CS203148B2 - Process for preparing terminal octapeptidamid-sulphatestere of cholecystocinin-pancreozymine - Google Patents

Description

Vynález se týká nového způsobu výroby teirainálního oktapepPidianid-suUlátesteru cholecystoklninpankcroozjminu vzorce I,

L-Asp-L-sTyrsLsMetsGlysLsTrp-L-Met-L-Asp-L-Phe-NHj(I)

I

SOjH jakož i solí tohoto esteru

Ivy a Oddberg (Amir. J. Ptyssol. 86, 599 /1928/) isolovali' v roce 1928 ze střevní sliznice účinnou látku vyrvoáávjící kontrakci žlučníku, kterou nazvali cholecystokinin. Později Harper a Rape г (J. P^sú-oI· 102, 115 /1943//) isolovali z extraktů střevní sliznice účinnou látku zvySující sekreci slinivky břišní, kterou nazvali pankreozymin”. Mutt a Joopes (Acta Chem. Seand. 18, 2 40β/1964/) potom prokázán, že , obojí biologické účinky vyvolává stejná sloučenina - hormon, který nazvali choйecystokinin-pai^kreozsiin’'. Titíž badatelé objevvii sled tohoto hormonu - , Lys-Ala-ProsSersGly-Arg-Vaa-SersMetsIls-Lys-Asn-LetsGlnsSer-LeusAspsProsSer-His-Arg-Iae-Ser-Usρ-Syr(OOнH)Met-Gay-Trp-Met-Asp-Phe-NHg (Biochem. J. 22b 678 /1971//).

Oldeti a PLuscec uylthe1isovali C-tenninální okteρeetid-sutfátester cholecystokiiii-pankreozyminu a četná jeho analoga a zjistili, že oktapeetidεjaid-sutfáze1ter, jakož i některá jeho analoga jsou podstatně účinnější než celá m^o^l^Jk^la (J. Am. Chem. Soc. ,22, 195 /1970/); J. Med. Chem. 23» 349 /1970/); maďarské patenty č. 162 875 a 163 6215).

Tento oktapeptidедmddsu^tf^ázest1r může být použSit v dávkách asi od ^10-6 mg/kg ^jako užitečný diagnostický prostředek namísto chol1cyutokinin-aink1eozsmi.nu při vyšetřování k on trakt ibility žlučníku a sekrece slinivky břišní (viz maďarský patent č. 162 875). Při novějších výzkumech bylo také zjištěno, že b^ta]^€^{^Pt.dia^mi-s^uUl^i^teÍ^^<ter vyvolává silný relaxační účinek na kruhové svalstvo sphincteru Oddib, pročež tento ester může být pouUit v terapii k odstranění křečí, které se vysilují po operacích žlučníku . (viz. M. A. frinitti, B. Ribin, S. Engel: J. Aner. Digestive E^eases 15. 149 /1970/). *

Způsob výroby tohoto nktkpeptii1kImdiSuUfá testeru je znám z prací tandetbho a spolupracovníků (maďarský patent č. 162 875; DOS 1 922 185; J: Am. Chem. Soc. 02. 195 /1970/). Chráněný oktapeptidamid a k jeho synthese potřebné meziprodukty se připrav:! metodami zná- . mými z - chemie peptidů, potom se tyrouitlová část, způsobem . známým z působením kompPexní sloučeniny pyridinu a kysličníku sírového esterifikuje zbytkem kyseliny sírové a nakonec se chrániči skupiny odstraní acidolysou kyselinou trffuoooocoovou.

Tento způsob dává výtěžky asi 30 %. Podle jhiého způsobu stejných autorů se volný oktapeptidamid při nízké teplotě zpracuje s koncentrovanou kyselinou sírovou, popřípadě siPsí kyseliny sírové a lklitpUyiroggenuUfátu,- přičrnž nktapeptiiιa!pdi8uUfátester se získá v nízkém vý-t^ku ⁽¹⁰%⁾ a ja^ko v^<3^í<^;J^s:í. produkt vzni^ká p^pt^ obse^uuící' značná nn^tv! sulfonovaného tymsim.

