Gegenstand der Erfindung ist ein neues Verfahren zur Herstellung von Peptiden, welche mehr als eine Cystin-Disulfidbindung enthalten, insbesondere von Insulinen und Fragmenten oder synthetischen Analogen davon, z.B. Verbindungen bestehend aus A- und B-Kette, die durch Peptidketten oder nicht-peptidische Brücken miteinander verknüpft sind, vgl.
Biochem. Biophys. Res. Comm. 55, 60 (1973).
Unter Analogen sind insbesondere entsprechende Peptidamide zu verstehen, ferner Peptide oder Peptidamide, in denen funktionelle Gruppen wie z.B. Aminogruppen, Carboxylgruppen, Hydroxylgruppen, in bekannter Weise geschützt sind.
Bekanntlich sind beim Insulin zweiverschiedeneAminosäuresequenzen durch zwei Disulfidbrücken verbunden, nämlich durch den Dystinrest der A-Kette (7-Stellung) und der B Kette (7-Stellung) einerseits und den Cystinrest der A-Kette (20-Stellung) und der B-Kette (19-Stellung) andererseits.
Dazu kommt noch das Vorhandensein einer weiteren Disulfidbrücke in einer und derselben Kette, und zwar des Cystinrests der Stellungen 6 und 11 der A-Kette.
Bei der synthetischen Herstellung solcher Peptide stellt sich das Problem, die Cystein-haltigen Aminosäuresequenzen so zu oxidieren, dass die Disulfidbindungen zwischen den gewünschten Cysteinresten, die sich in einer bzw. in zwei Ketten befinden, gebildet werden.
Durch Anwendung der bekannten selektiv abspaltbaren Mercapto-Schutzgruppen konnte das Problem bisher nicht in befriedigender Weise gelöst werden. Alkalisch oder hydrogenolytisch abspaltbare Gruppen sind schon deswegen nicht günstig, weil unter den Abspaltungsbedingungen eine teilweise Zersetzung des Peptids, speziell an der Disulfidbindung, eintritt. Bei den sauer abspaltbaren Schutzgruppen ist eine ausreichende Selektivität schwer zu erreichen. Eine grosse Schwierigkeit besteht auch darin, dass dann, wenn man mittels selektiv abspaltbarer Mercapto-Schutzgruppen die für die erste Disulfidbindung erforderlichen Mercaptogruppen freigesetzt und durch Oxidation daraus die Disulfidbindung gebildet hatte, eine weitere, durch eine andere Schutzgruppe noch geschützte Mercaptogruppe nach Abspaltung der Schutzgruppe mit der Disulfidbindung unter Disproportionierung des Moleküls reagieren kann.
Es wurde nun ein Verfahren gefunden, nach dem Insulin Peptide oder -Peptidderivate in überraschender vorteilhafter Weise hergestellt werden können.
Das erfindungsgemässe Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass man eine Sequenz herstellt, welche mindestens die Aminosäuren 6-11 der A-Kette enthält, deren Amino-, Carboxyl- und/oder Hydroxylgruppen gegebenenfalls geschützt sind und in der die Cysteingruppen in 6- und 11-Stellung durch eine Schutzgruppe Rl vom Aralkyltypus und die Cysteingruppe in 7-Stellung durch eine Acylaminomethylgruppe R2 geschützt ist und dass man in dieser Sequenz die Schutzgruppen Rl mit Jod in einer polyhalogenierten Oxy- oder Oxoverbindung unter Bildung der Disulfidbrücke abspaltet und dann, gegebenenfalls nach Verlängerung der A-Kette zum Amino- und/ oder Carboxylende hin, mit einer Sequenz, welche die Disulfidbrücke des Cystins der A-Kette in 20-Stellung und der B Kette in 19-Stellung enthält, kondensiert,
wobei eine gegebenenfalls in dieser Sequenz vorhandene Cysteingruppe in 7 Stellung der B-Kette durch eine Acylaminomethylgruppe R2 geschützt ist, dann die A-Kette und B-Kette, wenn erforderlich, vervollständigt, wobei die Cysteingruppe in 7-Stellung der B-Kette durch eine Acylaminomethylgruppe R2 geschützt wird, die Amino-, Carboxyl- und/oder Hydroxylschutzgruppen abspaltet und, vor oder nach dieser Abspaltung, die Disulfidbrücke zwischen den beiden Cystein7-Resten der A- und B Kette durch Abspaltung der Acylaminomethylgruppen R2 und gegebenenfalls gleichzeitige Oxidation zur Disulfidbrücke bildet.
Die hier angegebene Reihenfolge der Bildung der verschiedenen Disulfidbindungen ist besonders günstig.
Beim erfindungsgemässen Verfahren wird von der selektiven Abspaltbarkeit von Mercapto-Schutzgruppen Rl und R2 in Gegenwart von polyhalogenierten niederen aliphatischen Oxyoder Oxoverbindungen Gebrauch gemacht, welche in der Schweizer Patentschrift Nr. 576 946 beschrieben ist und welche dadurch gekennzeichnet ist, dass man in einer oder zwei cysteinhaltigen Aminosäuresequenzen, in welchen Disulfidbindungen hergestellt werden sollen, zwei zu verbindende Cysteinreste je einzeln durch eine Aralkyl- bzw.
Arylcycloalkylgruppe Rt, zwei weitere Cysteinreste je einzeln durch eine Acylaminomethylgruppe R2 schützt, die Schutzgruppen Ri durch Behandlung mit Jod in Gegenwart einer polyhalogenierten niederen aliphatischen Oxy- oder Oxoverbindung entfernt, wobei gleichzeitig die Disulfidbindung zwischen diesen Cysteinresten, die durch Rl geschützt waren, gebildet wird, und zu einem beliebigen Zeitpunkt nach Entfernung der polyhalogenierten Verbindung die zweite Disulfidbrücke durch Behandlung mit Jod bildet.
Unter Mercapto-Schutzgruppen Ri vom Aralkyltypus sind Gruppen zu verstehen, in denen das mindestens einen Arylrest tragende Kohlenstoffatom an den Schwefel der Mercaptogruppe gebunden ist. Ein Arylrest kann mono- oder bicyclisch (z.B. Naphthyl) sein; vor allem ist er ein unsubstituierter oder durch elektrotronenliefernde Substituenten substituierter, z.B.
durch einen oder mehrere Reste aus der Gruppe von Niederalkyl-, Niederalkoxy und Halogen substituierter Phenylrest. Der aliphatische Teil des Aralkylrestes ist ein Niederalkyl- oder Cycloalkylrest mit bis zu 7 Kohlenstoffatomen, besonders Mehtyl. Ausser dem Arylrest enthält R1 z.B. mindestens noch einen cyclischen Rest, der entweder ein Arylrest wie angegeben oder ein Cycloalkylrest mit 5-7 Kohlenstoffatomen ist.
Als Beispiele der Reste Rl sind zu nennen 1-Phenylcyclopentyl, 1-Phenylcyclohexyl, 1-Phenylcycloheptyl, p-Methoxyphenylcyclohexyl, 1,1 -Diphenyläthyl, 1 ,1-Di-(p-tolyl)-äthyl, insbesondere aber Triphenylmethyl (Trt).
Unter der Acylaminomethylgruppe R2 ist eine Gruppe der Formel -CH2-NH-CO-R zu verstehen, worin CO - R den Acylrest einer Carbonsäure, wie einer aliphatischen, aromatischen, araliphatischen oder heterocyclischen Carbonsäure oder eines Kohlensäurederivates, wie einen Kohlensäureester- oder Carbaminsäurerest bedeutet. In erster Linie ist R ein gegebenenfalls substituierter Niederalkylrest, z.B. Methyl-, Äthyl-, Propyl-, Isopropyl-, n-Butyl oder tert. Butylrest, der als Substituenten z.B. Halogenatome wie Fluor, Chlor, Brom oder Jod, Trifluormethyl oder die Nitrogruppe enthalten kann.
Weiter ist R beispielsweise ein gegebenenfalls substituierter
Cycloalkylrest mit 3-8, vorzugweise 5-6, Ringatomen wie der
Cyclopentyl- oder Cyclohexylrest oder ein gegebenenfalls substituierter aromatischer oder araliphatischer Rest, worin der aromatische Ring vorzugsweise der Benzolring ist, vor allem gegebenenfalls substituiertes Phenyl oder Benzyl, z. B.
unsubstituiertes oder im Phenylrest durch Niederalkyl, Niederalkoxy, Halogen oder Nitro substituiertes Phenyl oder Benzyl, oder ein gegebenenfalls wie erwähnt substituierter, vor allem monocyclischer Heterocyclylrest, z.B. Thienyl- oder Furylrest.
Vorzugsweise steht R2 für die Acetylaminomethylgruppe (-Acm).
Die Behandlung mit Jod zur Abspaltung der Mercapto Schutzgruppe Rl unter gleichzeitiger Oxidation der Cysteingruppen zur Cystingruppe wird in Gegenwart einer polyhalogenierten niederen Oxy- oder Oxoverbindung vorgenommen, wobei als Halogenatome Brom, Chlor und insbesondere Fluor in Betracht kommen. Das Reaktionsmedium soll vorzugsweise mindestens 40 Gew.% der polyhalogenierten Verbindung enthalten.
Wenn Wasser im Gemisch vorhanden ist, soll dessen Gewichtsanteil höchstens 20% betragen. Polyhalogenierte niedere aliphatische Oxy- oder Oxoverbindungen sind vor allem polyhalogenierte Niederalkanole und Diniederalkylketone mit 2 bis 5, insbesondere 2 bis 3 Kohlenstoffatomen, ferner entsprechende Niederalkansäureniederalkylester, z.B.
polyhalogenierte Essigsäureniederalkylester wie Trifluoressigsäuremethylester oder Trichloressigsäureäthylester. Die Verbindungen sind vorzugsweise perhalogenisiert, mindestens an einem sonst unsubstituierten Kohlenstoffatom. Bevorzugte Beispiele sind 2,2,2-Tribromäthanol, 2,2,2-Trichloräthanol, 1,1,1 -Trifluoraceton, Hexachloraceton, Hexafluoraceton und besonders 2,2,2-Trifluoräthanol und 1,1,1,3,3,3-Hexafluor-2- propanol.
Die Umsetzung mit Jod erfolgt unter an sich bekannten Reaktionsbedingungen, z.B. wie in der obgenannten Schweizer Patentschrift Nr. 576 946 beschrieben. Vorzugsweise arbeitet man bei Zimmertemperatur und bei saurem pH, das durch den bei der Reaktion gebildeten Jodwasserstoff ereicht wird.
Wenn die Reaktion bei einem pH über 4 durchgeführt wird, sollten in der Peptidsequenz gegebenenfalls vorhandene Seitenkettenhydroxylgruppen des Tyrosins geschützt werden.
Zweckmässig wird ein Überschuss an Jod verwendet; das überschüssige Jod kann beispielsweise mit Thiosulfat oder Ascorbinsäure entfernt werden.
Die Abspaltung der R2-Schutzgruppe unter gleichzeitiger Bildung der zweiten Disulfidbrücke wird ebenfalls mit Jod, wie im britischen Patent Nr. 1 329 860 beschrieben, vorgenommen. Man kann wässerige, wässerigorganische oder organische Lösungsmittel mit Ausnahme von polyhalogenierten Niederalkanolen verwenden, vorteilhaft reine oder wässerige Essigsäure.
Bei dem erfindungsgemässen Verfahren liegen in den als Ausgangsstoffen verwendeten Aminosäuresequenzen die Aminogruppen in der protonierten oder durch übliche Aminoschutzgruppen geschützten Form, die Hydroxyl- und Carboxylgruppen vorzugsweise in geschützter Form vor.
Als Aminoschutzgruppen sind beispielsweise zu nennen: Acylgruppen wie Formyl, Trifluoracetyl, Phthaloyl, p-Toluolsulfonyl, Benzylsulfonyl, Benzolsulfenyl, o-Nitrophenylsulfenyl, oder vor allem von der Kohlensäure oder Thiokohlensäure sich ableitende Gruppen, wie gegebenenfalls im aromatischen Rest durch Halogenatome, Nitrogruppen, Niederalkyl- oder Niederalkoxy- oder Niedercarbalkoxygruppen substituierte Carbobenzoxygruppen, z.B.
Carbobenzoxy, o-Brom, p-Brom oder p-Chlorcarbobenzoxy, 2,4-Dichlorcarbobenzoxy, p Nitrocarbobenzoxy, p-Methoxycarbobenzoxy, farbige Benzyloxycarbonylgruppen wie p-Phenylazo-benzyloxycarbonyl und p-(p'-Methoxyphenylazo)-berzyloxycarbonyl, Tolyloxycarbonyl, (a,a-Dimethyl-3,5-dimethoxybenzyl)-oxycarbonyl, Benzhydryloxycarbonyl, 2-Phenyl-isopropyloxycarbonyl, 2-Tolylisopropyloxycarbonyl und vor allem 2-(para-Biphenylyl)-2propyloxycarbonyl, ferner aliphatische Oxycarbonylgruppen wie z.B. 1-Methylcyclobutyloxycarbonyl, Isonicotinyloxycarbonyl, Allyloxycarbonyl, Cyclopentyloxycarbonyl, tert.-Amyloxycarbonyl, Adamantyloxycarbonyl, Isobornyloxycarbonyl, und in erster Linie tert.-Butyloxycarbonyl.
Carboxylgruppen können beispielsweise durch Amid- oder Hydrazidbildung oder durch Veresterung geschützt sein. Zur Veresterung geeignet sind z.B. niedere gegebenenfalls substituierte Alkanole wie Methanol, Äthanol, Cyanmethylalkohol, Benzoylmethylalkohol oder insbesondere tert.-Butanol, ferner Aralkanole wie Arylniederalkanole, z.B. gegebenenfalls durch Niederalkyl- oder Niederalkoxygruppen oder Halogenatome substituierte Benzyl- oder Benzhydrylalkohole wie p-Nitrobenzylalkohol oder 2,4,6-Trimethylbenzylalkohol, oder Phenole und Thiophenole wie Phenol, Thiophenol, Thiokresol.
