CH618959A5 - - Google Patents

Description

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PATENTANSPRÜCHE

1. Verfahren zur Herstellung von neuen Polypeptiden der allgemeinen Formel

R1-Arg-R2-Phe-Phe-R3, (I)

worin R] Wasserstoff oder einen basischen oder neutralen Aminosäurerest und R2 einen neutralen Aminosäurerest bedeuten und R3 NH2, Tyr—NH2 oder ein Rest von aus 1 bis 5 Aminosäureresten bestehendem Tyrosylpeptid oder ein Rest eines Ami-des eines solchen Tyrosylpeptides ist, vorausgesetzt, dass, wenn R, Wasserstoff ist, R2 Pro bedeutet, dadurch gekennzeichnet, dass (a) eine dem Rest R, entsprechende Aminosäure oder-wenn Rt Wasserstoff bedeutet - Arginin oder ein Peptidfrag-ment des Polypeptids der allgemeinen Formel I, welches den mit Rj bezeichneten Aminosäurerest oder - wenn Rj Wasserstoff bedeutet — eine Arginylgruppe als N-endständige Aminosäure aufweist, mit dem verbleibenden Fragment des Polypeptids der Formel I oder (b) ein Polypeptid der Formel:

R !-Arg—R2—Phe-Phe-R ' 3 (II)

worin Rj und R2 wie oben definiert sind und R'3 für—OH oder -Tyr-OH steht, mit Ammoniak kondensiert wird, wobei die nicht für die Teilnahme an der beabsichtigten Kondensation bestimmten Amino- oder Carboxylgruppen der Ausgangsmaterialien geschützt und die für die Teilnahme an der beabsichtigten Kondensation bestimmten Amino- oder Carboxylgruppen aktiviert werden können und die gegebenenfalls vorhandenen Schutzgruppen aus dem entstandenen Produkt entfernt werden.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass eine Verbindung der allgemeinen Formel I hergestellt wird, worin R, den Rest einer basischen oder neutralen Aminosäure, die eine andere ist als eine neutrale a-Aminosäure, R2 Gly und R3 NH2 oder Tyr-NHZ bedeuten.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass eine Verbindung der allgemeinen Formel I hergestellt wird, worin R2 einen neutralen Aminosäurerest mit mindestens 3 C-Atomen bedeutet.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass eine Verbindung der allgemeinen Formel I hergestellt wird, worin R! einen basischen oder neutralen Aminosäurerest mit bis zu 10 C-Atomen und R2 einen neutralen Aminosäurerest mit bis zu 10 C-Atomen bedeuten.

5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass eine Verbindung der allgemeinen Formel

Rj—L—Arg—R2-L—Phe—L-Phe—R3, I'

hergestellt wird, worin Rt Wasserstoff oder einen basischen oder neutralen Aminosäurerest, R2 einen neutralen L-Aminosäurerest und R3 NH2, L-Tyr-NH2, den Rest eines L-Tyrosyl-peptides mit 1 bis 5 L-Aminosäureresten oder den Rest eines Amides des L-Tyrosylpeptides bedeutet, mit der Massgabe, dass, wenn Rj Wasserstoff bedeutet, R2 für L-Pro steht.

6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass eine Verbindung der allgemeinen Formel I hergestellt wird, worin alle Aminosäurereste, die die Polypeptide I aufbauen, in der L-Konfiguration vorliegen.

7. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass eine Verbindung der allgemeinen Formel I' hergestellt wird, worin die Aminosäurereste R! in der D-Konfiguration vorliegen.

8. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass eine Verbindung der allgemeinen Formel I hergestellt wird, worin Rj ß-Ala bedeutet.

9. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,

dass eine Verbindung der allgemeinen Formel I hergestellt wird, worin R2 Gly bedeutet.

10. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass eine Verbindung der allgemeinen Formel I hergestellt wird, worin R2 Pro bedeutet.

11. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass eine Verbindung der allgemeinen Formel I' hergestellt wird, worin R2 L-Pro bedeutet.

12. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass eine Verbindung der allgemeinen Formel I hergestellt wird, worin R3 NH2 bedeutet.

13. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass eine Verbindung der allgemeinen Formel I hergestellt wird, worin R3 Tyr-NH2 bedeutet.

14. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass eine Verbindung der allgemeinen Formel I' hergestellt wird, worin R3 L-Tyr-NH2 bedeutet.

15. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass eine Verbindung der allgemeinen Formel I hergestellt wird, worin R2 Gly und R3 Tyr-Nh2 bedeuten.

16. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass eine Verbindung der allgemeinen Formel I' hergestellt worin R2 Gly und R3 Tyr-NH2 bedeuten.

17. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass eine Verbindung der allgemeinen Formel I hergestellt wird, worin R2 Pro und R3 Tyr-NH2 bedeuten.

18. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass eine Verbindung der allgemeinen Formel I' hergestellt wird, worin R2 L-Pro und R3 L-Tyr-NH2 bedeuten.

19. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass eine Verbindung der allgemeinen Formel I hergestellt wird, worin R, ß-Ala und R2 Gly bedeuten.

20. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass eine Verbindung der allgemeinen Formel I hergestellt wird, worin R, ß-Ala und R2 Pro bedeuten.

21. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass eine Verbindung der allgemeinen Formel I' hergestellt wird, worin R! ß-Ala und R2 L-Pro bedeuten.

22. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass eine Verbindung der allgemeinen Formel I hergestellt wird, worin Rt ß-Ala und R3 NH2 bedeuten.

23. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass eine Verbindung der allgemeinen Formel I hergestellt wird, worin Rj ß-Ala und R3 Tyr-NH2 bedeuten.

24. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass eine Verbindung der allgemeinen Formel I' hergestellt wird, worin Rj ß-Ala und R3 L-Tyr-NH2 bedeuten.

25. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass L-Arg-L-Pro-L-Phe-L-Phe-L-Tyr-NH2 hergestellt wird.

26. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass Gly-L-Arg-L-Pro-L-Phe-L-Phe-L-Tyr-NH2 hergestellt wird.

27. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass y-Abu-L-Arg-L-Pro-L-Phe-L-Phe-L-Tyr-NH2 hergestellt wird.

28. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass e-Acap-L-Arg-L-Pro-L-Phe-L-Phe-L-Tyr-NH2 hergestellt wird.

29. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass L-Lys-L-Arg-L-Pro-L-Phe-L-Phe-L-Tyr-NH2 hergestellt wird.

30. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass L-a, y-Dab-L-Arg-L-Pro-L-Phe-L-Phe-L-Tyr-NH2 hergestellt wird.

31. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass ß-Ala-L-Arg-L-Pro-L-Phe-L-Phe-L-Tyr-NH2 hergestellt wird.

32. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass ß-Ala-L-Arg-L-Pro-L-Phe-L-Phe-NH2 hergestellt wird.

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33. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass ß-Ala-L-Arg-ß-Ala-L-Phe-L-Phe-L-Tyr-NH2 hergestellt wird.

34. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass L-Ala-L-Arg-ß-Ala-L-Phe-L-Phe-L-Tyr-NH2 hergestellt wird.

35. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass ß-Ala-L-Arg-Sar-L-Phe-L-Phe-L-Tyr-NH2 hergestellt wird.

36. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass L-Leu-L-Arg-L-Pro-L-Phe-L-Phe-L-Tyr-NH2 hergestellt wird.

37. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,

dass ß-Ala-L-Arg-L-Phe-L-Phe-L-Phe-L-Tyr-NHz hergestellt wird.

38. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass ß-AIa-L-Arg-L-Leu-L-Phe-L-Phe-L-Tyr-Gly-NH2 hergestellt wird.

39. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass ß-Ala-L-Arg-L-Ser-L-Phe-L-Phe-L-Tyr-Gly-NH2 hergestellt wird.

40. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass ß-Ala-L-Arg-L-Pro-L-Phe-L-Phe-L-Tyr-L-Thr-L-Pro-L-Lys-L-Ala hergestellt wird.

41. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass ß-Ala-L-Arg-Gly-L-Phe-L-Phe-L-Tyr-L-Leu hergestellt wird.

42. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass ß-Ala-L-Arg-Gly-L-Phe-L-Phe-L-Tyr-L-Ala-NH2 hergestellt wird.

43. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass ß-Ala-L-Arg-Gly-L-Phe-L-Phe-L-Tyr-L-Thr-L-Pro hergestellt wird.

44. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass e-Acap-L-Arg-Gly-L-Phe-L-Phe-L-Tyr-L-Thr-L-Pro hergestellt wird.

45. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass L-Lys-L-Arg-Gly-L-Phe-L-Phe-L-Tyr-L-Tyr-L-Pro hergestellt wird.

46. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass ß-Ala-L-Arg-Gly-L-Phe-L-Phe-L-Tyr-L-Thr-L-Pro-L-Lys-L-Ala hergestellt wird.

47. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass Gly-L-Arg-Gly-L-Phe-L-Phe-L-Tyr-L-Thr-L-Pro-L-Lys-L-Ala hergestellt wird.

48. Verfahren nachAnspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass L-Leu-L-Arg-Gly-L-Phe-L-Phe-L-Tyr-Gly-NH2 hergestellt wird.

49. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass ß-Ala-L-Arg-Gly-L-Phe-L-Phe-L-Tyr-L-Ala-Gly-NH2 hergestellt wird.

50. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass L-a, y-Dab-L-Arg-Gly-L-Phe-L-Phe-L-Tyr-L-Ala-Gly-NH2 hergestellt wird.

51. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass Gly-L-Arg-Gly-L-Phe-L-Phe-NH2 hergestellt wird.

52. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass D-Ala-L-Arg-Gly-L-Phe-L-Phe-NH2 hergestellt wird.

53. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass L-Phe-L-Arg-Gly-L-Phe-L-Phe-NH2 hergestellt wird.

54. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass L-Leu-L-Arg-Gly-L-Phe-L-Phe-L-Tyr-NH2 hergestellt wird.

55. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass L-a-Abu-L-Arg-Gly-L-Phe-L-Phe-L-Tyr-NH2 hergestellt wird.

56. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass L-Nle-L-Arg-Gly-L-Phe-L-Phe-L-Tyr-NH2 hergestellt wird.

57. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, s dass L-Val-L-Arg-GIy-L-Phe-L-Phe-L-Tyr-NH2 hergestellt wird.

58. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass ß-Ala-L-Arg-Gly-L-Phe-L-Phe-NH2 hergestellt wird.

59. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,

H, dass Y-Abu-L-Arg-Gly-L-Phe-L-Phe-NH2 hergestellt wird.

60. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass Ö-Aval-L-Arg-Gly-L-Phe-L-Phe-NH2 hergestellt wird.

61. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass e-Acap-L-Arg-Gly-L-Phe-L-Phe-NH2 hergestellt wird.

i s 62. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass L-Lys-L-Arg-Gly-L-Phe-L-Phe-NH2 hergestellt wird.

63. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass L-a, y-Dab-L-Arg-Gly-L-Phe-L-Phe-NH2 hergestellt wird.

2o 64. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass L-Arg-L-Arg-Gly-L-Phe-L-Phe-NH2 hergestellt wird.

65. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass ß-Ala-L-Arg-Gly-L-Phe-L-Phe-L-Tyr-NH2 hergestellt wird.

66. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass y-Abu-L-Arg-Gly-L-Phe-L-Phe-L-Tyr-NH2 hergestellt wird.

67. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass e-Acap-L-Arg-GIy-L-Phe-L-Phe-L-Tyr-NH2 hergestellt m wird.

68. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass L-Lys-L-Arg-Gly-L-Phe-L-Phe-L-Tyr-NH2 hergestellt wird.

69. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass L-a, y-Dab-L-Arg-Gly-L-Phe-L-Phe-L-Tyr-NH2 hergestellt wird.

,40 Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung neuer Polypeptide der allgemeinen Formel:

R,-Arg-R2-Phe-Phe-R3 (I)

45 worin Ri Wasserstoff oder einen basischen oder neutralen Aminosäurerest und R2 einen neutralen Aminosäurerest bedeuten und R3 NH2, Tyr-NH2 oder ein Rest von aus 1 bis 5 Aminosäureresten bestehendem Tyrosylpeptid oder ein Rest eines Ami-des eines solchen Tyrosylpeptids ist, vorausgesetzt, dass, wenn 5„ Ri Wasserstoff ist, R2 Pro bedeutet.

Vor dem Prioritätsdatum des vorliegenden Patentes wurde berichtet, dass die Polypeptide Arg-Gly-Phe-Phe-NH2 oder Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-NH2 eine schwache erhöhende Wirkung auf die Glucoseaufnahme haben, wenn diese mittels des 55 Zwerchfells von Mäusen getestet wird [Hoppe-Seilers Z. Phy-' siol. Chem. 352,1735 (1971) und 354, 321 (1973)]. Diese bekannten Polypeptide sind aber in vivo praktisch unwirksam. Die erfindungsgemäss hergestellten neuen Polypeptide der Formel (I) können hingegen wirksam zur Behandlung der Insuffi-Mi zienz des Kohlenhydratstoffwechsels und des Lipidstoffwechsels verwendet werden.

Die Polypeptide der allgemeinen Formel (I) werden wirksam für die Behandlung von Insuffizienzen im Kohlehydrat- und Lipidstoffwechsel, insbesondere für die Behandlung von Diabete tes mellitus verwendet.

In der vorliegenden Beschreibung und den Patentansprüchen werden Abkürzungen für die Bezeichnung der Aminosäuren, Peptide und deren aktivierenden oder Schutz-Gruppen und

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die aktivierenden oder Schutzmittel für die Aminosäuren oder Peptide verwendet, wie sie den Bestimmungen der IUPAC-IUB Commission on Biological Nomenclature entspechen oder nach dem Stand der Technik allgemein üblich sind. Nachstehend werden die Beispiele für Abkürzungen angeführt:

a-Abu:

a-Aminobuttersäure y-Abu:

y-Aminobuttersäure e-Acap:

e-Aminocapronsäure

Ala:

Alanin

ß-AIa:

ß-Alanin

Arg:

Arginin

ô-Aval:

ö-Aminovaleriansäure a, y-Dab:

a, y-Diaminobuttersäure

Gly:

Glycin

His:

Histidin

Leu:

Leucin

Lys:

Lysin

Nie:

Norleucin

Phe:

Phenylalanin

Pro:

Prolin

Sar:

Sarcosin

Ser:

Serin

Thr:

Threonin

Val:

Valin

Aoc:

tert.-Amyloxycarbonyl

Bzl:

Benzyläther

DCC:

N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid

HONB:

N-Hydroxy-5-norbornen-2,3-dicarboximid

Tyr:

Tyrosin

OBzl:

Benzylester

ODNP:

2,4-Dinitrophenylester

OEt:

Äthylester

ONB:

HONBester

Opcp:

Pentachlorphenylester

Osu:

N-Hydroxysuccinimidester

OtBu:

tert.-Butylester

Tos:

Tosyl

Z:

Benzyloxycarbonyl

In der vorliegenden Beschreibung und in den Patentansprüchen bedeuten in jenen Fällen, wo optische Isomere der Aminosäuren vorkommen, die Aminosäuren jedes einzelne der optischen Isomere oder jede razemische Verbindung, wenn nicht ausdrücklich anderes ausgeführt ist. Wenn Wasserstoff ist, bedeutet die Gruppe RrArg folgende Arginylgruppe:

h2Nx

\C-NH-(CH2)3-C H-CO-I

nh2

Unter dem Ausdruck «Aminosäurerest» ist bekanntlich eine Gruppe zu verstehen, welche Peptidbindungen bilden kann, d.h. eine Aminosäuregruppe, welcher entweder eines oder beide Wasserstoffatome ihrer Amino- oder Iminogruppe bzw. die Hydroxylgruppe ihrer Carboxylgruppe entzogen wurden.

Die basischen oder neutralen Aminosäuren, deren Reste mit Rt bezeichnet sind, weisen vorzugsweise 2 bis 10 C-Atome auf. Beispiele für basische Aminosäure, sind a-Aminosäuren, wie z.B. a,ß-Diaminopropionsäure, a,y-Diaminobuttersäure, Arginin, Lysin oder Histidin. Beispiele für neutrale Aminosäuren sind a-Aminosäuren, wie Glycin, Alanin, Serin, Threonin, a-Aminobuttersäure, Prolin, Leucin, Isoleucin, Norleucin, Phenylalanin und Tyrosin, und andere Aminosäuren, wie z.B. ß-Alanin, y-Aminobuttersäure, ö-Aminovaleriansäure und e-Aminocapronsäure. Wenn optische Isomere der Aminosäuren,

deren Reste mit R, bezeichnet sind, vorliegen, so können die Aminosäuren jedes einzelne der optischen Isomere oder jegliche razemische Verbindung bedeuten. Unter den Aminosäuren, deren Reste mit R, bezeichnet sind, wird ß-Alanin für den s beabsichtigten Zweck bevorzugt.

Die neutralen Aminosäuren, deren Reste mit R2 bezeichnet sind, weisen vorzugsweise 2 bis 10 C-Atome auf; Beispiele dafür sind Glycin, Alanin, ß-Alanin, Sarcosin, Serin, Prolin, Valin, Leucin, Isoleucin, Phenylalanin und Tyrosin.

, „ Unter den Aminosäuren, deren Reste mit R2 bezeichnet sind, werden Glycin und Prolin für die erfindungsgemässe Verwendung bevorzugt. Bedeutet R2 einen Prolinrest, so wird der beabsichtigte Zweck erreicht, wenn Rt Wasserstoff ist.

Die Aminosäuren, welche die Tyrosylpeptide oder deren i, Amide aufbauen können, weisen vorzugsweise 2 bis 10 C-Atome auf ; Beispiele hiefür sind Glycin, Alanin, Serin, Threonin, Valin, Prolin, Leucin, Isoleucin, Lysin, Phenylalanin und Tyrosin. Diese Aminosäuren können in jeder beliebigen Reihenfolge aneinandergefügt sein, um die aus 1 bis 5 Aminosäure-2,1 resten bestehenden Tyrosylpeptide oder deren Amide zu bilden. Nachstehend werden Beispiele für derartige Tyrosylpeptide angeführt, deren entsprechende Amide als Tyrosylpeptidamide bezeichnet werden können.

1) Tyr-Gly-OH

2) Tyr-Ala-CIy-OH

3) Tyr-Leu-Ala-Gly-OH

4) Tyr-Leu-Gly-Val-Ala-OH

5) Tyr-Thr-Pro-Ser-Phe-OH

6) Tyr-Thr-Pro-Lys-Ala-OH

7) Tyr-Thr-Pro-Lys-Thr-OH

8) Tyr-Ser-Pro-Arg-Gly-OH

9) Tyr-Pro-Ile-OH

10) Tyr-Leu-Leu-Leu-OH

11) Tyr-Gly-Gly-Gly-Gly-OH " 12) Tyr- Ala- Ala-Ala- Ala-OH

13) Tyr-Thr-Pro-Lys-OH

Unter den angeführten Aminosäuren und Tyrosylpeptiden und deren Amiden wird Tyr-NH2 für die industrielle Herstel-

411 1 u lung bevorzugt.

Bei den mit R2 bezeichneten oder die Gruppe R3 aufbauenden Aminosäuren können in jenen Fällen, wo optische Isomere vorhanden sind, die Aminosäuren jedes einzelne der optischen Isomere und jedes mögliche rezemische Gemisch bedeuten. 45 Von den Aminosäureresten, welche die Polypeptide der Formel I aufbauen, sind mit Ausnahme der mit Rt bezeichneten in jenen Fällen, wo optische Isomere vorliegen, die L-Aminosäurereste wegen ihrer geringeren Toxizität zu bevorzugen.

Nach dem erfindungsgemässen Verfahren werden die Poly-5(1 peptide der Formel I hergestellt, indem (a) eine dem Rest Rt entsprechende Aminosäure oder-wenn Rx Wasserstoff bedeutet - Arginin oder ein Peptidfragment des Polypeptids der allgemeinen Formel (I), welches den mit R[ bezeichneten Aminosäurerest oder - wenn Rj Wasserstoff bedeutet - eine Argi-55 nylgruppe als N-endständige Aminosäure aufweist, mit dem verbleibenden Fragment des Polypeptids der Formel I oder (b) ein Polypeptid der Formel :

R1-Arg-R2-Phe-Phe und -R'3 (II)

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worin Ri und R2 wie oben definiert sind und R 3 für -OH oder -Tyr-OH steht, mit Ammoniak kondensiert wird, wobei die nicht für die Teilnahme an der beabsichtigten Kondensation bestimmten Amino- oder Carboxylgruppen der Ausgangsmate-65 rialien geschützt und die für die Teilnahme an der beabsichtigten Kondensation bestimmten Amino- oder Carboxylgruppen aktiviert werden können und die gegebenenfalls vorhandenen Schutzgruppen aus dem entstandenen Produkt entfernt werden.

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Die erfindungsgemässe Kondensation kann auch an sich bekannten und herkömmlichen Kondensationsverfahren zur Bildung von Peptidbindungen durchgeführt werden.

Die erfindungsgemässe Kondensation kann an jeder beliebigen Stelle der Bindungen in den Polypeptiden der Formel I durchgeführt werden, um die beabsichtigten Peptid- oder Amidbindungen zu erhalten. Für die industrielle Herstellung der Polypeptide der Formel I ist eine Kondensation zwischen der R2 entsprechenden, dritten Aminosäurekomponente und der Phenylalanin entsprechenden, vierten Aminosäurekomponente vorzuziehen.

Die Ausgangsmaterialien für das erfindungsgemässe Verfahren können, soweit sie Polypeptide sind, wie die bekannten Polypeptidverbindungen aus Aminosäurematerialien, welche Bestandteile der herzustellenden Polypeptide sind, durch wiederholte Kondensationsreaktionen hergestellt werden. Im allgemeinen besteht der letzte Verfahrensschritt in der Kondensation zwischen zwei Komponenten, d.h. entweder einem Peptid und einer endständigen Aminosäure oder zwei Peptiden oder einem Peptid der Formel II und Ammoniak. Die Ausgangsstoffe können nach jedem beliebigen, an sich bekannten Peptidherstel-lungsverfahren gewonnen werden.

Beispiele für Ausgangsstoffe in dem erfindungsgemässen Verfahren sind die N-endständigen Aminosäuren der Polypeptide der Formel I als solche und Peptidfragmente, welche die N-endständigen Aminosäuren enthalten, an welche die einzelnen Aminosäuren der Reihe nach entsprechend der Aminosäuresequenz der Polypeptide der Formel I gebunden sind. Zugehörige Ausgangsstoffe sind die Fragmente des Restes des Polypeptides der Formel I nach Entfernung der gennanten Ausgangsmaterialien.

Kombinationen der Ausgangsstoffe und die dazugehörigen Ausgangsmaterialien sind in der nachstehenden Tabelle angeführt.

Tabelle 1 :

Ausgangsmaterialien

RpOH

Rj-Arg-OH

R1-Arg-R2-OH

R1-Arg-R2-Phe-OH

RrArg-R2-Phe-Phe-OH

R ! - Arg-R2-Phe-Phe-OH

RpArg-R^Phe-Phe-Tyr-OH

H-Arg-R2-Phe-Phe-R3

H-R2-Phe-Phe-R3

H-Phe-Phe-R3

H-Phe-Rs

H-R3

H-Tyr-NH2 NH3

Die erfindungsgemässe Kondensationsreaktion kann nach für die Herstellung von Peptidbindungen bekannten Verfahren durchgeführt werden. Zu diesen Verfahren gehört das DCC/ HONB-Verfahren (BE-PS 796 399), das Azidverfahren, das Chloridverfahren, das Säureanhydridverfahren, das gemischte Säureanhydridverfahren, das DCC-Verfahren, das Aktivesterverfahren, das Verfahren unter Einsatz des Woodward-Reagens K, das Carbodiimidazolverfahren od.dgl. (The Peptides, Band 1 (1966), Schröder und Lubke, Academic Press, New York, U.S.A.).

