NO751044L

NO751044L -

Info

Publication number: NO751044L
Application number: NO751044A
Authority: NO
Inventors: M Fujino; M Wakimasu; S Taketomi; E Ishikawa
Original assignee: Takeda Chemical Industries Ltd
Priority date: 1974-03-26
Filing date: 1975-03-25
Publication date: 1975-09-29
Also published as: SE7503471L; CH618959A5; FI750925A; US4001199A; FR2274604A1; CS189694B2; IE40877B1; ES435990A1; ATA223975A; FR2274604B1; CA1059993A; HU175306B; AT348153B; IE40877L; SU577975A3; GB1499764A; NL7503519A; DK126275A; AU7904675A; DE2513057A1

Description

Foreliggende oppfinnelse angår nye polypeptider med formel

hvor er hydrogen, eller et basisk eller nøytralt aminosyre-residuum, Rg er et nøytralt aminosyre-residuum, mens R^er NHg, Tyr-NH^eller et residuum av tyrosylpeptidet bestående av fra 1 til 5 aminosyre-residua eller residua av amider av tyrosylpeptider, forutsatt at når R-^er hydrogen, så er Rg Pro.

Nevnte polypeptider kan effektivt brukes for behandling av svikt i karbohydrat mg i lipid-metabolisme, da spesielt ved behandling av sukkersyke.

I den foreliggende beskrivelse og de etterfølgende krav, så er de anvendte forkortelser som er brukt for å betegne aminosyrerpeptider og deres aktiverende eller beskyttende grupper samt beskyttende og aktiverende midler for aminosyrer eller peptider, brukt slik de er angitt i IUPAC-IUB Gommission on Bilogical Nomenclature, eller de som vanligvis brukes i forbindelse med peptider. Eksempler på disse forkortelser er følgende:

a-Abu: a-aminosmørsyre

Y-Abu: T-aminosmørsyre

£-Acap: 6-aminokapronsyre

Ala: Alanin

p-Ala: (3-alanin

Arg: Arginin

SAval: &-aminovalerinsyre

oc,T-Dab: a,Y-diaminosmørsyre

Gly: Glycin

His: Histidin

Leu: Leucin

Lys: Lysin

Nie: Norleucin

Phe: Fenylalanin

Pro: Prolin

Sar: Sarcosin

Ser: Serin

Thr: Threonin

Tyr: Tyrosin

Val: Valin

Aoc: t-amyloksykarbonyl

Bzl: Benzyléter

DGC: N,N'-dicykloheksylkarbodiimid

HONB: N-hydroksy-5-norbornen-2,3-dikarboksimid

OBzl: Benzylester

ODNP: 2,4-dinitrofenylester

OEt: Etylester

ONB: HONB ester

Opcp: Pentaklorfenylester

Osu: N-hydroksysuccinimid-ester

OtBu: t-butylester

Tos: Tosyl

Z. Benzyloksykarbonyl

Hvis det i den foreliggende beskrivelse eller i de

etterfølgende krav er angitt at det foreligger optiske isomere med hensyn til aminosyrene, så forstås det at nevnte aminosyrer innbefatter begge de optiske isomere eller en racemisk blanding hvis intet annet er angitt. Når R-^er "hydrogen, så betyr Rl-Arg gruppen følgende arginylgruppe:

Ved begrepet "aminosyre-residuum" forståes en gruppe som er i stand til å danne en peptidbinding, dvs. en aminosyre-gruppe som enten har ett -eller begge hydrogenatomer eller sin amino eller iminogruppe og hydroksy i sin karboksylgruppe.

Basiske eller nøytrale aminosyrer representert ved

R-L har fortrinnsvis fra 2 til 10 karbonatomer. Som basiske amino syrer kan man nevnte a-aminosyrer som a,(3-diaminopropionsyre, a,T-diaminosmørsyre, arginin, lysin eller histidin. Som nøytrale aminosyrer representert ved R, kan man eksempelvis nevnte a-aminosyrer som glycin, alanin, serin, treonin, a-aminosmørsyre, prolin, leucin, isoleucin, norleucin, fenylalanin og tyrosin, samt andre aminosyrer såsom p-alanin, "J^-aminosmørsyre, £-amino-valerinsyre og £-aminokaproinsyre. Når det forefinnes optiske isomerer i disse aminosyrer slik det er angitt i E^, så kan disse syrer enten være enhver av de optiske isomere eller racemiske forbindelser. Blant de aminosyrer som tilsvarer R-^, er det fore trukket å bruke |3-alanin.

fiøytrale aminosyrer representert ved Rg har fortrinnsvis 2 til 10 karbonatomer og kan eksemplifiseres ved glycin, alanin, p-alanin, sarcosin, serin, prolin, valin, leucin, isoleucin, fenylalanin og tyrosin.

Aminosyrer som tilsvarer Rg er fortrinnsvis glycin eller prolin. Hvis Rr> er et residuum av prolin, så oppnår man det forønskede resultat selv når R-^er hydrogen.

Aminosyrer som kan utgjøre tyrosylpeptider eller

dets amider er fortrinnsvis 2 til 10 karbonatomer og kan eksemplifiseres ved glycin, alanin, serin, treonin, valin, prolin, leucin, isoleucin, lysin, fenylalanin og tyrosin. Disse aminosyrer er konjugert i enhver rekkefølge slik at det dannes tyrosylpeptider eller deres amider som tilsvarer fra 1 til 5 aminosyre-residua. Det er i det følgende gitt eksempler på slike tyrosylpeptider og deres respektive amider er på tilsvarende måte eksemplifisert som tyrosylpeptid-amidene.

I) Tyr-Gly-OH

2$ Tyr-Ala-Gly-OH

3) Tyr-Leu-Gly-Val-Ala-OH

£) Tyr-Leu-Gly-Val-Aia-OH

5 ) Tyr-Thr-Pro-Ser-Phe-OH

6) Tyr-Thr-Pro-Lys-Ala-OH

7) Tyr-Thr-Pro-Lys-Thr-OH

8) Tyr-Ser-Pro-Arg-Gly-OH

9) Tyr-Pro-Ile-OH

10) Tyr-Leu-Leu-Leu-OH

II) Tyr-Gly-Gly-Gly-Gly-OH

12) Tyr-Ala-Ala-Ala-Ala-OH

13) Tyr-Thr-Pro-Lys-OH

Det er foretrukket å bruke Tyr-NH^blant nevnte aminosyrer og tyrosylpeptider samt deres amider.

Når det gjelder de aminosyrer som kan være representert ved Rp eller utgjøre R^-gruppen, så kan disse eventuelt være i form av rene optiske isomere eller racemiske forbindelser.

Hvis det er optiske isomerer blant de aminosyrer residua som utgjør polypeptidene (I), bortsett fra de som er angitt ved R^, så er det foretrukket å bruke L-aminosyre-residua på grunn av deres lavere toksitet.

Polypeptider med formel I vil ifølge foreliggende oppfinnelse fremstilles ved å kompensere en aminosyre som tilsvarer R-^eller arginin når R]_ er hydrogen, eller et peptidfragment av polypeptidet med formel I som har aminosyreresiduet Ri eller arginylgruppen når R-j_ er hydrogen, som sin N-terminale aminosyre, ved det gjenværende fragment av polypeptidet (I), og hvor hver av utgangsmaterialene kan være beskyttet ved sine amino-eller karboksylgrupper som ikke inngår i den angitte kondensasjon, eller kan være aktivert ved samme grupper hvis disse inngår i den angitte kondensasjon, horetter man eventuelt fjerner beskyttende grupper fra det resulterende produkt.

Den foreliggende kondensasjon utføres ved fremgangsmåter som i seg selv er kjent for kondensasjon av peptidbindingen.

Den foreliggende kondensasjon kan utføres ved alle stillinger i nevnte polypeptid, slik at man får dannet den for-ønskede peptid eller amidbinding. Ved' industriell produksjon er det foretrukket å utføre kondensasjonen mellom 3* aminosyrekomponent som tilsvarer R^og den 4* aminosyrekomponent som tilsvarer fenylalanin.

På samme måte som for kjente polypeptider kan polypeptidet ifølge foreliggende oppfinnelse syntetiseres fra aminosyre som inngår i det ferdige polypeptidet ved repetisjon av kondensasjonsreaksjonene. Vanligvis vil imidlertid éet siste trinn i syntesen være kondensasjonen mellom to komponenter, dvs. mellom peptidet og den terminale aminosyre eller to peptider. Disse to komponenter er utgangsmaterialene i siste kondensasjons-trinn for å syntetisere produktet. Disse utgangsmaterialer eller deres avsluttende mellomprodukter kan fremstilles på enhver fremgangsmåte som i seg selv er kjent i forbindelse med peptidsynteser. - Utgangsmaterialene i foreliggende fremgangsmåte kan eksemplifiseres ved aminosyrer som sådan av de N-terminale aminosyrer i polypeptidene (I), samt peptidfragmentet som består av de N-terminale aminosyrer som hver av aminosyrene etterpå skal knyttes til, slik det er angitt ved aminosyrerekkefølgen i polypeptidene (I). Korresponderende utgangsmateriale er frag-menter av den gjenværende del av polypeptidene (I), bortsett fra nevnte utgangsmaterialer.

Kombinasjoner av utgangsmaterialer og deres korre-sponderendeutgangsmaterialer er eksemplifisert i den følgende tabell.

Kondensasjonen ifølge foreliggende oppfinnelse kan utføres ved kondensasjonsmetoder eller prosesser som er kjent for dannelsen av peptidbindinger. Blant slike kondensasjonsprosesser er den såkalte DCC+HONB prosessen (Belgisk patent nr. 796.399), azidprosessen, kloridprosessen, syreanhydrid-prosessen, den blandede syreanhydrid-prosessen, DCC-prosessen, den aktive ester-prosessen, Woodward-reagent K prosessen, karbodiimidazol-prosessen, oksydasjons-reduksjons-prosessen og andre (The Peptides, Vol. 1 (I966), Schroder and Lubke, Academic Press, New Yorsk,

USA).

Før selve kord ensasjonsreaksjonen kan man om ønskelig beskytte karboksyl ogaminogrupper som ikke skal inngå i den omgivende reaksjon og eventuelt aktivere karboksyl og/eller aminogrupper som skal ta del i den angitte reaksjon, og dette kan gjøres ved fremgangsmåter som i seg selv er kjente. De karboksylgrupper i utgangsmaterialet som ikke skal inngå i den angitte reaksjon, kan beskyttes i form av metallsalter (f.eks. natrium og kaliumsaltet) eller i form av estere (f.eks. metyl, etyl,, benzyl, p-nitrobenzyl, t-butyl eller t-amylestere).

Beskyttende grupper for aminogrupper i utgangsmaterialene kan være enhver hensiktsmessig beskyttende gruppe som brukes for aminogrupper i peptidsynteser, f.eks. benzyloksykarbonyl, t-butoksykarbonyl, 6-amyloksykarbonyl, isobornyloksy-karbonyl etc. Disse beskyttende grupper kan brukes for å beskytte iminogruppen i prolin. Imidazolfunksjonen i histidin kan beskyttes ved hensiktsmessige beskyttende grupper såsom benzyl, tosyl, 2,4-dinitrofenol, t-butoksykarbonyl eller karbobenzoksy. Hydroksylgruppen i serin, tyrosin eller treonin kan beskyttes

ved enhver hensiktsmessig gruppe såsom benzyl, t-butyl og andre eterdannende grupper. Guanidinogruppen i arginin kan beskyttes med grupper såsom nitro, tosyl, karbobenzoksy, isobornyloksy-karbonyl eller adamantyloksykarbonyl. Som eksempler på aktiverte karboksylgrupper i utgangsmaterialene■kan man nevnte de tilsvarende syreanhydrider, azider, aktive estere (f.eks. estere med alkoholer (f.eks. pentaklorfenyl, 2,4,5-triklorfenol, 2,4-dinitrofenol, cyanometylalkohol, p-nitrofenol, N-hydroksy-5-norbornen-2,3-dikarboksimid, N-hydroksysuccinimid, N-hydroksy-ftalimid eller N-hydroksybenztriazol), etc. De beéyttende amino-rupper i utgangsmaterialene kan f.eks. være de tilsvarende fosfor-syreamider.

Den følgende tabell viser visse kombinasjoner av slike former av karboksyl og aminogrupper i materialene (å)

og (B).

Bemerk: I de tilfeller hvor det er angitt en stjerne ,

så er fortrinnsvis et dehydreringsmiddel (f.eks.

en karbodiimid-reagens, såsom dicykloheksyl-

karbodiimid) fortrinnsvis tilstede i reaksjons-systemet.

Den foreliggende kondensasjon kanliføres i nærvær av et oppløsningsmiddel. Dette oppløsningsmiddel kan velges fra den gruppe som brukes for slike kondensasjonsreaksjoner. Man kan f.eks. bruke vannfrie eller vandig dimetylformamid, dimetyl-sulfoksyd, pyridin, kloroform, dioksan, diklormetan, tetrahydrofuran eller egnede blandinger av slike oppløsningsmidler.

Reaksjonstemper aturen velges innenfor det område

som er kjent for reaksjoner som fører til dannelse av peptidbindinger, dvs. normalt i området fra ca. -20 til +30°C. Videre kan det angis at utgangsmaterialer (beskyttede peptider) for de angitte forbindelser ifølge foreliggende oppfinnelse også lett kan fremstilles ved såkalte fast fasesyntetiske prosesser.

Etter at kondensasjonsreaksjonen er utført kan eventuelle beskyttende grupper fjernes på kjent måte. Blant slike fremgangsmåter kan nevntes katalytiske reduksjoner i nærvær av katalysatorer såsom palladium, palladium-på-karbon, platina eller lignende, solvolyse vedmhjelp av hydrogenfluorid, trifluoreddiksyre eller lignende samt reduksjon med metallisk natrium i flytende ammoniakk.

Det således fremstilte peptid (1)- kan innvinnes fra reaksjonsproduktblandingen ved fremgangsmåter som er kjent for innvinning av peptider, f.eks. ved ekstraksjon, fordeling, kolonne-kromatografi etc.

Foreliggende reaksjon kan utføres ved den i seg selv kjente vanlige fast fasemetoden.

Polypeptidene kan også innvinnes i form av et salt

eller en metallkompleksforbindelse.

Blant syrer som kan danne salter med polypeptider

med formel (I) kan nevnes uorganiske syrer som saltsyre, hydro-brpmsyre, perklorsyre, salpetersyre, tiocyansyre, svovelsyre, fosforsyre etc, samt organiske syrer såsom maursyre, eddiksyre, propionsyre, glykolinsyrej, melkesyre, pyrodruesyre, oksalsyre, malonsyre, sitronsyre, ravsyre, maleinsyre, fumarsyre, antranylin-syre, kanelsyre, naftalensulfonsyre eller sulfanylinsyre.

Metaller som kan danne metallkompleksforbindelser med nevnte polypeptider innbefatter bl.a. sink, nikkel, kobolt,

kobber og jern. Slike metallkompleksforbindelser-kan fremstilles på vanlig kjent måte, f.eks. ved omsetning av polypeptidet ved hydroksydet eller oksydet av et metall ved et pH-nivå som varierer fra 6 til 8.

Polypeptider (I) ifølge foreliggende oppfinnelse har evne til å senke høyt innhold av glukose i blod og urin til et normalt nivå, ikke bare ved parenteral tilførsel, men også v ed oral tilførsel. Polypeptidene (I) har overraskende spesifik aktivitet ved ikke å redusere et normalt nivå med hensyn til glukose i blod og urin, og er således langt bedre enn insulin i som forårsaker hypojglykemi. Nevnte polypeptider har lav toksitet og kan trygt tilføres. De har også den aktivitet at de fremmer lipidmetabolismen. Nevnte polypeptider kan således effektivt tilføres mennesker og andre dyr, såsom rotter eller mus, enten i oralt eller parenteralt for å behandle sviktende karbohydrat eller lipidmetabolisme, da spesielt ved behandling av sukkersyke eller hypercholestemi uten at dette frembringer uønskede side-effekter. Nevnte..polypeptider kan tilføres så sådan eller i farma-søytiske former såsom tabletter, pellets, granulater, pulvere, væsker, eller injeksjonsoppløsninger som kan fremstilles på vanlig kjent måte.

Eksempler på farmasøytiske preparater er angitt i

det følgende:

Injeksjonsoppløsning. Pulver

Skjønt den daglige dose av nevnte polypeptider vil være avhengig av lidelsens type og grad, pasientens alder etc,

så vil den vanligvis ligge i området fra 50/US til ca. 100 mg/kg kroppsvekt.

Farmakologisk 'eksperiment med hensyn til bedring av sukkersyke

ved hjelp av polypeptider (I).

Åtte uker gamle hunmus som var genetisk sukkersyke (KKA<y>eller gul KK mus) ble holdt individuelt i metallbur for oppsamling av urin. Tre grupper med mus ble oralt tilført polypeptidet (I) med formel p-Åla-L-Arg-Gly-L-Phe-L-Phe-L-Tyr-NHg (forbindelse A) i tre forskjellige dosenivåer (1, 10 og 100 mg/kg/ dag). Behandlingsprosedyren er angitt i tabell 3» Kontroll- . gruppen ble gitt en saltoppløsning. Hver 4«dag ble plasma og uringlukose bestemt ved glukoseoksydase-metoden (Huggett, A.St.G. og Nixon, D.A., "Lamcet", volume II, side 368-370 (1957)).

Resultatene er angitt i tabell 3« I kontrollgruppen var plasmaglukose-nivået og uringlukose som ble utskilt i løpet av 24 timer meget høy under hele eksperimentet. I motsetning til dette fikk man en gradvis senkning enten av plasmaglukosen eller uringlukosen i de dyr som ble behandlet med polypeptidet. Man kunne oppdage en doseavhengig reaksjon i disse anti-sukkersyke effektene. I etterbehandlingsfasen steg begge glukosenivåene i de tre behandlede grupper. Man kunne imidlertid observere en viss dose-avhengighet ved den vedvarende anti-sukkesyke-effekten man fikk etter at behandlingen var avsluttet.

Det fremgår av disse eksperimenter at polypeptidene letter sukkersyken hos disse mus.

Behandlingsprosesyre

PG: plasmaglukose (mg/lOO ml) UG: uringlukose (g/døgn)

K signifikant i'forhold til saltgruppen (p<0,05)

<K3£>signifikant i forhold til saltgruppen (p<0,01)

Hvis det i de etterfølgende eksempler forefinnes optiske isomere med hensyn til de angitte aminosyrer, så er alle disse aminosyrer i form av en L-konfigurasjon hvis intet annet er angitt.

Eksempel 1.

Fremstilling av Arg-Pro-Phe-Phe-Tyr-NH2

a) Fremstilling av Z-Arg(N02)-.Pro-Phe-Phe-Tyr-NH2

I 50 ml DMF (dimetylformamid) ble det oppløst

10,0 g Z-Phe-Phe-Tyr-NH2og det ble utført en katalytisk reduksjon med palladium som katalysator i 10 timer. Katalysatoren ble frafiltrert, og mens filtratet ble avkjølt med is tilsatte man 7,37 g Z-Arg(N02)-Pro-0H og 3,53 g HONB.

Denne fremgangsmåte ble fulgt ved en tilsetning av 4,06 g DCC og blandingen ble rørt i 16 timer. Den dannede DC (dicykloheksyl-)urea ble frafiltrert, og dimetylformamid ble avdestillert under redusert trykk. Residuumet ble tilsatt 200 ml etylacetat, og det resulterende pulver oppsamlet ved filtrering. Pulveret ble renset ved gjenutfelling fra DMF-metanol-vann. Utbytte: 14,5 g. (95,6$), smeltepunkt 100-103°G, (a)24 -29,7° (c = 0,55%) DMF.

