DK148235B - Fremgangsmaade til fremstilling af den c-terminale oktapeptid-amid-sulfatester af kolecystokinin-pankreozymin eller et farmaceutisk acceptabelt salt deraf - Google Patents

Description

i 148235

Den foreliggende opfindelse angår en særlig fremgangsmåde til fremstilling af den C-terminale oktapeptidamid-sulfat-ester af kolecystokinin-pankreozymin med formlen L-Asp-L-^yr-L-Met-Gly-L-Trp-L-Met-L-Asp-L-Phe-NHj so3h 1

Hier farmaceutisk acceptable salte af denne ester.

Ivy og Oddberg (Amer. J. Physiol. 86, 599 (1928)) har i året 1928 fra tarmslimhinden isoleret en forbindelse der fremkalder kontraktion af galdeblæren, hvilken forbindelse de betegner kole-cystokinin. Senere har Harper og Raper (J. Physiol. 102, 115 (1943)) fra tarmslimhindeekstrakter isoleret en forbindelse, kaldet pankreo-zymin, som forøger bugspytkirtlens enzymsekretion. Mutt og Joopes (Acta Chem. Scand. 18, 2408 (1964)) har derpå eftervist at det er den samme forbindelse, nemlig det hormon der af sidstnævnte forfattere betegnes kolecystokinin-pankreozymin, der er ansvarlig for disse to forskellige biologiske virkninger. De samme forskere har også opklaret dette hormons aminosyresekvens (Biochem. J. 125, 678 (1971)): Lys-Ala-Pro-Ser-Gly-Arg-Val-Ser-Met-Ile-Lys-Asn-Leu-Gln-Ser-Leu-Asp-Pro-Ser-His-Arg-Ile-Ser-Asp-Arg-Asp-Tyr(SOgH)-Met-Gly-Trp-Met-Asp-Phe-NH2· Ondetti og Pluscec har syntetiseret den C-terminale oktapeptidamid-sulfatester af kolecystokinin- pankreozymin samt talrige analoger og har fundet at oktapeptidamid-sulfatesteren, samt nogle analoge dertil, er væsentligt mere virksomme end det samlede molekyle (J. Am. Chem. Soc. 92, 195 (1970); J. Med. Chem.

13, 349 (1970) samt ungarske patentskrifter nr. 162.875 og 163.626).

Denne oktapeptidamid-sulfatester kan i doser på ca. 10-6 mg/kg anvendes som et nyttigt diagnostisk middel i stedet for kolecystokinin-pankreozymin ved undersøgelse af galdeblærekontraktion og bugspytkirtelsekretion (jvf. ungarsk patentskrift nr. 162.875). Ved de nyere undersøgelser blev det også fastslået, at oktapeptidamid-sulfatester udøver en kraftig relaxerende virkning på ringmusklerne sphincter oddii, hvorved denne ester også kan indføres i terapien til afspænding af de kramper der optræder efter galdeblæreoperationer (jvf. M.A. Ondetti, B. Rubin og S. Engel: ' J. Amer. Digestive Diseases 15, 149 (1970)).

148235 2

En fremgangsmåde til fremstilling af denne oktapeptidamid-sulfatester blev også kendt fra arbejder af Ondetti et al (ungarsk patentskrift 162.875, tysk offentliggørelsesskrift 1.922.185, J.

Am. Chem. Soc. 92, 195 (1970)). Det beskyttede oktapeptidamid og de til dets syntese nødvendige mellemprodukter fremstilles ifølge kendte peptidkemiske metoder, hvorpå tyrosindelen sulfateres på i litteraturen kendt måde ved behandling med komplexforbindelsen af pyridin og svovltrioxyd og til sidst fjernes beskyttelsesgrupperne ved acidolyse med trifluoreddikesyre. Denne fremgangsmåde giver udbytter på ca. 30%. Ved en anden metode af de samme forfattere,, jvf. også DK fremlæggelsesskrift nr. 132.074, behandles det frie oktapeptidamid ved lav temperatur med koncentreret svovlsyre, eller med en blanding af svovlsyre og kaliumbisulfat, hvorved oktapeptidamid-sulfatesteren vindes i udbytter på henholdsvis 10% og 60%. Imidlertid fremkommer der som biprodukt en betydelig mængde af et peptid, der indeholder sulfoneret tyrosin, ved denne metode.

