DE2807393A1

DE2807393A1 - Verfahren zur herstellung von d,1-5-methyltetrahydrofolsaeure und deren salzen

Info

Publication number: DE2807393A1
Application number: DE19782807393
Authority: DE
Inventors: Federico Gennari
Original assignee: BIORESEARCH Sas
Current assignee: BIORESEARCH Sas
Priority date: 1977-02-22
Filing date: 1978-02-21
Publication date: 1978-09-07
Also published as: GB1572137A; NL190285C; AU520715B2; NZ186465A; JPS5831353B2; BE863808A; IL54052A0; EG13399A; IE780285L; YU40505B; GR71704B; FR2381047A1; AU3343078A; FI780565A; DK144944C; FR2385397B1; JPS53124297A; PT67656B; FI67082C; FI67082B

Description

PATENTANWÄLTE

PROF. DR. DR. J. REITSTÖTTER

DR.-ING. WOLFRAM BUNTE

DR. WERNER KINZEBACH

BAUERSTRASSE 22. D-SOOO MÜNCHEN 4O · FERNHUF «3891 37 63 83 · TELEX 5213208 ISAR D POSTANSCHRIFT: POSTFACH 78O. D-8O00 MÜNCHEN 43

München, 21. Februar 1978 M/19 012

BIORESEARCH S.a.S.del Dr. Livio Camozzi & C. Via Marcona 37

Mai 1and/Italien

Verfahren zur Herstellung von d,l-5-Methyltetrahydrofolsäure und deren Salzen

809836/0610

M/19 012

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von
d,l-N-[p-(2-Amino-3,4,5,6,7,8-hexahydro-5-methyl-4-oxo-6-pteridinyl) -methyl] -benzoyl-glutartiinsäure und deren Salzen
der Formel I:

(I)

worin

X für Wasserstoff, ein Alkalimetall oder ein Äquivalent eines Erdalkalimetalls steht.

In der nachfolgenden Beschreibung wird die Säure der
Formel (I) kurz als 5-Methyl-tetrahydrofölsäure (MTHF) bezeichnet.

Das neue Verfahren ist industriell anwendbar, um ein Produkt hoher Reinheit einfach und wirtschaftlich in großer Ausbeute zu erhalten.

Insbesondere d,l-5-Methyltetrahydrofölsäure wird im allgemeinen ausgehend von Folsäure nach einem Verfahren hergestellt, das die folgenden wesentlichen Stufen umfaßt:

a) Folsäure

Reduktion

Tetrahydrofölsäure,

b) Abtrennung und Reinigung der Tetrahydrofolsäure,

809 8 3 6/0610

Methylierung

c) Tetrahydrofölsäure > 5-Methyltetrahydro-

fölsäure, und

d) Abtrennung und Reinigung der 5-Methyltetrahydrofölsäure»

Stufe (a) wurde sowohl durch katalytische Hydrierung als auch durch chemische Reduktion, insbesondere unter Verwendung alkalischer Borhydride, durchgeführt. (Y. Hetefi et al. Biochem. Prep. 7, 89 (1960); K.G. Serimgeour et al. Biochemistry 5, 1438 (1966)). In dieser Stufe erhält man, egal welches bekannte Verfahren verwendet wird, eine Mischung von Folsäure, Tetrahydrofölsäure und Dihydrofölsäure, welche im wesentlichen aus den beiden ersteren Bestandteilen besteht und schwer aufzuspalten ist. Die einzig brauchbaren Verfahren bestehen darin, daß man in Stufe (b) mit sehr großen Chromatographiesäulen arbeitet und eine Reihe von Eluierungsmitteln verwendet (L. Jaenicke et al. - Z. physiol. Chem. 326, 168 (1961); J.Ci. Keresztesy et al. - Biochem. Biophysic. Res. Commun. 5, 286 (1961); H. Rüdiger et al. FE/BS/ Letters 4, 316 (1969)). Das überschüssige Borhydrid in der zu chromatographierenden Lösung wird zuerst durch eine Säure, vorzugsweise Chlorwasserstoffsäure oder Essigsäure, zersetzt.

