SE437028B - Forfarande for framstellning av d,l-5-metyltetrahydro-folsyra - Google Patents

Description

7801973-4 2 upplösa. De enda användbara metoderna omfattar utförande av steg (b) med mycket stora kromatografikolonner och med an- vändning av en serie av elueringsmedel (L. Jaenicke et al.- Z.physiol. Chem. 326, 168 (l96l); J.C. Keresztesy et al. - Biochem. Biophysic Res. Commun. 5, 286 (l96l); H. Rüdiger et al. FE/BS/Letters 4, 316 (1969)). överskottet av bor- hydrid i lösningen som underkastas kromatografisk separa- tion förstörs först med en syra, företrädesvis klorvätesyra eller ättiksyra. 7 Metyleringen av tetrahydrofolsyran(steg c) kan även ut- föras genom olika metoder, av vilka den vanligaste och lämpligaste omfattar reaktion med formaldehyd och sedan re- duktion med ett kemiskt reduktionsmedel, företrädesvis åter- igenefl1alkalimetallborhydrid (W.Sakami et al., Biochem.

Prep. 10, 103 (1963)).

Separationen och den slutliga reningen av 5-metyltetra- hydrofolsyra (steg d) har alltid hitintills utförts genom kromatografiförfaranden av större eller mindre komplexitet, vilket bestäms av naturen hos den blandning som skall renas.

I en modifikation av nämnda metod (J.A.Blair et al., Analytical Biochemistry 34, 376-381 (1970)) tillämpas inte steg (b),och reaktionsblandningen i vilken överskottet bor- hydrid har förstörts behandlas direkt med formaldehyd och en annan alkalimetallborhydrid. Uppenbarligen förbättrar en sådan modifikation inte väsentligt förfarandet, eftersom steg (a) i varje fall leder till framställningen av en blandning som ovan angivits, ger uteslutandetav steg (b) en slutlig blandning som är t o m mer komplex och svår att upplösa, varvid reningssteget (d) som en följd härav försvå- ras och geren' förlust i 'detta steg av cirka 60 % av produkten.

Därtill erhålles inte en produkt med hög renhetsgrad, vilket skulle erfordras för användning på det farmaceutiska området.

Sammanfattningsvis har nämnda förfarande, vilket är det bästa för närvarande kända, aldrig gått längre än till laboratorieanvändning och framställning av små mängder sub- stans för experimentell användning.

Man har nu överraskande funnit att det är möjligt att 7801973-4 3 omvandla folsyra (en produkt som är kommersiellt lätttill- gänglig till ekonomiskt lämpliga priser) till d,l-5-metyl- tetrahydrofolsyra i myckethöga utbyten och av farmaceutisk renhetsgrad samt utan användning av dyra och komplicerade kromatografiska reningssteg, om folsyran reduceras under kritiska reaktionsbetingelser, vilket gör den praktiskt taget 100 % selektiv för framställning av tetrahydrofolsyra.

Detta utgör föremål för föreliggande uppfinning Förfarandet enligt föreliggande uppfinning omfattar väsentligen följande steg: l. Reduktion av folsyra till tetrahydrofolsyra medelst natriumborhydrid i en vattenhaltig alkalisk lösning och i en inert gasatmosfär, vid en temperatur mellan 600 och 8o°c.

Förhållandet av NaBH4: folsyra ligger mellan O,5:l och 3:1, och reaktionstiden mellan 30 min och 2 h.

På denna basis är de föredragna reaktionsbetingelserna följande: - förhållande av NaBH4 till folsyra 0,7:l, 2:1 - reaktionstid l h - pH 7-8 - temperatur 70°C. 2. Metylering av tetrahydrofolsyrantill 5-metyltetrahydro- folsyra genom behandling med en 37 % vattenlösning av form- aldehyd och sedan återigen med natriumborhydrid.

Vid slutet av reaktionen tillsättes åter 37 % form- aldehyd.

