CH628323A5 - Verfahren zur herstellung von cholecystokinin-pancreozymin-octapeptidamid-sulfatester. - Google Patents
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Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung des Cholecystokinin-pancreozymin-octapeptidamid-sulfatesters der Formel
L-Asp-L-Tyr-L-Met-Gly-L-Trp-L-Met-L-Asp-L-Phe-NH2
SO3H (I)
sowie der Salze dieses Esters.
Ivy und Oddberg [Amer. J. Physiol. 86,599 (1928)] haben im Jahr 1928 aus der Darmschleimhaut einen die Kontraktion der Gallenblase herbeiführenden Wirkstoff isoliert, welchen sie «Cholecystokinin» genannt haben. Später haben Harperund Raper [J. Physiol. 102,115 (1943)] einen «Pan-creozymin» genannten, die Enzymsekretion der Bauchspeicheldrüse steigernden Wirkstoff aus Darmschleimhaut-Extrakten isoliert. Mutt und Joopes [Acta Chem. Scand. 18, 2408 (1964)] haben dann nachgewiesen, dass für diese zweierlei biologische Wirkungen dieselbe Verbindung, das von ihnen «Cholecystokinin-pancreozymin» genannte Hormon verantwortlich ist. Dieselben Forscher haben auch die Aminosäure-Sequenz dieses Hormons - Lys-Ala-Pro-Ser-Gly-Arg-Val-Ser-Met-Ile-Lys-Asn-Leu-Gln-Ser-Leu-Asp-Pro-Ser-His-Arg-Ile-Ser-Asp-Arg-Asp-Tyr(S03H)-Met-Gly-Trp-Met-Asp-Phe-NHî - aufgeklärt [Biochem. J. 125,678 (1971)]. Ondetti und Pluscec haben den C-terminalen Octa-peptid-sulfatester von Cholecystokinin-pancreozymin und zahlreiche Analoga davon synthetisiert und haben gefunden, dass der Octapeptidamid-sulfatester, sowie einige Analoga davon wesentlich wirksamer sind, als das gesamte Molekül [J. Am. Chem. Soc. 92,195 (1970); J. Med. Chem. 13,349 (1970); ungarische Patentschriften Nr. 162 875 und 163 626].
Dieser Octapeptidamid-sulfatester kann in Dosen von etwa 10"6 mg/kg als nützliches diagnostisches Mittel anstatt von Cholecystokinin-pancreozymin in der Untersuchung der Gallenblasenkontraktion und Bauchspeicheldrüsesekretion angewendet werden (vgl. ungarische PS 162 875). In den neueren Untersuchungen wurde auch festgestellt, dass der Octapeptidamid-sulfatester eine starke relaxierende Wirkung auf die Ringmuskeln sphincter Oddii ausübt, wodurch dieser Ester auch in der Therapie zum Lösen der nach Gallenblasenoperationen auftretenden Krämpfe eingesetzt werden kann [vgl. M.A. Ondetti, B. Rubin, S. Engel: J. Amer. Digestive Diseases 15,149 (1970)].
Ein Verfahren zur Herstellung dieses Octapeptidamid-sul-fatesters wurde aus den Arbeiten von Ondetti und seinen Mitarbeitern [ungarische PS 162 875; DOS 1922185; J. Am. Chem. Soc. 92,195 (1970)] bekannt. Das geschützte Octapeptidamid und die zu seiner Synthese nötigen Zwischenprodukte werden nach bekannten peptidchemischen Methoden hergestellt, dann wird der Tyrosin-Teil in aus der Literatur bekannter Weise, durch Behandlung mit der Komplexverbindung von Pyridin und Schwefeltrioxyd sulfatiert und schliesslich werden die Schutzgruppen durch Acidolyse mit Trifluoressigsäure entfernt. Dieses Verfahren liefert Ausbeuten von etwa 30%. Nach einer anderen Methode derselben Autoren wird das freie Octapeptidamid bei niedriger Temperatur mit konz. Schwefelsäure bzw. mit dem Gemisch von Schwefelsäure und Kaliumbisulfat behandelt, wobei das Octapeptidamid-sulfatester in ziemlich niedriger (10%) Ausbeute erhalten wird und als Nebenprodukt eine erhebliche Menge von einem sulfonierten Tyrosin enthaltenden Peptid entsteht.
