Przedmiotem wynalazku jest nowy sposób wytwarzania kwasu d,l-N-[p-(2-amino-3,4,5,6t7,8- szesciowodoro-5-mctylo-4-keto-6-pterydynylo)-metylo]-benzoiloglutaminowego oraz jego soli, o wzorze ogólnym przedstawionym na rysunku, w którym X oznacza atom wodoru, atom metalu alkalicznego lub równowaznik metalu ziem alkalicznych. W dalszym ciagu opisu kwas powyzszy nazywany bedzie kwasem 5-metyloczterodowodorofoliowym, w skrócie MTHF.Sposób wedlug wynalazku nadaje sie do zastosowania przemyslowego, jest bardzo prosty i pozwala na osiagniecie wysokich wydajnosci.Kwas d,l-5-metyloczterowodorofoIiowy otrzymuje sie zwykle z kwasu foliowego znanymi sposobami obejmujacymi nastepujace zasadnicze etapy: a) kwasfoliowy cJa kwas czterowodorofoliowy b) oddzielanie i oczyszczanie kwasu czterowodorofoliowego c) kwas czterowodorofoliowy - kwas 5-metyloczterowodorofoliowy d) oddzielanie i oczyszczanie kwasu S-metyloczterowodorofoliowego Etap a) prowadzono zarówno na drodze katalitycznego uwodorniania jak i na drodze redukcji chemi¬ cznej, zwlaszcza przy uzyciu borowodorków alkalicznych (Y.Hetcfi i in. — Biochem. Prep. 7, 89/1960/; G.Serimgeour i in. Biochemistry 5, 1438 /l966/. W etapie tym, niezaleznie od rodzaju znanego sposobu, otrzymuje sie mieszanine kwasu foliowego, kwasu czterowodorofoliowego oraz dwuwodorofoliowego, skladajaca sie glównie z dwóch pierwszych skladników i trudna do rozdzielenia. Jedynie praktycznie uzyteczne sposoby prowadzenia etapu b) polegaja na zastosowaniu bardzo duzych kolumn chromatografi¬ cznych oraz szeregu eluentów (L. Jaenicke i in. — Z. physiol. Chem. 326, 168 /1961/; J.C. Kercsztesy i in. — Biodfem. Biophisic. Res. Comun. 5,286 /1961/; H. Rudiger i in. FE/BS/ Letters 4,316/1969/). Nadmiar borowodorku w roztworze poddawanym chromatograficznie rozdzielaniu rozklada sie uprzednio kwasem, korzystnie kwasem chlorowodorowym lub kwasem octowym.Metylowanie kwasu czterowodorofliowego (etap c) mozna prowadzic róznymi metodami z których najpospolitsza i najdogodniejsza polega na reakcji z formaldehydem i nastepnej redukcji chemicznym czynnikiem redukujacym, korzystnie znów borowodorkiem alkalicznym (W. Sakami i in. Biochem. Prep. 10, 103,/l963). Oddzielanie i koncowe oczyszczanie kwasu 5-metyloczterowodorofoliowego (etap d)dotychczas zawsze prowadzone bylo mniej lub wiecej zlozonymi sposobami chromatograficznymi, zalezacymi od natury oczyszczanej mieszaniny.2 Ul«54 W jednej z modyfikacji powyzszej metody opisanej przez (J.A. Blair i in., Analytical Biochemistry, 34, 376-381 /l970/ oraz w Brytyjskim opisie patentowym nr 1293541), etap b) pomija sie i mieszanine reakcyjna, w której rozlozono nadmiar borowodorku traktuje sie bezposrednio formaldehydem i innym borowodorkiem alkalicznym. Jednakze modyfikacja ta nie ulepsza w zasadniczy sposób procesu, poniewaz wobec tego ze etap a) zawsze prowadzi do wytworzenia wyzej wymienionej mieszaniny, ominiecie etapu b) daje w efekcie mieszanine koncowa jeszcze bardziej zlozona i jeszcze trudniejsza