Elementæranalyse beregnet for: c^5H^^0ioNio'H20

Beregnet: G 59,73 H 6,10 N 15,11

Funnet: C 59,51 H 6,06 N 14,90

b) Fremstilling av Arg-Pro-Phe-Phe-Tyr-NH2

I 30 ml eddiksyre ble det oppløst 500 mg Z-Arg(N02)-Pro-Phe-Phe-Tyr-NH2og katalytisk reduksjon ble utført med palladium som katalysator i 20 timer. ' Katalysatoren ble frafiltrert og filtratet ble konsentrert til tørrhet under redusert trykk. Residuumet ble oppløst i 50 ml vann, og etter frafiltrering av mindre mengder uoppløselige stoffer, ble filtratet lyofilisert. Produktet ble oppløst i 5 ml vann, og oppløsningen ble påsatt en kolonne (1,8 x 9 cm) av karboksymetyl-sefadex.

Det ble utført en gradienteluering med 0,1 molar vanndig ammoniumacetat (400 ml) og 1 molar vandig ammoniumacetat (400 ml). Frakksjonene fra 25O til 370 ml ble slått sammen og lyofilisert, og man fikk 250 mg (52,3$) av et hvitt lett produkt.

(a)^-4l,9<0>(c = 0,47%, vann).

Aminosyre-analyse (hydrolyse med HC1): Arg, 1,00,

Pro 1,05, Tyr 0,91, Phe 1,96, (peptidinnhold 86,5%).

Elementæranalyse for C^gH^OgN^. 20^^. 2H20

Beregnet: G 57,06 H 6,96 N 14,26

Funnet: G 56,76 H 6,98 N 14.28.

Eksempel 2.

Fremstilling av Gly-Arg-Pro-Phe-Phe-Tyr-NH2

a) Fremstilling av Z-Gly-Arg-Pro-Phe-Phe-Tyr-NH2

I 30 ml eddiksyre ble det oppløst 800 mg Z-Arg(NOg)-Pro-Phe-Phe-Tyr-NH2 og katalytisk reduksjon ble utført med palladium•som katalysator i 8 timer. Katalysatoren ble frafiltrert, og filtratet ble konsentrert til tørrhet under redusert trykk. Residuumet ble oppløst i 20 ml vann og lyofilisert.

Det resulterende pulver ble oppløst i 10 ml dimetyl-ormamid og man tilsatte 147 mg p-toluensulfonsyre-monohydrat. Blandingen ble så tilsatt 349 mg Z-Gly-0NB, fulgt av en røring

i 10 timer. Nevnte dimetylformamid ble avdestillert under redusert trykk, og man tilsatte 50 ml etylacetat. Det resulterende pulver ble oppsamlet ved filtrering. Utbytte 858 mg (89,5%), smp. 119-121°C, { a) p -26,7° (c = 0,96%, DMF).

Elementæranalyse for C^gH^g0gNlo.C^HgO^S.HgO

Beregnet: C 59,55 H 6,l8 N 12,63 S 2,89

Funnet: C 59,45 H 6,08 N 12,37 S 2,76

b) Fremstilling av Gly-Arg-Pro-Phe-Phe-Tyr-NH2.

I 30 ml eddiksyre ble det oppløst 500 mg Z-Gly-Arg-Pro-Phe-Phe-Tyr-NH2p-toluensulfonat og det ble utført en katalytisk reduksjon med palladium som katalysator i 5 timer. Katalysatoren ble frafiltrert, og oppløsningsmidlet av destillert under redusert trykk. Residuumet ble oppløst i 20 ml vann og opplæsningen underkastet en ioneutbyttings-kromatografi (kolonne av Amberlite IRA 410') (aaetatform) (sterkt basisk anionisk utbyttingsharpiks av Rohm & Haas Co. Ltd., USA). Eluatet ble lyofilisert, og det resulterende pulver oppløst i 5 ml vann. Oppløsningen ble påsatt en kolonne (2,6 x 23 cm) av karboksymetylcellulose og eliiering ble utført ved gradientmeto den idet man bkrukte 0,05 molar til 0,2 molar vandig ammomiumacetat (700 ml av hver). Fraksjonene fra 840 ml til 97O ml ble slått sammen og lyofilisert. Utbytte 270 mg (63,6%), (a)<22>-62,0°,

(c = 0,46%, vann).

Elementæranalyse for C^oH^20^Nlo.2C2H^02.2H20

Beregnet: C 56,15 H 6,86 N 14,89

Funnet: C 55,99 H 6,92 N 14,77

Aminosyre-analyse: Arg, 0,94, Pro 1,06, Gly 1,00, Tyr 0,94,

Phe 2,03 (peptidinnhold: 83,2%).

Eksempel 3»

Fremstilling av ^Abu-Arg-Pro-Phe-Phe-Tyr-NHr,

Mån fulgte fremgangsmåten fra eksempel 2 bortsett

fra at Z-Y-Abu-ONB ble brukt i stedet for Z-Gly-ONB, hvorved man fikk 324 mg av det ovenfor angitte produkt (a)^<2>-58,7° (c = 0,45%, vann).

Elementæranalyse for C^2H^g0y<N>lo.<2G>2H^02.3H20

Beregnet: C 55,97 H 7,15 N 14,19

Funnet: C 56,14 H 7,36 N 13,92

Aminosyre-analyse: Arg 1,00, Pro 1,08, Tyr 0,97, Phe 2,13 (peptidinnhold 80,8%).

Eksempel 4.

Fremstilling av £-Acap-Arg-Pro-Phe-Phe-Tyr-NH2

a) Fremstilling av Z-£-Acap-Arg-Pro-Phe-Phe-Tyr-NH2.

I 10 ml dimetylformamid ble det oppløst 25O mg

Z-£-Acap-0H og under avkjøling ed is tilsatte man 186 mg HONB og 214 mg DGC. Blandingen ble rørt i 16 timer, og den dannede DC-urea ble frafiltrert. Filtratene ble tilsatt en DMF-oppløsning av H-Arg-Pro-Phe-Tyr-NH2p-toluensulfonat som var fremstilt på samme måte som i eksempel 2 a). Blandingen ble rørt i 12 timer, og dietylformamid ble avdestillert under redusert trykk. Residuumet ble tilsatt 30 ml etylacetat, og det resulterende pulver oppsamlet ved filtrering. Utbytte 8l0 mg (79)1%)>smeltepunkt 90-92°C (a)j-30,3° (c = 1,07%, DMF).

Elementæranalyse for C^HggOgN-^ .C^HgO^S. 2H20

Beregnet: C 59,88 H 6,65 N 11,84 S 2,80

Funnet: C 59,8l H 6,75 N 11,80 S 3,00.

b) Fremstilling av £-Acap-Arg-Pro-Phe-Phe-Tyr-NH2

500 mg av Z-derivatet ble fremstilt som angitt under

avsnitt a), og ble behandlet som angitt i eksempel 2b), og man fikk 316 mg av den angitte forbindelse. (0)^-58,9(c = 0,55%, vann)..

Aminosyre-analyse: Arg, 1,02, Pro 1,03, TYr 0>92>he 2,13

£-Acap (ikke bestemt) (peptidinnhold: 8l,5%).

Eksempel 5»

Fremstilling av Lys-Arg-Pro-Phe-Phe-Tyr-NH^

a) Fremstilling av di-Z-Lys-Arg-Pro-Phe-Phe-Tyr-NH2

Man fulgte fremgangsmåten i eksempel 4 a) bortsett

fra at man brukte 390 mg di-Z-Lys-OH i stedet for nevnte Z-£-Acap-0H og man fikk 932 mg av den ovenfor angitte forbindelse. Smeltepunkt 103-105°C, .(<x)jp -28,5° (c = 1,04%, DMF) Elementæranalyse for CgoH^^011N-L1.C^HgO^S.2H20

Beregnet: G 60,39 H 6,43 N 11,56 S 2,41

Funnet: C 60,64 H 6,21 N 11,79 S 2,82

b) Fremstilling av Lys-Arg-Pro-Phe-Phe-Tyr-NH25OO mg av di-Z-derivåtet fremstilt som angitt under

avsnitt a) ble behandlet på samme måte som angitt i eksempel 2b), og man fikk 336 mg av den ovenfor angitte forbindelse. (a)<23>-52,6° (c = 0,57%, vann).

Aminosyre-analyse: Lys 1,02, Arg 0,98, Pro 1,00, Tyr 0,94,

Phe 2,04 (peptid-innhold 91%).

Eksempel 6.

Fremstilling av a ,y-Dab-Arg-Pro-Phe-Phe-Tyr-NH2 På samme måte som angitt i eksemplene 4 og 5 ble

den ovenfor angitte forbindelse syntetisert fra 535 mg av di-Z-a,f-Dab-dicykloheksylamin-saltet. Utbytte 325 mg,

(a)f<p3>-58,2° (c = 0,50%, vann)

Aminosyre-analyse: A,7"-Dab, 1,00, Arg, 0,98, Pro 1,00, Tyr 0,87,

Phe 1,96 (peptid-innhold 84,2%).

Eksempel 7.

Fremstilling av p-Ala-Arg-Pro-Phe-Phe-Tyr-NH2

a) Fremstilling av Z-p-Ala-Arg(N02)-Pro-0Me.

3,50 g Z-Arg(N02)-Pro-0Me ble tilsatt 35 ml 25% HBr-eddiksyre, og blandingen ble rystet ved romtemperatur i 35 min. Blandingen ble så tilsatt 300 ml etyleter, og det resulterende bunnfall ble oppsamlet ved filtrering, vasket med eter og tørket.

Pulveret ble oppløst i 20 ml DMF og under avkjøling med is ble oppløsningen nøytralisert med trietylamin. Etter tilsetning av 2,9 g Z-p-Ala-0NB ble blandingen røtt i 16 timer.

Nevnte DMF ble avdestillert under redusert trykk,

og residuumet ble oppløst i J30 ml etylacetat. Oppløsningen ble vasket tre ganger méd 100 ml porsjoner av 20% vandig natriumhydrogenkarbonat. Ettervasking med vann ble oppløsningen tørket over vannfritt natriumsulfat. Oppløsningsmidlet ble avdestillert under redusert trykk, og etyleter ble tilsatt residuumet. Det resulterende pulver ble oppsamlet ved filtrering. Utbytte 3>05 g (74,3%), smeltepunkt 62-65°C, (a)<22>-34,1° (c = 1,04%, DMF).

Elementæranalyse for Cg^H^OgHy -"-/^ HgO

Beregnet: C 50,73 H 6,29 N 18,01

Funnet: G 50,98 H 6,36 N 17,72

b) Fremstilling av Z-|3-Ala-Arg(N02 )-Pro-0H.

I 30 ml aceton ble det oppløst 2,82 g Z-B-Ala-Arg(N02)-Pro-0Me og under avkjøling med is tilsatte man 10,7 ml 1 normal vandig natriumhydroksyd. Blandingen ble rørt ved romtemperatur i 2 timer. Etter nøytralisering med 11 ml 1 normal saltsyre ble aceton avdestillert under redusert trykk. Det oljeaktige residuum ble tilsatt 30 ml kaldt vann, og vannet ble fjernet ved dekantering. Residuumet ble vasket en gang til med kaldt vann og så tørket.. Det ble deretter kromatografert på en kolonne av 90 S silisiumdioksyd-gel med et oppløsningsmiddel som besto av etyl-acetat-pyridin-eddiksyre-vann (60:20:6:11). De fraksjoner som var rike på den forønskede forbindelse ble slått sammen og konsentrert til tørrhet under redusert trykk. Residuumet ble vasket med eter og oppsamlet ved filtrering. Utbytte 2,62 g, smp. 65-67°C, (a)<22>-27,5° (c = 1,07% DMF).

Elementæranal se for Gg<gH>^<OgNy>

Beregnet: C 50,66 H 5,99 N 18,80

Funnet: C 50,41 H 6,19 N 18,58

c) Fremstilling av Z-p-Ala-Arg(N02)-Pro-Phe-Phe-Tyr-NH2

I 15 ml DMF ble det oppløst 1,50 g Z-Phe-Phe-Tyr-NH2

og katalytisk reduksjon ble utført med palladium som katalysator i 4 timer. Katalysatoren ble frafiltrert, og mens filtratet ble avkjølt med is tilsatte man 1,21 g Z-p-Ala-Arg(N02)-Pro-0H,

0,53 g HONB og 0,6l g DCC. Blandingen ble så rørt i 18 timer.

Den dannede DC-urea ble-frafiltrert og nevnte DMF ble fordampet ved destillasjon under redusert trykk. Residuumet ble tilsatt 50 ml vann, og det resulterende pulver oppsamlet ved filtrering og tørket. Pulveret ble gjenlutfelt fra DMF-etylacetat. utbytte 1,99 g (80,9%), smp. 135-138°C, (a)<22>-33,1° (c = 0,9^,

DMF).

Elementæranalyse for G^gH^O^^N-^-^.HgO

Beregnet: G 59,08 H 6,17 N 15,47

Funnet: C 58,93 H 6,18 N 15,02

d) Fremstilling av |3-Ala-Arg-Pro-Phe-Phe-Tyr-NH2

I 40 ml iseddik ble det oppløst 1,50 g Z-p-Ala-Arg(N02)-Pro-Phe-Phe-Tyr-NH2og katalytisk reduksjon ble utført med palladium som katalysator i 8 timer. Katalysatoren ble fjernet ved filtrering, og oppløsningsmidlet ble avdestillert under redusert trykk.

Residuumet ble oppløst i 50 ml vann og små mengder uoppløselige stoffer ble frafiltrert. Filtratet ble lyofilisert. Produktet ble ytterligere oppløst i 20 ml vann og ført gjennom en kolonne (3j0 x 28 cm) av karboksymetyl-cellulose, og ble så eluert med gradientmetoden ved at man brukte 0,005 molar og 0,2 molar vandig ammoniumacetat (1,5 liter av hver). Fraksjonene fra 1490 til I84O ml ble slått sammen og lyofilisert. Utbytte 980 mg (65,7%), (a)22 -69,1° (c = 0,52%, vann).

Elementæranalyse for CpH^O^N-^. 2C2H^02.4H20

Beregnet: G 54,53 H 7,12 N 14,13

Funnet: C 54,34 H 6,98 N 13,98

Aminosyre-analyse: Arg 1,00, Pro 1,11, Tyr 1,00 Phe 2,10

p-Ala 0,94 (peptidinnhold 75,7%).

På samme måte som c) og d) ovenfor kan den samme forbindelse fremstilles ved hjelp av følgende reaksjonsjskjerna:

Eksempel 8.

Fremstilling av p-Ala-Arg-Pro-Phe-Phe-NHg

I fremgangsmåten fra eksempel 7 c) ble Z-Phe-Phe-Tyr-NHg Erstattet med Z-Phe-Phe-NHg og den samme fremgangsmåte man anvendte i eksempel'7 c) ble fulgt hvorved man fikk 1,24 g av den ovennevnte forbindelse som et hvitt luftig produkt. (a)<22>-48,6° (c = 0,32%, vann). Aminosyre-analyse: Arg 1,08, Pro 1,00, Phe 1,98, p-Ala 0,97 (peptidinnhold 82,6%).

Eksempel 9«

Fremstilling av p-Ala-Arg-p-Ala-Phe-Phe-Tyr-NH2

a) Fremstilling av Z-p-Ala-Phe-Phe-Tyr-NH2

I 40 ml DMF ble det oppløst 2,00 g Z-Phe-Phe-Tyrp-NHg

og katalytisk reduksjon ble utført med palladium som katalysator i 5 timer. Katalysatoren ble frafiltrert, og 1,396

Z-p-Ala-0NB ble tilsatt filtratet. Blandingen ble røtt i 9 timer og DMF ble avdestillert under destillert trykk. Residuumet ble tilsatt 50 ml vann, og det resulterende pulveroppsamlet ved filtrering og tørket. Produktet ble gjenutfelt fra DMF-etylacetat. Utbytte 2,02 g (88,0%), smp. 232°C, (a)<22>-23,4° (c = 0,94%, DMF9.

Elementæranalyse for C^gH^OyN^ .HgO

Beregnet: C 65,41 H 6,21 N 10,04

Funnet: C 65,18 H 6,20 N 10,32

b) Fremstilling av Z-Arg(N02)-p-Ala-Phe-Phe-Tyr-NH2

I 30 ml DMF ble det oppløst 1,0 gZ-p-Ala-Phe-Phe-Tyr-NH2og ved å brulkte palladium som katalysator utførte man

en katalytisk reduksjon i løpet av 16 timer. Katalysatoren ble så frafiltrert. Filtratet ble tilsatt en oppløsning av Z-Arg(N02 )-0DNP i tetrahydrofuran (dinitrof enylester-en fremstilt fra 0,52 g Z-Arg(N02)-0H og 0,30 g 2,4-dinitrofenol i 10 ml tetrahydrofuran.ved den såkalte DCC-prosessen). Blandingen ble røfct i 13 timer, og oppløsningsmidlet ble avdestillert. Residuumet ble tilsatt 50 ml vann, og det resulterende pulver oppsamlet ved filtrering og tørket. Utbytte 1,01 g (79,9%),

smp. 192-194°C, (a)<22>-11,1° (c = 1,02%, DMF).

Elementæranalyse for G^*H^20loLN-^o.H20

Beregnet: C 57,63 H 6,l6 N 15,28

. Funnet: C 57,63 H 5,93 N 15,6l

c) Fremstilling av Z-p-Ala-Arg(N02)-B-Ala-Phe-Phe-Tyr-NH2700 mg Z-Arg(N02)-B-Ala-Phe-Phe-Tyr-NH2ble tilsatt

0,2 ml anisol, fulgt av 7 ml 25% HBr-eddiksyre. Blandingen ble rystet ved romtemperatur i 40 min. Reaksjonsblandingen ble tilsatt 100 ml etyleter, og det resulterende bunnfall oppsamlet ved filtrering og vasket med etyleter. Etter tørking ble bunnfallet oppløst i 10 ml DMF og under avkjøling med is ble oppløsningen nøytralisert med trietylamin. Etteren tilsetning av 336 mg Z-B-Ala-0NB ble oppløsningen rørt i 18 timer. Nevnte DMF ble avdestillert under redusert trykk, og residuumet ble tilsatt 50 ml vann. Det resulterende bunnfall ble oppsamlet ved filtrering, og tørket og gjenutfelt fra DMF og etylacetat. Utbytte 56O mg (73%)j, smeltepunkt 200-202°C (dekomponering), (a)<2>)<2>-7,3° (c=0,91%, DMF).

Elementæranalyse for c^yh^y0]_]_<n>ii'<H>2°

Beregnet: C 58,19 H 6,13 N 15,89

Funnet: G 58,06 H 6,41 N 15,57

d) Fremstilling av B-Ala-Arg-B-Ala-Phe-Phe-Tyr-NH2.

I 30 ml iseddik ble det oppløst 400 mg Z-B-jAla-Arg(N02)-p-Ala-Phe-Phe-Tyr-NH2 og katalytisk reduksjon ble utført med palladium som katalysator i 8 timer. Katalysatoren ble fjernet ved filtrering, og oppløsningsmidlet avdestillert under redusert trykk. Residuumet ble oppløst i 5 ml vann og oppløs- ningen kjørt ned en kolonne (2,6 x 22 cm) av karboksymetyl-cellulose. Man utførte en gradienteluering ved å bruke 0,005 M og 0,2M vandige oppløsninger av ammoniumacetat (700 ml av hver). Fraksjonene fra 720 til 87O ml ble slått sammen og lyofilisert, og man fikk 270 mg (69,1%) av et hvitt lett produkt. (a)<22>-17,2° (c = 0,53%, vann).

Elementæranalyse for G^o</>^<gC>^<l>o*2C2H4^2* 3H2^

Beregnet: C 54,53 H 7,03 N 14,79

Funnet: C 54,52 H 6,96 N 15,00

Aminosyre-analyse: Arg 1,00, Tyr 1,00, Phe 2,03, B-Ala 2,14 (peptidinnhold 79,0%).

Eksempel 10.