Es wurde nun gefunden, dass das Sulfatieren des geschützten Octapeptidamids wesentlich beschleunigt werden kann, wenn man anstatt von Pyridin-Schwefel-trioxyd-Komplex einen Komplex aus einem mindestens eine Alkylgruppe enthaltenden tertiären Amin und Schwefeltrioxyd in Gegenwart eines Äthers verwendet. Es wurde auch beobachtet, dass die in der Literatur zum Schützen der Tryptophans gegen tert.-Butylierung und Oxydation anempfohlene N'-Formylgruppe [vgl. D. Yamashiro, C.H. Li, J. Org-Chem. 38,2594 (1973)] in überraschender Weise auch zum Schützen des Tryptophans gegen Sulfonierung während der Herstellung des Sulfatesters erfolgreich verwendet werden kann. Bei dem Entfernen der Schutzgruppen durch Acidolyse wurde ferner in interessanter Weise gefunden, dass die sonst bekannte saure Hydrolyse der Sulfatestergruppe selbst bei langer, mehrstündiger Behandlung nicht eintritt, wenn man s
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ein Alkalimetallsalz des geschützten Octapeptidamids mit überschüssiger Trifluoressigsäure oder Mercaptoäthansul-fonsäure behandelt. Durch die Anwendung dieser drei neuen Massnahmen kann man also bei der Herstellung des Octa-peptidamid-sulfatesters wesentlich bessere Resultate erzielen, als mit den aus der Literatur bekannten Methoden.
Der Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist also ein Verfahren zur Herstellung von L-Asparagyl-(0-sulfato-L-tyrosyl)-L-methionyl-glycyl-L-tryptophyl-L-methionyl-L-asparagyl-L-phenylalaninamid, d.h. des Sulfatesters des C-terminalen Octapeptidamids von Cholecystokinin-pancreozymin, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass man ein geschütztes Octapeptidamid der allgemeinen Formel
X-Asp-Tyr-Met-Gly-Trp-Met-^sp-Phe-NH2
Y FOR W
worin X = BOC, Cbz oder Ddz Y = O'Bu, Obzl oder OH W = O'Bu, OBzl oder OH,
in Gegenwart eines Äthers mit dem Komplex aus einem mindestens eine Alkylgruppe enthaltenden tertiären Amin und aus Schwefeltrioxyd sulfatiert, den erhaltenen Sulfatester durch Behandlung mit einem Alkalimetallhydroxyd in das Alkalisalz überfuhrt und damit zugleich die an der Trypto-phan-Einheit anwesende Formyl-Schutzgruppe abspaltet, dann die übrigen Schutzgruppen durch Acidolyse entfernt. Gewünschtenfalls kann das erhaltene Octapeptidamid-sulfatester mit einer pharmazeutisch anwendbaren Base in das entsprechende Salz überführt werden.
Als mindestens eine Alkylgruppe enthaltendes tertiäres Amin kann vorteilhaft ein N-Alkylmorpholin mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen im Alkylteil, besonders N-Methylmor-pholin eingesetzt werden; die Komplexverbindung des tertiären Amins kann in bekannter Weise, z.B. durch Umsetzen des Amins mit Chlorsulfonsäure hergestellt werden. Da das als Ausgangsstoff des erfindungsgemässen Verfahrens dienende geschützte Octapeptid in Gegenwart von einem Äther, vorteilhaft von Dioxan mit der aus dem Amin-Schwefel-trioxyd Komplexverbindung umgesetzt wird, ist es zweckmässig, schon die Bildung des Komplexes in einem ätherhal-tigen Reaktionsgemisch, z.B. im Gemisch von Dioxan und Dimethylformamid durchzuführen.