do rozdzielenia, co w konsekwencji utrudnia etap oczyszczania d) i utrate w tym etapie okolo 60% produktu. Ponadto nie uzyskuje sie produktu o wysokiej czystosci, wymaganego do celów farmaceutycznych. W rezultacie, powyzszy sposób, który byl dotad najbardziej znany, nie wyszedl nigdy poza skale laboratoryjna dowytwarzania malych ilosci substancji do celów doswiadczalnych.Stwierdzono, ze sposobem wedlug wynala/ku mozliwe jest przeksztalcenie kwasu foliowego, który jest latwo dostepny handlowo, w kwas d,l-5-metyloczterowodorofoliowy z wysoka wydajnoscia, przy czym uzyskuje sie produkt o czystosci farmaceutycznej bez koniecznosci stosowania skomplikowanych i praco¬ chlonnych ¦* ejapów oczyszczania chromatograficznego, jezeli redukuje sie kwas foliowy w krytycznych wamnkaeh reakcyjnych, które sprawiaja, ze wytwarza sie selektywnie praktycznie 100% kwas czterowodorofoliowy.Sposób wedlug wynalazku obejmuje zasadniczo nastepujace etapy: 1. Redukcje kwasu foliowego do kwasu czterowodorofoliowego za pomoca borowodorku sodu w wodnym alkalicznym roztworze i w atmosferze gazu obojetnego, w temperaturze 60-80°C.Stosunek NaBhU do kwasu foliowego wynosi 1,3:1 -3:1, a czas reakcji 30 min — 2 godz. Korzystne warunki reakcji w powyzszym etapie sa nastepujace: — stosunek NaBH4 do kwsu foliowego — 2:1 — czas reakcji — 1 godz — wartosc pH 7-8 — temperatura 70°C 2. Metylowanie kwasu czterowodorofoliowego do kwasu 5-metyloczterowodorofoliowego za pomoca traktowania 37% wodnym roztworem formaldehydu i nastepnie ponownie borowodorkiem sodu. Pod koniec reakcji ponownie dodaje sie 37% formaldehyd. W tym etapie krytyczne warunki reakcyjne sa nastepujace: — wartosc pH 6-8 — temperatura 25-30°C — stosunek 37%-owego formaldehydu do kwasu czterowodorofoliowego 0,8: 1-2,5: 1 — stosunek NaBH4 do kwasu czterowodorofoliowego 1: 1-1:2 — atmosfera gazu obojetnego — obecnosc czynnika redukujacego w koncowym etapie redukcji (cysteina, zredukowany glutation, panteteina) Korzystne warunki reakcji dla tego etapu sa nastepujace: — wartosc pH 6,5 — temperatura 30°C — stosunek 37%-owy formaldehydu do kwasu czterowodorofoliowego — 1,4:1 — stosunek NaBH4 do kwasu czterowodorofoliowego 1:1 — czynnik redukujacy obecny w mieszaninie reakcyjnej: cysteina. 3. Oddzielanie i oczyszczanie soli sodowej kwasu 5-metyloczterowodorofoliowego. Etap ten mozna prowadzic dwoma równie korzystnymi alternatywnymi sposobami, dzieki temu, ze roztwór, otrzymany w etapie 2) praktycznie zawiera tylko sól sodowa kwasu 5-metyloczterowodorofoliowego: A — oddzielanie przez adsorpcje /desorpcje na weglu aktywnym.W sposobie tym wegiel aktywny w ilosci 5-20- krotnej wagowo w stosunku do wyjsciowego kwasu foliowego rozrabia sie z woda na breje i dodaje sie, mieszajac do koncowej mieszaniny reakcyjnej w pH 6,5-6,8. Przesaczony wegiel zawiesza sie w mieszaninie eluujacej, skladajacej sie z alkoholu, zawieraja¬ cego 1-4 atomy wegla lub 2-metoksyetanol u oraz wody w stosunku 50/50 i 95/5. Mieszanina eluujaca zawiera