Fremstilling av Ala-Arg-B-Ala-Phe-Phe-Tyr-NH2

I fremgangsmåten fra eksempel 9°) ble Z-8-Ala-0NB erstattet med 340 mg Z-Ala-0NB og man brukte samme fremgangsmåte som i eksempel 9 c) til d),.hvorved man fikk fremstilt 297 mS

av ovenfor angitte forbindelse som et hvitt lett pulveraktig produkt. (a)<24>"-18,9° (c 0,62%, vann).

Aminosyre-analyse: Arg 1,02, Ala 1,04, Tyr 0,97, Phe 2,00.

B-Ala 0,97 (peptidinnhold 8l,0%).

Eksempel 11.

Fremstilling av 8-Ala-Arg-Sar-Phe-Phe-Tyr-NH2

a) Fremstilling av Z-Sar-Phe-Phe-Tyr-NH2

I 30 ml DMF ble det oppløst 2,02 g Z-Phe-Phe-Tyr-NH2

og katalytisk reduksjon ble utført med palladium som katalysator i 5 timer. Katalysatoren ble frafiltrert, og filtratet ble avkjølt. Deretter tilsatte man 8l0 mg Z-Sar-0H oppløst i 10 ml tetrahydrofuran, hvoretter man tilsatte 0,71 g HONB. Blandingen ble avkjølt under 0°C og 0,82 g DCG ble tilsatt..Blandingen ble rørt i 3 timer. Den dannede DC-urea ble frafiltrert, og filtratet ble tilsatt ovennevnte DMF oppløsning. Blandingen ble rørt i 20 timer. Oppløsningsmidlet ble avdestillert under redusert trykk, og 50 ml vann tilsatt residummet. Det resulterende pulver ble oppsamlet ved filtrering og gjenutfelt fra DMF-etylacetat. Utbytte 1,90 g (83,8%), smp. 246-248°C (dekomponering), (a)j53 -9>7°1,07%,DMF)..

Elementæranalyse for C^g<H>^<0yN>^<.l/>2H20

Beregnet: C 66,26 H 6,15 N 10,17

Funnet: C 66,32 H 6,39 N 10,52.

b) Fremstilling av Z-Arg(N02)-Sar-Phe-Phe-Tyr-NH2.

I 10 ml DMF ble det oppløst 1,0 g Z-Sar-Phe-Phe-Tyr-NH2og katalytisk reduksjon ble utført med palladium som katalysator i 7 timer. Katalysatoren ble frafiltrert, og filtratet avkjølt. På den annen side ble så 0,52 g Z-Arg(N02)-0H oppløst i 10 ml tetrahydrofuran og under avkjøling med is, tilsatt 0,3 g 2,4-dinitrofenol og 0,33 g DCC. Blandingen ble rørt i 3 timer. Den dannede DC-urea ble frafiltrert, og filtratet ble tilsatt-ovennevnte DMF oppløsning. Blandingen ble rørt i 20 timer og oppløsningsmidlet ble avdestillert under redusert trykk. Residuumet ble tilsatt 50 ml vann, og det resulterende pulver oppsamlet ved filtrering. Etter tørking ble pulveret gjenutfelt fra DMF-etyl-acetat-etyleter. Utbytte 1,04 g (77,2%), smp. 96-98°C, (a)<23->7,3° (c = 1,06%, DMF).

Elementæranalyse for C^H^20lo%o. 2H20

Beregnet: C 57,63 H 6,l6 N 15,28

Funnet: C 57,60 H 6,10 N 15,01

c) Fremstilling av Z-B-Ala-Arg(N02)-Sar-Phe-Phe-Tyr-NH2

I 7 ml 25% HBr-eddiksyre ble det oppløst å700 mg

Z-Arg(N02)-Sar-Phe-Phe-Tyr-NH2og 0,2 ml anisol, og oppløsningen ble rystet ved romtemperatur i 40 min. Reaksjonsblandingen ble så tilsatt 100 ml etyleter, og det resulterende bunnfall oppsamlet ved filtrering, vasket med eter og tørket over natriumhydroksyd i 2 timer.

Det tørkede bunnfall ble oppløst i 10 ml DMF og under avkjøling med is ble oppløsningen nøytralisert med trietylamin. Etter tilsetning av 336 mg Z-B-Ala-0NB ble oppløsningen rørt i 20 timer. Dietylformamidet ble avdestillert under redusert .trykk, og 50 ml vann ble tilsatt. Det resulterende pulver ble oppsamlet ved filtrering, tørket og gjenutfelt fra DMF-etylacetat. Utbytte 59O mg (76,5%), smp. 135-138°C, (a)<23>-15,5° (c=0,99%,

DMF).

Elementæranalyse for ^/^ j^^^ l^ ll'^^

Beregnet: C 58,19 H 6,13 N 15,89

Funnet: C 58,18 H 6,40 N 15,60

d) Fremstilling av p-Ala-Arg-Sar-Phe-Phe-Tyr-NH2

I 30 ml eddiksyre ble det oppløst 45O mg Z-p-Ala-Arg(N02)-Sar-Phe-Phe-Tyr-NH2og katalytisk reduksjon ble utført med palladium som katalysator i 8 timer. Katalysatoren ble frafiltert, og filtratet konsentrert til tørrhet under redusert trykk. Residuumet ble oppløst i 5 ml vann og kromatografert på en kolonne (2,6 x 22 cm) av karboksymetylcellulose.. Gradient-eluering ble utført med 0,005M og 0,2M vandig oppløsning av ammoniumacetat (700 ml av hver), og man fikk den forønskede forbindelse i fraksjonene fra 77° "til 880 ml. Disse fraksjoner ble slått sammen og lyofilisert og man fikk 309 mg (70,4%) av et hvitt luftig produkt. (a)2,2 -21,5° (c = 0,46%, vann).

Elementæranalyse for C^H^OyN-^. 2C2H^02• 3H20

Beregnet:' C 54,53 H 7,03 N 14,79

Funnet: C 54,99 H 6,76 N 14,58

Aminosyre-analyse: Arg, 1,00, Tyr 0,88, Phe 3,02, p-Ala 0,98, Sar(ikke bestemt) (peptidinnhold 78,7%)..

Eksempel 12.

Fremstilling av Leu-Arg-Pro-Phe-Phe-Tyr-NH2

a) Fremstilling av Z-Leu-Arg(N02)-Pro-Phe-Phe-Tyr-NH2

I 20 ml DMF ble det oppløst 700 mg Z-Phe-Phe-Tyr-NH2

og katalytisk reduksjon ble utført med palladium i 6 timer. Katalysatoren blefrafiltrert, og filtratet avkjølt. Dette fil-trat ble tilsatt 648 mg Z-Leu-Arg(N02)-Pro-0H, fulgt av 247 mg HONB og 285 mg DCC. Blandingen ble rørt i 20 timer. Den dannede DC-urea ble frafiltrert, og nevnte DMF ble avdestillert under redusert trykk.' Residuumet ble tilsatt 50 ml vann og det resulterende pulver ble oppsamlet ved filtrering, og tørket og gjenutfelt fra DMF-etylacetat-eter. Utbytte 1,05 g (86,5%), smp. 110-111°C, (a)<22>-38,1° (c = 1,0%, DMF).

Elementæranalyse for O^gHg^O-^N-^. 2H20

Beregnet: C 59,13 H 6,59 N 14,59

Funnet: C 59,24 H 6,50 N 14,62

b) Fremstilling av Leu-Arg-Pro-Phe-Phe-Tyr-NH2

I 20 ml eddiksyre ble det oppløst 500 mg Z-Leu-Arg(N02 )-Pro-Phe-Phe-Tyr-NH2 og katalytisk reduksjon ble utført

med palladium som katalysator i 10 timer.

Katalysatoren ble frafiltrert, og filtratet konsentrert til tørrhet under redusert trykk. Residuumet ble oppløst i 5 ml vann og kromatografert på en kolonne (2,6 x 20 cm) av karboksymetyl-cellulose. Gradient-eluering ble utført med 0,005M og 0,2M vandige oppløsninger av ammoniumacetat (700 ml av hver), og man fikk den forønskede forbindelse i fraksjonene fra 700 "til 790 ml« Disse fraksjoner ble slått sammen qg lyofilisert og man fikk 300 mg (63,6%) av et hvitt luftig produkt. (a)<22>-58,3° (c = 0,59%, vann).

Elementæranalyse for<g>/j,^<h>60°<yn>i0«2C2H^02.2H20

Beregnet: C 57,8l H 7,28 N 14,05

Funnet: C 57,72 ... H 7,24 N 14,25

Aminosyre-analyse: Arg 1,07, Gly 1,03, Tyr 0,87, Phe 2,07,

Phe 1,00 (peptidinnhold 83,9$).

Eksempel 13.

Fremstilling av 8-Ala-Arg-Phe-Phe-Phe-Tyr-NH2

a) Fremstilling av Z-B-Ala-Arg(N02)-Phe-Phe-Phe-Tyr(Bzl)harpiks.

I reaksjonskaret i et fast-fase peptidsyntese-apparat

(Simadzu APS-800, Simadzu Seisakusho, Japan) ble det tilsatt 4,33 g B0C-Tyr(Bzl)-harpiks (Tyr-innhold 2,l8 mM) og etter svelling med diklormetan ble B0C-Phe-0H, BOC-Phe-OH, BOC-Phe-OH, B0C-Arg(N02) og Z-6-Ala-0H tilsatt i den angitte rekkefølge med DCC-metoden slik det er angitt av Merrifield (se J.A.C.S. 86, 304(1964))'Etter at reaksjonene var ferdige ble harpiksei vasket med diklormetan, DMF, etanol, iseddik og metanol og så tørket. Denne fremgangsmåte gir 6,55 g peptidharpiks..

b) Fremstilling av Z-6-Ala-Arg(N02)-Phe-Phe-Phe-Tyr(Bzl)-NH2

I 50 ml 17% ammoniakk-metanol ble det suspendert

6,04 g av den harpiks hiis fremstilling er besksrevet i avsnitt a) ovenfor, og suspensjonen ble ført ved romtemperatur i 48 timer. Harpiksen ble frafiltrert, og filtratet konsentrert til tørrhet

under redusert trykk. Residuumet ble tilsatt eter, og det resulterende pulver oppsamlet ved filtrering og tørking. Utbytte 2,43 g-

c) Fremstilling av B-Ala-Arg-Phe-Phe-Phe-Tyr-NH2

I 30 ml iseddik ble det oppløst 500 mg av det: råprodukt hvis fremstilling er angitt i avsnitt b) ovenfor, og katalytisk reduksjon ble utført med palladium som katalysator i 10 timer. Katalysatoren ble fsrafiltrert, og filtratet ble konsentrert til tørrhet under redusert trykk. Residuumet ble oppløst i 5ml vann og oppløsningen kjørt ned en kolonne (2,6 x 24»5cm) av karboksymetyl-cellulose. Gradient-eluering ble utført med 0,005M og 0,2M vandige oppløsninger av ammoniumacetat (800 ml av hver). Fraksjonene fra ll80 til 1545 ml ble slått sammen og lyofilisert. Utbytte 237 mg (64%), (<a>)<24>-33,19° (c = 0,46%, vann).

Elementæranalyse for C^H^ .O^N^.2C2H^02.3H20

Funnet: C 58,44 H 6,Sl N 12,52

Funnet: G 58,44 H 6,24 N 12,86

Aminosyre-analyse: Arg 1,00, Tyr 0l8l, Phe 3,20, p-Ala 0,9 (peptidinnhold 84,8%).

Eksempel 14»

Fremstilling av p-Ala-Arg-Leu-Phe-Phe-Tyr-Gly-NH2

a) Fremstilling av Z-p-Ala-Arg(Tos)_Leu-Phe-Phe-Tyr(Bzl)-Gly-harpiks. I reaksjonskaret i et fast-fase peptidsyntese-apparat (Simadzu APS-800) ble det tilført 4,0 g BOC-Gly-harpiks (inneholdende 1,7 mM ekvivalent Gly) som var svellet med diklormetan i 20 timer. Reaksjonskaret ble tilført BOC-Phe-OH, BOC-Phe-OH, BOC-Leu-OH, Aoc-Arg(Tos)-0H og Z-p-Ala-OH i den angitte rekke-følge med DCC som kondensasjonsmiddel og trifluoreddiksyre-diklormetan (1:1) som middel for fjerning av BOC. Etter at reaksjonen var ferdig var harpksen vasket med diklormetan, DMF, metanol, iseddik og metanol og tørker.' Utbytte 5>09 g* b) Fremstilling av Z-p-Ala-Arg(Tos)-Leu-Phe-Phe-Tyr(Bzl)-Gly-NH2.

I 50 ml 17% ammoniakk-metanol ble det suspendert

4,4 g av harpiksen hvis fremstillingsmåte er beskreet i avsnitt a) ovenfor, og etterat karet var lukket ble suspensjonen rørt ved romtemperatur i 48 timer.

Harpiksen ble frafiltrert og vasket med DMF. Filtratene ble slått sammen og konsentrert til tørrhet under redusert trykk. Den gjenværende olje ble tilsatt eter, og pulveret oppsamlet ved filtrering. Utbytte 950 mg.

c) Fremstilling av p-Ala-Arg-Leu-Phe-Phe-Tyr-Gly-NH2

500 mg av det råprodukt hvis fremstillinger angitt

under avsnitt b) ble tilsatt 0,5 ml anisol og blandingen ble så tilsatt 10 ml hydrogenfluorid. Blandingen ble rørt ved 0°C

i 60 min., hvoretter hydrogenfluoridet ble avdestillert under redusert trykk. Residuuåmet ble oppløst i 50 ml vann. Oppløs-ningen ble vasket to ganger med 20 ml eter, og så ført ned i en kolonne (1 x 10 cm) av Amberlite IRA~410(acetat-form) og så lyofilisert. Produktet ble oppløst i 20 ml vann og oppløsningen ført gjennom en kolonne (2,6 x 25 cm) av karboksymetyl-celllulose. Gradient-eluering ble utført ved å bruke 0,005M og 0,2M vandige oppløsninge5 av ammoniumacetat (800 ml av hver). Fraksjonene fra 1200 til 1530 ml ble slått sammen og lyofilisert. Fremgangsmåten ga I67 mg av et hvitt luftig produkt. (a)^-28,93° (c = 0,6%, vann).

Elementæranalyse for C^<Hg>1<0>gN11.2C2H^02.3»5H2°

Beregnet: C 54,64 H 7,26 N 14,60

Funnet: C 54,64 H 7,58 N 14,37

Aminosyre-analyse: Arg 1,06, Gly 1,00, Leu 1,11, Tyr 0,87,

Phe 2,09, p-Ala 1,14 (peptidinnhold 82,0%).

Eksempel 15»

Fremstilling av p-Ala-Arg-Ser-Phe-Phe-Tyr-Gly-NH2

a) Fremstilling av Z-p-Ala-Arg(Tos)-Ser(Bzl)-Phe-Phe-Tyr-(Bzl)-Gly-harpiks.

I reaksjonskaret i et fast-fase peptidsyntese-apparat frxodel APS-8OO Simadzu Seisakusho, Japan) ble det tilsatt 4,02 g BOC-Gly-harpiks (inneholdende 2,17 mmol Gly) og hvoretter B0C-Tyr-(Bzl)-0H, BOC-Phe-OH, BOC-Phe-OH, B0C-Ser(Bzl)-0H, Aoc-Arg(Tos)-0H og Z-p-Ala-OH ble tilsatt i den angitte rekkefølge ved Merrifields fremgangsmåte. Etter at reaksjonen var ferdig, ble harpiksen vasket med diklormetan, metanol, DMF, iseddik og metanol og så tørket. Utbytte 6,4 g. b) Fremstilling av Z-p-Ala-Arg(Tos)-Ser(Bzl)-Phe-Phe-Tyr(Bzl)-Gly-NH2.

I 50 ml 17% ammoniakk-metanol Me det suspendert

5,9 S av. den harpiks hvis fremstilling er angitt under avsnitt a) ovenfor, og suspensjonen ble rørt ved romtemperatur i 48 timer. Harpiksen ble frafiltrert og vasket med DMF. Vaskeoppløsningen ble slått sammen med filtratet, og det hele konsentrert til tørrhet under redusert trykk. Residuumet ble tilsatt eter, og det resul-

terende pulver oppsamlet ved filtrering. Utbytte 2,02 g.

c) Fremstilling av p-Ala-Arg-Ser-Phe-Phe-Tyr-Gly-NH2.

I 10 ml vannfritt hydrogenfluorid ble det oppløst

1,0 g av det råprodukt hvis fremstilling er beskrevet under avsnitt b) ovenfor, hvoretter man tilsatte 1 ml anisol og det hele ble rørt ved 0°C i 60 minutter. Hydrogenlluoridet ble avdestillert under redusert trykk og residuumet oppløst i 20 ml vann. Oppåøsningen ble vasket to ganger med 10 ml eter, ført gjennom en kolonne (1,0 x 15 cm) av Amberlite IRå-410 og lyofilisert. Produktet ble oppløst i 10 ml vann, og oppløsningen ført gjennom-en kolonne (2,5 x 25 cm) av karboksymetyl-cellulose. Gradient-eluering ble utført med 0,005M og .0,2 M vandige oppløs-ninger av ammoniumacetat (800 ml av hver). De fraksjoner man fikk fra 800 til 950 ml ble slått sammen og lyofilisert. Produktet ble ytterligere ført gjennom en kolonne (2 x 10 cm) av Amberlite XAD-2 (p91ystyren-harpiks fra Rohm & Haas Co.Ltd, USA)

(vann) og så lyofilisert. Fremgangsmåten gir 55 mS av den ovenfor angitte forbindelse som et hvitt luftig produkt. (a)<2>^ -30,11° (c = 0,47%, vann).

Aminosyre-analyse: Arg, 1,04, Ser 0,96, Gly 1,00-, Tyr 0,88,

Phe 2,10, p-Ala 0,98 (peptidinnhold 83,0%)..

Eksempel l6."

Fremstilling av p-Ala-Arg-Pro-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys-Ala-OH.

I 30 ml metanol ble det oppløst 1,16 g Z-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys(B0C)-Ala-0tBu og katalytisk reduksjon ble utført med palladium som katalysator i 4 timer. Katalysatoren ble frafiltrert og filtratet ble konsentrert til tørrhet under redusert trykk. Residuumet ble oppløst i 15 ml DMF. Denne oppløsning

ble tilsatt 492 mg Z-p-Ala-Arg(N02)-Pro-0H og 200 mg HONB, og under avkjøling tilsatte man 25O mg DCC. Blandingen ble så rørt i l8 timer.

Uoppløselige faste stoffer ble frafiltrert, og di-metylformamidet ble avdestillert under redusert trykk. Reisduumet ble tilsatt etylacetat, og det resulterende pulver tørket og oppløst i 10 ml trifluoreddiksyre. Oppløsningen ble hensatt i 40 min. Trifluoreddiksyren ble avdestillert under redusert trykk, og residuumet oppløst i 3° ml iseddik. Katalytisk reduksjon ble utført med palladium som katalysator i 16 timer.

Katalysatoren ble frafiltrert, og filtratet konsentrert til tørrhet under redusert trykk og så oppløst i 10 ml vann. Etter ioneutbytting med Amberlite IRå-4-10 ble små mengder uoppløse-lige faste stoffer frafiltrert, og filtratet kjørt ned gjennom en kolonne på 2,2 x 30 cm av karboksymetyl-cellulose. Gradient-eluering ble utført med 0,005M og 0,2M vandige oppløshirjpr av ammoniumacetat (800 ml av hver). De fraksjoner man fikk fra 820 til ll80 mg ble slått sammen og lyofilisert. Fremgangsmåten ga 67O mg av et hvitt luftig produkt.

Aminosyre-analyse: Lys 1,02, Arg 0,98, Thr 0,96, Pro 2,04,

Ala 1,00, Tyr 0,87, Phe 2,02, B-Ala 1,05 (peptidinnhold 74%). Eksempel 17.

Fremstilling av B-Ala-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Leu-OH.

a) Fremstilling av Z-Phe-Phe-Tyr-OEt.