Nyní bylo nalezeno, že estarifikace chráněného oktapeptidemidu zbytkem kyseliny sírové se může podstatně urycOUit, když se namísto komplexu pyridin-kysličník sírový pou^je komplexu připraveného z terciárního aminu nbsukuιUíoíUn nejméně jednu alkyl skupinu a - ’ kyssičníku sírového, v přínnooUi některého etheru. Bylo také pozorováno, že k chránění trypto^fanu proti Urc^uty^i a oxiteci v l:L^eβ:ka^Uře toporučovaná K^-foirnyl stopina ⁽viz D. ΙμιρΜν, C. H. Li, J. Org. Chem. 33. 2594 /1973/) s překvapením může být také - s úspěchem pouužta k chránění tryptofanu proti sulf onač i během přípravy sulfát-esteru.

Při odstraňování chránících skupin kobdnlysou bylo dále zajmavým způsobem zjištěno, že jinak známá kyselá - hydrolysa uulfáttuttrové skupiny nenastává ani po dlouhém, víotUndinovém působení, když se na sůl aH^cckého kovu chráněného - oktapeptidemidu působí přebytečnou trffUnooocnovnu kyselinou nebo perkaptoβtUanuulfonovou kyselinou. PouHt! těchto tří nových opatření je tedy možno piři výrobě nktkpeetiiιknPdi8uUfá testeru dosá^^out podstatně lepších výsledků než metodami - známými z lieeratury.

Podstatou vynálezu je nový způsob - výroby ttopinélníUo oktkpeptiiιanP(liSuUfátesteru cUoltcystnlinnn-etnktnoypu vzorce I,

L-Aup-L-Tyr-L-Mtt-Gly-LτTppLL-MetLL-UspLLpUhe-NHg (I) so₃H vyznačený tím, že se chráněný oktkptptidkpid obecného vzorce II,

Χ-Α^-Τ^-Μ,Ι^^-Τγρ-ΜθΙ-^ΡρΠιθ-Ν^

Y FOR W ^(II) kde značí

X Ure iUutyloУťkabnnnyOvoou , kβbnobenzoзyLnvnuu nebo - alfa, e<fkaibmttUyl-3, benzylnxylaobonylovou skupinu,

Y tereiUuУyOxxlOvnul - benzyloxyovouu nbbo hydroxyovoou skupinu,

W ttro.iutyloxylovnu, benzyloxylovou neboohydroxylovou stopinu,

FOR f omylovou skupinu, v příto^i^t^^t^tL - cyklického etheru, s výhodou v příonoot.1 di^oxanu nebo tetreUyirolUrknu, esterifitoje komplexem tvořerým kysliCnkeim sírovým a trailkylminem obskhuuíd alkylstopiny s 1 až 4 - atomy uhLíku, s výhodou treeUkykадLnn(P, nebo cykicclým terciární! aminem, který může mít v kruhu také atem kyslíku, subetiuuoviMým alkyl stopinou s 1 až 4 atomy uhlíku, s výhodou N-alkylmorfolinm s 1 až 4 atomy uhlíku v alkylové části, přiCimž poměr oktapeptidemidu a kopplexu aminikksSičiík sírový je v rozmezí od 1:10 do 1:30, získaný sullátester se působením hydroxidu alkalického kovu převede na alkalickou sůl a tí se současně odštěpí na tryptofanové jednotce přítomné formylové chránící skupina a potom se acidolysou odstraní ostatní chránicí skupiny.