Die Hydroxygruppen der Serin-, Threonin- und Tyrosinreste können z.B. durch Veresterung oder Verätherung geschützt werden. Als Acylreste bei der Veresterung sind z.B. Niederalkanoylreste wie Acetyl, Aroylreste wie Benzoyl und vor allem von der Kohlensäure sich ableitende Reste wie Benzyloxycarbonyl, o-Brombenzyloxycarbonyl oder Äthyloxycarbonyl geeignet. Zur Verätherung geeignete Gruppen sind z.B. Benzyl-, m-Brombenzyl, 2,6-Dichlorbenzyl, Tetrahydropyranyloder tert. Butylreste. Ferner eignen sich zum Schutz der Hydroxylgruppen die in Ber. 100 (1967), 3838-3849 beschriebenen 2,2,2-Trifluor-1-tert.-butyloxycarbonylamino- oder -1benzyloxycarbonylaminoäthylgruppen (Weygand).
In erster Linie verwendet man acidolytisch, z.B. durch Essigsäure, Trifluoressigsäure, Salzsäure oder Fluorwasserstoff abspaltbare Schutzgruppen, insbesondere Gruppen vom tert. Butyl-Typ wie die tert. Butyloxycarbonylgruppe, die tert. - Butylester- und tert.-Butyläthergruppe. Dabei ist dem Umstand Rechnung zu tragen, dass beim Aufbau der Sequenzen durch Kettenverlängerung am Aminoende die verschiedenen Ketten selektiv gegenüber einander abspaltbare Aminoschutzgruppen tragen müssen, wie dies in der Schweizer Patentschrift Nr. 577 464 oder dem belgischen Patent 805 147 beschrieben ist. Wie dort ausgeführt, benötigt man sog. stabile Schutzgruppen als konstant beizubehaltende Gruppen, z.B.
zum Schutz von Amino-, Hydroxy- und Carboxylgruppen der Seitenketten und zum Schutz von Endcarboxylgruppen, ferner zwei Arten von sog. labilen Schutzgruppen für die a-Aminogruppen der im Aufbau befindlichen verschiedenen Ketten.
Das Verfahren der Schweizer Patentschrift Nr. 577 464 beschreibt auch die Herstellung einer Teilsequenz des menschlichen Insulins, nämlich A-Kette 14-21 + B-Kette 17-30, die im vorliegenden erfindungsgemässen Verfahren als Bruchstück IV verwendet wird. Dabei werden als Aminoschutzgruppen für die beiden Ketten die 2- (p-Biphenylyl)-2-isopropyloxycarbonylgruppe und die Tritylgruppe verwendet. Der Inhalt der beiden genannten Schweizer Patentschriften bzw. des belgischen Patentes 805 147 ist zur Ergänzung des vorliegenden erfindungsgemässen Verfahrens heranzuziehen.
Die beim vorliegenden Verfahren erhaltenen Cystin-haltigen geschützten Aminosäuresequenzen können direkt für die Synthese von Sequenzen mit längerer Aminosäurekette verwendet werden, oder, wenn erwünscht, können die Schutzgruppen in bekannter Weise abgespalten werden.
Die Ausgangsstoffe für das Verfahren der vorliegenden Anmeldung, nämlich cysteinhaltige Aminosäuresequenzen, in denen die Cysteinreste durch Mercaptoschutzgruppen Rl oder Rz geschützt sind, sind bekannt oder können nach an sich bekannten Methoden hergestellt werden, vgl. z.B. die englischen Patente 1 259 017 und 1 329 860, in denen auch die Abspaltung dieser Schutzgruppen beschrieben ist. Die Cysteinhaltigen Aminosäuresequenzen können auch Cystin-S-S Brücken, die in einem früheren Zeitpunkt der Synthese auf gleiche oder andere Weise gebildet wurden, enthalten.
Die cysteinhaltigen Ausgangsstoffe sowohl als auch die mittels cystinhaltiger Sequenzen als Endstoff herzustellenden Insuline werden erhalten, indem man die zum Aufbau des Peptids nötigen Aminosäuren unter Bildung von CONH Bindungen miteinander kondensiert, wobei nicht an der Reaktion teilnehmende funktionelle Gruppen intermediär geschützt und die Cysteinreste zu Cystinresten oxidiert werden.
Die zu verwendenden Schutzgruppen wurden bereits erwähnt.
Die Verknüpfung der Aminosäure- und/oder Peptideinheiten erfolgt z.B. in der Weise, dass man eine Aminosäure oder ein Peptid mit geschützter a-Aminogruppe und aktivierter terminaler Carboxylgruppe mit einer Aminosäure oder einem Peptid mit freier a-Aminogruppe und freier oder geschützter, z.B. veresterter oder amidierter terminaler Carboxylgruppe, umsetzt oder dass man eine Aminosäure oder ein Peptid mit aktivierter a-Aminogruppe und geschützter terminaler Carb oxylgruppe mit einer Aminosäure oder einem Peptid mit freier terminaler Carboxylgruppe und geschützter a-Aminogruppe umsetzt.
Die Carboxylgruppe kann beispielsweise durch Überführung in ein Säureazid, -anhydrid, -imidazolid, -isoxazolid oder einen aktivierten Ester, wie Cyanmethylester, Carboxymethylester, p-Nitrophenylthioester, p-Nitrophenylester, 2,4,5-Trichlorphenylester, Pentachlorphenylester, N-Hydroxysuccinimidester, N-Hydroxyphthalimidester, 8-Hydroxychinolinester, N-Hydroxypiperidinester oder durch Reaktion mittels eines Carbodiimids (gegebenenfalls unter Zusatz von N Hydroxysuccinimid oder einem unsubstituierten oder z.B.
durch Halogen, Methyl oder Methoxy substituierten 1-Hydroxybenzotriazol) oder N,N'-Carbonyl-diimidazols, die Aminogruppe beispielsweise durch Reaktion mit einem Phosphitamid aktiviert werden. Als gebräuchlichste Methoden sind zu nennen die Carbodiimidmethode, die Azidmethode, die Methode der aktivierten Ester und die Anhydridmethode, ferner die Merrifield-Methode und die Methode der N-Carboxyanhydride oder N-Thiocarboxyanhydride.
Im nachfolgenden Beispiel werden die Temperaturen in Celsiusgraden angegeben und folgende Abkürzungen verwen- det: Boc = tert.-Butyloxycarbonyl Acm = Acetylaminomethyl Trt = Trityl Z = Carbobenzoxy But = tert.-Butyl Me = Methyl Bpoc = 2-(p-Biphenylyl)-2-propyloxycarbonyl ONp = p-Nitrophenylester OSu = N-Hydroxysuccinimidester DMF = Dimethylformamid
In der Dünnschichtchromatographie werden die folgenden Systeme verwendet: System 3 .
Essigester-Pyridin-Wasser (65 : 20:15) System 43A: tert.-Amylalkohol-Isopropanol-Wasser (67 :26 : 7) System 43C: tert.-Amylalkohol-Isopropanol-Wasser (51: 21 : 28) System 43E: tert.-Amylalkohol-Isopropanol-Wasser (32: 32 : 36) System 45: sec. Butanol-3 %iges wässeriges Ammoniak (70 : 30) System 52: n-Butanol-Eisessig-Wasser (75 : 7,5 : 21) System 52A: n-Butanol-Eisessig-Wasser (67 : 23) System 70: Äthylacetat-Pyridin-Wasser (40 : 20 :40), Oberphase System 87:
Isopropanol-Ameisensäure-Wasser (77 : 4: 19) System 100: Äthylacetat-Pyridin-Eisessig-Wasser (62 :21:6:11) System 101: n-Butanol-Pyridin-Eisessig-Wasser (38 : 24 : 8 : 30) System 101A: n-Butanol-Pyridin-Eisessig-Wasser (42: 24 :4 : 30) System 102A: Essigester-Methyläthylketon-Ameisensäure-Wasser (50 : 30: 10:10) System 107: Äthylacetat-Pyridin-Wasser (49 : 24 : 27) System 110: Äthylacetat-n-Butanol-Pyridin-Eisessig-Wasser (42 :21: 21: 6: 10) System 112A: n-Butanol-Pyridin-Ameisensäure-Wasser (42: 24 :4 : 20) System 115: Äthylacetat-Pyridin-Ameisensäure-Wasser (63:21:10:6).
Synthese von menschlichem Insulin der Formel (A-Kette)
EMI3.1
Arg-GlyPhe-Phe-Tyr-Thr-Pro-LyThr-OH
22 23 24 25 26 27 28 29 30 (B -Kette) Das obige Produkt wird mittels des Bruchstückes der Aminosäuren 613 der A-Kette, nämlich
EMI3.2
und der folgenden weiteren Bruchstücke hergestellt: II = Boc-Gly-Ile-Val-Glu(OBut)-Gln-NH-NH2 (A-Kette 1-5) III = Boc-Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys(Acm}Gly-Ser(ButSHis- Leu-Val-Glu(OBut)-Ala-Leu-Tyr(ButtOH (B-Kette 1-16)
EMI4.1
(A-Kette 14-21 + B-Kette 17-30) Das Bruchstück IV ist in der Schweizer Patentschrift Nr. 577464 beschrieben.
A. Das Bruchstück I wird wie folgt hergestellt: la. Trt-Cys(Trt)-Cys(Acm)-OMe
7,0 g Trt-Cys(Trt)-OSu und 2,0 g H-Cys(Acm)-OMe werden in 50 ml Chloroform 20 Stunden bei Raumtemperatur stehen gelassen. Die Lösung wird dann mit 100 ml Chloroform verdünnt und mit 1-n. Citronensäure, 1-n. Natriumbicarbonat und Wasser gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und eingedampft. Der Rückstand wird aus Essigester-Äther umkristallisiert. F. 197-1980.
2a. Trt-Cys(Trt)-Cys(Acm)-OH
5,63 g Trt-Cys(Trt)-Cys(Acm)-OMe werden in 75 ml Dioxan aufgelöst und die Lösung vorsichtig mit 17,5 ml Wasser und 3,71 ml 2-n. Natronlauge versetzt. Nach 1 Stunde bei 200 wird auf 0O gekühlt, 3,71 ml 2-n. Salzsäure zugegeben, die Lösung bei vermindertem Druck und Raumtemperatur auf ca.
30 ml eingeengt und dann mit 200 ml Chloroform verdünnt.
Die Lösung wird dreimal mit Wasser gewaschen und über Natriumsulfat getrocknet. Beim Abdampfen des Lösungsmittels erhält man das dünnschichtchromatographisch reine Produkt als weissen Schaum.
Im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel ist Rf45 = 0,45; Rfioo = 0,65.
3a. Z-Thr(But)-Ser(But)-OMe
Zu 200 ml Essigester werden 16,25 g Z-Thr(But)-OSu und 8,47 g H-Ser(But)-OMe HCI zugefügt, bei 0" mit 5,6 ml Triäthylamin versetzt und 15 Stunden bei 20" gerührt und mit 1-n. Citronensäure, 1-n. Natriumbicarbonat und Wasser gewaschen. Nach dem Trocknen über Natriumsulfat wird die Lösung eingedampft, wobei das dünnschichtchromatographisch reine Produkt als Öl erhalten wird.
Im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel ist Rf = 0,60 in Chloroform-Methanol (95:5) und Rf = 0,75 in Toluol Aceton (1:1).
4a. H-Thr(But)-Ser(But)-OMe
3,27 g Z-Thr(But)-Ser(But)-OMe werden in 50 ml Essigester in Gegenwart von 0,5 Palladiumkohle (10%) hydriert.
Nach beendeter Wasserstoffaufnahme (1 Stunde) wird vom Katalysator abfiltriert und die Lösung eingedampft. Das als Ol anfallende Produkt ist dünnschichtchromatographisch einheitlich.
Im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel ist Rf = 0,30 in Chloroform-Methanol (95:5).
5a. Trt-Cys(Trt)-Cys(Acm)-Thr(But)-Ser(But)-OMe
5,43 g Trt-Cys(Trt)-Cys(Acm)-OH und 2,33 g H-Thr(But) Ser(But)-OMe werden in 70 ml Essigester gelöst und bei 0" mit 1,55 g Dicyclohexylcarbodiimid und 1,02 g N-Hydroxybenzotriazol versetzt. Nach 4 Stunden bei 0" und 17 Stunden bei 4 wird filtriert, die Lösung mit 200 ml Essigester verdünnt und mit 1-n. Citronensäure, 1-n. Natriumbicarbonat und Wasser gewaschen. Nach dem Trocknen über Natriumsulfat wird eingedampft und der Rückstand aus Essigester-Petroläther umgefällt.
Im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel ist Rf = 0,60 in Toluol-Aceton (1:1) und Rf = 0,45 in Essigester.
6a. Trt-Cys(Trt)-Cys(Acm)-Thr(But)-Ser(But)-NHNH2
4,7 g Trt-Cys(Trt)-Cys(Asm)-Thr(But)-Ser(But)-OMe in 11 ml Methanol werden nach Zugabe von 2,2 ml Hydrazinhydrat 6l/2 Stunden bei Raumtemperatur belassen. Das Hydrazid wird mit 50 ml eiskaltem Wasser gefällt, abgenutscht und gut mit Wasser gewaschen. Das getrocknete Rohprodukt wird in 80 ml heissem Toluol gelöst, etwas eingeengt und bei 60 mit 80 ml Hexan versetzt. Es wird langsam auf 0O gekühlt, das ausgefallene Produkt abgenutscht und mit Toluol-Hexan 1:1 und Hexan gewaschen. Ausbeute 4,06 g.
Im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel ist Rf = 0,26 in Chloroform-Methanol.
7a. Z-Ser(But)-Leu-OMe
5,9 g Z-Ser(But)-OH in 20 ml Essigester werden bei 10' mit 2,75 ml Triäthylamin und 2,63 ml Chlorameisensäureisobutylester versetzt. Nach 10 Minuten werden 4,0 g H-Leu OMe HCI und 3,05 ml Triäthylamin zugefügt. Nach 11/2 Stunden Rühren im Eisbad wird mit Phosphorsäure und Natriumhydrogencarbonatlösung ausgeschüttelt und nach Trocknen über Natriumsulfat der Essigester vollständig verdampft. Man erhält 8,2 g einer wachsartigen Masse. F. (nach Kristallisation aus Hexan): 56-580. Im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel ist Rf = 0,58 in Essigester.
