<Desc/Clms Page number 1>
Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung neuer hypocalcämisch wirksamer Peptide der Formel
EMI1.1
worin R für Wasserstoff oder eine gegebenenfalls acylierte Aminogruppe steht, oder entsprechender Verbindungen, in welchen einer oder mehrere der Asparagin- oder Glutaminreste durch den Asparaginsäure- bzw. Glutaminsäurerest und/oder der Asparaginsäurerest durch den Asparaginrest ersetzt sind, ihrer Dimeren sowie Säure-
EMI1.2
sulfidbindung verbunden sind.
Acylgruppen für die Acylierung der Na-Aminogruppe sind die Reste von Carbonsäuren wie aliphatischen, aromatischen, araliphatischen, heterocyclischen und heterocyclyl-aliphatischen Carbonsäuren, insbesondere von niederen ein-oder zweiwertigen Alkan- oder Alkensäuren wie Ameisensäure, Essigsäure, Propionsäure, Buttersäuren, Acrylsäure, Bernsteinsäure, von alicyclischen Carbonsäuren wie Cycloalkylcarbonsäuren, von ein-
EMI1.3
ren wie Phenylessigsäure, von unsubstituierten oder substituierten ein-oder zweiwertigen 5-bis 6gliedrigen he- terocyclischen Säuren mit Stickstoff, Schwefel und/oder Sauerstoff als Heteroatomen, wie Pyridincarbonsäuren, Thiophencarbonsäuren, oder von Heterocyclyl-niederalkansäuren wie Pyridylessigsäure, Imidazolylessig- säure, worin die Substituenten der Ringe z. B.
Halogenatome, Nitrogruppen, Niederalkyl- oder Niederalkoxy- gruppen oder Niedercarbalkoxygruppen sind. Weiter sind als Acylreste vor allem Acylreste von Aminosäuren, besonders a-Aminosäuren, wie z. B. der Pyroglutamylrest, zu nennen, ferner Acylreste, die sich von Kohlensäure oder Thiokohlensäure bzw. ihren Estern oder Amiden ableiten, z. B. Niederalkyloxycarbonylgruppen wie Äthoxycarbonyl, tert-Butyloxycarbonyl, ferner unsubstituiertes und wie oben angegeben substituiertes Benzyloxycarbonyl, Carbamoyl und Thiocarbamoyl sowie N-substituiertes Carbamoyl und Thiocarbamoyl, z. B. N-Niederalkylcarbamoyl, N-Phenylcarbamoyl, N-Phenyl-thiocarbamoyl.
Als Säureadditionssalze sind besonders Salze von therapeutisch anwendbaren Säuren wie Salzsäure, Essigsäure, Schwefelsäure, Phosphorsäure und Sulfonsäuren, wie Niederalkansulfonsäuren, Benzol- oder Toluolsulfonsäure zu nennen.
Unter Komplexen sind die in ihrer Struktur noch nicht abgeklärten Verbindungen zu verstehen, die beim Zusatz gewisser anorganischer oder organischer Stoffe zu langkettigen Peptiden entstehen und diesen eine verlängerte Wirkung verleihen. Solche Stoffe sind beispielsweise beschrieben für Insulin und für ACTH und andere adrenocorticotrop wirksame Peptide. Zu nennen sind z. B. anorganische Verbindungen, die sich von Metallen wie Calcium, Magnesium, Aluminium, Cobalt und insbesondere von Zink ableiten, vor allem schwerlösliche Salze wie Phosphate, Pyrophosphate und Polyphosphate sowie Hydroxyde dieser Metalle, gegebenenfalls in Kombination mit sauren organischen Stoffen, z.
B. saure Gruppen enthaltenden polysacchariden wie Carboxymethylcellulose, oder Gerbsäure, Polyglutaminsäure oder teilweise hydrolysierte Gelatine, ferner Alkalimetallpolyphosphate wie z. B."Calgon N","Calgon 322","Calgon 188"oder"Polyron B 12". Organische Stoffe, die eine Verlängerung der Wirkung hervorrufen, sind beispielsweise nicht antigene Gelatine, z. B. Polyoxygelatine, Polyvinylpyrrolidon und Carboxymethylcellulose, ferner Sulfonsäure- oder Phosphorsäureester von Alginsäure, Dextran, Polyphenolen und Polyalkoholen, vor allem Polyphoretinphosphat und Phytinsäure, sowie Polymerisate und Copolymerisate von Aminosäuren, z. B. Protamin oder Polyglutaminsäure.
Die neuen Verbindungen weisen eine hypocalcämische Wirkung auf. So zeigt das C-terminale Amid der Formel I an der Ratte eine Aktivität von zirka 100 bis 200 MRC-Einheiten pro mg (Peptid) in dem von Kumar et al., J. Endocrinology 33 [1965], S. 470, beschriebenen Test. Die neuen Verbindungen senken den PlasmaCalcium- und -Phosphatgehalt des Blutes von Säugetieren, wie durch Versuche an 50 bis 150 g schweren Ratten nachgewiesen wurde. Bei Patienten mit erhöhtem Knochenmetabolismus senken sie den Ca1ciumspiegel des Blutes bei intravenöser, intramuskulärer oder subcutaner Gabe von 0,01 bis 5 mg, z. B in 0, 1m-Acetatpuffer vom PH 4,6. Sie können daher zur Behandlung von Hyperca1cämien und von Knochenkrankheiten wie Pagett s disease oder Osteoporose verwendet werden.
Die Verbindung der Formel I mit freier C-terminaler Carboxylgruppe ist selbst nur sehr wenig aktiv, kann aber als Zwischen- oder Ausgangsprodukt zur Herstellung aktiver Verbindungen verwendet werden. So kann man sie z. B. in das entsprechende Asps5, ProS2 -Diamid, welches gleich wirksam wie Calcitonin M ist, umwandeln, z. B. indem man das Produkt der Formel I mittels tert. Butyloxycarbonylazid in das Na, N-di-BOC-geschützte
<Desc/Clms Page number 2>
Produkt überführt, dann mit Ammoniak in Gegenwart von Dicyclohexylcarbodiimid und Hydroxysuccinimid das Diamid bildet und schliesslich die BOC-Gruppen mit Säure. z. B. Salzsäure oder Trifluoressigsäure, abspaltet.
Das erfindungsgemässe Verfahren zur Herstellung der Peptide der Formel I
EMI2.1
worin R für Wasserstoff oder eine gegebenenfalls acylierte Aminogruppe steht, oder entsprechender Verbindungen, in welchen einer oder mehrere der Asparagin- oder Glutaminreste durch Asparaginsäure-bzw. Glutaminsäurereste und/oder der Asparaginsäurerest durch den Asparaginrest ersetzt sind, ihrer Dimeren sowie Säureadditionssalze und Komplexe dieser Verbindungen, ist dadurch gekennzeichnet, dass man aus entsprechenden Verbindungen der Formel I oder den genannten Analogen oder Dimeren dieser Verbindungen, in welchen Verbindungen mindestens eine Aminogruppe oder eine Carboxylgruppe durch eine Schutzgruppe geschützt ist, die Schutzgruppe (n) abspaltet und, wenn erwünscht, erhaltene Verbindungen mit freier Na-Aminogruppe in ihre N-Acylderivate überführt, und, wenn erwünscht,
die erhaltenen Verbindungen in Säureadditionssalze oder Komplexe überführt.
Bei der Herstellung der Ausgangsstoffe wie auch aller Zwischenprodukte kommen als Schutzgruppen besonders die von der Synthese langkettiger Peptide her bekannten sowie einige neue Schutzgruppen in Betracht, die leicht abgespalten werden können, z. B. durch Hydrolyse, Reduktion, Aminolyse oder Hydrazinolyse.
So verwendet man z. B. als Schutzgruppen für Aminogruppen Acyl- oder Aralkylgruppen wie Formyl-, Tri-
EMI2.2
B. Sulfite,Thiosulfate, vgl. brit. Patentschrift Nr. 1, 104, 27 1, abgespalten werden), gegebenenfalls substituierte, wie z. B. durch Niederalkoxygruppen, besonders 0- oder p-Methoxygruppen, substituierte Benzyl- oder Diphenyl- oder Triphenylmethylgruppen oder von der Kohlensäure sich ableitende Gruppen, wie gegebenenfalls in den aromatischen Ringen, z. B. durch Halogenatome, wie Chlor oder Brom, Nitrogruppen, Niederalkyl- oder Niederalkoxygruppen oder farbgebende Gruppen, z. B.
Azogruppen substituierte Arylmethyloxycarbonylgruppen, in denen die Methylengruppe durch einen weiteren Arylrest und/oder einen oder gegebenenfalls zwei niedere Al-
EMI2.3
und insbesondere 2- (p-Biphenylyl) -isopropyloxycarbonyl (vg !. franz. Patentschrift Nr. 1. 554. 051), sowie aliphatische Oxycarbonylgruppen wie Adamantyloxycarbonyl, Cyclopentyloxycarbonyl, Trichloräthyloxycarbonyl, tert. Amyloxycarbonyl oder vor allem tert. Butyloxycarbonyl.
Die Aminogruppen können auch durch Bildung von Enaminen, erhalten durch Reaktion der Aminogruppe mit 1, 3-Diketonen, z. B. Benzoylaceton, Acetylaceton oder Dimedon, geschützt werden.
Carboxylgruppen werden beispielsweise durch Amid- oder Hydrazidbildung oder durch Veresterung geschützt. Die Amid- und Hydrazidgruppen können gegebenenfalls substituiert sein, die Amidgruppe z. B. durch die 3, 4-Dimethoxybenzyl- oder bis- (p-Methoxyphenyl)-methylgruppe, die Hydrazidgruppe z. B. durch die Carbobenzoxygruppe, die Trichloräthyloxycarbonylgruppe, die Trifluoracetylgruppe, die Tritylgruppe, die tert. Butyloxycarbonylgruppe oder die 2- (p-Biphenylyl) -isopropyloxycarbonylgruppe. Zur Veresterung geeignet sind z. B. niedere, gegebenenfalls substituierte Alkanole wie Methanol, Äthanol, Cyanmethylalkohol, Benzoylmethylalkohol oder insbesondere tert. Butanol, ferner Aralkanole wie Arylniederalkanole, z.
B. gegebenen-
EMI2.4
falls durch elektronenanziehende Substituenten substituierte Phenole und Thiophenol wie Thiophenol, Thiokresol, p-Nitrothiophenol, 2,4, 5- und 2, 4,6-Trichlorphenol, Pentachlorphenol, p-Nitrophenol, 2,4-Dinitrophenol, p-Cyanophenol, oder p-Methansulfonylphenol, weiter z. B. N-Hydroxysuccinimid, N-Hydroxyphthalimid, N-Hydroxypiperidin, 8-Hydroxychinolin.
Die Hydroxygruppen der Serin-, Threonin- und Tyrosinreste können z. B. durch Veresterung oder Veräthe -
EMI2.5
reste. Ferner eignen sich zum Schutz der Hydroxylgruppen die in Ber. 100 [1967], S. 3838 bis 3849, beschriebenen 2, 2, 2-Trifluor-l-tert. butyloxycarbonylamino- oder-l-benzyloxycarbonylaminoäthylgruppen (Weygand).
Die Hydroxylgruppen brauchen aber nicht notwendig geschützt zu werden.