Jako terciárního aminu obsahujícího nejméně jednu alkylskupinu může být použito s výhodou N-alkylmorfolinu s 1 až 4 atomy uhlíku v alkylové části, obzvláště --ppethlmirfioinu; ^ιηρίίβοαιί sloučenina terciárního aminu může být připravena znémým způsobem, například reakcí aminu s kyselinou chlorsulfonovou. Jelikož chráněný oktapeptid, sloužící jako výchozí látka při způsobu podle vynálezu, se uvádí v reakci s . Παπρ^^οι! sloučeninou aminu a kysličníku sírového v přítomnosti některého etheru, s výhodou dioxanu, je účelné provést přípravu komplexu již v reakČní prostředí obsahující ether, například ve . spísí divanu a dipethylfoíapidu.

Jako výchozí sloučenina použitý chráněný oktaleltidερid může být vystavěn známým Způsobem, kon den sací fragpentů nebo postupným napoj ováním jednotlivých v pořadí, přičemž může být použito syntetických metod známých .v chemii peptidů - acylace směsnými anhydridy, aktivníi estery, azidy nebo v lřítopnosti dicyklrhexylkarbrdiiρidu, nebo také takzvané synthesy v pevné lázi, při které může sloužit jako výchozí látka C-terminální tminoSkrseliiα, vázaná na pevném polymerním nosiči karboxylovou skupinou.

Funkční skupiny, které se nezúčastňují reakcí, se při provádění reakcí vhodně chrání; k chránění těchto skupin se použžjí takové známé cCrání.cí skupiny, které se po reakci mohou snadno obvvláště hydrolysou, a^Jo^sou, ^draz^o^sou nebo redukcí. Indolový atom dusíku u tryptofanu se chrání forpylovou skupinou, protože tato chránicí skupina při acidolysách prováděných během výstavby peptidové molekuly zabraňuje vzniku nežádoucích terc.butylderivátů.

Použití odp^^dejících koppinací chránících skupin lze dosáhnout toho, že tyto chránící skupiny, použité na rozdíltých pístech peptidového řetězce, jsou odstranitelné známými metodami, například hydrolysou, аciSolysru, rydralinolysru nebo redukcí žádaným způsobem, selektivně nebo současně.

. Při jednom výhodném provedení způsobu podle vynálezu se pobije výchozího ' chráněného rktαpeltidjpidu obecného vzorce II, který na místě X obsahuje terc.bttyrοxykаrboiLylovou skupinu a na místě Y terč.butyoxxyskupinu jako chránicí skupiny. Na tento chráněný oktaleltidjpid se pak působí roztokm komplexu N-miehhУnirrfSinikysličník sírový, který se pouuije ve 20 až 30násrbném přebytku, v dioxanu nebo ve spisi dioxanu a dimethylfonnapidu, a převede se tak na rdploVdsjící sullátester.

Takto získaný chráněný rktapepliSlмnids-užfláester se pak vodným roztokem 2 poo-ekvivalentů hydroxidu sodného převede na sodnou sůl a nakonec se odstraní terc.iutyloxykarirnylová a popřípadě terč.butoxylová ochranná skupina pomocí spisi 70 až 80 objemových % kyseliny trifunoroctevé, 5 až 10 objemových % pprkaptoethanolu, 5 až 10 objemových % vody a 5 až 10 objemových % anis^u, nebo s výhodou 3-íolární roztokem kyseliny. р^кер^в^еюsulfonové v ledové kyselině octové. Tímto způsobem se .získá žádaný rktaleptiSemdsužfátester v čistotě SosЪaδcιžϊcd pro praktické účely; je-li však .přece třeba produkt dále čistit, tedy se ohromatografuje na sloupci silikagelu za porážtí spisi stejrých dílů ethylacetátu a spisi pyridinu, kyseliny octové a vody 20:6:11.

