC=C1 PPBRXRYQALVLMV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 229910052740 iodine Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 239000011630 iodine Substances 0.000 claims description 3
- 230000001590 oxidative effect Effects 0.000 claims description 3
- 229920005989 resin Polymers 0.000 claims description 3
- 239000011347 resin Substances 0.000 claims description 3
- AZQWKYJCGOJGHM-UHFFFAOYSA-N 1,4-benzoquinone Chemical compound O=C1C=CC(=O)C=C1 AZQWKYJCGOJGHM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 230000005526 G1 to G0 transition Effects 0.000 claims description 2
- 238000003820 Medium-pressure liquid chromatography Methods 0.000 claims description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 2
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 claims description 2
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 claims description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 2
- 150000002894 organic compounds Chemical class 0.000 claims description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims description 2
- 239000012071 phase Substances 0.000 claims description 2
- 239000011148 porous material Substances 0.000 claims description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims description 2
- 238000005507 spraying Methods 0.000 claims description 2
- HQJLEFDAYKUXSA-UHFFFAOYSA-N 2,3-dihydroxycyclohexa-2,5-diene-1,4-dione Chemical compound OC1=C(O)C(=O)C=CC1=O HQJLEFDAYKUXSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims 1
- 125000003011 styrenyl group Chemical group [H]\C(*)=C(/[H])C1=C([H])C([H])=C([H])C([H])=C1[H] 0.000 claims 1
- 238000010626 work up procedure Methods 0.000 claims 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 abstract description 5
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 8
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 6
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 6
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 6
- 238000010532 solid phase synthesis reaction Methods 0.000 description 5
- QFSYADJLNBHAKO-UHFFFAOYSA-N 2,5-dihydroxy-1,4-benzoquinone Chemical compound OC1=CC(=O)C(O)=CC1=O QFSYADJLNBHAKO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical group Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 3
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 1,2-bis(ethenyl)benzene;1-ethenyl-2-ethylbenzene;styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1.CCC1=CC=CC=C1C=C.C=CC1=CC=CC=C1C=C NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000004202 aminomethyl group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])* 0.000 description 2
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 2
- 239000003456 ion exchange resin Substances 0.000 description 2
- 229920003303 ion-exchange polymer Polymers 0.000 description 2
- 229920005990 polystyrene resin Polymers 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 2
- LPXPTNMVRIOKMN-UHFFFAOYSA-M sodium nitrite Chemical compound [Na+].[O-]N=O LPXPTNMVRIOKMN-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 239000013638 trimer Substances 0.000 description 2
- USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N Ammonium acetate Chemical compound N.CC(O)=O USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005695 Ammonium acetate Substances 0.000 description 1
- VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N Ammonium hydroxide Chemical compound [NH4+].[OH-] VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 1
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 1
- 235000019257 ammonium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 229940043376 ammonium acetate Drugs 0.000 description 1
- 235000011114 ammonium hydroxide Nutrition 0.000 description 1
- 229920001222 biopolymer Polymers 0.000 description 1
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- YAGKRVSRTSUGEY-UHFFFAOYSA-N ferricyanide Chemical compound [Fe+3].N#[C-].N#[C-].N#[C-].N#[C-].N#[C-].N#[C-] YAGKRVSRTSUGEY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- XNOPRXBHLZRZKH-MQYCRUOZSA-N oxytocin Chemical compound C([C@H]1C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](N)C(=O)N1)C(=O)N1C(CCC1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(N)=O)=O)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 XNOPRXBHLZRZKH-MQYCRUOZSA-N 0.000 description 1
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011591 potassium Substances 0.000 description 1
- 238000004886 process control Methods 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000007086 side reaction Methods 0.000 description 1
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000010288 sodium nitrite Nutrition 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Description
AT 398 766 B
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur intramolekularen Oxidation von zwei -SH Gruppen in einer Peptidverbindung zu einer Disulfidbrücke, wobei man wenigstens ein Oxidationsmittel, welches -SH Gruppen zu Disulfidbrücken zu oxidieren vermag, in Wasser unter Rühren vorlegt, dann eine wässerige Lösung der zu oxidierenden Peptidverbindung mit einer Konzentration von 1 bis 100 mg Peptid pro ml Wasser langsam dosiert zugibt, die Reaktionsteilnehmer miteinander unter intensivem Rühren reagieren läßt und anschließend die rohe, eine Disulfidbrücke aufweisende Peptidverbindung aufarbeitet.