Das als Ausgangsstoff einzusetzende geschützte Octapeptidamid kann in an sich bekannter Weise, durch Fragmentenkondensation oder durch schrittweise erfolgendes Anknüpfen der einzelnen Aminosäuren der Sequenz aufgebaut werden, wobei die bekannten peptidchemischen Synthesemethoden - Acylierung mit gemischten Anhydriden, mit aktiven Estern, mit Aziden oder in Gegenwart von Dicy-clohexylcarbodiimid, oder auch die sogennante Synthese in fester Phase, bei welcher die mit ihrer Carboxylgruppe an einen festen Polymerträger gebundene C-terminale Aminosäure als Ausgangsstoff der schrittweisen Acylierung dient -angewendet werden können.
Die in den Reaktionen nicht teilnehmenden funktionellen Gruppen werden bei der Durchführung der Reaktionen zweckmässig geschützt; zu dem Schützen dieser Gruppen werden solche an sich bekannte Schutzgruppen verwendet, welche nach der Reaktion leicht, besonders durch Hydrolyse, Acidolyse, Hydrazinolyse oder Reduktion entfernt werden können. Das Indol-Stickstoffatom von Tryptophan wird mit einer Formylgruppe geschützt, da diese Schutzgruppe bei den während des Aufbaus des Peptidmoleküls durchgeführten Acidolysen die Bildung von unerwünschten tert.-Butylderi-vaten verhindert.
Durch die Anwendung von entsprechenden Kombina628323
tionen von Schutzgruppen kann es erreicht werden, dass diese an verschiedenen Stellen der Peptidkette verwendeten Schutzgruppen nach bekannten Methoden, z.B. durch Hydrolyse, Acidolyse, Hydrazinolyse oder Reduktion in gewünschter Weise, selektiv oder gleichzeitig entfernbar sein sollen.
Bei einer vorteilhaften Ausführungsweise des Verfahrens wird ein geschütztes Octapeptidamid der allgemeinen Formel II als Ausgangsstoff eingesetzt, welches an der Stelle von X eine tert.-Butyloxycarbonylgruppe und an der Stelle von Y eine tert.-Butyloxygruppe als Schutzgruppen enthält. Dieses geschützte Octapeptidamid wird dann mit einer Lösung des in etwa 20- bis 30fachem Überschuss verwendeten N-Methyl-morpholin-Schwefeltrioxyd-Komplexes in Dioxan oder im Gemisch von Dioxan und Dimethylformamid behandelt und so in das entsprechende Sulfatester übergeführt. Der so erhaltene geschützte Octapeptidamid-sulfatester wird dann mit der wässrigen Lösung von 2-Mol-äquivalenten Natriumhy-droxyd in das Natriumsalz übergeführt und schliesslich werden die tert.-Butyloxycarbonyl- bzw. tert.-Butyloxy-Schutzgruppen mit Hilfe eines Gemisches von 70-85 Vol.% Trifluorsäure, 5-10 Vol.% Mercaptoäthanol, 5-10 Vol.% Wasser und 5-10 Vol.% Anisol oder einer vorteilhaft 3molaren Lösung von Mercaptoäthansulfonsäure in Eisessig entfernt. Auf diese Weise wird der gewünschte Octapeptidamid-sulfatester in für praktische Zwecke genügender Reinheit erhalten; ist es aber doch erforderlich, das Produkt weiter zu reinigen, so wird es auf einer Silicagel-Säule mit dem Gemisch von gleichen Teilen von Äthylacetat und von einem 20:6:11 Gemisch von Pyridin, Essigsäure und Wasser chro-matographiert.