Vor Durchführung der Kondensationsreaktion können die nicht für die Teilnahme an der Kondensationsreaktion bestimmten Carboxyl- und Aminogruppen, z.B. nach an sich bekannten Verfahren, geschützt und die für die Teilnahme an der Kondensation bestimmten Carboxyl- und/oder Aminogruppen, z.B. nach an sich bekannten Verfahren, aktiviert werden. Die nicht für die Teilnahme an der beabsichtigten Reaktion bestimmten Carboxylgruppen in den Ausgangsmaterialien können in Form von Metallsalzen (z.B. Natrium- und Kaliumsalzen) oder Estern (z.B. Methyl-, Ähtyl-, Benzyl-, p-Nitrobenzyl-, tert.-Butyl-oder tert.-Amylestern) geschützt werden.

Als Schutzgruppen für die Aminogruppen der Ausgangsmaterialien sind alle bei der Peptidherstellung üblichen Schutzgruppen für Aminogruppen geeignet, wie z.B. Benxyloxycarbo-nyl, tert.-Butoxycarbonyl, tert.-Amoyloxycarbonyl, Isobornylo-xycarbonyl u.dgl. Diese Schutzgruppen können zum Schutz der Iminogruppen des Prolins eingesetzt werden. Die Imidazol-s gruppe des Histidins kann durch jede herkömmliche Gruppe, wie Benzyl, Tosyl, 2,4-Dinitrophenol, tert.-Butoxycarbonyl oder Carbobenzoxy, geschützt werden. Die Hydroxylgruppe des Serins, Tyrosins oder Threonins kann durch jede herkömmliche Gruppe, wie Benzyl, tert.-Butyl und andere ätherbildende m Gruppen, geschützt werden. Die Guanidinogruppe des Arginins kann durch Nitro, Tosyl, Carbobenzoxy, Isobornyloxycarbonyl oder Adamantyloxycarbonyl geschützt werden. Beispiele für aktivierte Carboxylgruppen in den Ausgangsstoffen sind die entsprechenden Säureanhydride, Azide, aktiven Ester mit Phe-, «i nolen bzw. Alkoholen, wie z.B. Pentachlorphenol, 2,4,5-Tri-chlorphenol, 2,4-Dinitrophenol, Cyanomethylalkohol, p-Nitro-phenol, N-Hydroxy-5-norbornen-2,3-dicarboximid, N-Hydroxysuccinimid, N-Hydroxyphthalimid oder N-Hydroxy-benztriazol od.dgl. Als Beispiele für die aktivierten Aminogrup-id pen in den Ausgangsstoffen seien z.B. die entsprechenden Phos-phorsäureamide genannt.

Aus der nachstehenden Tabelle sind Beispiele für Kombinationen derartiger Formen von Carboxyl- und Aminogruppen in den Materialien (A) und (B) ersichtlich.

25

Tabelle 2:

Kombinations- Ausgangsstoffe beispiele

(A) (B)

111 COOH NH2 COOH NH2

1* frei geschützt geschützt frei

2 aktiviert geschützt frei frei

3 frei geschützt geschützt aktiviert

.15

Anmerkung: In dem mit Sternchen * bezeichneten Fall liegt im Reaktionssystem vorzugsweise ein Dehydratisierungsmittel, wie z.B. ein Carbodiimidreagens, wie Dicyclohexylcarbodiimid, vor.

4I, Die erfindungsgemässe Kondensation kann in Gegenwart .eines Lösungsmittels durchgeführt werden. Das Lösungsmittel kann jedes beliebige, für die Verwendung in Peptidkondensa-tionsreaktionen geeignete sein. Als Beispiele seien wasserfreies oder wässeriges Dimethylformamid, Dimethylsilfoxid, Pyridin, 45 Chloroform, Dioxan, Dichlormethan, Tetrahydrofuran genannt; auch Mischungen dieser Stoffe können eingesetzt werden.

Die Reaktionstemperatur liegt innerhalb eines Bereiches, welcher für Reaktionen zur Bildung von Peptidbindungen 50 geeignet ist, gewöhnlich zwischen etwa —20° C und etwa 30° C. Auch können die Vorläufermaterialien (geschützten Peptide) der erfindungsgemäss herzustellenden Verbindungen leicht nach Festphaseverfahren hergestellt werden.

Nach Beendigung der Kondensationsreaktion werden die 55 gegebenenfalls vorhandenen Schutzgruppen, z.B. nach an sich bekannten Verfahren, entfernt. Beispiele für derartige Verfahren sind katalytische Reduktion in Gegenwart eines Katalysators, wie Palladiumschwarz, Palladium auf Kohle, Platin od. dgl., Solvolyse mittels Fluorwasserstoff, Trifluoressigsäure Ml od.dgl. und Reduktion mit metallischem Natrium in flüssigem Ammoniak.

Die so hergestellten Peptide der allgemeinen Formel (I) können aus dem Reaktionsproduktengemisch nach an sich für diesen Zweck bekannten Verfahren, wie z.B. Extraktion, Ver-65 teilung, Säulenchromatographie od.dgl., gewonnen werden.

Die erfindungsgemässe Reaktion kann nach jedem an sich bekannten, herkömmlichen Festphaseverfahren durchgeführt werden.

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Als Beispiele für Säuren, welche für die Bildung von Salzen mit den Polypeptiden der allgemeinen Formel (I) geeignet sind, seien anorganische Säuren, wie Salzsäure, Bromwasserstoffsäure, Perchlorsäure, Salpetersäure, Rhodanwasserstoffsäure, Schwefelsäure, Phosphorsäure od.dgl., und organische Säuren, wie Ameisensäure, Essigsäure, Propionsäure, Glykolsäure, Milchsäure, Brenztraubensäure, Oxalsäure, Malonsäure, Zitronensäure, Bernsteinsäure, Maleinsäure, Fumarsäure, Anthranil-säure, Zimtsäure, Naphthalinsulfonsäure oder Sulfanylsäure, genannt.

Metalle, welche mit den Polypeptiden der allgemeinen Formel (I) Metallkomplexverbindungen bilden können, sind z.B. Zink, Nickel, Kobalt, Kupfer und Eisen. Die Metallkomplexverbindungen können nach herkömmlichen Verfahren, wie z.B. durch Umsetzung der Polypeptide der allgemeinen Formel (I) mit dem Hydroxid oder Oxid eines der vorstehend angeführten Metalle bei einem pH-Wert von etwa 6-8, hergestellt werden.

Die erfindungsgemässen Polypeptide der allgemeinen Formel (I) besitzen die Wirkung, bei parenteraler oder peroraler Verabreichung einen hohen Glukosegehalt in Blut und Harn auf einen normalen Grad herabzusetzen. Ihre besondere Eigenschaft besteht darin, dass sie einen normalen Gehalt an Glukose in Blut und Harn nicht herabsetzen, wodurch sie dem Insulin, das Hypoglykämie verursacht, weit überlegen sind. Die Polypeptide der allgemeinen Formel (I) sind von geringer Toxizität und können gefahrlos verabreicht werden, sie sind wirksam bei der Förderung des Lipidstoffwechsels. Aufgrund dieser spezifischen Eigenschaften sind die Polypeptide der allgemeinen Formel (I) besonders gut für die Behandlung von Menschen und Tieren, wie Ratten und Mäusen, gegen Insuffizienz des Kohlehydrat- und Lipidstoffwechsels, insbesondere für die Behandlung von Diabetes oder Hypercholeserämie ohne unerwünschte Nebenwirkungen geeignet. Die Polypeptide der allgemeinen Formel (I) können so, wie sie sind, oder in jeder beliebigen pharmazeutischen Form wie Tabletten, Pellets, Granulaten, Pulvern, Flüssigkeiten oder Injektionen, die nach an sich bekannten Verfahren hergestellt wurden, verabreicht werden.

Obgleich die tägliche Dosierungsmenge des Polypeptids der allgemeinen Formel (I) von Art und Grad der Krankheit, dem Alter des Wirtes, u.dgl. abhängt, liegt sie gewöhnlich innerhalb eines Bereiches von etwa 50 |xg bis etwa 100 mg/pro Kilogramm Körpergewicht.

Pharamakologischer Versuch auf Behandlung von Diabetes mit Polypeptiden der allgemeinen Formel (I):

8 Wochen alte, genetisch von Diabetes befallene, weibliche Mäuse (Stamm KKAy oder gelber KK) wurden einzeln in s Metallkäfigen gehalten, um ihren Harn zu sammeln. Drei Gruppen dieser Mäuse wurden Polypeptide der allgemeinen Formel (I) ß-Ala-L-Arg-Gly-L-Phe-L-Phe-L-Tyr-NH2 (Verbindung A) in drei verschiedenen Dosierungsmengen peroral verabreicht (1,10,100 mg/kg/Tag). Die Behandlungsmethode ist aus uiTabelle 3 ersichtlich. Den Kontrollgruppen wurde Salzlösung verabreicht. Alle 4 Tage wurde die Plasma- und Harnglukose nach dem Glukoseoxidaseverfahren (Huggett, A.St.G und Nixon, D.A., «Lamcet» Band II, Seiten 368-370 (1957)) bestimmt.

15 Die Ergebnisse sind aus Tabelle 3 ersichtlich. In der Kontrollgruppe waren der Plasmaglukosespiegel und jener der innerhalb von 24 Stunden abgeschiedenen Harnglukose während der gesamten Dauer des Versuches sehr hoch. Im Gegensatz dazu nahmen der Plasmaglukose- und Harnglukosespiegel 2i der mit den Polypeptiden behandelten Gruppen während der Behandlung allmählich ab. Bei der antidiabetischen Wirkung konnte eine Abhängigkeit von der Dosierungsmenge beobachtet werden. Während der Nachbehandlungsphase stiegen beide Glukosespiegel in den drei behandelten Gruppen an. Eine Abhängigkeit von der Dosierungsmenge konnte jedoch im Andauern der antidiabetischen Wirkung nach Entzug beobachtet werden.

Aus diesen Erkentnissen kann geschlossen werden, dass der Zustand der von Diabetes befallenen Mäuse durch die Behandln lung mit Polypeptiden verbessert wurde.

B ehandlungsschema :

Tage

0 4 8. - 12 16 20

"n—; r-r-r

Zeitraum der Behandlung Zeitraum nach Behandlung

40 PG: Plasmaglukose (mg/100 ml) UG: Harnglukose (g/Tag) * bedeutend gegenüber der mit Salzlösung behandelten Gruppe (p<0,05)

** bedeutend gegenüber der mit Salzlösung behandelten Gruppe (p<0,01)

Tabelle 3:

Medi- Anzahl Vorbehandlung medikamentöse Behandlung (Tag) Nachbehandlung (Tag) kament der

Mäuse

4.

Salz- 5

lösung

Verb. A 5 mg/kg/Tag

Verb. A 3 10 mg/kg/

Tag

Verb. A 5 100 mg/kg/ Tag

PG UG 445 ±39 0.560: 0.072

457±43 0.595: 0.081

458±43 0.571: 0.075

455±14 0.582: 0.068

PG

483:

35

352:

36

433: 78

UG

0,484 ± 0.051

0.299 ± 0.092

0.160 ± 0.061**

PG

528± 45

343 ±

yj**

338 ± 35*

344 ± 0.0743 ± 254 ± 27* 0.0279**41**

UG

0.635:

0.072

12.

PG

497 ± 76

16.

0.213± 370± 0.079** 40

0.0786 ± 354 ± 0.0346** 25

UG 0.557 ± 0.152

PG 447 + 22

0.190± 469± 0.010 22

0.0858 ± 396 ± 0.0472* 7

UG

0.462 ± 0.070

0.451 ± 0.091

0.238 ± 0.099

20. PG UG 513+ 0.486 ± 53 0.052

523 ± 0.450 ± 58 0.056

513: 101

0.0446 ± 232 ± 0.0466 ± 339 ± 0.0750 ± 457 + 0.0200**19** 0.0220* 44 0.0188**51

0.478 ± 0.022

0.250 ± 0.045**

7

618 959

In allen folgenden Ausführungsbeispielen weisen in allen Fällen, in welchen in bezug auf die Aminosäuren optische Isomere vorhanden sind, die Aminosäuren, wenn nicht ausdrücklich anders angeführt, die L-Konfiguration auf.

Beispiel 1

Herstellung von Arg-Pro-Phe-Phe-Tyr-NH2 a) Herstellung von Z-Arg(N02)-Pro-Phe-Phe-Tyr-NH2

In 50 ml DMF (Dimethylformamid) wurden 10,0 g Z-Phe-Phe-Tyr-NH2 gelöst, dann wurde unter Verwendung von Palladiumschwarz als Katalysator innerhalb von 10 Stunden die katalytische Reduktion durchgeführt. Der Katalysator wurde abfiltriert, während des Kühlens des Filtrâtes mit Eis wurden 7.37 g Z-Arg(NOz)-Pro-OH und 3,53 g HONB zugegeben.

Dann wurden 4.06 g DCC zugegeben und das Gemisch wurde 16 Stunden lang gerührt. Der entstandene DC(Dicyclo-hexyl-)harnstoff wurde abfiltriert und das DMF bei vermindertem Druck abdestilliert. Der Rückstand wurde mit 200 ml Äthylacetat versetzt und das entstandene Pulver abfiltriert und durch nochmaliges Ausfällen aus DMF-Methanol-Wasser gereinigt. Die Ausbeute betrug 14.5 g (95.6%) FP: 100-103° C;

[<x] q -29,7°(c=0,55%, DMF).

Elementaranalyse: für ci6h5401(|nu) • h2o berechnet c59,73; h6,10; N 15,11 gefunden c 59,51; h 6,06; N 14,90

b) Herstellung von Arg-Pro-Phe-Phe-Tyr-NH2

In 30 ml Essigsäure wurden 500 mg Z-Arg(NOz)-Pro-Phe-Phe-Tyr-NH2 gelöst, dann wurde innerhalb von 20 Stunden unter Verwendung von Palladiumschwarz als Katalysator kata-lytisch reduziert. Der Katalysator wurde abfiltriert und das Filtrat bei vermindertem Druck zur Trockene eingeengt. Der Rückstand wurde in 50 ml Wasser gelöst und das Filtrat nach Abfiltrieren der geringen Menge unlöslicher Substanzen lyophilisiert. Das Produkt wurde in 5 ml Wasser gelöst und die Lösung über eine mit Carbomethyl-Sephadex gefüllte Kolonne (1,8 x 9 cm) geleitet. Die Elution nach dem Gradientenverfahren wurde mit 0,1 M wässerigem Ammoniumacetat (400 ml) und 1 M wässerigem Ammoniumacetat (400 ml) vorgenommen. Die Fraktionen 250 bis 370 ml wurden gesammelt und lyophilisiert, man erhielt ein weisses, flaumiges Produkt mit einer Ausbeute von 250 mg(52,3%).

[a]2^-41,9° (c=0.47% Wasser)

Aminosäureanalyse (Hydrolyse mit HCl):

Arg 1.00; Pro 1,05 ; Tyr 0,91 ; Phe 1,96 ;

(Peptidgehalt 86,5 %)

Elementaranalyse für C38H4906Ng • 2C2H402 • 2H 20 berechnet C 57,06; H 6,96; N 14,26 gefunden C 56,76 ; H 6,98 ; N 14,28

Beispiel 2

Herstellung von Gly-Arg-Pro-Phe-Phe-Tyr-NH2 a) Herstellung von Z-Gly-Arg-Pro-Phe-Phe-Tyr-NH2

In 30 ml Essigsäure wurden 800 mg Z-Arg(N02)-Pro-Phe-Phe-Tyr-NH2 gelöst, dann wurde innerhalb von 8 Stunden unter Einsatz von Palladiumschwarz als Katalysator katalytisch reduziert. Der Katalysator wurde abfiltriert und das Filtrat bei vermindertem Durck zur Trockene eingeengt, der Rückstand in 20 ml Wasser gelöst und lyophilisiert.

Das entstandene Pulver wurde in 10 ml DMF gelöst und mit 147 g p-Toluolsulfonsäuremonohydrat versetzt. Dem Gemisch wurden 349 mg Z-Gly-ONb zugegeben und es wurde 10 Stunden lang gerührt. Das DMF wurde darauf bei vermindertem Druck abdestilliert und 50 ml Äthylacetat wurden zugegeben. Das entstandene Pulver wurde abfiltriert. Ausbeute: 858 mg (89,5 %).Fp:l 19-121° C;

' N d -26,7° (c=0,96%, DMF).

Elementaranalyse für C48H58O9N10 • C7H803S • H20 berechnet C 59,55; H 6,18; N 12,63; S 2,89

gefunden C 59,45; H 6,08; N 12,37; S 2,76

in b) Herstellung von Gly-Arg-Pro-Phe-Phe-Tyr-NH2

In 30 ml Essigsäure wurden 500 mg Z-Gly-Arg-Pro-Phe-Phe-Tyr-NH2-p-toluolsulfonat gelöst, die katalytische Reduktion wurde innerhalb von 5 Stunden unter Verwendung von 15 Palladiumschwarz als Katalysator durchgeführt. Der Katalysator wurde abfiltriert und das Lösungsmittel bei vermindertem Druck abdestilliert. Der Rückstand wurde in 20 ml Wasser gelöst und die Lösung einer Ionenaustauscherchromatographie an einer Kolonne Amberlite IRA 410 (Acetatform) von Rohm & Haas Co. Ltd., USA, stark basisches Austauscherharz, unterworfen. Das Eluat wurde lyophilisiert und das entstandene Pulver in 5 ml Wasser gelöst. Die Lösung wurde über eine mit Carboxymethylzellulose gefüllte Kolonne (2,6 X 23 cm) geleitet und die Elution wurde nach dem Gradientenverfahren unter Verwendung von 0,005M bis 0,2M wässerigem Ammoniumacetat (je 700 ml) durchgeführt. Die Fraktionen von 840 ml bis 970 ml wurden gesammelt und lyophilisiert. Ausbeute: 270 ml (63,6%);

w M 22-62,0° (c=0,46% Wasser).

Elementaranalyse für C40H52O7N10 ■ 2C2H402 • 2H20 berechnet C56,15; H6,86; N 14,89 gefunden C 55,99; H 6,92; N 14,77

Aminosäureanlayse:

Arg 0,94; Pro 1,06; Gly 1,00; Tyr 0,94; Phe 2,03 Peptidgehalt: 83,2%).

4i) Beispiel 3

y-Abu-Arg-Pro-Phe-Phe-Tyr-NH2

Das in Beispiel 2 beschriebene Verfahren wurde wiederholt, jedoch wurde anstatt Z-Gly-ONB Z-y-Abu-ONB eingesetzt, und es wurden 324 g der oben angeführten Verbindung er-45 halten.

[a]2^-58,7° (c=0,45% Wasser).

Elementaranalyse für C42H56O7N10 • 2C2H402 • 3H20 5() berechnet C 55,97; H 7,15; N 14,19 gefunden C56,14; H7,36; N 13,92

Aminosäureanalyse:

Arg 1,00; Pro 1,08; Tyr 0,97; Phe 2,13 55 (Peptidgehalt: 80,8%).

Beispiel 4

e-Acap-Arg-Pro-Phe-Phe-Tyr-NH2 a) Herstellung von Z-e-Acap-Arg-Pro-Phe-Phe-Tyr-NH2 ft0 In 10 ml DMF wurden 250 ml Z-e-Acap-OH gelöst, und dann unter Eiskühlung 186 mg HONB und 214 mg DCC zugegeben. Das Gemisch wurde 16 Stunden lang gerührt und der entstandene DC-Harnstoff abfiltriert. Das Filtrat wurde zu einer DMF-Lösung von H-Arg-Pro-Phe-Phe-Tyr-NH2-p-(,5 toluolsulfonat zugegeben, welche wie in Beispiel 2-a) angeführt hergestellt worden war. Das Gemisch wurde 12 Stunden lang gerührt und das DMF bei vermindertem Druck abdestilliert. Dem Rückstand wurden 30 ml Äthylacetat zugegeben und das

618 959

8

entstandene Pulver wurde abfiltriert. Ausbeute: 810 mg (79,1%). Fp: 90-92° C;

[a] ^ — 30,3° (c— 1,07% DMF).

Elementaranalyse für C52H66O9N10 ■ C7H803S • 2H20 berechnet C 59,88; H 6,65; N 11,84; S 2,80

gefunden C59,81; H6,75; Nil,80; S3,00

b) Herstellung des e-Acap-Arg-Pro-Phe-Phe-Tyr-NH2

500 mg des gemäss a) hergestellten Z-Derivats wurden wie in Beispiel 2-b) beschrieben behandelt, und 316 mg der oben angeführten Verbindungen erhalten.

[a] 2^ -58,9° (c= 0,55% Wasser)

Aminosäureanalyse :

Arg 1,02; Pro l,03; Tyr 0,92; Phe 2,13; e-Acap (nicht bestimmt) Peptidgehalt 81,5%.

Beispiel 5 Lys-Arg-Pro-Phe-Phe-Tyr-NH2

a) Herstellung von di-Z-Lys-Arg-Pro-Phe-Phe-Tyr-NH2

Das in Beispiel 4-a) beschriebene Verfahren wurde wiederholt, jedoch wurden anstelle des Z-e-Acap-OH 390 mgdi-Z-Lys-OH verwendet, und 932 mg der oben angeführten Verbindung erhalten. Fp: 103-105° C;

[a] ^ — 28,5° (c= 1,04% DMF).

Elementaranalyse für C60H73Oi iNu • C7H803S • 2H20 berechnet C60.39; H6,43; N 11,56; S2,41

gefunden C60,64; H6,21; N 11,79; S2,82

b) Herstellung von Lys-Arg-Pro-Phe-Phe-Tyr-NH2

500 mg des gemäss a) hergestellten Di-Z-Derivates wurden wie in Beispiel 2-b) beschrieben behandelt, und 336 mg der oben angeführten Verbindung erhalten.

[a] q - 52,6° (c= 0,57% Wasser).

Aminosäureanalyse :

Lys 1,02 ; Arg 0,98 ; Pro 1,00 ; Tyr 0,94 ; Phe 2,04 (Peptidgehalt: 91%).

Beispiel 6

a,v-Dab-Arg-Pro-Phe-Phe-Tyr-NH2

Die in den Beispielen 4 und 5 beschriebenen Verfahren wurden genau wiederholt, und aus 535 mg Di-Z-a, y-Dab-di-cyclohexylaminsalz die oben angeführte Verbindung mit einer Ausbeute von 325 mg erhalten.

[a] 2^ -58,2° (c= 0,50% Wasser).

Aminosäureanalyse :

a,v-Dab 1,00; Arg0,98;Pro l,00;Tyr0,87;

Phe 1,96 (Peptidgehalt: 84,2%)

Beispiel 7 ß-AIa-Arg-Pro-Phe-Phe-Tyr-NH2 a) Herstellung von Z-ß-Ala-Arg(N02)-Pro-0Me

3,50 g Z-Arg(N02)-Pro-OMe wurden mit 35 ml 25-%iger HBr-Essigsäure versetzt, die Mischung wurde 35 min lang bei Raumtemperatur geschüttelt. Diesem Gemisch wurden 300 ml Äthyläther zugegeben, der entstandene Niederschlag wurde abfiltriert, mit Äther gewaschen und getrocknet.

Das erhaltene Pulver wurde in 20 ml DMF gelöst und die Lösung unter Eiskühlung mit Triäthylamin neutralisiert. Nach Zugabe von 2,9 g Z-ß-Ala-ONB wurde das Gemisch 16 Stunden lang gerührt.