Při způsobu podle vynálezu jako výchozí látka použitý chráněný rktaleltidapiS BOC-AspíotBO-Tzr-Met-Gly^rpfFOJO-Met-Asp-Phe-NH² se vý^dni lři¹rtv^d ^sle^jícíp z¹ůsrieí:

L-Meth^roril-L--tp¹ra^tgy-L-^fei^yla^lanintpi^s se acyluje ^—-terc. ⁱULtyloxy^ktrⁱriyl-^—‘-^forpyl-L-tryltofailenttchlrrfeiylesterep a lrtsí se u získaného chráněného tetrapeptSaíiSu obvyklým způsobem odstraní N-terc.bityloxykarbonylová chráníci skupina účinkem 1 N kyseliny chlorovodíkové v ledové kyselině octové. Tímto způsobem získaný N^formyy-L-tryptofyl-L-meehionnt.-L-asparagyt-L-fenylalaninímid se acyluje terc.butylooykarboonrt-L-meehhonntglyc inpen hac hlorfenylesherem.

Získaný chráněný hezoapeptid se isoluje obvyklým způsobem, herc.tuityooxykarbonylová chránicí skupina se odstraní a získaný L-eeehiioil-ggytct-Ni-formyl-L-tryptofyl-L-enthionyl-L-asparayylfenylalaninemid se acyluje teгc.butyl-L-tyrosinΓrihhlгreetyeeseгeem. Po odddlení produktu obvyklým způsobem a odstranění chránící skupiny získaný L-tyrosyl-L-methion^G.glysyl-N^-formyl-iL-trjrptoíyi-L-metMonyl.-L-aspiMraarl-^fenylalaninmto ^{se ac}y luje pentlchllrfeiylesteeгl tnгc.butylooylarboliУ-bbetlterc.buty1-Llasparagové kyseliny, přičimž· jako produkt se získá žádaný chráněný oktapeptid^id.

Způsobem podle vynálezu ve vysoké Čistotě i vysokém výtěžku získatelný lktapeppidlmid-sulfá tester obecného vzorce I je jak po stránce charakteristicích fyzlkéinicheeiclých vlastností, tak také po stránce fairaakoloyických účinků identický s produktem získarým známými metodnni. V dávkách 2 až 10 mg/ky i. v. vyvolává tato sloučenina u psů značné kontrakce žlučníku a relaxaci sphicteru Oddii. Produkt může být pouuit jak pro diaynostické, tak pro terapeutické účely. Pro parenierálií (intravenosní nebo sublktármí) podávání, jakož i pro přípravu bucálních přípravků se lktlpeePii^amdislfátestnr převede obvyklým způsobem na farmaceuticky vhodné soU.

V tomto popisu používané zkratky, popřípadě krátká ' označení aminoOkrtee:Ln a peptidových derivátů o^jdc^oíč^íIzí nomenniatuře doporučované IUPAC-IUB, viz J. Biol. Chem. 24*7 977 (1972); dále bylo použito následnících zkratek:

BOC = terc. Ь^у1ооу11гЬшуУ,

Cbz = laгbobenzoxy,

Ddz = llfа,аffа-einhtУyl-3₎ii·eimθtloyynerlzylootilгblnyl, ,

O^Bu = torč.butylooy,

OBbI = benzylooy,

FOR = formyl.

Způsob podle vynálezu, jakož i příprava výchozích látek,·popřípadě meziproduktů je blíže osvětlena v .níže uvedeném příkladu. V příkladu uváděné body tání byly stanoveny na Dr. Tottoliho' přístroji (výrobce: Firma Buhi, ·Švýcarskoo. Chrlmeahlyгfické zkoušky na tenké·vrstvě byly prováděny na sillaageOoíih destičkách (Silicagel nach Stáhl) s následnícími systémy rozpouštědel:

1. Ethylacetát - (pyгiiin-kyselinl octová-voda 20:6::1) =1:1

2. Ethylacetát - (pyгidin-ktsnlinl octová-voda 20:é^:111 =6:4

3. Ethylacetát - (pyгidin-kyselina octová-voda 20:é^:111 =8:0

Čísla uvedená v závorkách u · hodnot · se vztahuj na uvedené systémy rozpouštědel.