Das als Ausgangsstoff des erfindungsgemässen Verfahrens einzusetzende geschützte Octapeptidamid BOC-Asp(O'Bu)-Tyr-Met-Gly-Trp(FOR)-Met-Asp-Phe-NH2 wird vorteilhaft in der folgenden Weise hergestellt:
L-Methionyl-L-asparagyl-L-phenylalanin-amid wird mit N-tert.-Butyloxycarbonyl-N'-formyl-L-tryptophan-penta-chlorphenylester acyliert und dann wird von dem erhaltenen geschützten Tetrapeptidamid die N-tert.-Butyloxycarbonyl-Schutzgruppe in der üblichen Weise, mit einer N Salzsäurelösung in Eisessig entfernt. Das in dieser Weise erhaltene N'-Formyl-L-tryptophyl-L-methionyl-L-asparagyl-L-phenyl-alanin-amid wird mit tert.-Butyloxycarbonyl-L-methionyl-glycin-pentachlorphenylester acyiiert. Das erhaltene geschützte Hexapeptidamid wird in der üblichen Weise isoliert, die tert.-Butyloxycarbonyl-Schutzgruppe wird entfernt und das erhaltene L-Methionyl-glycyl-N'-formyl-L-trypto-phyl-L-methionyl-L-asparagyl-phenylalanin-amid mit tert.-Butyl-L-tyrosin-trichlorphenylester acyliert. Nach dem in üblicher Weise durchgeführten Abtrennen des Produkts und Entfernen der Schutzgruppe wird das erhaltene L-Tyrosyl-L-methionyl-glycyl-N'-formyl-L-typtophyl-L-methionyl-L-asparagyl-L-phenylalanin-amid mit tert.-Butyloxycarbonyl-ß-tert.-butyl-L-asparaginsäure-pentachlorphenylester acyliert, wobei als Produkt das gewünschte geschützte Octapeptidamid erhalten wird.
Das erfindungsgemäss in hoher Reinheit und hoher Ausbeute erhältliche Octapeptidamidsulfatester der Formel I ist sowohl in seinen charakteristischen physikochemischen Eigenschaften, als auch in seinen pharmakologischen Wirkungen mit dem nach bekannten Methoden erhaltenen Produkt identisch. In Dosen von 2 bis 10 mg/kg i.V. an Hunden verursacht diese Verbindung eine erhebliche Kontraktion der Gallenblase und eine Relaxation des Sphincter Oddii. Das Produkt kann sowohl für diagnostische, als auch für therapeutische Zwecke verwendet werden. Zur parenteralen (intravenösen oder subcutanen) Verabreichung, sowie zur Herstellung von buccalen Präparaten wird das Octapeptidamid-sul-
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fatester in üblicher Weise in pharmazeutisch anwendbare Salze übergeführt.
Die in dieser Beschreibung verwendeten Abkürzungen bzw. Kurzbezeichnungen von Aminosäuren und Peptidderi-vaten entsprechen der von IUPAC-IUB empfohlenen Nomenklatur, vgl. J. Biol. Chem. 247,977 (1972); ferner wurden noch die folgenden Abkürzungen verwendet:
BOC = tert.-Butyloxycarbonyl,
Cbz = Carbobenzoxy,
Ddz = a,a-Dimethyl-3,5-dimethoxybenzyloxycar-bonyl,
O'Bu = tert.-Butyloxy,
OBzl = Benzyloxy,
FOR = Formyl.