równiez maly procent (0,2-1,5%) czynnika redukujacego oraz maly procent (0,5-5%) amoniaku w wodnym roztworze. Sól sodowa kwasu 5-metyloczterowodorofoliowego mozna odzyskiwac zeluatu odsa¬ czonego od wegla, przez wytracenie rozpuszczalnikiem organicznym, mieszajacym sie woda albo przez zatezanie roztworu i liofilizowanie, albo znów w postacie soli metalu ziem alkalicznych, z której mozna uwolnic kwas 5-metyloczterowodorofoliowy.Korzystne warunki w tej reakcji dla etapu oddzielenia i oczyszczenia wedlug alternatywy A sa nastepujace: — stosunek wegla aktywnego do kwsu foliowego 7: 1111454 3 — mieszanina eluujaca skladajaca sie z etanolu, metanolu lub 2-metoksyetanolu i wody w stosunku objetosciowym 80/20, — c/vnnik redukujacy w mieszaninie reakcyjnej: cysteina do zawartosci 1% w stosunku do calej mies/uniin duujacej — 34* i wodny roztwór amoniaku do zawartosci 2% w stosunku do calej mieszaniny eluujacej (0,7% amoniaku).B — Oddzielanie przez bezposrednie wytracanie kwasu 5-metyloczterowodorofoliowego z roztworu go zawierajacego w postacie jego soli z metalem ziem alkalicznych, zwlaszcza soli wapniowej.Alternatywa ta, jeszcze prostsza niz altrnatywa A,jest zwlaszcza korzystna w przypadku,gdy etapy (1) i (2) prowadzono w stezonym wodnym srodowisku i w zwiazku z tym kwas 5-metyloczterowodorofoliowy musi byc oddzielany ze stezonego wodnego roztworu. Roztwór otrzymany z etapu (2) traktuje sie stezonym wodnym roztworem CaCl 2 i pozostawia sie na okolo 12 godzin w temperaturze 0-5°C w obecnosci malej ilosci czynnika redukujacego. Wytracony tak piectowododzian soli wapniowej kwasu metyloczterowodoro- foliowego oczyszcza sie przez rozpuszczenie w malej ilosci wrzacej wody i rekrystalizuje sie pozo*tawiaj%c roztwór w temperaturze 0-5°G Korzystny stosunek kwasu filiowego do CaCU wynosi 2:1-3: l, a zwlaszcza 2,5. Jako czynnik redukujacy korzystnie stosuje sie takijak cysteina, cysteamina, zredukowanyfhitabonlub panteteina.Produkt otrzymany sposobem wedlug wynalazku ma czystosc ponad99%, wydajnosc zawsze przekra¬ cza 80% w stosunku do wyjsciowego kwasu foliowego. Powyzsze etapy prowadzi sie kolejno w tym samym reaktorze, bez oddzielania produktów posrednich. Podane stosunki oznaczaja zawsze stosunki wagowe.Porównanie sposobu wedlug wynalazku z najlepszym znanym procesem, którego zasadnicze etapy opisano na wstepie opisu, prowadzi do oczywistego wniosku, ze nowy sposób umozliwia opuszczenie chromatograficznego oddzielania i oczyszczania zarówno produktu posredniegojak i koncowego. Prowadzi to nie tylko do powaznego uproszczenia procesu, (gdyz znany sposób wymaga dlugich kolumn i dlugiego czasu), lecz równiez daje znaczny wzrost wydajnosci, poniewaz w czasie oddzielania chromatograficznego powstaja powazne strety produktu. Dalsze straty nastepuja przy odzyskiwaniu produktu, z bardzo rozcien¬ czonych roztworów, które jest bardzo skomplikowane.Koncowy etap oddzielania i oczyszczania zastapiony zostal etapem adsorpcji/desorpcji na weglu aktywnym lub wytracaniu