8a. Trt-Cys(Trt)-Ser(But)-Leu-OMe
8,5 g des obigen Dipeptids werden in 130 ml Essigester gelöst, nach Abkühlen auf 0O mit 19,4 ml 1-n. Salzsäure und 0,6 g 10% Palladiumkohle versetzt und hydriert. Nach Abfiltrieren des Katalysators wird der Essigester verdampft, der Rückstand in 60 ml Methylenchlorid aufgenommen und mit 14,7 g Trt-Cys(Trt)-OSu und 2,2 ml N-Methylmorpholin versetzt. Nach 48 Stunden bei Raumtemperatur wird mit Essigester verdünnt und mit kalter, verdünnter Phosphorsäure und Natriumhydrogencarbonatlösung ausgeschüttelt. Der nach Trocknen und Verdampfen der Lösungsmittel erhaltene Rückstand wird im System Methanol-Hexan-Wasser (20:20:1) durch Craig-Verteilung über 600 Stufen gereinigt, k = 0,33.
Man erhält 10,1 g eines farblosen Schaums.
Im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel ist Rf = 0.46 in Essigester-Hexan (1:1).
9a. Bpoc-Ile-Cys(Trt)-Ser(But)-Leu-OMe
1,72 g des obigen, geschützten Tripeptids werden bei Raumtemperatur in 17,2 ml Eisessig gelöst, mit 4,2 ml Wasser versetzt und 30 Minuten gerührt. Nach Zugabe von 5 ml Eisessig wird gefriergetrocknet, der Rückstand in 35 ml 70% tert. Butanol suspendiert, noch mit 5 ml Wasser versetzt, das Triphenylcarbinol abfiltriert und das Filtrat erneut gefriergetrocknet. Man erhält 1,3 g eines weissen Pulvers; Rf 0,30 in Essigester, das zu dem wie folgt bereiteten gemischten Anhydrid gegeben wird: 830 mg Bpoc-Ile-OH in 4 ml Dimethylformamid werden bei 15o mit 0,25 ml N-Methylmorpholin und 0,295 ml Chlorameisensäureisobutylester versetzt. Nach 10 Minuten wird das oben erhaltene Tripeptid zugesetzt, gefolgt von 0,166 ml N-Methylmorpholin und 4 ml Dimethylformamid.
Man lässt über Nacht bei 0O stehen, fällt das Produkt durch Eintropfen in eiskalte wässerige Kaliumhydrogencarbonatlösung, nutscht ab, wäscht gut mit Wasser und trocknet bei 40 . Das erhaltene Produkt (1,98 g) ist rein genug für die weitere Verwendung, kann jedoch auch aus Methanol-Wasser umkristallisiert werden. F.: 175-177 .
Im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel ist Rf = 0,55 in Essigester-Hexan (8:2).
10a. Trt-Cys(Trt)-Cys(Acm)-Thr(But)-Ser(But)-Ile Cys(Trt)-Ser(But)-Leu-OMe
5,1 g Bpoc-Ile-Cys(Trt)-Ser(But)-Leu-OMe in 44 ml Eisessig und 11 ml Wasser werden 18 Stunden bei Raumtemperatur belassen. Nach Zugabe von 20 ml Eisessig wird lyophilisiert, dann noch zweimal aus tert.-Butanol gefriergetrocknet. Das klebrige Material wird mit 10 ml Äther zerrieben, nach Zugabe von 70 ml Hexan abgenutscht und mit Äther-Hexan
1:9 gewaschen. Ausbeute 2,92 g.
Im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel ist Rf = 0,16 in Essigester.
3,96 g Trt-Cys(Trt)-Cys(Acm)-Thr(But)-Ser(But)-NHNH2 in 15 ml Dimethylformamid werden bei 30 mit 3,3 ml 3,3-n.
Salzsäure in Dioxan und bei 15' mit 0,56 ml tert. Butylnitrit versetzt. Nach 15 Minuten bei ¯200 werden das obige Tetrapeptid und 2,4 ml N-Methylmorpholin zugefügt und über Nacht bei 0O belassen. Das mit eiskaltem Wasser gefällte Rohprodukt wird nach Trocknen mit Essigester-Hexan 8:2 an 290 g Kieselgel chromatographiert. Die dünnschichtchromatographisch reinen Fraktionen werden vereinigt und zur Trockne verdampft, man erhält 4,6 eines weissen Pulvers.
Im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel ist Rf = 0,38 in Essigester.
1 la. Trt-Cys(Trt)-Cys(Acm)-Thr(But)-Ser(But)-Ile Cys(Trt)-Ser(But)-Leu-OH
3,6 g Trt-Cys(Trt)-Cys(Acm)-Thr(But)-Ser(But)-Ile Cys(Trt)-Ser(But)-Leu-OMe werden in 50 ml Dioxan gelöst und 17 ml Wasser und 4 ml 1-n. Natronlauge zugegeben. Nach
1 Stunde bei 20 wird auf 0O abgekühlt und tropfenweise 4 ml
1-n. Salzsäure zugegeben. Bei 20 und vermindertem Druck wird dann das Dioxan weitgehend abgedampft, 20 ml Wasser zugegeben, der Niederschlag abfiltriert und über Kaliumhydroxid getrocknet.
Im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel ist Rf4s = 0,55 und Rf3 = 0,60.
12a. H-Cys(Trt)-Cys(Acm)-Thr(But)-Ser(But)-Ile Cys(Trt)-Ser(But)-Leu-OH 2 HCI
6,94 g Trt-Cys(Trt)-Cys(Acm)-Thr(But)-Ser(But)-Ile- Cys(Trt)-Ser(But)-Leu-OH werden in 72 ml Trifluoräthanol gelöst, 8 ml Wasser zugegeben und mit 1 ,2-n. Salzsäure in 90% Trifluoräthanol ein pH von 4,0 eingestellt und mittels eines pH-States bei dieser Säurestärke gehalten. Nach 50 Minuten werden 50 ml tert. Butanol zugegeben, das Trifluor äthanol bei vermindertem Druck abgedampft und die Lösung lyophilisiert. Rf3 = 0,40.
1 3a. H-Cys-Cys(Acm)-Thr(But)-Ser(But)-Ile-Cys Ser(But)-Leu-OH (I)
0,47 g H-Cys(Trt)-Cys(Acm)-Thr(But)-Ser(But)-Ile Cys(Trt)-Ser(But)-Leu-OH in 15 ml Trifluoräthanol werden innert 10 Minuten zu einem stark gerührten Gemisch von
18 ml mit Jod gesättigtem Methylenchlorid und 180 ml Tri fluoräthanol gegeben. 2 Minuten nach beendetem Eintragen wird eine Lösung von 3,2 g Ascorbinsäure in 60 ml Wasser und 30 ml 1-m. Ammoniumacetat zugegeben, die Lösung mit verdünntem Ammoniak auf pH 5,6 gebracht und bei vermindertem Druck das Trifluoräthanol grösstenteils entfernt. Das Gemisch wird dann in 100 ml Chloroform-Methanol (95:5) aufgenommen und die organische Phase zweimal mit Wasser gewaschen. Nach dem Trocknen über Natriumsulfat wird eingedampft und das Titelprodukt (I) durch eine Gelfiltration an Sephadex-LH 20 (Säule: 2 x 100 cm) gereinigt.
Elutionsmittel: Chloroform-Methanol (1:1).
Im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel ist Rfloo = 0,32; Rfs2 = 0,35.
B. Das Bruchstück II wird wie folgt hergestellt: lb. Boc-Gly-Ile-Val-Glu(OBut)-Gln-OCH3
Zu einer Suspension von 8,80 g Boc-Gly-Ile-Val-Glu(O But)-NH-NH2 (vgl. Zahn et al, Z. Naturf. 21b, 763 [1966]) in 60 ml abs. DMF werden bei 35 15 ml 3-n. HCI in Dioxan und 2,24 ml tert. Butylnitrit gegeben. Nach 15 minütigem Rühren bei ¯200 werden zu der klaren Lösung nacheinander 2,95 g H-Gln-OCH3 HCl und 10 ml N-Methylmorpholin hinzugefügt. Das Reaktionsgemisch wird während 28 Stunden im Eisbad gerührt. Man fällt das Produkt mit 450 ml kaltem Wasser aus, wäscht den Niederschlag und trocknet ihn. Nach mehrfachem Verreiben mit Methanol-Essigsäureäthylester (1:20) verbleiben 8,60 g eines farblosen Pulvers.
F. 223-226" (Zers.). [a]20 = ¯ 130 + 10 (c = 1 in DMF).
Im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel ist Rfs2 = 0,70, Rf im System Chloroform-Methanol-Trifluoräthanol (7:2:1) = 0,65; Rf im System Methyläthylketon-Pyridin-Wasser (65:5:20) = 0,65.
2b. Boc-Gly-Ile-Val-Glu(OBut)-Gln-NH-NH2
7,15 g Boc-Gly-Ile-Val-Glu(OBut)-Gln-OCH3 werden in
100 ml Methanol-DMF (1:7) gelöst und mit 10 ml Hydrazinhydrat versetzt. Nach 22-stündigem Stehen bei Raumtemperatur verdünnt man die feste Masse mit 70 ml Methanol, rührt im Eisbad und filtriert. Der Niederschlag wird mit Methanol verrieben. Man erhält 6,2 g eines farblosen Pulvers. Es schmilzt unter Zersetzung bei 243-270 . [a120 = 37" + 1 (c = 0,75 in Trifluoräthanol). Im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel ist Rfs2 = 0,40; Rf im System Chloroform-Methanol-Trifluoräthanol (7:2:1) = 0,23; Rf im System Methyl äthylketon-Pyridin-Wasser 65:5:20 = 0,57.
C. Die Bruchstücke I und II werden wie folgt zum Bruchstück V (A-Kette 1-13) kondensiert: Boc-Gly-Ile-Val-Glu(OBut)-Gln-Cys-Cys(Acm)-Thr(But) Ser(But)-Ile-Cys-Ser(But)-Leu-OH (V)
3,33 g Boc-Gly-Ile-Val-Glu(OBut)-Gln-NH-NH2 in 40 ml DMF werden bei ¯15 mit 5,59 ml 2,5-n. Chlorwasserstoff in Essigester und 0,7 ml tert.-Butylnitrit versetzt. Nach 10 Minuten bei dieser Temperatur wird eine Lösung von 2,48 g H-Cys-Cys(Acm)-Thr(But)-Ser(But)-Ile-Cys-Ser(But) Leu-OH und 2,64 ml N-Äthylmorpholin in 12 ml DMF zugetropft. Man lässt 1 Std. bei 10' und 15 Std. bei 0O stehen, engt dann die Reaktionslösung auf ein kleines Volumen ein und fällt mit Äther aus. Das erhaltene Rohprodukt wird einer Gegenstromverteilung unterworfen. System: Methanol-0,075m. Ammoniumacetat (pH 4.75)-Chloroform-Tetrachlorkohlenstoff (10:3:8:4).
Nach 740 Verteilungsschritten befindet sich die Substanz in den Rohren 50-83. K = 0,1.
Im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel ist Rf3 = 0,35, Rfs2 = 0,70.
D. Das Bruchstück III wird wie folgt hergestellt: ld. Boc-Cys(Acm)-Gly-OMe
20,5 g Boc-Cys(Acm)-OH und 7,5 g H-Gly-OCH3 (letztes frisch aus dem Hydrochlorid freigesetzt) werden in 250 ml Chloroform gelöst, mit 4,7 g N-Hydroxyhenzotriazol und
17,3 g Dicyclohexylcarbodiimid versetzt und während 4 Std.
bei 25o gerührt. Nach Abfiltrieren des Dicyclohexylharnstoffs wird mit weiteren 200 ml Chloroform verdünnt und nacheinander mit wenig 1-n. Zitronensäure, 1-m. NaHCO3 und mit Kochsalzlösung gewaschen, über Na2SO4 getrocknet und zur Trockne eingeengt. Den öligen Rückstand reinigt man durch Chromatographieren an einer Säule mit 300 g Silicagel, eingefüllt mit Essigester-Petroläther (2:1). Das reine Produkt wird mit Essigester eluiert; es ist ein Ö1, das aus Essigester-Petrol äther kristallisiert werden kann, F. 83-860.
Dünnschichtchromatogramm auf Silicagel: Rf43A = 0,49; Rf im System Chloroform-Methanol (9:1) = 0,42.
2d. H-Cys(Acm)-Gly-OMe HCI
5 g Boc-Cys(Acm)-Gly-OMe werden in 20 ml Methanol gelöst und mit 50 ml 4,4-n. HCI in Dioxan versetzt. Nach 10 Minuten bei 25o engt man das Volumen auf die Hälfte ein und gibt 100 ml Äther zu. Die Mutterlauge wird vom entstandenen amorphen Niederschlag abgetrennt und dieser getrocknet.
Im Dünnschichtchromatogramm auf Silicagel ist Rf in Chloroform-Methanol (7:3) = 0,45; Rfs2 = 0,21.
3 d. Boc-Leu-Cys(Acm)-Gly-OMe
32,45 g H-Cys(Acm)-Gly-OMe HCI und 12,5 ml N Methylmorpholin werden in 130 ml DMF gelöst, auf 0O gekühlt und mit 46 g Boc-Leu-ONp versetzt. Man rührt während 1 Std. bei 0O, dann 2 Std. bei 25o, gibt nochmals 11,8 ml N-Methylmorpholin zu und lässt über Nacht bei 25o stehen.
Man kühlt sodann auf 0O, filtriert vom auskristallisierten N Methylmorpholinhydrochlorid ab und engt das Filtrat im Hochvakuum ein. Der ölige Rückstand wird in 300 ml Essigester gelöst und nacheinander mit KOH-Lösung (5,4 g KOH in 100 ml H20), 0,5-n. Na2CO3, 1-n. Zitronensäure und NaCIgesättigtem Wasser gewaschen und zur Trockne eingeengt.
Das rohe Produkt wird durch Zerreiben mit Äther und durch Umfällen aus Benzol-Petroläther gereinigt, wobei man ein amorphes Pulver vom F. 112-1 13'erhält.