Auch die Methylierung der Tetrahydrofolsäure (Stufe c) kann auf verschiedene Weise durchgeführt werden, am gebräuchlichsten und einfachsten ist die Umsetzung mit Formaldehyd und eine anschließende Reduktion mit einem chemischen Reduktionsmittel, bevorzugt wiederum mit einem Alkaliborhydrid (W. Sakami et al., Biochem.Prep. 10, 103 (1963)).

Die Abtrennung und endgültige Reinigung der 5-Methyltetrahydrof ölsäure (Stufe d) erfolgte bis jetzt immer durch mehr oder weniger komplexe Chromatographieverfahren, je nach der Art der zu reinigenden Mischung.

809836/0610

! Bei einem dieser Verfahren (J.A- Blair et al.. Analytical ! Biochemistry 34, 376-381 (1970), entfällt Stufe (b) und die Reaktionsmischung, in der überschüssiges Borhydrid zer- '

■ stört wurde, wird direkt mit Formaldehyd und einem anderen Alkaliborhydrid behandelt. Offensichtlich ergibt jedoch eine solche Modifizierung keine wesentliche Verbesserung, des Verfahrens. Nachdem in Stufe (a) auf jeden Fall eine j ! Mischung wie oben angegeben erhalten wird, erhält man nach Weglassen von Stufe (b) eine noch komplexere Mischung, die noch schwieriger aufzuspalten ist und somit die Reinigung in

; Stufe (d) erschwert und in dieser Stufe zu einem Verlust ; von etwa 60 % des Produkts führt.

Darüberhinaus erhält man kein hoch reines Produkt, wie es

! für pharmazeutische Zwecke notwendig wäre.

; Dies war auch der Grund, warum dieses nach dem Stand der

Technik beste Verfahren bis jetzt nie über Laborversuche

! hinausging, welche zur Herstellung kleiner Mengen an Verbindung

■ für Versuchszwecke dienten.

Es wurde nun überraschenderweise gefunden, daß man Folsäure, welche im Handel zu wirtschaftlichen Preisen leicht erhältlich ist, in großer Ausbeute in d,l-5-Methyltetrahydrofölsäure von hoher Reinheit überführen kann, ohne daß kostspielige und komplizierte chromatographische Reinigungsverfahren notwendig sind. Wenn man die Folsäure unter kritischen Reaktionsbedingungen reduziert, kann man praktisch selektiv 100 % Tetrahydrofolsäure erhalten. ^N

Das erfindungsgemäße Verfahren umfaßt im wesentlichen die folgenden Stufen:

1) Reduktion von Folsäure zu Tetrahydrofolsäure durch Natriumborhydrid in wässrig-alkalischer Lösung und unter Inertgasatmosphäre bei einer Temperatur zwischen 60 und 80 C

809836/0610

M/19 012 - 9 -

Das Verhältnis an NaBH₄ : Folsäure liegt zwischen 0,5:1 und 3:1 und die Reaktionszeit beträgt zwischen 30 Minuten und Stunden.

Bevorzugte Reaktionsbedingungen sind in diesem Fall":

- Verhältnis von NaBH. : Folsäure 0,7:1 bis 2:1,

- Reaktionszeit 1 Stunde,

- pH 7 bis 8

- Temperatur 70 ⁰C.

2) Methylierung der Tetrahydrofolsäure zu 5-Methyltetrahydrofolsäure durch Behandeln mit einer 37 %-igen, wässrigen Formaldehydlösung und dann erneut mit Natriumborhydrid. Nach beendeter Reaktion wird erneut 37 %-iger Formadehyd zugegeben.

In dieser Stufe sind die kritischen Reaktionsbedingungen wie folgt:

- pH 6 bis 8

- Temperatur 25 bis 30 ⁰C,

- Verhältnis an 37 %-igem Formaldehyd : Tetrahydrofolsäure zwischen 0,8 : 1 und 2,5 : 1,

- Verhältnis von NaBH. : Tetrahydrofolsäure zwischen 0,25 : 1 bis 1,5 : 1,

- Inertgasatmosphäre,

- Anwesenheit eines Reduktionsmittels in der letzten Reaktion^ stufe (Cystein, reduziertes Glutathion, Pantethein).

Bevorzugte Reaktionsbedingungen sind in diesem Fall:

- pH 6,5

- Temperatur 30 ⁰C . .

- Verhältnis von 37 %-igem Formaldehyd : Tetrahydrofolsäure 1,4:1.