I detta stegïär de kritiska reaktionsbetingelserna följande: - pa 6 :in s - temperatur 25-30°C - förhållande av 37 % formaldehyd till tetrahydrofolsyra mellan 0,8:l och 2,5:l - förhållande av NaBH4 till tetrahydrofolsyra mellan 0,25:l och l,5:l - inert gasatmosfär - närvaro ett reduktionsmedel i det slutliga reduktions- steget (cystein, reducerad glutation, pantetein). ,7sn197s-4 4 På ovan angivna basis är de föredragna reaktionsbe- tingelserna följande: - pH 6,5 - temperatur 30°C - förhållande 37 % - förhållande av NaBH4:tetrahydrofolsyra inberäknat mellan 0,5:l och 1:1 - reduktionsmedel närvarande i reaktionsblandningen:cystein; formaldehyd:tetrahydrofolsyra l,4:l 3. Separation och rening av natrium-5-me¿yltetrahydrofo- latet. Detta steg kan utföras genom att följa två lika för- delaktiga alternativ,varvid båda möjliggöres av det faktum att den lösning som skall behandlas, erhållen i steg (2), innehåller praktiskt taget endast natrium-5-metyltetrahydro- folat: A - Separation genom adsorption/desorption på aktivt kol.

För att utföra detta steg göres en mängd av aktivt kol som motsvarar 5-20 ggr den initialt behandlade folsyrans vikt till en mos i vatten och sättes till den slutliga reak- ' tionsblandningen vid pH 6,5- 6,8 under omröring.

Det filtrerade kolet snspenderas i en elueringsmedels- blandning som består av en alkohol (med l-4 kolatomer) el- ler 2-metoxi-etanol och vatten i ett förhållande mellan 50/50 och 95/5. Elueringsmedelsblandningen innehåller även en liten procentsats (0,2 till 1,5 %) av ett reduktions- medel, och en liten procentsats (0,5 till 5 %) av ammoniak i vattenlösning. Natrium-5-metyltetrahydrofolatet kan åter- vinnas från effluentblandningen som filtrerats från kolet genom utfällning med ett vattenblandbart organiskt lösnings- medel eller genom koncentrering av lösningen och lyofili- sering, eller igen i form av ett alkaliskt jordartsmetall- salt, från vilket 5-metyltetrahydrofolsyran kan frigöras.

På ovan angiven basis är de föredragna be_tingelserna för separations- och reningssteget enligt detta alternativ A följande: - förhållande av aktivt kol:folsyra 7:1 - elueringsmedelsblandning bestående av etanol, metanol el- ler 2-metoxietanol och vatteni.ettförhâllandeav 80/20,v/v 7801973-4 S - reduktionsmedel i reaktionsblandningen:cystein till en omfattning av l % av hela elueringsmedelsblandningen - 34 % vattenhaltig ammoniaklösning till en omfattning av 2 % av hela elueringsmedelsblandningen(0,7f%avammoniak).

B ~ Separation genom direkt utfällning av 5-metyltetra- hydrofolsyran från den lösning som innehåller den i form av alkalisk jordartsmetallsalter, särskilt i form av kal- ciumsalt.

Detta alternativ, ännu enklare än alternativet A, är särskilt användbart när stegen (l) och (2) har utförts i ett koncentrerat vattenmedium ochsålundamåste 5-metyl- tetrahydrofolsyran separeras från en koncentrerad vatten- lösning. _ Lösningen som resulterar från steg (2) behandlas med en koncentrerad vattenlösning av CaCl2 och får stå under cirka 12 h vid en temperatur mellan OO och 5°C i närvaro av en liten mängd av en reducerande produkt.

Kalcium-metyl-tetrahydrofolat-pentahydratet, som så- lunda utfallit, renas genom upplösning i en liten volym kokande vatten och omkristalliseras genom att lösningen får stå vid o°-5°c.

Det föredragna förhållandet av folsyra:CaCl2 inne- slutes mellan 2:1 och 3:1 och är företrädesvis 2,5.

Den reducerande produkten är företrädesvis vald bland cystein, cysteamin, reducerad glutation och pantetein.

Den produkt som erhålles genom det beskrivna nya för- farandet har en renhetsgrad som överstiger 99 % och erhål- les i utbyten som alltid överskrider 80 % med hänsyn till begynnelsefolsyran.

De steg som i det föregående beskrivits utföres i följd i samma reaktor, utan att mellanprodukten separeras.

De förhållanden som angetts är alltid viktförhållanden.

Vid jämförelse av det nya förfarandet enligt uppfin- ningen med det bästa förfarandet enligt den kända tekniken, vars väsentliga steg sammanfattades i början av denna be- skrivning, framgår det omedelbart att det nya förfarandet möjliggör att både det mellanliggande steget och slutliga steget avseende kromatografisk separation och rening kan 7801973-4 lO 6 uteslutas. Detta leder inte enbart till ekonomiskt och av- sevärt förenklat förfarande, jämfört med det kända för- farandet son: erfordrar långa och dyrbara kolonner samt långa processtider, utan.även till en avsevärd ökning av utbytena, ty den kromatografiska separationen ger stora förluster av användbar produkt.

