CH623806A5

CH623806A5 -

Info

Publication number: CH623806A5
Application number: CH994576A
Authority: CH
Inventors: Marvin R Brown; Jean E F Rivier; Wylie W Jun Vale
Original assignee: Salk Inst For Biological Studi
Priority date: 1975-08-06
Filing date: 1976-08-04
Publication date: 1981-06-30
Also published as: IE44532B1; PT65388A; AU1643676A; GB1551929A; FI762252A; PT65388B; IL50047A; FR2320108A1; ES450439A1; NO762716L; AU504070B2; CA1125282A; DE2634416A1; US4372884A; IE44532L; IL50047A0; DK351576A; SE7608794L; NL7608764A; FR2320108B1

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Peptiden, die eine inhibierende Wirkung auf

1. die Sekretion des Wachstumshormons durch die Hypophyse,

2. die Sekretion von Glucagon und Insulin durch die Bauchspeicheldrüse und

3. die Sekretion der gefässaktiven Eingeweidepolypeptide wie Sekretin und Gastrin sowie der Magensäure bei Menschen und Tieren ausüben.

Die Erfindung betrifft insbesondere die Herstellung solcher Peptide, die eine inhibierende Wirkung auf die Freisetzung des Wachstumshormons durch die Hypophyse und auf die Freisetzung von Glucagon und Insulin durch die Bauchspeicheldrüse ausüben.

Ein Peptid, das eine inhibierende Wirkung auf die Sekretion des Wachstumshormons besitzt, ist in der US-PS 3 904 595 beschrieben. Dieses Peptid wird als «Somatosta-tin» bezeichnet. Somatostatin ist ein Tetradecapeptid und besitzt die folgende Struktur, in der die Aminosäurereste gemäss der üblichen Praxis von links nach rechts durchnumeriert sind:

40

45

H-Ala-Gly-Cys-Lys-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-Cys-OH 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

Somatostatin, die lineare Form des Somatostatins (Dihy-drosomatostatin) und verschieden acylierte Derivate von Somatostatin und Dihydrosomatostatin sind in der oben erwähn- 55 ten US-PS 3 904 595 beschrieben. Die vorliegende Erfindung basiert nun auf der Erkenntnis, dass man durch den Ersatz bestimmter Aminosäuren in dem Gerüst des Somatostatins und des Dihydrosomatostatins durch bestimmte andere Aminosäuren Peptide erhält, die therapeutisch wertvolle Wirkungen ent- 60 falten, wenn sie entweder direkt oder indirekt in den Blutkreislauf von Säugern eingeführt werden, da sie die Sekretion des Wachstumshormons durch die Hypophyse und die Sekretion des Insulins und des Glucagons durch die Bauchspeicheldrüse inhibieren. Man kann die Peptide indirekt nasal in den « Blutkreislauf überführen, indem man die Peptide subkutan oder intramuskulär implantiert oder mit Hilfe anderer Methoden zuführt, wobei man gegebenenfalls übliche Verdünnungsmittel oder Trägermaterialien verwendet. Die Peptide können auch direkt durch Injektion in den Blutkreislauf überführt werden. Es hat sich gezeigt, dass die erfindungsgemäss zugänglichen Peptide bei der Inhibierung des Wachstumshormons, des Insulins und des Glucagons eine Wirkung ausüben, die um ein Mehrfaches grösser ist als diejenige von Somatostatin.

Die Aufgabe der Erfindung besteht somit darin, neue Peptide zu schaffen, die eine inhibierende Wirkung auf

1. die Sekretion des Wachstumshormons durch die Hypophyse und

2. die Sekretion von Glucagon und Insulin durch die Bauchspeicheldrüse von Säugern, einschliesslich Menschen, ausüben und die weiterhin die Sekretion von schilddrüsenstimulierenden Hormonen bei Säugern, einschliesslich Menschen, beeinflussen.

3

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Diese Aufgabe wird durch das erfindungsgemässe Verfahren zur Herstellung der folgenden Peptide gelöst, die eine inhibierende Wirkung auf die Sekretion des Wachstumshormons

Ri-Cys-Lys-R2-Phe-D-Trp worin

Ri eine von Aminosäuren, Dipeptiden, Tripeptiden, Pen- io tapeptiden oder eine von aliphatischen, aromatischen oder ali-cyclischen organischen Säuren mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen abgeleitete Acylgruppe, ein Wasserstoffatom oder eine Gruppe Des-Rj und

R2 Ala, Asn oder eine Gruppe Des-R2 is bedeuten, wobei die in den 7- und 11-Stellungen sitzenden Reste Phe einzeln oder beide durch Tyr ersetzt und darüber hinaus beliebige Aminosäurereste der Peptide durch Ala ersetzt sein können, mit der Massgabe, dass in der allgemeinen Formel I Ra nicht die Bedeutung Ala-Gly hat, wenn R2 Asn 20 bedeutet. Der Verbindungsstrich zwischen Cys3 und Cys14 in Formel I stellt eine Disulfidbrücke dar.