Das erfindungsgemässe Verfahren, sowie die Herstellung der Ausgangsstoffe bzw. Zwischenprodukte wird in dem nachstehenden Beispiel näher veranschaulicht. Die in dem Beispiel angegebenen Schmelzpunkte wurden in einem Dr. Tottoli-Apparat (Hersteller: Firma Büchi, Schweiz) ermittelt. Die dünnschichtchromatographischen Untersuchungen wurden an Silicagelplatten («Silicagel nach Stahl»), mit den folgenden Lösungsmittelsystemen durchgeführt:
(1) Äthylacetat - (Pyridin-Essigsäure-Wasser 20:6:11) = 1:1
(2) Äthylacetat - (Pyridin-Essigsäure-Wasser 20:6:11) = 6:4
(3) Äthylacetat - (Pyridin-Essigsäure-Wasser 20:6:11) = 8:2
Die bei den Rf-Werten in Klammern angegebenen Zahlen beziehen sich auf die obigen Lösungsmittelsysteme.
Beispiel 1
L-Asparagyl-O-sulfato-L-tyrosyl-L-methionyl-glycyl-L-tryptophyl-L-methionyl-L-asparagyl-L-phenylalanin-amid
1,6 ml (25 mmol) Chlorsulfonsäure werden in 2 ml Chloroform gelöst und bei -10°C, unter lebhaftem Rühren mit der Lösung von 3,3 ml (30 mmol) N-methylmorpholin im Gemisch von 3 ml Dioxan und 3 ml Dimethylformamid versetzt. Der entstandenen Suspension wird nach 5 Minuten die Lösung von 1,25 g (1,0 mmol) tert.-Butyloxycarbonyl-ß-tert.-butyl-L-asparagyl-L-tyrosyl-L-methionyl-glycyl-N'-formyl-L-tryptophyl-L-methionyl-L-asparagyl-L-phenylalanyl-amid in 8 ml Dimethylformamid zugesetzt. Das Gemisch wird bei Raumtemperatur 3 Stunden gerührt, dann auf 0°C abgekühlt und unter Rühren mit 5 ml 4 N Natronlauge versetzt. Die Lösung wird zur Trockne verdampft, der Rückstand mit 20 ml auf 0°C abgekühltem Wasser verrieben, das unlösliche Produkt abfiltriert, zweimal mit je 20 ml Wasser, dann mit 20 ml Äther einmal gewaschen. Der auf diese Weise erhaltene rohe geschützte Octapeptidamid-sulfatester wird dann im Gemisch von 25 ml Methanol und 25 ml Wasser gelöst und der pH-Wert der Lösung mit 2 ml 4 N Natronlauge auf 8 eingestellt. Nach 20 Minuten wird die Lösung eingedampft, der Rückstand mit einem 1:1 Gemisch von Aceton und Äther verrieben, abfiltriert und mit Äther gewaschen. Das auf diese Weise erhaltene Produkt wird im auf 0°C abgekühlten Gemisch von 8 ml Trifluoressigsäure, 1 ml Wasser, 1 ml Anisol und 1 ml Mercaptoäthanol gelöst, die Lösung 3 Stunden bei 15 bis 20°C stehen gelassen und dann unter Rühren in 100 ml Äther gegossen. Es werden auf diese Weise 0,90 g L-Asparagyl-O-sulfato-L-tyrosyl-L-methionyl-glycyl-L-tryptophyl-L-methionyl-L-asparagyl-L-phenylalanin-amid (77% d.Th.) erhalten; Rf (1) = 0,4. Falls das erhaltene Endprodukt noch Verunreinigungen enthält, kann es durch Chromatographieren an einer 80 g Silicagel enthaltenden Säule gereinigt werden; als Eluiermittel wird das 37:20:6:11 Gemisch von Äthylacetat, Pyridin, Eisessig und Wasser verwendet.