Ytterligare förluster uppstår vid återvinning av pro- dukten från dess mycket utspädda lösningar. Sådan återvin- ning är även uppenbart mycket dyrbar. _ Det slutliga separations- och reningssteget ersättes med adsorptions/desorptionssteget på aktivt kol eller ge- nom utfällningen med Ca-salter, vilka är synnerligen enkla och ger höga utbyten. Dessa steg är helt nya vid framställ- ningen av 5-metyltetrahydrofolsyra och dess salter.

Från den beskrivning som ovan givits kan man se att hela framställningsförfarandet av 5-metyltetrahydrofolsyra utföres i närvaro av en inert gas, och i vissa steg i när- varo av ett reduktionsmedel. Detta beror på behovet av att hindra självoxidation antingen av tetrahydrofolsyran eller av 5-metyltetrahydrofolsyran till motsvarande dihydrofol- syra och folsyra.

Samma självoxidationsproblem uppträder vid-förvaring av 5-metyltetrahydrofolsyran.

Hitintills var de reduktionsmedel som föreslogs för bevaring av MTHF-syra 2-merkaptoetanol och askorbinsyra.

Dessa substanser betydde uppenbart att ingen industriell användning av produkten på det farmaceutiska området kunde övervägas, och de var begränsade till att lösa laboratorie- problem.

I detta hänseende är 2-merkaptoetanol en toxisk pro- dukt med äcklig lukt, medan askorbinsyra snabbt sönderdelas vid de optimala pH-värdena (7-8) för injicerbara lösningar.

Stabiliserade kompositioner kan uppgöras av alkali- metall- eller alkaliska jordartsmetall-5-mety1tetrahydro- folater, som framställts enligt uppfinningen, för far- maceutisk användning.

De nya stabila kompositionerna består väsentligen av -metyltetrahydrofolat (som aktiv substans) och 5-50 % av - 7861973-4 7 av en organisk förening av biologiskt ursprung som inne- håller minst en grupp -SH (som stabilisator). Karaktäris- tiska föreningar av denna klass är exempelvis cystein, cysteamin, pantetein, reducerad glutation och alla deras derivat där -SH-funktionen bibehâlles aktiv.

Alla de ovannämnda substanserna är utan toxicitet, är stabila vid fysiologiska pH-värden och är därför lämpliga för framställningen av vätskeformiga eller fasta farmaceu- tiska föreningar för vilken som helst typ av applikation på det humana området.

De nya farmaceutiska kompositionerna besitter hemato- poetisk verkan, skyddande aktivitet pâ levern och antineo- plastisk aktivitet.

Vissa praktiska exempel av förfarandet ges nedan för att bättre illustrera och underlätta reproduktion av för- farandet enligt föreliggande uppfinning.

Det är uppenbart att dessa exempel inte är begränsande, och reaktionsbetingelserna kan varieras inom de gränser som definierats i beskrivningen, och härmed införlivas alla hjälpmedel som är väl kända eller omedelbart uppenbara för en expert på området.

EXEMPEL 1 80 liter avjoniserat vatten satsades i en reaktor och 2,4 kg av d,l-folsyra suspenderades däri. Fast Na2CO3 till- sattes under omröring tills folsyran fullständigt lösts 4 löst i 40 liter H20 tillsattes och reaktionsblandningen värmdes (slutlig lösning pH 7,8), varefter 4,8 kg NaBH till 70°C. Blandningen fick reagera i l h under omröring, medan den hela tiden var under en kvävgasström. När reak- tionen var avslutad kyldes reaktorn till 30°C och 3,5 kg av 37 % vattenhaltig formaldehyd samt 2,4 kg av natrium- borhydrid löst i 20 liter vatten tillsattes under omröring.

Reaktionen fick fortsätta i l h under omröring i en kväv- gasström. Härefter tillsattes ytterligare 0,15 kg 37 % formaldehyd och l kg cystein. 17 kg aktivt kol suspenderades i 100 liter avluftat vatten och kolsuspensionen sattes under omröring till reak- tionsblandningen, som bringats till pH 6,5. Efter några 7ao197z-4 8 minuter filtrerades blandning under kvävgas,och kolkakan på filtret tvättades med vatten, som innehöll l % cystein, tills alla oorganiska salter fullständigt hade avlägsnats.