Es hat sich ferner gezeigt, dass ohne eine Beeinflussung der Wirksamkeit der Peptide die in den 7- und 11-Stellungen stehenden Aminosäurereste Phe einzeln oder beide durch Tyr er- 25 setzt sein können. Es hat sich ferner gezeigt, dass irgendwelche Aminosäuresubstituenten der obigen Peptide durch Ala ersetzt werden können.

Bevorzugte Acylgruppen Rx der Peptide der obigen allgemeinen Formeln I und II sind aus den folgenden Resten aus- 30 gewählt:

a) Des-Ala-Gly. Wenn Rj die Bedeutung Des-AIa-Gly besitzt, kann Cys3 die Bedeutung Des-Amino-Cys besitzen;

b) den Rest irgendeiner Aminosäure. Bei den verbrückten Peptiden (Formel I) ist es bevorzugt, dass die Aminosäure 35 keine Sulfhydrylgruppe aufweist;

c) den Rest eines Dipeptids, das aus zwei beliebigen Aminosäuren aufgebaut ist, bei denen jedoch die zweite Aminosäure, die an Cys3 gebunden ist, keine sterische Hinderung verursacht. Bevorzugte zweite Aminosäuren dieser Art sind 40 Gly, Ala und /3-Ala. Im Fall der verbrückten Peptide (Formel

I) ist es bevorzugt, dass die Aminosäuren der Dipeptide keine Sulfhydrylgruppe aufweisen;

d) den Rest eines Tripeptids, bei dem die dritte, an Cys3 gebundene Aminosäure keine sterische Hinderung verursacht 45 und bei denen die beiden restlichen Aminosäuren irgendwelche beliebigen Aminosäuren sind. Bevorzugte dritte Aminosäuren des Tripeptids sind Gly, Ala und D-Ala. Im Fall der verbrückten Peptide (Formel I) ist es bevorzugt, dass keine der Aminosäuren des Tripeptids eine Sulfhydrylgruppe aufweist; so e) den Rest eines Pentapeptids, bei dem die ersten drei Aminosäurebestandteile Gly, die vierte Aminosäure Ala oder ankuppelt, in der R! und R2 die oben angegebenen Bedeutungen besitzen, und dass man dann sämtliche noch verbliebenen Schutzgruppen sowie das Harz abspaltet.

Die Synthese erfolgt erfindungsgemäss schrittweise unter 60 Aufbau des Peptids an einem chlormethylierten Harz. Das Harz besteht im allgemeinen aus feinen Kügelchen mit einem Durchmesser im Mikronbereich (20 bis IQ um) aus einem synthetischen Harz, das durch Copolymerisation von Styrol mit 1 bis 2'/c, Divinylbenzol hergestellt ist. Die Benzolringe des Har- 65 zes sind z. B. unter Durchführung einer Friedel-Crafts-Reak-tion mit Chlormethylmethyläther und Zinn(IV)-chlorid chlor-methyliert worden. Das in dieser Weise eingeführte Chlor ist ausüben und den folgenden allgemeinen Formeln I und II entsprechen

(I)

(II)

D-Ala und die fünfte, an Cys3 gebundene Aminosäure keine sterische Hinderung verursacht und Ala, Gly oder D-Ala bedeutet;

f) den Rest einer von Aminosäuren verschiedenen aliphatischen, aromatischen oder alicyclischen organischen Säure mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen, wobei die organischen Säuren gesättigt sein und/oder andere funktionelle Gruppen aufweisen können.

Besonders bevorzugte Acylgruppen sind: Gly, Ala, Ala-Gly, Acetyl-Ala-Gly, Tyr-Gly, Sarc-Gly, Tyr-Ala-Gly, Ala-Tyr-Gly, Acetyl, Acryl, Pivalyl und Benzoyl.