solami Ca, co jest bardzo proste i daje wysoka wydajosc. Etapy te sa calkowicie nowe przy wytwarzaniu kwasu 5-metyloczterowodorofoliowego orazjego soli. Zpowyzszego opisu widac, ze cal proces wytwarzania kwasu 5-metyloczterowodorofoliowego prowadzi sie w obecnosci gazu obojetnego, a w pewnych etapach w obecnosci czynnika redukujacego.Jest to spowodowane koniecznoscia zapobiegania samoutlenianiu kwasu czterowodorofoliowego oraz 5-metyloczterowodorofoliowego do odpowiednich kwasów dwuwodorofoliowych i foliowych. Tensam problem samo-utleniania wystepuje przy przechowywa¬ niu kwasu 5-metyloczterowodorofoliowego.Dotychczas polecano jako czynniki redukujace do przechowywania kwasu MTHF 2-merkatoetanol i kwas askorbinowy. Substancje te oczywiscie oznaczaja, ze produkt nie moze byc stosowany do przemyslo¬ wych celów farmaceutycznych; sluzyly one tylko do rozwiazania problemów laboratoryjnych. 2- merkaptoetanol jest toksyczny, o zapachu wywolujacym nudnosci, zas kwas asorbinowy gwaltownie rozpada sie przy optymalnych dla roztworów do wstrzykiwan wartosciach pH (7-8).Sole alkaliczne lub ziem alkalicznych kwasu 5-metyloczterowodorofoliowego nadaja sie do wytwarza¬ nia stabilizowanych kompozycji do celów farmaceutycznych. Kompozycje takie sa nowe i zasadniczo skladaja sie z soli kwasu 5-metyloczterowodorofoliowego, jako substancji czynnej oraz 5-50% zwiazku organicznego pochodzenia biologicznego, zawierajacego co najmniej jedna grupe —SHJako stabilizatora.Charakterystycznymi zwiazkami tej klasy sa np. cysteina, cysteamina, panteteina, zredukowany glutation oraz wszystkie ich pochodne, w których grupa —SH jest aktywna. Wszystkie powyzsze substancje sa nietoksyczne, stabilne w fizjologicznym zakresie pH, w temperaturze otoczenia i dlatego nadaja sie do wytwarzania cieklych lub stalych preparatów farmaceutycznych dla kazdego typu zastosowania w medycy¬ nie ludzkiej. Powyzsze nowe kompozycje farmaceutyczne wykazujadzialanie krwiotwórcze, dzialanie zabez¬ pieczajace watrobe i dzialanie przeciwnowotworowe.Ponizsze przyklady blizej wyjasniaja wynalazek, nie ograniczajac jego zakresu. Warunki reakcji mozna zmieniac w granicach okreslonych w opisie i wprowadzac znane i oczywiste dla fachowców ulepszenia.Przyklad I. 801 wody dejonizowanej wprowadza sie do reaktora i zawiesza w niej 2,4kg kwasu d, I-foliowego. Mieszajac, dodaje sie staly Na2C03do calkowitego rozpuszczenia kwasu foliowego (koncowy roztwór pH = 7,8), nastepnie dodaje sie 4,8 kg NaBH4, rozpuszczonego w 401 wody i mieszanine reakcyjna ogrzewa sie do 70°C. Mieszanine poddaje sie reakcji w ciagu 1 godz. mieszajac w ciaglym strumieniu azotu.Po zakonczeniu reakcji reaktor ochladza sie do 30°C dodaje sie mieszajac 3,5 kg 37% wodnego roztworu formaldehydu i 2,4 kg borowodorku sodu, rozpuszczonego w 201 wody. Reakcje prowadzi sie w ciagu 1 go-4 118 654 dziny, mieszajac w strumieniu azotu. Po tym czasie dodaje sie dalsze 0,15 kg 37% formaldehydu i 1 kg cysteiny. 