P ří k la-d1

L-AspPlгαyl-(Ohy(lroxooylloflitL-tyyгoyl-LLπmthionyitggytcl-LLtгyptlfy1-L-enthiliyl-L-lsparagtl-L-fθnylaaiiinlmii

1,6 ml · (25 m^mD kysleiny chlorsulfonové se rozpustí ve 2 ml chloroformu a za intensivního míchání při -10 °C se přidá roztok 3,3 ml (30 mj^mD N-eenhyУmolΓfliiU ve směsi se 3 ml dioxonu a 3 ml di^i^lthyl^f^omi^e^i^^. Ke vzniklé suspensi se po 5 minutách přidá roztok 1,25 g (1,0 meel) tnгi.butylloyllrboonУ1bbna-tnri.blty1nsplraяУ.-L-tyrosy1-L-eethiliyl-glycyl-N· -forayl-L-tryptofyl-N-enthioiyl-L-aspara^yУ-L-fniyll1lniil v 8 ml dimethylformamidu.

Sméěs se míchá 3 hodiny při teplotě místaosti, potom se ochladí na 0 °C a za míchání se přidá 5 ml 4 N hydroxidu sodného. Roztok te zahustí k'tuchu, zbytek te roztírá s 20 ml vo^dy ochlazené n^{a 0} °C nerozpustný ^pro^dukt se odfiltruje, ^promyje se dvakrát ²0 ml vody, pak jednou 20 ml etheru. Tímto způsobem získaný surový chráněný · skta^pe^ptidMIlidfЗsSfátester se pak rozpětí ve směsi 25 ml methanolu a 25 ml vody a hodnota pH roztoku se 'nastaví 2 ml 4 N hydroxidu sodného na 8. '

Po 20 minutách se roztok odppaí, zbytek se rozetře se směsí aceton-ether 1:1, odfiltruje se a promyje se etherem. Tímto způsobem získaný produkt se rozpustí ve směsi 8 ml kyseliny ti^i^ířL^e^i^e^c-^e^vé, 1 ml vody, 1 ml anisolu a 1 ml merkaptoethanolu, předem ochlazené na 0 °C, roztok se ponechá stát 3 hodiny při 15 až 20 °C a potem se za míchání vlije do 100 ml etheru.

Tímto způsobem se získá 0,90 g L-atparag^yl-(0-hldrsx^yУsSisn^yl-L-tlrssll)-L-oethion^yl-glycyl-L-trypSifyl-L-methionyl-L-asparagyl-L-fenylalaninадids (77 % teorie); Rf (1) = ·0,4. V případě, že získaný produkt obsahuje ještě nečistoty, může být čištěn chromátograiováncm na sloupci 80 g silikagelu; k eluci se pouuije směs ethylacetátu, pyridinu, kyseliny octové a vody v poměru 37:20:6:11.

Jako výchozí látka pro shora uvedenou synthesu sloužící terč.butyloxykarbonylíbeta' -terč.but^ll-L-atparag^ll-L-t^lrss^ll-L-methisn^ll-Ni-ⁱsrmy^l-L-tr^lpts^ill-L-methisny^l-L-atparagyl-L-fenllalaninmif může být nejvýhsedlC ji připraven takto:

a) N-terc.but^ylox^lkarbsn^yl-Nⁱ-isrmyl-L-tryptsⁱyl-L-methⁱsnyl-L-aspara^gl-L-i^enylal^a- ninamid ' .

22,34 g (50 mol) L-meehionnl-Lasparagyl-L·-ienllalaninaoifh^ydrochloridu, připraveného podle I. M. Davey, A. H. Laird, I. · S. Morley: J. Chem. ' Soc. 1966, 555, se rozpustí ve 200 ml dimethy.lforaamidu, přidá se 11,1 ml (100' ·' rand) N-Imeh^ylmorr olinu a 28,.9 g (50 ml) N-tθrc.butllsxykarbonll-N1-i^,sro^yl-L-trlptsienpentschlorfenylesteru.