- Verhältnis von NaBH. : Tetr.ahydrofölsäure zwischen 0,5 s und 1:1,

809836/0610

M/19 012 - 10 -

- in der Reaktionsmischung enthaltenes Reduktionsmittel: Cystein.

3) Abtrennung und Reinigung von Natrium-5-methyltetrahydrofolat.

Dies kann durch zwei gleich vorteilhafte Alternativverfahren erfolgen, da die zu behandelnde Lösung, die in Stufe (2) erhalten wurde, praktisch nur Natrium-5-methyltetrahydrofolat enthält.

A - Abtrennung durch Absorption/Desorption auf Aktivkohle.

Dabei gibt man eine Menge an Aktivkohle, die 5 bis 20 mal dem Gewicht der ursprünglich behandelten Folsäure, entspricht,aufgeschlämmt in Wasser, bei pH 6,5 bis 6,8 unter Rühren zu der endgültigen Reaktionsmischung. Die abfiltrierte Kohle suspendiert man in einer Mischung von Eluierungsmitteln bestehend aus einem Alkohol (mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen) oder 2-Methoxyäthanol und Wasser in einem Verhältnis zwischen 50/50 und 95/5. Die Mischung der Elutionsmittel enthält auch einen geringen Prozentsatz (0,2 bis 1,5 %) eines Reduktionsmittels und einen geringen Prozentsatz (0,5 bis 5 %) Ammoniak in wässriger Lösung. Das j Natrium-5-methyltetrahydrofolat kann aus der über die Aktivkohle filtrierten Filtratmischung durch Ausfälleh mit einem mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittel oder durch Konzentrieren und Lyophilisieren der Lösung oder auch in Form eines Erdalkalisalzes, aus dem die 5-Methyltetrahydrofölsäure freigesetzt werden kann, gewonnen werden.

Bevorzugte Bedingungen für die Abtrennung μηα Reinigung in Stufe A sind folgende:.

809836/0610

M/19 012 - Ii -

- Verhältnis von Aktivkohle : Folsäure 7:1,

- die Filtratmischung besteht aus Äthanol, Methanol oder 2-Methoxyäthanol und Wasser in einem Verhältnis von 80/20 Vol/Vol,

- Reduktionsmittel ist Cystein bis zu 1 % der gesamten Eluatmischung,

- 34 %ige wässrige ammoniakalische Lösung bis zu 2 % der gesamten Eluatmischung (0,7 % Ammoniak).

B - Abtrennung durch direkte Ausfällung der 5-Methyltetrahydrofolsäure aus der diese enthaltenden Lösung in Form eines Erdalkalimetallsalzes, insbsondere eines Kalziumsalzes.

Diese Alternative, die noch einfacher ist als die Alternative A ist besonders günstig, wenn die Stufen (1) und (2) in konzentriertem wässrigem Medium durchgeführt wurden und so die 5-Methyltetrahydrofölsäure aus einer konzentrierten wässrigen Lösung aufgefällt werden soll.

Die aus Stufe (2) erhaltene Lösung behandelt man mit einer konzentrierten wässrigen CaCl₂ Lösung und läßt sie etwa 12 Stunden bei einer Temperatur zwischen 0° und 5 ⁰C in Gegenwart einer geringen Menge Reduktionsmittel stehen.

Das so ausgefällte Kalzium-methyl-tetrahydrofolatpentahydrat wird durch Auflösen in einem geringen Volumen siedenden Wassers und Umkristallisation, indem man die Lösung bei 0° bis 5 ⁰C stehen läßt, gereinigt.

Das bevorzugte Verhältnis von Folsäure : CaCl₂ liegt zwischen 2:1 und 3:1,. und beträgt insbesondere 2,5.

809836/0610

M/19 012 - 12 -

Das Reduktionsmittel wird vorzugsweise ausgewählt unter Cystein, Cysteamin,reduziertem Glutathion, reduziertem Pantethein.

Das mit dem beschriebenen Verfahren erhaltene Produkt hat eine Reinheit von mehr als 99 % und wird in Ausbeuten erhalten, die grundsätzlich mehr als 80 %, bezogen auf die ursprünglich eingesetzte Folsäure betragen.