Das DMF wurde bei vermindertem Druck abdestilliert und der Rückstand in 300 ml Äthylacetat gelöst. Die Lösung wurde dreimal mit je 100 ml 4-%igem, wässrigem Natriumcarbonat, dann mit Wasser gewaschen und über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet. Das Lösungsmittel wurde bei vermindertem Druck abdestilliert und der Rückstand mit Äthyläther versetzt. , Das entstandene Pulver wurde abfiltriert ; Ausbeute: 3,05 g (74,3%); Fp: 62-65° C;

[a] 22-34,1° (c= 1,04% DMF)

Elementaranalyse für C23H3308N7 - j-H20 in 2

berechnet C50,73; H6,29; N 18,01 gefunden C 50,98; H 6,36; N 17,72

b) Herstellung von Z-ß-Ala-Arg(N02)-Pro-0H

! 5 In 30 ml Aceton wurden 2,82 g Z-ß-Ala-Arg(N02)-Pro-OMe gelöst und unter Eiskühlung mit 10,7 ml IN wässrigem Natriumhydroxid versetzt. Das Gemisch wurde bei Raumtemperatur 2 Stunden lang gerührt und nach Neutralisieren mit 11 ml IN Salzsäure bei vermindertem Druck das Aceton abde-2i) stilliert. Dem öligen Rückstand wurden 30 ml kaltes Wasser zugegeben und das Wasser wurde dekantiert. Der Rückstand wurde einmal mit kaltem Wasser gewaschen und getrocknet, dann der Chromatographie an einer mit Silikagel (90 g) gefüllten Kolonne unterworfen, als Entwicklerlösung wurde Äthyl-;iacetat-Pyridin-Essigsäure-Wasser (60:20:6:11) eingesetzt. Die Fraktionen mit einem hohen Gehalt an der gewünschten Verbindung wurden gesammelt und bei vermindertem Druck zur Trockene eingeengt, der Rückstand wurde mit Äther gewaschen und abfiltriert. Ausbeute: 2,62 g; Fp: 65-67° C;

30 N 2q - 27,5° (c= 1,07% DMF).

Elementaranalyse für C22H3108N7 berechnet C50,66; H5,99; N 18,80 gefunden C50,41; H6,19; N 18,58

35

c) Herstellung von Z-ß-Ala-Arg (N02)-Pro-Phe-Phe-Tyr-NH2

In 15 ml DMF wurden 1,50 g Z-Phe-Phe-Tyr-NH2 gelöst, dann wurde innerhalb von 4 Stunden die katalytische Reduktion unter Einsatz von Palladiumschwarz als Katalysator vorgenom-111 men. Der Katalysator wurde abfiltriert und während der Eiskühlung des Filtrats wurden 1,21 g Z-ß-Ala-Arg(N02)-Pro-OH, 0,53 gvonHONBund 0,61 g von DCC zugegeben. Das Gemisch wurde 18 Stunden lang gerührt. Der entstandene DC-Harnstoff wurde abfiltriert und das DMF bei vermindertem 45 Druck abgedampft, der Rückstand mit 50 ml Wasser versetzt und das entstandene Pulver abfiltriert und getrocknet. Nach erneutem Ausfällen des Pulvers aus DMF-Äthylacetat erhielt man 1,99 g Produkt (Ausbeute: 80,9%) ;Fp:135—138° C;

so [a] 2j5 —33,1° (c= 0,9%DMF)

Elementaranalyse für C49H59011N11 • H20 berechnet C 59,08; H 6,17; N 15,47

gefunden C58,93; H6,18; N 15,02

55

d) Herstellung von ß-Ala-Arg-Pro-Phe-Phe-Tyr-NH2

In 40 ml Eisessig wurden 1,50 gZ-ß-Ala-Arg(N02)-Pro-Phe-Phe-Tyr-NH2 gelöst und darauf wurde innerhalb von 8 Stunden die katalytische Reduktion unter Verwendung von 60 Palladiumschwarz als Katalysator durchgeführt. Der Katalysator wurde abfiltriert und das Lösungsmittel bei vermindertem Druck abdestilliert.

Der Rückstand wurde in 50 ml Wasser gelöst und die kleine Menge an unlöslichen Substanzen abfiltriert, das Filtrat lyophili-65 siert. Das Produkt wurde in 20 ml Wasser gelöst und über eine mit Carboxymethylzellulose gefüllte Kolonne (3,0X28 cm) geleitet, die Elution wurde nach dem Gradientenverfahren mit je 1,5 ml 0,005 M bis 0,2 M wässrigem Ammoniumacetat vor

9

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genommen, darnach die Fraktionen von 1490 ml bis 1840 ml gesammelt und lyophilisiert. Ausbeute: 980 ml (65,7%),

[a] 2p-59,l° (c= 0,52% Wasser).

Elementaranalyse für C41H54O7N10 • 2C2H402 • 4H20 berechnet C54,53; H7,12; N 14,13

gefunden C 54,34; H 6,98; N 13,98

Aminosäureanalyse :

Arg 1,00 ; Pro 1,11 ; Tyr 1,00 ; Phe 2,11 ; ß-Ala 0,94 (Peptidgehalt: 75,7%).

Nach der in c) und d) beschriebenen Vorgangsweise kann die erwünschte Verbindung gemäss dem nachstehenden Reaktionsschema hergestellt werden

1) Z-ß-Ala-Arg(N02)-Pr0-Phe-0H+H-Phe-Tyr-NH2

\ HONB/DCC Z-ß-Ala-Arg(N02)-Pro-Phe-Phe-Tyr-NH2

| H2/Pd or HF

ß-Ala-Arg-Pro-Phe-Phe-Tyr-NH2

2) Z-ß-Ala-Arg(N02)-Pr0-Phe-Phe-0H+H-Tyr-NH2

I HONB/DCC

Z-ß-Ala-Arg(N02)-Pro-Phe-Phe-Tyr-NH2

| H2/Pd oder HF ß-Ala-Arg-Pro-Phe-Phe-Tyr-NH2 +HC1

3) Z-ß-Ala-Arg-OH+H-Pro-Phe-Phe-Tyr-NH2

\ HONB/DCC Z-ß-Ala-Arg-Pro-Phe-Phe-Tyr-NH2

I

, t H2/Pd ß-Ala-Arg-Pro-Phe-Phe-Tyr-NH2

Elementaranalyse: für C38H4107N5 • H20 berechnet C 65,41; H 6,21; N 10,04 gefunden C 65,18; H 6,20; N 10,32

b) Herstellung von Z-Arg(NO)2-ß-Ala-Phe-Phe-Tyr-NH2

' In 30 ml DMF wurden 1,0 g Z-ß-Ala-Phe-Phe-Tyr-NH-2 gelöst, dann wurde innerhalb von 6 Stunden die katalytische Reduktion unter Einsatz von Palladiumschwarz als Katalysator vorgenommen und darauf der Katalysator abfiltriert. Dem Filtrat wurde eine Lösung von Z-Arg(N02)-0DNP in Tetrahydro-furan (dem Dinitrophenylester, der aus 0,52 g Z-Arg(N02)-0H und 0,30 g 2,4-Dinitrophenol hergestellt worden war), in 10 ml Tetrahydrofuran nach dem DCC-Verfahren zugegeben. Das Gemisch wurde 13 Stunden lang gerührt und das Lösungsmittel abdestilliert, der Rückstand mit 50 ml Wasser versetzt und das entstandene Pulver abfiltriert und getrocknet. Ausbeute: 1,01 g (74,9%);Fp: 192-194° C;

[a] 2£ -11,1° (c= 1,02% DMF).

:,] Elementaranalyse für C44H52Oi0N10 • 2H20 berechnet C57,63; H6,16; N 15,28 gefunden C 57,63; H 5,93; N 15,61

c) Herstellung von Z-ß-Ala-Arg(N02)-ß-AIa-Phe-Tyr-NH2

700 mg Z-Arg(N02)-ß-Ala-Phe-Phe-Tyr-NH2 wurden zuerst mit 0,2 ml Anisol und darauf mit 7 ml 250%iger HBr-Essigsäure versetzt. Das Gemisch wurde 40 min lang bei Raumtemperatur geschüttelt und mit 100 ml Äthyläther versetzt, der entstandene Niederschlag abfiltriert und mit Äthyläther gewa-

1(1 sehen. Nach gründlichem Trocknen wurde der Niederschlag in 10 ml DMF gelöst und die Lösung unter Eiskühlung mit Tri-äthylamin neutralisiert und dann nach Zugabe von 336 mg Z-ß-Ala-ONB 18 Stunden lang gerührt. Das DMF wurde bei vermindertem Druck abdestilliert und der Rückstand mit 50 ml Wasser versetzt, der entstandene Niederschlag abfiltriert, getrocknet und aus DMF und Äthylacetat nochmals ausgefällt. Ausbeute: 560 mg (73%); Fp: 200-202° C (Zersetzung);

,22

[<x] - 7,3° C (c=0,91 % DMF).

Beispiel 8 ß-Ala-Arg-Pro-Phe-Phe-NH2

Das in Beispiel 7-c) beschriebene Verfahren wurde wiederholt, jedoch wurde Z-Phe-Phe-Tyr-NH2 durch Z-Phe-Phe-NH2 ersetzt. Nach den in den Beispielen 7-c) und 7-d) beschriebenen Verfahren wurden 1,24 g der oben angeführten Verbindung in Form eines weissen, flaumigen Produktes erhalten.

[a] q-48,6° (c— 0,42% Wasser).

Aminosäureanalyse:

Arg 1,08; Pro 1,00; Phe 1,98; ß-Ala 0,97 82,6%).

Beispiel 9

ß-Ala-Arg-ß-Ala-Phe-Phe-Tyr-NH2 a) Herstellung von Z-ß-Ala-Phe-Phe-Tyr-NH2

In 40 ml DMF wurden 2,00 g Z-Phe-Phe-Tyr-NH2 gelöst und die katalytische Reduktion wurde innerhalb von 5 Stunden unter Einsatz von Palladiumschwarz als Katalysator durchgeführt, dann der Katalysator abfiltriert und das Filtrat mit 1,39 g Z-ß-Ala-ONB versetzt. Das Gemisch wurde 9 Stunden lang gerührt und das DMF bei vermindertem Druck abdestilliert, der Rückstand mit 50 ml Wasser versetzt und das entstandene Pulver abfiltriert und getrocknet. Nach erneutem Ausfällen des Produktes aus DMF-Äthylacetat, Ausbeute: 2,02 g (88,0%); Fp: 232° C;

[a] 2q - 23,4° (c=0,94% DMF).

40

Elementaranalyse für Q7H570liNu ■ H20 berechnet C 58,19; H 6,13; N 15,89 gefunden C 58,06; H 6,41; N 15,57

45 d) Herstellung von ß-Ala-Arg-ß-Ala-Phe-Phe-Tyr-NH2

In 30 ml Eisessig wurden 400 mg Z-ß-Ala-Arg(N02)-ß-Ala-Phe-Phe-Tyr-NH2 gelöst, dann wurde innerhalb von 8 Stunden die katalytische Reduktion unter Einsatz von Palladiumschwarz als Katalysator durchgeführt, der Katalysator 5(l abfiltriert und das Lösungsmittel bei vermindertem Druck abdestilliert, der Rückstand in 5 ml Wasser gelöst und die Lösung über eine mit Carboxymethylzellulose gefüllte Kolonne (2,6 X 22 cm) geleitet. Die Elution wurde nach dem Gradientenverfahren unter Verwendung von je 700 ml 0,005M und 55 0,2M wässierigen Ammoniumacetatlösungen vorgenommen, die Fraktionen von 720 bis 870 ml wurden gesammelt und lyophilisiert, Ausbeute: 270 mg (69,1 %) ; weisses, flaumiges Produkt.

M D-

17,2° (c=0,53% Wasser).

Elementaranalyse für C3gHS2O7NI0 • 2C2H402 ■ 3H20 berechnet C 54,53; H 7,03; N 14,79 gefunden C 54,52; H 6,96; N 15,00

Aminosäureanalyse :

Arg 1,00; Tyr 1,00; Phe 2,03 ß-Ala 2,14 (Peptidgehalt 79,0%).

618 959

10

Beispiel 10 Ala-Arg-ß-Ala-Phe-Phe-Tyr-NH2

In dem in Beispiel 9-c) beschriebenen Verfahren wurde das Z-ß-Ala-ONB durch 340 mg Z-Ala-ONB ersetzt und die in den Beispielen 9-c) bzw. 9-d) beschriebenen Verfahren wurden wiederholt. Es wurden 297 mg der oben angeführten Verbindung in Form eines weissen, flaumigen Produktes erhalten.

[a] 2q - 18,9° (c=0,62% Wasser)

Aminosäureanalyse:

Arg 1.02 ; Ala 1,04 ; Tyr 0,97 ; Phe 2,00 ; ß-Ala 0,97 (Peptidgehalt 81,0%).

Beispiel II ß-Ala-Arg-Sar-Phe-Phe-Tyr-NH2

a) Herstellung des Z-Sar-Phe-Phe-Tyr-NH2

In 30 ml DMF wurden 2,02 g Z-Phe-Phe-Tyr-NH2 gelöst, dann wurde innerhalb von 5 Stunden die katalytische Reduktion unter Einsatz von Palladiumschwarz als Katalysator vorgenommen, der Katalysator abfiltriert und das Filtrat gekühlt. Anderseits wurden 810 mg Z-Sar-OH in 10 ml Tetrahydrofuran gelöst und darauf mit 0,71 g HONB versetzt. Das Gemisch wurde auf 0° C gekühlt, mit 0,82 g DCC versetzt und 3 Stunden lang gerührt, der entstandene Harnstoff abfiltriert und das Filtrat der oben angeführten DMF-Lösung zugegeben, darauf 20 Stunden lang gerührt. Dann wurde das Lösungsmittel bei vermindertem Druck abdestilliert und der Rückstand mit 50 ml Wasser versetzt. Schliesslich erfolgte erneutes Ausfällen des abfiltrierten entstandenen Pulvers aus DMF-Äthylcacetat, Ausbeute: 1,90 g (83,8 %) ; Fp: 246-248° C (Zersetzung) ;

[a] p-9,7°(c= 1,07%DMF).

Elementaranalyse für c38h41o7n5- ìh2o berechnet C 66,26; H 6,15; N 10,17

gefunden C 66,32; H 6,39; N 10,52

b) Herstellung des Z-Arg(N02)-Sar-Phe-Phe-Tyr-NH2

In 10 ml DMF wurden 1,0 g Z-Sar-Phe-Phe-Tyr-NH2 gelöst und die katalytische Reduktion wurde innerhalb von 7 Stunden unter Verwendung von Palladiumschwarz als Katalysator vorgenommen, der Katalysator abfiltriert und das Filtrat gekühlt. Anderseits wurden 0,52 g Z-Arg(No2)-OH in 10 ml Tetrahydrofuran gelöst und unter Eiskühlung mit 0,3 g 2,4-Dinitrophenol und 0,33 g DCC versetzt, das Gemisch wurde dann 3 Stunden lang gerührt, der entstandene DC-Harnstoff abfiltriert und das Filtrat der oben angeführten DMF-Lösung zugegeben, das Gemisch 20 Stunden lang gerührt und das Lösungsmittel bei vermindertem Druck abdestilliert. Der Rückstand wurde mit 50 ml Wasser versetzt und das entstandene Pulver abfiltriert, getrocknet und aus DMF-Äthylacetat-Äthyl-äther erneut ausgefällt. Ausbeute: 1,04 g (77,2%) ; Fp: 96-98° C;

[a] q - 7,3° (c= 1,06% DMF).

Elementaranalyse für C44H52O10N10 ■ 2H20 berechnet C57,63; H6,16; N 15,28 gefunden C 57,60; H 6,10; N 15,01

c) Herstellung von Z-ßAla-Arg(N02)-Sar-Phe-Phe-Tyr-NH2

In 7 ml 25 %iger HBr-Essigsäure wurden 700 mg Z-Arg(N02)-Sar-Phe-Phe-Tyr-NH2 und 0,2 ml Anisol gelöst und die Lösung wurde 40 min lang bei Raumtemperatur geschüttelt. Dieses Reaktionsgemisch wurde mit 100 ml Äthyläther versetzt und der entstandene Niederschlag abfiltriert, mit Äther gewaschen und über Natriumhydroxidpellets 2 Stunden lang getrocknet.

Der getrocknete Niederschlag wurde in 10 ml DMF gelöst und die Lösung unter Eiskühlung mit Triäthylamin neutralisiert, mit 336 mg Z-ß-Ala-ONB versetzt und 20 Stunden lang gerührt. Diesem Vorgang folgte Abdestillieren des DMF bei vermindertem Druck und Zugabe von 50 ml Wasser, Abfiltrieren des entstandenen Pulvers, Trochnen und erneutes Ausfällen desselben aus DMF-Äthylacetat. Ausbeute: 590 mg (76,5%);

Fp: 135-138° C; [a] -15,5° (c=0,99%DMF).

Elementaranalyse für c47h57o11 h2o berechnet C58,19; h6,13; N 15,89 gefunden C58,18; h6,40; N 15,60;

d) Herstellung von ß-Ala-Arg-Sar-Phe-Phe-Tyr-NH2

In 30 ml Essigsäure wurden 450 mg Z-ß-Ala-Arg(N02)-Sar-Phe-Phe-Tyr-NH2 gelöst und dann wurde innerhalb von 8 Stunden die katalytische Reduktion mit Palladiumschwarz als Katalysator durchgeführt, der Katalysator abfiltriert und das Filtrat bei vermindertem Druck zur Trockene eingeengt. Der Rückstand wurde in 5 ml Wasser gelöst und der Chromatographie an einer mit Carboxymethylzellulose gefüllten Kolonne (2,6 X 22 cm) unterworfen. Die Elution wurde unter Verwendung von 0,005M und 0,2M wässrigen Ammoniumacetatlösun-gen (je 700 ml) nach dem Gradientenverfahren vorgenommen, die gewünschte Verbindung lag in den Fraktionen von 770 ml bis 880 ml vor, welche zusammengegeben und lyophilisiert wurden. Ausbeute: 309 mg (70,4%) weisses, flaumiges Produkt.

[a]2d2—21,5° (c=0,46% Wasser).

Elementaranalyse für C39H52O7N10 • 2C2H402 • 3H20 berechnet C 54,53; H 7,03; N 14,79 gefunden C 54,99; H 6,76; N 14,58

Aminosäureanalyse :

Arg 1,00; Tyr 0,88 ; Phe 2.02; ß-Ala 0,98; Sar nicht bestimmt (Peptidgehalt 78,7 %).

Beispiel 12 Leu-Arg-Pro-Phe-Phe-Tyr-NH2

a) Herstellung von Z-Leu-Arg(N02)-Pro-Phe-Phe-Tyr-NH2

In 20 ml DMF wurden 700 mg Z-Phe-Phe-Tyr-NH2 gelöst und dann wurde innerhalb von 6 Stunden unter Verwendung von Palladiumschwarz als Katalysator die katalytische Reduktion vorgenommen. Der Katalysator wurde abfiltriert, das Filtrat gekühlt und zuerst mit 648 mg Z-Leu-Arg(N02)-Pro-0H, dann mit 247 mg HONB und 285 mg. DCC versetzt und 20 Stunden lang gerührt. Darauf wurde der entstandene DC-Harnstoff abfiltriert und das DMF bei vermindertem Druck abdestilliert, der Rückstand mit 50 ml Wasser versetzt, das entstandene Pulver abfiltriert, getrocknet und aus DMF-Äthylacetat-Äther erneut ausgefällt. Ausbeute: 1,05 g (86,5%); Fp: 110-111° C;

[a] 22 -38,1° (c—1,0% DMF).

Elementaranalyse für C52H65011NII ■ 2HzO berechnet C 59,13; H 6,59; N 14,59 gefunden C 59,24; H 6,50; N 14,62

b) Herstellung von Leu-Arg-Pro-Phe-Phe-Tyr-NH2

In 20 ml Essigsäure wurden 500 mg Z-Leu-Arg(N02)-Pro-Phe-Phe-Tyr-NH2 gelöst und die katalytische Reduktion wurde innerhalb von 10 Stunden unter Verwendung von Palladiumschwarz als Katalysator durchgeführt.

Dann wurde der Katalysator abfiltriert und das Filtrat bei vermindertem Druck zur Trockene eingeengt, der Rückstand in 5 ml Wasser gelöst und der Chromatographie an einer mit

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Carboxymethylzellulose gefüllten Kolonne (2,6 X 20 cm) unterzogen. Die Elution erfolgte nach dem Gradientenverfahren unter Einsatz von 0,005M und 0,2M wässrigen Ammoniumace-tatlösungen (je 700 ml) und die gewünschte Verbindung lag in den Fraktionen von 700 ml bis 790 ml vor, welche zusammengegeben und lyophilisiert wurden, Ausbeute: 300 mg (63,6%), weisses, flaumiges Produkt.

M D-

•58,3° (c=0,59% Wasser).

Elementaranalyse für C44H6o07N,0 • 2C2H402 • 2H20 berechnet C 57,81; H 7,28; N 14,05

gefunden C 57,72; H 7,24; N 14,25

Aminosäureanalyse:

Arg 1,07; Gly l,03;Tyr0,87;Phe2,07;Phe 1,00 (Peptidgehalt 83,9%).

Beispiel 13 ß-Ala-Arg-Phe-Phe-Phe-Tyr-NH2

a) Herstellung von Z-ß-Ala-Arg(N02)-Phe-Phe-Phe-Tyr(Bzl)-Harz

In ein Reaktionsgefäss zur Festphasepeptidsynthese (Simadzu APS-800, Simadzu Seisakusho, Japan) wurden 4,33 g BOC-Tyr(Bzl)-Harz (Tyr-Gehalt 2,18 mM) eingebracht. Nach Anquellen mit Dichlormethan wurden BOC-Phe-OH, BOC-Phe-OH, BOC-Phe-OH, BOC-Arg(NOz) und Z-ß-Ala-OH nach dem DCC-Verfahren (Merrifield-Verfahren) zugegeben (siehe J.A.C.S. 86,304 (1964). Nach beendigter Reaktion wurde das Harz mit Dichlormethan, DMF, Äthanol, Eisessig und Methanol gewaschen und dann getrocknet, Ausbeute: 6,55 g Peptidharz.

b) Herstellung von Z-ß-Ala-Arg(N02)-Phe-Phe-Phe-Tyr-(Bzl)-NH2

In 50 ml 17 %igem Ammoniak-Methanol wurden 6,04 g des gemäss a) hergestellten Harzes suspendiert und die Suspension wurde bei Raumtemperatur 48 Stunden lang gerührt, das Harz abfiltriert und das Filtrat bei vermindertem Druck zur Trockene eingeengt, der Rückstand mit Äther versetzt und das entstandene Pulver abfiltriert und getrocknet. Ausbeute: 2,43 g c) Herstellung von ß-Ala-Arg-Phe-Phe-Phe-Tyr-NH2

In 30 ml Eisessig wurden 500 mg des nach b) hergestellten rohen, geschützten Peptidamides gelöst und dann wurde innerhalb von 10 Stunden unter Verwendung von Palladiumschwarz als Katalysator die katalytische Reduktion vorgenommen, der Katalysator abfiltriert und das Filtrat bei vermindertem Druck zur Trockene eingeengt, der Rückstand in 5 ml Wasser gelöst und die Lösung über eine mit Carboxymethylzellulose gefüllte Kolonne (2,6 X 24,5 cm geleitet. Die Elution wurde nach dem Gradientenverfahren unter Verwendung von 0,005M und 0,2M wässrigen Ammoniumacetatlösungen (je 800 ml) durchgeführt. Nach Sammeln und Lyophilisieren der Fraktionen von 1180 bis 1545 ml betrug die Ausbeute 237 mg (64%) ;

[et] q - 33,19° (c=0,46% Wasser).