Abgesehen von D-Trp liegt jede der Aminosäuren in dem Teil der erfindungsgemäss erhältlichen Peptide, der zwischen den beiden Cys-Gruppen liegt und diese einschliesst, das heisst die Aminosäurereste 3 bis 14, in Form der L-Isomeren vor, wenn die Aminosäure isomere Formen besitzt. Die Aminosäuren, die den Resten Ri der erfindungsgemäss darstellbaren Peptide zugrundeliegen, können entweder in Form des L-Isomeren oder in Form des D-Isomeren vorhanden sein, wenn die Aminosäure isomere Formen besitzt. Man erhält ein bevorzugtes Peptid mit starker Wirkung, wenn als mit Cys3 verbundener Aminosäurerest Ri D-Ala vorhanden ist.

Uberraschenderweise erhält man durch den Ersatz des Trp durch D-Trp in der Stellung 8 Peptide, die Wirkungen besitzen, die um ein Mehrfaches grösser sind als die Wirkung von Somatostatin in bezug auf Inhibierung des Wachstumshormons als auch in bezug auf die Freisetzung von Glucagon und Insulin. Ersetzt man verschiedene Aminosäuren in dem Gerüst des Somatostatins durch Ala, so erhält man Peptide mit einer bemerkenswerten pharmazeutischen Wirkung.

Die Peptide I und II können durch Techniken mit fester Phase synthetisiert, werden, im allgemeinen nach dem Verfahren der US-PS 3 904 595.

Gegenstand der Erfindung ist daher ein Verfahren zur Herstellung der Peptide der obigen allgemeinen Formeln I und II, das dadurch gekennzeichnet ist, dass man einen Ester aus einer N"-geschützten Cys-Aminosäure und einem chlormethylierten Harz bildet, die Schutzgruppe der Cys-Aminosäure abspaltet und schrittweise Na- und Seitenketten-geschützte Aminosäuren an die Cys-Aminogruppe durch Aufbau von Peptid-bindungen unter Bildung eines an das Harz gebundenen Peptids der allgemeinen Formel III

(III)

in Form einer reaktiven Benzylchlorid-Bindung gebunden. Die Friedel-Crafts-Reaktion ist dabei zweckmässig so weit fortgesetzt worden, dass das Harz pro Gramm 0,5 bis 2 mMol Chlor enthält.

In der folgenden Beschreibung von praktischen Ausführungsformen der Synthese der Peptide werden die eingesetzten Reagenzien zunächst mit ihrem üblichen chemischen Namen bezeichnet, wobei die übliche Abkürzung dieser Materialien in Klammern angegeben ist. Im folgenden werden die Reagenzien nur noch durch ihre übliche Abkürzung angesprochen.

Gemäss der folgenden Festphasen-Herstellungsweise bereitet man ein Peptid der folgenden Struktur

Ri-Cys-Lys-R2-Phe-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-Cys-OH 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-Cys-OH

Ri-Cys-Lys-R2-Phe-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-Cys-Harz

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4

Ala-Gly-Cys-Lys-Asn-Phe-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-Cys-OH 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

Weitere, im folgenden beschriebene Peptide erhält man in ähnlicher Weise. s

Man bindet das tert.-Butyloxycarbonyl-S-p-methoxyben-zyl-derivat (Boc-SpOMe-Bzl) von Cys mit Hilfe von einer der drei folgenden bekannten Methoden an das Harz:

1. durch Erhitzen am Rückfluss in Äthanol in Gegenwart von Triäthylamin; io

2. man bewahrt das Caesiumsalz der Boc-geschützten Aminosäure über Nacht bei 50° C in Dimethylformamid (DMF)

auf;

3. man erhitzt das Kaliumsalz der Boc-geschützten Aminosäure in Dimethylsulfoxid (DMSO) während 2 Stunden auf 15 80° C.

Man verwendet nur 1 Milliäquivalent der geschützten Cys pro Milliäquivalent Chlor auf dem verwendeten Harz. Die Methode 3 sei im folgenden genauer erläutert:

Zu einer Aufschlämmung des Harzes und dem gelösten 20 und geschützten Cys in Dimethylsulfoxid gibt man 0,9 Milli-äquivalente Kalium-tert.-butylat (KOtBut) pro Milliäquivalent der Aminosäure. Man setzt die Reaktionsmischung möglichst wenig der Luft aus, so dass sie keine gelbe Färbung annimmt. Durch Umsetzen während 2 Stunden bei 80° C erhält man ein 2s für die Synthese der Peptide in geeigneter Weise substituiertes Harz (das etwa 0,2 Milliäquivalente des Aminosäurederivats pro Gramm des Harzes aufweist). Nach dem Abspalten der Schutzgruppe und dem Neutralisieren wird die Peptidkette auf dem Harz aufgebaut. Die Abspaltung der Schutzgruppe, die 30 Neutralisation und die Bindung einer jeden Aminosäure erfolgt gemäss dem Reaktionsschema I. Man verwendet jeweils das N"-tert.-Butyloxycarbonylderivat (Boc-Derivat) der Aminosäure, wobei man für den Alaninrest 1 irgendeine a-Amino-schutzgruppe verwenden kann (das Benzyloxycarbonylderivat (Z-Derivat); das Boc-Derivat und andere). Nach der Abspaltung der Schutzgruppe des ersten Restes (das heisst SpOMe-Bzl-Cys) (gemäss dem Reaktionsschema I) (einschliesslich der Schritte 3 bis 8) wird das Na-Boc-Derivat von Ser unter Verwendung von Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) als Kupplungsmittel angefügt (Stufe 9 des Reaktionsschemas I). Die Seitenkette von Ser wird mit Benzyläther (OBzl) geschützt. Die O-Benzylschutzgruppe (OBzl) wird auch zum Schutz des Threo-nins eingesetzt. Zur Aktivierung der Carboxylendgruppe von Asn benützt man den p-Nitrophenylester (ONp). Man kann zu diesem Zweck auch einen o-Nitrophenylester anwenden. Zum Schutz der Indol-Aminogruppe (N-H) kann man Formylgrup-pen benützen. Als Schutzgruppe für die Seitenkette von Lys verwendet man Benzyloxycarbonylgruppen (Z) oder 2-Chlor-benzyloxycarbonylgruppen [Z-(2-Cl)]. Die Na-Schutzgruppe der letzten an das Peptid gebundenen Aminosäure kann irgendeine Oxycarbonylgruppe sein, beispielsweise Boc oder Z. Wenn es sich bei der Gruppe Rx des Peptids um den Rest einer organischen Säure handelt, wird die organische Säure an das Peptid gebunden, bevor das Peptid von dem Harz abgespalten wird. Die organische Säure wird in der Weise an das an das Harz gebundene Peptid gebunden, dass man die organische Säure in Gegenwart von Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) einführt oder indem man das Anhydrid der organischen Säure oder einen aktiven Ester der organischen Säure verwendet. Die organische Säure kann auch dadurch eingeführt werden, dass man sie als N"-Schutzgruppe für die zuletzt gebundene Aminosäure benützt.

Reaktionsschema I zum Ankuppeln von von Asn verschiedenen Aminosäuren bei der Synthese in fester Phase (5 bis 10 g Harz)

Stufe Reagenzien und Verfahrensmassnahmen Misch zeiten (Min.)

1 Waschen mit 80 ml CH2C12 (zweimal) 3

2 Waschen mit 30 ml Methanol (MeOH) 3 (zweimal)

3 Waschen mit 80 ml CH2C12 (dreimal) 3

4 Umsetzen mit 50%iger Trifluoressigsäure (TFA), 10 die 5 % 1,2-Äthandithiol enthält, in 70 ml

CH2C12 (zweimal)

5 Waschen mit 80 ml CH2CI2 (zweimal) 3

6 Behandeln mit Triäthylamin (Et3N), 12,5% in 5 CH2C12 70 ml (zweimal)

7 Waschen mit 40 ml MeOH (zweimal) 2

8 Waschen mit 80 ml CH2Q2 (dreimal) 3

9 Umsetzen mit Boc-Aminosäure (10 mMol) 30 bis in 10 ml DMF (einmal) und 30 ml CH2C12 120 plus DCC (10 mMol) in CH2C12 (2 M)

10 Waschen mit 40 ml MeOH (zweimal) 3

11 Umsetzen mit 12,5 % Et3N in CH2C12 70 ml 3 (zweimal)

12 Waschen mit 30 ml MeOH (zweimal) 3

13 Waschen mit 80 ml CH2C12 (zweimal) 3

Nach dem Schritt 13 entnimmt man einen aliquoten Anteil und führt einen Ninhydrintest durch. Wenn dieser Test negativ ist, beginnt man erneut mit der Stufe 1 zum Ankuppeln der nächsten Aminosäure.

Wenn der Test positiv oder schwach positiv ist, führt man die Schritte 9 bis 13 erneut durch.

Das obige Reaktionsschema I wird für das Ankuppeln sämtlicher Aminosäuren des Peptids an Cys angewandt, mit Ausnahme von Asn, falls diese Aminosäure vorhanden ist. Für die Aminosäure Asn wendet man die Stufen 1 mit 8 in gleicher Weise an und führt die restliche Kupplungsreaktion gemäss dem folgenden Reaktionsschema II durch:

65

5

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Reaktionsschema II für das Kuppeln von Boc-Asn-ONp oder für andere aktive Ester gemäss der Synthese in fester Phase (5 bis 10 g Harz)

Stufe

Reagenzien und Verfahrensmassnahmen

Mischzeiten (Min.)