Das Prinzip der Festphasensynthese von Peptiden ist von R.B. Marrifieid zum Beispiel in "Angewandte Chemie", Band 97, (1985), Seiten 801 bis 812, beschrieben. Im "International Journal of Peptide and Protein Research", Band 25, (1985), Seiten 449 bis 474 beschreibt M. Bodanszky das Prinzip der Peptidsynthese in Flüssigphase.
Im europäischen Patent Nr. 38 516 wird eine Festphasensynthese eines Vasopressinderivates nach Marrifieid beschrieben, und in dem die Seiten 7 und 8 überbrückenden Abschnitt wird eine Oxidation erwähnt, bei dem das Oxidationsmittel zur Peptidverbindung hinzugegeben wird. Eine ähnliche Oxidation wird auch in der US-PS 4 148 787 und in "Collection Czechoslov.Chem.Comm.", Vol.31, (1966), Seiten 4581 bis 4591, beschrieben.
In der US-PS 4,093.610 wird bei einer Flüssigphasensynthese eine Oxidation mit Jod in einem niedrigen Alkanol oder in Essigsäure beschrieben.
Unter den in der DE-OS 2,723.453 und DE-PS 1,643.273 beschriebenen Bedingungen einer Oxidation werden auch Dimere entstehen, d.h. es bilden sich intermolekulare S-S-Brücken.
Auf die Problematik der intermolekularen Nebenreaktion ist auch von G.FIouret et al. im "IntJ.Peptide Protein Res.",13 (1979), Seiten 137 bis 141, hingewiesen worden.
Im übrigen sei auch auf folgende, zum Stand der Technik gehörende Literaturstellen verwiesen: K.Noda in "Int.J.Peptide Protein Res.", 19, (1982),Seiten 413 - 419; "Collection of Czechoslov.Chem.Comm.", Vol.32, (1967),Seiten 1250 bis 1257; Europäische Patentanmeldung Nr. 112 809, insbesondere Beispiel 1; US-PS 4,495.097; V.du Vigneaud et al., (1960), J.Biol.Chem.,Vol.235,Nr.12,Seiten 64 bis 66; Journal of the American Chemical Society,90:10, May 8,1968,Seiten 2577 - 2681; Von Friedrich Weygand et al Z.Naturforschg.176 Seiten 807 bis 810,B.Kamber et al, Helvetica Chimica Acta,Vol.83,Fasc.4 (1980) Seiten 900 bis 915.
Aus diesen Literaturstellen folgt, daß es bekannt ist, daß intramolekulare Reaktionen in der Regel von intermolekularen Reaktionen konkurrenziert werden, was jeweils zu normalerweise unbrauchbaren dimeren, trimeren usw., also polymeren Nebenprodukten führt. Dies ist umso ärgerlicher, wenn solche Nebenprodukte in einem fortgeschrittenen Stadium einer Synthese anfailen, denn so geht wertvolles, teures, veredeltes Material unnütz verloren.
Bislang hat man zumeist versucht, die intermolekulare Konkurrenzreaktion zu unterdrücken, indem man mit stark verdünnten Lösungen gearbeitet hat. Dies ist aber wirtschaftlich nicht vertretbar, weil große Mengen an Lösungsmittel benötigt werden und weil diese Lösungsmittel auch wieder abgedampft werden müssen, was mit einem hohen unwirtschaftlichen Zeit- und Energieaufwand verbunden ist. Letzterer Nachteil ist bei einem Verfahren der im ersten Absetz beschriebenen Art (Biopolymers, Band 17,1978,John Wiley & Sonsjnc. Seiten 1927 bis 1938; US-A 4 216 141) bekannt, wobei mit einer Ferricyanid-Oxidation in Lösung gearbeitet wird. Untersuchungen der Anmelderin haben aber gezeigt, daß dabei eine nur unbefriedigende Ausbeute erhalten wird und daß die verhältmismäßig lange Reaktionszeit (zumindest eine Stunde) für eine Verfahrensführung im industriellen Maßstab störend wirkt.