Die vorstehend beschriebenen Verfahrensstufen werden nacheinander im gleichen Reaktionsgefäß, ohne Abtrennung von Zwischenprodukten durchgeführt. Die angegebenen Verhältniswerte i beziehen sich immer auf Gewichtsverhältnisse.

Vergleicht man das erfindungsgemäße Verfahren mit dem nach dem Stand der Techik bekannten besten Verfahren, dessen wesentliche Verfahrensstufen zu Beginn der Beschreibung aufgezeigt wurden, so ist sofort offensichtlich, daß bei dem neuen Verfahren sowohl die Zwischenstufe, wie auch die chromatographische Abtrennung und Reinigung entfällt. Dies führt nich nur zu einer beträchtlichen Vereinfachung und Wirtschaftlichkeit des Verfahrens, da die bekannten Verfahren lange und kostspielige Chromatographiesäulen und lange Verfahrenszeiten benötigen, sondern führt auch zu einer beträchtlichen Zunahme der Ausbeute, da bei der chromatographischen Abtrennung große Verlauste an brauchbarem Produkt auftreten.

Weitere Verluste entstehen bei der Gewinnung des Produkts aus stark verdünnten Lösungen, was ebenfalls sehr kostspielig ist.

Die abschließende Abtrennungs- und Reinigungsstufe wird durch die Absorptions/Desorptions-Stufe über Aktivkohle oder durch die Ausfällung mit Ca-Salzen ersetzt, was äußerst einfach ist und zu einer hohen Ausbeute führt. Diese Stufen sind völlig neu bei der Herstellung von 5-Methyltetrahydrofolsäure und

deren Salzen.

809836/0610

M/19 012

Aus der vorstehenden Beschreibung ist auch ersichtlich, daß das gesamte Herstellungsverfahren für die 5-Methyltetrahydrofolsäure in Anwesenheit eines Inertgases und in einigen Stufen in Gegenwart eines Reduktionsmittels erfolgt. Dies ist notwendig um die Selbstoxydation der Tetrahydrofolsäure oder der 5-Methyltetrahydrofolsäure in die entsprechenden Dihydrofolsäuren und Folsäuren zu verhindern.

Das gleiche Selbst-Qxydationsproblem liegt bei der Konservierung von 5-tfethyltetrahydrofölsäure vor. Bis jetzt wurden als Reduktionsmittel zur Konservierung von MTHF-Säure 2-Mercaptoäthanol und Ascorbinsäure verwendet. Offensichtlich wurde dabei nicht daran gedacht, das Produkt in der Pharmazie zu verwenden, sondern es wurde nur für Laborversuche hergestellt.

2-Mercaptoäthanol ist nämlich ein toxisches Produkt mit einem Übelkeit hervorrufenden Geruch, während sich Ascorbinsäure bei den für Injektionslösungen optimalen pH-Werten (7 bis 8) rasch zersetzt.

Weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Schaffung stabilisierter Mittel mit Alkali- oder Erdalkali-5-methyltetrahydrofolaten für pharmazeutische Zwecke.

Die neuen stabilen Mittel bestehen im wesentlichen aus 5-Methyltetrahydrofolat (als aktiver Substanz) und 5 bis 50 % einer oganischen Verbindung biologischen Ursprungs, welche mindestens eine -SH Gruppe (als Stabilisator)enthält. Charakteristische Verbindungen dieser Klasse sind beispielsweise Cystein, Cysteamin, Pantethein, reduziertes Glutathion und all deren Derivate, welche eine aktive -SH Funktion aufweisen.

Alle vorgenannten Verbindungen sind nicht toxisch, bei physiologischen pH-Werten stabil und deshalb zur Herstellung flüssiger oder fester pahrmazeutischer Mittel für jegliche

809836/0610

M/19 012 - 14 -

Anwendungsart in der Humantherapie geeignet.

Die neuen pharmazeutischen Mittel besitzen hämatopoetische Wirkung, Leberschutzwirkung sowie antineoplastische Wirkung.

Die nachstehenden Beispiele sollen das erfindungsgemäße Verfahren näher veranschaulichen.

Diese Beispiele sollen selbstverständlich nicht einschränkend sein und die Reaktionsbedingungen können im Rahmen der Erfindung beliebig variiert werden.