Det har nu vist sig at sulfateringen af det beskyttede oktapeptidamid kan fremmes væsentligt, når man i stedet for pyridin/ svovltrioxyd-komplexet anvender· et komplex af N-alkylmorfolin med 1-4 kulstofatomer i alkyIdelen og svovltrioxyd i nærværel se af en æter. Det viste sig også at den i litteraturen til beskyttelse af tryptofan mod tert-butylering og oxydation anbefalede N^formylgruppe (jvf. D. Yamashiro og C.H. Li, J. Org. Chem. 38, 2594 (1973)) på overraskende måde også med succes kan anvendes til beskyttelse af tryptofan mod sulfonering under fremstillingen af sulfatesteren. Ved fjernelsen af beskyttelsesgrupperne ved acidolyse viste der sig desuden det interessante, at den ellers kendte sure hydrolyse af sulfatestergruppen selv ved længere behandling i flere timer ikke indtræder, hvis man behandler et alkalimetalsalt af det beskyttede oktapeptidamid med overskud af trifluor-eddikesyre eller merkaptoætansulfonsyre. Ved anvendelsen af disse tre hidtil ukendte foranstaltninger kan man altså ved fremstillingen af oktapeptidamid-sulfatesteren opnå væsentligt bedre resultater sammenlignet med de i litteraturen kendte metoder.

Genstanden for den foreliggende opfindelse er altså en hidtil ukendt fremgangsmåde til fremstilling af L-aspartyl—(O-sulfat-L-tyrosyl)-L-metiony1-glycyl-L-tryptofyl-L-metionyl-L-asparty1-L-fenylalaninamid, dvs. sulfatesteren af det C-terminale oktapep- 3 148235 tidamid af kolecystokinin-pankreozymin, eller et farmaceutisk acceptabelt salt deraf, hvilken fremgangsmåde er ejendommelig ved at man sulfaterer et beskyttet oktapeptidamid med den almene formel

X-^sp-Tyr-Met-Gly-Trp-Met-Asp-Phe-NH2 II

Y ^OR W

hvor X er en tert-butyloxykarbonyl-, karbobenzoxy- eller α,α-dimetyl-3,5-dimetoxybenzyloxykarbonylgruppe, Y er en tert-butyloxy-, benzyloxy- eller hydroxylgruppe, W er en tert-bu-tyloxy-, benzyloxy- eller hydroxylgruppe og FOR er en formyl-gruppe, i nærværelse af en æter med et kompleks af N-alkyl-morfolin med 1-4 kulstofatomer i alkyldelen og svovltrioxyd, omdanner den vundne sulfatester til et alkalimetalsalt ved behandling med et alkalimetalhydroxyd og dermed samtidigt fraspalter den på tryptofan-enheden værende formyl-beskyttel-sesgruppe, hvorpå man fjerner de øvrige beskyttelsesgrupper ved acidolyse med overskud af trifluoreddikesyre i en blanding af vand, anisol og merkaptoætanol eller med merkaptoætansulfon-syre i iseddike, hvorpå man om ønsket omdanner den vundne okta-peptidamid-sulfatester til et farmaceutisk acceptabelt salt deraf.

Som N-alkylmorfolin med 1-4 kulstofatomer i alkyldelen anvendes navnlig N-metylmorfolin; komplexforbindelsen af N-alkyl-morfolin kan fremstilles på kendt måde, fx ved at omsætte N-alkylmorfolinen med klorsulfonsyre. Da det som udgangsmateriale ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen tjenende beskyttede okta-peptid omsættes i nærværelse af en æter, fortrinsvis dioxan, med komplexforbindelsen af N-alkylmorfolin/svovltrioxyd, er det hensigtsmæssigt allerede at gennemføre dannelsen af komplexet i en æterholdig reaktionsblanding, fx i en blanding af dioxan og dimetyl-formamid.