Elementaranalyse für C45H5407N9 • 2C2H4Oz • 3H20

berechnet C 58,44; H 6,81; N 12,52 gefunden C 58,44; H 6,24; N 12,86

Aminosäureanalyse:

Arg 1,00; Tyr 0,81 ; Phe 3,20 ; ß-Ala 0,9 (Peptidgehalt 84,8%).

Beispiel 14 ß-Ala-Arg-Leu-Phe-Phe-Tyr-Gly-NH2 a) Herstellung des Z-ß-Ala-Arg(Tos)-Leu-Phe-Phe-Tyr(Bzl)-Gly-Harzes

In ein Reaktionsgefäss Festphasepeptid-Synthetisators (Simadzu APS-800) wurden 4,0 g BOC-Gly-Harz (mit einem Gehalt von 1,7 mM Äquivalent Gly) eingebracht und mit Dichlormethan 20 Stunden lang angequollen. Dann wurden in das s Reaktionsgefäss BOC-Phe-OH, BOC-Phe-OH, BOC-Leu-OH, Aoc-Arg(Tos)-OH, und Z-ß-Ala-OH, mit DCC als Kondensationsmittel und Trifluoressigsäure-Dichlormethan (1:1) als Mittel zur Entfernung des BOC, eingebracht. Nach Beendigung aller Reaktionen wurde das Harz mit Dichlormethan, DMF,

m Methanol, Eisessig und Methanol gewaschen und dann getrocknet. Ausbeute: 5,09 g.

b) Herstellung von Z-ß-Ala-Arg(Tos)-Leu-Phe-Phe-Tyr(BzI)-Gly-NH2

In 50 ml 17%igem Ammoniak-Methanol wurden 4,4 g des nach a) hergestellten Harzes suspendiert und nach Versiegeln des Gefässes wurde die Suspension bei Raumpemperatur 48 Stunden lang gerührt.

Dann wurde das Harz abfiltriert und mit DMF gewaschen. Die Filtrate wurden kombiniert und bei vermindertem Druck zur Trockene eingeengt. Der ölige Rückstand wurde mit Äther versetzt und das entstandene Pulver abfiltriert. Ausbeute: 950 mg.

c) Herstellung von ß-Ala-Arg-Leu-Phe-Phe-Tyr-Gly-NH2

500 mg des nach b) hergestellten rohen, geschützten Peptidamides wurden mit 0,5 ml Änisol versetzt und das Gemisch dann zu 10 ml Fluorwasserstoff zugegeben, bei 0° C 60 min lang gerührt und der Fluorwasserstoff bei vermindertem Druck abdestilliert, der Rückstand in 50 ml Wasser gelöst und die Lösung zweimal mit je 20 ml Äther gewaschen und über eine mit Amberlite IRA-410 (Acetatform) gefüllte Kolonne (1X10 cm) geleitet und lyophilisiert. Das Produkt wurde in 20 ml Wasser gelöst und die Lösung über eine mit Carboxymethylzellulose gefüllte Kolonne (2,6 X 25 cm) geleitet. Dann wurde die Elution nach dem Gradientenverfahren unter Verwendung von 0,005M und 0,2M wässrigen Ammoniumacetatlösungen (je 800 ml) vorgenommen. Die Fraktionen von 1200 ml bis 1530 ml wurden vereinigt und lyophilisiert. Ausbeute: 167 mg eines weissen, flaumigen Produktes ;

4o [a] 2^-28.93° (c=0,6% Wasser)

Elementaranalyse für C44H6. OgN. ■ • 2C2H402 • 3 • 5H20 berechnet C 54,64; H 7,26; N 14,60

gefunden C 54,64; H 7,58; N 14,37

45

Aminosäureanalyse :

Arg 1,06; Gly 1,00; Leu 1,11; Tyr 0,87; Phe 2,09; ß-AIa 1,14 (Peptidgehalt 82,0%).

5(i Beispiel 15

ß-Ala-Arg-Ser-Phe-Phe-Tyr-Gly-NH2

a) Herstellung von Z-ß-Ala-Arg(Tos)-Ser(BzL)-Phe-Phe-Tyr(Bzl)-Gly-harz

In ein für die Festphasepeptidsynthese bestimmtes Reak-

55 tionsgefäss (Modell APS-800 Simadzu Seisakusho, Japan) wurden 4,02 g BOC-Gly-Harz (mit einem Gehalt von 2,17 mMol Gly) und BOC-Tyr(Bzl)-OH, BOC-Phe-OH, BOC-Phe-OH, BOC-Ser(Bzl)-OH, Aoc-Arg(Tos)-OH und Z-ß-Ala-OH nach dem Merrifield-Verfahren eingebracht. Nach Beendigung sämt-licher Reaktionen wurde das Harz mit Dichlormethan, Methanol, DMF, Eisessig und Methanol gewaschen und dann getrocknet. Ausbeute: 6,4 g.

b) Herstellung von Z-ß-Ala-Arg(Toy)-Ser(Bzl)-Phe-Phe-Tyr(BzI)-Gly-NH2

6S In 50 ml 17%igem Ammoniak/Methanol wurden 5,9 g des nach a) hergestellten Harzes suspendiert und die Suspension wurde bei Raumtemperatur 48 Stunden lang gerührt, das Harz abfiltriert und mit DMF gewaschen, das Waschwasser mit dem

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12

Filtrat kombiniert und die kombinierte Lösung bei vermindertem Druck zur Trockene eingeengt, der Rückstand mit Äther versetzt und das entstandene Pulver abfiltriert. Ausbeute: 2,02 g.

c) Herstellung von ß-Ala-Arg-Ser-Phe-Phe-Tyr-Gly-NH2

In 10 ml wasserfreiem Fluorwasserstoff wurden 1,0 g des nach b) hergestellten rohen, geschützten Peptidamides und 1 ml Anisol gelöst und die Lösung wurde 60 min lang bei 0° C gerührt. Der Fluorwasserstoff wurde darauf bei vermindertem Druck abdestilliert und der Rückstand in 20 ml Wasser gelöst. Die Lösung wurde zweimal mit je 10 ml Äther gewaschen und über eine mit Amberlite IRA-410 gefüllte Kolonne (1,0 X15 cm) geleitet und lyophilisiert, das Produkt in 10 ml Wasser gelöst und die Lösung über eine mit Carboxymethylzellulose gefüllte Kolonne (2,5 X 25 cm) geleitet. Die Elution wurde nach dem Gradientenverfahren unter Einsatz von je 800 ml 0,005M und 0,2M wässrigen Ammoniumacetatlösungen vorgenommen. Die Fraktionen von 800 ml bis 950 ml wurden vereinigt und lyophilisiert und das Produkt über eine mit Amberlite XAD-2 (von Rohm & Haas Co. Ltd. USA, Polystyrolharz) gefüllte Kolonne (2X10 cm) (Wasser) geleitet und lyophilisiert. Ausbeute: 55 mg der oben angeführten Verbindung in Form eines weissen, flaumigen Produktes.

[a) p -30,11° (c— 0,47% Wasser).

Aminosäureanalyse:

Arg 1,04 ; Ser 0,96 ; Gly 1,00 ; Tyr 0,88 ; Phe 2,10 ; ß-Ala 0,98 (Peptidgehalt 83,0%).

Beispiel 16

ß-Ala-Arg-Pro-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys-Ala-OH

In 30 ml Methanol wurden 1,16 g Z-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys(B0C)-Ala-0'Bu gelöst und die katalytische Reduktion wurde innerhalb von 4 Stunden unter Einsatz von Palladiumschwarz als Katalysator durchgeführt, der Katalysator wurde abfiltriert und das Filtrat bei vermindertem Druck zur Trockene eingeengt, der Rückstand in 15 ml DMF gelöst und die Lösung mit 492 mg Z-ß-Ala-arg(N02)-Pr0-0H und 200 mg HONB, dann unter Eiskühlung mit 250 mg DCC versetzt und die Mischung 18 Stunden lang gerührt.

Darauf wurden die unlöslichen Substanzen abfiltriert und das DMF wurde bei vermindertem Druck abdestilliert, der Rückstand mit Äthylacetat versetzt und das entstandene Pulver getrocknet und in 10 ml Trifluoressigsäure gelöst, die Lösung 40 min lang stehen gelassen, die Trifluoressigsäure bei vermindertem Druck abdestilliert und der Rückstand in 30 ml Eisessig gelöst, dann innerhalb von 16 Stunden die katalytische Reduktion unter Einsatz von Palladiumschwarz als Katalysator vorgenommen.

Der Katalysator wurde abfiltriert und das Filtrat bei vermindertem Druck zur Trockene eingeengt und in 10 ml Wasser gelöst. Nach einem Ionenaustauschvorgang auf Amberlite IRA-140 wurden die kleinen Mengen an unlöslichen Substanzen abfiltriert und das Filtrat wurde über eine mit Carboxymethylzellulose gefüllte Kolonne (2,2 X 30 cm) geleitet. Die Elution wurde nach dem Gradientenverfahren unter Einsatz von je 800 ml 0,005M und 0,2M wässriger Ammoniumacetatlösungen vorgenommen. Nach Vereinigung und Lyophilisieren der Fraktionen von 820 ml bis 1180 ml betrug die Ausbeute 670 mg eines weissen, flaumigen Produktes.

Aminosäureanalyse:

Lys 1,02 ; Arg 0,98 ; Thr 0,96 ; Pro 2,04 ; Ala 1,00 ;

Tyr 0,87 ; Phe 2,02; ß-Ala 1,05 (Peptidgehalt 74%).

Beispiel 17

ß-Ala-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Leu-OH a) Herstellung von Z-Phe-Phe-Tyr-OEt

In 30 ml Äthanol wurden 3,43 g Z-Phe-Tyr-OEt gelöst, dann folgte die katalytische Reduktion unter Verwendung von Palladiumschwarz als Katalysator innerhalb von 2 Stunden. Der Katalysator wurde abfiltriert und das Lösungsmittel bei vermin-? dertem Druck abdestilliert, der Rückstand in 15 ml DMF gelöst und mit 2,77 g Z-Phe-OSu versetzt, das entstandene Gemisch wurde 10 Stunden lang gerührt. Diesem Reaktionsgemisch wurden 80 ml Wasser zugegeben und die entstandenen Kristalle abfiltriert und aus Äthanol-Äthylacetat-Äthyläther umkristalli-lii siert. Ausbeute: 3,72 g (83,4%); Nadeln; Fp: 185—186° C.

[a] 'q —18,1° (c=l,09% DMF).

Elementaranalyse für C37H39O.7N3 .berechnet C69,68; H6,16; N6,59 "gefunden C 69,64; H 6,14; N 6,54

b) Herstellung von Z-ß-Ala-Arg (N02)-Gly-Phe-Phe-Tyr-0Et

In 50 ml Äthanol wurden 2,0 g Z-Phe-Phe-Tyr-OEt suspendiert, die katalytische Reduktion wurde unter Verwen-dung von Palladiumschwarz als Katalysator innerhalb von 1,5 Stunden durchgeführt, der Katalysator abfiltriert und das Lösungsmittel bei vermindertem Druck abdestilliert. Der Rückstand wurde in 20 ml DMF gelöst und unter Eiskühlung mit ^ 1,56 g Z-ß-AIa-Arg(N02)-GIy-0H, 0,7 g HONB und 0,8 g DCC versetzt und das Gemisch wurde schliesslich 12 Stunden lang gerührt.

Dann wurde das entstandene Harnstoffderivat abfiltriert und das DMF bei vermindertem Druck abdestilliert, der Rückstand mit 60 ml Wasser versetzt und das entstandene Pulver abfiltriert, getrocknet und aus DMF-Äthylacetat erneut ausgefällt; Ausbeute: 2,58 g (82%); Fp: 83-85° C;

[ex] 11 -10.0° (c=l,l%DMF).

35 Elementaranalyse für C48H5gO12N10 • 2H20 berechnet C 57,43; H 6,23; N 13,97 gefunden C 57,41; H 6,05; N 14,49

c) Herstellung von Z-ß-Ala-Arg(N02)-Gly-Phe-Phe-Tyr-0H 4(| In 30 ml Aceton wurden 2,00 g Z-ß-Ala-Arg(N02)-Gly-

Phe-Phe-Tyr-OEt suspendiert und unter Eiskühlung mit 6,3 ml IN wässrigem Natriumhydroxid versetzt. Dann wurde die Mischung 1 Stunde lang bei Raumtemperatur gerührt, mit 3 ml IN Salzsäure versetzt und das Aceton bei vermindertem Druck 4 J abdestilliert, die kleine Menge an unlöslichen Substanzen wurde abfiltriert und das Gemisch mit 3,8 ml IN Salzsäure versetzt. Der entstandene Niederschlag wurde abfiltriert, gut mit Wasser gewaschen und getrocknet. Ausbeute: 1,96 g (98%) Fp: 70-73° C;

«> [a] - 8,7° (c=0,97% DMF).

Elementaranalyse für QeH54O12N10 -H20 berechnet C57,77; H5,90; N 14,64 gefunden C58,13; H5,89; N 14,51

55 d) Herstellung von Z-ß-Ala-Arg(N02)-GIy-Phe-Phe-Tyr-Leu-OBzl

In 5 ml DMF wurden 275 ml H-Leu-OBzl-p-Toluolsulfonat gelöst, die Lösung wurde mit 0,9 ml 10% N-Äthylmorpholin-DMF neutralisiert und unter Eiskühlung mit 670 mg Z-ß-Ala-fio Arg(N02)-Gly-Phe-Phe-Tyr-0H, 251 mg HONB und 289 mg DCC versetzt, das Gemisch 12 h lang gerührt und der entstandene DC-Harnstoff abfiltriert, das DMF bei vermindertem Druck abdestilliert und der Rückstand mit 30 ml Wasser versetzt. Der entstandene Niederschlag wurde abfiltriert, mit heis-f>5 sem Methanol gewaschen und getrocknet; Ausbeute: 703 mg (87,9%) ;Fp: 178-181° C;

[a] 2^ -15,0° (c= 1,02% DMF).

13

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Elementaranalyse für C59H72OJ3N1 j berechnet C61,98; H 6,35; N 13,49

gefunden C 61,88; H 6,78; N 13,15

e) Herstellung von ß-AIa-Arg-GIy-Phe-Phe-Tyr-Leu-OH

In 30 ml Essigsäure wurden 500 mg Z-ß-Ala-Arg(N02)-Gly-Phe-Phe-Tyr-Leu-OBzl gelöst, darauf folgte die katalytische Reduktion mit Palladiumschwarz als Katalysator innerhalb von 8 Stunden. Der Katalysator wurde abfiltriert und das Lösungsmittel bei vermindertem Druck abdestilliert, der Rückstand in 5 ml Wasser gelöst und die Lösung über eine mit Carboxymethylzellulose gefüllte Kolonne (2,6 X18 cm) geleitet, die Elution nach dem linearen Gradientenverfahren unter Einsatz von je 700 ml 0,005M und 0,2M wässrigem Ammoniumacetat durchgeführt. Die oben angeführte Verbindung lag in den Fraktionen von 370 ml bis 720 ml vor, diese wurden vereinigt und lyophilisiert. Ausbeute: 277 mg. (64,2%);

[a] 2l - 32,5° (c=0,51 % Wasser).

Elementaranalyse für C44H60O9N10 ■ C2H402 • 3H20 berechnet C 55,97; H 7,15; N 14,19

gefunden C 55,80; H 7,20; N 14,17

Aminosäureanalyse :

Arg 1,00; Gly 1,04; Leu 1,08; Phe 2,16; Tyr 0,88; ß-Ala 1,04; (Peptidgehalt 85,9%)

Beispiel 18 ß-Ala-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Ala-NH2

Die in den Beispielen 17-d) und -e) beschriebenen Verfahren wurden wiederholt, jedoch H-Ala-NH2. Hydrochlorid statt H-Leu-OBzl-p-ToluolsuIfonat verwendet. Ausbeute: 216 mg-ß-Ala-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Ala-NH2. di-Acetat

Aminosäureanalyse :

Arg 1,01 ; Gly 1,00; Ala 1,02; Phe 2,00; Tyr 0,89; ß-Ala 1,12 (Peptidgehalt 82,4%).

Beispiel 19 ß-Ala-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-OH

a) Herstellung von Z-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-O'Bu

In 30 ml Methanol wurden 1,80 g Z-Thr-Pro-O'Bu gelöst, dann wurde innerhalb von 5 Stunden die katalytische Reduktion unter Verwendung von Palladiumschwarz als Katalysator durchgeführt, der Katalysator abfiltriert und das Lösungsmittel bei vermindertem Druck abdestilliert, der Rückstand in 20 ml DMF gelöst und nach Kühlen der Lösung auf —10° C mit 2,70 g Z-Phe-Phe-Tyr-OH, 1,59 g HONB und 1,37 g DCC versetzt. Das Gemisch wurde 18 Stunden lang gerührt, das entstandene Harnstoff dérivât abfiltriert und mit 100 ml Wasser versetzt, der entstandene Niederschlag wurde abfiltriert, getrocknet und in 100 ml Äthylacetat gelöst. Die Lösung zweimal mit je 50 ml Wasser gewaschen und über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet, das Lösungsmittel abdestilliert und der Rückstand mit Äthylacetat versetzt, das entstandene Pulver abfiltriert und getrocknet, Ausbeute: 2,51 g (89,8%); Fp: 137—139° C;

[a] -44,1° (= 1,08% DMF).

Elementaranalyse für C48H57O10N5H2O berechnet C 65,36; H 6,74; N7,94

gefunden C 65,49; H 6,82; N7,91

b) Herstellung von Z-ß-Ala-Arg (N02)-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-O'Bu

In 20 ml Methanol wurden 1,50 g Z-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-O'Bu gelöst, die katalytische Reduktion wurde innerhalb von 4 Stunden im Wasserstoff ström unter Verwendung von Palladiumschwarz als Katalysator durchgeführt, der Katalysator wurde abfiltriert und das Lösungsmittel bei vermindertem Druck abdestilliert.

Der Rückstand wurde in 10 ml DMF gelöst und die Lösung unter Eiskühlung mit 0,87 g Z-ß-Ala-Arg-(N02)-Gly-0H, s 0,47 g HONB und 0,54 g DCC versetzt, das Gemisch 16 Stunden lang gerührt, der entstandene DC-Harnstoff abfiltriert und das Filtrat mit 50 ml Wasser versetzt, worauf sich ein Niederschlag in Form eines Gels bildete. Dieser Niederschlag wurde abfiltriert, getrocknet und aus DMF-Äthylacetat erneut ausge-I» fällt. Der so gebildete Niederschlag wurde abfiltriert und nochmals aus Äthanol umgefällt. Ausbeute: 1,40 g (67,4%; Fp: 153-156° C;

[a] ^ — 32,3° (c=0,97 % DMF).

I S

Elementaranalyse für D59H76015N12 berechnet C58,50; H6,57; N 13,88

gefunden C 58,24; H 6,54; N 13,87

c) Herstellung von ß-Ala-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-OH 211 900 mg Z-ß-Ala-Arg(N02)-GIy-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-O'Bu wurden mit 0,9 ml Anisol und darauf mit 10 ml wasserfreiem Fluorwasserstoff versetzt. Das Gemisch wurde bei — 4° C 30 Minuten lang gerührt, der Fluorwasserstoff bei vermindertem Druck abdestilliert und der Rückstand mit 30 ml Wasser 25 versetzt.

Die Lösung wurde mit 30 ml Äthyläther extrahiert und die wässrige Schicht über eine Kolonne (1,0 X 10,0 cm), Amberlite IRA-410 (Acetatform) geleitet, darauf wurde die Kolonne mit Wasser gewaschen, das Waschwasser mit den Abwässern verei-nigt und die kombinierte Lösung lyophilisiert. Das Produkt wurde in 10 ml Wasser gelöst und die Lösung über eine mit Carboxymethylzellulose gefüllte Kolonne (2,2 X 21 cm) geleitet. Darauf wurde die Elution nach dem Gradientenverfahren unter Verwendung von je 700 ml 0,005 M und 0,3 M wässrigem 15 Ammoniumacetat vorgenommen, die gewünschte Verbindung lag in den Fraktionen von 235 bis 385 ml vor. Nach Vereinigen und Lyophilisieren derselben betrug die Ausbeute 476 mg (57,0%).

4» [a] ^ -38,8° (c=0,25% Wasser).

Elementaranalyse für C47H630uNuC2H402-5H20 berechnet C53,10; H7,00; N 13,91

gefunden C 53,27; H7,04; N 13,82

Aminosäureanalyse :

Arg 1,05; Thr 1,00; Pro 1,02; Gly 0,95; Tyr 0,95; Phe 2,02; ß-Ala 0,93 (Peptidgehalt 85,5%).

5»

Beispiel 20

e-Acap-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-OH a) Herstellung von Z-e-Acap-Arg(N02)-Gly-0Et

2,41 g Z-Arg(N02)-Gly-0Et wurden mit 12 ml 25 %iger 55 HBr-Essigsäure versetzt und die Mischung wurde bei Raumtemperatur 40 min lang geschüttelt, darauf die Lösung mit Äthyläther versetzt und der entstandene Niederschlag abfiltriert und über Natriumhydroxid getrocknet.

Anderseits wurden 1,33 g Z-e-Acap-OH und 0,99 g HONB M, in 5 ml Tetrahydrofuran gelöst und unter Eiskühlung mit 1,14 g DCC versetzt. Das Gemisch wurde 4 Stunden lang gerührt und der entstandene Dicyclohexyharnstoff abfiltriert. Die oben angeführte Aminokomponente wurde in 10 ml DMF gelöst und nach Neutralisieren der Lösung mit Triäthylamin mit der oben ,,5 angegebenen aktiven Esterlösung versetzt, das Gemisch über Nacht gerührt, das Lösungsmittel bei vermindertem Druck abdestilliert und der Rückstand in 50 ml Äthylacetat gelöst. Die Lösung wurde mit Wasser und dann mit einer gesättigten,

618 959

14

wässerigen Natrimbicarbonatlösung (50 ml X2), dann wieder mit Wasser gewaschen und über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet, das Lösungsmittel bei vermindertem Druck abdestilliert und der Rückstand mit Petroleumbenziun versetzt. Nach Umkristallisieren der erhaltenen Kristalle aus Wasser-Äthanol-Äthylacetat betrug die Ausbeute 2,1 g (76%) ; Fp: 85-87° C;

[a] ^ — 11,9° (c= 1,0% DMF).

Elementaranalyse für C24H3708N7

berechnet C52,26; H6,76; N 17,78

gefunden C 52,43; H 6,64; N 17,76

b) Herstellung von Z-e-Acap-Arg(N02)-Gly-0H

In 10 ml Aceton wurden 1,8 Z-e-Acap-Arg(N02)-Gly-0Et gelöst und nach Eiskühlung mit 2,9 ml 2 N Natriumhydroxid versetzt. Das Gemisch wurde 2 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt, mit 2,5 ml 1 N Salzsäure versetzt und das Aceton abdestilliert, der Rückstand mit 10 ml Wasser versetzt und die Lösung nach Abfiltrieren der unlöslichen Substanzen mit 1 N Salzsäure angesäurert. Die entstandenen Kristalle wurden abfiltriert. Ausbeute: 1,59 g (93%). Fp: 97,5-99° C;

M2£-

10,7° (c= 1,0% DMF).

Elementaranalyse für C22H330gN7 • H20

berechnet C48,79; H 6,52; N 18,10

gefunden C48,50; H6,28; N 18,23

c) Herstellung von e-Acap-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-OH

Das in Beispiel 19-b) beschriebene Verfahren wurde wiederholt, jedoch unter Ersetzen des Z-ß-Ala-Arg(N02)-Gly-0H durch Z-e-Acap-Arg(N02)-Gly-0H. Bei Wiederholung der in den Beispielen 19-b) und -c) beschriebenen Verfahren betrug die Ausbeute 428 mg der oben angeführten Verbindung.