Kolet suspenderades i 100 liter av en elueringsmedelsbland- ning med följande volymetriska sammansättning: 2-metoxi-etanol 80, vatten (innehållande 5 % cystein) 20, ammoniak (34 %) 2.

Suspensionen fick stå under omröring i några minuter, varefter den filtrerades och filtratet koncentrerades till en volym av 20 liter. Det koncentrerade filtratet hälldes i en lösning som innehöll 700 g CaCl2 i 100 liter etanol.

Kalcium-5-metyltetrahydrofolat utföll och frånfiltre- rades under kvävgas, tvättades med etanol samt torkades under vakuum. 2,3 kg av produkten erhölls, vilket motsva- rade ett utbyte av 86 % på begynnelsefolsyran.

Vid tikor: (pa = 7; E = 32-103): maximum absorption vid 290 nm UV-analys uppvisade produkten följande karaktäris- minimum absorption vid 245 nm föfnåilanae Ezgo/E245 : 3,8.

Analys på en Sephadex DEAE A-25 kromatografikolonn med användning av metoden enligt Nixon och Bertino (P.F.Nixon, J.R.Bertino, Methods in Enzym. 18, 661 (1971)) visade endast -metyltetrahydrofolsyratoppen. HPLC-analys (Partisil-l0SAX 4,6 x 250 mm kolonn; elueringsmedel 5 % ammoniumcitrat; pH = 6) visade endast 5-metyltetrahydrofolsyratoppen.

NMR-spektrum: siglet karaktäristisk för N5-CH3 vid I = 7,5. l kg av kalcium-5-metyltetrahydrofolatet, som fram- ställts på detta sätt, löstes i 40 liter vatten, som inne- höll 1 kg cystein, under värme och kvävgas. pH-värdet bringades till 6 med utspädd klorvätesyra och blandningen fick stå i ett kylskåp. -metyltetrahydrofolsyran utföll och frånfiltrerades, tvättades med litet kallt vatten samt torkades. Produkten visade ett E29O/E245-värde av 3,8.

Samma förfarande upprepades men 2-metoxi~etanolen i elueringsmedelsblandningen ersattes med etanol, metanol, 7801973-4 9 1- eller 2-propanol, n-butanol, t-butanol, sec-butanol resp isobutanol. I vart och ett av fallen erhölls en produkt med samma karaktäristikor och i samma utbyte.

EXEMPEL 2 Semetyltetrahydrofolat framställdes såsom beskrevs i exempel l. Kolet eluerades med en blandning med följande sammansättning: metanol 80, vatten (innehållande 5 % av re- ducerad glutation) 20, ammoniak (34 %) 2.

Efter filtrering av det aktiva kolet sattes 700 g CaCl2 löst i litet vatten till eluatet.

Kalcium-5-metyltetrahydrofolat utföll och frånfiltre- rades under en kvävgasström, tvättades med etanol samt tor- kades under vakuum. 2,1 kg av produkten erhölls, vilket motsvarade ett utbyte av 80 % på folsyran.

Produkten hade samma karaktäristikor som erhölls i exempel 1.

EXEMPEL 3 Framställningen upprepades såsom beskrevs under exem- pel l så långt som till behandlingen av kolkakan med elu- eringsmedelsblandningen bestående av 2-propanol och vatten, som innehöll små procentsatser av ammoniumhydrat och cystein, varefter det filtrerade eluatet koncentrerades till en vo- lym av 20 liter.

Denna lösning underkastades lyofilisering för att ge 2,1 kg natrium-5-metyltetrahydrofolat i ett utbyte av 80 %.

Produkten uppvisade ett Ezgo/E245-värde av 3,8.

EXEMPEL 4 Exempel 1 följdes så långt som till koncentreringen av eluatet. I detta försök behandlades eluatet med 1,3 kg BaCl2 löst i 100 liter etanol.

Barium-5-metyltetrahydrofolat utföll i ett utbyte av 83 %. E29O/E245 = 3,79.

EXEMPEL 5 Exempel 1 följdes så långt som till koncentreringen av eluatet. I detta försök behandlades eluatet med 0,6 kg MgCl2 löst i 100 liter etanol.

Magnesium-5-metyltetrafolat utföll i ett utbyte av 82 %. 7801973~4 Ezso/E24s = 3'8' EXEMPEL 6 100 g kalcium-5-metyltetrahydrofolat, som framställts såsom beskrevs under exempel 1, löstes i 4 liter vatten.