Det som udgangsmateriale indførte beskyttede oktapeptidamid kan opbygges på i og for sig kendt måde ved fragmentkondensation eller ved skridtvis forløbende tilknytning af de enkelte aminosyrer i sekvensen, idet der kan anvendes de kendte peptidkemiske syntesemetoder, acylering med blandede anhydrider, med aktive 148235 4 estre, med azider eller i nærværelse af dicyklohexylkarbodiimid, eller også den såkaldte syntese i fast fase, ved hvilken den med sin karboxylgruppe i en fast polymerbærer bundne C-terminale aminosyre tjener som udgangsforbindelse til den trinvise acylering.

De i reaktionen ikke deltagende funktionelle grupper beskyttes hensigtsmæssigt ved gennemføringen af reaktionen. Til beskyttelsen af sådanne grupper anvendes sådanne i sig selv kendte beskyttelsesgrupper, som let kan fjernes efter reaktionen, navnlig ved hydrolyse, acidolyse, hydrazinolyse eller reduktion. Indol-nitrogenatomet i tryptofan beskyttes med en formylgruppe, da denne beskyttelsesgruppe ved den under opbygningen af peptidmolekylet gennemførte acidolyse forhindrer dannelsen af uønskede tert-butylderivater.

Ved anvendelsen af passende kombinationer af beskyttelsesgrupper kan man opnå, at disse på forskellige steder i peptidkæden anvendte beskyttelsesgrupper efter kendte metoder, fx ved hydrolyse, acidolyse, hydrazinolyse eller reduktion, på ønsket måde skal kunne fjernes selektivt eller samtidigt.

Ved en fordelagtig udførelsesform for fremgangsmåden anvendes der som udgangsmateriale et beskyttet oktapeptidamid med den almene formel II, der i stillingen X som beskyttelsesgruppe indeholder en tert-butyloxykarbonylgruppe og i stillingen Y en tert-butyloxygruppe. Dette beskyttede oktapeptidamid behandles derpå med det i et overskud på 20-30 gange anvendte N-metylmorfolin/svovl-trioxydkomplex i dioxan eller i en blanding af dioxan og dimety1-formamid, hvorved det omdannes til den tilsvarende sulfatester.

Den således vundne beskyttede oktapeptidamid-sulfatester omdannes . derefter til natriumsaltet med en vandig opløsning af 2-molækvi-valenter natriumhydroxyd og til sidst fjernes tert-butyloxykarbo-nyl- og tert-butyloxy-beskyttelsesgruppen ved hjælp af en blanding af 70-85 rumfangs% trifluoreddikesyre, 5-10 rumfangs% merkap-toætanol, 5-10 rumfangs% vand og 5-10 rumfangs% anisol eller en fortrinsvis 3-molær opløsning af merkaptoætansulfonsyre i iseddike.

På denne måde vindes den ønskede oktapeptidamid-sulfatester i en til praktiske formål tilstrækkelig renhed. Det er dog hensigtsmæssigt at rense produktet yderligere, hvorved det kromatograferes på en silikagel-søjle med en blanding af lige dele ætylacetat og en blanding i forholdet 20:6:11 af pyridin, eddikesyre og vand.

5 148235

Det som et udgangsmateriale ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen anvendte beskyttede oktapeptidamid, BOC-Asp(C^Bu)-Tyr-Met-Gly-Trp(POR)-Met-Asp-Phe-NH2 fremstilles med fordel på følgende måde: L-Metionyl-L-aspartyl—L-fenylalanin-amid acyleres med N-tert-butyloxykarbonyl-N1-formyl-L-tryptofan-pentaklorfenylester og derpå fjernes fra det vundne beskyttede tetrapeptidamid N-tert-butyloxykarbonyl-beskyttelsesgruppen på sædvanlig måde med IN saltsyreopløsning i iseddike. Det på denne måde vundne N1-formyl-L-tryptofyl-L-metionyl-L-aspartyl—L-fenylalanin-amid acyleres med tert-butyloxykarbonyl-L-metionyl-glycin-pentaklorfenyl-ester. Det vundne beskyttede hexapeptidamid isoleres på almindelig måde, tert-butyloxykarbonyl-beskyttelsesgruppen fjernes og det vundne L-metionyl-glycyl-N1-formyl-L-tryptofyl-L-metionyl-L-as-partyl-fenylalanin-amid acyleres med tert-butyl-L-tyrosin-triklor-fenylester. Efter på sædvanlig måde gennemført udskillelse af produktet og fjernelse af beskyttelsesgruppen acyleres det vundne L-tyrosyl-L-metionyl-glycyl-N1-formyl-L-tryptofyl-L-metionyl-L-aspartyl—L-fenylalanin-amid med tert-butyloxykarbonyl-p-tert-bu-tyloxyL-asparaginsyre-pentaklorfenylester, hvorved der som produkt vindes det ønskede beskyttede oktapeptidamid.