Im Dünnschichtchromatogramm auf Silicagel ist Rfs2 = 0,62; Rfloo = 0,90; Rf in Chloroform-Methanol (8:2) = 0,65.
4d. H-Leu-Cys(Acm)-Gly-OMe HCI
30 g des unter 3d erhaltenen Produktes werden in 120 ml Methanol gelöst, mit 300 ml 4,1-n. HCI in Dioxan versetzt und während 20 Minuten bei 250 stehen gelassen. Man engt sodann auf das halbe Volumen ein, gibt 600 ml Äther zu, pulverisiert die anfänglich schmierige Fällung, filtriert ab, wäscht mit Äther und trocknet den Rückstand im Hochvakuum über KOH. Das Produkt enthält gemäss Titration mit 0,1-n. NaOH
1,1-1,3 Äquivalent HCI, je nach Trocknungsbedingungen.
Auf Silicagel ist Rfs2 = 0,20; Rfloo = 0,23; Rf in Chloroform-Methanol (8:2) = 0,31.
5d. Boc-Gln-His-NH-NH2
27,9 g Boc-Gln-His-OCH (Marchiori et al, J.Chem. Soc[C] 1967, 81) werden in 280 ml reinstem Methanol gelöst, mit 28 ml Hydrazinhydrat versetzt und während 20 Std. bei 25O stehen gelassen. Man engt im Hochvakuum zur Trockne ein und kristallisiert den Rückstand aus Methanol-Essigester Petroläther um. F. 187-189 .
Im Dünnschichtchromatogramm auf Silicagel ist Rfs2 = 0,12; Rfioo = 0,1.
6d. Boc-Gln-His-Leu-Cys(Acm) -Gly-OMe
25,3 g des gemäss 5d erhaltenen und fein pulverisierten Produktes werden in 260 ml DMF suspendiert und bei ¯200 mit 40 ml 3,2-n. HCl in Dioxan und anschliessend mit 9,45 ml tert.-Butylnitrit versetzt. Man rührt während 15 Minuten bei 12' und gibt dann eine auf 0O vorgekühlte Lösung von 28,6 g des unter 4d erhaltenen Produktes in 120 ml DMF und 28 ml N-Methylmorpholin zu. Nach einstündigem Rühren bei 0O gibt man nochmals 10,5 ml N-Methylmorpholin zu und lässt dann während 20 Std. bei 0O stehen. Das auskristallisierte Methylmorpholin-hydrochlorid wird abfiltriert, das Filtrat im Hochvakuum eingeengt, zweimal mit Essigester verrieben und der pulverige Rückstand getrocknet.
Man reinigt durch Gegenstromverteilung über 200 Stufen im System Methanol-Puffer Chloroform (2:1:4) (Puffer: 38,5 g Ammoniumacetat + 57,2 ml Eisessig + 1000 ml Wasser). Das chromatographisch reine Pentapeptidderivat erhält man aus den Rohren 54-88 (rmax = 71; K = 0,55) durch Einengen zur Trockne und Wegsublimieren des Puffersalzes im Hochvakuum bei 45 . Es wird nochmals 5 %ig in Wasser gelöst und lyophilisiert; man erhält auf diese Weise das Acetat des Produktes.
Im Dünnschichtchromatogramm auf Silicagel ist Rf43c = 0,4; Rfiio = 0,5; RflOlA = 0,73.
7d. H-Gln-His-Leu-Cys(Acm)-Gly-OMe 2 HCI
28 g des unter 6d erhaltenen Produktes werden in 140 ml Trifluoräthanol und 140 ml Methanol gelöst, auf 0O gekühlt und mit 280 ml 4,4-n. HCI in Dioxan versetzt. Man lässt wäh rend 5 Minuten bei 250 reagieren, kühlt wieder auf 0O, fällt durch Zugabe von 560 ml Essigester und 280 ml Petroläther aus und dekantiert die überstehende Lösung. Der amorphe
Rückstand wird durch Zerreiben mit Essigester-Petroläther (2:1) pulverisiert und im Hochvakuum über KOH bei Raumtemperatur getrocknet.
Auf Silicagel ist RflolA = 0,4; Rfioi = 0,35.
8d. Boc-Asn-Gln-His-Leu-Cys(Acm)-Gly-OMe
27,3 g des unter 7d erhaltenen Produktes und 40,5 g Boc Asn-ONp werden in 140 ml DMF gelöst, mit 12,6 ml N Methylmorpholin versetzt, 1 Std. bei 250 gerührt, nochmals mit 8,4 ml N-Methylmorpholin versetzt und über Nacht stehen gelassen. Nach Abkühlen auf 0O wird das Methylmorpholinhydrochlorid abfiltriert, das Rohprodukt aus dem Filtrat mit Essigester ausgefällt und durch Umfällen aus Methanol-Äther gereinigt.
Man erhält das Hexapeptidderivat als amorphes Pulver vom F. 175-77 (Zers.).
Auf Silicagel ist RflolA = 0,6; Rf207 = 0,65; Rf43c = 0,3; Rfiio = 0,45.
9d. H-Asn-Gln-His-Leu-Cys(Acm)-Gly-OMe 2HCI
26 g des unter 8d erhaltenen Produktes werden in 130 ml Trifluoräthanol und 130 ml Methanol gelöst, mit 260 ml 4,8-n.
HCI in Dioxan versetzt und während 20 Minuten bei 250 stehen gelassen. Das Hexapeptidderivat wird alsdann durch Zufliessenlassen von 520 ml Essigester und 260 ml Petroläther bei 0O in pulveriger Form ausgefällt, abfiltriert und im Hochvakuum über KOH getrocknet.
Auf Silicagel: RflolA = 0,3; Rf43c = 0,12.
1 Od. Boc-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys(Acm)-Gly-OMe
33 g Boc-Val-ONp, 27 g des unter 9d erhaltenen Produktes und 18 ml N-Methylmorpholin werden in 400 ml DMF gelöst und während 6l/2 Stunden auf 50O erwärmt. Man engt sodann im Hochvakuum bis zu Öl ein und fällt das Rohprodukt durch Zugabe von Äther aus. Es wird durch Umfällen aus Methanol5 %iger NaHCO3-Lösung und aus Methanol-Essigester gereinigt, F. 210-12 .
Auf Silicagel: RflOlA = 0,6; Rfs2 = 0,15; Rf43C = 0,35.
mild. Boc-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys(Acm)-Gly-OH
20,6 g des unter 10d erhaltenen Produktes werden in 164 ml Methanol und 226 ml Wasser unter Erhitzen zum Sieden gelöst, auf 10o abgekühlt, mit 82 ml 1-n. NaOH versetzt und dann während 8 Minuten bei 25o stehen gelassen.
Man neutralisiert durch Zugabe von 82 ml 1-n. HCI, engt auf ein Volumen von ca. 250 ml ein und unterwirft diese Lösung zur Reinigung einer Gegenstromverteilung im System n-Butanol-Ammonacetatpuffer (7,7 g Ammoniumacetat + 5,72 ml Eisessig + 1000 ml Wasser; pH = 4,75). Nach 166 Stufen isoliert man das reine Heptapeptidderivat aus den Rohren Nr.
54-75 (rmax = 64; K = 0,63) durch Eindampfen zur Trockne, Absublimieren des Puffers und Trocknen bei 45O im Hochvakuum als amorphes Pulver vom F. 220 (Zers.).
Auf Silicagel: Rf43E = 0,45; Rflol = 0,5; Rfsi = 0,55.
12d. H-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys(Acm)-Gly-OH 2HCI
9 g des unter 1 1d erhaltenen Produktes werden in 225 ml 0,72-n. HCI in 94%igem Eisessig suspendiert und während 30 Minuten bei 250 gerührt, wobei man nach ca. 20 Minuten eine klare Lösung erhält. Diese wird lyophilisiert und der Trockenrückstand im Hochvakuum bei 30O nachgetrocknet.
Auf Silicagel: Rf43E = 0,18; Rf45 = 0,18; RflolA = 0,3.
13d. Boc-Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys(Acm)-Gly-OH
467 mg des unter 12d erhaltenen Produktes werden in 10 ml DMF und 0,5 ml Wasser gelöst, mit 765 mg (Boc Ph)20 und 275 1ll N-Methylmorpholin versetzt und während 3 Std. bei 50O stehen gelassen. Man engt sodann im Hochvakuum bis zur Bildung eines gallertigen Rückstandes ein, der mit 0,1-m. Ammoniumacetatpuffer (pH 4,75) verrieben, abfiltriert, mit Wasser gewaschen und getrocknet wird. Das Rohprodukt wird durch Verreiben mit Äther und anschliessend durch Umfällen aus Trifluoräthanol-Äther gereinigt.
Auf Silicagel: Rf43E = 0,45; Rf4s = 0,27; Rfs2 = 0,21.
14d. Boc-Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys(Acm)-Gly-Ser(But) His-Leu-Val-Glu(OBut)-Ala-Leu-Tyr(But)-OMe
1,66 g des unter 13d erhaltenen Produktes und 290 mg Toluolsulfonsäure-monohydrat werden unter Erwärmen auf 45O in 32 ml absolutem DMF gelöst und nacheinander mit einer Lösung von 1,7 g H-Ser(But)-His-Leu-Val-Glu(OBut) Ala-Leu-Tyr(But)-OMe (vgl. Zahn et al, Ann. Chem 731, 91 [1970]) in 18 ml DMF und von 467 mg N-Hydroxybenzotriazol in 6 ml DMF versetzt; zuletzt gibt man nach 2,51 g Dicyclohexylcarbodiimid in fester Form zu und rührt während 40 Minuten bei 45 . Die zu einer Gallerte erstarrende Masse wird mit 300 ml Äther homogenisiert, die sich bildende feinflockige Fällung abfiltriert, mit Äther gewaschen und getrocknet.
Zur Reinigung wird das Rohprodukt in 80 ml Trifluoräthanol Eisessig (19:1, Volumenteile) während 40 Min. auf 50O erwärmt, durch Zugabe von 250 ml Äther ausgefällt, abfiltriert und im Hochvakuum über KOH getrocknet. Es ist ein amorphes, in den meisten Lösungsmitteln schwerlösliches Pulver vom Zersetzungspunkt bei ca. 2500. Gemäss Titrationen enthält es 1,15 Äqu. Toluolsulfonsäure und 0,85 Äqu. Essigsäure.
Auf Silicagel: Rfloo = 0,3; Rf43c = 0,35; Rf70 = 0,6; Rfllo = 0,6.
15d. Boc-Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys(Acm)-Gly-Ser(But) His-Leu-Val-Glu(OBut)-Ala-Leu-Tyr(But)-OH (III)
6,4 g des unter 14d erhaltenen Produktes werden bei 650 in 470 ml Trifluoräthanol gelöst, mit 145 ml Wasser und 191 ml 1-n. NaOH versetzt, während 5 Std. bei 50O gerührt, auf 20 gekühlt und mit 191 ml 1-n. HCI neutralisiert. Durch Einengen auf das halbe Volumen und Zugeben von 950 ml Wasser wird das Rohprodukt ausgefällt. Man stellt das pH durch Zugabe von 1-n. NaOH auf 7,0, lässt über Nacht bei 0O stehen, filtriert ab, wäscht mit Wasser und trocknet. Zur Reinigung verteilt man über 680 Stufen im System Methanol-1-n. Essigsäure-Chloroform-Tetrachlorkohlenstoff (10:3:5:4); Apparatur mit 200 Verteilungselementen und je 25 ml Phasenvolumen, Kreislaufverfahren.
Das reine Hexadecapeptid isoliert man aus den Rohren 540-594 (rmax = 550; K = 4,2) durch Einengen bis zur Gelbildung und Lyophilisation. Zur Entfernung der gebundenen Essigsäure wird in Trifluoräthanol gelöst, das 5-fache Volumen Wasser zugegeben, ein pH-Wert von 7,0 eingestellt, über Nacht bei stehen gelassen, abfiltriert, gewaschen und getrocknet. Man erhält ein amorphes, schwerlösliches Pulver vom Zersetzungspunkt bei ca. 230 .
Auf Silicagel: Rf43C = 0,3; Rfs2A = 0,3; Rf70 = 0,5; Rfiio = 0,45.
E. Das Bruchstück III wird wie folgt mit dem in der Schweizer Patentschrift Nr. 577 464 beschriebenen Bruchstück W zum Bruchstück VI (bestehend aus geschützter A-Kette 14-21 und geschützter B-Kette 1-30) kondensiert:
EMI7.1
Glu(OButpArg-Gly-Phe-Phe-Tyr(ButF Pro-Lys(Boc > Thr(ButpOBut 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30
2,12 g des unter 15d beschriebenen Produktes (III) und
EMI7.2
Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr(B uttThr(B uttPrLys (Boc)-Thr(ButtOB ut
22 23 24 25 26 27 28 29 30 als Hydrochlorid sowie 0,94 g N-Hydroxybenzotriazol (Hydrat) werden in 92 ml DMF bei 45O gelöst, mit 0,63 g Dicyclohexylcarbodiimid versetzt und während 4'/2 Std. bei 45O gerührt.
Die Lösung wird dann in 850 ml Äther eingetropft, der feinflockige Niederschlag abfiltriert und mit Äther gewaschen.
Das Rohprodukt wird einer Gegenstromverteilung im System Methanol-0.1-m. Ammoniumacetat (pH 7.0)-Chloroform-Tetrachlorkohlenstoff (10:3:5:4) unterworfen. Nach 1200 Verteilungsschritten befindet sich das Produkt in den Rohren 15-42; K = 0.03.
Die Substanz zeigt im Dünnschichtchromatogramm auf Silicagel folgende Rf-Werte: Rf1o2A = 0,50; Rfs2A = 0,55; Rflao = 0,45.