9

Waschen mit 60 ml DMF (dreimal)

3

10

Umsetzen mit Boc-Asn-ONp (15 mMol)

800

in 20 ml DMF (einmal)

11

Waschen mit 30 ml MeOH (viermal)

3

12

Umsetzen mit 12,5% Et3N in 30 ml DMF

3

(zweimal)

13

Waschen mit 30 ml MeOH (zweimal)

3

14

Waschen mit 80 ml CH2C12 (dreimal)

3

Nach der Stufe 14 wird ein aliquoter Anteil entnommen und einem Ninhydrintest unterzogen. Wenn der Test negativ ist, wird die nächste Aminosäure beginnend mit der Stufe 1 angekuppelt. Wenn der Test positiv oder schwach positiv ist, werden die Stufen 9 bis 14 wiederholt.

Das Abspalten der Peptide von dem Harz (5 g) und die Abspaltung der die Seitenketten des Peptids schützenden Schutzgruppen erfolgt vorzugsweise unter Verwendung von Fluorwasserstoffsäure (75 ml) in Gegenwart von Anisol (8 ml). Nach der Entfernung der Fluorwasserstoffsäure im Hochvakuum wird das Haiz-Peptid mit Äther gewaschen.

Das getrocknete Harz wird sofort mit 25 %iger Essigsäure (150 ml) eluiert und mit entgastem Wasser (N2) auf 3000 ml verdünnt. Der pH-Wert der Lösung wird mit NH4OH auf 6,6 bis 7,0 eingestellt. Man titriert die Lösung zwecks Oxydation zum Disulfid tropfenweise unter Rühren mit einer Kaliumfer-ricyanidlösung (1 g/500 ml H20), bis man eine permanente gelbe Färbung beobachtet. Man lässt die Lösung während 10 Minuten stehen, stellt den pH-Wert dann mit Eisessig auf 5,0 ein, gibt 10 bis 15 g eines Ionenaustauschers in der Chloridform [Bio Rad AG 3-X4A, Teilchengrösse = 0,074 mm bis 0,149 mm (100 bis 200 mesh)] zu der trüben Lösung und rührt während 15 Minuten. Man filtriert die Lösung über ein Filterhilfsmittel (Celite) und trägt sie nacheinander auf zwei Säulen auf, nämlich a) ein Ionenaustauscherharz in der Chloridform [Bio Rad AG 3-X4A (10 ml)] und b) ein Ionenaustauscherharz in der Kationenform [Bio Rex-70 (100 ml)]. Man wäscht das Filterhilfsmittel und den Harzkuchen gut mit 500 ml Wasser und trägt die Waschflüssigkeit auf die Säulen a und b auf. Das Peptidmaterial wird dann aus der Säule b (Bio Rex-70) mit einer Pyridin/Essigsäure/Wasser-Mischung (30/4/66) oder mit 50%iger Essigsäure ausgewaschen. Man fängt Fraktionen auf, wobei man lediglich die das Peptid enthaltenden (mit einer positiven Ninhydrin-Reaktion) Fraktionen mit Wasser verdünnt und sofort gefriertrocknet. Man erhält 1,2 g eines rohen, cremefarbenen Materials. Man trägt es auf eine mit einem vernetzten Dextrangel (Sephadex G-25 F) gefüllte Säule (3 x 200 cm) auf, die mit 2n-Essigsäure äquilibriert worden ist und eluiert wird.