Den stökiometriska mängden av Na2SO4 sattes till denna lös- ning. CaS04 utfälldes och separerades genom filtrering. Den klara lösningen underkastades lyofilisering för att ge natrium-5-metyltetrahydrofolat.

EXEMPEL 7 Eramställning av kalciumsaltet av MTHF-syra. 2,50 kg av folsyran suspenderades i 10 liter och l liter 40 % Na2C03 tillsattes under omröring. pH-värdet justerades till 7,8 med Na2C03 och, efter kylning, tillsat- tes 1,700 kg NaBH4 under kvävgasatmosfär. Blandningen fick stå och reagera under 2 h medan den upphettades vid cirka 70°C för att fullborda reaktionen; 4,00 kg 37 % vattenhal- tig formaldehyd tillsattes och därefter 0,80 kg natriumbor- hydrid.

Natriumboratfällningen frånfiltrerades och överskottet borhydrid förstördes genom justering av lösningens pH-värde till 6 med HCl. 1 kg CaC12 löst i 2 liter vatten tillsattes under omröring och den erhållna reaktionsblandningen fick stå vid 3°C över natten. Kalcium-metyltetrahydrofolatet ut- föll som ett amorft, vitt pulver, vilket filtrerades och tvättades med vatten. Detta salt löstes i 10 liter kokande vatten och den kylda lösningen fick stå över natten. Det utfallna kristallina saltet filtrerades, tvättades och tor- kades under vakuum. 2,40 kg kalcium-metyl-tetrahydrofolat- -pentahydrat erhölls i ett totalt utbyte av 80 % gynnelsefolsyran. Under identiska betingelser erhålles även över be- Mg-saltet, vilket emellertid är svårt att filtrera.

Såsom angivits kan 5-metyltetrahydrofolatsyra eller dess salter, vilka erhållits genom föreliggande förfarande, bilda stabila terapeutiska kompositioner vid omgivningstem- peratur, om de blandas med 5-50 % av en. stabiliserande sub- stans som valts bland föreningar med biologiskt ursprung som innehåller minst l grupp -SH.

Karaktäristiska föreningar för denna klass är cystein, 7801973-4 ll cysteamin, pantetein och reducerad glutation.

För att illustrera denna aspekt av uppfinningen ges ett typiskt recept som kan framställas med användning av den ovan angivna föreningen.

EXEMPEL 8 Farmaceutisktpreparat i oral form.

Tabletter Aktiv substans 25 mg Stabilisator 12,5 mg Hjälpmedel för sammanpressning, nödvändig mängd för att uppgå till 150 mg.

Farmaceutiskt preparat i injicerbar form Aktiv förening 25 mg/ml Stabilisator 12,5 mg/ml Lyofiliseringshjälpmedel 150 mg/ml När det är nödvändigt bibringas lösningen ett pH-värde av 7,5 med koncentrerad NaOH, och lösningen sättes i en glasflaska och lyofiliseras.

Uttrycket "aktiv förening" betyder: - 5-metyltetrahydrofolsyra - natrium-5-metyltetrahydrofolat - kalcium-5-metyltetrahydrofolat - magnesium-5-metyltetrahydrofolat Uttrycket “stabilisator" i detta exempel betyder: - cystein - cysteamin - pantetein f reducerad glutation Uttrycket “lyofiliseringshjälpmedel" betyder varje substans som kan falla inom denna definition i vanlig lyo- filiseringsteknologi, såsom glycin.

I inget fall uppvisade lösningen någon förändring av den aktiva produkten under dess förvaring i glasflaskan eller lyofiliseringen.

Claims (10)