<Desc/Clms Page number 3>
Die Mercaptogruppen der Cysteinreste werden z. B. durch Acylierung oder Alkylierung geschützt. Zur Acy- lierung geeignet ist z. B. der Acetyl- oder Benzoylrest, ein Niederalkylcarbamoylrest, beispielsweise der Äthylcarbamoylrest, oder der gegebenenfalls substituierte Carbobenzoxyrest. Zur Alkylierung geeignet sind z. B. der tert. Butyl- oder Benzylthiomethylrest oder gegebenenfalls substituierte Arylmethylgruppen wie Ben- zyl, p-Nitrobenzyl, Diphenylmethyl, Dimethoxybenzhydryl oder Trityl, ferner Phenylcyclohexyl, Thienyl- - (2) -cyc1ohexyl u. a., vgl. Ber. 101 [1968], S. 681. Die Iminogruppe des Histidins braucht nicht unbedingt geschützt zu werden, jedoch kann es vorteilhaft sein, sie zu schützen, z.
B. durch Benzyl, Trityl, Carbobenz- oxy, Adamantyloxycarbonyl oder die oben genannten Weygandl schen Gruppen.
Vorzugsweise verwendet man zum Schutz der Carboxylgruppe der Seitenkette und gegebenenfalls der ter- minalen Carboxylgruppe die tert. Butylestergruppe, zum Schutz der Aminogruppe der Seitenkette die tert. Bu- tyloxycarbonylgruppe, für die Hydroxylgruppen der Serin-, Threonin-und Tyrosinreste, sofern diese überhaupt geschützt werden, die tert. Butyläthergruppe und, wenn erwünscht, zum Schutz der Iminogruppe des Histidins die 2, 2, 2-Trifluor-l-tert. butyloxycarbonylaminoäthylgruppe. Alle diese Schutzgruppen können, wenn er- wünscht, in einer Stufe durch saure Hydrolyse, z. B. mittels Trifluoressigsäure oder Salzsäure, abgespalten wer- den.
Beim Aufbau der als Ausgangsmaterial verwendeten geschützten Dotriacontapeptide unter Verwendung von mit Trifluoressigsäure oder Salzsäure abspaltbaren Schutzgruppen werden die Mercaptogruppen vorzugsweise durch Benzyl oder Trityl geschützt. Die S-Tritylgruppen können aus dem geschützten Peptid in organischer Lö- sung selektiv (unter Beibehaltung der mit Trifluoressigsäure abspaltbaren Gruppen) mit Mercuriacetat und
Schwefelwasserstoff abgespalten werden. Die S-Benzylgruppen können aus dem geschützten Peptid selektiv mit
Natrium in flüssigem Ammoniak abgespalten werden. In beiden Fällen erhält man das geschützte Peptid mit freien Mercaptogruppen. Dieses kann zum geschützten Disulfid, z. B. mit Jod in Eisessig, mit Dijodäthan oder
Dirhodan in organischen Lösungsmitteln oder mit Luftsauerstoff in flüssigem Ammoniak oxydiert werden.
Be- sonders vorteilhaft ist es, die Mercaptogruppen durch Tritylgruppen zu schützen und diese aus dem geschützten
Peptid unter gleichzeitiger Bildung der Disulfidbrücke mit Jod in Methanol zu entfernen, vgl. Kamber und Rit- tel, Heiv. Chim. Acta 51 [19681, S. 20 61. Die Bildung des Disulfidringes kann auf der Stufe einer die beiden
Cysteinreste enthaltenden Teilsequenz, z. B. des Decapeptids 1-10, oder auf der Stufe des Dotriacontapeptids ausgeführt werden.
Bei der Herstellung der N-Acylderivate kann die Acylgruppe als Aminoschutzgruppe verwendet werden.
Die erhaltenen monomeren Peptide können in an sich bekannter Weise nachträglich in ihre Dimeren und umgekehrt und/oder die mono- oder dimeren Peptide in ihre Derivate, Säureadditionssalze und/oder Komplexe übergeführt werden. Die nachträglichen Umwandlungen können in zweckmässiger Reihenfolge, einzeln oder in
Kombination, durchgeführt werden.
Die Überführung erhaltener monomerer in dimere Verbindungen erfolgt z. B. durch Behandlung mit Mercaptoverbindungen in neutralem oder schwach saurem Medium, beispielsweise durch Behandlung mit Cysteinhydrochlorid. Die dimeren Verbindungen können unter basischen Bedingungen, z. B. mit verdünntem Ammoniak, in die monomeren Verbindungen umgewandelt werden.
Zur Herstellung von Acylderivaten kann man das freie Peptid in üblicher Weise N-acylieren, z. B. durch Umsetzung mit einem den betreffenden Acylrest enthaltenden gemischten Anhydrid oder Säureazid oder vor allem einem aktivierten Ester wie Phenyl- oder substituierten Phenylester. Die Acylierung kann, wenn erwünscht, selektiv durchgeführt werden, so dass nur die a-Aminogruppe acyliert wird.
Die Bildung von Säureadditionssalzen wird in bekannter Weise vorgenommen.
Auch die Bildung von Komplexen erfolgt nach bekannten oder diesen äquivalenten Methoden.
Komplexe mit anorganischen Stoffen wie schwerlöslichen Metall-, z. B. Aluminium- oder Zinkverbindungen, werden vorzugsweise in analoger Weise wie für ACTH bekannt, z. B. durch Umsetzung mit einem löslichen Salz des betreffenden Metalls, z. B. Zinkchlorid oder Zinksulfat, und Ausfällung mit einem Alkalimetallphosphat und/oder-hydroxyd hergestellt. Komplexe mit organischen Verbindungen wie Polyoxygelatine, Carboxymethylcellulose, Polyvinylpyrrolidon, Polyphloretinphosphat, Polyglutaminsäure usw. werden durch Mischen dieser Substanzen mit dem Peptid in wässeriger Lösung erhalten. In gleicher Weise können auch unlösliche Verbindungen mit Alkalimetallpolyphosphaten hergestellt werden.
Die alsAusgangsstoffe verwendeten Peptide werden erhalten, indem man die Aminosäuren, wenn erforderlich oder erwünscht, unter Verwendung leicht abspaltbarer Schutzgruppen, in der erwähnten Reihenfolge einzeln oder nach vorheriger Bildung kleinerer Peptideinheiten verknüpft, wobei gegebenenfalls auf einer geeigneten Stufe der Synthese die Disulfidbrücke gebildet wird. Man arbeitet zweckmässig nach den für die Herstellung langkettiger Peptide, unter Berücksichtigung der Disulfid-Brücke, geeigneten Verknüpfungsmethoden, wie sie aus der Literatur bekannt sind.
Die Verknüpfung der Aminosäure- und/oder Peptideinheiten erfolgt daher z. B. in der Weise, dass man eine Aminosäure oder ein Peptid mit geschützter et-Aminogruppe und aktivierter terminaler Carboxylgruppe mit einer Aminosäure oder einem Peptid mit freier cl-iminogruppe und freier oder geschützter, z. B. veresterter oder amidierter terminaler Carboxylgruppe umsetzt oder dass man eine Aminosäure oder ein Peptid mit aktivierter a-Aminogruppe und geschützter terminaler Carboxylgruppe mit einer Aminosäure oder einem Peptid
<Desc/Clms Page number 4>
mit freier terminaler Carboxylgruppe und geschützter a-Aminogruppe umsetzt.
Die Carboxylgruppe kann beispielsweise durch Überführung in ein Säureazid, -anhydrid, -imidazolid oder einen aktivierten Ester, wie Cyanmethylester, Thiophenylester, p-Nitrothiophenylester, Thiokresylester, p-Methansulfonylphenylester, p-Nitro-
EMI4.1
Reaktion mittels eines Carbodiimids (gegebenenfalls unter Zusatz von N-Hydroxysuccinimid) oder N, Nt-Carbo- nyldiimidazols, oder Isoxazoliumsalzes, z. B. Woodward Reagens, die Aminogruppe beispielsweise durch Re- aktion mit einem Phosphit aktiviert werden.
Als gebräuchlichste Methoden sind zu nennen die Carbodiimidmethode, die Methode nach Weygand-Wünsch (Carbodiimid in Gegenwart von N-Hydroxysuccinimid), die Azidmethode, die Methode der aktivierten Ester und die Anhydridmethode, ferner die Merrifield-Methode und die Methode der N-Carboxyanhydride oder N-Thiocarboxyanhydride. Es wurde gefunden, dass es vorteilhaft ist, von einer Sequenz auszugehen, welche die ersten 10 N-terminalen Aminosäuren umfasst, und mit diesem N-Terminus die gesamte restliche Sequenz zu kondensieren.
Das N-terminale Decapeptid kann z. B. aus den Sequenzen 1-4 und 5-10 oder 1-5 und 6-10 oder 1-6 und 7-10 oder 1-7 und 8-10 aufgebaut werden, wie aus den Fig. 1 bis 8 ersichtlich.
In den folgenden Figuren und in den Beispielen bedeutet :
1) die Azidmethode
2) die Methode der gemischten Anhydride
3) die Methode der aktivierten Ester, besonders p-Nitrophenylester (ONP) oder Hydroxysuccinimidester (OSU)
4) die Carbodiimidmethode
5) die Methode nach Weygand-Wünsch
BOC tert. Butyloxycarbonyl
EMI4.2
Z Carbobenzoxy
TRI Trityl
Bzl Benzyl
OtBu tert. Butylester
OBzl Benzylester
ONB p-Nitrobenzylester
ONP p-Nitrophenylester
OMe Methylester
OEt Äthylester
OCP 2,4, 5-Trichlorphenylester tBu tert.
Butyläther
Ac Acetyl
Bmp ss-Mercaptopropionyl TFA Trifluoressigsäure
Die p-Nitrobenzylester- und Benzylestergruppen werden in Methionin-haltigen Sequenzen mit Natrium in flüssigem Ammoniak, sonst durch Hydrogenolyse in Gegenwart von Palladiumkohle abgespalten, die Carbobenzoxygruppe ebenfalls durch Hydrogenolyse, die N-Tritylgruppe mit wässeriger Essigsäure, die tert. Butyloxycarbonylgruppe mit Trifluoressigsäure, die Diphenylisopropyloxycarbonylgruppe mit wässeriger Essigsäure oder z. B. mit einem Gemisch von Eisessig, Ameisensäure (82, 8going) und Wasser (7 : 1 : 2) wie in der franz. Patentschrift Nr. 1. 554. 051 beschrieben. Der p-Nitrobenzyl-oder Methylester kann mit Hydrazinhydrat in das Hydrazid übergeführt werden. Mit verdünnter Natronlauge wird die Methylestergruppe hydrolysiert. Der tert.
Butylester wird mit Trifluoressigsäure gespalten, ebenso der tert. Butyläther. Die S-Tritylgruppen werden mit Mercuriacetat und Schwefelwasserstoff entfernt, die S-Benzylgruppe mit Natrium in flüssigem Ammoniak, wobei gegebenenfalls vorhandene Benzyl- oder p-Nitrobenzylestergruppen gleichzeitig abgespalten werden. Der Ringschluss zum Disulfid erfolgt z. B. durch Oxydation mit l, 2-Dijodäthan, derjenige der S-Trityl-geschützten Verbindungen mit Jod in Methanol.
Die mit der N-terminalen Sequenz zu verbindende C-terminale Sequenz, umfassend die 11. bis 32., wird beispielsweise aus den Sequenzen 11-16, 17-20, 21-28 und 29-32 zusammengesetzt, wie die Fig. 9 bis 15 zeigen.
Je nach der Arbeitsweise erhält man die neuen Verbindungen in Form von Basen oder ihren Salzen. Aus den Salzen können in an sich bekannter Weise die Basen gewonnen werden. Von letzteren wieder lassen sich durch Umsetzung mit Säuren, die zur Bildung therapeutisch verwendbarer Salze geeignet sind, Salze gewinnen, wie z. B. solche mit anorganischen Säuren, wie Halogenwasserstoffsäuren, beispielsweise Salzsäure oder Bromwasserstoffsäure, Perchlorsäure, Salpetersäure oder Thiocyansäure, Schwefel- oder Phosphorsäuren, oder organischen Säuren, wie Ameisensäure, Essigsäure, Propionsäure, Glykolsäure, Milchsäure, Brenztraubensäure.