Das bei 280 nm untersuchte Elutionsmuster zeigt einen symmetrischen Hauptpeak mit einem Zentrum bei 2 V„ (260 mg). Das Material wird anschliessend auf eine 1,8 x 100 cm Verteilungssäule aufgebracht und mit einer n-Butanol/Essig-säure/Wasser-Mischung (4/1/5) eluiert. Das Elutionsmuster (280 nm) zeigt eine Hauptbande bei V0 von 2,5 bis 4,0. Man bereitet zwei Schnitte, die sich anschliessend auf dem Dünn-schichtchromatogramm als identisch erweisen (165 mg) (Reinheit etwa 80%). Dieses Material (150 mg) wird in einer 0,1m Ammoniumacetatlösung mit einem pH-Wert von 7,0 auf eine mit Carboxymethylcellulose beschickte Säule (4,5 x 1 cm; 5 ml) aufgebracht und mit einer 0,2m Ammoniumacetatlösung mit einem pH-Wert von 7,0 eluiert. Die Reinigung über die Carboxymethylcellulose beseitigt die Verunreinigungen, die man häufig bei synthetischen Peptiden in Form von «Schwänzen» auf dem Dünnschichtchromatogramm beobachtet. Das gewünschte Produkt, das sich als sehr enge Bande eluieren lässt, ergibt nach dem zweimaligen Gefriertrocknen ein weisses, flockiges Pulver (115 mg). Wenn man das Material auf mit Siliciumdioxidgel beschichtet Platten (Eastman 6061) aufträgt und mit einer oberen Phase aus einer Butanol/Essigsäu-re/Wasser-Mischung (4/1/5) eluiert, so lässt sich eine geringe Menge einer Verunreinigung (weniger als 5 %) feststellen, die sich vor der D-Trp8-Somatostatin-Front befindet. Man trägt dieses Material (100 mg) daher auf eine Verteilungssäule (1,8 x 100 cm) auf. Das Elutionsmuster (280 nm) zeigt ein Peak mit einem Zentrum bei 3,3 Vc, worauf man nach dem Gefriertrocknen 65 mg eines homogenen Materials erhält.

Der spezifische optische Drehwert ([a]D23 = —47,3 ± 0,5, c = 1 in 1 %iger Essigsäure) unterscheidet sich erheblich von dem unter gleichen Bedingungen gemessenen Wert von Somatostatin ([a]D23 — -33 ± 0,5). Das Peptid ist um den Faktor 8 wirksamer als Somatostatin, wenn man das Material zur Inhibierung der Freisetzung des Wachstumshormons durch gezüchtete Hypophysenzellen oder zur Inhibierung der durch Arginin induzierten Freisetzung von Insulin und Glucagon durch die Bauchspeicheldrüse verwendet.

Man kann bei der Synthese in fester Phase aktive Ester einsetzen und man kann auch die klassischen Synthesemethoden zur Herstellung der neuen Peptide anwenden.

Es wurde eine in vitro-Bestimmung der Wirksamkeit der Somatostatin-Peptide auf die Inhibierung der Freisetzung des Wachstumshormons entwickelt. Die Untersuchung besteht darin, dass man die Hypophysen von Ratten entnimmt und daraus getrennte Zellen abtrennt. Die Zellen werden in Kulturschalen in dem von Dulbecco modifizierten Eagle-Medium gezüchtet [Dulbecco et al., Virology, Vol. 8 (1949) 396]. Man versorgt die Zellkulturen, die während 4 bis 5 Tagen vor der Untersuchung bei 37° C gehalten werden, mit Kohlendioxidgas und mit Sauerstoff. Dann ändert man die Medien, inkubiert die Zellkulturen während 4 Stunden und gibt die zu bestimmenden Somatostatin-Peptide zu. Zur Bestimmung der Geschwindigkeit der Sekretion des Wachstumshormons wendet man Radioimmunoassay-Analysenmethoden an, wobei die Geschwindigkeit der Hormonsekretion in Nanogramm (ng) pro Stunde angegeben ist.

Die erfindungsgemäss erhaltenen Peptide inhibieren die Basalsekretion und die stimulierte Sekretion von Insulin und Glucagon bei Säugern, einschliesslich Menschen, Hunden und Affen. Die Peptide inhibieren auch in vitro die Freisetzung von Insulin und Glucagon durch die perfundierte Bauchspeicheldrüse der Ratte, durch isolierte Inselzellen und durch Primärkulturen von enzymatisch dispergierten Pankreaszellen. Es wird angenommen, dass die Peptide bei der Inhibierung der Insulin- und Glucagon-Freisetzung eine direkte Wirkung auf die a- und/3-Zellen der Bauchspeicheldrüse ausüben.

Eine Untersuchung der Wirkung von Somatostatin, Dihy-drosomatostatin (die als Vergleichsverbindungen eingesetzt werden) und der erfindungsgemäss hergestellten Peptide auf die Inhibierung der Freisetzung von Glucagon und Insulin wurde wie folgt durchgeführt; Bei sämtlichen Untersuchungen benützt man männliche Ratten (Sprague-Dawley) mit einem Gewicht von 180 bis 220 g, die in Käfigen mit gesteuerter Temperatur und gesteuerter Feuchtigkeit gehalten werden, wobei sie 14 Stunden im Hellen (7.00 bis 21.00 Uhr) und 10 Stunden im Dunkeln gehalten werden. Die Tiere werden ad libitum mit Wasser versorgt. Die Untersuchungen werden während mindestens 5 Tagen nach der Lieferung der Tiere von dem Lieferanten zwischen 14.00 und 16.00 Uhr durchgeführt. Nach einer Betäubung mit Äther werden die Peptide