Das als Ausgangsstoff der obigen Synthese dienende tert.-Butyloxycarbonyl-ß-tert.-butyl-L-asparagyl-L-tyrosyl-L-methionyl-glycil-N'-formyl-L-tryptophyl-L-methionyl-L-asparagyl-L-phenylalanin-amid kann am vorteilhaftesten in der folgenden Weise hergestellt werden:
a) N-tert.-Butyloxycarbonyl-N'-formyl-L-tryptophyl-L-methionyl-L-asparagyl-L-phenylalanin-amid
22,34 g (50 mmol) L-Methionyl-L-asparagyl-L-phenyl-alanin-amid-hydrochlorid - hergestellt nach I.M. Davey, A.H. Laird, I.S. Morley: J. Chem. Soc. 1966,555 - werden in 200 ml Dimethylformamid gelöst, mit 11,1 ml (100 mmol) N-Methylmorpholin und 28,9 g (50 mmol) N-tert.-Butyloxy-carbonyl-N'-formyl-L-tryptophan-pentachlorphenylester versetzt. Der pH-Wert der Lösung wird durch die Zugabe von weiterem N-Methylmorpholin auf 7-7,5 eingestellt. Nach 12 Stunden wird das Reaktionsgemisch auf 50 ml Volumen eingedampft und unter lebhaftem Rühren in das auf 0°C abgekühlte Gemisch von 200 ml 5%iger KaliumhydrogensulfatlÖ-sung und 100 ml peroxydfreiem Äther gegossen. Das gefällte Produkt wird abfiltriert, mit Äther gewaschen und getrocknet. Es werden 26 g reines BOC-Tetrapeptidamid (72% d.Th.) erhalten; F. 209°C; [a]** = -22° (c = 2, in Dimethylformamid); Rf(2) = 0,7.
b) tert.-Butyloxycarbonyl-L-methionyl-glycin-pentachlor-phenylester
1,9 g (6,2 mmol) tert.-Butyloxycarbonyl-L-methionyl-glycin - hergestellt nach M.A. Ondetti, I. Pluscec, E.F. Sabo, J.T. Sheehan, N. Williams: J. Am. Chem. Soc. 92,195 (1970) -und 1,92 g (7,2 mmol) Pentachlorphenol werden in 31 ml Dimethylformamid gelöst. Das Gemisch wird auf 0°C abgekühlt, unter Rühren mit der Lösung von 1,41 g (6,85 mmol) Dicyclohexylcarbodiimid in 6,2 ml Dimethylformamid tropfenweise versetzt und bei der selben Temperatur eine Stunde gerührt. Das Reaktionsgemisch wird über Nacht bei Raumtemperatur stehen gelassen, dann wird der ausgeschiedene Dicyclohexylharnstoff durch Filtrieren entfernt und das Filtrat unter vermindertem Druck eingedampft. Der Verdampfungsrückstand wird mit Äther verrieben, filtriert, mit wenig Äther gewaschen und aus einer fünfzehnfachen Menge von Äthanol umkristallisiert. Es werden auf diese Weise 2,19 g tert.-Butyloxycarbonyl-L-methionyl-glycin-pentachlor-phenyl-ester (63,6% d.Th.) erhalten; F. 169-171 °C; Rf = 0,8 (Chloroform-Methanol 8:2).
c) tert.-Butyloxycarbonyl-L-methionyl-glycyl-N'-formyl-L-tryptophyl-L-methionyl-L-asparagyl-L-phenylalanin-amid
25,3 g (35 mmol) N-tert.-Butyloxycarbonyl-N'-formyl-L-tryptophyl-L-methionyl-L-asparagyl-L-phenylalanyl-amid werden in 120 ml N Salzsäurelösung in Eisessig gelöst. Nach 90 Minuten wird die Lösung auf halbes Volumen eingedampft und durch Zugabe von 500 ml Äther wird das Tetra-peptidamid-hydrochlorid gefällt. Das erhaltene Salz wird abfiltriert, mit Äther gewaschen und getrocknet. Es werden 20,3 g N'-Formyl-L-tryptophyl-L-methionyl-L-asparagyl-L-phenylalanyl-amid-hydrochlorid (88% d.Th.) erhalten; F.: 207-209°C.