I 30 ml etanol ble det oppløst 3,43 g Z-Phe-Tyr-0Et

og katalytisk reduksjon ble utført med palladium som katalysator i 2 timer. Katalysatoren ble frafiltrert, og oppløsningsmidlet ble fordampet ved destillasjon under redusert trykk. Residuumet ble oppløst i 15 ml DMF og man tilsatte 2,77 g Z-Phe-0Su. Blandingen ble så rørt i 10 timer. Reaksjonsblandingen ble tilsatt 80 ml vann og de resulterende krystallene ble oppsamlet ved filtrering og omkrystallisert fra etanol-etylacetat-etyleter. Fremgangsmåten ga 3,72 g (83,4%) av nåler som smeltet ved l85-l86°C.

(a)2^ _i8,l° (c = 1,09%, DMF).

Elementæranalyse for CoryHooO<ryNo>

Beregnet: C 69,68 H 6,16 N 6,59

Funnet: C 69,64 H 6,14 N 6,54

b) Fremstilling av Z-8-Ala-Arg(N02 )-Gly-Phe-Phe-Tyr-0E.t

I 50 ml etanol ble det suspendert 2,0 g Z-Phe-Phe-Tyr-OEt og katalytisk reduksjon ble utført med palladium som katalysator 1,5 time. Katalysatoren ble fjernet ved filtrering, og oppløsningsmidlet destillert urder redusert trykk. Residuumet ble oppløst i 20 ml DMF. Under avkjøling med is tilsatte man 1,56 g Z-B-Ala-Arg(N02)-Gly-0H, 0,7 g HONB og 0,8 g DCC og blandingen ble rørt i 12 timer.

Det dannede urea-derivat ble frafiltrert, og nevnte DMF ble avdestillert under redusert trykk. Residuumet ble tilsatt 60 ml vann, og det resulterede pulver ble oppsamlet ved filtrering, tørket og gjenutfelt fra DMF-etylacetat. Utbytte 2,58 g (82%), smp. 83-85°C, (a)25 -10,0° (c = 1,1%, DMF).

Elementæranalyse for C^yH^gO-^N-^. 2H20

Beregnet: C 57,43 H 6,23 N 13,97

Funnet: C 57,4<1>H 6,05 N 14,49

c) Fremstilling av Z-B-Ala-Arg(N02)-Gly-Phe-Phe-Tyr-OH.

I 30 ml aceton ble det suspendert 2,00 g Z-B-Ala-Arg(N02)-Gly-Phe-Phe-Tyr-OEt og under avkjøling med is tilsatte man 6,3 ml IN vandig natriumhydroksyd. Ved romtemperatur ble så blandingen rørt i 1 time. Etter tilsetning av 3 ml IN saltsyre ble a.cetonen avdestillert under redusert trykk.. Små mengder uoppløselige faste stoffer ble frafiltrert, og 3>8 ml IN saltsyre ble igjen tilsatt. Det resulterende bunnfall ble oppsamlet ved filtrering, vasket med kaldt vann og tørket. Utbytte 1,96 g (98%), smp. 7<0->73°C, (a)26 -8,7°(C = 0,97%, DMF).

Elementæranalyse for C^gH^O-j^N-^.<H>gO

Beregnet: C 57,77 H 5,90 N 14,64

Funnet: C 58,13. H 5,89 N 14,51

d) Fremstilling av Z-B-Ala-Arg(N02)-Gly-Phe-Phe-Tyr-Leu-OBzl.

I 5 ml DMF ble det oppløst 275 mg H-Leu-OBzl-p-toluensulfonat og oppløsningen ble nøytralisert med 0,9 ml 10% N-etylmorfolin-DMF. Under avkjøling ved -10°C .tilsatte man 67O mg Z-B-Ala-Arg(N02)-Gly-Phe-Phe-Tyr-0H, 251 mg HONB og 289 mg DCG. Blandingen ble rørt i 12 timer og det dannede DC-urea ble frafiltrert. Dimetylformamid ble avdesillert under redusert trykk og 30 ml vann ble tilsatt residuumet. Det resulterende bunnfall ble oppsamlet ved filtrering, vasket med varm etanol og tørket. Utbytte 703 mg (87,9%), smp. 178-l8l°G-, (a)<23>-15,0° (c = 1,02%, DMF).

Elementæranalyse for C^<Hy20->|^N<->Q

Beregnet: C 61,98 H 6,35 N 13,49

Funnet: C 6l,88 H 6,78 N 13,15

e) Fremstilling av B-Ala-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Leu-OH.

I 30 ml eddiksyre ble det oppløst 500 mg Z-B-Ala-Arg(N02)-Gly-Phe-Phe-Tyr-Leu-OBzl, og katalytisk reduksjonble utført med palladium som katalysator i 8 timer. Katalysatoren ble frafiltrert, og oppløsningsmidlet ble fordampet ved destillasjon under redusert trykk. Residuumet ble oppløst i 5 ml vann,

og oppløsningen kjørt gjennom en kolonne på 2,6 x 18 cm av karboksymetylcellulose. Eluering ble utført ved en lineær gradientmetode, idet man brukte 0,005M vandige ammoniumacetat (700 ml).og 0,2M vandig ammoniumacetat (700 ml), hvoretter den ønskede forbindelse fåes i fraksjoner fra 37° til " J20 ml. Disse fraksjoner ble slått sammen og lyofilisert. Utbytte 277#g«

(64,2%), (a)23 -32,5° (c = 0,51%, vann).

Elementæranalyse for C^H^O<gN->^.CgH^O^HgO

Beregnet: C 55,97 H 7,15 N 14,19

Funnet: C 55,80 H 7,20 N 14,17

Aminosyre-analyse: Arg 1,00, Gly 1,04, l<eu 1>08, Phe 2,16, Tyr 0,88, p-Ala 1,04 (peptidinnhold 85,9%).

Eksempel 18.

Fremstilling av p-Ala-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Ala-NH2

Fremstilling av fremgangsmåtene som er beskrevet i eksemplene 17 d) og e) ble gjentatt, bortsett f ra at H-Ala-NH2. hydroklorid ble brukt i stedet for H-Leu-OBzl-p-toluensulfonat, hvorved man fikk den p-Ala-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Ala-NH2.diacetat i et utbytte på 216 mg.

Aminosyre-analyse: Arg 1,01, Gly 1,00, Ala 1,02, Phe-2,00,

Tyr 0,89, p-Ala 1,12 (peptidinnhold 82,4%).

Eksempel IQ.

Fremstilling av p-Ala-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-OH.

a) Fremstilling av Z-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-OtBu

I 30 ml metanol ble det oppløst 1,80 g Z-Thr-Pro-

OtBu og katalytisk reduksjon ble utført med palladium som katalysator i 5 timer. Katalysatoren ble frafiltrert, og oppløsnings-midlet avdestillert under redusert trykk. Residuumet ble oppløst i 20 ml DMF og etter at oppløsningen var avkjølt til -10°C tilsatte man 2,70 g Z-Phe-Phe-Tyr-OH, 1,59 g HONB og 1,37 g -DCG. Blandingen ble så røtt i 18 timer. Det dannede urea-derivåtet ble frafiltrert, og 100 ml vann tilsatt. Den resulterede bunnfall ble oppsamlet ved filtrering, tørket og oppløst i 100 ml etylacetat. Oppløsningen ble vasket to ganger med 50 ml vann og så tørket over vannfritt natriumsulfat. Oppløsningsmidlet ble så avdestillert, og etylacetat ble tilsatt rediduumet. Det resulterende pulver ble oppsamlet ved filtrering og tørket. Utbytte 2,51 g (89,8%), smp. 137-<1>39°C, (a){p -44,1° (c = 1,08%, DMF).

Elementæranalyse for C^gH^yO-^N^ .HgO

Beregnet: C 65,36 H 6,74 N 7,94

Funnet: C 65,49 H 6,82 N 7,91 b) Fremstilling av Z-B-Ala-Arg(N02)-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-OtBu. I 20 ml metanol ble det oppløst 1,50 g Z-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-OtBu og katalytisk reduksjon ble utført med palladium som katalysator i en strøm av hydrogen i 4 timer. Katalysatoren ble frafiltrert, og oppløsningsmidlet fordampet under redusert trykk.

Residuumet ble oppløst i 10 ml DMF og under avkjøling med is tilsatte man 0,87 g Z-B-Ala-Arg(N02)-Gly-0H, 0,47 g HONB og 0,54 g DCC. Blandingen ble så rørt i 36 timer. Den dannede DC-urea ble frafiltrert, og 50 ml vann ble tilsatt filtratet, og 'man fikk utskilt en gel. Dette ble oppsamlet ved filtrering, tørket og gjenutfelt fra DMF-etylacetat. Bunnfallet ble oppsamlet ved filtrering og 9Pa nY utfelt fra etanol. Utbytte 1,40 g, (67,4%), smp. 153-156°C, (a)<25>-32,3° (c = 0,97<%,>DMF).

Elementæranalyse for £50^76^15^12

Beregnet: C 58,50 H 6,57 N 13,88

Funnet: C 58,24 H 6,54- N 13,87

c) Fremstilling av B-Ala-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-OH

900 mg Z-B-Ala-Arg(N02)-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-OtBu ble tilsatt 0,9 ml anisol, fulgt av 10 ml vannfri hydrogenfluorid. Blandingen ble rørt ved -4°C-i 30 minutter. Hydrogenfluoridet ble avdestillert under redusert trykk, og 30 ml vann ble tilsatt residuumet.

Oppløsningen ble ekstrahert med 30 ml etyleter, og det vandige lag ført gjennom en kolonne på 1,0 x 10,0 cm av Amberlite IRA-410 (acetat-form) som ble vasket med vann. De vandige vaskeoppløsninger ble slått sammen med væsken fra kolonnen og det hele lyofilisert. Produktet ble oppløst i 10 ml vann og oppløsningen ført gjennom en kolonne på 2,2 x 21 cm av karboksymetylcellulose. Gradienteluering ble utført med 0,005M vandig ammoniumacetat (700 ml) og 0,3M vandig ammoniumacetat (700 ml), og man fikk den forønskede forbindelse i fraksjoner fra 235 ml til 385 ml. Disse fraksjoner ble slått sammen og lyofilisert. Utbytte 476mg (57,0%) (a)<25>-38,5° (c = 0,25%, vann).

Elementæranalyse for ^^ j^^^ lJ^ ll^ Z^^ Z^^ Z^

Beregnet: G 53,10 H 7,00 N 13,91

Funnet:" C 53,27 H 7,04 N 13,82

Aminosyre-analyse: Arg 1,05, Thr 1,00, Pro 1,02. Gly 0,95, Tyr 0,95, Phe 2,02, p-Ala 0,93 (eptidinnhold 85,5%).

Eksemp el 20.

Fremstilling av £-Acap-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-OH.

a) Fremstilling av Z-6-Acap-Arg(N02)-Gly-OEt.

2,41 g Z-Arg(N02)-Gly-0Et Me tilsatt 12 ml 25% HBrp

eddiksyre, og blandingen ble ristet ved romtemperatur i 40 min. Den ble så tilsatt etyleter og det resulterende bunnfall ble oppsamlet ved filtrering og tørket over natriumhydroksyd.

Uavhengig av dette ble 1,33 S Z-6-åcap-0H og 0,99 g HONB oppløst i 5 ml tetrahydrofuran og under avkjøling med is tilsatte man 1,14 g DCG. Blandingen ble rørt i 4 timer og den dannede dicykloheksylurea b]e frafiltrert. Den ovennevnte amino-komponent ble oppløst i 10 ml DMF og etter at den var nøytrali-sert med trietylamin ble den ovenfor nevnte aktive esteroppløs-ningen tilsatt. Blandingen ble så rørt over natten. Oppløsnings-midlet ble avdestillert under redusert trykk, og residuumet oppløst i 50 ml etylacetat. Oppløsningen ble vasket med vann og så med en mettet vandig oppløsning av natriumhydrogenkarbonat (50 ml x 2). Den ble så' vasket med vann og tørket over vannfritt natriumsulfat. Oppløsningsmidlet ble avdestillert under redusert trykk og petroleumséensin ble tilsatt residuumet. De resulterende krystaller ble omkrystallisert fra vann-etanol-etylacetat. Utbytte j2,l g (76%), smp. 85-87°C, (a)<24>-11,9° (c = 1,0%, DMF).

Elementæranalyse for Cg^H^yOgN

Beregnet: C 52,26 H 6,76 N 17,78

Funnet: C 52,43 H 6,64 N 17,76

b) Fremstilling av Z-£-Acap-Arg(N02)-Gly-0H

I 10 ml aceton ble det oppløst 1,8 g Z-£-Acap-Arg-(N02)-Gly-0Et, og etter avkjøling med is tilsatte man 2,9 ml

2N natriumhydroksyd. Ved romtemperatur ble blandingen så rørt i 2 timer. Den ble tilsatt 2,5 ml IN saltsyre og acetonen ble

avdestillert. Residuumet ble tilsatt 10 ml vann og etter at uoppløselige faste stoffer var frafiltrert, ble oppløsringen gjort sur med IN saltsyre. De resulterende krystaller ble oppsamlet ved filtrering. Utbytte 1,59 g (93%)>smp. 97,5-

99°C,(a)2<4>-10,7° (c = 1,0%, DMF).

Elementæranalyse for C22<H>^<0g>N7'H2°

Beregnet: C 48,79 H 6,52 N 18,10

Funnet: C 48,50 H 6,28 N 18,23

c) Fremstilling av £-Acap-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-OH.

I fremgangsmåten fra eksempel 19 b) ble Z-B-Ala-Arg-(N02)-Gly-0H erstattet med Z-£-Acap-Arg(N02)-Gly-0H, og fremgangsmåten fra eksempel 19 b) og c) ble gjentatt, og man fikk 428 mg av den ovenfor angitte forbindelse, (oc)^ -37 > 9° (c = 0,25%, vann). Aminosyre-analyse: Arg 1,02, Thr 1,02, Pro 1,00, Gly 1,01,

Phe 2,04, Tyr 0,92, £-Acap (ikke bestemt) (peptidinnhold 84,9%). Eksempel 21.

Fremstilling av Lys-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-OH.

a) Fremstilling av di-Z-Lys-Arg(N02)-Gly-0Et

Ved å bruke 2,07 g di-Z-Lys-0H fikk man fremstilt

den ovenfor angitte forbindelse som en gel på samme måte som i eksempel 20 a). Gelen ble gjeniifelt fra vann-etanol-etyl-acetat. Utbytte 2,57 g (73%), smp. l6l-l62°C, (a)^ -11,9°

(c = 1,0%, DMF).

Elementæranalyse for c^2<H>4<4>°lo<N>8

Beregnet: . G 54,85 H 6,33 N 15,99

Funnet: G 54,45 H 6,05 N 15,99

b) Fremstilling av di-Z-Lys-Arg(N02)-Gly-0H

I 10 ml aceton ble det oppløst 2,0 g di-Z-Lys-årg-(N02 )-Gly-0Et, og under avkjøling med is ble 2,1 ml 2N natrium-hydoksyd tilsatt. Blandingen ble så rørt ved romtemperatur i 2 timer. Etter tilsetning av 1,4 ml IN saltsyre, ble acetonen avdestillert og man tilsatte 10 ml vann.

Uoppløselige faste stoffer ble frafiltrert, ogfiltra-tet ble gjort surt med IN saltsyre. Den resulterende gel ble oppsamlet ved filtrering. Utbytte 1,78 g (93%), smp. 131-132,5°C (a)<2>^ -10,5° (c = 1,0%, DMF). Elementæranalyse for C30H4o°loN8* 3/2^2°

Beregnet: C 51,49 H 6,20 N 16,02

Funnet: C 51,43 H 5,92 N 16,23

c) Fremstilling av Lys-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-OH

Fremgangsmåten fra eksempel 19 b) ble gjentatt, bortsett fra at di-Z-Lys-Arg(N02)-Gly-0H ble brukt i stedet for Z-B-Ala-Arg(N02)-Gly-0H og man fikk fremstilt 452 mg av den ovenfor angitte forbindelse. (a)<28>-34,8° (c = 0,4%, vann).

Aminosyre-analyse: Lys 1,08, Arg 1,01, Thr 0,92, Pro 1,00,

Gly 1,00, Phe 2,08, Tyr 0,89•(peptidinnhold 85,2%).

Eksempel 22.

Fremstilling av B-Ala-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys-Ala-OH.

a) Fremstilling av Z-Lys(BOC)-Ala-0tBu

I 300 ml metanol ble det oppløst 14 g Z-Ala-OtBu

og katalytisk reduksjon ble utført med palladium i 2 timer. Katalysatoren ble frafiltrert, og metanolen avdestillert.

Residuumet ble oppløst i 50 ml tetrahydrofuran. Uavhengig av dette ble 28,1 g Z-Lys(BOG)-OH-dicykloheksylamin-

salt suspendert i 300 ml etylacetat og vasket tre ganger, med 200 ml 0,5N svovelsyre. Etter vasking med vann ble oppløsingen tørket over vannfritt natriumsulfat.

Etylacetat ble delvis destillert av til et volum

på I5O ml. Residuumet ble tilsatt ovennevnte tetrahydrofuran-oppløsning, fulgt av 10 g HONB. Under avkjøling med is ble 11,3 g DGC tilsatt, og blandingen rørt i 16 timer. Den dannede DG-urea ble frafiltrert og filtratet kondensert til tørrhet. Residuumet ble oppløst i 5OO ml etylacetat og vasket med 0,5N svovelsyre og 4% vandig natriumhydrogenkarbonat. Etter vasking med vann ble etylacetatlaget tørket over vannfritt natriumsulfat. Oppløsnings-midlet ble fordampet til tørrhet under redusert trykk, og petroleums benzin ble tilsatt og man fikk utfelt.krystaller. Disse krystaller ble oppsamlet ved filtrering og omkrystallisert fra etyl-acetat-petroleumsbensin. Utbytte 21,9 g (87%), smp. 55-57°C,

(a)f-30,17° (c = 1,16%, metanol).

Elementæranalyse for C26^41^7^3

Beregnet: C 6l,52 H 8,14 N 8,28

Funnet: C 6l,6l H 8,10 N 8,l8

b) Fremstilling av Z-Pro-Lys(B0C9-Ala-0tBu

I 40 ml metanol ble det oppløst 2,5 g Z-Lys-(BOC)-Ala-OtBu og katalytisk reduksjon ble utført med palladium som katalysator i 2 timer. Katalysatoren ble frafiltrert, og filtratet konsentrert til tørrhet under redusert trykk. Residuumet ble oppløst i 20 ml etylacetat. Oppløsningen ble tilsatt 2,456Z-Pro-ONB og blandingen rørt ved romtemperatur i 18 timer. Opp-løsningen ble tilsatt 200 ml etylacetat og blandingen ble så vasket med 0,5N svovelsyre og 4% vandig natriumhydrogenkarbonat. Den ble så vasket tre ganger med vann, tørket over vannfritt natriumsulfat og konsentrert til tørrhet under redusert trykk. Residuumet ble tilsatt petroleumsbensin og de resulterende krystaller oppsamlet ved filtreing og omkrystallisert fra etylacetat-petroleumsbensin. Utbytte 2,53 g (85%), smp. 127-129°G,

(a)p -64,52° (c = 1,04%, metanol).

Elementæranalyse for C^H^g<O>g<N>^

Beregnet: C 6l,57 H 8,00 N 9,27

Funnet: C 6l",8l H 8,31 N 9,37

c) Fremstilling av Z-Thr-Pro-Lys(BOC)-Ala-0tBu.