EMI7.3
Glu(OButArg-Gly-Phe-Phe-Tyr(ButFThr(B utY Pro-Lys (B octThr(B uttOB ut 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 (VII)
Aus dem unter le beschriebenen Produkt (VI) wird die Bpoc-Gruppe nach dem Verfahren der Schweizer Patentschrift Nr. 577 464 abgespalten, wobei man das obige Produkt (VII) erhält:
1,1 g des unter le beschriebenen Produktes VI werden in 150 ml 90%igem Trifluoräthanol gelöst, mit 0,12-n. Chlorwasserstoff in 90 %dem Trifluoräthanol auf pH 0,5 gestellt und mittels eines pH-Staten auf diesem Wert gehalten. Nach 1/2 Std. gibt man 1 ml Pyridin zu und dampft die Lösung zur Trockne ein.
Der Rückstand wird zweimal mit Äther verrieben, filtriert und getrocknet.
Das Produkt (Hydrochlorid von VII) weist im Dünnschichtchromatogramm auf Silicagel folgende Rf-Werte auf: Rfs2A = 0,25; Rfloo = 0,30; Rf43c = 0,40; Rfto2A = 0,35.
F. Das Bruchstück VII wird mit dem unter C beschriebenen Bruchstück V zu den über eine Disulfidbrücke verbundenen geschützten Sequenzen A und B des menschlichen Insulins (VIII) kondensiert:
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 Boc-Glv-Ile-Val-Glu(OBut) -Gln-Cys-Cys(Acm)- Thr(ButtSer(ButtIle- Cys-Ser(B utt-Leu-Tyr(B;ttGin-Leu-Glu(OBut:
:
18 19 20 21 wAsn-Tyr(But > Cys-Asn-OBut
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 Boc-Phe-Val-Asn-Gln-HisLeu-Cys (AcmtGly Ser(ButtHis-Leu-Val-Glu(O ButtAla-Leu-Tyr(B uttLeu-Val-Cys-Gly 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 Glu(OB uttArg-Gly-Phe-Phe-Tyr(ButtThr(But > -Pro- BoctThr(ButtOBut
950 mg Boc-Gly-Ile-Val-Glu(OBut)-Gln-Cys-Cys(Acm) Thr(But)-Ser(But)-Ile-Cys-Ser(But)-Leu-OH (V) und 360 mg des unter 2e beschriebenen Produktes werden in 15 ml DMF gelöst, 70 N-Aethylmorpholin, 136 mg N-Hydroxybenzotriazol und 150 mg Dicyclohexylcarbodiimid zugegeben. Die Lösung wird 5 Std. bei 450 gehalten, dann abgekühlt und mit 100 ml Äther versetzt. Der Niederschlag wird abfiltriert, mit Äther gewaschen und getrocknet.
Zur Reinigung wird das Rohprodukt einer Gegenstromverteilung im System Methanol-0,1-m. Ammoniumacetat (pH 4.75)-Chloroform-Tetrachlorkohlenstoff (20:6:11:9) unterworfen. Nach 1425 Verteilungsschritten befindet sich die Substanz in den Rohren 42-66. K = 0,05.
Das Produkt weist im Dünnschichtchromatogramm auf Silicagel folgende Rf-Werte auf: Rf45 = 0,35; Rfs2 = 0,40; Rflls = 0,60.
G. Menschliches Insulin (h-Insulin)
Variante a) Aus dem unter F beschriebenen Produkt werden die Schutzgruppen vom tert. Butyl-Typ mit Trifluoressigsäure und die Mercaptoschutzgruppen mittels Jod abgespalten, wobei gleichzeitig die zweite Disulfidbrücke zwischen den Ketten A und B gebildet wird: 55 mg des unter F beschriebenen Produktes werden bei Raumtemperatur 30 Minuten mit 95 %iger Trifluoressigsäure behandelt. Die Lösung wird mit 60 ml 50%iger Essigsäure verdünnt und sofort zu 15 ml 0,1-m. Jodlösung in Eisessig getropft. Nach 10 Minuten wird mit 1,8 ml 1-m. wässeriger Ascorbinsäurelösung entfärbt und diese Lösung auf einer 450 ml-Säule aus Sephadex G 25 in 50%iger Essigsäure entsalzt. Das im UV bei 280 mm absorbierende Eluat wird im Vakuum eingeengt und gefriergetrocknet. Aus diesem Rohprodukt wird das h-Insulin durch Vetteilung im System tert.
Butanol- 1-m. Ammoniumacetat (pH 7,1)-Chloroform (10:10:0,5) gewonnen; K = 0,35. Das Produkt kristallisiert aus einem 0,095-m. Na-citrat-Puffer pH 6,0, enthaltend 0,03-m. NaC1, 0,012-m. Zn Ck und 16 Vol% Aceton, in den typischen rhomboedrischen Kristallen.
Im Dünnschichtchromatogramm an Cellulose ist Rflol = 0,55; Rflt2A = 0,45. Elektrophoresen auf Celluloseacetat: pH 1,9: Laufstrecke 9 cm gegen die Anode; pH 8,6: Laufstrecke 7 cm gegen die Kathode (Puffer nach Brandenburg et al, Hoppe-Seyler's Z. Physiol. Chem. 353,599 [1972]).
Variante b) Aus dem unter F beschriebenen Produkt werden zuerst die Mercaptoschutzgruppen mittels Jod abgespalten unter gleichzeitiger Bildung der zweiten Disulfidbrücke, anschliessend werden die Schutzgruppen vom tert. Butyl-Typ mit Trifluoressigsäure entfernt.
55 mg des unter F beschriebenen Produktes in 20 ml 87,5%iger Essigsäure werden zu 15 ml 0,1-m. Jodlösung in Eisessig, verdünnt mit 40 ml 50%iger Essigsäure, getropft und 10 Minuten bei Raumtemperatur gerührt. Das überschüssige Jod wird mit 1,8 ml 1-m. wässeriger Ascorbinsäurelösung entfärbt und das Reaktionsgemisch auf einer 450 ml-Säule aus Sephadex G 25 in 50%iger Essigsäure entsalzt. Das im UV bei 280 nm absorbierende Eluat wird im Vakuum eingeengt und gefriergetrocknet. Der Rückstand wird 30 Minuten mit 95 %iger Trifluoressigsäure behandelt und mit Äther gefällt.
Aus diesem Rohprodukt wird das h-Insulin wie bei Variante a) beschrieben erhalten.
The invention relates to a new process for the preparation of peptides which contain more than one cystine disulfide bond, in particular insulins and fragments or synthetic analogs thereof, e.g. Compounds consisting of A and B chains which are linked to one another by peptide chains or non-peptide bridges, cf.
Biochem. Biophys. Res. Comm. 55, 60 (1973).
Analogs are to be understood in particular as corresponding peptide amides, furthermore peptides or peptide amides in which functional groups such as e.g. Amino groups, carboxyl groups, hydroxyl groups, are protected in a known manner.
It is known that two different amino acid sequences are linked in insulin by two disulfide bridges, namely by the dystine residue of the A chain (7-position) and the B chain (7-position) on the one hand and the cystine residue of the A-chain (20-position) and the B-chain (19 position) on the other hand.
In addition, there is another disulfide bridge in one and the same chain, namely the cystine residue in positions 6 and 11 of the A chain.
In the synthetic production of such peptides, the problem arises of oxidizing the cysteine-containing amino acid sequences in such a way that the disulfide bonds are formed between the desired cysteine residues which are located in one or in two chains.
By using the known selectively cleavable mercapto protective groups, the problem has so far not been solved in a satisfactory manner. Groups which can be split off by alkaline or hydrogenolysis are not favorable because, under the conditions of splitting off, partial decomposition of the peptide, especially at the disulfide bond, occurs. Sufficient selectivity is difficult to achieve with the protecting groups which can be split off under acidic conditions. Another great difficulty is that if the mercapto groups required for the first disulfide bond have been released by means of selectively removable mercapto protective groups and the disulfide bond formed therefrom by oxidation, another mercapto group still protected by another protective group after the protective group has been split off the disulfide bond can react to disproportionate the molecule.
A method has now been found by which insulin peptides or peptide derivatives can be produced in a surprisingly advantageous manner.
The process according to the invention is characterized in that a sequence is produced which contains at least the amino acids 6-11 of the A chain, the amino, carboxyl and / or hydroxyl groups of which are optionally protected and in which the cysteine groups in 6- and 11- Position is protected by a protective group Rl of the aralkyl type and the cysteine group in the 7-position by an acylaminomethyl group R2 and that in this sequence the protective groups Rl are split off with iodine in a polyhalogenated oxy or oxo compound to form the disulfide bridge and then, optionally after extension of the A chain to the amino and / or carboxyl end, condensed with a sequence which contains the disulfide bridge of the cystine of the A chain in the 20 position and the B chain in the 19 position,
where a cysteine group which may be present in this sequence in the 7 position of the B chain is protected by an acylaminomethyl group R2, then the A chain and B chain, if necessary, completes, the cysteine group in the 7 position of the B chain by a Acylaminomethyl group R2 is protected, splits off the amino, carboxyl and / or hydroxyl protective groups and, before or after this cleavage, forms the disulfide bridge between the two cysteine 7 residues of the A and B chain by splitting off the acylaminomethyl groups R2 and possibly simultaneous oxidation to the disulfide bridge .
The sequence of formation of the various disulfide bonds given here is particularly favorable.
In the process according to the invention, use is made of the selective cleavage of mercapto protective groups R1 and R2 in the presence of polyhalogenated lower aliphatic oxy or oxo compounds, which is described in Swiss patent specification No. 576 946 and which is characterized in that one or two cysteine-containing Amino acid sequences in which disulfide bonds are to be made, two cysteine residues to be connected each individually by an aralkyl or
Arylcycloalkylgruppe Rt, two further cysteine residues each individually protected by an acylaminomethyl group R2, the protective groups Ri are removed by treatment with iodine in the presence of a polyhalogenated lower aliphatic oxy or oxo compound, with the disulfide bond between these cysteine residues, which were protected by Rl, being formed at the same time, and at any time after removal of the polyhalogenated compound, forms the second disulfide bridge by treatment with iodine.
Mercapto protective groups Ri of the aralkyl type are to be understood as meaning groups in which the carbon atom bearing at least one aryl radical is bonded to the sulfur of the mercapto group. An aryl radical can be mono- or bicyclic (e.g. naphthyl); above all it is unsubstituted or substituted by electrotron donating substituents, e.g.
phenyl radical substituted by one or more radicals from the group consisting of lower alkyl, lower alkoxy and halogen. The aliphatic part of the aralkyl radical is a lower alkyl or cycloalkyl radical with up to 7 carbon atoms, especially methyl. In addition to the aryl radical, R1 contains e.g. at least one more cyclic radical which is either an aryl radical as indicated or a cycloalkyl radical with 5-7 carbon atoms.
Examples of the radicals Rl include 1-phenylcyclopentyl, 1-phenylcyclohexyl, 1-phenylcycloheptyl, p-methoxyphenylcyclohexyl, 1,1-diphenylethyl, 1,1-di- (p-tolyl) -ethyl, but especially triphenylmethyl (Trt) .
The acylaminomethyl group R2 is a group of the formula -CH2-NH-CO-R, in which CO - R denotes the acyl radical of a carboxylic acid, such as an aliphatic, aromatic, araliphatic or heterocyclic carboxylic acid or a carbonic acid derivative, such as a carbonic ester or carbamic acid radical . Primarily R is optionally substituted lower alkyl, e.g. Methyl, ethyl, propyl, isopropyl, n-butyl or tert. Butyl radical, which is used as a substituent e.g. Halogen atoms such as fluorine, chlorine, bromine or iodine, trifluoromethyl or the nitro group may contain.
Furthermore, R is, for example, an optionally substituted one
Cycloalkyl radical with 3-8, preferably 5-6, ring atoms like that
Cyclopentyl or cyclohexyl radical or an optionally substituted aromatic or araliphatic radical, in which the aromatic ring is preferably the benzene ring, especially optionally substituted phenyl or benzyl, e.g. B.
phenyl or benzyl which is unsubstituted or substituted in the phenyl radical by lower alkyl, lower alkoxy, halogen or nitro, or an optionally substituted, especially monocyclic, heterocyclyl radical, e.g. Thienyl or furyl radical.
R2 preferably stands for the acetylaminomethyl group (-Acm).
The treatment with iodine to split off the mercapto protective group Rl with simultaneous oxidation of the cystine groups to the cystine group is carried out in the presence of a polyhalogenated lower oxy or oxo compound, bromine, chlorine and, in particular, fluorine being suitable halogen atoms. The reaction medium should preferably contain at least 40% by weight of the polyhalogenated compound.
If water is present in the mixture, its weight percentage should not exceed 20%. Polyhalogenated lower aliphatic oxy or oxo compounds are above all polyhalogenated lower alkanols and di-lower alkyl ketones having 2 to 5, in particular 2 to 3 carbon atoms, furthermore corresponding lower alkanoic acid lower alkyl esters, e.g.
polyhalogenated acetic acid lower alkyl esters such as trifluoroacetic acid methyl ester or trichloroacetic acid ethyl ester. The compounds are preferably perhalogenized, at least on one otherwise unsubstituted carbon atom. Preferred examples are 2,2,2-tribromoethanol, 2,2,2-trichloroethanol, 1,1,1 -trifluoroacetone, hexachloroacetone, hexafluoroacetone and especially 2,2,2-trifluoroethanol and 1,1,1,3,3, 3-hexafluoro-2-propanol.
The reaction with iodine takes place under reaction conditions known per se, e.g. as described in the aforementioned Swiss patent specification No. 576 946. It is preferred to work at room temperature and at an acidic pH, which is achieved by the hydrogen iodide formed in the reaction.
If the reaction is carried out at a pH above 4, side chain hydroxyl groups of the tyrosine that may be present in the peptide sequence should be protected.
It is advisable to use an excess of iodine; the excess iodine can be removed, for example, with thiosulfate or ascorbic acid.
The splitting off of the R2 protective group with simultaneous formation of the second disulfide bridge is also carried out with iodine, as described in British Patent No. 1,329,860. Aqueous, aqueous-organic or organic solvents, with the exception of polyhalogenated lower alkanols, can be used, advantageously pure or aqueous acetic acid.
In the process according to the invention, in the amino acid sequences used as starting materials, the amino groups are in the protonated form or in the form protected by customary amino protective groups, and the hydroxyl and carboxyl groups are preferably in the protected form.