Oxalsäure, Malonsäure, Bernsteinsäure, Maleinsäure, Fumarsäure, Äpfelsäure. Weinsäure, Zitronensäure, As-
<Desc/Clms Page number 5>
corbinsäure, Hydroxymaleinsäure, Dihydroxymaleinsäure, Benzoesäure, Phenylessigsäure, 4-Aminobenzoesäure, 4-Hydroxybenzoesäure, Anthranilsäure, Zimtsäure, Mandelsäure, Salicylsäure, 4-Aminosalicylsäure,
EMI5.1
den. Diese enthalten die Peptide in Mischung mit einem für die enterale oder parenterale Applikation geeigneten pharmazeutischen, organischen oder anorganischen Trägermaterial.
Die Erfindung wird in den folgenden Beispielen beschrieben. Die Temperaturen sind in Celsiusgraden angegeben.
In der Dünnschichtchromatographie werden die folgenden Systeme verwendet :
EMI5.2
<tb>
<tb> System <SEP> 37 <SEP> n-Butanol-Pyridin-Wasser <SEP> (46 <SEP> : <SEP> 31 <SEP> : <SEP> 23)
<tb> System <SEP> 43A <SEP> tert. <SEP> Amylalkohol-Isopropanol-Wasser <SEP> (100 <SEP> : <SEP> 40 <SEP> : <SEP> 10)
<tb> System <SEP> 43C <SEP> tert.Amylalkohol-Isopropanol-Wasser <SEP> (51 <SEP> : <SEP> 21 <SEP> : <SEP> 28)
<tb> System <SEP> 43E <SEP> tert. <SEP> Amylalkohol-Isopropanol-Wasser <SEP> (32 <SEP> : <SEP> 32 <SEP> : <SEP> 36)
<tb> System <SEP> 45 <SEP> : <SEP> sec. <SEP> Butanol-3%iges <SEP> wässeriges <SEP> Ammoniak <SEP> (70 <SEP> : <SEP> 30)
<tb> System <SEP> 52 <SEP> n-Butanol-Eisessig-Wasser <SEP> (75 <SEP> : <SEP> 7, <SEP> 5 <SEP> : <SEP> 21) <SEP>
<tb> System <SEP> 52A <SEP> n-Butanol-Eisessig-Wasser <SEP> (67 <SEP> : <SEP> 10 <SEP> :
<SEP> 23) <SEP>
<tb> System <SEP> 53 <SEP> n-Butanol-Ameisensäure-Wasser <SEP> (60 <SEP> : <SEP> 0,75 <SEP> : <SEP> 39)
<tb> System <SEP> 70 <SEP> : <SEP> Äthylacetat-Pyridin-Wasser <SEP> (40 <SEP> : <SEP> 20 <SEP> : <SEP> 40)
<tb> System <SEP> 79 <SEP> : <SEP> n-Butanol-Pyridin-Wasser <SEP> (34 <SEP> : <SEP> 33 <SEP> : <SEP> 33) <SEP>
<tb> System <SEP> 87 <SEP> : <SEP> Isopropanol-Ameisensäure-Wasser <SEP> (77 <SEP> : <SEP> 4 <SEP> : <SEP> 19)
<tb> System <SEP> 89 <SEP> Essigester-Aceton-Wasser <SEP> (72 <SEP> : <SEP> 24 <SEP> : <SEP> 4)
<tb> System <SEP> 96 <SEP> sec. <SEP> Butanol-Eisessig-Wasser <SEP> (67 <SEP> : <SEP> 10 <SEP> : <SEP> 23) <SEP>
<tb> System <SEP> 100 <SEP> Äthylacetat-Pyridin-Eisessig-Wasser <SEP> (62 <SEP> : <SEP> 21 <SEP> : <SEP> 6 <SEP> : <SEP> 11)
<tb> System <SEP> 101 <SEP> : <SEP> n-Butanol-Pyridin-Eisessig-Wasser <SEP> (38 <SEP> : <SEP> 24 <SEP> :
<SEP> 8 <SEP> : <SEP> 30)
<tb> System <SEP> 101A <SEP> n-Butanol-Pyridin-Eisessig-Wasser <SEP> (42 <SEP> : <SEP> 24 <SEP> : <SEP> 4 <SEP> : <SEP> 30)
<tb> System <SEP> 10 <SEP> 2A <SEP> Äthylacetat-Methyläthylketon-Ameisensäure-Wasser <SEP> (50 <SEP> : <SEP> 30 <SEP> : <SEP> 10 <SEP> : <SEP> 10)
<tb> System <SEP> 102E <SEP> : <SEP> Essigester-Methyläthylketon-Eisessig-Wasser <SEP> (50 <SEP> : <SEP> 30 <SEP> : <SEP> 10 <SEP> : <SEP> 10) <SEP>
<tb> System <SEP> 104 <SEP> Chloroform-Methanol-17%iges <SEP> wässeriges <SEP> Ammoniak <SEP> (41 <SEP> : <SEP> 41 <SEP> : <SEP> 18)
<tb> System <SEP> 107 <SEP> : <SEP> Äthylacetat-Pyridin-Wasser <SEP> (49 <SEP> : <SEP> 24 <SEP> : <SEP> 27)
<tb> System <SEP> 110 <SEP> Äthylacetat-n-Butanol-Pyridin-Eisessig-Wasser <SEP> (42 <SEP> : <SEP> 21 <SEP> : <SEP> 21 <SEP> : <SEP> 6 <SEP> :
<SEP> 10) <SEP>
<tb> System <SEP> 115 <SEP> Äthylacetat-Pyridin-Ameisensäure-Wasser <SEP> (63 <SEP> : <SEP> 21 <SEP> : <SEP> 10 <SEP> : <SEP> 6)
<tb> System <SEP> 121A <SEP> Isopropanol-Ammoniak <SEP> (26%ig)-Wasser <SEP> (85 <SEP> : <SEP> 5 <SEP> : <SEP> 10)
<tb> System <SEP> 1 <SEP> Benzol-Äthanol <SEP> (80 <SEP> : <SEP> 20)
<tb> System <SEP> 2 <SEP> Benzol-Äthanol <SEP> (90 <SEP> : <SEP> 10)
<tb> System <SEP> 3 <SEP> Benzol-Äthanol <SEP> (95 <SEP> : <SEP> 5)
<tb> System <SEP> 4 <SEP> n-Amylalkohol-Ameisensäure-Wasser <SEP> (70 <SEP> : <SEP> 20 <SEP> : <SEP> 10)
<tb> System <SEP> 5 <SEP> : <SEP> n-Butanol-Essigsäure-Wasser <SEP> (66, <SEP> 6 <SEP> : <SEP> 16, <SEP> 7 <SEP> : <SEP> 16,7)
<tb> System <SEP> 6 <SEP> : <SEP> n-Butanol-Pyridin-Essigsäure-Wasser <SEP> (66, <SEP> 6 <SEP> : <SEP> 12, <SEP> 5 <SEP> : <SEP> 4, <SEP> 2 <SEP> :
<SEP> 16, <SEP> 7)
<tb> System <SEP> 7 <SEP> n-Amylalkohol-Pyridin-Wasser <SEP> (50 <SEP> : <SEP> 30 <SEP> : <SEP> 20)
<tb> System <SEP> 8 <SEP> Chloroform-Methanol-Eisessig <SEP> (87,4 <SEP> : <SEP> 9, <SEP> 7 <SEP> : <SEP> 2, <SEP> 9)
<tb> System <SEP> 9 <SEP> Benzol-Äthanol <SEP> (70 <SEP> : <SEP> 30).
<tb>
Die Dünnschichtchromatographie wird auf Silicagel oder Aluminiumoxyd ("Alox" D-O der Firma Camag mit 8% Gips) oder auf Cellulose ("Selecta 1440 der Fa. Schleicher und Schuell) durchgeführt.
<Desc/Clms Page number 6>
EMI6.1
Fig. 1
<Desc/Clms Page number 7>
EMI7.1
2 3 4Fig. 2
<Desc/Clms Page number 8>
EMI8.1
2 3 4 5 6 7 8 9Fig. 3
<Desc/Clms Page number 9>
EMI9.1
2 3 4 5Fig. 4
<Desc/Clms Page number 10>
EMI10.1
2 3 4 5 6 7 8 9Fig. 5
<Desc/Clms Page number 11>
EMI11.1
2 3 4 5 6 7 8 9Fig. 6
<Desc/Clms Page number 12>
EMI12.1
BOC-OFig. 7
<Desc/Clms Page number 13>
EMI13.1
4 5 6 7 8 9Fig. 8
<Desc/Clms Page number 14>
EMI14.1
tBuFig. 9
<Desc/Clms Page number 15>
EMI15.1
Fig. 10
<Desc/Clms Page number 16>
A
EMI16.1
E F G
EMI16.2
Fig.
ll
<Desc/Clms Page number 17>
EMI17.1
Z-OH Z--ONP Z-L-OH Z-ONP Z-OH H--OMeFig. 12
<Desc/Clms Page number 18>
EMI18.1
ONP Z OH Z ONP H NH2Fig. 13
<Desc/Clms Page number 19>
EMI19.1
GlnFig. 14
<Desc/Clms Page number 20>
EMI20.1
Z-tFig. 15
<Desc/Clms Page number 21>
EMI21.1
EMI21.2
EMI21.3
lassen. Das Trifluoracetat des freigesetzten Dotriakontapeptidamids wird sodann durch Zufügen von 60 ml ab- solutem und peroxydfreiem Äther als amorphes Pulver ausgefällt, abzentrifugiert, in 10 ml frischem Äther sus- pendiert, nochmals zentrifugiert, und der Rückstand bei 300 getrocknet. Zur Umwandlung in das Acetat löst man das Trifluoracetat in 3 ml Wasser und filtriert durch eine mit 0, 02n-Essigsäure äquilibrierte Säule von schwach basischem Ionenaustauscher (z. B.
Merck Nr. H ; Durchmesser = 7, 5 mm ; Länge = 20 cm). Man wäscht
EMI21.4
200 ml). Das Eluat wird dünnschichtchromatographisch analysiert (Alox, System 52). Die Hauptfraktionen (Maximum bei zirka 100 bis 120 ml) werden vereinigt, im Rotationsverdampfer (Innentemperatur nicht über 20 ) zur Trockne eingeengt, in 5 ml Wasser wieder gelöst und lyophilisiert. Das so erhaltene Produkt wird zur end- gültigen Reinigung einer Craig-Verteilung über 500 Stufen im Lösungsmittelsystem n-Butanol-Eisessig-Wasser (4 : 1 : 5, Vol. ) mit Phasenvolumina von je 3 ml unterworfen.
Aus den Verteilungselementen Nr. l41 bis 180 (Maximum bei Nr 162 ; K = 0,48) isoliert man beim Einengen zur Trockne (Rotationsverdampfer, Innentemperatur höchstens ze Lösen in 0, in-Essigsäure und Lyophilisieren das chromatographisch und elektrophoretisch einheitliche Dotriakontapeptidamid als weisses, amorphes Pulver.