I 40 ml metanol ble det oppløst 2,12 g Z-Pro-Lys-(BOC)-Ala-0tBu og katalytisk reduksjon ble utført med palladium

i 3 timer. Katalysatoren ble frafiltrert, og oppløsningsmidlet avdestillert under redusert trykk. Residuumet ble oppløst i 20 ml dioksan. Uavhengig av dette ble 977 mg Z-Thr-OH og 806 mg HONB oppløst i 10 ml etylacetat-dioksan (1:1) og under avkjøling med is ble 800 mg DGC tilsatt. Blandingen ble rørt i 6 timer, og den dannede DC-urea ble frafiltrert, hvoretter filtratet ble tilsatt ovennevnte dioksan-oppløsning. Blandingen ble rørt i 16 timer. Oppløsningsmidlet ble avdestillert under redusert trykk, og residuumet oppløst i 150 ml etylacetat. Oppløsningen ble vasket med 0,5N svovelsyre og 4% vandig natriumhydrogenkarbonat. Etter vasking med vann. ble den tørket under vannfritt natriumsulf at, hvoretter oppløsningsmidlet ble avdestillert. Residuåmet ble tilsatt petroleumsbensin og det resulterede pulver ble oppsamlet. Utbytte 2,3 g (93%),<s>m<p.>64-670C, (a)jp -75,58° (c = 0,995, metanol).

Elementæranalyse for CocHC[-0t Nr

35 55 lo 5

Beregnet: C 59,55 H 7,85 N 9,92

Funnet: C 59,25 H 7,99 N 9,65

d) Fremstilling av Z-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys(BOG)-Ala-0tBu.

I 70..ml metanol ble det oppløst 1,41 g Z-Thr-Pro-Lys(B0C)-Ala-OtBu og katalytisk reduksjon ble utført med palladium som katalysator i 2 timer. Katalysatoren ble frafiltrert, og oppløsningsmidlet avdestillert under redusert trykk. Residuumet ble oppløst i 10 ml DMF, hvoretter man tilsatte 1,1 g Z-Phe-Phe-Tyr-OH og 720mg HONB. Under avkjøling med is ble 6l8 mg

DCC tilsatt, og blandingen rørt i 20 timer. Oppløsningsmidlet ble avdestillert under redusert trykk, og residujmet ble behandlet med etylacetat-eter (1:1). Det resulterende pulver ble oppsamlet ved filtrering og utkrystallisert fra etanol. Utbytte 2,1 g (100%), sm. I6O-I63,5°C, (cOjp -64,73° (c = 1,05%, metanol).

Elementæranalyse for Cg2H8o^l6<N>8

Beregnet: C 62,09 H 7,23 N 9,34

Funnet: C 62,02 H 7,14 N 9,64 e) Fremstilling av Z-Arg(N02)-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys(BOG )-Ala-OtBu.

I 30. ml. metanol ble det oppløst 2,32 g Z-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys(BOC)~Ala-0tBu, og katalytisk reduksjon ble utført med palladium i 3 timer. Katalysatoren ble frafiltrert, og metanolen avdestillert. Residuumet ble oppløst i 5 ml DMF. Denne oppløsning ble tilsatt 1,26 g Z-Arg(N02)-Gly-0NB og blandingen rørt ved romtemperatur i 20 timer. Nevnte DMF ble avdestillert under redusert trykk, og 50 ml vann ble tilsatt residuumet.

Det resulterende pulver ble oppsamlet ved filtrering og gjenutfelt' W ganger-fra DMF-vann. Utbytte 2,5 g (88%), smp. 13'8-141°C (dekomponering), (a)^ -32,4° (c=0,99%, DMF).

Elementæranalyse for C70HCj6°l8<N>14

Beregnet: G 59,14 H 6 ,8l N 1.3,80

Funnet: G 58,82 H 6,80 N 13,66

f) Fremstilling av B-Ala-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thro-Pro-Lys-Ala-OH. I 30 ml av en blanding av metanol og iseddik (2:1)

ble det oppløst 7IO mg Z-Arg(N02)-Gly^Phe-Phe-Tyr-ThrB-Pro-Lys(B0C)-Ala-0tBu og katalytisk reduksjon ble utført med palladium i 8 timer. Katalysatoren ble frafiltrert, og filtratet konsentrert til tørrhet under redusert trykk. Residuumet ble oppløst

i 10 ml vann, og oppløsningen ført gjennom en kolonne på 130 ml karboksymetyl-cellulose. Gradienteluering ble utført med 0,005M vandig ammoniumacetat og 0,2M vandig ammoniumacetat (800 ml av hver). Fraksjonene fra 913 til II90 ml ble slått sammen cg lyofilisert, og man fikk 35° mg av et hvitt luftig produkt.

Dette pulver ble oppløst i 8 ml DMF og man tilsatte 41 mg p-toluensulfonsyre-monohydrat. Deretter tilsatte .man

82 mg B0C-6-Ala-0NB og blandingen ble røtt i 16 timer. Dimetylformamid ble avdestillert og 3 ml trifluoreddiksyre ble tilsatt residuumet. Blandingen ble rystet i 30 min. og trifluoreddiksyren ble avdestillert. Residuumet ble oppløst i 10 ml vann og ført gjennom en kolonne på 1,0 x 10 cm av Amberlite IRA-410 (acetat-form), og forbindelsen ble omdannet tilacetatet. Eluatet ble lyofilisert og påsatt en kolonne på 2,2.x 17 cm av karboksymetyl-cellulose. Gradient-eluering ble utført med 0,005M vandig ammoniumacetat. (5OO ml) og 0,2M vandig ammonimacetat (500 ml). Fraksjonene fra 4-30 til 500 ml ble slått sammen og lyofilisert

og man fikk 25O mg av et hvitt luftig produkt. (a^^ -58j8°

( c = 0,5%, vann)..

Aminosyre-Analyse: Lys 1,00, Arg 1,04, Thr 1,00, Pro 1,04,

Gly 1,04, Ala 1,04, Tyr 0,89, Phe 2,00, p-Ala 0,93 (peptidinnhold 72%).

Eksempel 23.

Fremstilling av Gly-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys-Ala-OH.

Fremganpmåten fra eksempel 22 f) ble gjentatt, bortsett fra at nevnte BOC-p-Ala-ONB ble erstattet med BOG-G^y-ONB og man fikk 214 mg av den ovenfor angitte forbindelse som

et hvitt luftig produkt. (a)Jp -59>2° (c = 0,4%, vann). Aminosyre-analyse: Lys 1102, Arg 1,00, Thr 1,00, Pro 1,01,

Gly 2,00, Ala 1,03, Tyr 0,87, Phe 2,04 (peptidinnhold 78%).

Eksempel 24.

Fremstilling av Leu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Gly-NH2

a) Fremstilling av Z-Leu-Arg(tos)-Gly-Phe-Phe-Tyr(Bzl)-Gly-harpiks.

I reaksjonskaret i et fast-fase peptidsyntese-apparat (Simadzu APS-800 ) ble det tilført 4,04 g BOC-Gly-harpiks (inneholdende 1,75 mmol Gly), som var svellet med diklormetan i 20 timer. Deretter ved hjelp av Merrifields metode tilførte man

BOC-Tyr(Bzl)-OH, BOC-Phe-OH, BOC-Phe-OH, BOC-Gly-OH, Aoc-årg-(Tos)-OH og Z-Leu-OH i den rekle følge som er angitt her. DCC

ble brukt som kondensasjonsmiddel, og hver av aminosyrene ble brukt i 4 ekvivalenter, og fjerningen av BOC-gruppene ble utført med trifluoreddiksyre-diklormetan (1:1). Harpiksen ble tatt ut fra reaksjonskaret og vasket med diklormetan, DMF, metanol og eddiksyre og deretter tørket. Utbytte var 5>07 S av den ovenfor angitte harpiks.

b) Fremstilling av Z-Leu-Arg(Tos)-Gly-Phe-Phe-Tyr(Bzl)-Gly-NH2.

I 50 ml av en 17% ammoniakk-metanol oppløsning ble

det suspendert 4)41 g av den harpiks hvis fremstilling er beskrevet under avsnitt a) ovenfor, og under lukkede betingelser ble suspensjonen rørt ved romtemperatur i 48 timer. Harpiksen ble frafiltrert og vasket med DMF. -Filtratet bg vaskeoppløsningen ble slått sammen, og oppløsningsmidlet avdestillert under redusert trykk. Det oljeaktige residuum ble tilsatt etyleter, og det resulterende pulver ble oppsamlet ved filtrering og vasket med eter. Utbytte 950 mg.

c) Fremstilling av Leu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Gly-NH^.

I 10 ml vannfri hydrogenfluorid ble det oppløst

500 mg av det peptidamid hvis fremstilling er beskrevet under avsnitt b) ovenfor, samt 0,5 ml anisol og oppløsningen ble rørt ved 0°C i 1 time. Hydrogenfluoridet ble avdestillert og ved residuumet oppløst i 50 ml vann. Oppløsningen ble ekstrahert to ganger med 20 ml etyleter og det vandige laget ble ført gjennom en kolonne på 2 x 10 cm Amberlite IRå-410 (acetat-form) og deretter lyofilisert. Produktet ble så ført gjennom en kolonne på 2,3 x 17 cm karboksymetyl-cellulose og gradient-eluering ble utført med 0,005M vandig ammoniumacetat (400 ml) og 0,2 M vandig ammoniumacetat (400 ml). De fraksjoner man fikk fra 490 til 550 ml ble slått sammen og lyofilisert. Fremgangsmåten gir 167 mg av den ovenfor angitte forbindelse som et hvitt luftig produkt. Aminosyre-analyse: Arg 1,02, Gly 2,00, Leu 1,03, Tvr 0,89,

Phe 2,08 (peptidinnhold 84%).

Eksempel 25.

Fremstilling av B-Ala-Arg-Gly-Phe.^Phe-Tyr-Ala-Gly-NH2

a) Fremstilling av Z-B-Ala-Arg(Tos )-Gly-Phe-Phe-Tyr(Bzl)-Ala-Gly-harpiks.

I reaksjonskaret i et Simadzu APS-800 syntese-apparat ble det tilført 3,03 g BOC-Gly-harpiks (Gly-innhfcld 1,32 mM), som var svellet med diklormetan. Deretter ble BOC-Ala-OH, BOC-Tyr(Bzl)-OH, BOC-Phe-OH, BOC-Phe-OH, BOC-Gly-OH, Aoc-Arg(Tos)-0H og Z-B-Ala-OH tilført i den angitte rekkefølge ved den såkalte symmetriske anhydridprosessen (se Hoppe-Seyler's Z.Physiol.Chem. 353, 1973 (1972)). Fjerningen av BOC i hvert trinn ble utført ved hjelp av $ 0% trifluoreddiksyre-diklormetan.

Videre i hvert trinn ble uomsatte aminogrupper - acetylert med eddiksyre-anhydrid. Etter at alle aminosyrene var tilsatt, ble harpiksen vasket med etanol, DMF, diklormetan, eddiksyre og metanol,og deretter tørket under redusert trykk. Fremgangsmåten gir 3>70 g av pepetidharpiksen. b) Fremstilling av Z-B-Ala-Arg(Tos)-Gly-Phe-Phe-Tyr(Bzl)-åla-Gly-NH2j.

I 50 ml .17% ammoniakk-metanol ble det suspendert 3,28 g av peptidharpiksen hvis fremstiling er beskrevet - under avsnitt a) ovenfor, og under lukkede betingelser ble suspensjonen rørt ved romtemperatur i 40 timer. Harpiksen ble så frafiltrert og vasket med 50 ml QMF. Filtratet ig vaskeoppløsningen ble slått sammen o-g konsentrert til tørrhet under redusert trykk. Residuumet ble tilsatt eter, og det resulterende pulver oppsamlet ved filtrering og tørket. Fremgangsmåten gir 433 mg av et urent beskyttet peptid-amid.

c) Fremstilling av B-Ala-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Ala-Gly-NH2.

- I en blanding av 8 ml vannfri hydrogenfluorid og

0,3 ml anisol ble det oppløst 31° mg av det beskyttede peptid-amid hvis fremstilling er beskrevet under avsnitt- b) ovenfor,

og oppløsningen ble rørt ved 0°C -i 1 time.

Hydrogenfluoridet ble avdestillert under redusert trykk og residuumet oppløst i 50 ml vann. Oppløsningen ble ekstrahert to ganger med 10 ml eter. Det vandige lag ble ført gjennom en klolonne på 1 x 10 cm Amberlite IRA-410 (acetat-form) som var vasket med vann. Fraksjonene samt vaskeoppløsningen ble slått sammen og det hele. ble lyofilisert. Produktet ble oppløst i 10 ml vann og oppløsningen ført gjennom en kolonne på 2,3 x 17.cm karboksymetylcellulose. Gradient-eluering ble utført med 0,005M og 0,2M vandige oppløsninger av ammoniumacetat (400 ml av hver). Fraksjonene fra 495 til 54O ml ble slått sammen og lyofilisert, hvorved man fikk 134 mg av det ovenfor angitte produkt.

(a)jp -19,62° (c = 0,53%, vann).

Aminosyre-analyse: Arg 1,05, G1Y1»95»Ala 1,00, Tyr 0,86,

Phe lå98, p-Ala 1,02 (peptidinnhold 84%).

Elementæranalyse for C^H^gOgN-^. 2C2H^02.4H20

Beregnet: C 52,31 H 6,91 N 15,57

Funnet: C 52,40 H 6,55 N 15,65

Eksempel 26.

Fremstilling av a ,Y-Dab-ArgrGly-Phe-Phe-Tyr-Ala-Gly-NH2

Fremgangsmåten fra eksempel 25 gjentas, brtsett

fra at man som den avsluttende aminosyre bruker di-Z-p ,*T"-Abu-OH i stedet for Z-p-Ala-OH. Fremgangsmåten ga den ovenfor angitte forbindelse som et lhvitt luftig produkt. (a)<21>-20,3° (c = 0,2%, vann).

Aminosyre-analyse: Arg 1,00, Gly 1,89, Ala 1,02, Tyr 0,88, Phe 2,00,. et,Y-Abu 1,04 (peptidinnhold 8l,5%).

Eksempel 27.

Fremstilling av Gly-Arg-Gly-Phe-Phe-NH2

a) Fremstilling av Z-Gly-Arg(N02)-Gly-Phe-Phe-NH2.

0,80 av Z-Arg(N02)-Gly-Phe-Phe-NH2 ble tilsatt 8 ml

25% HBr-eddiksyre og blandingen ble rystet ved romtemperatur i 45 min. Reaksjonsvlandingen ble tilsatt 100 ml eter, og det resulterende pulver oppsamlet ved filtreing og tørket over natriumhydroksyd i et tørkekammer under redusert trykk i 2 døgn. Det tørkede produkt ble oppløst i 10 ml DMF, og oppløsningen nøytralisert med trietylamin. Oppløsningen ble så tilsatt 0,43 S Z-Gly-ONB, og blandingen rørt i 10 timer.

Oppløsningen ble så tilsatt 7 ml vann, og man fikk utskilt en olje. Etter at den overliggende væske var fjernet ved dekantering, ble 50 ml vann tilsatt. Det resulternde pulver ble oppamlet ved filtrering og tørket. Dette produkt ble renset ved gjenutfelling med DMF-etylacetat. Utbytte 0,66 g (77%),, smp. 119-122°C, (a)<21>-24,6° (c = 1,01%, DMF).

Analyse for C 3^^ fi0 • H20

Beregnet: C 55,51 H 5,95 N 17,99

Funnet: C 55,95 H 5,90 N 17,73

b) Fremstilling av Gly-Arg-Gly-Phe-Phe-NH2

I 3° ml eddiksyre ble oppløst 500 mg Z-Gly-Arg(N02)-Gly-Phe-Phe-NH2, og katalytisk réduksjon ble utført

i en hydrogenstrøm med palladium som katalysator i 7 timer. Katalysatoren ble frafiltrert, og eddiksyren avdestillert under redusert trykk. Residuumet ble oppløst i 10 ml vann, og oppløs-ningen ble ført gjennom en kolonne på 1,8 x 10 cm karboksy-metyl-cellulose.

Eluering ble utført ved en lineær gradient-metode idet man brukte 0,1M vandig ammoniumacetat (700 ml) og IM vandig ammoniumacetat (700 ml). Fraksjonene fra. 410 til 515 ml ble slått sammen og lyofilisert, og man fikk 307 mS (65%) av et hvitt luftig produkt. (a)2,2 -17,7° (c = 0,48%, vann).

Aminosyre-analyse (hydrolyse med HC1): Arg 1,15, Gly 2,00,

Phe 2,00 (peptidinnhold 84,6%).

Elementæranalyse for G2gH^^<0>^<Ng.2>C2H^02.2H20

Beregnet: G 52,09 H 6,97 N 17,09

Funnet: C 52,05 H 6,85 N 17,22.

Eksempel 28.

Fremstilling av D-Ala-Arg-Gly-Phe-Phe-NH2

a) Fremstilling av Z-D-Ala-Arg(N02)-Gly-Phe-Phe-NH2

I 8 ml av 25% HBr-eddiksyre ble det oppløst 0,80 g

Z-Arg(N02 )-Gly-Phe-Phe-NH2, og oppløsningen ble rystet ved romtemperatur i 40 min. Blandingen ble tilsatt 100 ml etyleter,

og man fikk dannet et bunnfall. Dette ble oppsamlet ved filtrering, vasket med eter og tørket. Det tørkede produkt ble oppløst i 10 ml DMF og oppløsningen nøytralisert med trietylamin, hvoretter man tilsatte 0,51 g Z-D-Ala-ONB. Blandingen ble rørt i 8 timer. Nevnte DMF ble avdestillert under redusert ttrykk, og residuumet tilsatt 50 ml vann.

Det resulterende pulver ble oppsamlet ved filtrering, Etter tørking ble pulveret vasket med varm etylacetat og gjenutfelt fra DMF-etylacetat. Utbytte 0,799 S (92%), smp. 223-225°C, (a)<21>-22,3° (c = 0,98%, DMF).

Elementæranalyse for C^y<H>^g<O>^<N->^.l/^HgO

Beregnet: C 56,69 H 6,04 N 17,87

Funnet: C 56,38 H 6,07 N 17,98

b) Fremstilling av D-Ala-Arg-Gly-Phe-Phe-ØH2.

I 30 ml eddiksyre ble det oppløst 600 mg Z-D-Ala-Arg(N02)-Gly-Phe-Phe-NH2og katalytisk reduksjon ble utført

med palladium som katalysator i 7 timer. Katalysatoren ble frafiltrert, og oppløsningsmidlet avdestillert under redusert trykk. Residuumet ble oppløst i 10 ml vann, og oppløsningen førtt gjennom en kolonne på 1,8 x 11 cm karboksymetyl-sefadex.

Lineær gradient-eluering ble utført med 0,1M vandig ammoniumacetat (700 ml) og IM vandig ammoniumacetat (700 ml)

og man fikk den ovenfor angitte forbindelse i de fraksjoner som man hadde fra 350 til 450 ml« Disse fraksjoner ble samlet og slått sammen og deretter lyofilisert. Fremgangsmåten gir 400 mg (73%) av et hvitt luftig produkt. (a)^<2>-22,2° (c = 0,51%, vann).

Aminosyre-analyse: Arg 1,01, Gly 1,03, Ala 1,00, Phe 1,99 (peptidinnhold 83,3%).

Elementæranalyse for Cg^H^O^Ng.gCgH^Og.ZHgO

Beregnet: G 52,72 H 7,11 N 16,77

Funnet: C 52,66 H 6,92 N 16,82

Eksempel 29.

Fremstilling av Phe-Arg-Gly-Phe-Phe-NH2

a) Fremstilling av Z-Phe-Arg(N02)-Gly-Phe-Phe-NH2

I 10 ml 25% HBr-eddiksyre ble det oppløst 800 mg

Z-Arg(N02)-Gly-Phe-Phe-NH2, og oppløsningen ble rystet i 50 min. Den ble tilsatt 80 ml eter, og bunnfallet ble oppsamlet ved filtrering, tørket og oppløst i 10 ml DMF. Oppløsningen ble nøytralisert med trietylamin, hvoretter man tilsatte 700 mg Z-Phe-0PCP (pentaklorfenylester). Blandingen ble rørt i 10 timer hvoretter man tilsatte 50 ml IN vandig ammoniakk. Det dannet seg en olje som ble tatt ut ved dekantering og så tilsatt vann. Det resultrende pulver ble oppsamlet ved filtrering og tørket. Etter tilsetning av 50 ml etylacetat ble blandingen oppvarmet

og pulveret oppsamlet ved filtrering i varm tilstand. Produktet ble renset ved gjenutfelling fra DMF-etylacetat. Utbytt 805 mg (92%), (a)<21>-29,0° (c = 1,0%,. DMF).