Den oktapeptidamidsulfatester med formel I, der ifølge opfindelsen kan vindes med høj renhed og i højt udbytte, er såvel med hensyn til dens karakteristiske fysiokemiske egenskaber som også med hensyn til dens farmakologiske virkninger identisk med det ifølge kendte metoder vundne produkt. I doser på 2-10 mg/kg i.v. til hunde giver disse forbindelser en betydelig kontraktion af galdeblæren og en relaxation af sphincter oddii. Produktet kan anvendes til såvel diagnostiske som terapeutiske formål. Til parenteral (intravenøs eller subkutan) indgift samt til fremstilling af buccale præparater omdannes oktapeptidamid-sulfatesteren på sædvanlig måde til farmaceutisk anvendelige salte.

De i den foreliggende beskrivelse og i kravene anvendte forkortelser for aminosyrer og peptidderivater svarer til den af IUPAC-IUB anbefalede nomenklatur, jvf. J. Biol. Chem. 247, 977 (1972) ·, desuden anvendes også følgende forkortelser: 148235 6 BOC = tert-butyloxykarbonyl Cbz = karbobenzoxy

Ddz = a,a-dimetyl-3,5-dimetoxybenzyloxykarbony1 O^u = tert-butyloxy OBzl = benzyloxy FOR = formyl

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen samt fremstilling af udgangsforbindelsen og mellemprodukter belyses nærmere i følgende eksempel. De i eksemplet angivne smeltepunkter bestemtes ved hjælp af et dr. Tottoli-apparat (fremstillet af firmaet Biichi, Schweiz). De tyndlagskromatografiske undersøgelser gennemførtes på silikagelplader ("Siiicagel ifølge Stahl"), med følgende opløsningsmiddelsystemer: 1) ffitylacetat/(pyridin/eddikesyre/vand 20:6:11) = 1:1 2) Ætylacetat/(pyridin/eddikesyre/vand 20:6:11) = 6:4 3) Ætylacetat/(pyridin/eddikesyre/vand 20:6:11) = 8:2

De ved R^-værdierne i klammerne angivne tal henviser til de Ovenfor beskrevne opløsningssystemer.

7 148235

Eksempel 1 L-Aspartyl—O-sulfato-L-tyrosyl-L-metionyl-glycyl-L-tryptofyl-L- metionyl-L-aspartyl—L-fenylalanin-amld_ 1,6 ml (25 mmol) klorsulfonsyre opløses i 2 ml kloroform og ved -10°C under kraftig omrøring tilsættes en opløsning af 3,3 ml (30 mmol) N-metylmorfolin i en blanding af 3 ml dioxan og 3 ml dimetylformamid. Til den fremkomne suspension sættes efter 5 minutter en opløsning af 1,25 g (1,0 mmol) tert-butyloxykarbonyl-e-tert-bu-tyloxy-aspartyl-L-tyrosyl-L-metionyl-glycyl-N1-formyl-L-tryptofyl-L-metionyl-L-aspartyl—L-fenylalanyl-amid i 8 ml dimetylformamid. Blandingen omrøres ved stuetemperatur i 3 timer, afkøles derefter til 0°C og under omrøring tilsættes 5 ml 4N natriumhydroxyd. Opløsningen inddampes til tørhed, remanensen rives med 20 ml til 0°C afkølet vand, det uopløselige produkt frafiltreres, og der vaskes to gange med hver 20 ml vand og derpå 1 gang med 20 ml æter. Den på denne måde vundne rå beskyttede oktapeptidamid-sulfatester opløses derpå i en blanding af 25 ml metanol og 25 ml vand og opløsningens pH-værdi indstilles på 8 med 2 ml 4N natriumhydroxyd. Efter 20 minutter inddampes opløsningen, remanensen rives med en blanding af acetone og æter i forholdet 1:1, frafiltreres og vaskes med æter. Det på denne måde vundne produkt opløses i en til 0°C afkølet blanding af 8 ml trifluoreddikesyre, 1 ml vand, 1 ml anisol og 1 ml merkaptoætanol, opløsningen henstår i 3 timer ved 15-20°C og derpå udhældes den under omrøring i 100 ml æter. På denne måde vindes 0,90 g (77% af det teoretiske) L-aspartyl-O-sulfato-L-tyrosyl-L-metionyl-glycyl-L-tryptofyl-L-metionyl-L-aspartyl—L-fenylalanin-amid med Rf (1) = 0,4.