809836/0610

μ/19 <»Γ ~ ~-Vs"- " 28Ö7393

Beispiel 1

Man gibt in ein Reaktionsgefäß 80 1 entionisiertes Wasser und suspendiert darin 2,4 kg d,l-Folsäure. Unter Umrühren > gibt man dann festes Na_CO_ zu, bis die Folsäure vollständig I gelöst ist (pH der endgültigen Lösung 7,8) , gibt dann 4,8 kg NaBH. gelöst in 40 1 H„O zu und erhitzt die Reaktionsmischung auf 70 ⁰C. Die Reaktion erfolgt eine Stunde unter Rühren, \ wobei man ständig Stickstoff durchströmen läßt. Nach beendeter i Reaktion kühlt man das Reaktionsgefäß auf 30 C und gibt : unter Umrühren 3,5 kg 37 %-igen wässrigen Formaldehyd und } 2,4 kg Natriumborhydrid, gelöst in 20 1 Wasser zu. Man läßt j eine weitere Stunde unter einem Stickstoffstrom unter Umrühren reagieren und gibt danach 0,15 kg 37 %-igen Formaldehyd und 1 kg Cystein zu. ■

Man suspendiert 17 kg Aktivkohle in 100 1 entgastem Wasser und gibt die Kohlesuspension unter Umrühren zu der Reaktionsmischung, welche auf einen pH 6,5 gebracht wurde. Nach einigen Minuten filtriert man unter Stickstoff ab und wäscht den Aktivkohlekuchen auf dem Filter mit Wasser, das 1 % Cystein enthält, bis alle anorganischen Salze völlig entfernt sind. Dann suspendiert man die Aktivkohle in 100 1 einer Lösungsmittelmischung folgender Zusammensetzung, bezogen auf das Volumen:

2-Methoxy-äthanol 80 Teile, Wasser (das 5 % Cystein enthält) 20 Teile, Ammoniak (34 %-ig) 2 Teile.

Man läßt die Suspension unter Umrühren einige Minuten stehen, filtriert dann ab und engt das Filtrat auf ein Volumen von 20 Liter ein. Das konzentrierte Filtrat gießt man dann in eine Lösung, welche 700 g CaCl₂ in 100 1 Äthanol enthält. Kalzium-5-methyltetrahydrofolat fällt aus und wird unter

809836/0610

M/19 012 - 16

Stickstoffatmosphäre abfiltriert, mit Äthanol gewaschen und
im Vakuum getrocknet.

Man erhält 2,3 kg Produkt, was einer Ausbeute von 86 %, ^; bezogen auf die ursprünglich eingesetzte Folsäure, entspricht.

Bei UV-Analyse zeigt das Produkt die folgenden Eigenschaften: j

(pH = 7, £ = 32-10³): !

Maximale Absorption bei 290 nm, j

minimale Absorption bei 245 nm ι

Verhältnis ^E ₂9(/^E245 ^{= 3}'⁸· ■

Analyse an einer Sephadex DEAE A 25 Chromatographiesäule

unter Anwendung des Verfahrens nach Nixon und Bertino (P.F. | Nixon, J.R. Bertino, Methods in Enzym. 18, 661 (1971)) j ergibt nur den 5-MethyItetrahydrofolsäure-Peak.

HPLC Analyse (Partisil-1OSAX 4,6 χ 250 mm Säule, Eluant

5 %-iges Ammoniumeitrat; pH = 6) ergibt nur den 5-Methyltetrahydrofolsäure-Peak.

NMR-Spektrum: Singulett charakteristisch für die N₅-CH₃-Gruppe bei 3^⁼ 7,5.

1 Kg des so hergestellten Kalzium-5-methyltetrahydrofolats löst man unter einem Stickstoffstrom in 40 1
Wasser, das 1 kg Cystein enthält, wobei .man erhitzt.

Man stellt den pH mit verdünnter Chlorwasserstoffsäure auf

6 ein und läßt die Mischung in einem Kühlschrank stehen.
5-Methyltetrahydrofölsäure fällt aus und wird abfiltriert,
mit etwas kaltem Wasser gewaschen und getrocknet. Das
Produkt hat einen E_2go/E₂₄₅-Wert von 3,8.