In der Dünnschichtchromatographie weist es folgende Rf-Werte auf :
EMI21.5
EMI21.6
<tb>
<tb> "Alox" <SEP> D-ORf <SEP> (52) <SEP> = <SEP> 0, <SEP> 56 <SEP>
<tb> Rf <SEP> (79) <SEP> = <SEP> 0, <SEP> 66 <SEP>
<tb> Rf <SEP> (45) <SEP> = <SEP> 0, <SEP> 45 <SEP>
<tb>
EMI21.7
EMI21.8
<tb>
<tb> "Selecta" <SEP> 1440Rf <SEP> (45) <SEP> = <SEP> 0, <SEP> 51 <SEP>
<tb> Rf <SEP> (101A) <SEP> = <SEP> 0, <SEP> 60 <SEP>
<tb>
EMI21.9
EMI21.10
<tb>
<tb> Cellulose <SEP> "Selecta" <SEP> 1440 <SEP> :PH <SEP> 1, <SEP> 9, <SEP> 1 <SEP> 1/2 <SEP> h, <SEP> 280 <SEP> V <SEP> : <SEP> Laufstrecke <SEP> = <SEP> 3, <SEP> 5 <SEP> cm <SEP> zur <SEP> Kathode,
<tb> PH <SEP> 7, <SEP> 1, <SEP> 1 <SEP> 1/2 <SEP> h, <SEP> 280 <SEP> V <SEP> :
<SEP> Laufstrecke <SEP> = <SEP> l, <SEP> 3 <SEP> cm <SEP> zur <SEP> Kathode.
<tb>
EMI21.11
EMI21.12
EMI21.13
0,4 ml Wasser wird lyophilisiert, der Rückstand in 0,2 ml 0, In-Essigsäure gelöst und zur Umwandlung in das Acetat durch eine Säule (Durchmesser = 6 mm ; Länge = 100 mm) von schwach basischem Ionenaustauscher (z. B. Merck Ni. 11), der mit 0, in-Essigsäure äquilibriert worden ist, filtriert. Das Eluat wird bis auf ein Volumen von 0,5 ml konzentriert, lyophilisiert, bei 400 im Hochvakuum nachgetrocknet und schliesslich durch Stehenlassen im offenen Gefäss mit der Luftfeuchtigkeit äquilibriert. Man erhält so das Acetat von Calcitonin M als wasserlösliches weisses Pulver.
Das als Ausgangsmaterial verwendete geschützte Dotriacontapeptidamid kann wie folgt hergestellt werden :
1. H-Gly-Asn-Leu-OMe.
2,0 g Z-Gly-Asn-Leu-OMe (vom F. 158 bis 1590 nach Umkristallisation aus Methanol-Wasser) werden un-
EMI21.14
ten wird. Er kann nötigenfalls aus Methanol-Essigester-Petroläther umkristallisiert werden. Rf (52) = 0, 22 (auf Silicagel -
<Desc/Clms Page number 22>
2. BOC-Cys (TRI)-Gly-Asn-Leu-OMe.
5,7 g H-Gly-Asn-Leu-OMe, 9,2 g BOC-Cys (TRI) -OH und 4, 16 g N-Hydroxysuccinimid werden in 200 ml Dimethylformamid gelöst, auf 0 gekühlt und unter Rühren mit 5,57 g Dicyclohexylcarbodiimid in fester Form versetzt. Man rührt noch während 1 h bei 00, lässt dann über Nacht bei zirka 200 stehen, engt im Hochvakuum auf ein Volumen von zirka 100 ml ein und filtriert den ausgeschiedenen Dicyclohexylharnstoff ab. Das Filtrat wird sodann in Hochvakuum bis zur Bildung einer klebrigen Masse weiter eingeengt, in 200 ml n-Butanol gelöst und nacheinander mit Wasser, 5% figer Weinsäurelösung, ln-Natriumbicarbonat, und wieder mit Wasser gewaschen. Die Lösung wird nun auf ein Volumen von zirka 50 ml konzentriert, und daraus das Tetrapeptid-derivat durch Zugabe von 300 ml Petroläther ausgefällt.
Man reinigt durch Umfällen aus Dimethylformamid-Wasser und aus Methanol-Essigester-Petroläther und erhält so das Tetrapeptidderivat als amorphes Pulver vom Schmelzpunkt 145 bis 1480. Es weist im Dünnschichtchromatogramm auf Silicagel die folgenden Rf-Werte auf : Rf (115) = 0, 68 ; Rf (Aceton) = 0, 59 ; Rf (Chloroform-Methanol 8 : 2) = 0, 60.
3. BOC-Cys (TR])-Gly-Asn-Leu-NHNH ;.
2,7 g BOC-Cys -Gly-Asn-Leu-OMe werden in 22 ml Methanol gelöst, auf 00 gekühlt und mit 2,2 ml Hydrazinhydrat versetzt. Nach zirka 30 min bei 00 lässt man die Lösung über Nacht bei zirka 200 stehen, kühlt wieder auf 00 ab und versetzt dann mit 102 ml 3% figer eiskalter Essigsäure. Die Fällung wird gut homogenisiert, abfiltriert und auf der Nutsche mit eiskalter, 3(7dger Essigsäure bis zur Folin-negativen Reaktion der Waschflüssigkeit gewaschen und anschliessend getrocknet. Man erhält 2, 2 g chromatographisch reines Tetrapeptid-hydrazid vom Zersetzungspunkt zirka 195 . Es weist im Dünnschichtchromatogramm auf Silicagel folgende Rf-Werte auf : Rf (Chloroform-Methanol 8 : 2) = 0,30 ; Rf (Aceton-Methanol 9 : 1) = 0,53.
4. BOC-Met-Leu-Gly-OMe.
6,72 g Z-Leu-Gly-OMe werden in 50 ml Methanol mit 500 mg Palladiumkohle (10% Pd) bis zur Beendigung der Wasserstoffaufnahme hydriert. Die Lösung wird vom Katalysator abfiltriert und im Vakuum auf zirka 10 ml eingeengt, mit 30 ml Dimethylformamid verdünnt und im Hochvakuum nochmals auf zirka 20 ml konzentriert. Dazu gibt man unter Eiskühlung 7, 7 g BOC-Met-OCP, lässt die klare Lösung während 6 h bei 200 stehen und verdampft das Lösungsmittel im Hochvakuum. Der ölige Rückstand wird in Essigester gelöst und nacheinander bei 00 mit 50/oiger Pottaschelösung, 0,2n-Salzsäure und schliesslich mit Wasser gewaschen, die organische Phase über Natriumsulfat getrocknet und zur Trockne eingeengt. Der ölige Rückstand wird aus Benzol-Petroläther kristallisiert ; F. 126 bis 1270 ; auf Silicagel ist Rf (43cl = 0, 66 ; Rf (Toluol-Aceton l : l) = 0, 58.
5. H-Met-Leu-Gly-OMe, Hydrochlorid.
3,24 g BOC-Met-Leu-Gly-OMe werden in 13 ml 3,8n-Chlorwasserstoff in Essigester gelöst und während 30 min bei 200 stehengelassen. Durch Zugabe von 100 ml Petroläther wird das Tripeptidester-hydrochlorid als klebrige Masse ausgefällt und die überstehende Lösung abdekantiert. Durch Zerreiben mit 100 ml peroxydfreiem Äther bei 00 wird ein feinpulveriges Produkt erhalten, das abfiltriert und über Kaliumhydroxyd bei Zimmertemperatur im Exsikkator bis zur Gewichtskonstanz getrocknet wird. Die Verbindung ist chromatographisch rein, jedoch amorph und stark hygroskopisch. Sie weist auf Silicagel die folgenden Rf-Werte auf : Rf (43C) = 0, 48 ; Rf (Toluol-Aceton l : l) = 0, 35.
6. H-Cys (TRI) -Met-Leu-Gly-OMe.
EMI22.1
mit Wasser gewaschen, getrocknet und dann während 5 min bei 400 mit 50 ml Essigester fein zerrieben. Der unlösliche Dicyclohexylharnstoff wird bei Zimmertemperatur abfiltriert und mit 20 ml Essigester gewaschen.
Aus dem Filtrat wird TRI-Cys (TRI) -Met-Leu-Gly-OMe durch Zugabe von 300 ml Petroläther als gallertiger Niederschlag ausgefällt, abfiltriert und getrocknet. Beim Umfällen dieses Rohproduktes aus Methanol-Essigester-Petroläther erhält man ein chromatographisch einheitliches Produkt vom F. zirka 2150. Auf Silicagel weist es folgende Rf-Werte auf :
EMI22.2
<tb>
<tb> im <SEP> System <SEP> : <SEP> CHq <SEP> -Methanol <SEP> (97 <SEP> : <SEP> 3) <SEP> Rf <SEP> = <SEP> 0, <SEP> 57 <SEP> ; <SEP>
<tb> in <SEP> n-Butylacetat <SEP> Rf <SEP> = <SEP> 0, <SEP> 51. <SEP>
<tb>
b) Zu einer Lösung von 1,862 g TRI-Cys (TR1) -Met-Leu-Gly-OMe in 16 ml Eisessig werden 4 ml Wasser so zugetropft, dass sich der gebildete Niederschlag jeweils wieder löst.
Die klare Lösung wird 1 h bei Raumtemperatur gerührt und dann bei 00 mit 12 ml Wasser versetzt, filtriert und der Niederschlag mit kalter 50% niger Essigsäure gewaschen. Das Filtrat wird am Hochvakuum bei 300 zu einem Öl eingedampft, dieses mit Wasser verrieben und lyophilisiert. Das erhaltene weisse Pulver wird 15 h über Kaliumhydroxyd am Hochvakuum getrocknet. Das Produkt erweist sich im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel als einheitlich.
EMI22.3
<Desc/Clms Page number 23>
und bei 00 dreimal mit 25 ml in-Zitronensäure und fünfmal mit 40 ml halbgesättigter Kochsalzlösung ausgeschüttelt. Nach dem Trocknen der Lösung über Natriumsulfat wird eingedampft und der erhaltene Schaum in
EMI23.1
gerührt und dann über Nacht bei Zimmertemperatur stehengelassen.
Die Lösung wird vom ausgeschiedenen Tri- äthylamin-hydrochlorid abfiltriert und bei 00 dreimal mit je 20 ml ln-Zitronensäure und fünfmal mitgesättigter Kochsalzlösung gewaschen, getrocknet und eingedampft. Rohprodukt (Öl) : 22, 07 g. Zur Reinigung wird 1 g an einer Silicagelsäule (2, 5 cm, 30 cm) chromatographiert. Mit Petroläther-Essigester (1 : 1) werden nach einem Vorlauf von 110 ml 787 mg reines Produkt eluiert.
Im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel in Toluol-Aceton (7 : 3) ist Rf = 0, 51.
7. a) DPC-Ser (tBu) Thr (tBu)-NH-NH .
EMI23.2
wird in 450 ml Essigester aufgenommen und viermal mit halbgesättigter Kochsalzlösung gewaschen. Nach dem Trocknen der Lösung über Natriumsulfat wird auf zirka 15 ml eingeengt und mit zirka 5 ml Petroläther versetzt.
Über Nacht kristallisieren 3,17 g des Hydrazins vom F. 132 bis 1340 aus.
Im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel in Toluol-Aceton (7 : 3) ist Rf = 0,40.
8. DPC-Ser (tBu) -Thr (tBu) -Cys (TRI) -Met-Leu-Gly-OMe.
EMI23.3
(tBu)-Thr (tBu)-NH-NH1, 4 ml Triäthylamin wird die auf-100 gekühlte Lösung von 1, 406 g H-Cys (TRI)-Met-Leu-Gly-OMe-Acetat in
10 ml Dimethylformamid zugetropft. Das PH der Reaktionslösung beträgt dann 5. Durch Zugabe von 2 Tropfen
Triäthylamin in Dimethylformamid (2,8 ml Triäthylamin mit Dimethylformamid auf 10 ml aufgefüllt wird das PH 7 bis 8 eingestellt. Nach 5,10 und 20 min wird mit je 2 Tropfen Triäthylaminlösung das PH wieder auf 7 bis 8 erhöht. Nachher bleibt dieser Wert konstant. Die Reaktionslösung wird 1 h bei-100 und 15 h bei 00 gehalten. Dann wird vom ausgeschiedenen Triäthylamin-hydrochlorid abfiltriert und das Filtrat bei 300 am Hochvakuum zu einem Öl eingedampft.