Schließlich ist es aus der US-A 4 271 068 bekannt, bei geschützten Cystein-Gruppen bei der Oxidation in Lösung zu arbeiten, wobei ähnliche Nachteile wie zuvor auftreten.
Es ist daher bis jetzt kein Verfahren zur intramolekularen Oxidation von zwei -SH Gruppen in einer Peptidverbindung bekannt geworden, bei dem die Konzentration und das Volumen des Lösungsmittels in einem vernünftigen ökonomischen Verhältnis zur zu oxidierenden Peptidverbindung und zur Verfahrensdauer derart stehen, daß hohe Ausbeuten bei einem Vermeidung unerwünschter Mebenprodukte erzielt werden. Anhand der bekannten Literatur mußte man annehmen, daß ein solches Verfahren überhaupt nicht möglich ist. Völlig überraschend wurde nun doch ein solches Verfahren gefunden.
Die Aufgabe, welche der Erfindung zugrundeliegt, besteht darin, ein Verfahren zu schaffen, mit welchem mit vergleichsweise geringen Mengen an Lösungsmittel die Verfahrensführung so gewählt werden kann, daß unerwünschte Konkurrenzreaktionen unterbleiben, wobei auch eine hohe Ausbeute erzielt werden zoll.
Das erfindungsgemäße Verfahren löst diese Aufgabe, ausgehend von einer Verfahrensführung der eingangs geschilderten Art, dadurch, daß das Oxidationsmittel zur Vermeidung einer intermolekularen Reaktion der Peptidmoleküle kovalent oder elektrostatisch an eine feste Phase gebunden ist, wobei die anfängliche Konzentration des Oxidationsmittels dem doppelten stöchiometrischen Überschuß der zu oxidierenden -SH Gruppen entspricht, und daß man die vermischten Reaktionsteilnehmer bis zu 30 Minuten 2
AT 398 766 B miteinander reagieren läßt.
Erstaunlicherweise entstehen mit dem erfindungsgemäßen Verfahren praktisch keine Produkte, die auf eine intermolekulare Reaktion schließen lassen würden. Es wurden weder Dimere noch Trimere usw. gefunden. Weiters werden mit dem erfindungsgemäßen Verfahren bei ökonomischer Verfahrensführung hohe Ausbeuten erzielt, welche in der Regei über 95%, meistens 99%, der Theorie betragen.
Im Rahmen der Erfindung kann die zu oxidierende Peptidverbindung beliebig viele -SH Gruppen enthalten, doch dürfen bei der erfindungsgemäßen Oxidation nur zwei miteinander reagieren; die restlichen -SH Gruppen müssen auf geeignete Art geschützt sein. Das im erfindungsgemäßen Verfahren verwendete Oxidationsmittel kann auch die Funktion eines Sauerstoff-Überträgers haben.
Vorzugsweise wird im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens so vorgegangen, daß der Zusatz der wässrigen Lösung der zu oxidierenden Peptidverbindung durch Einsprühen, langsames Einfließenlassen oder in an sich bekannter Weise durch Hinzutropfen erfolgt, vorzugsweise mit einer Geschwindigkeit von 10 bis 30 ml/Minute, insbesondere 20 ml/Minute. Diese Zugabegeschwindigkeit, insbesondere der Zutropfung, der zu oxidierenden Peptidverbindung zum vorgelegten Oxidationsmittel hängt ab zunächst von der Konzentration des Oxidationsmittels und dessen Reaktivität, weiters von der Konzentration der zu oxidierenden Peptidverbindung und von deren Reaktivität, ferner von der Temperatur, und schließlich vom Luftdruck (wegen Sauerstoffangebot). Die Zugabegeschwindigkeit kann vom Fachmann leicht mittels Vorversuchen ermittelt werden. Hiebei kann erfindungsgemäß die wässerige Lösung der zu oxidierenden Peptidverbindung insbesondere eine Konzentration von 1 bis 10 mg Peptid pro ml Wasser haben. Beispielsweise kann die Zugabegeschwindigkeit derart gewählt werden, daß 5g Peptidverbindung innerhalb von zwei Stunden oxidiert werden. Die Zugabe durch Hinzutropfen ist aus der US-PS 4 216 141 an sich bekannt, und zwar für die Zugabe einer Somatostatinlösung in Essigsäure zu einer Kaliumferrizyanidlösung in Wasser mit einem Gehalt an Ammoniumacetat.