Det som udgangsmateriale ved ovennævnte syntese tjenende tert-butyloxykarbonyl-Ø-tert-butyloxy-L-aspartyl-L-tyrosyl-L-metio-nyl-N1-formyl-L-tryptofyl-L-metionyl-L-aspartyl-—L-fenylalanin-amid kan på den mest fordelagtige måde fremstilles som følger: a) N-tert-Butyloxykarbonyl-I^-formyl-L-tryptofyl-L-metionyl-L- aspar-tyl-—L-fenylalanin-amid_ 22,34 g (50 mmol) L-metionyl-L-aspartyl—L-fenylalanin-amid-hydroklorid, fremstillet ifølge I.M. Davey, A.H. Laird og I.S.

8 148235

Morley: J. Chem. Soc. 1966, 555, opløses i 200 ml dimetylformamid og der tilsættes 11,1 ml {100 mmol) N-metylmorfolin og 28,9 g (50 mmol) N-tert-butyloxykarbonyl-N1-form.yl-L-tryptofan-pentaklor-fenylester. Opløsningens pH-værdi indstilles på 7-7,5 ved tilsætning af yderligere N-metylmorfolin. Efter 12 timer inddampes reaktionsblandingen til et rumfang på 50 ml og under kraftig omrøring udhældes den i en til 0°C afkølet blanding af 200 ml 5%s kaliumhydrogensulfatopløsning og 100 ml peroxydfri æter. Det udfældede produkt frafiltreres, vaskes med æter og tørres. Der vindes 26 g (72% af det teoretiske) rent BOC-tetrapeptidamid med smp. 209°C [o]p° = -22° (c = 2 i dimetylformamid), Rf (2) = 0,7.

b) Tert-butyloxykarbonyl-L-metionyl-glycin-pentaklorfenylester 1/9 g (6,2 mmol) tert-butyloxykarbonyl-L-metionyl-glycin, fremstillet ifølge M.A. Ondetti, I. Pluscec, E.F. Sabo, J.T.

Sheehan og N. Williams: J. Am. Chem. Soc. 92, 195 (1970), og 1,92 g (7,2 mmol) pentaklorfenol opløses i 31 ml dimetylformamid. Blandingen afkøles til 0°C og under omrøring tilsættes dråbevis en opløsning af 1,41 g (6,85 mmol) dicyklohexylkarbodiimid i 6,1 ml dimetylformamid og der omrøres 1 time ved samme temperatur. Reaktionsblandingen henstår natten over ved stuetemperatur hvorpå det udskilte dicyklohexylurinstof fjernes ved filtrering og filtratet inddampes under nedsat tryk. Inddampningsremanensen rives med æter, filtreres, vaskes med en lille smule æter og omkrystalliseres fra den 15-dobbelte mængde ætanol. På denne måde vindes 2,19 g (63,6% af det teoretiske) tert-butyloxykarbonyl-L-metionyl-glycin-pentaklorfenyl-ester med smp. 169-171°C, R^ = 0,8 (kloroform/ metanol 8:2).

c) Tert-butyloxykarbonyl-L-metionyl-glycyl-N^-formyl-L-tryptofyl- L-metionyl-L-aspartyl—L-fenylalanin-amid_ 25.3 g (35 mmol) N-tert-butyloxykarbonyl-N1-formyl-L-trypto-fyl-L-metionyl-L-aspartyl—L-fenylalanyl-amid opløses i 120 ml N saltsyreopløsning i iseddike. Efter 90 minutter inddampes opløsningen til det halve rumfang og ved tilsætning af 500 ml æter udfældes tetrapeptidamid-hydrokloridet. Det vundne salt frafiltreres, vaskes med æter og tørres. Der vindes 20,3 g (88% af det teoretiske) N^-formyl-L-tryptofyl-L-metionyl-L-aspartyl—L-fenylalanyl-amid-hydroklorid med smp. 207-209°C.