Examples of amino protective groups are: acyl groups such as formyl, trifluoroacetyl, phthaloyl, p-toluenesulfonyl, benzylsulfonyl, benzenesulfenyl, o-nitrophenylsulfenyl, or especially groups derived from carbonic acid or thiocarbonic acid, such as, if appropriate, in the aromatic radical by halogen atoms, nitro groups - Or lower alkoxy or lower carbalkoxy groups substituted carbobenzoxy groups, eg
Carbobenzoxy, o-bromine, p-bromine or p-chlorocarbobenzoxy, 2,4-dichlorocarbobenzoxy, p-nitrocarbobenzoxy, p-methoxycarbobenzoxy, colored benzyloxycarbonyl groups such as p-phenylazo-benzyloxycarbonyl and p- (p'-methoxyphenyloxycarbonyl, tolyloxycarbonyl, tolyloxycarbonyl a, a-Dimethyl-3,5-dimethoxybenzyl) -oxycarbonyl, benzhydryloxycarbonyl, 2-phenyl-isopropyloxycarbonyl, 2-tolylisopropyloxycarbonyl and especially 2- (para-biphenylyl) -2propyloxycarbonyl, also aliphatic oxycarbonyl groups such as 1-methylcyclobutyloxycarbonyl, isonicotinyloxycarbonyl, allyloxycarbonyl, cyclopentyloxycarbonyl, tert-amyloxycarbonyl, adamantyloxycarbonyl, isobornyloxycarbonyl, and primarily tert-butyloxycarbonyl.
Carboxyl groups can be protected, for example, by amide or hydrazide formation or by esterification. Suitable for esterification are e.g. lower optionally substituted alkanols such as methanol, ethanol, cyanomethyl alcohol, benzoylmethyl alcohol or, in particular, tert-butanol, and also aralkanols such as aryl-lower alkanols, e.g. benzyl or benzhydryl alcohols optionally substituted by lower alkyl or lower alkoxy groups or halogen atoms, such as p-nitrobenzyl alcohol or 2,4,6-trimethylbenzyl alcohol, or phenols and thiophenols such as phenol, thiophenol, thiocresol.
The hydroxy groups of the serine, threonine and tyrosine residues can e.g. be protected by esterification or etherification. As acyl residues in the esterification e.g. Lower alkanoyl radicals such as acetyl, aroyl radicals such as benzoyl and, above all, radicals derived from carbonic acid such as benzyloxycarbonyl, o-bromobenzyloxycarbonyl or ethyloxycarbonyl are suitable. Groups suitable for etherification are e.g. Benzyl-, m-bromobenzyl, 2,6-dichlorobenzyl, tetrahydropyranyl or tert. Butyl residues. Furthermore, the protection of the hydroxyl groups in Ber. 100 (1967), 3838-3849 described 2,2,2-trifluoro-1-tert-butyloxycarbonylamino or -1benzyloxycarbonylaminoethyl groups (Weygand).
It is primarily used acidolytically, e.g. protective groups which can be split off by acetic acid, trifluoroacetic acid, hydrochloric acid or hydrogen fluoride, in particular groups from tert. Butyl type like the tert. Butyloxycarbonylgruppe, the tert. - Butyl ester and tert-butyl ether group. It must be taken into account that when the sequences are built up by chain extension at the amino end, the various chains must carry amino protective groups that can be selectively split off from one another, as described in Swiss patent specification No. 577 464 or Belgian patent 805 147. As stated there, so-called stable protecting groups are required as groups to be kept constant, e.g.
for the protection of amino, hydroxyl and carboxyl groups of the side chains and for the protection of terminal carboxyl groups, furthermore two types of so-called unstable protective groups for the α-amino groups of the various chains under construction.
The method of Swiss patent specification No. 577 464 also describes the production of a partial sequence of human insulin, namely A chain 14-21 + B chain 17-30, which is used as fragment IV in the present inventive method. The 2- (p-biphenylyl) -2-isopropyloxycarbonyl group and the trityl group are used as amino protective groups for the two chains. The content of the two Swiss patents mentioned and the Belgian patent 805 147 are to be used to supplement the present inventive method.
The cystine-containing protected amino acid sequences obtained in the present process can be used directly for the synthesis of sequences with a longer amino acid chain, or, if desired, the protective groups can be split off in a known manner.
The starting materials for the process of the present application, namely cysteine-containing amino acid sequences in which the cysteine residues are protected by mercapto protective groups Rl or Rz, are known or can be prepared by methods known per se, cf. e.g. English patents 1,259,017 and 1,329,860, in which the removal of these protective groups is also described. The cysteine-containing amino acid sequences can also contain cystine-S-S bridges, which were formed in the same or different way at an earlier point in the synthesis.
The cysteine-containing starting materials as well as the insulins to be produced by means of cystine-containing sequences as the end product are obtained by condensing the amino acids necessary to build up the peptide with the formation of CONH bonds, with functional groups not participating in the reaction being intermediately protected and the cysteine residues being oxidized to cystine residues will.
The protective groups to be used have already been mentioned.
The amino acid and / or peptide units are linked e.g. in such a way that an amino acid or a peptide with a protected α-amino group and activated terminal carboxyl group is combined with an amino acid or a peptide with a free α-amino group and free or protected, e.g. esterified or amidated terminal carboxyl group, or that an amino acid or a peptide with activated a-amino group and protected terminal carboxyl group is reacted with an amino acid or a peptide with a free terminal carboxyl group and protected a-amino group.
The carboxyl group can be converted, for example, into an acid azide, anhydride, imidazolide, isoxazolide or an activated ester, such as cyanomethyl ester, carboxymethyl ester, p-nitrophenyl thioester, p-nitrophenyl ester, 2,4,5-trichlorophenyl ester, pentachlorophenyl ester, N-hydroxysuccinimide ester, N-hydroxyphthalimide ester, 8-hydroxyquinoline ester, N-hydroxypiperidine ester or by reaction using a carbodiimide (optionally with the addition of N-hydroxysuccinimide or an unsubstituted or e.g.
1-hydroxybenzotriazole substituted by halogen, methyl or methoxy) or N, N'-carbonyldiimidazole, the amino group can be activated, for example, by reaction with a phosphite amide. The most common methods are the carbodiimide method, the azide method, the activated ester method and the anhydride method, also the Merrifield method and the N-carboxyanhydride or N-thiocarboxyanhydride method.
In the following example, the temperatures are given in degrees Celsius and the following abbreviations are used: Boc = tert-butyloxycarbonyl Acm = acetylaminomethyl Trt = trityl Z = carbobenzoxy But = tert-butyl Me = methyl Bpoc = 2- (p-biphenylyl) - 2-propyloxycarbonyl ONp = p-nitrophenyl ester OSu = N-hydroxysuccinimide ester DMF = dimethylformamide
The following systems are used in thin layer chromatography: System 3.
Acetate-pyridine-water (65: 20:15) system 43A: tert-amyl alcohol-isopropanol-water (67: 26: 7) system 43C: tert-amyl alcohol-isopropanol-water (51: 21: 28) system 43E : tert-amyl alcohol-isopropanol-water (32: 32: 36) System 45: sec.butanol-3% aqueous ammonia (70:30) System 52: n-butanol-glacial acetic acid-water (75: 7.5: 21) System 52A: n-butanol-glacial acetic acid-water (67:23) System 70: ethyl acetate-pyridine-water (40: 20:40), upper phase system 87:
Isopropanol-formic acid-water (77: 4: 19) system 100: ethyl acetate-pyridine-glacial acetic acid-water (62: 21: 6: 11) system 101: n-butanol-pyridine-glacial acetic acid-water (38: 24: 8: 30) System 101A: n-butanol-pyridine-glacial acetic acid-water (42: 24: 4: 30) System 102A: ethyl acetate-methyl ethyl ketone-formic acid-water (50: 30: 10:10) System 107: ethyl acetate-pyridine-water (49: 24: 27) System 110: ethyl acetate-n-butanol-pyridine-glacial acetic acid-water (42: 21: 21: 6: 10) System 112A: n-butanol-pyridine-formic acid-water (42: 24: 4 : 20) System 115: ethyl acetate-pyridine-formic acid-water (63: 21: 10: 6).
Synthesis of human insulin of formula (A chain)
EMI3.1
Arg-GlyPhe-Phe-Tyr-Thr-Pro-LyThr-OH
22 23 24 25 26 27 28 29 30 (B chain) The above product is obtained by means of the fragment of amino acids 613 of the A chain, namely
EMI3.2
and the following further fragments prepared: II = Boc-Gly-Ile-Val-Glu (OBut) -Gln-NH-NH2 (A-chain 1-5) III = Boc-Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu -Cys (Acm} Gly-Ser (ButSHis- Leu-Val-Glu (OBut) -Ala-Leu-Tyr (ButtOH (B-chain 1-16)
EMI4.1
(A chain 14-21 + B chain 17-30) The fragment IV is described in Swiss patent specification No. 577464.
A. The fragment I is made as follows: la. Trt-Cys (Trt) -Cys (Acm) -OMe
7.0 g of Trt-Cys (Trt) -OSu and 2.0 g of H-Cys (Acm) -OMe are left to stand in 50 ml of chloroform for 20 hours at room temperature. The solution is then diluted with 100 ml of chloroform and 1-n. Citric acid, 1-n. Washed sodium bicarbonate and water, dried over sodium sulfate and evaporated. The residue is recrystallized from ethyl acetate-ether. F. 197-1980.
2a. Trt-Cys (Trt) -Cys (Acm) -OH
5.63 g of Trt-Cys (Trt) -Cys (Acm) -OMe are dissolved in 75 ml of dioxane and the solution is carefully mixed with 17.5 ml of water and 3.71 ml of 2-n. Sodium hydroxide solution added. After 1 hour at 200, the mixture is cooled to 0O, 3.71 ml of 2-n. Hydrochloric acid is added, the solution is reduced to approx.
Concentrated to 30 ml and then diluted with 200 ml of chloroform.
The solution is washed three times with water and dried over sodium sulfate. When the solvent is evaporated, the product which is pure according to thin layer chromatography is obtained as a white foam.
In the thin-layer chromatogram on silica gel, Rf45 = 0.45; Rfioo = 0.65.
3a. Z-Thr (But) -Ser (But) -OMe
16.25 g of Z-Thr (But) -OSu and 8.47 g of H-Ser (But) -OMe HCl are added to 200 ml of ethyl acetate, 5.6 ml of triethylamine are added at 0 "and the mixture is stirred at 20" for 15 hours and with 1-n. Citric acid, 1-n. Washed sodium bicarbonate and water. After drying over sodium sulfate, the solution is evaporated, the product which is pure according to thin-layer chromatography being obtained as an oil.
In the thin-layer chromatogram on silica gel, Rf = 0.60 in chloroform-methanol (95: 5) and Rf = 0.75 in toluene-acetone (1: 1).
4a. H-Thr (But) -Ser (But) -OMe
3.27 g of Z-Thr (But) -Ser (But) -OMe are hydrogenated in 50 ml of ethyl acetate in the presence of 0.5 palladium-carbon (10%).
After the hydrogen uptake has ended (1 hour), the catalyst is filtered off and the solution is evaporated. The product obtained as oil is uniform according to thin-layer chromatography.
In the thin-layer chromatogram on silica gel, Rf = 0.30 in chloroform-methanol (95: 5).
5a. Trt-Cys (Trt) -Cys (Acm) -Thr (But) -Ser (But) -OMe
5.43 g of Trt-Cys (Trt) -Cys (Acm) -OH and 2.33 g of H-Thr (But) Ser (But) -OMe are dissolved in 70 ml of ethyl acetate and at 0 "with 1.55 g of dicyclohexylcarbodiimide and 1.02 g of N-hydroxybenzotriazole are added. After 4 hours at 0 "and 17 hours at 4 it is filtered, the solution is diluted with 200 ml of ethyl acetate and diluted with 1-n. Citric acid, 1-n. Washed sodium bicarbonate and water. After drying over sodium sulfate, it is evaporated and the residue is reprecipitated from ethyl acetate-petroleum ether.
In the thin-layer chromatogram on silica gel, Rf = 0.60 in toluene-acetone (1: 1) and Rf = 0.45 in ethyl acetate.
6a. Trt-Cys (Trt) -Cys (Acm) -Thr (But) -Ser (But) -NHNH2
4.7 g of Trt-Cys (Trt) -Cys (Asm) -Thr (But) -Ser (But) -OMe in 11 ml of methanol are left at room temperature for 6l / 2 hours after adding 2.2 ml of hydrazine hydrate. The hydrazide is precipitated with 50 ml of ice-cold water, suction filtered and washed thoroughly with water. The dried crude product is dissolved in 80 ml of hot toluene, concentrated somewhat and, at 60, 80 ml of hexane are added. It is slowly cooled to 0O, the precipitated product is suction filtered and washed with toluene-hexane 1: 1 and hexane. Yield 4.06g.
In the thin-layer chromatogram on silica gel, Rf = 0.26 in chloroform-methanol.
7a. Z-Ser (But) -Leu-OMe
5.9 g of Z-Ser (But) -OH in 20 ml of ethyl acetate are mixed with 2.75 ml of triethylamine and 2.63 ml of isobutyl chloroformate at 10 '. After 10 minutes, 4.0 g of H-Leu OMe HCI and 3.05 ml of triethylamine are added. After stirring for 11/2 hours in an ice bath, the mixture is extracted by shaking with phosphoric acid and sodium hydrogen carbonate solution and, after drying over sodium sulfate, the ethyl acetate is completely evaporated. 8.2 g of a waxy mass are obtained. F. (after crystallization from hexane): 56-580. In the thin-layer chromatogram on silica gel, Rf = 0.58 in ethyl acetate.
8a. Trt-Cys (Trt) -Ser (But) -Leu-OMe
8.5 g of the above dipeptide are dissolved in 130 ml of ethyl acetate, after cooling to 0O with 19.4 ml of 1-n. Hydrochloric acid and 0.6 g of 10% palladium carbon were added and hydrogenated. After the catalyst has been filtered off, the ethyl acetate is evaporated, the residue is taken up in 60 ml of methylene chloride, and 14.7 g of Trt-Cys (Trt) -OSu and 2.2 ml of N-methylmorpholine are added. After 48 hours at room temperature, the mixture is diluted with ethyl acetate and extracted with cold, dilute phosphoric acid and sodium hydrogen carbonate solution. The residue obtained after drying and evaporation of the solvents is purified in the system methanol-hexane-water (20: 20: 1) by Craig distribution over 600 stages, k = 0.33.