37,9° (c=0,25% Wasser).

M D

Aminosäureanalyse :

Arg 1,02 ; Thr 1,02 ; Pro 1,00 ; Gly 1,01 ; Phe 2,04 ; Tyr 0,92 ; e-Acap (nicht bestimmt) - Peptidgehalt 84,9%).

Beispiel 21 Lys-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-OH

a) Herstellung von di-Z-Lys-Arg(N02)-Gly-0Et

Das in Beispiel 20-a) beschriebene Verfahren wurde unter Einsatz von 2,07 g di-Z-Lys-OH wiederholt, man erhielt die oben angeführte Verbindung in Gelform, das Gel wurde aus Wasser-Äthanol-Äthylacetat erneut umgefällt. Ausbeute: 2,57 g (73%); Fp: 161-162° C;

[a]2^-ll,9° (c= 1,0% DMF).

Elementaranalyse für C32H44O10N8 berechnet C 54,85; H 6,33; N 15,99

gefunden C 54,45; H 6,05; N 15,99

b) Herstellung von di-Z-Lys-Arg(N02)-Gly-0H

In 10 ml Aceton wurden 2,0 g di-Z-Lys-Arg(N02)-Gly-OEt gelöst und unter Eiskühlung mit 2,1 ml 2 N Natriumhydroxid versetzt. Darauf wurde das Gemisch 2 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt, mit 1,4 ml 1 N Salzsäure versetzt, das Aceton bei vermindertem Druck abdestilliert und der Rückstand mit 10 ml Wasser versetzt.

Die unlöslichen Substanzen wurden abfiltriert und das Filtrat wurde mit 1 N Salzsäure angesäuert, die entstandenen Gele abfiltriert. Ausbeute: 1,78 g (93%); Fp: 131-132,5° C;

[a] 2£ -10,5° (c= 1,0% DMF).

Elementaranalyse für C30H4U010Ng • 3/2H20 berechnet C 51,49; H 6,20; N 16,02

gefunden C51,43; H5,92; N16,23;

c) Herstellung von Lys-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-OH

Das in Beispiel 19-b) beschriebene Verfahren wurde wiederholt, jedoch unter Ersetzen des Z-ß-Ala-Arg(N02)-Gly-0H durch di-Z-Lys-Arg(N02)-Gly-0H. Ausbeute: 452 g der oben angeführten Verbindung.

m [a] ^ — 34,8° (c=0,4% Wasser).

Aminosäureanalyse:

Lys 1,08; Arg 1,01 ; Thr 0,92; Pro 1,00; Gly 1,00;

Phe 2,08 ; Tyr 0,89 (Peptidgehalt 85,2%).

' Beispiel 22

ß-Ala-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys-Ala-OH a) Herstellung von Z-Lys(B0C)-Ala-0'Bu

In 300 ml Methanol wurden 14 gZ-Ala-O'Bu gelöst und die katalytische Reduktion wurde innerhalb von 2 Stunden unter Einsatz von Palladiumschwarz als Katalysator durchgeführt, der Katalysator abfiltriert und das Methanol abdestilliert. Der Rückstand wurde in 50 ml Tetrahydrofuran gelöst.

Gleichzeitig wurden 28,1 g Z-Lys(BOC)-OH-dicyclohexyl-aminsalz in 300 ml Äthylacetat suspendiert und dreimal mit je 200 ml 0,5 N Schwefelsäure, darauf mit Wasser gewaschen und über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet.

Darauf wurde das Äthylacetat bis auf ein Volumen von etwa 150 ml abdestilliert, der Rückstand der oben angeführten i(| Tetrahydrofuranlösung zugegeben und mit 10 g HONB versetzt. Dann wurden unter Eiskühlung 11,3g DCC zugegeben und das Gemisch wurde 16 Stunden lang gerührt. Der entstandene DC-Harnstoff wurde abfiltriert und das Filtrat zur Trok-kene eingeengt, der Rückstand in 500 ml Äthylacetat gelöst und mit 0,5 N Schwefelsäure und 4%igem, wässrigem Natriumbicar-bonat, darauf gut mit Wasser gewaschen und die Äthylacetat-schicht über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet. Das Lösungsmittel wurde bei vermindertem Druck zur Trockene eingeengt und mit Petroläther versetzt, worauf Kristalle ent-4(| standen, welche abfiltriert und aus Äthylacetat-Petroläther umkristallisiert wurden. Ausbeute: 21,9 g (87 %) ; Fp:

55-57° C;

[a]2^ -30,17° (c= 1,16%Methanol).

■15 Elementaranalyse für C26H4107N3

berechnet C 61,52; H 8,14; N8,28 gefunden C 61,61; H 8,10; N8,18

S(, b) Herstellung des Z-Pr0-Lys(BOC)-Ala-O'Bu

In 40 ml Methanol wurden 2,5 g Z-Lys(B0C)-Ala-0'Bu gelöst, dann wurde innerhalb von 2 Stunden die katalytische Reduktion unter Verwendung von Palladiumschwarz als Katalysator durchgeführt. Der Katalysator wurde abfiltriert, das 55 Filtrat bei vermindertem Druck zur Trockene eingeengt und der Rückstand in 20 ml Äthylacetat gelöst. Diese Lösung wurde mit 2,45 g Z-Pro-ONB versetzt und das Gemisch 18 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt. Es wurde dann mit 200 ml Äthylacetat versetzt und darnach mit 0,5 N Schwefelsäure und M) 4 %igem wässrigem Natriumbicarbonat, darauf dreimal mit Wasser gewaschen, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und bei vermindertem Druck zur Trockene eingeengt. Der Rückstand wurde mit Petroläther versetzt, die entstandenen Kristalle wurden abfiltriert und aus Äthylacetat-Petroläther ()5 umkristallisiert. Die Ausbeute betrug 2,53 g (85 %) ; Fp: 127-129° C;

[a] ^ - 64,52° (c= 1,04% Methanol).

15

618 959

Elementaranalyse für C3IH480(jN4 berechnet C 61,57; H 8,00; N 9,27

gefunden C 61,81; H 1,31; N9,37

c) Herstellung von Z-Thr-Pro-Lys(BOC)-Ala-0'Bu

In 40 ml Methanol wurden 2,12 g Z-Pro-Lys(BOC)-Ala-O'Bu gelöst, dann wurde die katalytische Reduktion innerhalb von 3 Stunden unter Einsatz von Palladiumschwarz als Katalysator vorgenommen, der Katalysator abfiltriert und das Lösungsmittel bei vermindertem Druck abdestilliert.

Der Rückstand wurde in 20 ml Dioxan gelöst, gleichzeitig wurden 977 mg Z-Thr-OH und 806 mg HONB in 10 ml Äthyl-acetat-Dioxan (1:1) gelöst und unter Eiskühlung mit 800 mg DCC versetzt. Das Gemisch wurde 6 Stunden lang gerührt und der entstandene DC-Harnstoff abfiltriert, das Filtrat der oben angeführten Dioxanlösung zugegeben, das Gemisch 16 Stunden lang gerührt, das Lösungsmittel bei vermindertem Druck abdestilliert und der Rückstand in 150 ml Äthylacetat gelöst. Die Lösung wurde mit 0,5 N Schwefelsäure und 4%igem wässrigem Natriumbicarbonat, darauf mit Wasser gewaschen, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und das Lösungsmittel bei vermindertem Druck abdestilliert. Der Rückstand wurde mit Petroläther versetzt und das entstandene Pulver gesammelt. Ausbeute: 2,3 g (93%); Fp: 64-67° C;

[a] -75,58° (c=0,995 Methanol).

Elementaranalyse für C35H55O10N5 berechnet C 59,55; H 7,85; N9,92

gefunden C 59,28; H 7,99; N9,65

d) Herstellung von Z-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys(BOC)-Ala-O'Bu

In 70 ml Methanol wurden 1,41 g Z-Thr-Pro-Lys (BOC)-Ala-O'Bu gelöst und dann wurde innerhalb von 2 Stunden unter Verwendung von Palladiumschwarz als Katalysator die katalytische Reduktion durchgeführt, der Katalysator abfiltriert und das Lösungsmittel bei vermindertem Druck abdestilliert, der Rückstand in 10 ml DMF gelöst und mit 1,1 g Z-Phe-Phe-Tyr-OH und 720 mg HONB, darauf unter Eiskühlung mit 618 g DCC versetzt und das Gemisch 20 Stunden lang gerührt, das Lösungsmittel bei vermindertem Druck abdestilliert und der Rückstand mit Äthylacetat-Äther (1:1) behandelt. Das entstandene Pulver wurde abfiltriert und aus Äthanol kristallisiert. Ausbeute: 2,1 g (100%); Fp: 160-163,5° C;

[<x] 2^ - 63,73° (c= 1,05% Methanol)

Elementaranalyse für C62Hg0O16N8 berechnet C 62,09; H 7,23;

gefunden C 62,02; H 7,14;

N 9,34 N 9,64

Elementaranalyse für C70Ha6OI8N|4

berechnet C 59,14; H 6,81; N 13,80

gefunden C 58,82; H 6,80; N 13,66

. f) Herstellung von ß-Ala-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys-Ala-OH

In einem Gemisch aus Methanol und Eisessig (2:1) wurden 710 mg Z-Arg(N02)-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys(B0C)-Ala-O'Bu gelöst und dann wurde innerhalb von 8 Stunden unter 1 Verwendung von Palladiumschwarz als Katalysator die katalytische Reduktion vorgenommen, der Katalysator abfiltriert und das Filtrat bei vermindertem Druck zur Trockene eingeengt. Der Rückstand wurde in 10 ml Wasser gelöst und die Lösung über eine mit Carboxymethylzellulose gefüllte Kolonne (130 ml) geleitet. Die Elution wurde nach dem Gradientenverfahren unter Einsatz von je 800 ml 0,005M und 0,2M wässrigem Ammoniumacetat vorgenommen. Die Fraktionen von 913 ml bis 1190 ml wurden vereinigt und lyophilisiert. Ausbeute: 350 mg eines weissen, flaumigen Produktes.

211 Dieses Pulver wurde in 8 ml DMF gelöst und mit 41 mg p-Toluolsulfonsäuremonohydrat versetzt. Darauf folgte die Zugabe von 82 mg BOC-ß-Ala-ONB und die Mischung wurde 16 Stunden lang gerührt, das DMF unter vermindertem Druck abdestilliert und der Rückstand mit 3 ml Trifluoressigsäure versetzt, das Gemisch 30 min lang geschüttelt und die Trifluoressigsäure abdestilliert, der Rückstand in 10 ml Wasser gelöst und über eine mit Amberlite IRA-410 (Acetatform) gefüllte Kolonne (1,0 X10 cm) geleitet, wodurch die Verbindung zum Acetat umgewandelt wurde. Das Eluat wurde lyophilisiert und <ii über eine mit Carboxymethylzellulose gefüllte Kolonne (2,2 X17 cm) geleitet, dann die Elution nach dem Gradientenverfahren unter Einsatz von je 500 ml 0,005 M und 0,2 M wässrigem Ammoniumacetat vorgenommen. Die Fraktionen von 430 ml bis 500 ml wurden zusammengegeben und lyophili-siert. Ausbeute: 250 mg eines weissen flaumigen Produktes.

[a]2^-58,8° (c=0,5% Wasser).

Aminosäureanalyse:

Lys 1,00; Arg l,03;Thr 1,00; Pro 1,04; Gly 1,04;

4(i Ala 1,04; Tyr 0,89; Phe 2,00; ß-Ala 0,93 (Peptidgehalt 72%).

Beispiel 23

Gly-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys-Ala-OH 45 Das in Beispiel 22-f) beschriebene Verfahren wurde wiederholt, jedoch das BOC-ß-Ala-ONB durch BOC-Gly-ONB ersetzt. Es wurden 214 mg der oben angeführten Verbindung in Form eines weissen, flaumigen Produktes erhalten.

50

M D-

■59,2° (c=0,4% Wasser).

e) Herstellung von Z-Arg(N02)-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys(B0C)-Ala-0'Bu

In 30 ml Methanol wurden 2,32 g Z-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys(B0C)-Ala-0'Bu gelöst, dann wurde innerhalb von 3 Stunden die katalytische Reduktion unter Einsatz von Palladiumschwarz als Katalysator vorgenommen, der Katalysator abfiltriert und das Methanol abdestilliert, der Rückstand in 5 ml DMF gelöst. Dieser Lösung wurden 1,26 g Z-Arg(N02)-Gly-ONB zugegeben und die Mischung wurde 20 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt, das DMF bei vermindertem Druck abdestilliert und der Rückstand mit 50 ml Wasser versetzt, das entstandene Pulver abfiltriert und zweimal aus DMF-Wasser erneut ausgefällt. Ausbeute: 2,5 g (88%) ; Fp: 138-141° C (Zersetzung)

[et] - 32,4° (c=0,99 % DMF).

Aminosäureanalyse:

Lys 1,02; Arg 1,00;Thr 1,00; Pro 1,01; Gly 2,00;

Ala 1,03 ; Tyr 0,87 ; Phe 2,04 (Peptidgehalt 78 %).

55 Beispiel 24

Leu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Gly-NH2 a) Herstellung von Z-Leu-Arg(Tos)-GIy-Phe-Phe-Tyr(Bzl)-Gly-Harz

In ein für die Peptidherstellung nach dem Festphaseverfah-6() ren bestimmtes Reaktionsgefäss (Simadzu APS-800) wurden 4,04 g BOC-Gly-Harz mit einem Gehalt an Gly von 1,75 mMol eingebracht und mit Dichlormethan 20 Stunden lang angequollen. Darauf wurden nach dem Merrifieldverfahren BOC-Tyr(Bzl)-OH, BOC-Phe-OH, BOC-Phe-OH, BOC-Gly-OH, (,5 Aoc-Arg(Tos)-OH und Z-Leu-OH eingebracht. DCC wurde als Kondensationsmittel verwendet und jede Aminosäure in vier Äquivalenten eingesetzt, und die Entfernung der BOC-Grup-pen mit Trifluoressigsäure/Dichlormethan (1:1) vorgenommen.

618 959

16

Dann wurde das Harz aus dem Reaktionsgefäss genommen, mit Dichlormethan, DMF, Methanol und Essigsäure gewaschen und getrocknet. Ausbeute: 5,07 g des oben angeführten Harzes.

b) Herstellung von Z-Leu-Arg(Tos)-Gly-Phe-Phe-Tyr(Bzl)-Gly-NH2

In 50 ml 17%igem Ammoniak/Methanol wurden 4,41 g des nach a) hergestellten Harzes suspendiert, die Suspension wurde unter Sulfatschluss 48 Stunden bei Raumtemperatur gerührt, das Harz abfiltriert und gut mit DMF gewaschen. Filtrat und Waschlösung wurden vereinigt und das Lösungsmittel wurde bei vermindertem Druck abdestilliert. Der ölige Rückstand wurde mit Äthyläther versetzt, das entstandene Pulver abfiltriert und gut mit Äther gewaschen.

Ausbeute: 950 mg.

c) Herstellung von Leu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Gly-NH2

In 10 ml wasserfreiem Fluorwasserstoff wurden 500 mg des nach b) hergestellten, rohen, geschützten Peptidamides und 0,5 ml Anisol gelöst und die Lösung wurde bei 0° C 60 min lang gerührt, der Fluorwasserstoff abdestilliert und der Rückstand in 50 ml Wasser gelöst. Die Lösung wurde zweimal mit 20 ml Äthyläther extrahiert und die wässrige Schicht über eine mit Amberlite IRA-410 (Acetatform) gefüllte Kolonne (2X10 cm) geleitet und lyophilisiert. Das erhaltene Produkt wurde über eine mit Carboxymethylzellulose gefüllte Kolonne (2,3 X17 cm) geleitet und die Elution nach dem Gradientenverfahren unter Verwendung von je 400 ml 0,005M und 0,2M wässrigem Ammoniumacetat vorgenommen. Nach Lyophilisieren der Fraktionen von 490 ml bis 550 ml wurden 167 mg der oben angeführten Verbindung in Form eines weissen, flaumigen Produktes erhalten.

Aminosäureanalyse:

Arg 1,02 ; Gly 2,00 ; Leu 1,03 ; Tyr 0,89 ; Phe 2,08 (Peptidgehalt 84%).

Beispiel 25

ß-Ala-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Ala-Gly-NH2

a) Herstellung von Z-ß-Ala-Arg(Tos)-Gly-Phe-Phe-Tyr(Bzl)-Ala-Gly-Harz

In ein Reaktionsgefäss vom Typ Simadzu APS-800 wurden 3,03 g BOC-Gly-Harz mit einem Gly-Gehalt von 1,32 mM eingebracht und darauf mit Dichlormethan angequollen. Dann wurden BOC-Ala-OH, BOC-Tyr(Bzl)-OH, BOC-Phe-OH, BOC-Phe-OH, BOC-Gly-OH, Aoc-Arg-(Tos)-OH und Z-ß-Ala-OH gemäss der im symmetrischen Anhydridverfahren (siehe Hoppe-Seyler's, Z.Physiol.Chem. 353,1973(1972)) beschriebenen Reihenfolge zugegeben. In jedem Verfahrensschritt wurden die BOC-Gruppen mittels 50%igem Trifluores-sigsäure-Dichlormethan entfernt.

Ausserdem wurden in jedem Verfahrensschritt die nicht umgesetzten Aminogruppen mit Essigsäureanhydrid acetyliert. Nach Einbringen aller Äminosäuren wurde das Harz mit Äthanol, DMF, Dichlormethan, Essigsäure und Methanol gewaschen und bei vermindertem Druck getrocknet. Ausbeute: 3,70 g Peptidharz.

b) Herstellung von Z-ß-Ala-Arg(Tos)-Gly-Phe-Phe-Tyr(Bzl)-Ala-Gly-NH2

In 50 ml 17%igen Ammoniak/Methanol wurden 3,28 g des nach a) hergestellten Peptidharzes suspendiert, die Suspension wurde bei Raumtemperatur 40 Stunden lang gerührt, das Harz abfiltriert und mit 50 ml DMF gewaschen, das Filtrat und Waschwasser vereinigt und bei vermindertem Druck zur Trok-kene eingeengt. Der Rückstand wurde mit Äther versetzt, das entstandene Pulver abfiltriert und getrocknet. Ausbeute: 433 mg rohes, geschütztes Peptidamid.

c) Herstellung von ß-Ala-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Ala-Gly-NH2

In einem Gemisch aus 8 ml wasserfreiem Fluorwasserstoff und 0,3 ml Anisol wurden 310 mg des nach b) hergestellten,

rohen, geschützten Peptidamids gelöst, die Lösung wurde bei 0° C 60 min lang gerührt.

Der Fluorwasserstoff wurde bei vermindertem Druck abdestilliert und der Rückstand in 50 ml Wasser gelöst, die Lösung zweimal mit 10 ml Äther extrahiert, die wässerige Schicht über eine mit Amberlite IRA-410 (Acetatform) gefüllte Kolonne (1X10 cm), welche mit Wasser gewaschen wurde, geleitet. Der Effluent und das Waschwasser wurden vereinigt und die kombinierte Lösung wurde lyophilisiert, das Produkt in 10 ml Wasser gelöst und die Lösung über eine mit Carboxymethylzellulose gefüllte Kolonne (2,3 X17 cm) geleitet. Die Elution wurde nach dem Gradientenverfahren unter Einsatz von je 400 ml 0,005M und 0,2M wässerigen Ammoniumacetatlösungen vorgenommen, die Fraktionen von 495 ml bis 540 ml wurden vereinigt und lyophilisiert. Ausbeute: 134 mg des oben angeführten Produkts.

[a] -19,62° (c=0,53% Wasser).

Aminosäureanalyse: Arg 1,05 ; Gly 1,95 ; Ala 1,00 ; Tyr 0,86; Phe 1,98, ß-Ala 1,02 (Peptidgehalt 84%).

Elementaranalyse für C^H^OgN,-, • 2C2H402 ■ 4H20 berechnet: C 52,31; H 6,91; N 15,57

gefunden: C 52,40; H 6,55; N 15,65

Beispiel 26

a, Y-Dab-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Ala-Gly-NH2

Es wurde nach dem in Beispiel 25 beschriebenen Verfahren vorgegangen, jedoch als zuletzt zugegebene Aminosäure Di-Z-a,y-Abu-OH anstelle von Z-ß-Ala-OH eingesetzt. Man erhielt die oben angeführte Verbindung in Form eines weissen, flaumigen Produkts.

[a] q - 20,3° (c=0,2% Wasser)

Aminosäureanalyse: Arg 1,00; Gly 1,89; Ala 1,02;

Tyr 0,88 ; Phe 2,00 ; a/y-Abu 1,04 (Peptidgehalt 81,5%).

Beispiel 27 Gly-Arg-Gly-Phe-Phe-NH2

a) Herstellung von Z-Gly-Arg(N02)-Gly-Phe-Phe-NH2

0,80 g Z-Arg(N02)-Gly- Phe-Phe-NH2 wurden mit 8 ml 25 %iger HBr-Essigsäure versetzt und das Gemisch wurde bei Raumtemperatur 45 min lang gut geschüttelt, mit 100 ml Äther versetzt und das entstandene Pulver abfiltriert und über Natriumhydroxidpellets in einem Exsikkator bei vermindertem Druck 2 Tage lang getrocknet, das getrocknete Produkt in 10 ml DMF gelöst und die Lösung mit Triäthylamin neutralisiert, mit 0,43 g Z-Gly-ONB versetzt und die Mischung 10 Stunden lang gerührt.

Dann wurden der Lösung 7 ml Wasser zugegeben, wonach sich ein öl absetzte. Nach Dekantieren der überstehenden Schicht wurden 50 ml Wasser zugegeben. Das entstandene Pulver wurde abfiltriert und getrocknet, darauf durch erneutes Ausfällen aus DMF-Äthylacetat gereinigt. Ausbeute: 0,66 g (77%):

Fp: 119-122° C;

[a] ^-24,6° (c= 1,01%, DMF).

Elementaranalyse für CjgH^OgNjo ■ H20:

berechnet: C 55,51; H 5,95; N 17,99

gefunden: C 55,95; H 5,90; N 17,73

b) Herstellung von Gly-Arg-Gly-Phe-Phe-NH2

In 30 ml Essigsäure wurden 500 mg Z-GIy-Arg(N02)-Gly-Phe-Phe-NH2 gelöst und dann wurde innerhalb von 7 Stunden die katalytische Reduktion unter Durchleiten eines Wasserstoffstroms und Einsatz von Palladiumschwarz als Katalysator vor-

5

Kl

15

20

25

.10

35

40

45

50

55

60

65

17

618 959

genommen, der Katalysator abfiltriert und die Essigsäure bei vermindertem Druck abdestilliert. Der Rückstand wurde in 10 ml Wasser gelöst und die Lösung über eine mit Carboxyme-thylcellulose gefüllte Kolonne (1,8 X10 cm) geleitet.

Die Elution wurde nach dem linearen Gradientenverfahren unter Verwendung von je 700 ml 0,1 M und 1 M wässerigem Ammoniumacetat durchgeführt. Dann wurden die Fraktionen von 410 ml bis 515 ml vereinigt und lyophilisiert. Ausbeute: 307 mg (65%) eines weissen, flaumigen Produkts.

[<x] £ -17,'7° (c=0,48% Wasser).