3.3 g (5 mmol) af det ovennævnte tetrapeptidamid-hydroklorid og 2,77 g (5 mmol) tert-butyloxykarbonyl-L-metionyl-glycin-penta- 9 148235 klorfenylester opløses i 25 ml dimety lf ormamid og der tilsættes 1,11 ml (10 mmol) N-metylmorfolin. Efter 24 timer inddampes reaktionsblandingen under vakuum til det halve rumfang hvorpå den under omrøring udhældes i en blanding af 50 ml 5%s kaliumhydrogen-sulfatopløsning og 30 ml æter. Bundfaldet frafiltreres, vaskes med vand og derpå med æter og tørres. Der vindes 3,7 g (81% af det teoretiske) tert-butyloxykarbonyl-L-metionyl-glycyl-N1-formyl-L-tryptofyl-L-metionyl-L-aspartyl—L-fenylalanin-amid med smp. 175-179°C, Rf (3) = 0,45.

d) Tert-butyloxykarbonyl-L-tyrosyl-L-metionyl-glycyl-N1-formyl-L-tryptofyl-L-metionyl-L-asparty1—L-fenylalanin-amid.

3,65 g (4 mmol) tert-butyloxykarbonyl-L-metionyl-glycyl-N1-fornyl-L-tryptofyl-L-metionyl-L-aspartyl—L-fenylalanyl-amid opløses i 15 ml N saltsyreopløsning i iseddike. Efter 30 minutter fældes hexapeptidamid-hydrokloridet ved tilsætning af 300 ml æter, og det frafiltreres, vaskes med æter og tørres. Der vindes 3,2 g (94% af det teoretiske) L-metionyl-glycyl-N1-formyl-L-tryptofyl-L-metionyl-L-aspartyl—L-fenylalanin-amid-hydroklorid med smp. 130-132°C.

3,2 g (3,77 mmol) af det ovennævnte hexapeptidamid-hydro-klorid og 1,84 g (4 mmol) tert-butyloxykarbonyl-L-tyrosin-2,4,5-triklorfenylester opløses i 25 ml dimetylformamid og der tilsættes 0,9 ml (8 mmol) N-metylmorfolin. Reaktionsbiåndingen henstår i 24 timer hvorpå den inddampes til det halve rumfang og under omrøring udhældes den i en blanding af 50 ml 5%s kaliumhydrogensul-fatopløsning og 30-ml æter. Bundfaldet frafiltreres, vaskes med vand og derpå med æter og tørres. Der vindes 3,7 g (92% af det teoretiske) tert-butyloxykarbonyl-L-tyrosyl-L-metionyl-glycyl-N1-formyl-L-tryptofyl-L-metionyl-L-aspartyl—L-fenylalanin-amid,

Rf (3) = 0,55.

e) Tert-butyloxykarbonyl-p-tert-butyloxy-L-aspartyl-L-tyrosyl-L- metionyl-glycyl-N1-formyl-L-tryptofyl-L-metionyl-L-aspartyl-L—f enylalanin-L—amid__ 3,7 g (3,45 mmol) tert-butyloxykarbonyl-L-tyrosyl-L-metionyl-glycyl-N1-forny1-L-tryptofy1-L-metiony1-L-aspartyl-L-fenylalanin-amid opløses i 15 ml N saltsyreopløsning i iseddike. Efter 30 minutter udfældes heptapeptidamid-hydrokloridet ved tilsætning af 300 ml æter og det frafiltreres, vaskes med æter og tørres. Der vindes 3,45 g (99% af det teoretiske) L-tyrosyl-L-metionyl-glycyl- 148235 ίο N^-formyl-L-tryptofyl-L-metionyl-L-aspartyl— L-fenylalanin-amid-hydroklorid.