17 kg wegla aktywnego zawiesza sie w 1001 odpowietrzonej wody i zawiesine weglowa dodaje sie mieszajac, do mieszaniny reakcyjnej, doprowadzonej do wartosci pH = 6,5. Po paru minutach odsacza sie calosc w atmosferze azotu, a placek weglowy na filtrze przemywa sie woda, zawierajaca \% cysteiny do calkowitego usuniecia wszystkich soli nieorganicznych. Wegiel zawiesza sie w 1001 mieszaniny eluujacej o nastepujacym skladzie objetosciowym: 2-metoksyetanol — 80, woda (zawierajaca 5% cysteiny) — 20, amoniak (34%) — 2. Zawiesine miesza sie w ciagu kilku minut, nastepnie odsacza sie, a przesacz zateza siedo objetosci 201. Zatezony przesacz wlewa sie do roztworu zawierajacego 700g CaCIj w 1001 etanolu.Sól wapniowa kwasu 5-metyloczterowodorofoliowego wytraca sie i odsacza w atmosferze azotu. przemywa etanolem i nastepnie suszy sie pod zmniejszonym cisnieniem. Otrzymuje sie 2,3 kg produktu, co odpowiada wydajnosci 86% w stosunku do wyjsciowego kwasu foliowego.Analiza w nadfiolecie produktu wykazuje nastepujaca charakterystyke: (pH = 7, 2 = 32 • 103) : maksy¬ malna absorbeja przy 290nm, minimalna absorpcja przy 245 nm, stosunek E2*/E245 = 3,8.Analiza na kolumnie chromatograficznej Sephadcx DEAE A-25, metoda Nixona i Bertino(P,E. Nixon, J.R. Bertino, Methods in Enzym. 18, 661 /1971) wykazuja jedynie pik kwasu 5-metyloczterowodorofolio¬ wego. Analiza HPIC (Kolumna Partisil — 10 SAX 4,6X250nm; eluent 5% cytrynian amonu; pH = 6) wykazuje jedynie pik kwasu 5-metyloczterowodoforoliowego. Widmo NMR: singlet charakterystyczny dla grupy Ns—CHiprzy r= 7,5. 1 kg soli wapniowej kwasu 5-metyloczterowodorofoliowego wytworzonej w ten sposób rozpuszcza sie w 401 wody, zawierajacej 1 kg cysteiny, ogrzewajac w atmosferze azotu. WartoscpH doprowadza sie do 6 rozcienczonym kwasem chlorowodorowym i mieszanine pozostawia sie w lodówce.Kwas 5-metyIoczterowodorofoliowy wytraca sie i odsacza przemywa mala iloscia zimnej wody i suszy.Produkt wykazuje wartosc Em/E24s= 3,8. Powtarzano ten sam sposób, zastepujacjedynie 2-metoksyetanol w mieszaninie eluujacej odpowiednio etanolem, metanolem, 1- lub 2-propanolem, n-butanolem., Ill-rzed. -butanolem, H-rzed.-butanolem i izobutanokm. W kazdym przypadku uzyskiwano produkt o tej samej charakterystyce i z ta sama wydajnoscia.Przyklad II. Sól kwasu 5-metyloczterowodorofoliowego wytwarza sie wedlug przykladu I. Wegiel eluuje sie mieszanina o nastepujacym skladzie: metanol — 80; woda (zawierajaca 5% zredukowanego glutationu) — 20; amoniak (34%) — 2. Po odsaczeniu wegla aktywnego, dodaje sie 700 g CaCh rozpuszczo¬ nego w malej ilosci wody do eluatu. Sól wapniowa kwasu 5-metyloczterowodorofoliowego wytraca sie i odsacza sie w strumieniu azotu, przemywa etanolem i suszy pod zmniejszonym cisnieniem. Uzyskuje sie 2,1 kg produktu, co odpowiada wydajnosci 80% w stosunku do ilosci kwasu foliowego. Produkt ten ma te sama charakterystyke co produkt z przykladu I.Przyklad III. Powtarza sie postepowanie z przykladu I do momentu obróbki placka weglowego mieszanina eluujaca, skladajaca