10.1 g of a colorless foam are obtained.
In the thin-layer chromatogram on silica gel, Rf = 0.46 in ethyl acetate-hexane (1: 1).
9a. Bpoc-Ile-Cys (Trt) -Ser (But) -Leu-OMe
1.72 g of the above, protected tripeptide are dissolved in 17.2 ml of glacial acetic acid at room temperature, treated with 4.2 ml of water and stirred for 30 minutes. After adding 5 ml of glacial acetic acid, the mixture is freeze-dried, the residue in 35 ml of 70% tert. Suspended butanol, 5 ml of water were added, the triphenylcarbinol was filtered off and the filtrate was freeze-dried again. 1.3 g of a white powder are obtained; Rf 0.30 in ethyl acetate, which is added to the mixed anhydride prepared as follows: 830 mg of Bpoc-Ile-OH in 4 ml of dimethylformamide are mixed with 0.25 ml of N-methylmorpholine and 0.295 ml of isobutyl chloroformate at 15 °. After 10 minutes the tripeptide obtained above is added, followed by 0.166 ml of N-methylmorpholine and 4 ml of dimethylformamide.
It is left to stand overnight at 0 °, the product is dropped into ice-cold aqueous potassium hydrogen carbonate solution, filtered off with suction, washed well with water and dried at 40. The product obtained (1.98 g) is pure enough for further use, but can also be recrystallized from methanol-water. F .: 175-177.
In the thin-layer chromatogram on silica gel, Rf = 0.55 in ethyl acetate-hexane (8: 2).
10a. Trt-Cys (Trt) -Cys (Acm) -Thr (But) -Ser (But) -Ile Cys (Trt) -Ser (But) -Leu-OMe
5.1 g of Bpoc-Ile-Cys (Trt) -Ser (But) -Leu-OMe in 44 ml of glacial acetic acid and 11 ml of water are left at room temperature for 18 hours. After adding 20 ml of glacial acetic acid, it is lyophilized, then freeze-dried twice more from tert-butanol. The sticky material is triturated with 10 ml of ether, suction filtered after adding 70 ml of hexane and with ether-hexane
Washed 1: 9. Yield 2.92g.
In the thin-layer chromatogram on silica gel, Rf = 0.16 in ethyl acetate.
3.96 g of Trt-Cys (Trt) -Cys (Acm) -Thr (But) -Ser (But) -NHNH2 in 15 ml of dimethylformamide are mixed with 3.3 ml of 3.3-n.
Hydrochloric acid in dioxane and tert at 15 'with 0.56 ml. Butyl nitrite added. After 15 minutes at ¯200, the above tetrapeptide and 2.4 ml of N-methylmorpholine are added and left at 0O overnight. The crude product precipitated with ice-cold water is dried with ethyl acetate-hexane 8: 2 and chromatographed on 290 g of silica gel. The fractions which are pure by thin-layer chromatography are combined and evaporated to dryness, giving 4.6 of a white powder.
In the thin-layer chromatogram on silica gel, Rf = 0.38 in ethyl acetate.
1 la. Trt-Cys (Trt) -Cys (Acm) -Thr (But) -Ser (But) -Ile Cys (Trt) -Ser (But) -Leu-OH
3.6 g of Trt-Cys (Trt) -Cys (Acm) -Thr (But) -Ser (But) -Ile Cys (Trt) -Ser (But) -Leu-OMe are dissolved in 50 ml of dioxane and 17 ml of water and 4 ml 1-n. Sodium hydroxide added. To
1 hour at 20 is cooled to 0O and dropwise 4 ml
1-n. Hydrochloric acid added. The dioxane is then largely evaporated at 20 and reduced pressure, 20 ml of water are added, the precipitate is filtered off and dried over potassium hydroxide.
In the thin-layer chromatogram on silica gel, Rf4s = 0.55 and Rf3 = 0.60.
12a. H-Cys (Trt) -Cys (Acm) -Thr (But) -Ser (But) -Ile Cys (Trt) -Ser (But) -Leu-OH 2 HCI
6.94 g of Trt-Cys (Trt) -Cys (Acm) -Thr (But) -Ser (But) -Ile-Cys (Trt) -Ser (But) -Leu-OH are dissolved in 72 ml of trifluoroethanol, 8 ml Water added and with 1, 2-n. Hydrochloric acid in 90% trifluoroethanol adjusted to a pH of 4.0 and kept at this acid strength by means of a pH state. After 50 minutes, 50 ml of tert. Butanol was added, the trifluoroethanol was evaporated off under reduced pressure and the solution was lyophilized. Rf3 = 0.40.
1 3a. H-Cys-Cys (Acm) -Thr (But) -Ser (But) -Ile-Cys Ser (But) -Leu-OH (I)
0.47 g of H-Cys (Trt) -Cys (Acm) -Thr (But) -Ser (But) -Ile Cys (Trt) -Ser (But) -Leu-OH in 15 ml of trifluoroethanol become one within 10 minutes strongly stirred mixture of
18 ml of methylene chloride saturated with iodine and 180 ml of tri fluoroethanol are added. 2 minutes after the end of the entry, a solution of 3.2 g of ascorbic acid in 60 ml of water and 30 ml of 1-m. Ammonium acetate was added, the solution was brought to pH 5.6 with dilute ammonia and most of the trifluoroethanol was removed under reduced pressure. The mixture is then taken up in 100 ml of chloroform-methanol (95: 5) and the organic phase is washed twice with water. After drying over sodium sulfate, it is evaporated and the title product (I) is purified by gel filtration on Sephadex-LH 20 (column: 2 × 100 cm).
Eluant: chloroform-methanol (1: 1).
In the thin-layer chromatogram on silica gel, Rfloo = 0.32; Rfs2 = 0.35.
B. Fragment II is made as follows: lb. Boc-Gly-Ile-Val-Glu (OBut) -Gln-OCH3
To a suspension of 8.80 g of Boc-Gly-Ile-Val-Glu (O But) -NH-NH2 (cf. Zahn et al, Z. Naturf. 21b, 763 [1966]) in 60 ml of abs. DMF are at 35 15 ml 3-n. HCl in dioxane and 2.24 ml of tert. Butyl nitrite given. After stirring for 15 minutes at ¯200, 2.95 g of H-Gln-OCH3 HCl and 10 ml of N-methylmorpholine are added successively to the clear solution. The reaction mixture is stirred in an ice bath for 28 hours. The product is precipitated with 450 ml of cold water, the precipitate is washed and dried. After repeated trituration with methanol-ethyl acetate (1:20), 8.60 g of a colorless powder remain.
F. 223-226 "(dec.). [A] 20 = ¯ 130 + 10 (c = 1 in DMF).
In the thin-layer chromatogram on silica gel, Rfs2 = 0.70, Rf in the chloroform-methanol-trifluoroethanol (7: 2: 1) system = 0.65; Rf in the methyl ethyl ketone-pyridine-water system (65: 5: 20) = 0.65.
2 B. Boc-Gly-Ile-Val-Glu (OBut) -Gln-NH-NH2
7.15 g of Boc-Gly-Ile-Val-Glu (OBut) -Gln-OCH3 are in
Dissolve 100 ml of methanol-DMF (1: 7) and add 10 ml of hydrazine hydrate. After standing at room temperature for 22 hours, the solid mass is diluted with 70 ml of methanol, stirred in an ice bath and filtered. The precipitate is triturated with methanol. 6.2 g of a colorless powder are obtained. It melts at 243-270 with decomposition. [a120 = 37 "+ 1 (c = 0.75 in trifluoroethanol). In the thin-layer chromatogram on silica gel, Rfs2 = 0.40; Rf in the system chloroform-methanol-trifluoroethanol (7: 2: 1) = 0.23; Rf im System methyl ethyl ketone-pyridine-water 65: 5: 20 = 0.57.
C. Fragments I and II are condensed into fragment V (A-chain 1-13) as follows: Boc-Gly-Ile-Val-Glu (OBut) -Gln-Cys-Cys (Acm) -Thr (But) Ser (But) -Ile-Cys-Ser (But) -Leu-OH (V)
3.33 g of Boc-Gly-Ile-Val-Glu (OBut) -Gln-NH-NH2 in 40 ml DMF are mixed with 5.59 ml 2.5-n. Hydrogen chloride in ethyl acetate and 0.7 ml of tert-butyl nitrite are added. After 10 minutes at this temperature, a solution of 2.48 g of H-Cys-Cys (Acm) -Thr (But) -Ser (But) -Ile-Cys-Ser (But) Leu-OH and 2.64 ml of N -Ethylmorpholine in 12 ml DMF was added dropwise. The mixture is left to stand at 10 ° for 1 hour and at 0 ° for 15 hours, then the reaction solution is concentrated to a small volume and precipitated with ether. The crude product obtained is subjected to countercurrent distribution. System: methanol-0.075m. Ammonium acetate (pH 4.75) -chloroform carbon tetrachloride (10: 3: 8: 4).
After 740 distribution steps, the substance is in tubes 50-83. K = 0.1.
In the thin-layer chromatogram on silica gel, Rf3 = 0.35, Rfs2 = 0.70.
D. The fragment III is produced as follows: ld. Boc-Cys (Acm) -Gly-OMe
20.5 g of Boc-Cys (Acm) -OH and 7.5 g of H-Gly-OCH3 (the last freshly released from the hydrochloride) are dissolved in 250 ml of chloroform, with 4.7 g of N-hydroxyhenzotriazole and
17.3 g of dicyclohexylcarbodiimide are added and for 4 hours.
stirred at 25o. After filtering off the dicyclohexylurea, it is diluted with a further 200 ml of chloroform and successively with a little 1-n. Citric acid, 1-m. NaHCO3 and washed with brine, dried over Na2SO4 and evaporated to dryness. The oily residue is purified by chromatography on a column with 300 g of silica gel filled with ethyl acetate-petroleum ether (2: 1). The pure product is eluted with ethyl acetate; It is an oil that can be crystallized from ethyl acetate-petroleum ether, F. 83-860.
Thin layer chromatogram on silica gel: Rf43A = 0.49; Rf in the chloroform-methanol (9: 1) system = 0.42.
2d. H-Cys (Acm) -Gly-OMe HCI
5 g of Boc-Cys (Acm) -Gly-OMe are dissolved in 20 ml of methanol and mixed with 50 ml of 4,4-n. HCl added in dioxane. After 10 minutes at 25o, the volume is reduced to half and 100 ml of ether are added. The mother liquor is separated from the amorphous precipitate formed and this is dried.
In the thin-layer chromatogram on silica gel, Rf in chloroform-methanol (7: 3) = 0.45; Rfs2 = 0.21.
3 d. Boc-Leu-Cys (Acm) -Gly-OMe
32.45 g of H-Cys (Acm) -Gly-OMe HCl and 12.5 ml of N-methylmorpholine are dissolved in 130 ml of DMF, cooled to 0O, and 46 g of Boc-Leu-ONp are added. The mixture is stirred for 1 hour at 0 °, then for 2 hours at 25 °, a further 11.8 ml of N-methylmorpholine are added and the mixture is left to stand overnight at 25 °.
It is then cooled to 0O, the N methylmorpholine hydrochloride which has crystallized out is filtered off and the filtrate is concentrated in a high vacuum. The oily residue is dissolved in 300 ml of ethyl acetate and washed successively with KOH solution (5.4 g of KOH in 100 ml of H 2 O), 0.5 n. Na2CO3, 1-n. Citric acid and NaCl saturated water and concentrated to dryness.
The crude product is purified by trituration with ether and by reprecipitation from benzene-petroleum ether, an amorphous powder of F. 112-113 'being obtained.
In the thin-layer chromatogram on silica gel, Rfs2 = 0.62; Rfloo = 0.90; Rf in chloroform-methanol (8: 2) = 0.65.
4d. H-Leu-Cys (Acm) -Gly-OMe HCI
30 g of the product obtained under 3d are dissolved in 120 ml of methanol, with 300 ml of 4.1-n. HCI in dioxane was added and the mixture was left to stand at 250 for 20 minutes. It is then concentrated to half its volume, 600 ml of ether are added, the initially greasy precipitate is pulverized, filtered off, washed with ether and the residue is dried over KOH in a high vacuum. The product contains according to titration with 0.1-n. NaOH
1.1-1.3 equivalent of HCI, depending on the drying conditions.
On silica gel, Rfs2 = 0.20; Rfloo = 0.23; Rf in chloroform-methanol (8: 2) = 0.31.
5d. Boc-Gln-His-NH-NH2
27.9 g of Boc-Gln-His-OCH (Marchiori et al, J. Chem. Soc [C] 1967, 81) are dissolved in 280 ml of the purest methanol, mixed with 28 ml of hydrazine hydrate and left to stand for 20 hours at 250 . It is concentrated to dryness in a high vacuum and the residue is recrystallized from methanol-ethyl acetate petroleum ether. F. 187-189.
In the thin-layer chromatogram on silica gel, Rfs2 = 0.12; Rfioo = 0.1.
6d. Boc-Gln-His-Leu-Cys (Acm) -Gly-OMe
25.3 g of the finely pulverized product obtained in accordance with 5d are suspended in 260 ml of DMF and at ¯200 with 40 ml of 3.2-n. HCl in dioxane and then 9.45 ml of tert-butyl nitrite. The mixture is stirred for 15 minutes at 12 'and then a solution, pre-cooled to 0O, of 28.6 g of the product obtained under 4d in 120 ml of DMF and 28 ml of N-methylmorpholine is added. After stirring at 0 ° for one hour, another 10.5 ml of N-methylmorpholine are added and then left to stand at 0 ° for 20 hours. The crystallized methylmorpholine hydrochloride is filtered off, the filtrate is concentrated in a high vacuum, triturated twice with ethyl acetate and the pulverulent residue is dried.