Durch Zerreiben mit Wasser erhält man ein Pulver, das mit Wasser gewaschen und dann mit Wasser zerrieben und lyophilisiert wird. Durch zweimaliges Zerreiben mit 10 ml BenzolPetroläther (1 : 2) wird das Hexapeptidderivat rein erhalten. Im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel in Toluol-Aceton (7 : 3) ist Rf = 0,42.
9. H-Ser (tBu)-Thr (tBu)-Cys (TRI)-Met-Leu-Gly-OMe.
2 g DPC-Ser (tBu)-Thr (tBu)-Cys (TRI)-Met-Leu-Gly-OMe werden bei 450 in 40 ml 80'igem Eisessig gelöst und anschliessend während 1 h bei 450 stehengelassen. Man engt sodann im Vakuum auf ein Volumen von zirka 10 ml ein und lyophilisiert. Der Rückstand wird zur vollständigen Entfernung von Essigsäure in 15 ml tert. Butanol und l, 5 ml Wasser gelöst und nochmals lyophilisiert. Man erhält einen pulverigen Rückstand, der in 5 ml Methanol und 20 ml Essigester gelöst und durch Zugabe von 150 ml Petroläther wieder gefällt wird. Nach kurzem Stehenlassen bei 00 wird abfiltriert, mit Petroläther gewaschen und getrocknet. Man erhält ein amorphes Pulver vom F. 1800, das nur noch Spuren von 2- (p-Biphenylyl) -propanol- (2) als einzige Verunreinigung enthält.
Das Hexapeptid wird in dieser Form zur Weiterverarbeitung verwendet. Es weist im Dünnschichtchromatogramm auf Silicagel die folgenden Rf-Werte auf :
EMI23.4
<tb>
<tb> in <SEP> Chloroform-Aceton <SEP> (1 <SEP> : <SEP> 1) <SEP> Rf <SEP> = <SEP> 0, <SEP> 48 <SEP> ; <SEP>
<tb> in <SEP> Chloroform-Methanol <SEP> (9 <SEP> : <SEP> 1) <SEP> Rf <SEP> = <SEP> 0, <SEP> 54 <SEP> ; <SEP>
<tb> in <SEP> Toluol-Aceton <SEP> (1 <SEP> : <SEP> 1) <SEP> Rf <SEP> = <SEP> 0, <SEP> 49. <SEP>
<tb>
10. H-Ser (tBu) -Thr (tBu) -Cys (TRl) -Met-Leu-Gly-OH.
1, 4 g Hexapeptid-methylester von 9. werden bei 450 in 16 ml 90'igemMethanol gelöst, auf 20 abgekühlt (wobei das Peptid teilweise wieder ausfällt und mit 4,32 ml in-Natronlauge versetzt. Man rührt die Suspension während 25 min bei 220 (nach zirka 15 min ist alles klar gelöst und fällt dann das Hexapeptid durch Zugabe von 4,32 ml ln-Salzsäure und 30 ml Wasser als feinflockigen Niederschlag aus. Man lässt noch während 15 min bei 00 stehen, filtriert und wäscht mit Wasser, bis das Filtrat frei von Chloridionen ist. Nach Trocknen über Kaliumhydroxyd und Phosphorpentoxyd erhält man 1, 3 g Rohprodukt, das zur Reinigung während 5 min bei 80 mit einer Mischung von 25 ml Dimethylformamid und 60 ml Benzol homogenisiert und durch Zugabe von 120 ml Petroläther gefällt wird.
Nach 10minütigem Stehenlassen bei 00 wird abfiltriert, mit Benzol und Petroläther gewaschen und getrocknet. Das so erhaltene, chromatographisch reine Hexapeptidderivat weist einen Zersetzungspunkt von zirka 2100 auf und ist in vielen Lösungsmitteln sehr schwer löslich. Bei der Dünnschichtchromatographie auf Silicagel ist
EMI23.5
<tb>
<tb> Rf <SEP> (45) <SEP> = <SEP> 0, <SEP> 39, <SEP>
<tb> Rf <SEP> (52) <SEP> = <SEP> 0, <SEP> 77, <SEP>
<tb> Rf <SEP> (100) <SEP> = <SEP> 0, <SEP> 47. <SEP>
<tb>
<Desc/Clms Page number 24>
EMI24.1
gekühlt und dazu langsam 0,92 ml 3,6n-Salzsaure in Dioxan zugetropft, dann 0, 179 ml tert. Butylnitrit.
Diese Mischung wird während 15 min bei-100 gerührt, auf -150 abgekühlt und in eine auf -150 gekühlte Lösung von 878 mg H-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Cys(TRI)-Met-Leu-Gly-OH und 0, 588 ml Triäthylamin in 12 ml absolutem Dimethylformamid hinein pipettiert. Man rührt während zirka 10 min bei-10 und während 3 h bei 00. Zur Auf- rechterhaltung einer schwach basischen Reaktion (PH zirka 8) gibt man anfänglich noch zweimal je 0, 0 65 rnl Triäthylamin zu. Die Mischung wird während 15h bei 00 stehengelassen und dann im Hochvakuum bis zur brei-
EMI24.2
20 ml Methanol. Man erhält beim Trocknen im Hochvakuum über Kaliumhydroxyd und Phosphorpentoxyd reines Decapeptidderivat von unscharfem Zersetzungspunkt bei zirka 220 bis 2300.
Es weist im Dünnschichtchro- matogramm auf Silicagel die folgenden Rf-Werte auf :
EMI24.3
<tb>
<tb> im <SEP> System <SEP> Chloroform-Methanol <SEP> (8 <SEP> : <SEP> 2) <SEP> Rf <SEP> = <SEP> 0, <SEP> 28 <SEP> ;
<tb> im <SEP> System <SEP> 70 <SEP> Rf <SEP> = <SEP> 0, <SEP> 55 <SEP> ; <SEP>
<tb> im <SEP> System <SEP> 104 <SEP> Rf <SEP> = <SEP> 0, <SEP> 75 <SEP> ; <SEP>
<tb> im <SEP> System <SEP> 121A <SEP> Rf <SEP> = <SEP> 0, <SEP> 59. <SEP>
<tb>
EMI24.4
EMI24.5
(tBu) -Thr (tBu) -Cys-Met-Leu-Gly-OH.gerührten Lösung von 2,5 g Jod in 500 ml Methanol getropft. Anschliessend rührt man noch eine weitere Stunde und entfärbt dann die auf 00 gekühlte Lösung mit In-Natriumthiosulfat fast vollständig.
Nach Einengen der Lösung im Vakuum, zuletzt im Hochvakuum bei 400, auf zirka 100 ml fällt man mit Äther vollständig aus, wobei das ausfallende Öl rasch erstarrt. Nach Abgiessen der Ätherlösung wird der Rückstand kurz im Vakuum getrocknet und dann mit Wasser zerrieben Das ausgefallene Dekapeptidderivat wird abgenutscht, mit Wasser gewaschen und getrocknet. Zur Reinigung wird in 25 ml Chloroform gelöst, wenig unlösliches Material abfiltriert, das Filtrat auf etwa die Hälfte eingeengt und mit Hexan ausgefällt. Man erhält das reine Dekapeptidderivat, das im Dünnschichtchromatogramm auf Silicagel Rf 100 = 0,48 zeigt.
13. H-Asp (OtBu)-Phe-OCH,.
30, 3 g Z-Asp (OtBti) -ONP und 18, 3 g H-Phe-OCH3, HCl, werden zusammen in 150 ml Dimethylformamid gelöst und zu der klaren Lösung 11,8 ml Triäthylamin zugetropft. Die entstandene Suspension wird 20 h bei Zimmertemperatur gerührt, wobei sie sich tiefgelb färbt. Anschliessend wird im Vakuum auf etwa 100 ml eingeengt und in 11 Essigester/Chloroform (4 : 1) dreimal mit 51oiger Zitronensäure, 19mal mit zirka 2n-Natriumcarbonat und mit gesättigter Kochsalzlösung bis zur neutralen Reaktion ausgeschüttelt. Das rohe Z-Asp (OtBu)-
EMI24.6
Im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel ist der Rf-Wert im System Chloroform-Methanol (95 : 5) = 0,74, in Chloroform-Aceton (75 : 25) = 0,65.
48,6 g Z-Asp (OtB -Phe-OCtL werden in 700 ml Methanol nach Zusatz von 33, 5 ml 3n-Chlorwasserstoff in Dioxan und 5 g 10'igem Palladiumkatalysator auf Kohle decarbobenzoxyliert.
Im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel in Chloroform-Methanol (9 : 1) ist Rf = 0, 60 ; in ChloroformAceton (1 : 1) ist Rf = 0, 58 ; Rf (102E) = 0, 42.
14. H-Gln-Asp (OtBu)-Phe-OCHj.
38,6 g des erhaltenen H-Asp(OtBu)-Phe-OCH3, HCl, werden mit 42, 0 g Z-Gln-ONP in 170 ml Dimethylformamid zu einer klaren, leicht gelben Lösung gelöst und unter Rühren mit 13,9 ml Triäthylamin langsam versetzt. Es entsteht eine orange Suspension, die 24 h bei 30 bis 35 Badtemperatur gerührt wird. Während dieser Zeit gibt man weitere 40 ml Dimethylformamid und ausserdem noch 1, 39 ml Triäthylamin zu.
Zur Aufarbeitung wird der Ansatz in 4 1 Chloroform gelöst und in einer 20stufigen Gegenstromverteilapparatur (Phasenvolumen : untere Phase 400 ml, obere Phase 200 ml pro Gefäss) nacheinander mit 1 1 neiger Zitronensäurelösung, 400 ml gesättigter Kochsalzlösung, 61 zirka 2n-Soda und 2,8 1 gesättigter Kochsalzlösung ge-
EMI24.7
Im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel werden folgende Rf-Werte erhalten :
EMI24.8
<tb>
<tb> in <SEP> Chloroform-Methanol <SEP> (9 <SEP> : <SEP> 1) <SEP> : <SEP> Rf <SEP> = <SEP> 0, <SEP> 39 <SEP> ; <SEP>
<tb> in <SEP> Chloroform-Aceton <SEP> (1 <SEP> : <SEP> 1) <SEP> : <SEP> Rf <SEP> = <SEP> 0, <SEP> 24 <SEP> ; <SEP>
<tb> Rf <SEP> (102E) <SEP> = <SEP> 0, <SEP> 69, <SEP> Rf <SEP> (89) <SEP> = <SEP> 0, <SEP> 46, <SEP> Rf <SEP> (43A) <SEP> = <SEP> 0, <SEP> 65 <SEP> ;
<SEP>
<tb>
EMI24.9
Das Produkt wird wie unter 13. hydriert. Im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel werden folgende RfWerte erhalten :
<Desc/Clms Page number 25>
EMI25.1
<tb>
<tb> in <SEP> Chloroform-Methanol <SEP> (9 <SEP> : <SEP> l) <SEP> : <SEP> Rf <SEP> = <SEP> 0, <SEP> 13 <SEP> ; <SEP>
<tb> in <SEP> Chloroform-Aceton <SEP> (25 <SEP> : <SEP> 75) <SEP> : <SEP> Rf <SEP> = <SEP> 0, <SEP> 14 <SEP> ; <SEP>
<tb> Rf <SEP> (102E) <SEP> = <SEP> 0,22.