Hoediota pH roztoku se přídavkem ' dalšího N-moehhlLnorrolinu nastaví na 7 až 7,5· Po 12 · hodinách se reakční směs zahltí ·na objem 50 ml a za · intensivního míchání se vlije do směsi 200 ml 5% roztoku kalismhydrogéncsSiátu a 100 ml etheru prostého peroxidů, předem ochlazené na 0 °C. Vyloučený produkt se odfiltruje, promyje se etherem a usuší. Získá se 26.^{g či}stého B(°-teerapept^am^u' ·⁽7² % teorie); bo^{d tá}ní ²⁰⁹ °C; [al^^⁰ = ^-22° ⁽c = ' 2 ^; v dimethylf omamidu); Rf (2) = 0,7

b) terč .l:sltyloxlkarbsnyl-L-meehiorylglylin^peetachlforeenleeter

1,9 g (6,2 mml) terc..'bulyOoxykarbsnll-L-oethionylgllcinu, připraveného poedLe ' M. A. taddeti, I. Pluscec, E. F. · Sabo, J. T. Scheehan, N. Willims: J. Ao. Chem. Soc. 92. 195 (1970), a 1,92 g (7,2 mnc>l) pentachlorienolu se rozpětí v 31 ml dimethylf oimamidu. Směs se ochladí na 0 · °C a za míchání se po kapkách přidá roztok 1,41 g (6,85 mnc>l) dicyklohexylkarbodilmidu v 6,2 ml dimethylfomiamidu a při této teplotě se míchá 1 hodinu.

Reakční směs sé ponechá stát · přes noc při teplotě oístnosti, potom se odfiltruje vyloučená dicyklrhexyLmočovine a filtrát se·· zahltí za sníženého tlaku. Odparek se · roztírá s etherem, ziiltjuje, promyje se etherem a překrystaluje · se z patnáctináootmého m^c^o^s^1Lv:í ethanolu. Tímto způsobem se získá 2,19 g terc.bu^,tyroxykarbsnyl-L-meehionnlglycinpentachlorienylesteru (63,6 % teorie); bod tání 169 až 171 °C; R^ = 0,8 (chlorofom-methano! 8:2).

c) terč. butlloxykarboryl-L-methioryl-glylyl-Nⁱ-isrool-L-trlptoill-L-methionll-L-atparagll-L-fenllalanCnmif

25,3 g (35 mmol) N-terc. butyl oxy karbonyl-^-f ormyl-L-tryptofyl-L-me thi onyl-L-a sper аgyl-L-fenylalanylamidu se rozpustí ve 120 ml N kyseliny chlorovodíkové v ledové kyselině octové. Po 90 minutách se roztok odpaří na poloviční objem e přídavkem 500 ml etheru se vysráží tetrapeptidamidhydrochlorid. Získané sůl se odfiltruje, pranýje etherem a vysuší. Získá se 20,3 g Nⁱ-formyl-L-tryptofyl-L-methionyl-L-asparagyl-L-fenylelanylamidhydrochlorid (88 % teorie); bod tání 207 až 209 °C.

3>3 g (5 mmol) shora uvedeného tetrapeptidamidhydrochloridu e 2,77 g (5 mmol) terč· butyloxykarbonyl-L-methionyIglycinpentachlorfenylesteru se rozpustí v 25 ml dimethylformamidu a přidá se 1,11 ml (10 mmol) N-methylmorfolinu·. Po 24 hodinách se reakční směs ve vakuu odpaří na poloviční objem, potom se za míchání vlije do směsi 5θ ml 5% roztoku kaliumhydrogen8ulfátu a 30 ml etheru· Sraženina se odfiltruje, promyje se vodou, potom ethe- * rem a vysuší se. Získá se 3,7 g tore.butyloxykarbonyl-L-methionyl-glycin-Nⁱ-formyl-L-tryptofyl-L-methionyl-L-asparagyl-L-fenylalaninamidu (81 £ teorie); bod tání 172 až 179 °C R_f (3) = 0,45-

d) terč.Butyloxykarbonyl-L-tyrosyl-L-methionyl-áiycyl-N^-formyl-L-tryptofyl-L-methionyl-L-asparagyl-L fénylalaninemid.