3,3 g (5 mmol) des obigen Tetrapeptidamid-hydrochlorids und 2,77 g (5 mmol) tert.-Butyloxycarbonyl-L-methionyl-glycin-pentachlorphenylester werden in 25 ml Dimethylformamid gelöst und mit 1,11 ml (10 mmol) N-Methyl-morpholin versetzt. Nach 24 Stunden wird das Reaktionsgemisch im Vakuum auf halbes Volumen eingedampft, dann unter Rühren in das Gemisch von 50 ml 5%iger Kaliumhydrogensulfatlösung und 30 ml Äther gegossen. Der Niederschlag
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wird abfiltriert, mit Wasser und dann mit Äther gewaschen und getrocknet. Es werden 3,7 g tert.-Butyloxycarbonyl-L-methionyl-glycyl-N'-formyl-L-tryptophyl-L-methionyl-L-asparagyl-L-phenylalanin-amid (81% d.Th.) erhalten; F. 175-179°C; Rf (3) = 0,45.
d) tert.-Butyloxycarbonyl-L-tyrosyl-L-methionyl-glycyl-N'-formyl-L-tryptophyl-L-methionyl-L-asparagyl-L-phenyl-alanin-amid.
3,65 g (4 mmol) tert.-Butyloxycarbonyl-L-methionyl-glycyl-N'-formyl-L-tryptophyl-L-methionyl-L-asparagyl-L-phenylalanyl-amid werden in 15 ml N Salzsäurelösung in Eisessig gelöst. Nach 30 Minuten wird das Hexapeptidamid-hydrochlorid durch die Zugabe von 300 ml Äther gefällt, abfiltriert, mit Äther gewaschen und getrocknet. Es werden 3,2 g L-Methionyl-glycyl-N'-formyl-L-tryptophyl-L-me-thionyl-L-asparagyl-L-phenylalanin-amid-hydrochlorid (94% d.Th.) erhalten; F.: 130-132°C.
3,2 g (3,77 mmol) obiges Hexapeptidamid-hydrochlorid und 1,84 g (4 mmol) tert.-Butyloxycarbonyl-L-tyrosin-2,4,5-trichlorphenylester werden in 25 ml Dimethylformamid gelöst und mit 0,9 ml (8 mmol) N-Methylmorpholin versetzt. Das Reaktionsgemisch wird 24 Stunden stehen gelassen, dann auf halbes Volumen eingedampft und unter Rühren in das Gemisch von 50 ml 5%iger Kaliumhydrogensulfatlösung und 30 ml Äther gegossen. Der Niederschlag wird abfiltriert, mit Wasser, dann mit Äther gewaschen und getrocknet. Es werden 3,7 g tert.-Butyloxycabonyl-L-tyrosyl-L-methionyl-
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glycyl-N'-formyl-L-tryptophyl-L-methionyl-L-asparagyl-L-phenylalanin-amid (92% d.Th.) erhalten; Rf (3) = 0,55.
e) tert.-Butyloxycarbonyl-ß-tert.-butyl-L-asparagyl-L-tyr-5 osyl-L-methionyl-glycyl-N'-formyl-L-tryptophyl-L-me-thionyl-L-asparagyl-L-phenylalanin-amid
3,7 g (3,45 mmol) tert.-Butyloxycarbonyl-L-tyrosyl-L-me-thionyl-glycyl-N'-formyl-L-tryptophyl-L-methionyl-L-aspa-ragyl-L-phenylalnin-amid werden in 15 ml N Salzsäurelö-lo sung in Eisessig gelöst. Nach 30 Minuten wird durch Zugabe von 300 ml Äther das Heptapeptidamid-hydrochlorid gefällt, abfiltriert, mit Äther gewaschen und getrocknet. Es werden 3,45 g L-tyrosyl-L-methionyl-glycyl-N'-formyl-L-tryptophyl-L-methionyl-L-asparagyl-L-phenylalanin-amid-hydrochlorid 15 (99% d.Th.) erhalten.