Im Rahmen der Erfindung wird als Oxidationsmittel Benzochinon oder in an sich bekannter weise K3Fe-(CN)e, Jod oder Sauerstoff eingesetzt. Der pH-Wert beträgt zweckmäßig 5 bis 10, insbesondere 6,5 bis 8, die Verfahrenstemperatur beträgt zweckmäßig 1 bis 40 * C, insbesondere wird bei Raumtemperatur gearbeitet, vorzugsweise bei 20 bis 25 · C.
Es empfiehlt sich, durch intensives Rühren die zu oxidierende Peptidverbindung augenblicklich zu verteilen. Hiezu ist es gemäß einer Weiterbildung der Erfindung günstig, die wässerige Lösung der zu oxidierenden Peptidverbindung auf die ein Rotationsparaboloid beschreibende Flüssigkeitsoberfläche der gerührten, das Oxidationsmittel enthaltenden, wässerigen Lösung tropfen zu lassen.
Obwohl anzunehmen ist, daß die Reaktion augenblicklich erfolgt, ist es bevorzugt, die Reaktionsteilnehmer während längerer Zeit, d.h. bis zu 30 Minuten, miteinander reagieren zu lassen. Zweckmäßig werden vor der Aufarbeitung allenfalls vorhandene Salze entfernt, vorzugsweise mittels Ionenaustauschern, welche beispielsweise in Chromatographiesäulen gefüllt sind.
Zweckmäßig umfaßt die Aufarbeitung der Peptidverbindung eine Lyophilisation.
Das mit dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellte Rohpeptid kann auf irgendeine Art und Weise gereinigt werden, z.B. mittels Ionenaustauscher-Säulen, Gel-Chromatographie nach Molekulargewicht, Craig-Verteilung oder vorzugsweise mit einer neuen Methode zur Reinigung eines Rohpeptids mittels präparativer Mitteldruckflüssigkeitschromatographie. Diese Methode besteht darin, daß man das zu reinigende Peptid in möglichst konzentrierter Form auf eine Chromatographie-Säule aufträgt, die alkylierte hochkondensierte Polykieselsäure mit einer Korngröße von 20 bis 90 Mikrometer und mit einer Porengröße von 6 bis 30 nm als stationäre Phase enthält, und daß man dann bei einem Druck unter 40 bar mit einem mobilen Phase unter kombiniertem Zusatz zumindest eines Chelierungsmittels und zumindest einer stark polaren organischen Verbindung in geringer Konzentration eluiert und so das Gemisch auftrennt und das erhaltene Eluat fraktioniert. Für das erfindungsgemäße Verfahren können Peptidverbindungen verwendet werden, die sowohl mittels Festphasensynthese nach Merrifield ("Angewandte Chemie", Band 97 (1985), Seiten 810 bis 812) als auch in der Flüssigphasensynthese ("Int. J. Peptide Protein Res." 25, (1985), Seiten 449 bis 474) synthetisiert werden.
Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren können insbesondere folgende Peptide hergestellt werden: Terlipressin der Formel
Gly-Gly-Gly-Cys-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys-Pro-Lys-Gly-NHg .
Vasopressin und seine Derivate, Calcitonin sowie Somatostatin.