3,65 g (4 mmol) terc.butyloxykarbonyl-L-methionylglycyl-Nⁱ-forniyl-L-tryptofyl-L-methionyl-L-asparagyl-L-fenylalanylamidu se rozpustí v 15 ml roztoku 1 N kyseliny chlorovodíkové v ledové kyselině octové. Po 30 minutách se hexapeptidemidhydrochlorid vysráží přidáním 300 ml etheru, odfiltruje se, promyje etherem a vysuší. Získá se 3,2 g L-methionyl-glycyl-Nⁱ-formyl-L-tryptofyl-L-methionyl-L-asparagyl-L-fenylalaninamidhydrochloridu (94 % teorie); bod tání 130 až 132 °C.

3,2 g (3,77 mmol) shora uvedeného hexapeptidemidhydrochloridu a 1,84 g (4 mmol) terc.butyloxykarbonyl-L-tyro8in-2,4,5-trichlorfenylesteru se rozpustí ve 25 ml dimethylformemidu a přidá se 0,9 ml (8 mmol) N-methylmorfolinu. Reakční směs se ponechá stát 24 hodin, pak se odpaří na poloviční objem a za míchání se vlije do směsi 50 ml 5% roztoku kaliumhydrogensulfátu a 30 ml etheru. Srelenina se odfiltruje, promyje se vodou, potom etherem a vysuší se. Získá se 3,7 g terč.butyloxykarbonyl-L-tyrosyl-L-methionyl-glycyl-N^-formyl-L-tryptofyl-L-methionyl-L-asparagyl-L-fenylalaninemidu (92 % teorie); R^ (3) = 0,55*

e) terč.Butyloxykarbonyl-beta-terč.butyl-L-asparagyl-L-tyrosyl-L-methionyl-glycyl-N¹-formyl-L-tryptofyl-L-methionyl-L-asparagyl-L-fenylalaninamid

3,7 g (3,45 mmol) terc.butyloxykarbonyl-L-tyrosyl-L-methionyl-.glycyl-Nⁱ-formyl-L-tryptofyl-L-methionyl-L-asparagyl-L-fenylalaninamidu se rozpustí v 15 ml N kyseliny chlorovodíkové v ledové kyselině octové. Po 30 minutách se přidáním 300 ml etheru vysráží heptapeptidamidhydrochlorid, odfiltruje se, promyje se etherem a vysuší. Získá se 3,45 g L-tyrosyl-L-methionyl-glycyl-N^-formyl-L-tryptofyl-L-methionyl-L-asperagyl-L-fenylalaninamidhydrochloridu (99 % teorie).

3,04 g (3,0 mmol) shora uvedeným způsobem získaného heptapeptidamidhýdrochloridu a

1,7 & (3,17 mmol) pentachlorfenylesteru kyseliny terč.butyloxykarbonyl-beta-terč.butylaspařagové se rozpustí ve 20 ml dimethylformamidu a přidá se 0,7 ml (6,3 mmol) N-methylmorf olinu. Reakční směs se ponechá stát 24 hodin, potom se za míchání vlije do směsi 50 ml 5% roztoku kaliumhydrogensulfátu a 30 ml etheru. Sraženina se odfiltruje, promyje se vodou, potom etherem a vysuší se. Tímto způsobem se získá.3,01 g terč.butyloxykarbony1-beta- terč. butyl-L-a sparagyl-L-tyro syl-L-me thi onylglycyl -N^ -f ormyl-L- try pt of yl -L-me thi onyl-L-asparagylfenylalaninemidu (80 % teorie); R^ (3) = 0 7.

Příklad 2

Postupuje se jako v příkladu 1, s tím rozdílem, že se místo N-methylmorfolinu použi jí 4,2 ml (30 mmol) triethylaminu, výtěžek: 0,85 kg (72,7 %).