sie z 2-propanolu i wody, zawierajacej maly procent wodzianu amonowego i cysteiny, po czym przesaczony eluat zasteza sie do objetosci 20 litrów. Roztwór ten poddaje sie liofilizacji, otrzymujac 2,1 kg soli sodowej kwasu 5-metyloczterowodorofoliowego, z wydajnoscia 80%. Produkt wyka¬ zuje wartosc E2to/Ej45= 3,8.P rz y k l a d IV. Powtarza sie postepowanie do momentu zatezenia eluatu, który nastepnie traktuje sie 1,3 kg BaCli, rozpuszczonego w etanolu. Sól barowa kwasu 5-metyloczterowodorofoliowego wytraca sie z wydajnoscia 83% E2fo/E243=3,79.PrzykladV.Powtarza sie postepowanie z przykladu I do momentu zatezania eluatu, który nastepnie traktuje sie 0,6 kg MgCU rozpuszczonego w 1001 etanolu. Sól magnezowa kwasu 5-metyloczterowodorofo¬ liowego wytraca sie z wydajnoscia 82%. E2*/E24j= 3,8.Przyklad VI. 100 soli wapniowej kwasu 5-mctyloczterowodorofoliowego, wytworzonej wedlugprzy¬ kladu I, rozpuszcza sie w 41 wody. Do roztworu dodaje sie stechiometryczna ilosc Na2S04. Wytraca sie CaS04 i oddziela przez odsaczenie. Przezroczysty roztwór liofilizuje sie, otrzymujac sól sodowa kwasu 5-metyloczterowodorofoliowego.Przyklad VII. Wytwarzanie soli wapniowej kwasu MTHF. 2,50kg kwasu foliowego zawiesza sie w 10ml wody i dodaje mieszajac 11 40% Na^Oj. Wartosc pH nastawia sie na 7,8 za pomoca Na2C03 i po ochlodzeniu dodaje sie 1,700 kg NaBH4 w atmosferze azotu.Mieszanine pozostawia sie do przereagowania w ciagu ponad 2 godzin, ogrzewajac w temperaturze okolo 70° do zakonczenia reakcji, dodaje sie 4,00 kg 37% wodnego formaldehydu, a nastepnie 0,80kg borowodorku sodu. Wytracony boran sodu odsacza sie, a nadmiar borowodorku rozklada sie nastawiajac wartosc pH roztworu na 6 za pomoca HG. Mieszajac, dodaje sie 1 kg CaCh rozpuszczonego w 21 wody i otrzymana mieszanine reakcyjna pozostawia sie w 3°C na noc. Sól wapniowa kwasu metyloczterowodoforo- liowego wytraca sie w postaci bezpostaciowego bialego proszku, który odsacza sie i przemywa woda. Sól te rozpuszcza sie w 101 wrzacej wody i ostudzony roztwór pozostawia na noc. Wytracona krystaliczna sól odsacza sie, przemywa i suszy pod zmniejszonym cisnieniem. Otrzymuje sie 2,40kg pteciowodzianu soli118 654 5 wapniowej kwasu metylocztcrowodorofoliowego, z wydajnoscia ogólna 80% w stosunku do wyjsciowego k*asu foliowego. W identycznych warunkach otrzymuje sie równiez sól Mg, która jednak jest trudna do odsaczania.Zastrzezenia patentowe 1. Sposób wytwarzania kwasu d,i-5-metyloczterowodorofoliowego oraz jego soli o wzorze ogólnym przedstawionym na rysunku, w którym X oznacza atom wodoru, atom metalu alkalicznego lub równowa¬ znik metalu ziem alkalicznych w skali przemyslowej, z duza wydajnoscia, o czystosci farmaceutycznej, na drodze reakcji kwasu foliowego i borowodorku sodu oraz nastepnego metylowania kwasu czterowodorofo- liowego formaldehydem i borowodorkiem sodu, zaamieMy tym, ze kwas foliowy redukuje sie do kwasu czterowodorofoliowego za pomoca NaBFh w wodnym roztworze o wartosci pH 7-8 i w atmosferze gazu