<tb>
15. H-Thr(tBu)-Gln-Asp(OtBu)-Phe-OCH3.
Die gesamte Menge des Hydrochlorids von 14. wird zusammen mit 7, 4 g Z-Thr(tBu)-OSU in 14 ml Dimethylformamid bei Zimmertemperatur gelöst, und zu dieser Lösung werden unter Kühlung im Eisbad 1, 72 ml Triäthylamin getropft. Anschliessend wird die bräunliche Suspension 20 h bei Raumtemperatur gerührt. Nach üblicher Aufarbeitung in viel Essigester (je dreimaliges Waschen mit piger Zitronensäure und zirka 2n-Natriumcarbonat, Neutralwaschen mit gesättigter Kochsalzlösung, Trocknen über Natriumsulfat und Eindampfen im Vakuum bei 30 bis 40 ) wird das Z-Thr (tBu)-Gln-Asp (OtBu)-Phe-OCR in Äthanol mit Aktivkohle behandelt und aus 90 ml Äthanol im Kühlschrank kristallisiert. F. 155 bis 1610.
Im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel werden folgende Rf-Werte gefunden :
EMI25.2
Das Produkt wird in Methanol mit Palladiumkohle neutral hydriert. Im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel werden folgende Rf-Werte erhalten :
EMI25.3
<tb>
<tb> in <SEP> Chloroform-Methanol <SEP> (l <SEP> : <SEP> l) <SEP> : <SEP> Rf <SEP> = <SEP> 0, <SEP> 75 <SEP> ; <SEP>
<tb> in <SEP> Chloroform-Methanol <SEP> (9 <SEP> : <SEP> 1) <SEP> : <SEP> Rf <SEP> = <SEP> 0. <SEP> 17 <SEP> ; <SEP>
<tb> in <SEP> Aceton <SEP> : <SEP> Rf <SEP> = <SEP> 0, <SEP> 18 <SEP> ; <SEP>
<tb> Rf <SEP> (102E) <SEP> = <SEP> 0, <SEP> 23 <SEP> ; <SEP> Rf <SEP> (89) <SEP> = <SEP> 0, <SEP> 12. <SEP>
<tb>
16. H-Tyr (tBu)-Thr (tBu) -Gln-Asp (OtBu))-Phe-OCHg.
687 mg Z-Tyi (tB -OH-Dicyclohexylammoniumsalz werden in Chloroform mit wässeriger Zitronensäure ausgeschüttelt, und die erhaltene freie Säure, ein klares Öl, wird in 6,5 ml Tetrahydrofuran mit 0, 139 ml
EMI25.4
rührt man noch 15 h bei Raumtemperatur. Nachher wird am Vakuum eingeengt und in Essigester wie üblich aufgearbeitet. Das Z-Tyr (tBu)-Thr (tBu)-Gln-Asp (OtBu)-Phe-OCH wird in 15 ml Essigester gelöst, mit 40 ml Äther gefällt und anschliessend aus Methanol im Kühlschrank kristallisiert. Kurze, dicke Nadeln, die beim Trocknen am Hochvakuum bei 500 verwittern. F. 169 bis 1730.
Im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel werden folgende Rf-Werte erhalten :
EMI25.5
<tb>
<tb> in <SEP> Chloroform-Methanol <SEP> (9 <SEP> : <SEP> l) <SEP> : <SEP> Rf <SEP> = <SEP> 0, <SEP> 46 <SEP> ; <SEP>
<tb> in <SEP> Chloroform-Methanol <SEP> (l <SEP> : <SEP> 1) <SEP> : <SEP> Rf <SEP> = <SEP> 0, <SEP> 95 <SEP> ; <SEP>
<tb> in <SEP> Chloroform-Aceton <SEP> (1 <SEP> : <SEP> 1) <SEP> : <SEP> Rf <SEP> = <SEP> 0, <SEP> 44 <SEP> ; <SEP>
<tb> Rf <SEP> (89) <SEP> = <SEP> 0, <SEP> 61 <SEP> ; <SEP>
<tb> Rf <SEP> Aceton <SEP> = <SEP> 0, <SEP> 68 <SEP> ; <SEP>
<tb> Rf <SEP> (102E) <SEP> = <SEP> 0, <SEP> 73. <SEP>
<tb>
EMI25.6
Das Produkt von 16. wird zusammen mit 1, 48 g Z-Thr (tBu)-OSU in 3 ml Dimethylformamid gelöst und 21 h bei Zimmertemperatur gerührt.
Nach Verdünnen der Reaktionslösung mit viel Essigester wird wie üblich aufgearbeitet (vgl. 15). Das Rohprodukt wird in 30 ml Essigester-Methanol (9 : 1) warm gelöst und nach Kühlen im Eisbad mit 80 ml Äther gefällt. Man erhält das Produkt als farbloses, amorphes Pulver vom F. 146 bis 1480.
Im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel werden folgende Rf-Werte erhalten :
EMI25.7
<tb>
<tb> in <SEP> Chloroform-Methanol <SEP> (9 <SEP> : <SEP> 1) <SEP> : <SEP> Rf <SEP> = <SEP> 0, <SEP> 55 <SEP> ; <SEP>
<tb> in <SEP> Chloroform-Aceton <SEP> (1 <SEP> : <SEP> 1) <SEP> : <SEP> Rf <SEP> = <SEP> 0,60;
<tb> Rf <SEP> (89) <SEP> = <SEP> 0, <SEP> 43 <SEP> ; <SEP>
<tb>
EMI25.8
(e(Zersetzung).
Im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel werden folgende Rf-Werte gefunden :
<Desc/Clms Page number 26>
EMI26.1
<tb>
<tb> in <SEP> Chloroform-Methanol <SEP> (9 <SEP> : <SEP> 1) <SEP> : <SEP> Rf <SEP> = <SEP> 0, <SEP> 32 <SEP> ; <SEP>
<tb> in <SEP> Cyclohexan-Aceton <SEP> (3: <SEP> 7): <SEP> Rf <SEP> = <SEP> 0, <SEP> 23 <SEP> ; <SEP>
<tb> Rf <SEP> (89) <SEP> = <SEP> 0, <SEP> 34.
<tb>
EMI26.2
20. Z-Asn-Lys (BOC) -Phe-His-NH-NH2'
3,97 g Z-Asn-Lys (BOQ-Phe-His-OMe werden in 8 ml warmem Dimethylformamid und 12 ml Methanol gelöst Zu der noch etwa 300 warmen Lösung werden 2, 5 ml Hydrazinhydrat zugesetzt und es wird während 20 h bei Raumtemperatur stehengelassen. Durch Zugabe von Wasser wird das Peptidhydrazid ausgefällt, abfiltriert und mit Wasser Hydrazin-frei gewaschen. Das Produkt wird aus Äthanol umkristallisiert, F. = 200 bis 2010. Im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel ist Rf (43C) = 0, 5.
21. Z-Thr (tBu)-Phe-Pro-OH.
EMI26.3
amin werden in M ml Dimethylformamid gelöst, über Nacht bei 200 stehengelassen und dann im Hochvakuum bis zur Bildung einer klebrigen Masse konzentriert. Diese wird in 500 ml Essigester gelöst und fünfmal mit je 100 ml piger Weinsäurelösung und anschliessend bis zur Neutralität mit Wasser gewaschen. Die organische Phase wird zur Trockne eingeengt und der zurückbleibende feste Schaum pulverisiert und im Hochvakuum bei 400 getrocknet. Durch zweimaliges Umfällen aus Essigester-Petroläther erhält man 13, 3 g amorphes, chromatographisch reines Tripeptidderivat mit unscharfem Schmelzbereich bei zirka 75 bis 850. Im Dünnschichtchro- matogramm. auf Silicagel ist Rf (115) = 0, 68 ; Rf (121A) = 0, 57.
22. Z-Thr (tBu)-Ala-Ile-Gly-OMe.
1, 36 g H-Ala-Ile-Gly-OMe und 2,5 g Z-Thr (tBu)-OSU werden in 3 ml Dimethylformamid während 20 h
EMI26.4
Rf = 0,55 im System Chloroform-Methanol (95 : 5) an Silicagel.
23. H-Thr (tBu)-Ala-Ile-Gly-OMe.
5,66 g der obigen Carbobenzoxyverbindung werden in 400 ml warmem Methanol gelöst und in Gegenwart von 1 g Pd-Kohle (10o/ hydriert. Nach Abfiltrieren des Katalysators wird das Methanol im Vakuum bei 400 verdampft. Der feste Rückstand wird sofort weiterverarbeitet. Rf = 0,2 im System Chloroform-Methanol (95 : 5) an Silicagel.
24. Z-Gln-Thr (tBu)-Ala-Ile-Gly-OMe.
EMI26.5
3, 5 g Z-Gln-ONP versetzt und bei Raumtemperatur gerührt, bis das Gemisch fest wird. Nach Stehenlassen über Nacht wird mit Äther verdünnt, die Fällung abfiltriert und mit Äther Nitrophenol-frei gewaschen. Das geschützte Pentapeptid zeigt im Dünnschichtchromatogramm auf Silicagel Rf = 0, 14 im System Chloroform-Methanol (95 : 5). F. : > 2500.
25. H-Gln-Thr (tBu)-Ala-Ile-Gly-OMe, HC1.
14,4 g des unter 24. beschriebenen Pentapeptidderivats werden in 800 ml 80'igem Methanol suspendiert und einige Zeit auf 500 erwärmt. Die Suspension wird auf Raumtemperatur gekühlt, mit 20,8 ml Salzsäure und
EMI26.6
der Rückstand durch zweimaliges Eindampfen mit Dimethylformamid im Hochvakuum entwässert. Der Rückstand wird ohne weitere Reinigung verwendet. Rf (100) = 0, 33 im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel.
26. Z-Thr (tBu)-Phe-Pro-Gln-Thr (tBu)-Ala-Ile-Gly-OMe.
12,0 g des unter 25. beschriebenen Pentapeptidmethylester-hydrochlorids werden in 80 ml Dimethylformamid gelöst. Nacheinander werden unter Rühren bei Raumtemperatur 13,3 g Z-Thr (tBü)-Phe-Pro-OH und 5, 75 g N-Hydroxysuccinimid zugegeben, dann bei 00 2. 76 ml Triäthylamin und 6,2 g Dicyclohexylcarbodiimid. Man rührt bei 00, bis die Mischung dick wird, dann wird über Nacht bei 00 stehengelassen. Nach Einengen im Hochvakuum auf zirka 50 ml wird das Produkt mit 300 ml Äther gefällt. Das isolierte Material wird mit 0, 05m-Zitronensäure und Wasser gewaschen und im Hochvakuum bei 400 getrocknet. Gereinigt wird durch Umkristallisieren aus zirka 1 l Isopropanol. Man erhält 18, 2 g des geschützten Octapeptidderivats. Rf (89) = 0, 27 im Dünnschichtchromatogramm auf Silicagel.
<Desc/Clms Page number 27>
27. Z-Thr (tBu)-Phe-Pro-Gln-Thr (tBu)-Ala-ne-Gly-OH.
10,9 g des unter 26. beschriebenen Octapeptidmethylesters werden in 190 ml 90'igem Methanol unter Erwärmen auf 70 gelöst. Nach Abkühlen auf Raumtemperatur werden 30 ml ln-Natronlauge und 10 min später 160 ml Wasser in kleinen Portionen zugefügt. Dann wird klar filtriert und aus dem Filtrat das Produkt nach Eingiessen in 600 ml 0, 05n-eiskalte Salzsäure gefällt. Der Niederschlag wird abfiltriert und mit Wasser neutral gewaschen. Das im Dünnschichtchromatogramm auf Silicagel einheitliche Produkt [Rf (100) = 0, 45] kann aus Methanol-Wasser umkristallisiert werden.
EMI27.1
(tBu)-Ala-Ile-Gly-OH.piger Essigsäure gelöst und die Lösung wird in Gegenwart von 0, 5g Palladiumkohle (10% Pd) hydriert.
Nach beendeter Wasserstoffaufnahme nutscht man vom Katalysator ab und dampft die Lösung zur Trockne ein. Das als farbloser Firn erhaltene essigsaure Salz des Octapeptidderivats wird im Hochvakuum getrocknet. Im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel ist Rf (100) = 0,21.