Es ist bevorzugt, mit dem erfindungsgemäßen Verfahren Terlipressin herzustellen. 3
AT 398 766 B
Entsprechende Strukturformeln sind beschrieben in: "Handbook of Biochemistry" C-164 bis C-188
Amino Acid Sequences of Proteins, C-265, Handbook of Biochemistry selected date for Molecular Biology, 2nd edition (1970), Editor: Herbert A.SOBER, PhD, veröffentlicht von: The Chemical Rubber Co., Cleveland, 5 Ohio, 44 128, und "Int. J. Peptide Protein Res." 15, (1980), Seiten 342 bis 354.
Die nachfolgenden Beispiele sollen die vorliegende Erfindung erläutern.
Beispiel 1 io Oxidation zur Herstellung^ von Jerljpressin 3,5 g deblockiertes Peptid (hergestellt mittels Festphasensynthese) der Formel Gly-Gly-Gly-Cys-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys-Pro-Lys-Gly-NH2, gelöst in 2,5 I destilliertem Wasser, wurden mit 400 ml 3M NH4OH unter Stickstoff auf pH 7,5 titriert. Diese Lösung wurde zu einer Suspension von 1 Liter von wässeriger 1,8 15 mM K3 (Fe(CN)G), elektrostatisch gebunden an 80 g AG3 - X4A Ionenaustauscher Harz in seiner Chlorid-Form, pH 7,5, unter stetigem Rühren in einer Geschwindigkeit von 20 ml pro Minute zugetropft. Nach vollständiger Zugabe wurde die Reaktion noch 30 Min. reagieren gelassen. Anschließend wurde die Suspension mit 50%iger Essigsäure auf pH 5 titriert. Ausbeute an Terlipressin der Formel 20 Gly-Giy-Gly-Cys-Tyr-Phe-Gln-Asn-CyjS-Pro-Lys-Gly-NHg: 99,6% d.Th. Mittels HPLC-Analyse wurde festgestellt, daß das so hergestellte Produkt weder Dimere noch Trimere enthielt. Wird dieses Produkt mit der 10-fachen Menge Mannit versetzt und lyophilisiert, so wurden 25 in dieser galenischen Formulierung beim Wiederauflösen in Wasser keine Aggregate erhalten.
Beispiel 2
Oxidation zur Herstellung von Vasopressin 30
Nach dem Verfahren gemäß Beispiel 1 wurden 1 mM deblockiertes Peptid (hergestellt mittels Festphasensynthese) der Formel Cys-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys-Pro-Arg--Gly-NH2, welches die Struktur von Vasopressin hatte, aber noch 2 -SH Gruppen anstelle der Disulfidbrücke aufwies, mit 2,0 mM K3 (Fe(CN)6), elektrostatisch gebunden an 90 g Ionenaustauscher-Harz (AG3 - X4A) in seiner Chloridform, oxidiert. 35 Ausbeute von Vasopressin: 99,6 % d.Th.
Beispiel 3
Oxidation zur Herstellung von Calcitonin 40
Nach dem Verfahren gemäß Beispiel 1 wurden 1 mM deblockiertes Peptid, welches die Struktur von Calcitonin hatte, aber noch 2 -SH Gruppen anstelle der Disulfidbrücke aufwies, mit 3,0 mM 2,5-Dihydroxy-1,4-benzochinon, kovalent an Styrolharz gebunden, oxidiert, welches wie folgt hergestellt wurde: a) 100 g Aminomethyi-Polystyrolharz (0,2 mM/g) werden in 500 ml 5N Salzsäure suspendiert. Unter 45 Kühlen (unter 5*C) und Rühren addiert man 20 mMol Natriumnitrit (2,5 molare Lsg). Nach 10 Minuten bei 0-5 °C wird abfiltriert und das Harz zuerst mit 1N NaHC03-Lsg, dann mit H20 bis zur Neutralität gewaschen. b) 100 g diazotiertes (a) Aminomethyi-Polystyrolharz werden zu 20 mMol 2,5-Dihydroxy-1,4-benzochinon in 500 ml 2H NaOH unter Rühren bei 5-10’C zugegeben. Nach 5 Minuten wird abfiltriert und mit so Wasser, dann mit Ethanol gewaschen.