Aminosäureanalyse (Hydrolyse mit Salzsäure): Arg 1,15 ; Gly 2,00; Phe 2,00 (Peptidgehalt 84,6%)

Elementaranalyse für C28H39OsN9 • 2C2H402 • 2H20:

berechnet: C 52,09; H 6,97; N 17,09 gefunden: C 52,05; H 6,85; N 17,22

Beispiel 28 D-Ala-Arg-Gly-Phe-Phe-NH2

a) Herstellung von Z-D-Ala-Arg(N02)-GIy-Phe-Phe-NH2

In 8 ml 25 %iger HBr-Essigsäure wurden 0,80 g Z-Arg(N02)-Gly-Phe-Phe-NH2 gelöst und die Lösung wurde 40 min lang bei Raumtemperatur geschüttelt, darauf die Mischung mit 100 ml Äthyläther versetzt, worauf sich ein Niederschlag bildete. Dieser wurde abfiltriert, mit Äther gewaschen und getrocknet, das getrocknete Produkt in 10 ml DMF gelöst und die Lösung mit Triäthylamin neutralisiert und mit 0,51 g Z-D-Ala-ONB versetzt. Das Gemisch wurde 8 Stunden lang gerührt, das DMF bei vermindertem Druck abdestilliert und der Rückstand mit 50 ml Wasser versetzt.

Das entstandene Pulver wurde abfiltriert, getrocknet, mit heissem Äthylacetat gewaschen und aus DMF-Äthylacetat erneut umgefällt. Ausbeute: 0,799 g (92%) ; Fp: 223-225° C;

In 10 ml 25 %iger HBr-Essigsäure wurden 800 mg Z-Arg(N02)-GIy-Phe-Phe-NH2 gelöst und die Lösung wurde 50 min lang geschüttelt, darauf mit 80 ml Äther versetzt und der entstandene Niederschlag abfiltriert, getrocknet und in 10 ml 5 DMF gelöst. Dann wurde die Lösung mit Triäthylamin neutralisiert und mit 700 mg Z-Phe-OPCP (Pentachlorphenylester) versetzt. Das Gemisch wurde 10 Stunden lang gerührt und mit 50 ml IN wässerigem Ammoniak versetzt. Dann wurde die ölige Schicht dekantiert und die ölige Substanz mit Wasser m versetzt. Das enstandene Pulver wurde abfiltriert und getrocknet. Dem Pulver wurden 50 ml Äthylacetat zugegeben, das Gemisch wurde erhitzt und das Pulver heiss abfiltriert. Reinigen des Pulvers durch erneutes Ausfällen aus DMF-Äthylacetat ergab 805 mg (92%) Ausbeute).

15 [a] ^ -29,0° (c=l,0%DMF).

Elementaranalyse für C43H50O9N10 • ì-H20:

berechnet: C 60,06; H 5,98; N 16,29 2" gefunden: C60,32; H6,02; N 16,10

[a] "q -22,3° (c=0,98% DMF).

Elementaranalyse für C37H46O9N10- ÌH20:

berechnet: gefunden:

C 56,69; C 56,38;

H 6,04; H 6,07;

N 17,87 N 17,98

b) Herstellung von D-Ala-Arg-Gly-Phe-Phe-NH2

In 30 ml Essigsäure wurden 600 mg Z-D-Ala-Arg (N02)-Gly-Phe-Phe-NH2 und dann wurde die katalytische Reduktion unter Verwendung von Palladiumschwarz als Katalysator innerhalb von 7 Stunden durchgeführt, der Katalysator abfiltriert und das Lösungsmittel bei vermindertem Druck abdestilliert. Der Rückstand wurde in 10 ml Wasser gelöst und die Lösung über eine mit Carboxymethyl-Sephadex gefüllte Kolonne (1,8 X11 cm) geleitet.

Die Elution wurde nach dem linearen Gradientenverfahren unter Einsatz von je 700 ml 0,1M und IM wässerigem Ammoniumacetat vorgenommen, die oben angeführte Verbindung lag in den Fraktionen von 350 ml bis 450 ml vor, welche vereinigt und lyophilisiert wurden. Ausbeute: 400 mg (73%) eines weissen, flaumigen Produkts.

[ex] q -22,2° (c=0,51 % Wasser).

Aminosäureanalyse: Arg 1,01 ; Gly 1,03 ; Ala 1,00 ; Phe 1,99 (Peptidgehalt 82,3%)

Elementaranalyse für C29H4105N9 • 2C2H402 • 2H,0:

berechnet: C 52,72; H 7,11; N 16,77 gefunden: C 52,66; H 6,92; N 16,82

Beispiel 29

Phe-Arg-Gly-Phe-NH2

a) Herstellung von ZrPhe-Arg (N02)-Gly-Phe-Phe-NH2

b) Herstellung von Phe-Arg-GIy-Phe-Phe-NH2

In 6 ml wasserfreiem Fluorwasserstoff wurden 500 mg Z-Phe-Arg(N02)-Gly-Phe-Phe-NH2 gelöst und die Lösung wurde 40 min lang bei —10° C gerührt. Dann wurde der Fluorwasserstoff abdestilliert und der Rückstand in 10 ml Wasser gelöst. Die Lösung wurde über eine mit Amberlite IRA-410 (Acetatform) gefüllte Kolonne (0,9 X15 cm) geleitet, die Kolonne wurde mit Wasser gewaschen. Der Effluent wurde mit den Waschwässern kombiniert und die kombinierte Lösung wurde lyophilisiert. Man erhielt 402 mg der oben angeführten Verbindung.

Aminosäureanalyse: Arg 1,01 ; Gly 0,98 ; Phe 2,94 ^ (Peptidgehalt 86,2%).

Beispiel 30 Leu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-NH2 a) Herstellung von Z-Arg(N02)-Gly-Phe-Phe-Tyr-NH2 4(| In 100 ml DMF wurden 12,2 g Z-Phe-Phe-Tyr-NH2 gelöst, dann wurde die katalytische Reduktion unter Verwendung von Palladiumschwarz als Katalysator innerhalb von 5 Stunden durchgeführt, der Katalysator abfiltriert und es wurden 8,6 g Z-Arg-(N02)-Gly-0H und 4,3 g HONB zugegeben.

Dann wurden unter Eiskühlung 4,95 g DCC zugegeben und das Gemisch wurde 12 Stunden lang gerührt. Der entstandene DC-Harnstoff wurde abfiltriert und das Filtrat mit 1 1 Wasser versetzt. Das entstandene Gel wurde abfiltriert und aus Methanol und Wasser erneut ausgefällt. Ausbeute: 16,25 g (91,8%);

s« Fp: 181-184° C;[a] ^-16,0° (c= 1,01% DMF).

Elementaranalyse für C41Hc0OiANin ■ H20:

berechnet: C58,35; H5,92; N 15,83

gefunden: C 58,02; H 5,98; N 15,66

h b) Herstellung des Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-NH2

In 30 ml Essigsäure wurden 600 mg Z-Arg(N02)-Gly-Phe-Phe-Tyr-NH2 gelöst, dann wurde innerhalb von 9 Stunden die katalytische Reduktion unter Einsatz von Palladiumschwarz als Katalysator durchgeführt, der Katalysator abfiltriert und das mi Lösungsmittel bei vermindertem Druck abdestilliert. Der Rückstand wurde in 15 ml Wasser gelöst und an einer Kolonne (1,3 X11 cm) mit Carboxymethyl-Sephadex gereinigt. Die Elution wurde nach dem linearen Gradientenverfahren mit je 500 ml 0,1M und IM wässerigem Ammoniumacetat durchge-65 führt. Die Fraktionen von 250 ml bis 420 ml wurden vereinigt und lyophilisiert. Ausbeute: 416 mg (72,5%),

[a] q -7,6° (c=0,49% Wasser).

618 959

18

Elementaranalyse für C35H4706Nç, • 2C2H402 • 2H20:

berechnet: C 55,37; H 7,03; N 14,90

gefunden: C 55,81; H 6,83; N 14,78

Aminosäureanalyse: Arg 1,02 ; Gly 1,00 ; Tyr 0,91 ; Phe

2.02 (Peptidgehalt 82,5%).

c) Herstellung von Z-Leu-Arg(N02)-Gly-Phe-Phe-Tyr-NH2

700 mg Z-Arg(N02)-Gly-Phe-Phe-Tyr-NH2 wurden mit 0,2 ml Anisol, darauf mit 7 ml 25 %iger HBr-Essigsäure versetzt. Das Gemisch wurde bei Raumtemperatur 40 min lang geschüttelt, darauf mit 100 ml Äthyläther versetzt, der entstandene Niederschlag wurde abfiltriert, getrocknet und in 10 ml DMF gelöst. Die Lösung wurde mit Triäthylamin neutralisiert und dann mit 344 mg Z-Leu-Osu(N-hydroxysuccinimidester) versetzt. Das Gemisch wurde 12 Stunden lang gerührt, das DMF bei vermindertem Druck abdestilliert und der Rückstand mit 50 ml Wasser versetzt. Das entstandene Pulver wurde abfiltriert und durch erneutes Ausfällen aus Methanol und Wasser gereinigt. Ausbeute: 560 mg (70,9%); Fp: 193-195° C,

[a] ^ -18,9° (c= 1,13% DMF).

Elementaranalyse für GjgHgiOnNn -H20:

berechnet: C58,96; H6,36; N 15,44 gefunden: C58,72; H 6,22; N 15,36

d) Herstellung von Leu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-NH2

In 30 ml Essigsäure wurden 400 mg Z-Leu-Arg(N02)-Gly-Phe-Phe-Tyr-NH2 gelöst und dann wurde innerhalb von 10 Stunden die katalytische Reduktion unter Einsatz von Palladiumschwarz als Katalysator durchgeführt, der Katalysator abfiltriert und das Lösungsmittel bei vermindertem Druck abdestilliert. Der Rückstand wurde in 5 ml Wasser gelöst und die Lösung über eine mit Carboxymethylcellulose gefüllte Kolonne (2,6 X 22 cm) geleitet.

Die Elution wurde nach dem Gradientenverfahren unter Verwendung von je 700 ml 0,005M und 0,2M wässerigem Ammoniumacetat vorgenommen. Dann wurden die Fraktionen von 830 ml bis 910 ml vereinigt und lyophilisiert. Ausbeute: 217 mg (55,5%)

[et] -14,9° (c=0,47% Wasser).

Elementaranalyse für C41H56O7N10 ■ 2C2H402 ■ 3H20: berechnet: C 55,43; H 7,24; N 14,37 gefunden: C 55,71; H 7,12; N 14,81

Aminosäureanalyse: Arg 1,03; Gly 1,00; Leu 1,00; Phe 2,00; Tyr 0,85 (Peptidgehalt 78,0%).

Beispiel 31 a-Abu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-NH2

Das in Beispiel 30 beschriebene Verfahren wurde wiederholt, jedoch wurde Z-a-Abu anstelle von Z-Leu eingesetzt, um die oben angeführte Verbindung zu erhalten.

[a] q -13,6° (c=0,32% Wasser).

Aminosäureanalyse: Arg 1,02; Gly 0,98; a-Abu 1,04; Phe 2,00; Tyr 0,92 (Peptidgehalt 81%).

Beispiel 32 Nle-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-NH2

Das in Beispiel 30 beschriebene Verfahren wurde wiederholt, jedoch wurde Z-Nle anstelle von Z-Leu eingesetzt, um die oben angeführte Verbindung zu erhalten.

[a] ^ -14,3° (c=0,4% Wasser).

Aminosäureanalyse: Arg 1,00; Gly 0,97; Nie 1,04; Phe

2.03 ; Tyr 0,91 (Peptidgehalt 84%).

Beispiel 33 Val-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-NH2

In 10 ml DMF wurden 400 mg Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-NH2-diacetat, das nach Beispiel 30 b) hergestellt worden war, gelöst s und darauf mit 300 mg Z-Val-ONB versetzt. Die Lösung wurde mit Triäthylamin neutralisiert und 10 Stunden lang gerührt. Dann wurden der Lösung 50 ml Äther zugegeben und der entstandene Niederschlag wurde abfiltriert, mit Äthylacetat gewaschen und getrocknet. Dieses Produkt wurde in 30 ml io Essigsäure-Wasser (1:1) gelöst und 4 Stunden lang der katalyti-schen Reduktion unter Einsatz von Palladiumschwarz als Katalysator unterworfen. Dann wurde der Katalysator abfiltriert und das Filtrat zur Trockene eingeengt. Der Rückstand wurde in 10 ml Wasser gelöst und nach dem in Beispiel 30 c) beschriebe-i s nen Verfahren chromatographiert. Ausbeute: 360 mg.

[a] —13,7° (c=0,5% Wasser).

Aminosäureanalyse: Arg 1,02; Gly 1,00; Val 0,97; Phe 2,04 ; Tyr 0,97 (Peptidgehalt 86,2%).

21)

Beispiel 34 ß-Ala-Arg-Gly-Phe-Phe-NH2 a) Herstellung von Z-Arg(NOz)-Gly-OEt

In 200 ml Tetrahydrofuran wurden 70,7 g Z-Arg (N02)-2* OH gelöst und unter Eiskühlung mit 40,5 g 2,4-Dinitrophenol und 45,4 g DCC versetzt. Das Gemisch wurde 4 Stunden lang gerührt. Gleichzeitig wurden 30,7 g Gly-OEt- HCl in 200 ml Tetrahydrofuran suspendiert, die Suspension wurde unter Eiskühlung mit 30,8 ml Triäthylamin neutralisiert. Der entstan-îii dene DC-Harnstoff wurde abfiltriert und das Filtrat mit der oben angeführten aktiven Esterlösung versetzt und über Nacht gerührt. Die Lösung wurde konzentriert und der Rückstand in 500 ml Äthylacetat gelöst.Die Lösung wurde mit einer gesättigten wässerigen Natriumbicarbonatlösung (200 ml X 3), mit IN i s Salzsäure (200 ml X 3), darauf mit einer gesättigten wässerigen Natriumchloridlösung (200 ml X 3) gewaschen und über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet. Dann wurde die Lösung konzentriert und aus Äthylacetat/Petroläther umkristallisiert. Die Kristalle wurden abfiltriert und aus Äthylacetat/Petroläther j(i umkristallisiert. Ausbeute: 70,0 g (79,8 %), Fp: 109-110° C

[a] 2^-3,4° (c=l%DMF).

Elementaranalyse für C18H2607N6: berechnet: C 49,31; H 5,98;

45 gefunden: C 49,26; H 5,79;

N 19,17 N 18,55

b) Herstellung von Z-Arg(N02)-Gly-0H

In 100 ml Aceton wurden 20,0 g Z-Arg(N02)-Gly-0Et suspendiert und darauf unter Eiskühlung mit 64 ml IN wässeri-50 ger Natriumhydroxidlösung versetzt. Das Gemisch wurde 2 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt.

Nach Neutralisieren des Alkaliüberschusses mit Salzsäure wurde die Lösung bei vermindertem Druck zur Trockene eingeengt und der Rückstand mit 100 ml Wasser versetzt. Die unlös-55 liehen Substanzen wurden abfiltriert, das Filtrat mit Salzsäure angesäuert und die entstandenen Kristalle wurden abfiltriert. Ausbeute: 18,3 g (93,7%), Fp: 103-105° C,

[a]^-25,9° (c=0,9%DMF).

60

Elementaranalyse für C16H22Q7N6 • H20:

berechnet: C 44,86; H 5,65; N 19,62

gefunden: C 44,48; H 5,35; N 19,53

65 c) Herstellung von Z-Arg(N02)-Gly-Phe-Phe-NH2

In einem Gemisch aus 60 ml DMF und 40 ml Methanol wurden 8,91 g Z-Phe-Phe-NH2 gelöst und dann wurde innerhalb von 14 Stunden in Gegenwart von Palladiumschwarz als

19

618 959

Katalysator die katalytische Hydrierung vorgenommen. Der Katalysator wurde abfiltriert und das Lösungsmittel bei vermindertem Druck abdestilliert, der Rückstand in 30 ml DMF gelöst. Gleichzeitig wurden 50 ml Tetrahydrofuran zuerst mit 6,80 g Z-Arg(N02)-Gly-0H und dann mit 3,23 g HONB und 3,71 g DCC versetzt, darauf wurde 4 Stunden lang gerührt. Der entstandene DC-Harnstoff wurde abfiltriert und die oben angeführte Aminokomponente (H-Phe-Phe-NH2) zugegeben, das Gemisch über Nacht gerührt. Nach Abdestillieren des Lösungsmittels bei vermindertem Druck wurde der Rückstand mit 100 ml Wasser versetzt und das entstandene Pulver abfiltriert.

Nach dem Trocknen wurde das Produkt mit Äthylacetat gewaschen und aus Äthanol/Äthylacetat umkristallisiert. Ausbeute: 8,34 g (72,7%), Fp: 112-113° C,

[et] q -21,6° (c = 1 % DMF).

Elementaranalyse für C34H4108N9 • H20:

berechnet: C 56,58; H 6,01; N 17,47

gefunden: C 56,75; H 5,72; N 17,40

d) Herstellung von Z-ß-Ala-ONB

In 40 ml Tetrahydrofuran wurden 3,35 g Z-ß-Ala-OH und 3,23 g HONB gelöst und nach Eiskühlung mit 3,71 g DCC versetzt. Das Gemisch wurde über Nacht gerührt und der entstandene Dicyclohexylharnstoff abfiltriert, das Lösungsmittel bei vermindertem Druck abdestilliert und Petroläther zugegeben. Die entstandenen Kristalle wurden abfiltriert und aus Acetonitril umkristallisiert. Ausbeute: 3,83 g (66,4%); Fp: 125-126° C.

Elementaranalyse für berechnet: C 62,49; H 5,24; N7,29 gefunden: C 62,52; H 5,18; N7,29

e) Herstellung von Z-ß-Ala-Arg(N02)-Gly-Phe-Phe-NH2

1,06 g Z-Arg(N02)-Gly-Phe-Phe-NH2 wurden mit 10 ml 25 %iger HBr-Essigsäure und nach 40 min langem Schütteln bei Raumtemperatur mit Äthyläther versetzt. Der entstandene Niederschlag wurde abfiltriert, bei vermindertem Druck in einem Exsikkator über Natriumhydroxid getrocknet und in 10 ml DMF gelöst. Nach dem Abkühlen wurde die Lösung mit 0,84 ml Triäthylamin neutralisiert und mit 0,69 g Z-ß-Ala-ONB versetzt. Das Gemisch wurde über Nach gerührt und das Lösungsmittel bei vermindertem Druck abdestilliert, dann wurden 50 ml Wasser zugegeben. Das entstandene Pulver wurde getrocknet, mit Äthylacetat gewaschen und aus Wasser-Dioxan-Äthylacetat erneut ausgefällt. Ausbeute: 0,98 g (83,3%), Fp: 161-163° C,

fa] 2£5 -20,9°

Die Fraktionen von 780 ml bis 990 ml wurden vereinigt und lyophilisiert. Ausbeute: 500 mg (66%),

[a] 2^'5 -13,9° (c=0,5% Wasser).

1 Elementaranalyse für C29H41OsN2 • 2C2H402 • HzO:

berechnet: C 54,00; H 7,01; N 17,18 gefunden: C 53,75; H 7,07; N 17,15

Aminosäureanalyse: Arg 1,00(1); Gly 1,00(1); Phe 2,00(2) (die Zahlen in Klammern bedeuten theoretische Werte ; dies gilt auch von jetzt an) Peptidgehalt 76%.

Beispiel 35 . y-Abu-Arg-Gly-Phe-Phe-NH2 a) Herstellung von Z-y-Abu-ONB

In 40 ml Tetrahydrofuran wurden 4,75 g Z-y-Abu-OH und 3,94 g HONB gelöst und nach Eiskühlung 4,54 g DCC zugegeben. Das Gemisch wurde 6 Stunden lang gerührt und der entstandene Dicyclohexylharnstoff abfiltriert. Das Lösungsmittel wurde bei vermindertem Druck abdestilliert und der Rückstand mit 30 ml Äthyläther, dann mit einer kleinen Menge Wasser versetzt. Die entstandenen Kristalle wurden abfiltriert. Ausbeute: 6,0 g (75,3%), Fp: 66-69° C.

Elementaranalyse für C21H2205N2:

berechnet: C 63,31; H 5,57; N7,03 gefunden: C 63,39; H 5,42; N7,06

„i b) Herstellung von Z-y-Abu-Arg(N02)-Gly-Phe-Phe-NH2 Nach dem in Beispiel 34 e) beschriebenen Verfahren wurden 0,53 g Z-Arg(N02)-Gly-Phe-Phe-NH2 mit HBr-Essigsäure behandelt und in 15 ml DMF gelöst. Nach Neutralisieren mit Triäthylamin wurden der Lösung 0,44 g Z-y-Abu-ONB zugege-ben. Das Gemisch wurde über Nacht gerührt, das Lösungsmittel bei vermindertem Druck abdestilliert und dem Gemisch Wasser zugegeben. Das entstandene Pulver wurde abfiltriert und gut getrocknet.

Es wurde mit Äthylacetat gewaschen und aus Äthanol/ 4(l Wasser erneut ausgefällt. Ausbeute: 0,38 g (65%), Fp:

167-170° C,

[et] 2£'5-21,2° (c= 1,0% DMF).

1

Elementaranalyse für Q38H48O9N10- -H20:

45 2

berechnet: C57,20; H6,19; N 17,56

gefunden: C 57,14; H 6,10; N 17,56

(c=0,9% DMF).

Elementaranalyse für C37H46O9N10- ^-H20:

berechnet: gefunden:

C 56,69; C 56,84;

2

H 6,04; H 5,88;

N 17,89 N 17,50

f) Herstellung von ß-Ala-Arg-Gly-Phe-Phe-NH2

In 40 ml Essigsäure wurden 800 mg Z-ß-Ala-Arg(N02)-Gly-Phe-Phe-NH2 gelöst und dann wurde innerhalb von 14 Stunden die katalytische Reduktion in Gegenwart von Palladiumschwarz als Katalysator durchgeführt. Der Katalysator wurde abfiltriert und das Lösungsmittel bei vermindertem Druck abdestilliert. Der Rückstand wurde über eine mit Carb-oxymethyl-Sephadex gefüllte Kolonne (2,5 X 9 cm) geleitet und die Elution wurde nach dem linearen Gradientenverfahren unter Verwendung von je 700 ml 0,01N und IN wässerigem Ammoniumacetat vorgenommen.

c) Herstellung von y-Abu-Arg-Gly-Phe-Phe-NH2 so In 30 ml Essigsäure wurden 300 mg Z-y-Abu-Arg(N02)-Gly-Phe-Phe-NH2 gelöst und dann wurde innerhalb von 6 Stunden die katalytische Reduktion in Gegenwart von Palladium als Katalysator vorgenommen.

Nach Abfiltrieren des Katalysators wurde das Lösungsmittel 55 bei vermindertem Druck abdestilliert und der Rückstand über eine mit Carboxymethyl-Sephadex gefüllte Kolonne (1,8 X10 cm) geleitet. Dann wurde die Elution nach dem linearen Gradientenverfahren unter Einsatz von 0,005N (350 ml) bis IN (350 ml) wässerigem Ammoniumacetat durchgeführt und so die Fraktionen von 290 ml bis 340 ml wurden vereinigt und lyophilisiert. Ausbeute: 180 mg (63%),

[a] 'q -15,0° (c=0,5% Wasser).

fi5 Elementaranalyse für C30H43O5N9-2C2H4O2- j H20:

berechnet: C 53,95; H 7,19; N 16,66

gefunden: C53,93; H7,29; N 16,34

618 959

20

Aminosäureanalyse: Arg 1,00(1); Gly 1,00(1); Phe 1,94(2); Peptidgehalt 76%.

Beispiel 36 ô-Aval-Arg-Gly-Phe-Phe-NH2

a) Herstellung von Z-ô-Aval-Arg(N02)-Gly-Phe-Phe-NH2

Nach dem in Beispiel 34 e) beschriebenen Verfahren wurden 0,80 g Z-Arg(N02)-Gly-Phe-Phe-NH2 mit HBr-Essigsäure behandelt und in 10 ml DMF gelöst. Die Lösung wurde mit Triäthylamin neutralisiert. Gleichzeitig wurden 0,30 g Z-ô-Aval-OH und 0,24 g HONB in 5 ml Tetrahydrofuran gelöst.