3,04 g (3,0 mmol) des in obiger Weise erhaltenen Heptapep-tidamid-hydrochlorids und 1,7 g (3,17 mmol) tert.-Butyloxy-carbonyl-ß-tert.-butyl-asparaginsäure-pentachlorphenylester werden in 20 ml Dimethylformamid gelöst und mit 0,7 ml 20 (6,3 mmol) N-Methylmorpholin versetzt. Das Reaktionsgemisch wird 24 Stunden stehen gelassen, dann unter Rühren in das Gemisch von 50 ml 5%iger Kaliumhydrogensulfatlösung und 30 ml Äther gegossen. Der Niederschlag wird abfiltriert, mit Wasser und dann mit Äther gewaschen und getrocknet. 25 Es werden auf diese Weise 3,01 g tert.-Butyloxycarbonyl-ß-tert.-butyl-L-asparagyl-L-tyrosyl-L-methionyl-glycyl-Ni-formyl-L-tryptophyl-L-methionyl-L-asparagyl-phenylalanin-amid (80% d.Th.) erhalten, Rf (3) = 0,7.
B
Claims (6)
1. Verfahren zur Herstellung des Cholecystokinin-pan-creozymin-octapeptidamid-sulfatesters der Formel
L-Asp-L-Tyr-L-Met-Gly-L-Trp-L-Met-L-Asp-L-Phe-NH2
SO3H (I)
dadurch gekennzeichnet, dass man ein geschütztes Octapep-tidamid der allgemeinen Formel
X-/|sp-Tyr-Met-GIy-'yrp-Met-Asp-Phe-NH2
Y FOR W (II)
worin
X eine tert.-Butyloxycarbonyl-, Carbobenzoxy- oder a,a-Dimethyl-3,5-dimethoxybenzyloxycarbonylgruppe, Y eine tert.-Butyloxy-, Benzyloxy- oder Hydroxylgruppe, W eine tert.-Butyloxy-, Benzyloxy- oder Hydroxylgruppe, FOR eine Formylgruppe bedeuten,
in Gegenwart eines Äthers mit dem Komplex aus einem mindestens eine Alkylgruppe enthaltenden tertiären Amin und aus Schwefeltrioxyd sulfatiert, den erhaltenen Sulfatester durch Behandlung mit einem Alkalimetallhydroxyd in das Alkalisalz überführt und damit zugleich die an der Trypto-phan-Einheit anwesende Formyl-Schutzgruppe abspaltet, dann die übrigen Schutzgruppen durch Acidolyse entfernt.
2. Verfahren nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man den aus dem tertiären Amin mit Schwefeltrioxyd gebildeten Komplex in einem 20- bis 30fachen Über-schuss verwendet.
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PATENTANSPRÜCHE
3. Verfahren nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man als Amin-Schwefeltrioxyd-Komplex die Komplexverbindung von N-Methyl-morpholin und Schwefeltrioxyd und als Äther Dioxan verwendet.
4. Verfahren nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man ein geschütztes Octapeptidamid der allgemeinen Formel II als Ausgangsstoff verwendet, in welchem die Aminogruppe der N-terminalen Asparaginsäure mit einer tert.-Butyloxycarbonylgruppe und ihre ß-Carboxylgruppe mit einer tert.-Butylestergruppe geschützt ist.
5. Verfahren nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man den erhaltenen geschützten Octapeptid-amid-sulfatester in wässriger Lösung mit Natronlauge in das Natriumsalz überführt und gleichzeitig die Formyl-Schutzgruppe des Tryptophans abspaltet.
6. Verfahren nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man die Schutzgruppen vom Octapeptidamid-sulfatester-dinatriumsalz durch Behandlung mit einem Gemisch von 70-85% Trifluoressigsäure, 5-10% Mercapto-äthanol, 5-10% Wasser und 5-10% Anisol oder mit in Eisessig gelöster Mercaptoäthansulfonsäure abspaltet.
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