Die Zutropfgeschwindigkeit betrug nur 10 ml/min.
Ausbeute an Calcitonin: 99,6 % d.Th. · 4 55
Claims (8)
- AT 398 766 B Beispiel 4 Oxidation zur HersteNung von Sonnatostatin 5 Nach dem Verfahren gemäß Beispiel 1 wurden 1 mM deblockiertes Peptid, welches die Struktur von Somatostatin hatte, aber noch 2 -SH Gruppen anstelle der Disulfidbrücke aufwies, mit 3,1 mM 2,5 Dihydroxy-1,4-benzochinon, kovalent an Styrolharz gebunden, oxidiert, welches wie in Beispiel 3 beschrieben hergestellt wurde. Ausbeute an Somastostatin: 99,5 % d.Th. io Patentansprüche 1. Verfahren zur intramolekularen Oxidation von zwei -SH Gruppen in einer Peptidverbindung zu einer Disulfidbrücke, wobei man wenigstens ein Oxidationsmittel, welches -SH Gruppen zu Disulfidbrucken zu oxidieren vermag, in Wasser unter Rühren vorlegt, dann eine wässerige Lösung der zu oxidierenden 75 Peptidverbindung mit einer Konzentration von 1 bis 100 mg Peptid pro ml Wasser langsam dosiert zugibt, die Reaktionsteilnehmer miteinander unter intensivem Rühren reagieren läßt und anschließend die rohe, eine Disulfidbrücke aufweisende Peptidverbindung aufarbeitet, dadurch gekennzeichnet, daß das Oxidationsmittel zur Vermeidung einer intermolekularen Reaktion der Peptidmoleküle kovalent oder elektrostatisch an eine feste Phase gebunden ist, wobei die anfängliche Konzentration des 20 Oxidationsmittels dem doppelten stöchiometrischen Überschuß der zu oxidierenden -SH Gruppen entspricht, und daß man die vermischten Reaktionsteilnehmer bis zu 30 Minuten miteinander reagieren läßt.
- 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Zusatz der wässrigen Lösung der zu 25 oxidierenden Peptidverbindung durch Einsprühen, langsames Einfließenlassen oder in an sich bekannter Weise durch Hinzutropfen erfolgt, vorzugsweise mit einer Geschwindigkeit von 10 bis 30 ml/Minute, insbesondere 20 ml/Minute.
- 3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet daß die wässerige Lösung der zu 30 oxidierenden Peptidverbindung auf die ein Rotationsparaboloid beschreibende Flüssigkeitsoberfläche der gerührten, das Oxidationsmittel enthaltenden, wässerigen Lösung tropfen gelassen wird.
- 4. Verfahren nach Anspruch 1, 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß als Oxidationsmittel Benzochin-on oder in an sich bekannter Weise K3Fe(CN)6, Jod oder Sauerstoff eingesetzt wird. 35
- 5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß man vor der Aufarbeitung allenfalls vorhandene Salze entfernt, vorzugsweise mittels Ionenaustauschern, welche beispielsweise in Chromatographiesäulen gefüllt sind.
- 6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die zu oxidierende Peptidverbindung einer Reinigung mittels präparativer Mitteldruckflüssigkeitschromatographie dadurch unterworfen wird, daß man das zu reinigende Peptid in möglichst konzentrierter Form auf eine Chromatographie-Säule aufträgt, die alkylierte hochkondensierte Polykieselsäure mit einer Korngröße von 20 bis 90 Mikrometer und mit einer Porengröße von 6 bis 30 nm als stationäre Phase enthält, daß 45 man dann bei einem Druck von unter 40 bar mit einer mobilen Phase unter Zusatz zumindest eines Chelierungsmittels und zumindest einer stark polaren organischen Verbindung in geringer Konzentration eluiert und so das Gemisch auftrennt und das erhaltene Eluat fraktioiert.