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15

20

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30

35

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60

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oder eine Salzlösung in einem Volumen von 0,2 ml über die äussere Halsvene verabreicht, worauf man sofort eine grosse 1-ml-Pille Arginin gibt. 5 Minuten später entnimmt man das Rumpfblut durch schnelles Abtrennen der Köpfe. Dann bestimmt man den Insulin- und den Glucagon-Gehalt des Pias- s mas durch spezifischen Radioimmunoassay. Die Wirkung in bezug auf Somatostation (100%) wird durch biologische Untersuchung ermittelt (four and six point bioassays).

Wenn man Arginin in einer Dosis von 100 mg/100 g des Körpergewichts verabreicht, so wird die Freisetzung von Insulin und Glucagon signifikant erhöht. Somatostatin und Dihy-drosomatostatin inhibieren die durch Arginin induzierte Freisetzung von Insulin und Glucagon in einer von der Dosis abhängigen etwa gleich starken Weise (wobei diese Mittel jeweils in einer Dosis von 100^g/100 g des Körpergewichts verabreicht werden).

Mit Hilfe der oben beschriebenen Methode unter Anwendung der festen Phase wurden die in der folgenden Tabelle I angegebenen Peptide hergestellt. Die Zusammensetzung der Peptide ist in der folgenden Tabelle I angegeben.

10

Tabelle I Peptid Kontrolle (Somatostatin)

Erfindungsgemäss erhaltene Peptide Die im folgenden angegebenen Peptide sind verbrückt und entsprechen der folgenden allgemeinen Formel I

Ri-Cys-Lys-R2-Phe-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-Cys-OH (I)

Ri

R2

Ri

R2

1

H-Ala-Gly

Asn

9

H-Gly-Gly-Gly-Ala-Gly

Asn

2

H-Ala-D-Ala

Ala

10

H-Gly-Gly-Gly-Ala-Gly

Ala

3

H-Ala-Gly

Asn

11

H-Gly-Gly-Gly-Ala-Ala

Ala

4

H-Ala

Ala

12

H-Gly-Gly-Gly-Ala-Ala

Asn

5

H-Ala-Gly

Ala

13

H-Gly-GIy-Gly-AIa-D-Ala

Asn

6

Des-Ala-Gly

Ala

14

H-Gly-Gly-Gly-Ala-D-Ala

Ala

7

H-AIa-D-Ala

Asn

15

H-Ala-Gly

Des-Asn

8

H-Tyr-Gly

Asn

Die Wirkung von Somatostatin (Vergleichssubstanz) und der erfindungsgemäss erhaltenen Peptide auf die Inhibierung der Sekretion des Wachstumshormons wurde mit Hilfe des oben beschriebenen in vitro-Tests untersucht. Jedes der in der obigen Tabelle I angegebenen Peptide hat sich in bezug auf die Inhibierung der Sekretion des Wachstumshormons um den Faktor 8 bis 10 wirksamer erwiesen als die Vergleichsverbindung Somatostatin. Weiterhin sind die relativen Wirkungen der in der obigen Tabelle I angegebenen neuen Verbindungen auf die Inhibierung der durch Arginin induzierten Sekretion von Glucagon und Insulin untersucht worden. Es hat sich gezeigt, dass die erfindungsgemäss hergestellten Peptide eine um den Faktor 8 bis 10 stärkere Wirkung in bezug auf die Inhibierung der durch Arginin induzierten Sekretion von Glucagon und Insulin ausüben als die Vergleichsverbindung Somatostatin.

Es wurde eine Reihe anderer erfindungsgemäss erhaltener Peptide mit ähnlicher Struktur wie den in der obigen Tabelle I angegebenen hergestellt, mit dem Unterschied, dass die Aminosäure Phe in der 7-Stellung und/oder der 11-Stellung durch Tyr ersetzt wurde. Diese Tyr-substituierten Peptide entfalten ebenso eine inhibierende Wirkung auf die Sekretion des Wachstumshormons, des Glucagons und des Insulins, die in bezug auf die Wirkung der Vergleichssubstanz Somatostatin mindestens um den Faktor 8 grösser ist.

Es wurden auch die geradkettigen Gegenstücke dei: neuen Peptide, die in der Tabelle I angegeben sind, hergestellt. Diese geradkettigen Peptide besitzen ebenfalls eine inhibierende Wirkung auf die Sekretion des Wachstumshormons, des Glucagons und des Insulins, die mindestens um den Faktor 8 grösser ist wie die der Vergleichssubstanz Somatostatin.