3,04 g (3,0 mmol) af det på den ovenfor beskrevne måde vund-ne heptapeptidamid-hydroklorid og 1,7 g (3,17 mmol) tert-butyloxy-karbonyl-fl-tert-butyloxy-asparaginsyre-pentaklorfeny lester opløses i 20 ml dimetylformamid og der tilsættes 0,7 ml (6,3 mmol) N-metylmorfolin. Reaktionsblandingen henstår i 24 timer og derpå udhældes den under omrøring i en blanding af 50 ml 5%s kalium-hydrogensulfatopløsning og 30 ml æter. Bundfaldet frafiltreres, vaskes med vand og derpå med æter og tørres. På denne måde vindes 3,01 g (80% af det teoretiske) tert-butyloxykarbonyl-(3-tert-butyloxy-L-aspartyl—L-tyrosyl-L-metionyl-glycyl-N1-formyl-L-tryptofyl-L-metionyl-L-aspartyl—fenylalanin-amid, R^ (3) = 0,7.

Eksempel 2 L-Aspartyl—O-sulfato-L-tyrosyl-L-metionyl-glycyl-L-tryptofyl-L-metionyl-L-aspar tyl—l·-fenylalanin-amid._

Man går frem på samme måde som i eksempel 1, med den forskel, at beskyttelsesgrupperne fjernes på følgende måde:

Det efter vask med æter vundne beskyttede produkt opløses ved en temperatur på 0°C i 11 ml af en 3-molær opløsning af merkaptoætansulfonsyre i iseddike, hvorefter opløsningen henstår i 3 timer ved 15 til 20°C, hvorpå den under omrøring udhældes i 100 ml æter. På denne måde vindes 0,86 g (74%) okta-peptidamid-sulfatester med R^ (1) = 0,4.

Claims (4)

148235

1. Fremgangsmåde til fremstilling af den C-terminale oktapeptid-amid-sulfatester af kolecystokinin-pankreozymin med formlen L-Asp-L-Tyr-L-Met-Gly-L-Trp-L-Met-L-Asp-L-Phe-NH2 so3H 1 eller et farmaceutisk acceptabelt salt deraf, kendetegnet ved at man sulfaterer et beskyttet oktapeptidamid med den almene formel X-Asp-Tyr-Met-Gly-Trp-Met-Asp-Phe-NH„ I I l Δ IX Y FOR . W hvor X er en tert-butyloxykarbonyl-, karbobenzoxy- eller α,α-dimetyl-3,5-dimetoxybenzyloxykarbonylgruppe, Y er en tert-butyloxy-, benzyloxy- eller hydroxylgruppe, W er en tert-butyloxy-, benzyloxy-eller hydroxylgruppe og FOR er en formylgruppe, i nærværelse af en æter med et komplex af N-alkylmorfolin.med 1-4 kulstofatomer i alkyldelen og svovltrioxyd, omdanner den vundne sulfatester til et alkalimetalsalt ved behandling med et alkalimetalhydroxyd og dermed samtidigt fraspalter den på tryptofan-enheden værende formyl-beskyttelsesgruppe, hvorpå man fjerner de øvrige beskyttelsesgrupper ved acidolyse med overskud af trifluoreddikesyre i en blanding af vand, anisol og merkaptoætanol eller med merkaptcætansul-fonsyre i iseddike, hvorpå man om ønsket omdanner den vundne forbindelse til et farmaceutisk acceptabelt salt deraf.

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved at man anvender det af N-alkylmorfolin og svovltrioxyd dannede komplex i et 20-30-foldigt overskud.

3. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved at man som N-alkylmorfolin/svovltrioxyd-komplex anvender komplexfor-bindelsen af N-metylmorfolin og svovltrioxyd og at man som æter anvender dioxan.

4. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegne t ved at man som udgangsmateriale anvender et beskyttet oktapeptid med den almene formel II, hvor den N-terminale asparaginsyres aminogruppe er beskyttet med en tert-butyloxykarbonylgruppe og dens β-karboxyl-gruppe er beskyttet med en tert-butyloxygruppe.