809836/0610

" " " "" 2~8Ö7393

M/19 012 - 17 -

Man wiederholt das gleiche Verfahren, ersetzt dabei jedoch in der Lösungsmittelmischung das 2-Methoxy-äthanol durch Äthanol, Methanol, 1- oder 2-Propanol, n-Butanol, t-Butanol, sek.-Butanol bzw. Isobutanol. In jedem Fall erhält man ein Produkt mit den gleichen Eigenschaften in der gleichen Ausbeute.

Beispiel 2

Man stellt 5-Methyltetrahydrofolat wie in Beispiel 1 beschrieben her und eluiert die Aktivkohle mit einer Mischung folgender Zusammensetzung:

Methanol 80 Teile, Wasser (welches 5 % reduziertes Glutathion enthält) 20 Teile, Ammoniak (34 %-ig) 2 Teile.

Nach Abfiltrieren der Aktivkohle löst man 700 g CaCl₂ in ein wenig Wasser und gibt es zu dem Eluat.

Kalzium-5-methyltetrahydrofolat fällt aus und wird unter einem Stickstoffstrom abfiltriert, mit Äthanol gewaschen und im Vakuum getrocknet.

Man erhält 2,1 kg Produkt, was einer Ausbeute von 80 %, bezogen auf die ursprünglich eingesetzte Folsäure, entspricht.

Das Produkt hat die gleichen Eigenschaften wie das gemäß Beispiel 1.

809836/0610

M/19 012 - 18 -

Beispiel 3

Man arbeitet wie in Beispiel 1 beschrieben und behandelt den Aktivkohle-Kuchen mit einer Lösungsmittelmischung, bestehend aus 2-Propanol und Wasser, das einen geringen Prozentsatz Ammoniumhydrat und Cystein enthält und engt das Filtrat dann auf ein Volumen von 20 Liter ein.

Man lyophilisiert die Lösung, wobei man 2,1 kg Natrium-5-methyltetrahydrofolat in einer Ausbeute von 80 % erhält.

Das Produkt hat einen ^E ₂go^/'^E245 ^{Wert von 3}'⁸'

Beispiel 4

Man arbeitet wie in Beispiel 1 beschrieben und engt das Filtrat ein. Bei diesem Versuch behandelt man das Filtrat mit 1,3 kg BaCl-, gelöst in 100 Liter Äthanol.

Barium-5-methyltetrahydrofolat fällt aus, die Ausbeute beträgt 83 %.

^E290^/E245 " ³'⁷⁹·

Beispiel 5

] Man arbeitet wie in Beispiel 1 beschrieben und engt das Filtrat ein. Bei diesem Versuch behandelt man es mit 0,6 kg MgCl-, gelöst in 100 Litern Äthanol.

Magnesium-5-methyltetrahydrofolat fällt aus und die Ausbeute beträgt 82 %.

^E290^/E245 ^{= 3}'⁸·

809836/0610

M/19 012 - 19 -

Beispiel

Man löst 100g KaIzium-5-methyltetrahydrofolat, das wie in Beispiel 1 beschrieben hergestellt wurde, in 4 Litern H-O und gibt dann die stöchiometrische Menge Na„SO. zu dieser Lösung. CaSO. fällt aus und wird durch Filtrieren gesammelt. Man lyoph.il is iert die klare Lösung, wobei man Natrium-5-methyltetrahydrofolat erhält.

Beispiel

Herstellung des Kalziumsalzes der MTHF-Säure.

Man suspendiert 2,50 kg Folsäure in 10 1 Wasser und gibt unter Umrühren 1 1 40 %-ige Na₂CO₃ zu.

Den pH stellt man mit Na„CO auf 7,8 ein und gibt nach Kühlen unter Stickstoffatmosphäre 1,700 kg NaBH. zu. '

Man läßt die Mischung 2 Stunden stehen, wobei man auf 70 C erhitzt, um die Reaktion zu vervollständigen; gibt dann 4,00 kg 37 %-igen wässrigen Formaldehyd und danach 0,80 kg Natriumborhydrid zu.

Das ausgefällte Natriumborat wird abfiltriert und das überschüssige Borhydrid wird entfernt, indem man den pH der Lösung mit HCl auf 6 einstellt. Man gibt 1 kg CaCl₂ gelöst in 2 Liter Wasser unter Umrühren zu und läßt die erhaltene Reaktionsmischung bei 3 ⁰C über Nacht stehen. Das Kalziummethyltetrahydrofolat fällt in Form eines amorphen weißen Pulvers aus, welches abfiltriert und mit Wasser gewaschen wird.