EMI27.2
erwärmt, wobei durch gelegentlich Zugabe von Triäthylamin das PH auf 7 bis 8 gehalten wird. Insgesamt werden noch 3,5 ml Triäthylamin zugegeben. Nach Rühren über Nacht bei Oc) wird in 3 l Äther eingegossen, die flockige Fällung abfiltriert und zweimal mit Äther und einmal mit Wasser gewaschen. Das Rohprodukt wird in 500 ml warmem Methanol gelöst und durch Eingiessen in 1, 5 l l0ige Essigsäure wieder ausgefällt. Das abfiltrierte und zweimal mit Wasser gewaschene Produkt wird nochmals auf gleiche Weise umgefällt.
Rf (100) = 0,33 (auf Silicagelplatten).
30. H-Asn-Lys(BOC)-Phe-His-Thr(tBu)-Phe-Pro-Gln-Thr(tBu)-Ala-Ile-Gly-OH.
1, 7 g des obigen geschützten Dodekapeptids werden in 100 ml 80% figer Essigsäure gelöst und in Gegenwart von 0,5 g Palladiumkohle (10% Pd) wie üblich hydriert. Nach Abfiltrieren vom Katalysator wird im Hochvakuum bei 300 stark eingeengt und der Rückstand mit tert. Butanol lyophilisiert. Das in quantitativer Ausbeute erhaltene, im Dünnschichtchromatogramm [Rf (100) = 0, 1 auf Silicagel] einheitliche Produkt wird sofort weiterverarbeitet.
31. Z-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Gln-Asp(OtBu)-Phe-Asn-Lys(BOC)-Phe-His-Thr(tBu)-Phe-Pro-Gln- - Thr (tBu)-Ala-Ile-Gly-OH.
1, 73 g des unter 18. beschriebenen Peptidderivats werden bei 500 in 10 ml Dimethylformamid gelöst. Nach Abkühlen auf-20 werden 0, 9 ml 4, 2n-Chlorwasserstoff in Dioxan zugetropft. Dann gibt man bei-150 0, 22 ml tert. Butylnitrit zu und lässt 15 min bei-150 reagieren. Nun kühlt man wieder auf-20 ab und lässt 0, 53 ml Triäthylamin und dann eine Lösung von l, 6 g des unter 30. beschriebenen Peptidderivats in 40 ml 90'igem Dimethylformamid zutropfen. Man erhöht die Temperatur innerhalb 1 h auf 00, wobei durch portionenweise Zugabe von Triäthylamin das PH auf 7 bis 8 gehalten wird. Insgesamt werden 0, 25 ml Triäthylamin zugegeben.
Nach weiteren 15 h Rühren bei 00 wird das Produkt durch Eingiessen in Äther gefällt, die Fällung abfiltriert und mit Äther und Wasser gewaschen. Zur Reinigung wird einmal aus Dimethylformamid-Essigester und einmal aus Dimethylformamid 0, 02n-Salzsäure umgefällt. Das reine Material zeigt im Dünnschichtchromatogramm auf Silicagel Rf (100) = 0, 40.
32. H-Val-Gly-Ala-Pro-NH.
Das Produkt wird über folgende Stufen erhalten : Z-Ala-pro-NHz'F. 167, 5 bis 168, 50 ;
Z-Gly-Ala-Pro-NH, F. 109 bis 1120 (aus Essigester) ; Z-Val-Gly-Ala-Pro-NH, F. 209 bis 2110.
EMI27.3
(tBu)-Tyr (tBu)-Thr (tBu)-Gln-Asp (OtBu)-Phe-Asn-Lys (BOC)-Phe-His-Thr (tBu)-Phe-Pro-Gln-- Thr (tBu)-Ala-Ile-Gly-Val-Gly-Ala-Pro-NH .
800 mg des unter 31. beschriebenen Peptidderivats, 500 mg H-Val-Gly-Ala-Pro-NH und 170 mg N-Hydroxysuccinimid werden in 10 ml Dimethylformamid gelöst, im Hochvakuum auf etwa die Hälfte eingeengt und mit 250 mg Dicyclohexylcarbodiimid versetzt. Nach Rühren über Nacht bei Raumtemperatur wird mit Äther ausgefällt und das Material isoliert. Gereinigt wird durch Craig-Verteilung im Gemisch Methanol-PufferChloroform-Tetrachlorkohlenstoff (10 : 3 : 5 : 6; Puffer : 29 ml Eisessig, 19 g Ammoniumacetat, mit Wasser auf 1 l aufgefüllt), K = 0,29. Das aus der Verteilung isolierte reine Produkt zeigt im Dünnschichtchromatogramm Rf (107) = 0,62 (auf Silicagelplatten)..
EMI27.4
<Desc/Clms Page number 28>
Palladiumkohle (10% Pd) hydriert.
Nach vollständiger Decarbobenzoxylierung wird der Katalysator abfiltriert, das Filtrat im Hochvakuum bei 300 stark eingeengt und der Rückstand aus tert. Butanol lyophilisiert. Der Rück- stand wird in 10 ml Methanol gelöst, durch Zugabe von in-Natriumbicarbonat schwach alkalisch gemacht und durch Eintropfen in 0, ln-Natriumcarbonat ausgefällt. Das isolierte Produkt wird nochmals gleich umgefällt. Im
EMI28.1
EMI28.2
EMI28.3
succinimid werden in 2 ml Dimethylformamid unter Überleiten von Stickstoff bei 450 gelöst. Nach Zugabe von 52 mg Dicyclohexylcarbodiimid wird noch 3 h bei 450 gerührt, darauf mit peroxydfreiem Äther gefällt und das
Produkt isoliert.
Gereinigt wird durch eine Craig-Verteilung im System Methanol-Puffer (wie unter 33. be- schrieben) Chloroform-Tetrachlorkohlenstoff (11 : 3 : 6 : 7) ; K = 0, 74. Das aus der Verteilung isolierte reine
Produkt zeigt im Dünnschichtchromatogramm Rf (52A) = 0, 4 ; Rf (100) = 0,35 (auf Silicagel).
Beispiel 3 :
EMI28.4
EMI28.5
überführt das Produkt in das essigsaure Salz an einer kleinen Säule Amberlite CG-45 (schwach basischer Ionen- austauscher in Acetatform) und lyophilisiert. Man erhält das Produkt in Form eines farblosen Lyophilisats.
Im UV-Spektrum in piger Essigsäure ist kmax = 275 nm (e = 1700). Im Dünnschichtchromatogramm an
Cellulose (Selecta) ist Rf (45) =0, 48, Rf (101A) = 0, 49 ; an Aluminiumoxyd (Alox, Camag) istRf (79) =0, 57.
In der Elektrophorese wandert die Substanz bei 280 V in 1, 5 h auf Cellulose-Selectaplatten in Richtung Ka- thode bei PH = 1, 9 (Essigsäure-Ameisensäurepuffer) : 3, 5 cm.
Das Ausgangsmaterial kann über folgende Zwischenprodukte hergestellt werden :
EMI28.6
: F.H-Thr (tBu)-Gln-Asn-Phe-OCHg : an Silicagel ist Rf (52) =0, 21, Rf (102A) =0, 21 ; an Aluminiumoxyd ist Rf (43A) = 0, 19 ;
Z-Tyr (tBu)-Thr (tBu)-Gln-Asn-Phe-OCH : F. 216 bis 2190 ;
H-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Gln-Asn-Phe-OCH3 : Rf (89) = 0, 15 ; Rf (102E) = 0, 28 ; Rf in Chloroform-Methanol (9 : 1) = 0, 11 (an Silicagel) ;
EMI28.7
EMI28.8
EMI28.9
EMI28.10
EMI28.11
<Desc/Clms Page number 29>
sen 90 min bei Zimmertemperatur stehengelasen. Bei wird mit 50 ml kaltem Äther ausgefällt, die Suspension zentrifugiert und der Niederschlag noch zweimal mit Äther verrieben.
Das über Ätznatron am Hochvakuum getrocknete Produkt wird zur Überführung in die Acetatform in 3 ml Wasser aufgenommen, auf eine mit 0,02nEssigsäure äquilibrierte Säule von schwach basischem Ionenaustauscher (z. B. Merck ; 7,5 mm ; 20 cm) aufgebracht und mit 0,02n-Essigsäure eluiert. Das Eluat wird bei 250 am Hochvakuum eingedampft, der Rückstand in Wasser aufgenommen und lyophilisiert. Das weisse Pulver wird zur Reinigung einer Craig-Verteilung im System n-Butanol-Eisessig-Wasser (4 : 1 : 5 ; 3 ml Phasenvolumen) unterworfen. Nach 600 Schritten werden die nach Dünnschichtchromatogramm einheitliches Produkt enthaltenden Fraktionen vereinigt, am Hochvakuum bei 250 eingedampft, in Wasser aufgenommen und lyophilisiert.
Trocknen über Ätznatron am Hochvakuum bei Zimmertemperatur ergibt ein amorphes Pulver.
EMI29.1
Rf (45) =0,55 ; Rf (101A) =0, 63 ; Rf (52) =0, 38.
Das Ausgangsmaterial kann über folgende Zwischenprodukte hergestellt werden :
TRI-Cys(TRI)-Gly-Asn-Leu-OME : F. 126 bis 1300 ; H-Cys (TRI)-Gly-Asn-Leu-OMe, Acetat : an Silicagel ist Rf = 0, 45 im System : Chloroform/Methanol (8 : 2) ; Ac-Cys (TR))-Gly-Asn-Leu-OMe : F. 156 bis 1580 ;
Ac-Cys (TRI)-Gly-Asn-Leu-NH-NH : Rf (53) = 0,55 (an Silicagel) ;
Ac-Cys (TRI)-Gly-Asn-Leu-Ser (tBu)-Thr (tBu)-Cys (TRI)-Met-Leu-Gly-OH : Rf = 0,25 im System Chloroform/ Methanol (8: 2) an Silicagel ;
EMI29.2
EMI29.3
EMI29.4
EMI29.5
Das Produkt hat in der Elektrophorese auf Cellulose "Selecta" 1440 (pH 1,9; 1 1/2 h, 280 V) eine Laufstrecke von l, 8 cm ; bei PH 4, 8 : 1. 2 cm zur Kathode.
Das Ausgangsmaterial kann wie folgt hergestellt werden :
1. Bmp (TRl)-OH.
EMI29.6
stoffspülung 25, 1 g Triphenylchlormethan portionenweise zu. Nach beendetem Eintragen wird die Eiskühlung entfernt. Aus der zunächst klaren Lösung beginnt das Produkt auszufallen. Nach 2 h wird auf 00 gekühlt, filtriert und mit kaltem Methanol gewaschen. Umkristallisation aus Methylenchlorid-Methanol liefert das reine Produkt vom F. 200 bis 201 .
2. Bmp (TRI)-Gly-Asn-Leu-OMe.
Zu einer bei 00 gerührten Lösung von 2,62 g Bmp (TRI)-OH und 1, 58 g H-Gly-Asn-Leu-OMe in 30 ml Dimethylformamid werden 1, 85 g Dicyclohexylcarbodiimid gegeben. Nach 24 h bei 00 wird vom Dicyclohexylharnstoff abfiltriert und das Filtrat bei 400 zur Trockne eingedampft. Das Produkt wird durch Umfällen aus Methanol gereinigt. Im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel ist Rf (45) = 0,67.
3. Bmp (TRI)-Gly-Asn-Leu-NH-NH.
1, 06 g Bmp(TRI)-Gly-Asn-Leu-OMe werden in 30 ml Methanol mit 3 ml Hydrazinhydrat versetzt. Nach 2 h bei Raumtemperatur kristallisiert das Hydrazid bei Animpfen aus. Es wird aus heissem Methanol umkristallisiert. F. 190 bis 1940. Rf = 0,35 im System Chloroform-Methanol (8 : 2).