- 7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Aufarbeitung eine 50 Lyophilisation umfaßt.
- 8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Peptid, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Terlipressin der Formel 55 61v-Gly-Glv-Cys-Tyr-Phe-Gln-Asn-CysrPro-Lys-Gly-NH0, Vasopressin, Calcitonin und Somatostatin, herstellt. 5
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| AT137988A AT398766B (de) | 1988-05-26 | 1988-05-26 | Verfahren zur intramolekularen oxidation von zwei -sh gruppen in einer peptidverbindung zu einer disulfidbrücke |
| PCT/AT1988/000062 WO1989001484A1 (fr) | 1987-08-14 | 1988-08-11 | Procede d'oxydation intramoleculaire de deux groupes -sh dans un compose peptidique de façon a former un pont bisulfure et peptide produit selon ce procede |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| AT137988A AT398766B (de) | 1988-05-26 | 1988-05-26 | Verfahren zur intramolekularen oxidation von zwei -sh gruppen in einer peptidverbindung zu einer disulfidbrücke |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ATA137988A ATA137988A (de) | 1994-06-15 |
| AT398766B true AT398766B (de) | 1995-01-25 |
Family
ID=3512605
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| AT137988A AT398766B (de) | 1987-08-14 | 1988-05-26 | Verfahren zur intramolekularen oxidation von zwei -sh gruppen in einer peptidverbindung zu einer disulfidbrücke |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| AT (1) | AT398766B (de) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2020212477A1 (en) * | 2019-04-16 | 2020-10-22 | Bachem Holding Ag | Manufacture of disulfide bonded peptides |
Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE2423549A1 (de) * | 1973-05-24 | 1974-12-12 | Ciba Geigy Ag | Verfahren zur herstellung von cystinhaltigen peptiden |
| DE2723453A1 (de) * | 1976-05-24 | 1977-12-15 | Ferring Ab | Antidiuretisches desamino-asparagin hoch 4 -d-arginin hoch 8 -vasopressin sowie verfahren zu seiner herstellung |
| US4216141A (en) * | 1978-07-19 | 1980-08-05 | The Salk Institute For Biological Studies | Method for cyclization of peptides |
| US4271068A (en) * | 1968-05-10 | 1981-06-02 | Ciba-Geigy Corporation | Process for the manufacture of cystine-containing peptides |
| EP0037516A1 (de) * | 1980-03-24 | 1981-10-14 | Vega Laboratories, Inc. | N-omega substituierte Derivate der 1-Desamino-Vasopressin Analoga |
| EP0061356A2 (de) * | 1981-03-24 | 1982-09-29 | Medical College of Ohio | Antagoniste der antidiuretischen und/oder vasopressorischen Wirkung von Argininvassopressin |
| EP0112809A1 (de) * | 1982-12-21 | 1984-07-04 | Ferring AB | Vasotocinderivate |
-
1988
- 1988-05-26 AT AT137988A patent/AT398766B/de not_active IP Right Cessation
Patent Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4271068A (en) * | 1968-05-10 | 1981-06-02 | Ciba-Geigy Corporation | Process for the manufacture of cystine-containing peptides |
| DE2423549A1 (de) * | 1973-05-24 | 1974-12-12 | Ciba Geigy Ag | Verfahren zur herstellung von cystinhaltigen peptiden |
| DE2723453A1 (de) * | 1976-05-24 | 1977-12-15 | Ferring Ab | Antidiuretisches desamino-asparagin hoch 4 -d-arginin hoch 8 -vasopressin sowie verfahren zu seiner herstellung |
| US4216141A (en) * | 1978-07-19 | 1980-08-05 | The Salk Institute For Biological Studies | Method for cyclization of peptides |
| EP0037516A1 (de) * | 1980-03-24 | 1981-10-14 | Vega Laboratories, Inc. | N-omega substituierte Derivate der 1-Desamino-Vasopressin Analoga |