809836/0610

M/19 012 - 20 - !

Dieses Salz löst man in 10 1 siedendem Wasser und läßt die

gekühlte Lösung über Nacht stehen. '

Das ausgefällte kristalline Salz wird abfiltriert, gewaschen und im Vakuum getrocknet. ι

Man erhält 2,40 kg Kalzium-methyl-tetrahydrofolat-pentahydrat i in einer Gesamtausbeute von 80 %, verglichen mit der eingesetzten Folsäure.

Unter den gleichen Bedingungen kann auch das Mg-SaIz erhalten werden, welches jedoch schwierig abzufiltrieren ist.

Wie vorstehend bereits angegeben, kann die 5-Methyltetrahydrofölsäure oder deren Salze, welche erfindungsgemäß hergestellt wurden, therapeutische Mittel ergeben, welche bei Umgebungstemperatur stabil sind, wenn man sie mit 5 bis 50 % einer stabilisierenden Verbindung, ausgewählt unter Verbindungen biologischen Ursprungs, welche mindestens eine -SH-Gruppe aufweisen, vermischt.

Typische Verbindungen dieser Art sind Cystein, Cysteamin, Pantethein und reduziertes Glutathion.

Um diese Ausführungsform der Erfindung zu veranschaulichen, wird nachstehend eine typische Formulierung beschrieben, welche mit den vorgenannten Verbindungen hergestellt ist.

809836/0610

M/19 012 - 21 -

Beispiel 8

Pharmazeutisches Mittel zur oralen Verabreichung: ,

Tabletten j

Aktive Substanz 25 mg

Stabilisierungsmittel 12,5 mg j

Zur Tablettenherstellung erforderliche Trägermaterialien I bis zu einem Gewicht von 150 mg. !

I Pharmazeutisches Präparat, das zur Injektion bestimmt ist j

Aktive Verbindung 25 mg/ml j

Stabilisierungsmittel 12,5 mg/ml
Lyophilisationsträger 150 mg/ml

Wenn notwendig,bringt man die Lösung mit konz. NaOH auf pH 7,5,
füllt sie in eine Ampulle und lyophilisiert.

Unter "aktiver Substanz" versteht man:

- 5-Methyltetrahydrofölsäure,

- Natrium-5-methyltetrahydrofolat,

- Kalzium-5-methyltetrahydrofolat,

- Magnesium-5-methyltetrahydrofolat,

Unter "Stabilisierungsmittel" versteht man:

- Cystein,
-Cysteamin,

- Pantethein,

- reduziertes Glutathion.

Die Bezeichnung "Lyophilisierungsträger" umfaßt alle
Substanzen, welche nach herkömmlichen Lyophilisierungsverfahren dafür in Frage kommen können, wie Glycin.

809836/0610

M/19 012 - 22 -

In keinem Fall wurde der aktive Bestandteil des Produkts während der Aufbewahrung in der Ampulle oder während der Lyophilisation beeinträchtigt.

809836/0610

Claims

Patentansprüche

dadurch gekennzeichnet, daß man

a) Folsäure mit NaBH. in wässrig-alkalischer Lösung und unter Inertgasatmosphäre zu Tetrahydrofölsäure reduziert, wobei man ein NaBH.:Folsäure-Verhältnis von 0,5 : 1 bis 3:1, eine Reaktionstemperatur

von 60 bis 80 ⁰C und eine Reaktionszeit von 30 Minuten bis 2 Stunden wählt;

b) die Tetrahydrofölsäure mit wässrigen Lösungen von Formaldehyd und Natriumborhydrid unter Inertgasatmosphäre zu 5-Methyltetrahydrofölsäure methyliert, wobei man ein Formaldehyd : Tetrahydrofolsäureverhältnis von 0,8: 1 bis 2,5 : 1, ein NaBH. : Tetra-

809836/0610

M/19 012 - -5 - ^{LO J}

hydrofolsäure-Verhältnis von 0,25 : 1 bis 1,5 : 1, eine Temperatur von 25 bis 30 °C und einen pH im Bereich von 6 bis 8 wählt, wobei man den Formaldehyd in aufeinanderfolgenden Fraktionen zugibt, wovon die letzte mit einem Formaldehyd: Tetrahydrofolsäure-Verhältnis 0,15 : 1 zugegeben wird, wenn die Reaktion beendet ist;

c) das Natrium-5-methyltetrahydrofolat aus der wässrigen Lösung abtrennt, wobei alle diese Stufen in einem einzigen Reaktionsgefäß durchgeführt werden, ohne daß Zwischenprodukte abgetrennt wurden.

2- Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Abtrennung in Stufe c) die Reaktionsmischung mit einer Menge Aktivkohle behandelt, welche dem 5 bis 20-fachen Gewicht der ursprünglich eingesetzten Folsäure entspricht, und das Natrium-5-methyltetrahydrofolat mittels eines Eluats, bestehend aus einem Alkohol mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen oder 2-Methoxyäthanol und Wasser in einem Verhältnis von 50/50 bis 95/5 aus dem Kohle-Filterkuchen desorbiert.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß in Stufe c) die Abtrennung aus der Reaktionsmischung mit einer wässrigen Lösung eines Ca-Salzes und Abkühlen der Lösung auf 0 bis 5 ⁰C erfolgt, wobei das Verhältnis von Folsäure:Kalziumsalz zwischen 2 : 1 und 3 : 1 liegt.

809836/0610

M/19 012 - > -

Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß in Stufe a) das NaBH. : Folsäure-Verhältnis 0,7 j 1, 2:1, die Temperatur 70 ⁰C, der pH 7 bis 8 und die Reaktionszeit 1 Stunde betragen, in Stufe b) die Reaktion bei einem Gesamtverhältnis an 37 %-igem Formaldehyd : Tetrahydrofölsäure von 1,4 : 1, einem NaBH. : Tetrahydrofolsäureverhältnis zwischen 0,5 : 1 und 1 : 1 und bei einer Temperatur von 30 ⁰C und einem pH von 6,5 erfolgt.

Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man in Stufe c) eine Menge an Aktivkohle verwendet, welche dem 7-fachen Gewicht der ursprünglich behandelten Folsäure entspricht, eine Lösungsmittelmischung, bestehend aus Methanol, Äthanol, 2-Methoxyäthanol, 1- oder 2-Propanol, n-Butanol, t-Butanol, sek.-Butanol oder Isobutanol und Wasser in einem Verhältnis von 80/20, bezogejn auf das Volumen, und 1 Vol.-% eines Reduktionsmittels, und 0,7 % Ammoniak in wässriger Lösung verwendet.

6. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die 5-Methyltetrahydrofolsäure durch Ansäuern aus der wässrigen Lösung in Form eines ihrer Alkali- oder Erdalkalisalze ausfällt.

7. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch .gekennzeichnet, daß man die 5-Methyltetrahydrofolsäure in Form des Natfiumsalzes isoliert, indem man das Eluat konzentriert und das Konzentrat dann lyophilisiert.

809836/0610

M/19 012 - -ff -

8. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die 5-Methyltetrahydrofölsäure aus dem Eluat abtrennt, indem man sie in Form eines Erdalkalisalzes ausfällt.

9. Verfahren gemäß Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man das Kalzium-5-methyltetrahydrofolat reinigt, indem man das Pentahydratsalz in wenig siedendem Wasser löst und die Lösung auf 0 bis 5°C kühlt.

10. Verfahren gemäß Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß Stufe c) in Gegenwart eines Reduktionsmittels durchgeführt wird.

11. Stabile therapeutische Mittel, dadurch gekennzeichnet,

j daß sie im wesentlichen aus einem Alkali- oder Erdalkali-

salz von 5-Methyltetrahydrofölsäure und 5 bis 50 %

! eines Stabilisierungsmittels, ausgewählt unter organischen

' Verbindungen biologischen Ursprungs, welche mindestens eine aktive -SH-Gruppe aufweisen, bestehen.

12. Stabile therapeutische Mittel gemäß Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß der Stabilisator, ausgewählt ist unter Cystein, Cysteamin, Pantethein, reduziertem Glutathion und Derivaten davon, welche eine aktive -SH-Gruppe aufweisen.

809836/0610