Elementæranalyse for G ^ U^ o0^ lQ. l/ ZE^ 0

Beregnet: G 60,06 H 5,98 N 16,29

Funnet: C 60,32 H 6,02 N 16,10.

b) Fremstilling av Phe-Arg-Gly-Phe-Phe-NH2

I 6 ml vannfri hydrogenfluorid ble det oppløst

500 mg Z-Phe-Arg(N02)-Gly-Phe-Phe-NH2og oppløsningen ble rørt ved -10°C i 40 min. Hydrogenfluoridet ble adestillert, og residuumet oppløst i 10 ml vann. Oppløsningen ble ført gjennom en kolonne på 0,9 x 15 cm Amberlite IRA-410 (acetat-form) og vasket med vann. De utstrømmende fraksjoner ble slått sammen med vaskeoppløsningen og oppløsningen som sådan ble lyofilisert. Fremgangsmåten gir 402 mg av den.ovenfor angitte forbindelse. Aminosyre-analyse: Arg 1,01, Gly 0,98, Phe 2,94

(peptidinnhold 86,2%).

Eksempel 30.

Fremstilling av Leu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-NH2

a) Fremstilling av Z-Arg(N02)-Gly-Phe-Phe-Tyr-NH2

I IBO ml DMF ble det oppløst 12,2 g Z-Phe-Phe-Tyr-NH2

og katalytisk reduksjon ble utført med palladium som katalys tor i 5 timer. Katalysatoren ble frafiltrert, hvoretter man tilsatte 8,6 g Z-Arg(N02)<1>Gly-0H og 4,3g HONB.

Under avkjøling med is tilsatte man 4>95g DCC. Blandingen ble så rørt i 12 timer. Den dannede DG-urea ble frafiltrert, og 1 liter vann tilsatt filtratet. Den resulterende gel ble oppsamlet ved filtrering og gjenutfelt fra metanol og vann. Utbytte 16,25 g (91,8%), smp. l8l-l84°C, (ct)<2>^ -16,0°

(c = 1,01%, DMF9.

Elementæranalyse for c^^<H>^o0lo<N>lo.<H>20

Beregnet: C 58,35 H 5,92 N 15,83

Fuånet: C 58,02 H j5,98 N 15,66-

b) Fremstilling av Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-NH2

I 30 ml eddiksyre ble det oppløst 600 cmg Z-Arg(N02)-Gly-Phe-Phe-Tyr-NH2, og katalytisk reduksjon ble utført med palladium som katalysator i 9 timer. Katalysatoren ble frafiltrert og oppløsningsmidlet avdestillert under redusert trykk-. Residuumet ble oppløst i 15 ml vann og renset ved hjelp av en kolonne på

1,3 x 11 cm karboksymetyl-sefadex. Lineær gradient-eluering ble utført med 0,1M vandig ammoniumacetat (500 ml) og IM vandig ammoniumacetat (500 ml). Fraksjonene fra 25O til 420 ml ble slått sammen og lyofilisert. Utbytte 416 mg (72,5%). (a)<25>-7,6° (c = 0,49%, vann).

Elementæranalyse for G^H^0gNg.2C2H^02.2H20

Beregnet: C 55,37 H 7,03 N 14,90

Funnet: G 55,8l H 6,83 N 14,78

LAminosyre-analyse. Arg 1,02, Gly 1,00, Tyr 0,91, Phe 2,02, (peptidinnhold 82,5%).

c) Fremstilling av Z-Leu-Arg(N02)-Gly-Phe-Phe-Tyr-NH2

700 mg Z-Arg(N02)-Gly-Phe-Phe-Tyr-NH2ble tilsatt

0,2 ml anisol og deretter 7 ml 25% HBr-eddiksyre. Blandingen ble rystet ved romtemperatur i 40 minutter og deretter tilsatt 100 ml etyleter. Det resulterende bunnfall ble oppsamlet ved filtrering, tørket og oppløst i 10 ml DMF. Oppløsningen ble så nøytralisert med trietylamin, hvoretter man tilsatte 344 mg Z-Leu-Osu(N«hydroksy-succinimid-ester). Blandingen ble rørt

i 12 timer. Nevnte DMF ble avdestillert under redusert trykk, og 50 ml vann ble tilsatt residuumet. Det resulterende pulver ble oppsamlet ved filtrering, og renset ved gjenutfelling fAa metanol og vann. Utbytte 560 mg (70,9%), smp. 193-195°C, (a)<22>-18,9° (c = 1,13%, DMF).

Elementæranalyse for C^^Hg-^O-^-^N^-^.H20

Beregnet: C 58,96' H 6,36 N 15,44

Funnet: C 58,72 H 6,22 N 15,36

d) Fremstilling av Leu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-NH2

I 30 ml eddiksyre ble det oppløst /\ D0 mg Z-Leu-Arg(N02)-Gly-Phe-Phe-Tyr-NH2og katalytisk reduksjon ble utført med palladium som katalysator i 10 timer. Katalysatoren ble frafiltrert, og oppløsningsmidlet avdestillert under redusert trykk. Residuumet ble oppløst i 5 ml vann, ogoppløsningen ført gjennom en kolonne på 2,6 x 22 cm karboksymetyl-cellulose.

Det ble utført en gradient-eluering med 0,005M vandige ammoniumacetatoppløsninger (700 ml) og 0,2M vandig ammoniumacetat (700 ml). Fraksjonene.fra 83O til 910 ml ble slått sammen og lyofilisert. Utbytte 217 mg (55,5%), (a)^<2>-14,9° (c-= 0,47%, vann).

Elementæranalyse for C4iH5607%o * 2C2H4°2' 3H2°

Beregnet: C 55,43 H 7,24 N 14,37

Funnet: C 55,71 H 7,12 N 14,8l

Aminosyre-analyse: Arg 1,03, G1y 1,00, Leu 1,00, Phe 2,00,

Tyr 0,85 (peptidinnhold 78,0%9.

Eksempel 31.

Fremstilling av cc-Abu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-NH2

Fremgangsmåten fra eksempel 30 ble gjentatt, bortsett fra at Z-a-Abu ble brukt i stedet for Z-leu, og man fikk den ovenfor angitte forbindelse. (°0D -13,6 (c = 0,32%, vann). Aminosyre-analyse: Arg 1,02, Gly 0,98, a-Abu 1,04,

Phe 2,00,. Tyr 0,92 (peptidinnhold 8l%).

Eksempel 32.

Fremstilling av Nle-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-NH2

Fremgangsmåten fra eksempel 30 ble gjentatt, bortsett fra at Z-Nle ble brukt i stedet for Z-Leu og man fikk den ovenfor angitte forbindelse, (a)^"14,3° (°= 0,4%, vann). Aminosyre-analyse: Arg 1,00, Gly 0,98, Nie 1,04, Phe 2,03,

Tyr 0,91 (peptidinnhold 84%).

Eksempel 33.

Fremstilling av Val-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-NH2

I 10 ml DMF ble det oppløst 400 mg Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-NH2-diacetat fremstilt som angitt i eksempel 30b), hvoretter man tilsatte 300 mg Z-Val-ONB. Oppløsningen ble nøytralisert med trietylamin og rørt i 10 timer.. Oppløsningen ble så tilsatt 50 ml eter, og bunnfallet oppsamlet ved filtrering, vasket med etylacetat og tørket. Dette produkt ble oppløst i 30 ml eddiksyre-vann (1:1) og katalytisk reduksjon ble utføfct med palladium som katalysator i 4 timer. Katalysatoren ble frafiltrert, og filtratet konsentrert til tørrhet. Residuumet ble oppløst i 10 ml vann og renset på kromatografi på samme måte som i eksempel 30 c).. Utbytte 360 mg, (a)2,2 -13,7° (c = 0,5%, vann). Aminosyre-analyse: Arg 1,02, Gly 1,00, Val 0,97, Phe 2,04,

Tyr 0,97 .(peptidinnhold 86,2%).

Eksempel 34.

Fremstilling av B-Ala-Arg-Gly-Phe-Phe-NH2

a) Fremstilling av Z-Arg(N02)-Gly-0Et

I 200 ml tetrahydrofuran ble det oppløst 70,7 g

Z-Arg(N02 )-0H og under avkjøling med is ble det tilsatt 40,-5 g 2,4-dinitrofenol og 45,4 g DOC. Blandingen ble rørt i 4 timer. Uavhengig av dette ble 30,7 g Gly-OEt.HCl suspendert i 200 ml tetrahydrofuran og under isavkjøling ble suspensjonen nøytrali-sert med 30, 8 ml trietylamin. Den dannede dicykloheksylurea ble frafiltrert, og den aktive eteroppløsningen fremstilt som angitt ovenfor, ble tilsatt filtratet og det hele ble rørt og latt i bero over natten. Oppløsningen ble konsentrert, og residuumet oppløst i 500 ml etylacetat. Oppløsningen ble vasket med en mettet vandig opplesning av natriumhydrogen-karbonat

(200 ml x 3), med IN saltsyre (200 ml x 3) og så med en mettet vandig oppløsning av natriumklorid .(200 ml x 3)>og så tørket over vannfritt natriumsulfat. Oppløsningen ble konsentrert og utkrystallisert fra etylacetat-petroleums-bensin. Krystallene ble gjenvunnet ved filtrering og omkrystallisert fra etyl-acetat-petroleumsbensin. Utbytte 70,0 g (89,8%), smp. 109-110°C, (a)<2>,<6>'<5>-3,4° $c = 1%, DMF),

Elementæranalyse for C]_8<H2>6^7<N6>

Beregnet: G 49,311 H 5,98 N 19,7

Funnet: C 49,25 H 5,79 N 18,55

b) Fremstilling av Z-Arg(N02)-Gly-0H

I 100 ml aceton ble det suspendert 20,Og Z-Arg (NOg)-Gly-OEt, og under avkjøling med is ble det tilsatt 64 ml av

en IN vandig natriumhydroksyd-oppløsning. Baldningen ble så rørt ved romtemperatur i 2 timer.

Etter at overskuddet av alkali var nøytralisert med saltsyre, ble oppløsningen konsentrert under reduserr trykk og residuumet tilsatt 100 ml vann. Uoppløselige faste stoffer ble frafiltrert, filtratet ble gjort surt med saltsyre, og de resulterende kyrstaller innvunnet ved filtrering. Utbytte 18,3 g (93,7%), smp.103-105°C, (a)<22>-25,9° (c = 0,9%, DMF9. Elementæranalyse for C-LgHggOyNg.HgO,

Beregnet: C 44,86 H 5,65 N 19,62

Funnet: C 44,48 H 5,35 N 19,53

c) Fremstilling av Z-Arg(N02)-Gly-Phe-Phe-NH2.

I en blanding av 60 ml DMF og 40 ml metanol ble det

oppløst 8,91 g Z-Phe-Phe-NHg og katalytisk hydrogenoering ble utført i 14 timer i nærvær av palladium. Katalysatoren ble frafiltrert, og oppløsningsmidlet avdestillert under redusert trykk.

Residuumet ble oppløst i 30 ml DMF. Uavhengig av dette ble 6,80 g Z-Arg(N02)-Gly-0H tilsatt 50 ml tetrahydrofuran og under avkjøling med is tilsatte man så 3,23 s HONB og 3,71 S DCC og det' hele ble rørt i 5 timer. Den dannede dicykloheksylurea ble frafiltrert, og den ovennevnte aminkomponent (H-Phe-Phe-NHg) ble tilsatt. Blandingen ble så rørt over natten. Etter at oppløsningsmidlet var avdestillert under redusert trykk, ble residuumet tilsatt 100 ml vann og pulveret oppsamlet ved filtrering.

Etter tørking ble produktet vasket med etylacetat, og omkrystallisert fra etanol-etylacetat. Utbytte 8,34 g«

(72,7%), smp. 112-113°C, (a)<22>-21,6° (c = 1%, DMF).

Elementæranalyse for C^^H^-^OgN^.HgO

Beregnet: C 56,58 H 6,01, N 17,47

Funnet: G 56,75 H 5,72 N 17,40.

d) Fremstilling av Z-B-Ala-ONB.

I 40 ml tetrahydrofuran ble det oppløst 3,35 S

Z-8-Ala-0H og 3,'23 g HONB, og etter avkjøling med is ble 3,71 g DCC tilsatt. Blandingen ble rørt over natten og den dannede dicykloheksylurea ble frafiltrert. Oppløsningsmidlet ble avdestillert under redusert trykk, og petroleumsvensin ble tilsatt. De resulterende krystaller ble gjenvunnet ved filtrering, og omkrystallisert fra acetonitril. Utbytte 3,&3 S (66,4%), smp. 125-126°C.

Elementæranalyse for G2oH2o°6N2

Beregnet: C 62,49 H 5,24 H 7,29

Funnet: C 62,52 H 5,18 N 7,29-

e) Fremstilling av Z-B-Ala-Arg(N02)-Gly-Phe-Phe-NH2

1,06 g Z-Arg(N02)-Gly-Phe-Phe-NH2ble tilsatt

10 ml 25% HBr-eddiksyre og etter rysting ved romtemperatur i

40 min. ble etyleter tilsatt. Det resulterende bunnfall ble

gjenvunnet ved filtrering, tørket under redusert trykk i et tørkekammer over natriumhydroksyd og så oppløst i 10 ml DMF. Etter avkjøling tale oppløsningen nøytralisert med 0,84 ml trietylamin og så ble 0,69 g. Z-B-Ala-ONB tilsatt. Blandingen ble rørt over natten, og oppløsningsmidlet avdestillert under redu-sertt trykk, hvorpå man tilsatte 50 ml vann. Det resulternde pulver ble tørket, vasket med etylacetat og gjenvunnet fra vann-

dioksan-etylacetat. Utbytte 0,98 g (83,3%), smp. l6l-l63°G,(a)21'<5>-20,9° (c = 0,9%,HMF).

Elementæranalyse for C^yH^gO^N.^. I/2H2O

Beregnet: C 56,69 H 6,04 N 17,89

Funnet: C 56,84 H 5,88 N 17,50

f) Fremstilling av B-Ala-Arg-Gly-Phe-Phe-NH2

I 40 ml eddiksyre ble det oppløst 800 mg Z-B-Ala-Arg(N02J-Gly-Phe-Phe-NHg sammen med Pd som katalysator, og katalytisk réduksjon ble utført i 14 timer. Katalysatoren ble frafiltrert, og oppløsningsmidlet avdestillert under redusert trykk. Residuumet ble på samm en kolonne på 2,5 x 9 cm av karboksymetyl-cellulose og eluering ble utført ved en lineær gradient-metode idet man brukte 0,01N vandig ammoniumacetat (700 ml)

til IN vandig ammoniumacetat (700 ml).

Fraksjonene fra 7^0 til 990 ml ble slått sammen og l<y>ofilisert. Utbytte 500 mg (66%), (a){p'5 -13,9° (c = 0,5%, vann),

Elementæranalyse for C^<H>^<-jO>^<N>^<C>gH^Og.HgO

BEregnet:'C 54,00 H 7,01 N 17,l8

Funnet: 53,75 - H 7,07 N 17,15

Aminosyre-analyse: Arg 1,00(1), Gly 1,00(1), Phe 2,00(2), (tallene i parentes angir teoretiske verdier, det samme gjelder i det etterfølgende). Peptidinnhold 76%.

Eksempel 35.

Fremstilling av Y-Abu-Arg-Gly-Phe-Phe-NHg

a) Fremstilling av Z-r-Abu-ONB.

I 40 ml tetrahydrofuran ble detoppløst 4,75 fe

Z-Y-Abu-OH og 3,95 g HONB, og etter avkjøling med is ble 4,54 g DCC tilsatt. Blandingen ble rørt i 6 timer, og den dannede dicykloheksylurea ble frafiltrert. Oppløsningsmidlet ble så avdestillert under redusert trykk, og residuumet tilsatt 30 ml etyleter og en mindre mengde vann. De resulterende krysaller ble gjenvunnet ved filtrering. Utbytte: 6,0 g (75,3%), smp. 66-69°C,

Elementæranalyse for G2lH22^6N2

Beregnet: C 63,31 H 5,57 N 7,03

Funnet: C 63,39 H 5,42 N 7,06.

b) Fremstilling av Z-*f-Abu-Arg (N02)-Gly-Phe-Phe-NH2

På samme måte som i eksempel 34. e) ble 0,53 g. Z-Arg-(N02 )-Gly-Phe-Phe-NH2 behandlet med HBr-eddiksyre og oppløst i 15 ml DMF. Etter nøytralisasjon med trietylamin ble 0,44 g Z-Y-Abu-ONB tilsatt. Blandingen ble så rørt over natten, og oppløsningsmidlet avdestillert under redusert trykk, og vann

ble så tilsatt. Det resulterende pulver ble gjenvunnet ved filtrering og tørket godt.

Det ble vasket med etylacetat og gjenutfelt fra etanol-vann. Utbytte 0,38 g (65%), smp. l67-170°C, (et)<26>'<5->21,2°

(c = 1,0%, DMF).

Elementæranalyse for C^gH^gO^N-^. l/2H20

Beregnet: C 57,20 H 6,19 N 17,56

Funnet: C 57,14 H 6,10 . N 17,56

c) Fremstilling av Y-Abu-Arg-Gly-Phe-Phe-NH2..

I 30 ml eddiksyre ble det oppløst 300 mg Z-f-Abu-Arg(N02)-Gly-Phe-Phe-NH2og med palladium som katalysator ble

en katalytisk reduksjon utført i 6.timer.

Etter frafiltrering av katalysatoren ble oppløsnings-midlet avdestillert under redusert trykk, og residuumet påsatt en kolonne på 1,8 x 10 cm av karboksymetyl-sefadex. Eluering ble utført ved den lineære gradientmetode fra 0,005N vandig ammoniumacetat (350ml) til IN vandig ammoniumacetat (350 ml)>°g fraksjonene fra 29O ml til 340 ml ble slått sammen og lyofilisert. Utbytte l80 mg (63%), (a)<2>,<6>-15,0° (c = 0,5%, vann).

Elementæranalyse for C^oH^^0^<Ng.2>C2H^02.3/2H20

Beregnet: C 53,95 H 7,19 N 16,66-

Funnet: G 53,93 H 7,29 N 16,34

Aminosyre-analyse: Arg 1,00(1), Gly 1,00(1), Phe 1,94 (2), paptiinnhold 76%.

Eksempel 36.

Fremstilling av 6-Aval-Arg-Gly-Phe-Phe-NH2

a) Fremstilling av Z-6-Aval-Arg(N02)-Gly-Phe-Phe-NH2.

På samme måte som i eksempel 34 e) tole 0,80 g

Z-Arg(N02)-Gly-Phe-Phe-NH2, behandlet med .HBr-eddiksyre og oppløst i 10 ml DMF. Oppløsningen ble nøytralisert med trietylamin. Uahengig av dette ble 0,30 g Z-S-Aval-OH og 0,24 g HONB oppløst i 5 ml tetrahydrofuran.