4. Bmp (TRI)-Gly-Asn-Leu-Ser (tBu)-Thr (tBu)-Cys (TRJ)-Met-Leu-Gly-OH.
926 mg Bmp (TR))-Gly-Asn-Leu-NHNH werden in 8 ml Dimethylformamid bei-150 mit 2. 21 ml 2, 21nChlorwasserstoff in Essigester und 0, 18 ml t-Butylnitrit versetzt. Nach 15 min bei-100 wird eine auf-10 gekühlte Lösung von 1,38 g H-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Cys(TRI)-Met-Leu-Gly-OH und 0. 7 ml Triäthylamin in 10 ml
<Desc/Clms Page number 30>
Dimethylformamid zugetropft. Es wird noch 1 h bei-100 gerührt und 15 h bei 00 stehengelassen. Nach Zugabe von 20 ml Methanol wird abfiltriert, der Niederschlag mit kaltem Methanol gewaschen, dann in Wasser zerrieben, filtriert und über Ätznatron getrocknet.
Das dünnschichtchromatographisch einheitliche Produkt liegt zu
EMI30.1
EMI30.2
EMI30.3
20 ml eingeengt, mit zirka 400 ml Äther versetzt und abdekantiert. Der Rückstand wird mit 20 ml Wasser zerrieben, filtriert, mit kaltem Wasser gewaschen und über Ätznatron getrocknet. Das Produkt wird durch UmfÅal-
EMI30.4
EMI30.5
EMI30.6
bei 450 gehalten. Die klare Lösung wird dann in 40 ml absolutem Äther bei 00 getropft und das ausgeschiedene
Produkt abfiltriert. Gereinigt wird durch Umfällen aus Methanol-Wasser. Rf (45) = 0, 38 im Dünnschichtchro- matogramm an Silicagel.
Beispiel 6 : Na-Acetyl-Calcitonin M
10 mg Calcitonin M-Acetat werden in 2 ml absolutem Dimethylformamid gelöst, mit 0,5 ml einer ligen
Lösung von p-Nitrophenylacetat in Dimethylformamid versetzt, mit Stickstoff gespült und das verschlossene
Gläschen während 30 min bei 400 stehengelassen. Man gibt sodann 5 ml 2n-Essigsäure zu, extrahiert das über- schüssige p-Nitrophenylacetat und das gebildete p-Nitrophenyl mit Essigester (2 x 30 ml), dampft die wässerige
Phase im Vakuum zur Trockne ein, löst wieder in 0,5 ml zager Essigsäure und lyophilisiert. Das Produkt be- steht aus einer Mischung von Mono- und Diacetylderivat, neben etwas Ausgangsmaterial. Das Monoacetylderi- vat ist wieder ein Gemisch von N-und N --Derivat, wie sich in der Elektrophorese bei PH 8 zeigt.
Die Auftrennung von Ausgangsmaterial, Mono- und Diacetylverbindung erfolgt in der Craig-Verteilung im
System n-Butanol-Eisessig-wasser (4 : 1 : 5), oder in einer präparativen Dünnschichtelektrophorese auf Cellu- loseplatten ("Selecta') bei PH 1, 9 (11/2 h bei 17 V/cm) ; Laufstrecken s. unten. Das auf diese Weise erhaltene
Gemisch der beiden Monoacetylderivate wird wieder durch präparative Dünnschichtelektrophorese bei PH 8
EMI30.7
grössere Substanzmengen wendet man die kontinuierliche, trägerfreie Elektrophorese an, ebenfalls bei PH 8 In beiden Fällen verhält sich Na-Acetyl-Calcitonin M elektrisch neutral, währenddem das NE -Acetyl derivat zur Anode läuft.
Die Verbindungen weisen folgende Rf-Werte auf :
EMI30.8
<tb>
<tb> Na <SEP> : <SEP> -Acetyl-Ca1citonin <SEP> M <SEP> auf <SEP> "Selecta"-Cellulose <SEP> : <SEP> Rf <SEP> (lOlA) <SEP> = <SEP> 0. <SEP> 67 <SEP> ; <SEP>
<tb> auf <SEP> Aluminiumoxyd <SEP> ("Alox" <SEP> der <SEP> Fa. <SEP> Camag) <SEP> : <SEP> Rf <SEP> (52) <SEP> =0, <SEP> 68.
<tb>
NIE-Acetyl-Calcitonin hat in beiden Systemen die gleichen Rf-Werte wie Nu--Acetyl-Calcitonin M (Calcitonin M weist in diesen System Rf (10lA) = 0,56 und Rf (52) = 0,62 auf).
Na, NE -Diacetyl-Calcitonin M zeigt in diesen beiden Systemen Rf (101A) =0,75 und Rf (52) = 0,73.
Bei der Elektrophorese auf Cellulose-Dünnschichtplatten ("Selecta") ist die Laufstrecke von Net- und von
EMI30.9
nin M unter gleichen Bedingungen -1, 3 cm (die von Calcitonin M -3, 7 cm). Bei PH 8,0 wandert NE -Acetyl- -Calcitonin M in 90 min bei 17 VI cm +0, 6 cm, während Nct-Acetyl-Calcitonin M (ebenso wie Calcitonin M) am Startpunkt bleibt.
<Desc/Clms Page number 31>
EMI31.1
EMI31.2
EMI31.3
(zirka 2 min) und die Lösung hierauf unter Stickstoff weitere 8 min bei 00 belassen. Hierauf befreit man vom gasförmig gelösten Chlorwasserstoff durch 1minütiges Evakuieren bei 0,01 Torr, gibt dann 100 ml t-Butanol zu und lyophilisiert. Man erhält dabei 138 mg salzsaures Salz des N-Palmitoyl-Calcitonins M als farbloses Pulver.
Bei Dünnschichtchromatographie auf Aluminiumoxyd ("lox') zeigt das Produkt Rf (45) =0, 52, Rf (52) = 0,76. Das Produkt zeigt im Test nach Kumar gegenüber Calcitonin M eine deutlich verlängerte Wirkung.
Das als Ausgangsmaterial verwendete, geschützte Na-Palmitoyl-Dotriacontapeptidamid kann folgendermassen hergestellt werden :
1. Palmitinsäure-p-nitrophenylester (Pal-ONP = Hexadekansäure-p-nitrophenylester) :
Zu 5,0 g p-Nitrophenol in 60 ml Chloroform-Äther (l : l) werden unter Eiskühlung zunächst 9,4 g Palmitylchlorid und dann 5,0 ml Triäthylamin gegeben. Nach 2 h Kochen unter Rückfluss wird in Essigester aufge-
EMI31.4
2. Pal-Cys (TRI)-Gly-Asn-Leu-OMe.
1, 32 g H-Cys (TRI) -Gly-Asn-Leu-OMe und 780 mg Palmitinsäure-p-nitrophenylester werden in 20 ml frisch destilliertem Dimethylformamid gelöst und 24 h bei Raumtemperatur stehengelassen. Aus dem nach Abdampfen des Lösungsmittels resultierenden Produkt wird durch Umfällen aus Methanol die Verbindung in dünnschichtchromatographisch reiner Form erhalten.
3. pal-Cys (TRI)-Gly-Asn-Leu-NH-NH .
Zu 1, 35 g Pal-Cys (TRI) -Gly-Asn-Leu-OMe in 40 ml Methanol werden 4,0 ml Hydrazinhydrat gegeben und die Lösung 24 h bei Raumtemperatur gehalten. Am Rotationsverdampfer wird dann bei 250 auf zirka 20 ml eingeengt und 150 ml 0,5n-Essigsäure zugegeben. Das ausgefallene Produkt wird abfiltriert, mit kaltem Wasser gewaschen und über Ätznatron getrocknet. Im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel zeigt das Produkt Rf (100) = 0, 45.
EMI31.5
(tBu)-Thr (tBti)-Cys (TR !)-Met-Leu-Gly-OH.- 100 gekühlte Lösung von 980 mg H-Ser (tBu) -Thr (tBu) -Cys (TRI) -Met-Leu-Gly-OH und 0,56 ml Triäthylamin in 10 ml Dimethylformamid zugetropft. Nach 1 h Stehen bei-100 und 15 h bei 00 werden 30 ml Methanol zugegeben und das ausgefallene Produkt wird abfiltriert, mit kaltem Methanol gewaschen und bei 400 am Hochvakuum getrocknet.
Das resultierende Pulver wird dreimal mit je 10 ml Wasser verrieben und dann über Ätznatron getrocknet. Umfällen aus Dimethylformamid-Methanol liefert das Produkt dünnschichtchromatographisch rein.
EMI31.6
EMI31.7
1- ys-G1y-Asn-Leu-Ser (tBu) -Thr (tBu) -Cys-Met-Leu-G1y-OH.Dimethylformamid wird bei Raumtemperatur innerhalb 20 min zu einer stark gerührten Lösung von 1, 0 g Jod in 150 ml Methanol getropft. Es wird noch 1 h gerührt und dann die Reaktionslösung bei 00 durch tropfenweise Zugabe von in-wässerigem Natriumthiosulfat entfärbt. Die klare Lösung wird zunächst am wasserstrahl-, dann am Hochvakuum bei 300 auf zirka 10 ml eingeengt, mit 200 ml Äther-Petroläther (1 : 1) versetzt und abdekantiert.
Der Rückstand wird nach kurzem Trocknen am Wasserstrahlvakuum dreimal mit je 10 ml Wasser verrieben und über Ätznatron getrocknet. Zur Reinigung wird aus Chloroform-Petroläther umgefällt. Im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel ist Rf (53) = 0, 50.
EMI31.8
EMI31.9
xylcarbodiimid. Man rührt noch 3 h unter Stickstoff weiter bei 450. gibt dann nochmals je 70 mg N-Hydroxysuccinimid und Dicyclohexylcarbodiimid zu und rührt weitere 4,5 h bei 450. Dann kühlt man auf 00 und giesst
<Desc/Clms Page number 32>
in 300 ml eiskalten, peroxydfreien Äther. Nach 12 h bei 0 nutscht man den Niederschlag ab, wäscht ihn mit Äther und trocknet in Vakuum bei 40 .
Zur Reinigung löst man das Produkt in Methanol-Chloroform (l : l) und chromatographiert in diesem Lösungsmittelgemisch aufsteigend an einer Säule von "Sepbadex" LH20 der Dimension 110 x 4,2 cm. Es werden Fraktionen ä 3 ml aufgefangen und dünnschichtchromatographisch geprüft. Bei
EMI32.1
EMI32.2
EMI32.3
Das Ausgangsmaterial kann analog wie im Beispiel 7 hergestellt werden.
PATENTANSPRÜCHE : 1. Verfahren zur Herstellung neuer Peptide der Formel I
EMI32.4
EMI32.5
gen, in welchen einer oder mehrere der Asparagin- oder Glutaminreste durch den Asparaginsäure- bzw. Glutaminsäurerest und/ oder der Asparaginsäurerest durch den Asparaginrest ersetzt sind, ihrer Dimeren sowie Säureadditionssalze und Komplexe dieser Verbindungen, dadurch gekennzeichnet, dass man aus entsprechenden Verbindungen der Formel I oder den genannten Analogen oder Dimeren dieser Verbindungen, in welchen Verbindungen mindestens eine Aminogruppe oder eine Carboxylgruppe durch eine Schutzgruppe geschützt ist, die Schutzgruppe (n) abspaltet und, wenn erwünscht, erhaltene Verbindungen mit freier Na-Aminogruppe in ihre N-Acylderivate überführt und, wenn erwünscht,
die erhaltenen Verbindungen in Säureadditionssalze, oder Komplexe überführt.
EMI32.6