Die relativen Wirkungen (Somatostatin = 100%) einer Reihe von neuen Peptiden in bezug auf die Inhibierung der Sekretion des Wachstumshormons und die Inhibierung der durch Arginin induzierten Sekretion von Insulin und Glucagon sind in der folgenden Tabelle II zusammengestellt.

Tabelle II

Relative Wirkung von Somatostatin (SRIF) und substituiertem

Somatostatin in bezug auf die in vitro-Freisetzung des Wachstumshormons aus freigelegten Hypophysenzellen und auf die in vivo-Inhibierung der durch Arginin induzierten Sekretion von Insulin und Glucagon. Für die in vivo-Untersuchungen wurden die Peptide unmittelbar vor der Injektion des Arginins (100 mg/100 g des Körpergewichts) in die Halsvene injiziert

Peptide Wachstums- Insulin Glucagon hormon

100 100 100

190 135 279

103 227 240

130 132

1 <10

3 <10 <0,5 <10

25 14

2 <10

4 26 -

6 27 -

45

SRIF Ala2SRIF D-Ala2SREF Ala5SRIF so AIa6SRIF Ala7SRIF AIa8SRIF Ala10SRIF AlanSRIF 65 Ala12SRIF Ala13SRIF

s

Claims

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2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass Ri für Gly, Ala, Ala-Gly, Acetyl-Ala-Gly, Des-Ala-Gly-Des-amino Cys, Tyr-Gly, Sarc-Gly, Tyr-Ala-Gly, Ala-Tyr-Gly, Gly-Gly-Gly-Ala-Gly, Gly-Gly-Gly-Ala-Ala, Gly-Gly-Gly-Ala-D-Ala, Acetyl, Acryl, Pivalyl oder Benzoyl steht.

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PATENTANSPRÜCHE 1. Verfahren zur Herstellung von Peptiden der Formel

R1-Cys-Lys-R2-Phe-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-Cys-OH 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

(II)

worin

Ri eine von Aminosäuren, Dipeptiden, Tripeptiden, Pen-tapeptiden oder eine von aliphatischen, aromatischen oder ali-cyclischen organischen Säuren mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen abgeleitete Acylgruppe, ein Wasserstoffatom oder eine Gruppe Des-Ri und

R2 Ala, Asn oder eine Gruppe Des-R2 bedeuten, wobei die in den 7- und 11-Stellungen sitzenden Reste Phe einzeln oder beide durch Tyr ersetzt und darüber hinaus beliebige Aminosäurereste der Peptide durch Ala ersetzt sein können, dadurch gekennzeichnet, dass man einen Ester aus einer N™-geschützten Cys-Aminosäure und einem chlor-

10 methylierten Harz bildet, die Schutzgruppe der Cys-Amino-säure abspaltet und schrittweise Na- und Seitenketten-geschützte Aminosäuren an die Cys-Aminosäure durch Aufbau von Peptidbindungen unter Bildung eines an das Harz gebundenen Peptids der Formel

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Ri-Cys-Lys-R2-Phe-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-Cys-Haiz

(III)

ankuppelt, in der Ri und R2 die oben angebenen Bedeutungen besitzen; und dass man dann sämtliche noch verbliebenen Schutzgruppen sowie das Harz abspaltet.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass R2 für Ala steht.
4. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass R2 für Asn steht.
5. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass R2 für D-Ala steht.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1, 3,4 und 5, dadurch gekennzeichnet, dass Rt für Ala-Gly steht.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1, 3, 4 und 5, dadurch gekennzeichnet, dass Ra für Acryl steht.

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8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1, 3, 4 und 5, dadurch gekennzeichnet, dass sämtliche an Cys gebundenen Gruppen Ala in Form des D-Isomeren vorliegen.
9. Verfahren zur Herstellung von Peptiden der Formel II, worin jedoch die beiden Cys-Reste 3 und 14 durch eine Disul-

25 fidbrücke miteinander verbunden sind und Ri und R2 die angegebenen Bedeutungen haben, mit der Massgabe, dass Rx nicht die Bedeutung Ala-Gly hat, wenn R2 Asn bedeutet, dadurch gekennzeichnet, dass man das Verfahren gemäss Patentanspruch 1 durchführt und dann durch Oxydation die Disul-

30 fidbrücke herstellt.
10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass man als Oxydationsmittel K3[Fe(CN)6] verwendet.