Under avkjøling med is ble 0,27 S DCC tilsatt, og blandingen rørt i 3 timer. Den dannede dicykloheksylurea ble frafiltrert, og filtratet tilsatt den ovennevnte aminkomponent (H-8-Aval-Arg(Å 0^)-Gly-Phe-Phe-NH2) over natten. Oppløsnings-midlet ble avdestillert under redusert trykk, hvoretter vann Ile tilsatt. Det resulterende pulver ble gjenvunnet ved filtrering og tørket godt. Det ble vasket med etylacetat og gjenutfelt fra DMF-etylacetat. Utbytte 0,62 g (70%), smp. 154-157°C,

(ct)23 -13,0° (c = 1,0%, DMF),

Elementæranalyse for C^H^O^N-^.l/^HgO

Beregnet: G 57,69 H 6,33 N 17,25

Funnet: C 57,84 H 6,42 N 16,86

b) Fremstilling av S-Aval-Arg-Gly-Phe-Phe-NH2

I 30 nil eddiksyre ble det oppløst 500 mg Z-$-Aval-Arg(N02 )-Gly-Phe-Phe-NH2 og med palladium som katalysator ble det utført en katalytisk reduksjon i 5 timer. Etter frafiltrering av katalysatoren ble oppløsningsmidlet avdestillert under redusert trykk. Residuumet ble påført en kolonne av karboksymetyl-sefadex (1,8 x 9 cm)°S eluering ble utført ved den lineære gradientmetode fra 0,1N vandig ammoniumacetat (500 ml) til IN vandig ammoniumacetat (500 ml). Fraksjonene fra 29O til 37O ml ble slått sammen og lyofilisert. Utbytte 290 mg (6l%),

(a)jp -12,6° (c = 0,5%, vann),

Elementæranalyse for C^1H^0^<N>^<.2>G2H/j_02.3/2H20

Beregnet: C 54,53 H 7,<;>32 N 16,36

Funnet: . C 54,34 H 7,35 N 16,20

Aminosyre-analyse: Arg 1,11(1), Gly 1,00(1), Phe 2,04(2), peptidinnhold 8l,4%«

Eksempel 37.

Fremstilling av £-Acap-Arg-Gly-Phe-Phe-NH2

a) Fremstilling av Z-£-Acap-Arg(N02)-Gly-Phe-PheNH2

På samme måte som i eksempel 34 e) ble 0,80 g

Z-Arg(N02 )-Gly-Phe-Phe-NH2 behandlet med HBr-eddiksyre og oppløst i 10 ml DMF. Oppløsningen ble nøytralisert med trietylamin.

0,32 g Z-e-Acap-OH og 0,24 g HONB ble oppløst i 5 ml tetrahydrofuran og under avkjølin med is ble 0,27 g DCC.tilsatt. Blandingen ble rørt i 3 timer, og den dannede dicykloheksylurea ble fra-

trert og tilsatt den ovennente aminkomponenten (H-årg(N02)-Gly-Phe-Phe-NHg). Hele blandingen ble så rørt over natten, og oppløsningsmidlet avdestillert under rédusert trykk, hvoretter vann ble tilsatt. Det resulterende pulver ble gjenvunnet ved filtrering og tørket godt. Det ble så vasket med etylacetat og omkrystallisert fra DMF-etylacetat. (a)^1 -20,0° (c = 1,0%,

DMF).

Elementæranalyse for C^H^OgN-^. l/2H20

Beregnet: G 57,69 H 6,33 N 17,25

Funnet: C 57,86 H 6,40 N 16,76

b) Fremstilling av £-Acap-Arg-Gly-Phe-Phe-NH2

E 30 ml eddiksyre ble det oppløst 400 mg Z-£-Acap-Arg(N02J-Gly-Phe-Phe-NHg og med palladium som katalysator ble

en katalytisk reduksjon utført i 7 timer. Katalysatoren ble frafiltrert, og oppløsningsmidlet avdestillert under redusert trykk. Residuumet ble påsatt en kolonne på 1,8 x 10 cm av karboksymetyl-sefadex og eluering utført ved den lineære gradient-metode fra 0,1N vandig ammoniumacetat (500 ml) til. IN vandig ammoniumacetat (5OO ml). Fraksjonene fra 25O til 330 ml ble slått sammen og lyofilisert. Utbytte 200 mg (51%), (a)^<2>-9,9°

(c = 0,6%, vann).

Elementæranalyse for C^<H>^O^<N>^<C>gH^Og^HgO

Beregnet: C 54,46 H 7,49 N 15,88

Funnet: C 54,24 H 7,26 N 15,76.

Aminosyre-analyse: Arg 1,00(1), Gly 0,98(1), Phe 2,00(2), £-Acap-(ikke bestemt), paptidinnhold 79%*

Eksempel 38.

Fremstilling av Lys-Arg-Gly-Phe-Phe-NH2

a) Fremstilling av di-Z-Lys-Arg(N02)-Gly-Phe-Phe-NH2

På samme måte som i eksempel 34 e) ble 0,80 g

Z-Arg(N02)-Gly-Phe-Phe-NH2behandlet med HBr-eddiksyre og så oppløst i 10 ml DMF. Oppløsningen ble nøytralisert med trietylamin.

Uavhengig av dette ble 0,54 g di-Z-Lys-OH og 0,26 g HONB oppløst i 5 ml tetrahydrofuran og under isavkjøling ble 0,30 g DCC tilsatt. Blandingen ble rørt i 4 timer, og den dannede dicykloy/eksylurea frafiltrert. Filtratet ble tilsatt den ovennevnte aminkomponenten (H-Arg(N02)-Gly-Phe-Phe-NH2), fulgt av røring over natten. Oppløsningsmidlet ble avdestillert under redusert trykk, og vann ble tilsatt residuumet. Det resulterende pulver ble innvunnet ved filtrering og tørket godt. Det ble så vaskest med etylacetat og gjenutfelt fra DMF-etylacetat. Utbytte 0,82 g (77%), sm. 200-204°C (dekom.), (a)jp -20,5° (c = 1,1%,

DMF).

Elementæranalyse for G^8^59^11^11* l/^^O

Beregnet: G 59,06. H 6,20 N 15,79

Funnet: C 59,04 H 6,13 N 15,78.

b) Fremstilling av Lys-Arg-Gly-Phe-Phe-NH2..

I 30 ml eddiksyre ble det oppløst 600 mg di-Z-Lys-Arg(N02)-Gly-Phe-Phe-NH2 og med palladium som katalysator ble det utført en katalytisk reduksjon i 6 timer. Katalysatoren ble frafiltrert, og oppløsningsmidlet avdestillert under redusert trykk. Residuumet ble påsatt en kolonne av 1,5 x 11 cm karboksymetyl-sefadex, og eluering ble utført ved den lineære gradient-metoden fra 0,1N vandig ammoniumacetat (700ml) til IN vandig ammoniumacetat (700 ml). Fraksjonene fra 65O til 760 ml ble slått sammen og lyifilisert. Utbytte 280 mg (52%), (cc)jp -4,3°C

(c = 0,5%, vann)

Elementæranalyse for<C>32<H>48°5Nlo*3C2H4°2*2H2°

Beregnet: C 52,52 H 7,42 N 16,12

Funnet: C 52,64 H 7,38 N 16,42

Aminosyre-analyse: Arg 1,06 (1), Lys l,o$(l), Gly 1,00(1),

Phe 1,97(2), paptidinnhold 73%.

Eksempel 39.

Fremstilling av a,">p-Dab-Arg-Gly-Phe-Phe-NH2.

a) Fremstilling av di-Z-Dab-Arg(N02)-Gly-Phe-Phe-NH2.

På samme måte som ie eksempel 34 e) ble 0,80 g

Z-Arg(N02)-Gly-Phe-Phe-NH2ble behandlet med HBr-eddiksyre og ' oppløst i 10 ml DMF. Oppløsningen ble nøytralisert med trietylamin. Uavhengig av dette ble 0,50 g di-Z-a/f-Dab-OH og 0,26 g HONB oppløst i 5 ml tetrahydrofuran, og under avkjøling med is ble 0,30 g DCC tilsatt. Blandingen ble rørt i 4 timer og den dannede dicykloheksylurea ble frafiltrert.

Filtratet ble tilsatt den ovennevnte aminkomponent (H-Arg(N02)-Gly-Phe-Phe-NH2) og blandingen ble rørt over natten. Oppløsningsmidlet ble avdestillert under reduser trykk, og vann tilsatt residuumet. Den resulterende pulver ble gjenvunnet ved filtrering o g tørket godt. Det ble så vasket med etylacetat og gjenutfelt fra DMF-etylacetat. Utbytte 0,82 g(78%), smp. 184-i88°c, (a)<23>-19,5° (c = 1,1%,DMF).

Elementæranalyse for O^H^O-qN-q. H20

Beregnet: C 5.7,79 H 6,01 N 16,21

Funnet: C 57,95 H 5,91 N 16,19

b) Fremstilling av a,T-Dab-Arg-Gly-Phe-Phe-NH2

I 30 ml eddiksyre ble det oppløst 600 mg di-Z-(a,T-Dab-Arg(N02)-Gly-Phe-Phe-NH2og med palladium som katalysator ble.det utfelt en katalytisk reduksjon i 6 timer. Katalysatoren ble frafiltrert, og oppløsningsmidlet avdestillert under redusert trykk. Residuumet ble påsatt en kolonne av 1,5 x 13 cm karboksymetyl-sefadex og eluering ble utført ved den lineære gradient-metoden fra 0,1N vandig ammoniumacetat (700 ml) til IN vandig ammoniumacetat (700 ml). Fraksjonene fra 6l0 til 680 ml ble slått sammen og lyofilisert. Utbytte 255 mg (46%), (<x)jp -12,5°

(c = 0,8%, vann).'

E-,ementæranalyse for C^<H>^<O>^<N>^^CgH^O^H^O

Beregnet: G 50,34 H 7,28 N 16,31

Funnet: C 50,59 H 7,6l Nl6,93

Aminosyreanalyse: Arg 1,00(1), Gly 1,00(1),

Phe 1,98(2), a,T-Dab 1,02(1), peptidinnhold 72%.

Eksempel 40.

Fremstilling av Arg-Arg-Gly-Phe-Phe-NH2

a) Fremstilling av Z-Arg(N02)-Arg(N02)-Gly-Phe-Phe-NH2

På samme måte som i eksempel 34 e) ble 0,80 g

Z-Arg(N02)-Gly-Phe-Phe-NH2 behandlet med HBr-eddiksyre og

så oppløst i 10 ml DMF. Oppløsningen ble nøytralisert med trietylamin. Uavhengig av dette ble 0,39 g Z-Arg(N02)-0H og 0,22 g 2,4-dinitrofenol oppløst i 5 ml tetrahydrofuran og under avkjøling med is-ble 0,25 S DCC tilsatt. - Blandingen ble ørrt i 2 timer og den dannede dicykloheksylurea ble frafiltrert. Filtratet ble tilsatt den ovennevnte aminkomponent (H-Arg(N02)-Gly-Phe-Phe-NH2), fulgt av røring over natten. Oppløsningsmidlet ble avdestillert under redusert trykk, og man tilsatte residuumet. Det oljeaktige produkt ble vasket med vann og gjenutfelt fra DMF-et yla cetat. Utbytte 0,90 g (89%), smp. 89-92°C, (cOjp -17,6°

(c = 1,0%, DMF).

Elementæranalyse for C4_0Hc;2^11N14*H2^

Beregnet: C 52,05 H 5,90 N 21,25

Funnet: C 52,20 H 6,16 N 20,91

b) Fremstilling av Arg-Arg-Gly-Phe-Phe-NH2

I 40 åml eddksyre ble det oppløst 700 mg Z-årg(N02)-Arg(N02)-Gly-Phe-Phe-NH2og med palladium som katalysator ble

det utført en katalytisk reduksjon i 9 timer. Katalysatoren ble frafiltrert, og oppløsningsmidlet avdestillert under redusert trykk. Residuumet ble påsatt en kolonne på 3 x l8 cm karboksymetyl-cellulose og eluering utført fra 0,005N vandig ammoniumacetat (1 liter) til 0,3N vandig ammoniumacetat (1 liter). Fraksjonene fra 89O til 1410 ml ble slått sammen og lyofilisert. Utbytte 38O mg (45%), (a)2<2>+2,4° (c = 0,5%, 5% eddiksyre).

Elementæranalyse for C^H^gO^.3C2H^02.3/2H20

Beregnet: C 51,40 H 7,15 N 18,93

Funnet: 0 51,25 H 7,29 N 19,08

Aminosyre-analyse: Arg 2,02(2), Gly 1,00(1), Phe 2,02(2), peptidinnhold 73%.

Eksempel 41.

Fremstilling av B-Ala-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-NH2

a) Fremstilling av Z-B-Ala-Arg(NO2)Gly-0Et

26,3 g Z-Arg(N02)-Gly-0Et ble tilsatt 130 ml 25%

HBr-eddiksyre og etter rysting ved romtemperatur ble etylacetat tilsatt etter 60 min. Bunnfallet ble gjenvunnet ved filtrering og tørket over natriumhydroksyd. Det tørkede bunnfall ble oppløst i 150 ml DMF og etter avkjøling med is nøytralisert med trietylamin. Deretter ble 23,1 g Z-B-Ala-ONB tilsatt, og blandingen rørt overnatten. Oppløsningsmidlet ble avdestillert under redusert trykk, og residuumet oppløst i 300 ml etylacetat inneholdende en mindre mengde N-butanol. Oppløsningen.ble vasket med vann, en mettet vandig oppløsning av natriumhydrogenkarbonat (100 ml x 3) og'en mettet vandig oppløsning av natriumklorid (100 ml x .3) > fulgt av tørking over vannfritt natriumsulf at. Oppløsningsmidlet ble avdestillert under redusert trykk, og etyleter ble Mlsatt. Det resulterende pulver ble gjenvunnet ved filtrering, og omkrystallisert fra etanol-etylacetat.

Utbytte 22,9 S (75%),<s>mp. 97"99°C, U)^<6>'5-U,2° (c = 0,9%, DMF).

Elementæranalyse for ^^ l^^ l^ Q^ J

Beregnet: C 49,50 H 6,13N 19.25

Funnet: C 49,51 H 6,06 N 18,93

b) Fremstilling av Z-B-Ala-årg(NO2)-Gly-0H

I en blanding av 50 ml aceton og 25 ml vann ble

det oppløst 12,1 g Z-B-Ala-Arg(N02)-Gly-0Et og under avkjøling med is og natriumklorid ble 27,8 ml IN vandig natriumhydroksyd-oppløsnirg tilsatt dråpevis i løpet av 30 min. Blandingen ble rørt under samme betingelser i 1 time og deretter 2 timer ved romtemperatur og etter tilsetning av 3,8 ml IN saltsyre ble acetonen.avdestillert under redusert trykk. Residuumet ble tilsatt 50 ml vann, og blandingen ble gjort sur med 6N saltsyre og man fikk et-oljeaktig stoff som snart stivnet.

Det faste produkt ble oppsamlet ved filtrering.

Utbytt. 10,3 g (86,0%), smp. 101-103°C, U)<26>'<5>—10,2°

(c = 1,0%, DMF).

Elementæranalyse for C1^<H>2y<0>gN^.l/2H20

Beregnet: C 46,53 H 5,75 N 19,99

Funnet: C 46,28 H 5,41 • N 20,01

c) Fremstilling av Z-Phe-Tyr-0Me

- I 100 ml tetrahydrofuran ble det suspendert 5)10 S

Tyr-OMe.HCl og etter avkjøling med is ble suspensjonen nøytrali-sert med 3>°8 ml trietylamin. Denne oppløsning ble tilsatt 5,99 g Z-Phe-0H, 3,94 g HONB og 4,54 g DCC og blandingen ble rørt over natten. Den dannede dicykloheksylurea ble frafiltrert, og oppløsningsmidlet fjernet ved fordampning under redusert trykk. Residuumet ble oppløst i 200 ml etylacetat. Oppløsningen ble vasket med mettet vandig oppløsning av natriumhydrogen-karbonat (100 mt x 3), IN saltsyre (100 ml x 3) og vann fulgt av tørking over vannfritt natriumsulfat. Etter at etylacetat var avdestillert under redusert trykk, ble petroleumsbensin tilsatt det gelatinøse residuum som så ble gjenvunnet ved filtrering og gjenutfelt fra etylacetat-petroleumsvensin.. Utbytte 6,00 g (63%), smp. 132-133°C, (a)<26>'<5>-9,9° (c = 1,0%, DMF), Elementæranalyse for C2^<H>2<g0>gN2

Beregnet: C 68,05 H -5 ,92 N 5 ,88

Funnet: C 68,07 H 5,92 N 5,95.

d) Fremstilling av Z-Phe-Tyr-NH2

I 4-0 ml metanol mettet med ammoniakk ble det oppløst

3.0 g Z-Phe-Tyr-OMe og oppløsningen ble lagret i. et lukket kar i 1 uke og man fikk utfelt nåler.. Etter at oppløsningsmidlet var avdestillert under redusert trykk, ble. etyleter tilattt og de resulterende krystaller ble gjenvunnet ved filtrering og omkrystallisert fra etanol-vann. Utbytte 2,6l g (90%9>

smp. 217-2l8°C, (a)26'5=28,6° (c = 1,0%, DMF).

Elementæranalyse for CggH<gyO>^<N>^

Beregnet: C.67,66 H 5,90 N 9,11

Funnet: C 67,45 H 5,88 N 9,05

e) Fremstilling av Z-Phe-Phe-Tyr-NH2

1,15 g Z-Phe-Tyr-NHg ble tilsatt en mindre mengde

anisol og så 11 ml 25% HBr-eddiksyre. Etter risting ved romtemperatur i 40 min. ble etyleter tilsatt. Det resulterende bunnfall ble gjenvunnet ved filtrering og tørket over natriumhydroksyd. Uavhengig av dette ble 0,67 g Z-Phe-OH og 0,45 S HONB oppløst i-5 ml tetrahydrofuran og under is avkjøling ble 0,52 g DCC tilsatt. Blandingen ble rystet i 4 timer og den dannede dicykloheksylurea ble frafiltrert. Den ovennevnte aminkomponenten (H-Phe-Tyr-NH2) ble oppløst i 10 ml DMF og oppløsningen ble nøytralisert med trietylamin. Denne oppløsning ble tilsatt åen ovennevnte aktive esteroppløsningen, og hele blandingen ble rørt over natten. Oppløsningsmidlet b]e avdestillert under redusert trykk, og vann ble tilsatt. De resulterende krystaller ble gjenvunnet ved filtrering, vasket med etylacetat og omkrystallisert fra DMF-etylacetat. Utbytte 1.01 g(74%)>smp. 2l8-221°C (dekomp.), (a)<2>6'5 -27,7° (c = 1,0%,

DMF).

Elementæranalyse for C^<H>^<gOg>N^

Beregnet: C 69,06 H J5,96 N 9,21

Funnet: . C 69,01 . H 6,02 N 9,23.

f) Fremstilling av Z-B-Ala-Arg(N02)-Gly-Phe-Phe-Tyr-NH2

I en blanding av 30 ml metanol og 20 ml DMF ble

det suspendert 0,91 g Z-Phe-Phe-Tyr-NH2ig katalytisk reduksjon ble utført i 7 timer. Metanolen ble så avdestillert under redusert trykk. 0,72 g Z-B-Ala-Arg(NO2)-Gly-0H og 0,32 g HONB ble uavhengig av dette oppløst i 5 ml DMF og under avkjøling med is

tilsatte man 0,37 S DCC. Blandingen ble rørt i 6 timer og den dannede dicykloheksylurea ble frafiltrert. Filtratet ble tilsatt den ovennevnte aminkomponenten (H-Phe-Phe-Tyr-NH2), hvoretter det hele ble rørt over natten. Oppløsningsmidlet ble fordampet under redusert trykk og man fikk et fast stoff som var behandlet med vann. Det resulterende pulver ble .. gjenvunnet ved filtrering, og gjenutfelt fra DMF-etylace1at. Utbytte 0,88 g (62%), smp. 174-177°C, (a)^<6>'<5>-15,0° (c = 1,0%,

DMF).