| EP0061356A2 (de) * | 1981-03-24 | 1982-09-29 | Medical College of Ohio | Antagoniste der antidiuretischen und/oder vasopressorischen Wirkung von Argininvassopressin |
| EP0112809A1 (de) * | 1982-12-21 | 1984-07-04 | Ferring AB | Vasotocinderivate |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2020212477A1 (en) * | 2019-04-16 | 2020-10-22 | Bachem Holding Ag | Manufacture of disulfide bonded peptides |
| US12466851B2 (en) | 2019-04-16 | 2025-11-11 | Bachem Holding Ag | Manufacture of disulfide bonded peptides |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ATA137988A (de) | 1994-06-15 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| DE69424940T2 (de) | Synthese zyklischer peptide | |
| DE3785864T2 (de) | Verfahren zur Herstellung von menschlichem Epidermalwachstumsfaktor und dessen Analogen. | |
| EP0600372B1 (de) | Verfahren zur Gewinnung von Proinsulin mit korrekt verbundenen Cystinbrücken | |
| DE19735711C2 (de) | Verfahren zur Herstellung eines Vorläufers von Insulin oder Insulinderivaten mit korrekt verbundenen Cystinbrücken | |
| DE3726655A1 (de) | Verfahren zur isolierung basischer proteine aus proteingemischen, welche solche basischen proteine enthalten | |
| EP0849277B1 (de) | Verfahren zur Gewinnung von Insulin durch Hochdruckflüssigchromatographie | |
| DE4405179A1 (de) | Verfahren zur Gewinnung von Insulin mit korrekt verbundenen Cystinbrücken | |
| DE69003595T2 (de) | Mikroproteine, Verfahren zur Herstellung derselben und Anwendung dieser Mikroproteine als Arzneimittel. | |
| CH495957A (de) | Verfahren zur Herstellung eines antidiuretisch wirksamen Polypeptids | |
| EP0354507A2 (de) | Verfahren zur Herstellung von Des-B30-Insulinen und Des-B30-Insulinderivaten | |
| DE3177306T2 (de) | Verfahren und Verbindungen zur Herstellung von H-ARG-X-Z-Y-TYR-R. | |
| EP0135720B1 (de) | Verfahren zur Herstellung von Insulin-Derivaten | |
| DE2807393A1 (de) | Verfahren zur herstellung von d,1-5-methyltetrahydrofolsaeure und deren salzen | |
| AT398766B (de) | Verfahren zur intramolekularen oxidation von zwei -sh gruppen in einer peptidverbindung zu einer disulfidbrücke | |
| DE19813849A1 (de) | Verfahren zur einstufigen Umsalzung und Aufreinigung von Oligopeptiden | |
| EP0130327A1 (de) | Moenomycin A-Derivate, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung als Antibiotika | |
| DE3888718T2 (de) | Chemische Derivate von GHL-Cu. | |
| EP0089007B1 (de) | Verfahren zur Umwandlung von Präproinsulinanaloga zu Insulinen | |
| EP0460446A1 (de) | Ein neues Kupplungsreagenz für die Peptidsynthese | |
| WO1989001484A1 (fr) | Procede d'oxydation intramoleculaire de deux groupes -sh dans un compose peptidique de façon a former un pont bisulfure et peptide produit selon ce procede | |
| DE3243358A1 (de) | Synthetisches humanes (1-38) parathormon-fragment, verfahren zu seiner herstellung und die verwendung zur behandlung der osteoporose | |
| DE69304155T2 (de) | Neue Peptid-Derivate mit Bradikyninantagonischer Wirkung, Verfahren zur deren Herstellung und pharmazeutische Zubereitungen die sie enthalten | |
| DE2038997A1 (de) | Von Polymyxinen abgeleitete Cyclopeptide und ihre Herstellung | |
| WO1989001485A1 (fr) | Purification de peptides bruts par chromatographie liquide de preparation sous une pression moyenne | |
| CH674848A5 (en) | Intramolecular peptide di:sulphide bridges formation |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| UEP | Publication of translation of european patent specification | ||
| EFA | Change in the company name | ||
| REN | Ceased due to non-payment of the annual fee | ||
| ELJ | Ceased due to non-payment of the annual fee |