obojetnego, przy czym stosuje sie stosunek NaBFLdo kwasu foliowego 1,5:1-3:1, temperature reakcji 60-80°C oraz czas reakcji 30 min - 2 godziny, po czym kwas czterowodorofoliowy metyluje sie do kwasu 5-metyloczterowodorofoliowego za pomoca 37% wodnego roztworu formaldehydu i borowodorku sodu w atmosferze gazu obojetnego, przy czym stosuje sie stosunek calkowitej ilosci formaldehydu do kwasu czterowodorofoliowego 0,8:1 - 2,5:1, stosunek NaBH4do kwasu czterowodorofoliowego 1:1-1:2, tempe¬ rature 25-30°C oraz pH 6-8, a nastepnie sól sodowa kwasu 5-metyloczterowodorofoliowego oddziela sie od wodnego roztworuja zawierajacego przy czym wszystkie powyzsze etapy prowadzi sie kolejno w tym samym reaktorze, pozostawiajac produkty posrednie w srodowisku reakcji. 2. Sposób wedlug zastrz. 1, zMunteaay tyn, ze oddzielanie prowadzi sie za pomoca traktowania mieszaniny reakcyjnej weglem aktywnym w ilosci 5-20 krotnej wagowo w stosunku do wyjsciowego kwasu foliowego i desorbowania soli sodowej kwasu 5-metyloczterowodorofoliowego zwegla za pomoca eluenta, skladajacego sie z alkoholu, zawierajacego 1-4 atomy wegla lub 2-metoksyetanolu oraz wody w stosunku 50/50-95/5. 3. Sposób wedlug zastrz. 1, zaamfeany tyn, ze oddzielanie prowadzi sie za pomoca traktowania mieszaniny reakcyjnej wodnym roztworem soli Ca korzystnie w obecnosci czynnika redukujacegoichlodze¬ nie roztworu do temperatury 0-5°C, przy czym stosuje sie stosunek kwasu foliowego do soli wapniowej 2:1 = 3:1, przy czym korzystnie oczyszczenie soli wapniowej kwasu 5-metyloczterowodorofoliowego pro¬ wadzi sie za pomoca rozpuszczania pieciowodzianu soli w malej ilosci wrzacej wodyi chlodzeniu roztworu w 0-5°C. 4. Sposób wedlug zastrz. 1, maik—r lyw, ze redukcje prowadzi sie stosujac stosunek NaBH4do kwasu foliowego 2:1, temperature 70°C, wartosc pH 7-8 oraz czas reakcji 1 godzina, zas metylowanie prowadzi sie stosujac stosunek calkowitej ilosci 37% formaldehydu do kwasu czterowodorofoliowego 1,4:1, stosunek NaBH4 do kwasu czterowodorofoliowego 1:1, temperature 30°C i wartosc pH6,5, 5. Sposób wedlug zastrz. 2, iwIiMy ty«, ze przy oddzielaniu itosujc sie wegiel aktywny w ilosci 7-krotnej wagowo w stosunku do wyjsciowego kwasu foliowego oraz eluent skladajacy sie z metanolu, etanolu, 2-metoksyetanolu, 1-lub 2-propanolu, n-butanolu, 111-rzed .-butanolu, H-rzed.-butanolu lubizobu- tanolu i wody w stosunku objetosciowym 80:20, zawierajacy 1% objetosciowy czynnika redukujacego oraz 0,7% amoniaku w wodnym roztworze. 6. Sposób wedlug zastrz 1, zMuaiewy tyw, ze kwas 5-metyloczterowodorofoIiowy wytraca sie z wodnego roztworu za pomoca zakwaszenia, w postaci jednej z jego soli alkalicznej lub ziem alkalicznych. 7. Sposób wedlug zastrz. 1, zaawte—y tyn, ze kwas 5-metyloczterowodorofoliowy otrzymuje sie w postaci soli sodowej za pomoca zatezania eluatu i liofilizowania koncentratu.11S 454 coox 0 ch3 nhh: ^co-nh-ch H2N^N^N^H2 CH2 WZÓR H COOX Pracownia Poligraficzna UP PRL. Naklad 120 egz.Cena 100 zl PL PL PL PL PL PL PL