•Elementæranalyse for c/j_^H^0]_]_Nil« 5

Beregnet: C 57,79 H 6,01 N 16,12

Funnet: C 57,54 H 6,18 H 16,12

g) Fremstilling av B-Ala-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-NH2

I 30 ml eddiksyre ble det oppløst 74O mg Z-B-Ala-Arg(N02)-Gly-Phe-Phe-Tyr-NH2og med palladium som katalysator ble det utført en katalytisk reduksjon i løpet av 7 timer. Katalysatoren ble frafiltrert, og oppløsningsmidlet avdestillert under redusert trykk. Residuumet ble påsatt en kolonne (1,6 x 15 cm) av karboksymetyl-sefadex og eluering ble utført ved den lineære gradientmetoden fra 0,005N vandig ammoniumacetat (700ml) til IN vandig ammoniumacetat (700 ml). Fraksjonene fra 5^0 til 79O ml ble slått sammen og lyofilisert. Utbytte 54O mg (75%), (a)<26>-20,0° (c = 0,5%, vann).

Elementæranalyse for C^g<H>^o<0>yNlo.2C2H^02.3H20

Beregnet: C 54,06 H 6,91 N 15,01

Funnet: C 54,20 _ H 6,50 N 14,99

Aminosyre-analyse: Arg 0,95(1), Gly 1,05(1), Tyr 1,00(1),

Phe 2,00(2), peptidinnhold 74%.

Eksempel 4 2.

Fremstilling av T-Abu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-NH2

a) Fremstilling av Z-Y-Abu-Arg(N02)-Gly-0Et

4,38 gf Z-Arg(N02)-Gly-0Et ble tilsatt 40 ml 25%

HBr-eddiksyre, og etter rysting ved romtemperatur i 30 min. ble etyleter tilsatt.. Det resulterende bunnfall ble gjenvunnet ved filtrering, og tørket over natriumhydroksyd.

Bunnfallet ble så oppløst i 30 ml DMF og etter is-avkjøling ble oppløsningen nøytralisert med trietylamin. Opp-løsningen ble så tilsatt 4,l6 g Z—Y-Abu-ONB og blandingen ble rørt over natten. Oppløsningsmidlet ble avdestillert under rédusert trykk, og vann' ble tilsatt residuumet. Vannet ble så fjernet ved dekantering og etyleter tilsatt residuumet, hvorved dette ble stivt. Det ble så gjenvunnet ved filtrering og gjenutfelt fra acetonitril. Utbytte 2,5 g (48%), smp. 60-62°C, (a)<21>-U,l° (c = 1,0%, DMF).

Elementæranalyse for C^<H>^<Og>Ny

Beregnet: G 50,47 H 6,35 N 18,73

Funnet: C 50,12 H 6,51 N 18,73

b) Fremstilling av Z-T-Abu-Arg(N02)-Gly-0H.

I 20 ml aceton ble det oppløst 2,0 g Z-^Abu-Arg(N02)-Gly-0Et, og under isavkjøling ble 5,7 ml IN vandig natriumhydroksydoppløsning tilsatt. Blandingen ble rørt ved romtemperatur i 2 timer. Etter tilsetning av 6 ml IN saltsyre ble acetonen avdestillert under redusert trykk. De resulterende krystaller ble gjenvunnet ved filtrering, og omkrystallisert fra etanolBvann. Utbyte 1,86 g (98%), smp. 113-115°C, (a)<21>-20,0° (c = 1,1%, DMF).

Elementæranalyse for C2oH2g0gNy.H20

Beregnet: C 46,78 H 6,09 N 19,10

Funnet: C 57,12 H 5,90 N 19,23

c) Fremstilling av Z-T-Abu-Arg(N02)-Gly-Phe-Phe-Tyr-NH2

1,34 g Z-Phe-Phe-Tyr-NH2ble tilsatt en mindre

mengde anisol og deretter 13 ml 25% HBr-eddiksyre.

Etter rysting ved romtemperatur i 45 min. ble etyleter tilsatt, og det resulterende bunnfall ble gjenvunnet ved filtrering og tørket over natriumhydroksyd. Uavhengig av dette ble 0,99 g Z-T"Abu-Arg(N02)-Gly-0H og 0,43 g HONB oppløst i 5 ml DMF og under avkjøling tilsatt 0,50 g DCC. Blandingen ble rørt i 6 timer og den dannede dicykloheksylurea ble frafiltrert.- Den ovennevnte aminkomponenten (H-Phe-Phe-Tyr-NH2) ble oppløst i 10 ml DMF og oppløsningen ble nøytralisert med trietylamin. Denne oppløsning ble tilsatt den ovennevnte aktive, esteroppløsning og hele blandingen ble rørt over natten. Oppløsningsmidlet ble avdestillert under redusert trykk, og vann ble tilsatt. Det resulterende pulver ble innvunnet ved filtrering, vasket med etylacetat og gjenutfelt fra DMF-etylacetat.

Utbytte 1,12 g (58%), smp.<1>39,5-141°C, (a)<21>-13,2° (c = 1,4%,

DMF).

Elementæranalyse for c^y<H>57^11<N>11,<H>2°

Beregnet: G 58,19 N 6,13 N 15,89

Funnet: G 57,76 H 6,43 N 15,91.

d) Fremstilling av T-Abu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-NH2

I 30 ml eddiksyre ble det oppløst 800 mg Z-7<*->Abu-Arg(N02)-Gly7Phe-Phe-Tyr-NH2og med palladium som katalysator

ble det utført en katalytisk reduksjon i løpet av 14 timer. Katalysatoren ble f rafiltrert, ogoppløsningsmidlet fjernet

ved destillasjon minder redusert trykk. Residuumet ble påsatt en kolonne på 1,5 x 10 cm karboksymetyl-sefadex, og eluering ble utført ved gradient-elueringsmetoden fra 0,1N vandig ammoniumacetat (700 ml) til IN vandig ammoniumacetat (700 ml). Fraksjonene fra 410 til 600 ml ble slått sammen og lyofilisert. Utbytte 412 mg (52%), (a)<22>-1§,1° (c = 0,5%, vann).

Elementæranalyse for c^gH^2°7Nlo*2C2H^02.4H20

Beregnet: C 54,02 H 7,10 N 14,52

Funnet: C 54,08 H 7,07 N 14,60.

Aminosyre-analyse: Arg 0,96(1), Gly 1,00(1), Tyr 0,97(1),

Phe 2,10(2), peptidinnhold 84%.

Eksempel 43.

Fremstilling av £-Acap-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-NH2

a) Fremstilling av Z-£-Acap-Arg(N02)-Gly-0Et

2,41 g Z-Arg(N02)-Gly-0Et ble tilsatt 12 ml 25% HBr-eddiksyre og etter rysting ved romtemperatur i 40 min. ble etyleter tilsatt. Det resulterende bunnfall ble gjenvunnet ved filtrering og tørket over natriumhydroksyd.

Uavhengig av dette ble 1,33 g Z-£-Acap-0H og 0,99 S HONB oppløst i-5 ml tetrahydrofuran og under isavkjøling ble

1,14 g DCC tilsatt.

Blandingen ble rørt .i 4 timer og den dannede dicykloheksylurea ble frafiltrert. Den ovennevnte aminkomponenten ble oppløst i 10 ml DMF og etter nøytralisasjon med trietylamin ble den tilsatt den aktive esteroppløsningen. Reaksjonsblandingen ble rørt over natten, hvorpå oppløsningsmidlet ble avdestillert under redusert trykk. Residuumet ble oppløst i 50 ml etylacetat, og oppløsningen ble vasket med vann, med en mettet vandig opp-løsning av natriumhydrogen-karbonat (50 ml x 2) og med vann, og det hele tørket over vannfritt natriumkarbonat. Oppløsnings-midlet ble avdestillert under redusert trykk, og petroleumsbensin ble tilsatt. De resulterende krystaller ble gjenutfelt fra vann-etanol-etylacetat. Utbytte 2,1 g (76%), smp. 85-87°C, (a)24" -11,9° (c = 1,0%, DMF).

Elementæranalyse for C24^37^8^7

Beregnet C 52,26 H 6,76 N 17,78

Funnet: C 52,43 H'6,64 N 17,76

b) Fremstilling av Z-£-Acap-Arg(N02)-Gly-0H

I 10 ml .aceton ble det oppløst 1,8 g Z-£-Acap-Arg(N02)-Gly-0Et og under isavkjøling tilsatte man 2,9 ml 2N vandig natriumhydroksydoppløsning. Blandingen ble rørt ved romtemperatur i 2 timer. Etter tilsetning av 2,5 ml IN saltsyre ble acetonene av destillert under redusert trykk. Residuumet ble tilsatt 10 ml vann og uoppløselige faste stoffer frafiltrert. Filtratet ble gjort surt med IN saltsyre og man fikk utfelt krystallar. Disse ble gjenvunnet ved filtrering. Utbytte 1,59 S (93%), smp. 97>5-99°C, (a)2,4 -10,7° (c = 1,0%, DMF).

Elementæranalyse for C22H^0gNy.H20

Beregnet: G 48,79 H 6,52 N 18,10

Funnet: C 48,50 H 6,28 N 18,23

c) Fremstilling av.Z-£-Acap-Arg(N02)-Gly-Phe-Phe-Tyr-NH2

1,22 g Z-Phe-Phe-Tyr-NH2 ble tilsatt en mindre

mengde anisol og så 10 ml 25% HBr-eddiksyre. Blandingen ble rystet ved romtemperatur i 40 min. hvoretter man tilsatte etyleter. Bunnfallet ble innvunnet ved filtrering, og tørket over natriumhydroksyd. Uavhengig av dette ble 1,05 S Z-£-Acap-Arg(N02)-Gly-0H og 0,36 g HONB oppløst i 10 ml DMF og under is-avkjøling ble 0,42 g DCC tilsatt. Blandingen ble rørt i 6 timer og dicykloheksylurea ble frafiltrert. Ovennevnte aminkomponent ble oppløst i 10 ml DMF og oppløsningen ble så nøytralisert med trietylamin.

Aminkomponent-oppløsningen ble tilsatt den aktive esteroppløsning og hele blandingen rørt over natten. Oppløsnings-midlet ble avdestillert under redusert trykk og vann ble tilsatt. Det resulterende pulver ble gjenvunnet ved filtrering, vasket med etylacetat og gjenutfelt fra DMF-etylacetat. Utbytte 1,01 g (57%), smp. 149-151°C, (a)<26>-12,9° (c = 1,1%, DMF).

Elementæranalyse for C^yHgyO-^N-^. l/2H20

Beregnet: C 59,50 H 6,32 N 15,58

Funnet: C 59,63 H 6,43 N 15,03.

d) Fremstilling av £-Acap-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-NH2

I 40 ml eddiksyre ble det oppløst " J00 mg Z-£-åcap-Arg(N02 )-Gly-Phe-Phe-Tyr-NH2 og med palladium som katalysator ble det utføet en katalytisk reduksjon i løpet av 14 timer. Katalysatoren ble frafiltrert, og oppløsningsmidlet fjernet ved destillasjon under redusert trykk. Residuumet ble påsatt en kolonne av karboksymetyl-sefadex på 1,8 x 12 cm og eluering ble utført ved den lineære gradient-metoden fra 0,1N vandig ammoniumacetat (700 ml) til IN vandig ammohiumacetat (700 ml). Fraksjonene fra 430 til 550 ml ble slått sammen og lyofilisert. Utbytte 430 mg (62%), (a)<26>-13,2° (c = 0,5%, vann).

Elementæranayse.for CpH^6°7Nlo*202H4°2' 3H2°

Beregnet: G 55,43 H 7,24 N 14,37

Funnet: C 55,46 H 7,39 N 14,47

Aminosyre-analyse Arg 1,00(1), Gly 1,00(1), Tyr 1,00(1),

Phe 2,07(2), peptidinnhold 84%.

Eksempel 44»

Fremstilling av Lys-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-NH2

a) Fremstilling-av di-Z-Lys-Arg(N02)-Gly-0Et Ved å bruke 2,07 g di-Z-Lys-0H og samme fremgangsmåte

som i eksempel 43 a), fikk man den forønskede forbindelse som en gel. Gjenutfelling fra vann-etanol-etylacetat ga 2,57 g (73%), smp. l6l-l62°C, (a)<24>"-11,9° (c = 1,0%, DMF).

Elementæranalyse for c^2H44^1oN8

Beregnet: G 54,85. H jb,33 N 15,99.

Funnet: C 54^45 H 6,05 N 15,99-

b) Fremstilling av di-Z-Lys-Arg(N02)-Gly-0H

I 10 ml aceton ble det oppløst 2,0 g di-Z-Lys-Arg(N02)-Gly-0et og under isavkjøling ble 2,1 ml 2N vandig natriumhydroksydoppløsning tilsatt. Blandingen ble så rørt ved romtemperatur i 2 timer. Etter tilsetning av 1,4 ml IN saltsyre ble acetonen avdestillert under redusert trykk. Residuumet ble fortynnet med 10 ml vann og uløselige faste stoffer frafiltrert. Oppløsningen ble så gjort sur med IN saltsyre, og det resulterende gelatinøse bunnfall ble innvunnet ved filtrering. Utbytte 1,78 g (93$), smp. 131-132,5°C, (a)<24>-10,5° (c = 1,0,

DMF).

Elementæranalyse for C^H^OloNq. 3/2H2°

Beregnet: C 51,49 H 6,20 N 16,02

Funnet: C 51,43 H 5,92 N 16,23

c) Fremstilling av di-Z-Lys-Arg(N02)-Gly-Phe-Phe-Tyr-NH2

Ved å bruke 1,21 g av di-Z-Lys-Arg(N02)-Gly-0H og

samme fremgangsmåte som i eksempel 43°) fikk man den forønskede forbindelse som en jgel. Utbytte 1,21 g (58%), smp. 199-203°C, (p)<24>-13,3° (c = 1,0, DMF).

Elementæranalyse for G^y<HggO>^^<N->^<g>.2H20

Beregnet: C 58,75 H 6,23 N 14,42

Funnet: C 58,70 H 6,26 N 14,72

d) Fremstilling av Lys-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-NH2

I 30 ml eddiksyre Be det oppløst 1,00 g di-Z-Lys-Arg(N02 )-Gly-Phe-Phe-Tyr-NH2 og med palladium som katalysator

ble det utført en katalytisk reduksjon, i løpet av 20 timer. Katalysatoren ble frafiltrert, og oppløsningsmidlet fjernet ved destillasjon under redusert- trykk. Residuumet ble påsatt en kolonne på 1,8 x 10 cm av karboksymetyl-sefadex. Eluering ble utført ved den lineære gradient-metoden fra 0,1N vandig ammoniumacetat (500 ml) til IN vandig ammoniumacetat (500 ml)

og fraksjonene fra 65O til 89O ml ble slått sammen og lyofilisert. Utbytte 4§8 mg (50%'), (a)<26>-10,6° (c = 0,5%, vann).

Enementæranalyse for-C^1H^y0yN11.3C2H^02.4<H>2<0>

Beregnet: G 52,84 H 7,27 N 14,43

Funnet: C 52,70 H 7,31 N 14,72

Aminosyre-analyse: Arg 1,00(1), Lys 0,94(1), Gly 1,00(1),

Tyr 1,00(1), Phe 2,06(2), peptidinnhold 82%.

Eksempel 45.

Fremstilling av a,X-Dab-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-NH2

a) Fremstilling av di-Z-cc,T-Dab-Arg(N02)-Gly-0Et

I 40 ml etyleter ble det suspendert 2,84 g di-Z-arr-Dab-OH.DCHA ("<D>CHA1<1>er en forkortelse for dicykloheksyl-amin), og suspensjonen ble rystet med 0,5N svovelsyre. Eterlaget ble vasket med vann og tørket under vannfritt natriumsulfat.

Oppløsningsmidlet ble avdestillert under redusert, trykk, og

ved å bruke samme fremgangsmåte som i eksempel 43 a) fikk man den forønskede forbindelse som en gel. Den ble gjenutfelt fra vann-etanol-etylacetat. Utbytte 2,36 g (70%), smp. 153-156°C, (a)<24>-9,4° (c = 1,0%, DMF).

Elementæranalyse for c^oH/|<_o>0io<N>6

Beregnet: C 53,56 H 5,99 N 16,66

Funnet: C 53,26 H 5,84 N 16,24

b) Fremstilling av di-Z-a,-y-Dab-Arg(N02>Gly-0H.

I 10 ml aceton ble det oppløst 2,0 g di-Z-a,Y-I>ab-Arg(N02)-Gly-0Et og under isavkjøling tilsatte man dråpevis

2,97 ml av en 2N vandig natriumhydroksyd-oppløsning. Blandingen ble rørt under samme betingelser i 1 time, hvoretter man tilsatte 3 ml IN saltsyre. Acetonen ble avdestillert under redusert trykk, og man tilsatte 10 ml vann. Uløselige faste stoffer ble frafiltrert, og filtratet gjort surt med IN saltsyre. Det resulterende gelatinøse bunnfall ble innvunnet ved filtrering.

Utbytte 1,67 g (90%), smp. 112-113°C, (a)26 -8,3° (c = 1,1%,

DMF)..

Elementæranalyse for Cgg<H>^<gO->^<Ng>.<H>gO

Beregnet: C 50,55 H 5,76 N 16,89

Funnet:. C 5<0,>53 H 5,59 N 17,19

c) Fremstilling av di-Z-a,7^Dab-Arg(N02)-Gly-Phe-Phe-Tyr-NH2

Ved å bruke 1,12 g di-Z-A,Y-Dab-Arg(N02 )-Gly-0H

og samme fremgangsmåte som i eksempel 43°) fikk man den forønskede forbindelse som en gel. Utbytte 1,02 g (51%), smp. 191-195°G, (a)<26>-14,0o (c = 0,9%, DMF).

Elementæranalyse for C^H<g>^<0->^^N<->^2.<H>20

Beregnet: C 59,02 H 5,95 N 15,02

Funnet: C 59,13 H 6,14- N 15,46

d) Fremstilling av a,Y-Dab-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-NH2

I 30 ml eddiksyre ble det oppløst 600 mg di-Z-a,T~

Dab-Arg(N02)-Gly-Phe-Phe-Tyr-NH2og med palladium som katalysator utførte man en katalytisk reduksjon i løpet av 12 timer. Katalysatoren blefrafiltrert, og oppløsningsmidlet fjernet ved fordampning under redusert trykk. Residuumet ble påsatt en kolonne på 1,8 x 10 cm av karboksymetylsåfadex og eluering ble utført med den lineære gradient-metoden fra 0,1N vandig ammoniumacetat (500 ml) til IN vandig ammoniumacetat (500 ml). Fraksjonene fra 49° til 620 ml- ble slått sammen og lyofilisert. Utbytte241 mg (43), (a)<26>-17,9° (c = 0,6%, vann).

Elementæranalyse for C^H^OyNii* 3C2H4°2*4H20

Beregnet: C 51,96 H 7,08 N 14,82

Funnet: G 52,12 H 6,99 N 15,31

Aminosyreanalyse: Arg 1,00(1), Dab 1,04(1), Gly 1,09(1),

Tyr 1,02(1), Phe 2,13(2), peptidinnhold 79%.

Claims

1. Fremstilling av polypeptider med formel

hvor R-^ er hydrogen, eller et basisk eller nøytralt aminosyre-residuum, R^ er et nøytralt aminosyre-residuum og R^ er NH^ , Tyr-NHg, et residuum av tyrosylpeptid med fra 1 til 5. amino-syreresidua eller et residuum av et amid av tyrosylpeptidet, forutsatt at når' R^ er hydrogen, så er Rg Pro, karakterisert ved at man kondenserer en aminosyre tilsarende R-^ eller arginin når R-^ er hydrogen, eller et peptidfragment av polypeptidet (I) med aminosyre-residuumet R^ eller arginyl-gruppen når R-^ er hydrogen, som sin N-terminale aminosyre, med det gjenværende fragment av polypeptidet (I), og hvor hver av utgangsmaterialene kan være beskyttet på sine amino- eller karboksylgrupper som ikke inngår i den angjeldende ondensasjonen, og som kan være aktivert i de amino- eller karboksylgrupper som inngår i den angjeldende kondensasjon, hvoretter man fjerner eventuelle beskyttende grupper fra det resulterende produkt.