Darauf wurde die Mischung unter Eiskühlung mit 0,27 g DCC versetzt und 3 Stunden lang gerührt. Der entstandene Dicyclohexylharnstoff wurde abfiltriert und das Filtrat der oben angeführten Aminokomponente [H-ô-AvaI-Arg(N02)-Gly-Phe-Phe-NH2] zugegeben, dann wurde über Nacht gerührt. Das Lösungsmittel wurde bei vermindertem Druck abdestilliert und Wasser zugegeben. Das entstandene Pulver wurde abfiltriert und gut getrocknet, mit Äthylacetat gewaschen und aus DMF-Äthylacetat erneut ausgefällt. Ausbeute: 0,62 g (70%), Fp: 154-157° C,

I 23

Äthylacetat erneut ausgefällt. Ausbeute: 0,49 g (55 %), Fp: 102-104° C,

[a] ^ -20,0° (c= 1,0% DMF).

1

[<x] ^ -13,0° (c= 1,0% DMF). Elementaranalyse für QwHjoOjN«,- ^H20:

berechnet: gefunden:

C 57,69; H6,33; N 17,25 C 57,84; H 6,42; N 16,86

b)HersteIlung von ô-Aval-Arg-Gly-Phe-Phe-NH2

In 30 ml Essigsäure wurden 500 mg Z-Aval-Arg(N02)-Gly-Phe-Phe-NH2 gelöst und dann wurde 5 Stunden lang in Gegenwart von Palladium als Katalysator katalytisch reduziert. Nach Abfiltrieren des Katalysators katalytisch reduziert. Nach Abfiltrieren des Katalysators wurde das Lösungsmittel bei vermindertem Druck abdestilliert. Der Rückstand wurde über eine mit Carboxymethyl-Sephadex gefüllte Kolonne (1,8 X 9 cm) geleitet und die Elution wurde nach dem linearen Gradientenverfahren unter Verwendung von 0,1N (500 ml) und IN (500 ml) wässerigem Ammoniumacetat durchgeführt. Die Fraktionen von 290 ml bis 370 ml wurden vereinigt und lyophilisiert. Ausbeute: 290 mg (61 %),

[et] 2^ -12,6° (c=0,5% Wasser).

Elementaranalyse für C3iH4503N9 • 2C2H402 • | H20:

berechnet: gefunden:

C 54,53; H 7,32; N 16,36 C 54,34; H 7,35; N 16,20

Aminosäureanalyse: Arg 1,11(1); Gly 1,00(1); Phe 2,04 (2) ; Peptidgehalt 81,4%

Beispiel 37 e-Acap-Arg-Gly-Phe-Phe-NH2

a) Herstellung von Z-e-Acap-Arg(N02)-Gly-Phe-Phe-NH2

Nach dem in Beispiel 34 e) beschriebenen Verfahren wurden 0,80 g Z-Arg(N02)-GIy-Phe-Phe-NH2 mit HBr-Essigsäure behandelt und in 10 ml DMF gelöst. Die Lösung wurde mit Triäthylamin neutralisiert. Gleichzeitig wurden 0,32 g Z-e-Acap-OH und 0,24 g HONB in 5 ml Tetrahydrofuran gelöst und unter Eiskühlung 0,27 g DCC zugegeben. Das Gemisch wurde 3 Stunden lang gerührt und der entstandene Dicyclohexylharnstoff abfiltriert, das Filtrat wurde der oben angeführten Aminokomponente [H-Arg-(N02)-Gly-Phe-Phe-NH2] zugegeben und das Gemisch über Nacht gerührt. Dann wurde das Lösungsmittel bei vermindertem Druck abdestilliert und Wasser zugegeben. Das entstandene Pulver wurde abfiltriert und gut getrocknet, mit Äthylacetat gewaschen und aus DMF/

Elementaranalyse für C39H50O9N10 • ^-H20:

berechnet: C57,69; H6,33; N 17,25

gefunden: C 57,86; H 6,40; N 16,76

b) Herstellung von e-Acap-Arg-Gly-Phe-Phe-NH2

In 30 ml Essigsäure wurden 400 mgZ-e-Acap-Arg(N02)-Gly-Phe-Phe-NH2 gelöst, dann wurde 7 Stunden lang die katalytische Reduktion in Gegenwart von Palladium als Katalysator durchgeführt. Der Katalysator wurde abfiltriert und das l> Lösungsmittel bei vermindertem Druck abdestilliert. Der Rückstand wurde über eine mit Carboxymethyl-Sephadex gefüllte Kolonne (1,8 X10 cm) geleitet und die Elution wurde nach dem linearen Gradientenverfahren unter Einsatz von 0,1N (500 ml) und IN wässerigem Ammoniumacetat durchgeführt. Die Frak-"" tionen von 250 ml bis 330 ml wurden vereinigt und lyophilisiert. Ausbeute: 200 mg (51%),

[a] 22 -9,9° (c=0,6% Wasser).

25 Elementaranalyse für C32H47OjN9 - 2C2H402 • 2H20:

berechnet: C54,46; H7,49; N 15,88

gefunden: C54,24; H7,26; N 15,76

Aminosäureanalyse: Arg 1,00(1); Gly 0,98(1); Phe 2,00(2) m e-Acap nicht bestimmt. Peptidgehalt 79%.

Beispiel 38 Lys-Arg-Gly-Phe-Phe-NH2

a) Herstellung von Di-Z-Lys-Arg(N02)-Gly-Phe-Phe-NH2 ,s Nach dem in Beispiel 34 e) beschriebenen Verfahren wurden 0,80 g Z-Arg(N02)-Gly-Phe-Phe-NH2 mit HBr-Essigsäure behandelt und dann in 10 ml DMF gelöst. Die Lösung wurde mit Triäthylamin neutralisiert.

Gleichzeitig wurden 0,54 g Di-Z-Lys-OH und 0,26 g 40 HONB in 5 ml Tetrahydrofuran gelöst und dann unter Eiskühlung 0,30 g DCC zugegeben. Das Gemisch wurde 4 Stunden lang gerührt und der entstandene Dicyclohexylharnstoff abfiltriert. Das Filtrat wurde der oben angeführten Aminokomponente [H-Arg(N02)-Gly-Phe-Phe-NH2] zugegeben und dann 45 wurde über Nacht gerührt, das Lösungsmittel bei vermindertem Druck abdestilliert und der Rückstand mit Wasser versetzt. Das entstandene Pulver wurde abfiltriert und gut getrocknet. Es wurde darauf mit Äthylacetat gewaschen und aus DMFÄthyl-acetat erneut ausgefällt. Ausbeute: 0,82 g (77%), Fp: 50 200-204° C (Zersetzung),

I 23

[a] -20,5° (c= 1,1% DMF). Elementaranalyse für C48H59OuNu • î-H20:

berechnet: gefunden:

C 59,06; C 59,04;

H 6,20; H 6,13;

N 15,79 N 15,78

b) Herstellung von Lys-Arg-Gly-Phe-Phe-NH2 M, In 30 ml Essigsäure wurden 600 mg Di-Z-Lys-Arg(N02)-Gly-Phe-Phe-NH2 gelöst, dann wurde in Gegenwart von Palladium als Katalysator 6 Stunden lang die katalytische Reduktion vorgenommen. Der Katalysator wurde abfiltriert und das Lösungsmittel bei vermindertem Druck abdestilliert. Der Rück-65 stand wurde über eine mit Carboxymethyl-Sephadex gefüllte Kolonne (1,5 X11 cm) geleitet und die Elution nach dem linearen Gradientenverfahren unter Verwendung von 0,1N bis IN (je 700 ml) wässerigem Ammoniumacetat durchgeführt. Die

21

618 959

Fraktionen von 650 ml bis 760 ml wurden vereinigt und lyophilisiert. Ausbeute: 280 mg (52%),

[a]2^ -4,3° (c=0,5%Wasser).

Elementaranalyse für C32H48O5N10 • 3C2H402 • 2H20: berechnet: C 52,52; H7,42; N 16,12

gefunden: C 52,64; H 7,38; N 16,42

Aminosäureanalyse: Arg 1,06(1); Lys 1,09(1); Gly 1,00(1); Phe 1,97(2); Peptidgehalt 73%.

Beispiel 39

a,7-Dab-Arg-Gly-Phe-Phe-NH2

a) Herstellung von Di-Z-Dab-Arg(N02)-Gly-Phe-Phe-NH2

Nach dem in Beispiel 34 e) beschriebenen Verfahren wurden 0,80 g Z-Arg(N02)-Gly-Phe-Phe-NH2 mit HBr-Essigsäure behandelt und in 10 ml DMF gelöst. Die Lösung wurde mit Triäthylamin neutralisiert. Gleichzeitig wurden 0,50 g Di-Z-a,y-Dab-OH und 0,26 g HONB in 5 ml Tetrahydrofuran gelöst und unter Eiskühlung mit 0,30 g DCC versetzt. Das Gemisch wurde 4 Stunden lang gerührt und der entstandene Dicyclohexylharnstoff abfiltriert.

Das Filtrat wurde der oben angeführten Aminokomponente [H-Arg(N02)-Gly-Phe-Phe-NH2] zugegeben und das Gemisch über Nacht gerührt. Das Lösungsmittel wurde bei vermindertem Druck abdestilliert und der Rückstand mit Wasser versetzt. Das entstandene Pulver wurde abfiltriert und gut getrocknet, mit Äthylacetat gewaschen und aus DMF-Äthylacetat erneut ausgefällt. Ausbeute: 0,82 g (78%), Fp: 184-188° C,

[a]2^-19,5° (c= 1,1% DMF).

Elementaranalyse für C46H550[]Nt! ■ HzO:

berechnet: C 57,79; H 6,01; N 16,21

gefunden: C 57,95; H 5,91; N 16,19

b) Herstellung von a,Y-Dab-Arg-Gly-Phe-Phe-NH2

In 30 ml Essigsäure wurden 600 mg Di-Z-(a,y-Dab-Arg(N02)-Gly-Phe-Phe-NH2 gelöst und dann wurde 6 Stunden lang die katalytische Reduktion in Gegenwart von Palladium als Katalysator vorgenommen. Der Katalysator wurde abfiltriert und das Lösungsmittel bei vermindertem Druck abdestilliert. Der Rückstand wurde über eine mit Carboxymethyl-Sephadex gefüllte Kolonne (1,5 X13 cm) geleitet und die Elution wurde nach dem linearen Gradientenverfahren unter Einsatz von 0,1 N (700 ml) bis 1 N (700 ml) wässerigem Ammoniumacetat durchgeführt. Die Fraktionen von 610 ml bis 680 ml wurden vereinigt und lyophilisiert. Ausbeute: 255 mg (46%),

i 23

dene Dicyclohexylharnstoff abfiltriert. Das Filtrat wurde der oben angeführten Aminokomponente [H-Arg(N02)-GIy-Phe-Phe-NH2] zugegeben und dann wurde über Nacht gerührt. Das Lösungsmittel wurde bei vermindertem Druck abdestilliert und ^ der Rückstand mit Wasser versetzt. Das ölige Produkt wurde gut mit Wasser gewaschen und aus DMF/Äthylacetat erneut ausgefällt. Ausbeute: 0,90 g (89%), Fp: 89-92° C,

[a] 2^ -17,6° (c= 1,0% DMF).

m

Elementaranalyse für C40H52O11N14 • H20:

berechnet: C 52,05; H 5,90; N 21,25 gefunden: C 52,20; H 6,16; N 20,91

, , b) Herstellung von Arg-Arg-Gly-Phe-Phe-NH2

In 40 ml Essigsäure wurden 700 mg Z-Arg(N02)-Arg(N02)-Gly-Phe-Phe-NH2 gelöst und dann wurde 9 Stunden lang die katalytische Reduktion in Gegenwart von Palladium als Katalysator vorgenommen. Der Katalysator wurde abfiltriert ,0 und das Lösungsmittel bei vermindertem Druck abdestilliert. Der Rückstand wurde über eine mit Carboxymethylcellulose gefüllte Kolonne (3X18 cm) geleitet und die Elution wurde unter Verwendung von 0,005 N (11) bis 0,3 N (11) wässerigem Ammoniumacetat vorgenommen. Die Fraktionen von 890 ml bis 1410 ml wurden vereinigt und lyophilisiert. Ausbeute: 380 mg (45%),

[a] ^ +2,4° (c=0,5%, 5% Essigsäure).

Elementaranalyse für C32H4805N2-3C2H402 |h20: m 2

berechnet: C 51,40; H 7,15; N 18,93;

gefunden: C 51,25; H7,29; N 19,08

[a] q -12,5° (c=0,8% Wasser).

Elementaranalyse für C3oH44OsN10 • 3C2H402 • 3H20: berechnet: C 50,34 H 7,28; N 16,31 gefunden: C 50,59; H 7,61; N 16,93

Aminosäureanalyse: Arg 1,00(1); Gly 1,00(1); Phe 1,98 (2); a,y-Dab 1,02(1); Peptidgehalt 72%.

Beispiel 40 Arg-Arg-Gly-Phe-Phe-NH2

a) Herstellung von Z-Arg(N02)-Arg(N02)-Gly-Phe-Phe-NH2 Nach dem in Beispiel 34 e) beschriebenen Verfahren wurden 0,80 g Z-Arg(N02)-Gly-Phe-Phe-NH2 mit HBr-Essigsäure behandelt und in 10 ml DMF gelöst. Die Lösung wurde mit Triäthylamin neutralisiert. Gleichzeitig wurden 0,39 g Z-Arg(N02)-0H und 0,22 g 2,4-Dinitrophenol in 5 ml Tetrahydrofuran gelöst und unter Eiskühlung 0,25 g DCC zugegeben. Das Gemisch wurde 2 Stunden lang gerührt und der entstanAminosäureanalyse: Arg2,02(2); Gly 1,00(1); Phe " 2,02(2); Peptidgehalt 73%.

Beispiel 41 ß-Ala-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-NH2 a) Herstellung von Z-ß-Ala-Arg(N02)-Gly-0Et 4,1 26,3 g Z-Arg(N02)-Gly-0Et wurden mit 130 ml HBr-Essigsäure und nach 60 min langem Schütteln bei Raumtemperatur mit Äthyläther versetzt. Der entstandene Niederschlag wurde abfiltriert und über Natriumhydroxid getrocknet.

Der getrocknete Niederschlag wurde in 150 ml DMF gelöst 45 und die Lösung nach Eiskühlung mit Triäthylamin neutralisiert. Dann wurden 23,1 g Z-ß-Ala-ONB zugegeben und die Mischung wurde über Nacht gerührt. Das Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck abdestilliert und der Rückstand in 300 ml Äthylacetat, welches einen geringen Gehalt an n-Bu-50 tanol aufwies, gelöst. Die Lösung wurde mit Wasser, einer gesättigten, wässerigen Natriumbicarbonatlösung (100 ml X 3) und einer gesättigten, wässrigen Natriumchloridlösung (100 ml X 3) gewaschen und über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet. Das Lösungsmittel wurde bei vermindertem Druck 55 abdestilliert und Äthyläther zugegeben. Das entstandene Pulver wurde abfiltriert und aus Äthanol-Äthylacetat umkristallisiert. Ausbeute: 22,9 g (75%), Fp: 97-99° C,

[oc] 2£>5 -11,2° (c=0,9% DMF).

AO

Elementaranalyse für C21H3108N7:

berechnet: C 49,50; H 6,13; N 19,25

gefunden: C49,51; H 6,06; N 18,93

(,5 b) Herstellung von Z-ß-Ala-Arg(N02)-Gly-0H

In einem Gemisch von 50 ml Aceton und 25 ml Wasser wurden 12,1 g Z-ß-Ala-Arg(N02)-Gly-0Et gelöst, dann wurden unter Kühlung mit Eis und Natriumchlorid innerhalb von

618 959

22

30 min 27,8 ml IN wässerige Natriumhydroxidlösung zugetropft. Die Mischung wurde unter gleichen Bedingungen eine Stunde und dann weitere 2 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt; nach Zugabe von 3,8 ml IN Salzsäure wurde das Aceton bei vermindertem Druck abdestilliert. Der Rückstand wurde mit 50 ml Wasser versetzt und das Gemisch mit 6N Salzsäure angesäuert. Man erhielt eine ölige Substanz, die bald erstarrte. Das so erhaltene feste Produkt wurde abfiltriert. Ausbeute: 10,3 g (86,0%), Fp: 101-103° C,

[a] 2£'5 -10,2° (c= 1,0% DMF).

Elementaranalyse für C19H27OgN7 • !~H20:

berechnet: C 46,53; H 5,75; N 19,99

gefunden: C 46,28; H 5,41; N 20,01

c) Herstellung von Z-Phe-Tyr-OMe

In 100 ml Tetrahydrofuran wurden 5,10 gTyr-OMEHCI suspendiert, nach Eiskühlung wurde die Suspension mit 3,08 ml Triäthylamin neutralisiert. Dazu wurden 5,99 g Z-Phe-OH, 3,94 g HONB und 4,54 g DCC gegeben und das Gemisch über Nacht gerührt. Der entstandene Dicyclohexylharnstoff wurde abfiltriert und das Lösungsmittel bei vermindertem Druck abgedampft. Der Rückstand wurde in 200 ml Äthylacetat gelöst. Die Lösung wurde mit einer gesättigten, wässerigen Natriumbicar-bonatlösung (100 ml X 3), IN Salzsäure (100 ml X 3) und Wasser gewaschen und über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet. Nach Abdestillieren des Äthylacetats bei vermindertem Druck wurde Petroläther zugegeben. Man erhielt einen gelförmigen Rückstand, welcher abfiltriert und aus Äthylacetat/Petroläther erneut ausgefällt wurde. Die erzielte Ausbeute betrug 6,00 g (63%), Fp: 132-133° C,

[a] 2^ -9,9° (c= 1,0% DMF),

Elementaranalyse für Ç27H2806N2:

berechnet: C 68,05; H 5,92; N5,88 gefunden: C 68,07; H 5,92; N5,95

d) Herstellung von Z-Phe-Tyr-NH2

In 40 ml mit Ammoniak gesättigtem Methanol wurden 3,0 g Z-Phe-Tyr-OMe gelöst und die Lösung wurde eine Woche lang in einem verschlossenen Behälter gelagert, worauf sich Nadeln absetzten. Nach Abdampfen des Lösungsmittels bei vermindertem Druck wurde Äthyläther zugegeben, die entstandenen Kristalle wurden abfiltriert und aus Äthanol-Wasser umkristallisiert. Die Ausbeute betrug 2,61 g (90%), Fp: 217—218° C,

[a] 26j^ -28,6° (c= 1,0% DMF).

Elementaranalyse für C26H27O5N3:

berechnet: C 67,66; H 5,90; N9,ll gefunden: C 67,45; H 5,88; N9,05

e) Herstellung von Z-Phe-Phe-Tyr-NH2

1,15 g Z-Phe-Tyr-NH2 wurden mit einer kleinen Menge Anisol und darauf mit 11 ml 25%iger HBr-Essigsäure versetzt. Nach 40 min langem Schütteln bei Raumtemperatur wurde Äthyläther zugegeben. Der entstandene Niederschlag wurde abfiltriert und über Natriumhydroxid getrocknet. Gleichzeitig wurden 0,67 g Z-Phe-OH und 0,45 g HONB in 5 ml Tetrahydrofuran gelöst und unter Eiskühlung 0,52 g DCC zugegeben. Das Gemisch wurde 4 Stunden lang gerührt und der entstandene Dicyclohexylharnstoff abfiltriert. Die oben angeführte Aminokomponente [H-Phe-Tyr-NH2] wurde in 10 ml DMF gelöst und die Lösung mit Triäthylamin neutralisiert. Dieser Lösung wurde die oben angeführte aktive Esterlösung zugegeben und die Mischung wurde über Nacht gerührt. Das Lösungsmittel wurde bei vermindertem Druck abdestilliert und Wasser zugegeben. Die entstandenen Kristalle wurden abfiltriert, mit Äthylacetat gewaschen und aus DMF/Äthylacetat umkristallisiert. Die Ausbeute betrug 1,01 g (74%), Fp: 218-221° C(Zer-5 Setzung),

[a] 26^ -27,7° (c= 1,0% DMF).

Elementaranalyse für C35H3606N4:

berechnet: C 69,06; H 5,96; N9,21 "'gefunden: C 69,01; H 6,02; N9,23

f) Herstellung von Z-ß-Ala-Arg(N02)-Gly-Phe-Phe-Tyr-NH2

In einer Mischung von 30 ml Methanol und 20 ml DMF wurden 0,91 g Z-Phe-Phe-Tyr-NH2 suspendiert und die kataly-1 ^ tische Reduktion wurde 7 Stunden lang vorgenommen. Das Methanol wurde bei vermindertem Druck abdestilliert. Gleichzeitig wurden 0,72 g Z-ß-Ala-Arg(NOz)-Gly-OH und 0,32 g HONB in 5 ml DMF gelöst und unter Eiskühlung 0,37 g DCC zugegeben. Das Gemisch wurde 6 Stunden lang gerührt und der entstandene Dicyclohexylharnstoff abfiltriert. Das Filtrat wurde der oben angeführten Aminkomponente [H-Phe-Phe-Tyr-NH2] zugegeben, dann wurde über Nacht gerührt. Das Lösungsmittel wurde bei vermindertem Druck abdestilliert, um einen Feststoff zu erhalten, der mit Wasser trituriert wurde. Das entstandene Pulver wurde abfiltriert und aus DMF/Äthylacetat erneut ausgefällt. Die Ausbeute betrug 0,88 g (62%), Fp: 174—177° C,

[a] 26^ -15,0° (c= 1,0% DMF).

,11 Elementaranalyse für C44H55OuNn • H20:

berechnet: C 57,79; H 6,01; N 16,12

gefunden: C57.54; H6,18; N 16,21

g) Herstellung von ß-Ala-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-NH2

,5 In 30 ml Essigsäure wurden 740 g Z-ß-Ala-Arg(N02)-Gly-Phe-Phe-Tyr-NH2 gelöst und die katalytische Reduktion wurde innerhalb von 7 Stunden in Gegenwart von Palladium als Katalysator vorgenommen. Der Katalysator wurde abfiltriert und das Lösungsmittel bei vermindertem Druck abdestilliert. Der 40 Rückstand wurde über eine mit Carboxymethyl-Sephadex gefüllte Kolonne (1,6 cmX 15 cm) geleitet und die Elution wurde nach dem linearen Gradienten verfahren unter Verwendung von 0,005N (700 ml) bis IN (700 ml) wässerigem Ammoniumacetat durchgeführt. Die Fraktionen von 580 ml bis 790 ml 45 wurden verienigt und lyophilisiert. Die Ausbeute betrug 540 mg (75%),

[a] -20,0° (c=0,5% Wasser).

Elementaranalyse für C38H50O7N10 • 2C2H402 - 3H20: 50 berechnet: C 54,06; H 6,91; N 15,01

gefunden: C 54,20; H 6,50; N 14,99

Aminosäureanalyse: Arg 0,95(1) ; Gly 1,05(1) ; Tyr 551,00(1) ; Phe 2,00(2); Peptidgehalt 74%).

' " h) Herstellung von ß-Ala-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-NH2-Di-citrat Das Acetat ß-AIa-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-NH2-Diacetat-tri-hydrat (9,33 g) wurde in 20 ml Wasser gelöst und es wurden 2,2 g Zitronensäure-Monohydrat unter Rühren zugegeben. Das ( () gebildete kristalline Präcipitat wurde abfiltriert und gewaschen, und zwar mit wenig kaltem Wasser. Ausbeute: 10,4 g des entsprechenden Dicitrats.

[a] ^ -19,6° (c= 1,0% Wasser).