Purification is carried out by countercurrent distribution over 200 stages in the system methanol-buffer chloroform (2: 1: 4) (buffer: 38.5 g ammonium acetate + 57.2 ml glacial acetic acid + 1000 ml water). The chromatographically pure pentapeptide derivative is obtained from tubes 54-88 (rmax = 71; K = 0.55) by concentrating to dryness and subliming away the buffer salt in a high vacuum at 45. It is again dissolved in 5% water and lyophilized; the acetate of the product is obtained in this way.
In the thin-layer chromatogram on silica gel, Rf43c = 0.4; Rfiio = 0.5; RflOlA = 0.73.
7d. H-Gln-His-Leu-Cys (Acm) -Gly-OMe 2 HCI
28 g of the product obtained under 6d are dissolved in 140 ml of trifluoroethanol and 140 ml of methanol, cooled to 0O and treated with 280 ml of 4,4-n. HCl added in dioxane. It is allowed to react for 5 minutes at 250, cooled again to 0O, precipitated by adding 560 ml of ethyl acetate and 280 ml of petroleum ether and the supernatant solution is decanted. The amorphous one
The residue is pulverized by trituration with ethyl acetate-petroleum ether (2: 1) and dried in a high vacuum over KOH at room temperature.
On silica gel, RflolA = 0.4; Rfioi = 0.35.
8d. Boc-Asn-Gln-His-Leu-Cys (Acm) -Gly-OMe
27.3 g of the product obtained under 7d and 40.5 g of Boc Asn-ONp are dissolved in 140 ml of DMF, 12.6 ml of N-methylmorpholine are added, the mixture is stirred at 250 for 1 hour, and again with 8.4 ml of N-methylmorpholine and left to stand overnight. After cooling to 0O, the methylmorpholine hydrochloride is filtered off, the crude product is precipitated from the filtrate with ethyl acetate and purified by reprecipitation from methanol-ether.
The hexapeptide derivative is obtained as an amorphous powder from F. 175-77 (decomp.).
On silica gel, RflolA = 0.6; Rf207 = 0.65; Rf43c = 0.3; Rfiio = 0.45.
9d. H-Asn-Gln-His-Leu-Cys (Acm) -Gly-OMe 2HCI
26 g of the product obtained under 8d are dissolved in 130 ml of trifluoroethanol and 130 ml of methanol, with 260 ml of 4.8-n.
HCI in dioxane was added and the mixture was left to stand at 250 for 20 minutes. The hexapeptide derivative is then precipitated in powder form by flowing in 520 ml of ethyl acetate and 260 ml of petroleum ether at 0O, filtered off and dried over KOH in a high vacuum.
On silica gel: RflolA = 0.3; Rf43c = 0.12.
1 Od. Boc-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys (Acm) -Gly-OMe
33 g of Boc-Val-ONp, 27 g of the product obtained under 9d and 18 ml of N-methylmorpholine are dissolved in 400 ml of DMF and heated to 50 ° for 6 1/2 hours. It is then concentrated in a high vacuum to an oil and the crude product is precipitated by adding ether. It is purified by reprecipitation from methanol 5% NaHCO3 solution and from methanol-ethyl acetate, mp 210-12.
On silica gel: RflOlA = 0.6; Rfs2 = 0.15; Rf43C = 0.35.
mild. Boc-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys (Acm) -Gly-OH
20.6 g of the product obtained under 10d are dissolved in 164 ml of methanol and 226 ml of water with heating to boiling, cooled to 10o, with 82 ml of 1-n. NaOH added and then left to stand at 25o for 8 minutes.
It is neutralized by adding 82 ml of 1-n. HCI, concentrated to a volume of approx. 250 ml and subject this solution to a countercurrent distribution in the system n-butanol-ammonium acetate buffer for purification (7.7 g ammonium acetate + 5.72 ml glacial acetic acid + 1000 ml water; pH = 4.75) . After 166 steps, the pure heptapeptide derivative is isolated from tubes no.
54-75 (rmax = 64; K = 0.63) by evaporation to dryness, subliming off the buffer and drying at 450 in a high vacuum as an amorphous powder with a melting point of 220 (decomp.).
On silica gel: Rf43E = 0.45; Rflol = 0.5; Rfsi = 0.55.
12d. H-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys (Acm) -Gly-OH 2HCI
9 g of the product obtained under 1 1d are in 225 ml of 0.72-n. HCl suspended in 94% glacial acetic acid and stirred at 250 for 30 minutes, a clear solution being obtained after about 20 minutes. This is lyophilized and the dry residue is dried in a high vacuum at 30 °.
On silica gel: Rf43E = 0.18; Rf45 = 0.18; RflolA = 0.3.
13d. Boc-Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys (Acm) -Gly-OH
467 mg of the product obtained under 12d are dissolved in 10 ml of DMF and 0.5 ml of water, 765 mg (Boc Ph) 20 and 275 μl of N-methylmorpholine are added and the mixture is left to stand at 50 ° for 3 hours. It is then concentrated in a high vacuum until a gelatinous residue is formed, which is 0.1 m. Ammonium acetate buffer (pH 4.75) is triturated, filtered off, washed with water and dried. The crude product is purified by trituration with ether and then by reprecipitation from trifluoroethanol ether.
On silica gel: Rf43E = 0.45; Rf4s = 0.27; Rfs2 = 0.21.
14d. Boc-Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys (Acm) -Gly-Ser (But) His-Leu-Val-Glu (OBut) -Ala-Leu-Tyr (But) -OMe
1.66 g of the product obtained under 13d and 290 mg of toluenesulfonic acid monohydrate are dissolved in 32 ml of absolute DMF while warming to 45O and successively with a solution of 1.7 g of H-Ser (But) -His-Leu-Val-Glu (OBut) Ala-Leu-Tyr (But) -OMe (cf. Zahn et al, Ann. Chem 731, 91 [1970]) in 18 ml of DMF and 467 mg of N-hydroxybenzotriazole in 6 ml of DMF; Finally, after 2.51 g of dicyclohexylcarbodiimide in solid form, the mixture is stirred for 40 minutes at 45. The mass, which solidifies to form a jelly, is homogenized with 300 ml of ether, the fine flaky precipitate that forms is filtered off, washed with ether and dried.
For purification, the crude product is heated in 80 ml of trifluoroethanol glacial acetic acid (19: 1, parts by volume) for 40 minutes to 50 °, precipitated by adding 250 ml of ether, filtered off and dried over KOH in a high vacuum. It is an amorphous powder, poorly soluble in most solvents, with a decomposition point of approx. 2500. According to titrations, it contains 1.15 equiv. Toluenesulfonic acid and 0.85 eq. Acetic acid.
On silica gel: Rfloo = 0.3; Rf43c = 0.35; Rf70 = 0.6; Rfllo = 0.6.
15d. Boc-Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys (Acm) -Gly-Ser (But) His-Leu-Val-Glu (OBut) -Ala-Leu-Tyr (But) -OH (III)
6.4 g of the product obtained under 14d are dissolved in 470 ml of trifluoroethanol at 650 ml, with 145 ml of water and 191 ml of 1-n. NaOH is added, the mixture is stirred at 50 ° for 5 hours, cooled to 20 and 191 ml of 1-n. HCI neutralized. The crude product is precipitated by concentrating it to half its volume and adding 950 ml of water. Adjust the pH by adding 1-n. NaOH to 7.0, left to stand overnight at 0O, filtered off, washed with water and dried. For purification, it is distributed over 680 stages in the methanol-1-n system. Acetic acid-chloroform-carbon tetrachloride (10: 3: 5: 4); Apparatus with 200 distribution elements and 25 ml phase volume each, circulation method.
The pure hexadecapeptide is isolated from the tubes 540-594 (rmax = 550; K = 4.2) by concentration until gel formation and lyophilization. To remove the bound acetic acid, it is dissolved in trifluoroethanol, 5 times the volume of water is added, the pH is adjusted to 7.0, left to stand overnight, filtered off, washed and dried. An amorphous, sparingly soluble powder with a decomposition point of approx. 230 is obtained.
On silica gel: Rf43C = 0.3; Rfs2A = 0.3; Rf70 = 0.5; Rfiio = 0.45.
E. The fragment III is condensed as follows with the fragment W described in Swiss patent specification No. 577 464 to form fragment VI (consisting of protected A-chain 14-21 and protected B-chain 1-30):
EMI7.1
Glu (OButpArg-Gly-Phe-Phe-Tyr (ButF Pro-Lys (Boc> Thr (ButpOBut 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30
2.12 g of the product (III) described under 15d and
EMI7.2
Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr (B uttThr (B uttPrLys (Boc) -Thr (ButtOB ut
22 23 24 25 26 27 28 29 30 as hydrochloride and 0.94 g of N-hydroxybenzotriazole (hydrate) are dissolved in 92 ml of DMF at 450, mixed with 0.63 g of dicyclohexylcarbodiimide and stirred for 4 1/2 hours at 450.
The solution is then added dropwise to 850 ml of ether, the fine flaky precipitate is filtered off and washed with ether.
The crude product is a countercurrent distribution in the methanol-0.1-m system. Ammonium acetate (pH 7.0) -chloroform-carbon tetrachloride (10: 3: 5: 4). After 1200 distribution steps, the product is in tubes 15-42; K = 0.03.
The substance shows the following Rf values in a thin-layer chromatogram on silica gel: Rf1o2A = 0.50; Rfs2A = 0.55; Rflao = 0.45.
EMI7.3
Glu (OButArg-Gly-Phe-Phe-Tyr (ButFThr (B utY Pro-Lys (B octThr (B uttOB ut 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 (VII)
The Bpoc group is split off from the product (VI) described under le according to the process of Swiss patent specification No. 577 464, giving the above product (VII):
1.1 g of the product VI described under le are dissolved in 150 ml of 90% trifluoroethanol with 0.12-n. Adjusted hydrogen chloride in 90% of the trifluoroethanol to pH 0.5 and kept it at this value by means of a pH stat. After 1/2 hour, 1 ml of pyridine is added and the solution is evaporated to dryness.
The residue is triturated twice with ether, filtered and dried.
The product (hydrochloride of VII) has the following Rf values in a thin-layer chromatogram on silica gel: Rfs2A = 0.25; Rfloo = 0.30; Rf43c = 0.40; Rfto2A = 0.35.
F. The fragment VII is condensed with the fragment V described under C to form the protected sequences A and B of human insulin (VIII) linked by a disulfide bridge:
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 Boc-Glv-Ile-Val-Glu (OBut) -Gln-Cys-Cys (Acm) - Thr (ButtSer (ButtIle-Cys-Ser (B. utt-Leu-Tyr (B; ttGin-Leu-Glu (OBut:
:
18 19 20 21 wAsn-Tyr (But> Cys-Asn-OBut
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 Boc-Phe-Val-Asn-Gln-HisLeu-Cys (AcmtGly Ser (ButtHis-Leu-Val-Glu (O ButtAla-Leu- Tyr (B uttLeu-Val-Cys-Gly 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 Glu (OB uttArg-Gly-Phe-Phe-Tyr (ButtThr (But> -Pro- BoctThr (ButtOBut
950 mg Boc-Gly-Ile-Val-Glu (OBut) -Gln-Cys-Cys (Acm) Thr (But) -Ser (But) -Ile-Cys-Ser (But) -Leu-OH (V) and 360 mg of the product described under 2e are dissolved in 15 ml of DMF, 70 mg of N-ethylmorpholine, 136 mg of N-hydroxybenzotriazole and 150 mg of dicyclohexylcarbodiimide are added. The solution is kept at 450 for 5 hours, then cooled and 100 ml of ether are added. The precipitate is filtered off, washed with ether and dried.
For purification, the crude product is distributed in countercurrent in the methanol-0.1-m system. Ammonium acetate (pH 4.75) -chloroform-carbon tetrachloride (20: 6: 11: 9). After 1425 distribution steps, the substance is in tubes 42-66. K = 0.05.
The product has the following Rf values in a thin layer chromatogram on silica gel: Rf45 = 0.35; Rfs2 = 0.40; Rflls = 0.60.
G. Human insulin (h-insulin)
Variant a) From the product described under F, the protective groups of the tert. Butyl type with trifluoroacetic acid and the mercapto protecting groups are split off with iodine, the second disulfide bridge being formed between chains A and B at the same time: 55 mg of the product described under F are treated with 95% trifluoroacetic acid at room temperature for 30 minutes. The solution is diluted with 60 ml of 50% acetic acid and immediately made up to 15 ml of 0.1-m. Iodine solution dripped in glacial acetic acid. After 10 minutes, 1.8 ml of 1-m. aqueous ascorbic acid solution decolorized and this solution is desalted on a 450 ml column of Sephadex G 25 in 50% acetic acid. The eluate, which absorbs in the UV at 280 mm, is concentrated in vacuo and freeze-dried. From this crude product, the h-insulin is tert by division in the system.
Butanol-1-m. Ammonium acetate (pH 7.1) -chloroform (10: 10: 0.5) obtained; K = 0.35. The product crystallizes from a 0.095-m. Na citrate buffer pH 6.0, containing 0.03-m. NaCl, 0.012-m. Zn Ck and 16 vol% acetone, in the typical rhombohedral crystals.
In the thin-layer chromatogram on cellulose, Rflol = 0.55; Rflt2A = 0.45. Electrophoresis on cellulose acetate: pH 1.9: distance 9 cm against the anode; pH 8.6: distance 7 cm against the cathode (buffer according to Brandenburg et al, Hoppe-Seyler's Z. Physiol. Chem. 353,599 [1972]).
Variant b) From the product described under F, the mercapto protective groups are first split off by means of iodine with simultaneous formation of the second disulfide bridge, then the protective groups are removed from the tert. Butyl type removed with trifluoroacetic acid.
55 mg of the product described under F in 20 ml of 87.5% acetic acid become 15 ml of 0.1 m. Iodine solution in glacial acetic acid, diluted with 40 ml of 50% acetic acid, added dropwise and stirred for 10 minutes at room temperature. The excess iodine is with 1.8 ml 1-m. aqueous ascorbic acid solution decolorized and the reaction mixture is desalted on a 450 ml column of Sephadex G 25 in 50% acetic acid. The eluate, which absorbs UV at 280 nm, is concentrated in vacuo and freeze-dried. The residue is treated with 95% trifluoroacetic acid for 30 minutes and precipitated with ether.
The h-insulin is obtained from this crude product as described in variant a).