Příklad 3

Postupuje se jako v příkladu 1, s tím rozdílem, že se místo N-methylmorfolinu použije 6,2 ml (30 mmol) tributylaminu, výtěžek: 0,82 kg (70,1 %).

Příklad 4

Postupuje se jako v příkladu 1, s tím rozdílem, že se místo N-methylmorfolinu použijí 4,1 ml 430 mmol) diisopropylethylaminu, výtěžek: 0,61 g (52,2 %).

Příklad 5

Postupuje se jako v příkladu 1, s tím rozdílem, že se jako etheru místo dioxanu použijí 3 ml tetrahydrofuranu, výtěžek: 0,73 g (62 %).

Claims (6)

1. PŘEDMĚT VYNÁLEZU

   1. Způsob výroby terminálního oktapeptidamid-sulfátesteru cholecystokinin-pankreozyminu obecného vzorce I,

   L-Asp-L-Tyr-L-Met-Gly-L-Trp-L-Met-L-Asp-L-Phe-NH2

   SO^H (I) vyznačený tím, že se chráněný oktapeptidamid obecného vzorce II,

   X-A sp-Tyr-Me t-Gly-Trp-Me t-A s p-Phe-NHg

   Y FOR W (II) kde značí

   X terč.butyloxykarbonylovou, karbobenzoxylovou nebo alfa,alfa-dimethyl-3,5-methoxyben-. zyloxykarbonylovou skupinu,

   Y terc.butyloxylovou, benzyloxylovou nebo hydroxylovou skupinu, W terc.butyloxylovou, benzyloxylovou nebo hydroxylovou skupinu, FOR formylovou skupinu, v přítomnosti cyklického etheru, s výhodou v přítomnosti dioxanu nebo tetrahydrofuranu, esterifikuje komplexem tvořeným kysličníkem sírovým a trialkylaminem obsahujícím alkylskupiny s 1 až 4 atomy uhlíku, s výhodou triethyleminem, nebo cyklickým terciárním aminem, který může v kruhu také mít atom kyslíku, substituovaným alkylskupinou s 1 až 4 atomy uhlíku, s výhodou N-alkylmorfolinem s 1 až 4 atomy uhlíku v alkylové části, přičemž poměr oktapeptidamidu a komplexu amin - kysličník sírový je v rozmezí od 1:10 do 1:30, získaný sulfátester se působením hydroxidu alkalického kovu převede na alkalickou sůl a tím se současně odštěpí na tryptofanové jednotce přítomná formylová chránící skupina a potom se acidolysou odstraní ostatní chránící skupiny.
2. 2. Způsob podle bodu 1, vyznačený tím, že komplex vytvořený aminem a kysličníkem sírovým se použije ve 20 až 30násobném přebytku.
3. 3. Způsob podle bodu 1, vyznačený tím, Že jako komplexu amin - kysličník sírový se použije komplexní sloučeniny N-methylmorfolinu a kysličníku sírového.
4. 4. Způsob podle bodu 1, vyznačený tím, že jako výchozí látky se použije chráněného oktapeptidamidu obecného vzorce II, ve kterém aminoskupina N-terminální kyseliny aspara203148 gové je chráněna terc.butyloxykarbonylovou skupinou a její beta-karboxylová skupina je chráněna terc.butyleseeoovou skupinou.
5. 5. Způsob podle bodu 1, vyznačený tím, že získaný chráněný oktapeptideaid-sulfátester se ve vodném roztoku převede roztokem hydroxidu sodného na sodnou sůl a současně se odštěpí f omylová chránící skupina tryptofanu.
6. 6. Způsob podle bodu 1, vyznačený tím, že chránící skupiny dvojsodné soli oktapeptidamid-suufátesteru se odštěpí působeni smis.i 70 až 85 % kyseliny trifuooroctové, 5 až 10 % merkaptoethanolu,.. 5 až 10 f vody a 5 až 10 % anisolu, nebo mmrkaptoethansulfonovou kysseinou rozštěpenou v kyselině octové.