"-*> Elementaranalyse für C38H50O7N10 • 2C6Hg07:

berechnet: C 52,54; H 5,82; N 12,25

gefunden: C 52,28; H 5,87; N 12,46

23

618 959

Beispiel 42 Y-Abu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-NH2

a) Herstellung von Z-y-Abu-Arg(N02)-Gly-0Et

4,38 g Z-Arg(N02)-Gly-0Et wurden mit 40 ml 25%iger HBr-Essigsäure und nach 30 min langem Schütteln bei Raumtemperatur mit Äthyläther versetzt. Der entstandene Niederschlag wurde abfiltriert und über Natriumhydroxid getrocknet. Dann wurde der Niederschlag in 30 ml DMF gelöst und nach Eiskühlung wurde die Lösung mit Triäthylamin neutralisiert. Dieser Lösung wurden 4,16 g Z-y-Abu-ONB zugegeben und das Gemisch wurde über Nacht gerührt. Das Lösungsmittel wurde bei vermindertem Druck abdestilliert und der Rückstand mit Wasser versetzt. Dann wurde das Wasser dekantiert, der Rückstand wurde mit Äther versetzt und erstarrte. Er wurde dann abfiltriert und aus Acetonitril erneut ausgefällt. Die Ausbeute betrug 2,5 g (48%), Fp: 60-62° C,

[cx]2^ -11,1° (c= 1,0% DMF).

Elementaranalyse für C22H3308N7:

berechnet: C50,47; H6,35; N 18,73 gefunden: C 50,12; H 6,51; N 18,73

b) Herstellung von Z-y-Abu-Arg(N02)-Gly-0H

In 20 ml Aceton wurden 2,0 g Z-y-Abu-Arg(N02)-Gly-OEt gelöst und dann wurden unter Eiskühlung 5,7 ml IN wässerige Natriumhydroxidlösung zugegeben. Die Mischung wurde 2 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt. Nach Zugabe von 6 ml IN Salzsäure wurde das Aceton bei vermindertem Druck abdestilliert. Die entstandenen Kristalle wurden abfiltriert und aus Äthanol/Wasser umkristallisiert. Die Ausbeute betrug 1,86 g (98%), Fp: 113-115° C,

[a] 2jJ, -20,0° (c= 1,1 % DMF).

Elementaranalyse für C20H29OsN7 • H20:

berechnet: C56,78; H6,09; N 19,10

gefunden: C 57,12; H 5,90; N 19,23

c) Herstellung von Z-y-Abu-Arg(N02)-Gly-Phe-Phe-Tyr-NH2

1,34 g Z-Phe-Phe-Tyr-NH2 wurden mit einer kleinen Menge Anisol versetzt, dann wurden 13 ml 25%ige HBr-Essigsäure zugegeben.

Nach 45 min langem Schütteln bei Raumtemperatur wurde Äthyläther zugegeben und der entstandene Niederschlag wurde abfiltriert und über Natriumhydroxid getrocknet. Gleichzeitig wurden 0,99 g Z-y-Abu-Arg(N02)-Gly-0H und 0,43 g HONB in 5 ml DMF unter Eiskühlung gelöst und 0,50 g DCC zugegeben, das Gemisch wurde 6 Stunden lang gerührt, der Dicyclohexylharnstoff abfiltriert. Die Aminkomponente H-Phe-Phe-Tyr-NH2 wurde in 10 ml DMF gelöst und die Lösung wurde mit Triäthylamin neutralisiert. Dieser Lösung wurde die oben angeführte aktive Esterlösung zugegeben und das Gemisch wurde über Nacht gerührt. Darauf wurde das Lösungsmittel bei vermindertem Druck abdestilliert und Wasser zugegeben. Das entstandene Pulver wurde abfiltriert, mit Äthylacetat gewaschen und erneut aus DMF/Äthylacetat ausgefällt. Die Ausbeute betrug 1,12 g (58%), Fp: 139,5-141° C,

[a] ^ -13,2° (c=l,4% DMF).

Elementaranalyse für C47H57OnNu • H20:

berechnet: C58,19; H6,13; N 15,89

gefunden: C57,76; H6,43; N 15,91

d) Herstellung von y-Abu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-NH2

In 30 ml Essigsäure wurden 800 mg Z-y-Abu-Arg(N02)-Gly-Phe-Phe-Tyr-NH2 gelöst, dann wurde 14 Stunden lang die katalytische Reduktion in Gegenwart von Palladium als Katalysator durchgeführt. Der Katalysator wurde abfiltriert und das Lösungsmittel bei vermindertem Druck abdestilliert. Der Rückstand wurde über eine mit Carboxymethyl-Sephadex gefüllte Kolonne (1,5 X10 cm) geleitet und die Elution wurde nach dem s Gradientenverfahren unter Verwendung von 0,1N bis IN (je 700 ml) wässerigem Ammoniumacetat durchgeführt. Die Fraktionen von 410 ml bis 600 ml wurden gesammelt und lyophilisiert. Die Ausbeute betrug 412 mg (52%),

[<x]2^-18,l° (c=0,5% Wasser).

0

Elementaranalyse für C3uHS2O7NI0 • 2C2H402 • 4H20: berechnet: C 54,02; H 7,10; N 14,52

gefunden: C 54,08; H 7,07; N 14,60

Aminosäureanalyse: Arg 0,96(1); Gly 1,00(1); Tyr 0,97(1); Phe 2,10(2); Peptidgehalt 84%.

Beispiel 43 e-Acap-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-NH2

a)Herstellung von Z-e-Acap-Arg(N02)-Gly-0Et

2,41 g Z-Arg(N02)-Gly-0Et wurden mit 12 ml 25 %iger HBr-Essigsäure versetzt und nach 40 min langem Schütteln bei Raumtemperatur wurde Äthyläther zugegeben. Der entstandene Niederschlag wurde abfiltriert und über Natriumhydroxid getrocknet.

Gleichzeitig wurden 1,33 gZ-e-Acap-OH und 0,99 g HONB in 5 ml Tetrahydrofuran gelöst und unter Eiskühlung 1,14 g DCC zugegeben. Dieses Gemisch wurde 4 Stunden lang gerührt und der entstandene Dicyclohexylharnstoff abfiltriert. Die oben angeführte Aminokomponente wurde in 10 ml DMF gelöst und nach Neutralisieren der Lösung mit Triäthylamin wurde die oben angeführte aktive Esterlösung zugegeben. 35 Das Gemisch wurde über Nacht gerührt und das Lösungsmittel bei vermindertem Druck abdestilliert. Der Rückstand wurde in 50 ml Äthylacetat gelöst und die Lösung mit Wasser, einer gesättigten, wässerigen Natriumbicarbonatlösung (50 ml X 2) und Wasser gewaschen und über wasserfreiem J" Natriumcarbonat getrocknet. Das Lösungsmittel wurde bei vermindertem Druck abdestilliert und Petroläther zugegeben. Die entstandenen Kristalle wurden aus Wasser/Äthanol/Äthylace-tat umkristallisiert. Die Ausbeute betrug 2,1 g (76%), Fp: 85-87° C,

45 94

[<x] zß -11,9° (c= 1,0% DMF).

Elementaranalyse für C24H3708N7:

berechnet: C 52,26; H 6,76; N 17,78

su gefunden: C52,43; H 6,64; N 17,76

b) Herstellung von Z-e-Acap-Arg(N02)-Gly-0H

In 10 ml Aceton wurden 1,8 g Z-e-Acap-Arg(N02)-Gly-OEt gelöst und unter Eiskühlung 2,9 ml 2N wässerige Natrium-55 hydroxidlösung zugegeben. Das Gemisch wurde 2 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt. Nach Zugabe von 2,5 ml IN Salzsäure wurde das Aceton bei vermindertem Druck abdestilliert. Dem Rückstand wurden 10 ml Wasser zugegeben und die unlöslichen Stoffe wurden abfiltriert. Das Filtrat wurde mit IN 60 Salzsäure angesäuert, worauf sich Kristalle bildeten. Die ausgefällten Kristalle wurden abfiltriert. Die Ausbeute betrug 1,59 g (93 %),Fp: 97,5-99° C,

[ex] 2p -10,7° (c= 1,0% DMF).

"5 Elementaranalyse für C22H33OsN7 • H20:

berechnet: C48,79; H6,52; N 18,10

gefunden: C48,50; H6,28; N 18,23

618 959

24

c) Herstellung von Z-e-Acap-Arg(N02)-Gly-Phe-Phe-Tyr-NH2

1,22 g Z-Phe-Phe-Tyr-NH2 wurden mit einer kleinen Menge Anisol und darauf mit 10 ml 25 %iger HBr-Essigsäure versetzt. Die Mischung wurde 40 min lang bei Raumtemperatur gerührt und dann wurde Äthyläther zugegeben. Der Niederschlag wurde abfiltriert und über Natriumhydroxid getrocknet. Gleichzeitig wurden 1,05 g Z-8-Acap-Arg(N02)-Gly-0H und 0,36 g HONB in 10 ml DMF gelöst und unter Eiskühlung 0,42 g DCC zugegeben. Das Gemisch wurde 6 Stunden lang gerührt und der als Nebenprodukt anfallende Dicyclohexylharnstoff abfiltriert. Die oben angeführte Aminokomponente wurde in 10 ml DMF gelöst und die Lösung mit Triäthylamin neutralisiert.

Dieser Lösung wurde die oben angeführte aktive Esterlösung zugegeben und die Mischung wurde über Nacht gerührt. Das Lösungsmittel wurde bei vermindertem Druck abdestilliert und Wasser zugegeben. Das entstandene Pulver wurde abfiltriert, mit Äthylacetat gewaschen und aus DMF/Äthylacetat erneut ausgefällt. Die Ausbeute betrug 1,01 g (57 %), Fp: 149-151° C,

[a] -12,9° (c= 1,1 % DMF).

Elementaranalyse für C57H67013N11" |-H20:

berechnet: gefunden:

C 59,50; C 59,63;

H 6,32; H 6,43;

N 15,58 N 15,03

d) Herstellung von e-Acap-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-NH2

In 40 ml Essigsäure wurden 700 mg Z-e-Acap-Arg(N02)-Gly-Phe-Phe-Tyr-NH2 gelöst, dann wurde 14 Stunden lang in Gegenwart von Palladium als Katalysator die katalytische Reduktion durchgeführt. Der Katalysator wurde abfiltriert und das Lösungsmittel bei vermindertem Druck abdestilliert. Der Rückstand wurde über eine mit Carboxymethyl-Sephadex gefüllte Kolonne (1,8 X12 cm) geleitet und die Elution wurde nach dem linearen Gradientenverfahren unter Einsatz von 0,1N (700 ml) bis IN (700 ml) wässerigem Ammoniumacetat durchgeführt. Die Fraktionen von 430 bis 550 ml wurden gesammelt und lyophilisiert. Die Ausbeute betrug 430 mg (62%),

[a] ^ -13,2° (c=0,5% Wasser).

Elementaranalyse für C41H5607NI0 • 2C2H402 • 3H20: berechnet: C 55,43; H 7,24; N 14,37

gefunden: C 55,48; H 7,39; N 14,47

Aminosäureanalyse: Arg 1,00(1); Gly 1,00(1);Tyr 1,00(1); Phe 2,07(2); Peptidgehalt 84%.

Beispiel 44 Lys-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-NH2 a) Herstellung von Di-Z-Lys-Arg(N02)-Gly-0Et

Unter Verwendung von 2,07 g Di-Z-Lys-OH wurde das in Beispiel 43 a) beschriebene Verfahren eingesetzt, um die gewünschte Verbindung in Form eines Gels zu erhalten. Erneutes Ausfällen aus Wasser/Äthanol/Äthylacetat ergab 2,57 g (73%), Fp: 161-162° C,

24

[a] -11,9° (c= 1,0% DMF).

Elementaranalyse für C32H44O10Ng: berechnet: C 54,85 ; H 6,33 ; gefunden: C 54,45; H 6,05;

N 15,99 N 15,99

b) Herstellung von Di-Z-Lys-Arg(N02)-Gly-0H

In 10 ml Aceton wurden 2,0 g Di-Z-Lys-Arg(N02)-Gly-OEt gelöst und während der Eiskühlung wurden 2,1 ml 2N wässerige Natriumhydroxidlösung zugegeben. Die Mischung wurde 2 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt. Nach Zugabe von 1,4 ml IN Salzsäure wurde das Aceton bei vermindertem Druck abdestilliert. Der Rückstand wurde mit 10 ml Wasser verdünnt und die unlöslichen Substanzen wurden abfil-5 triert. Die Lösung wurde dann mit IN Salzsäure angesäuert und der entstandene gelförmige Niederschlag abfiltriert. Die Ausbeute betrug 1,78 g (93%), Fp: 131—132,5° C,

[a] -10,5° (c=l,0 DMF).

1,1 Elementaranalyse für C30H40O10Ng • |-H20:

berechnet: C 51,49; H 6,20; N 16,02

gefunden: C 51,43; H 5,92; N 16,23

15 c) Herstellung von Di-Z-Lys-Arg(N02)-Gly-Phe-Phe-Tyr-NH2 Unter Verwendung von 1,21 gDi-Z-Lys-Arg(N02)-Gly-OH wurde das in Beispiel 43 c) beschriebene Verfahren wiederholt, um die gewünschte Verbindung in Form eines Gels zu erhalten. Die Ausbeute betrug 1,21 g (58%), Fp: 199-203° C,

2,1 74.

[a] -13,3° (c= 1,0% DMF).

Elementaranalyse für CS7H6g013N12 • 2H20:

berechnet: C 58,75; H 6,23; N 14,42

gefunden: C 58,70; H 6,26; N 14,72

d) Herstellung von Lys-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-NH2

In 30 ml Essigsäure wurden 1,00 g Di-Z-Lys-Arg(NÖ2)-Gly-Phe-Phe-Tyr-NH2 gelöst und dann wurde 20 Stunden lang 10 die katalytische Reduktion in Gegenwart von Palladium als Katalysator durchgeführt. Der Katalysator wurde abfiltriert und das Lösungsmittel bei vermindertem Druck abdestilliert. Der Rückstand wurde über eine mit Carboxymethyl-Sephadex gefüllte Kolonne (1,8 X10 cm) geleitet. Die Elution wurde nach 35 dem linearen Gradientenverfahren unter Verwendung von 0,1N (500 ml) bis IN (500 ml) wässerigem Ammoniumacetat durchgeführt und die Fraktionen von 650 ml bis 890 ml wurden gesammelt und lyophilisiert. Die Ausbeute betrug 468 mg (50%),

4" M 0 -10,6° (c=0,5% Wasser).

Elementaranalyse für C41HS707Nn • 3C2H402-4H20: berechnet: C 52,84; H 7,27; N 14,43

gefunden: C52,70; H7,31; N 14,72

Aminosäureanalyse: Arg 1,00(1) ; Lys 0,94(1) ; Gly 1,00(1) ; Tyr 1,00(1) ; Phe 2,06(2); Peptidgehalt 82%.

50 Beispiel 45

a,y-Dab-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-NH2 a) Herstellung von Di-Z-a-y-Dab-Arg(NQ2)-Gly-OEt

In 40 ml Äthyläther wurden 2,84 g Di-Z-a-y-Dab-OH-DCHA suspendiert (DCHA ist eine Abkürzung für Dicyclo-55 hexylamin) und die Suspension wurde mit 0,5N Schwefelsäure geschüttelt. Die Ätherschicht wurde mit Wasser gewaschen und über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet. Das Lösungsmittel wurde abdestilliert und das in Beispiel 43 a) beschriebene Verfahren wurde wiederholt, um die gewünschte Verbindung in Ml Form eines Gels zu erhalten. Dieses wurde aus Wasser/Äthanol/Äthylacetat erneut ausgefällt. Die Ausbeute betrug 2,36 g (70%), Fp: 153-156° C,

[a] 2p -9,4° (c= 1,0% DMF).

',s Elementaranalyse für C30H40O10Ng:

berechnet: C53,56; H5,99; N 16,66

gefunden: C 53,26; H 5,84; N 16,24

25

618 959

b) Herstellung von Di-Z-a-y-Dab-Arg(N02)-Gly-0H

In 10 ml Aceton wurden 2,0 g Di-Z-a,y-Dab-Arg(N02)-Gly-OEt gelöst und unter Eiskühlung 2,97 ml 2N wässeriges Natriumhydroxid zugetropft. Das Gemisch wurde unter den gleichen Bedingungen eine Stunde lang gerührt, dann wurden 3 ml IN Salzsäure zugegeben. Das Aceton wurde bei vermindertem Druck abdestilliert und 10 ml Wasser zugegeben. Die unlöslichen Substanzen wurden abfiltriert und das Filtrat wurde mit 1 N Salzsäure angesäuert. Der entstandene gelförmige Niederschlag wurde abfiltriert. Die Ausbeute betrug 1,67 g (90%), Fp: 112-113° C,

ja] p -8,3° (c= 1,1 % DMF).

Elementaranalyse für C28H36O10N8 • H20:

berechnet: C50,55; H5,76; N 16,89 gefunden: C50,53; H5,59; N 17,19

c) Herstellung von Di-Z-a,y-Dab-Arg(N02)-Gly-Phe-Phe-Tyr-NH2

Unter Verwendung von 1,12 g Di-Z-a,y-Dab-Arg(N02)-Gly-OH wurde genau das in Beispiel 43 c) beschriebene Verfahren verfolgt, um die gewünschte Verbindung in Form eines Gels zu erhalten. Die Ausbeute betrug 1,02 g (51%), Fp: 191-195° C,

[a] ^ —14,0° (c=0,9% DMF).

Elementaranalyse für C55H64013N12 • H20:

berechnet: C59,02; H 5,95; N 15,02

5 gefunden: C59,13; H6,14; N15,46

d) Herstellung von a,y-Dab-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-NH2 In 30 ml Essigsäure wurden 600 mg Di-Z-a,y-Dab-Arg(N02)-Gly-Phe-Phe-Tyr-NH2 gelöst und dann wurde 12 1(1 Stunden lang die katalytische Reduktion in Gegenwart von Palladium als Katalysator durchgeführt. Der Katalysator wurde abfiltriert und das Lösungsmittel bei vermindertem Druck abgedampft. Der Rückstand wurde über eine mit Carboxymethyl-Sephadex gefüllte Kolonne (1,8 X10 cm) geleitet und die Elu-11 tion wurde nach dem linearen Gradientenverfahren unter Verwendung von 0,1N (500 ml) bis IN (500 ml) wässerigem Ammoniumacetat durchgeführt. Die Fraktionen von 490 ml bis 620 ml wurden vereinigt und lyophilisiert. Die Ausbeute betrug 241 mg (43%),

' M -17,9° (c=0,6% Wasser).

Elementaranalyse für C-mH^C^N., • 3C2H402 • 4H20: berechnet: C51,96; H7,08; N 14,82

:5 gefunden: C 52,12; H6,99; H 15,31

Aminosäureanalyse: Arg 1,00(1); Dab 1,04(1); Gly 1,09(1); Tyr 1,02(1); Phe 2,13(2); Peptidgehalt 79%.

Liste der Beispiele R1-Arg-R2-Phe-Phe-R3

Ex.

Ri

C-Zahl r2

C-Zahl

R3

1

H

—

Pro

5

Tyr-NH2

2

Gly

2

Pro

5

Tyr-NH2

3

y-Abu

4

Pro

5

Tyr-NH2

4

e-Acap

6

Pro

5

Tyr-NH2

5

Lys

*6

Pro

5

Tyr-NH2

6

a,y-Dab

*4

Pro

5

Tyr-NH2

7

ß-Ala

3

Pro

5

Tyr-NH2

8

ß-Ala

3

Pro

5

NH2

9

ß-Ala

3

ß-Ala

3

Tyr-NH2

10

Ala

3

ß-Ala

3

Tyr-NH2

11

ß-Ala

3

Sar

3

Tyr-NH2

12

Leu

6

Pro

5

Tyr-NH2

13

ß-Ala

3

Phe

9

Tyr-NH2

14

ß-Ala

3

Leu

6

Tyr-Gly-NH2

15

ß-Ala

3

Ser

3

Tyr-Gly-NH2

16

ß-Ala

3

Pro

5

Tyr-Thr-Pro-Lys-Ala

17

ß-Ala

3

Gly

2

Tyr-Leu

18

ß-Ala

3

Gly

2

Tyr-Ala-NH2

19

ß-Ala

3

Gly

2

Tyr-Thr-Pro

20

e-Acap

6

Gly

2

Tyr-Thr-Pro

21

Lys

*6

Gly

2

Tyr-Thr-Pro

22

ß-Ala

3

Gly

2

Tyr-Thr-Pro-Lys-Ala

23

Gly

2

Gly

2

Tyr-Thr-Pro-Lys-Ala

24

Leu

6

Gly

2

Tyr-Gly-NH2

25

ß-Ala

3

Gly

2

Tyr-Ala-Gly-NH2

26

a,y-Dab

*4

Gly

2

Tyr-Ala-Gly-NH2

27

Gly

2

Gly

2

NH2

28

D-Ala

3

Gly

2

nh2

29

Phe

9

Gly

2

nh2

30

Leu

6

Gly

2

Tyr-NH2

31

a-Abu

4

Gly

2

Tyr-NH2

32

Nie

6

Gly

2

Tyr-NH2

33

Val

5

Gly

2

Tyr-NH2

34

ß-Ala

3

Gly

2

nh2

618 959

26

RrArg-R2-Phe-Phe-R3

Ex.

Ri

C-Zahl

R2

C-Zahl

R3

35

Y-Abu

4

Gly

2

nh2

36

ô-Aval

5

Gly

2

nh2

37

e-Acap

6

Gly

2

nh2

38

Lys

*6

Gly

2

nh2

39

a,Y-Dab

*4

Gly

2

nh2

40

Arg

*6

Gly

2

nh2

41

ß-Ala

3

Gly

2

Tyr-NH:

42

Y-Abu

4

Gly

2

Tyr-NH:

43

e-Acap

6

Gly

2

Tyr-NH-

44

Lys

*6

Gly

2

Tyr-NH;

45

a,Y-Dab

*4

Gly

2

Tyr-NH;

*Basische Aminosäure a-Abu (a-Aminobuttersäure)

y-Abu (Y-Aminobuttersäure) e-Acap (e-Aminocapronsäure) Ala (Alanin)

ch3ch2c h-cooh

I

nh2

nh2ch2ch2ch2cooh nh2(ch2)5cooh ch3c h-cooh I

nh,

ß-AIa(ß- Alanin) Arg (Arginin)

Ô-Aval (ô-Aminovaleriansâure) a,Y"Dab(a,Y-Diaminobuttersäure)

a,ß-Diaminopropionsäure

Gly (Glycin)

His (Histidin)

nh2ch2ch2cooh hn=c -nh-(ch2)3c h-cooh

I

NH,

nh,

nh2(ch2)4cooh nh2ch2ch2c h-cooh I

nh2

c h2-c h-cooh I I nh2 nh2

nh2-ch2-cooh n s;ch2c h-cooh

IL-NH^ 1

nh2

Leu (Leucin)

ch

chï

chch2c h-cooh

I

nh,

Lys (Lysin)

nh2(ch2)4c h-cooh I

nh,

Nie (Norleucin)

Phe (Phenylalanin)

ch3(ch2)3c h-cooh I

nh2

/ \

'< ")-ch2c h-cooh

J 1

nh,

27

Pro (Prolin)

•n-' h

-cooh

Sar (Sarcosin) Ser (Serin)

Thr (Threonin)

Tyr (Tyrosin)

ch3nhch2cooh hoch2c hcooh I

nh2

ch3c h-c h-cooh I I oh nh2

ho—-f. /) - ch2c h-cooh nh,

Val (Valin)

ch: ch3

[3\

>chc h-' I

cooh nh,

In allen Patentansprüchen bedeuten - wenn nicht ausdrücklich anders angeführt - in allen Fällen, in welchen optische Isomere der Aminosäuren vorliegen, die Aminosäuren jeweils einzelne optische Isomere und jedes racemische Gemisch.