1. 7801973-4 lO 15 20 25 30 35 12 PATENTKRÄV l. Förfarande för framställning av d,l-5-metyltetra- hydrofolsyra och dess salter med formeln I coox CH nu 'f \ o - nn - ca (1) ° | 3 tu '““"' Én N / 2 - | 2 H__N I \fH Cflä co x HZN \\N, ?/,cH2 H där X är väte, en alkalimetall eller en ekvivalent av en alkalisk jordartsmetall, i industriell skala med höga utbyten och farmaceutisk renhet, utgående frán folsyra och natriumborhydrid samt genom successiv me- tylering av tetrahydrofolsyra med formaldehyd och na- triumborhydrid, k ä n n e t e c k n a t av att a) folsyra reduceras till tetrahydrofolsyra med NaBH4 i en vattenhaltig lösning vid ett pH mellan 7 och 8, under inertgasatmosfär, med användning av ett NaBH4;fo1- syraförhållande av O,5:l till 3:1, en reaktionstempera- :ur av eo-ao°c och en reaktionstid av ao min till 2 h; b) tetrahydrofolsyran metyleras till 5-metyltetrahydrofol- syra med vattenlösningar av formaldehyd och natriumborhyd- rid i en inertgasatmosfär, med användning av ett totalt formaldehyd:tetrahydrofolsyraförhållande av O,8:l till 2,5:1, ett NaBH4:tetrahydrofolsyraförhâllande av 0,25:l till l,5:l, en temperatur av 25-30°C och ett pH-värde av 6-B, varvid formaldehyden tillsättes i på varandra följande fraktioner, av vilka ett formaldehyd:tetrahydrofolsyraförhållande av 0,l5:l tillsättes när reaktionen avslutas; c) natrium-S-metyltetrahydrofolatet separeras från den vat- tenlösning som innehåller det, varvid dessa steg alla utfö- res efter varandra i en enda reaktor utan separering av mel- lanprodukter. (II 10 l5 20 25 30 35 78-01973--4 13

2. Förfarande enligt patentkravet l, t e c k n a t av att separationssteget (c) utföres genom k ä n n e - behandling av reaktionsblandningen med en mängd av aktivt kol som motsvarar 5-20 ggr vikten av den initialt behand- lade folsyran, och desorbering av natrium-5-metyltetra- hydrofolatet från kolet medelst ett elueringsmedel som be- står av en alkohol med l-4 kolatomer eller 2-metoxietanol och vatten i ett förhållande av 50/50 till 95/5.

3. Förfarande enligt patentkravet l, k ä n n e - t e c k n a t av att separationssteget (c) utföres genom behandling av reaktionsblandningen med en vattenlösning av ett Ca-salt och kylning av lösningen vid 0-S°C, varvid för- hållandet folsyra:kalciumsa1t inberäknas mellan 2:1 och 3:1.

4. Förfarande enligt patentkravet 1, k ä ngn e - t e c k n a t av att steget (a) utföres med ett NaBH4:fol- syraförhållande av 0,7:l - 2:1, en temperatur av 70°C, ett pH-värde av 7-8 och en reaktionstid av 1 h, och steg (b) utföres vid ett totalt 37 % formaldehyd:tetrahydrofol- syraförhållande av l,4:l, ett NaBH4ztetrahydrofolsyraför- hållande inberäknat mellan O,5:l och l:l, en temperatur av 30°C och ett pH-värde av 6.5.

5. Förfarande enligt patentkravet 2, t e c k n a t av att steget (c) utföres med användning k ä n n e - av en mängd av aktivt kol som motsvarar 7 ggr vikten av den initialt behandlade folsyran och ett elueringsmedel som består av metanol, etanol, 2-metoxietanol, 1- eller 2-propanol, n-butanol, t-butanol, sek-butanol eller isobu- tanol och vatten i ett förhållande av 80/20, v/V med l vol% av ett reduktionsmedel och 0,7 % av ammoniak i vattenlös- ning.

6. Förfarande enligt patentkravet l, t e c k n a t av att 5-metyltetrahydrofolsyranutfälles från den vattenhaltiga lösningen genom surgöring, i form av ett av dess alkalimetall- eller alkaliska jordartsmetallsalter.

7. Förfarande enligt patentkravet 1, k ä n n e - t e c k n a t av att 5-metyltetrahydrofolsyra erhålles som k ä n n e - 7801973-4 l0 14 dess natriumsalt genom koncentrering av eluatet och lyofi- lisering av koncentratet.

8. Förfarande enligt patentkravet 1, t e c k n a t av att 5-metyltetrahydrofolsyra separeras från eluatet genom utfällning i form av ett alkaliskt jord- k ä n n e - artsmetallsalt.

9. Förfarande enligt patentkravet 3, t e c k n a t av att föreningen av ka1cium-5-metyltetra- k ä n n e - hydrofolatet utföres genom upplösning av saltpentahydratet i litet kokande vatten och kylning av lösningen vid O-5°C.

10. Förfarande enligt patentkravet 3, k ä n n e - t e c k n a t av att steget (c) utföres i närvaro av en reducerande produkt.